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1. WO2020197021 - PROCÉDÉ DE PRÉPARATION D'UN NANO-AGENT DE DIAGNOSTIC APTE À COLORER SÉLECTIVEMENT DES TISSUS ANORMAUX INFLAMMATOIRES OU DES TISSUS TUMORAUX

Document

명세서

발명의 명칭

기술분야

1  

배경기술

2   3   4  

발명의 상세한 설명

기술적 과제

5  

과제 해결 수단

6   7   8   9   10   11   12   13   14   15  

발명의 효과

16   17   18   19   20   21   22  

도면의 간단한 설명

23   24   25   26   27   28   29   30   31   32   33   34   35   36   37   38  

발명의 실시를 위한 최선의 형태

39   40   41   42   43   44   45   46   47   48   49   50   51   52   53   54   55   56   57   58   59   60   61   62   63   64   65   66   67   68   69   70   71   72   73   74   75   76   77   78   79   80   81   82   83   84   85   86   87   88   89   90   91   92   93   94   95   96   97   98   99   100   101   102   103   104   105   106   107   108   109   110   111   112   113   114   115   116   117   118   119   120   121   122   123   124   125   126   127   128   129   130   131   132   133   134   135   136   137  

청구범위

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  

도면

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16  

명세서

발명의 명칭 : 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 나노 진단 제제의 제조 방법

기술분야

[1]
본 발명은 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 나노 진단 제제의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 비정상적으로 형성된 조직의 미세 환경을 이용하여, 종양 조직을 특이적 또는 선택적으로 염색함으로써, 정상 조직과의 구분을 명확하게 할 수 있는 염색 물질이 담지된 나노 기반의 진단 제제의 제조 방법에 관한 것이다.

배경기술

[2]
세포는 세포주기에 따라서 분열과 생장을 반복하는데 모종의 이유로 세포분열의 억제 기작이 불충분하거나 또는 기능하지 않게 되면 계속해서 분열과 생장을 반복하게 된다. 이 결과 정상에 비해 과도하게 증식된 세포덩어리를 이루게 되는데 이를 종양이라고 한다. 이러한 종양은 짧은 시간 내에 세포의 과다 증식으로 의하여 형성된 조직으로서, 일반 정상 조직에 비해 세포 간 치밀도가 떨어진다.
[3]
최근들어 나노기술과 바이오기술이 융합된 나노바이오 기술 의료분야의 폭발적 증가로, 이러한 종양을 진단하거나 또는 치료가 가능한 기능성 나노입자체가 각광받고 있다.
[4]
그러나, 종래 보고된 기술들은 일반적으로 종양세포에서 특이적으로 발현되는 수용체를 타겟팅하거나, 종양 주변의 낮은 pH를 검출하거나, 또는 종양 부위에 과다분포되어 있는 특정 효소를 타겟으로 하여 조영제를 제조한 것이며, 종양의 미세 기공을 통해 직접 투과 및 흡수를 통해 전달되어 정상 조직과 비정상 조직을 정밀하게 구분하여, 질환 부위의 탐색 효율성을 높일 수 있는 나노 기반의 진단 제제에 관한 연구는 보고된 바 없다.

발명의 상세한 설명

기술적 과제

[5]
따라서 본 발명은 종양의 미세 기공을 통해 직접 투과 및 흡수를 통해 전달되어 정상 조직과 비정상 조직을 정밀하게 구분하여, 질환 부위의 탐색 효율성을 높일 수 있는 나노 기반의 진단 제제의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

과제 해결 수단

[6]
상기 목적은, 폴리소르베이트 80(polysorbate 80), 대두 오일(soybean oil) 및 비수용성 염색 물질을 혼합하여, 제 1 혼합물을 형성하는 단계; 제 1 혼합물과 삼중 블록 공중합체를 혼합한 후 가열하여, 제 2 혼합물을 형성하는 단계; 상기 제 2 혼합물을 냉각하여, 나노 플랫폼 고형물을 형성하는 단계; 상기 나노 플랫폼 고형물에 용매를 혼합하여, 제 3 혼합물을 형성하는 단계; 상기 제 3 혼합물로부터 불순물을 제거하는 단계; 및 상기 불순물이 제거된 제 3 혼합물을 동결건조하여, 나노 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 나노 진단 제제의 제조 방법에 의해 달성된다.
[7]
일 실시예에서, 상기 비수용성 염색 물질은, 커큐민(curcumin), FITC(fluorescein isothiocyanate), 나일 레드 (Nile red), Ce6 (Chlorin e6) 및 PpIX (Protoporphyrin IX)이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 염색 물질이다.
[8]
일 실시예에서, 상기 비수용성 염색 물질은 양이온성 제 1 염색 물질과 음이온성 제 2 염색 물질을 용매에 각각 용해한 후 혼합하여, 이온 결합을 통해 수득된 비수용성 염색 물질 복합체이다.
[9]
일 실시예에서, 상기 제 1 염색 물질은 인디고 카민(indigo carmine), 메틸렌 블루(Methylene Blue), 인도시아닌그린(Indocyanine green), 톨로이딘 블루(Toluidine Blue) 및 로다민 B(Rhodamine B)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 염색 물질이다.
[10]
일 실시예에서, 상기 제 2 염색 물질은 인도시아닌 그린(Indocyanine Green) 및 메틸렌 블루(Methylene Blue)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 염색 물질이다.
[11]
일 실시예에서, 상기 제 2 혼합물을 형성하는 단계에서 가열 온도는 55℃ 내지 65℃이다.
[12]
일 실시예에서, 상기 나노 플랫폼 고형물을 형성하는 단계에서 냉각 온도는 0℃ 내지 10℃이다.
[13]
일 실시예에서, 상기 용매는 3차 증류수이다.
[14]
한편, 마이셀 구조의 나노 복합체로서, 상기 마이셀 구조의 내부 코어는 비수용성 염색 물질이 용해된 폴리소르베이트 80(polysorbate 80) 및 대두 오일(soybean oil)을 포함하고, 상기 마이셀 구조의 외부 쉘은 수용액에서 상기 내부 코어에 포함된 성분의 석출로 인한 응집없이, 균일한 입자를 형성하기 위한 삼중 블록 공중합체를 포함하며, 상기 나노 복합체의 평균 직경은 1 nm 내지 100 nm인 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 나노 진단 제제에 의해서도 상기 목적은 달성된다.
[15]
본 발명의 또 다른 실시예인 진단 제제 용액은 전술한 진단 제제가 주사 용액 또는 완충 용액에 분산된 것이다.

발명의 효과

[16]
본 발명의 일 실시예에 따른 나노 진단 제제의 제조 방법에 의하면, 유기용매 또는 수용액을 전혀 사용하지 않고, 고분자 용융 상전이 현상을 기반의 단순 방법으로 제조되는 유효성분 탑재용 나노 크기의 진단 제제를 제공할 수 있다.
[17]
본 발명의 일 실시예에 따른 나노 진단 제제의 제조 방법에 의하면, 비 수용성 염색 물질이 탑재되어 수용액에서 초미립크기를 가지는 유효성분 탑재용 나노 크기의 진단 제제를 제공할 수 있다.
[18]
본 발명의 일 실시예에 따른 나노 진단 제제의 제조 방법에 의하면, 비 수용성 염색 물질의 특징에 따라 하나 또는 하나 이상의 분광학적 특성을 가지는 유효성분 탑재용 나노 크기의 진단 제제를 제공할 수 있다.
[19]
본 발명의 일 실시예에 따른 나노 진단 제제의 제조 방법에 의하면, 염색 물질을 정맥으로 투여한 경우, 시간이 지남에 따라 종양에 선택적으로 더 많은 양의 염색 물질을 종양에 전달하고, 종양을 염색하여, 우수한 종양 진단 기능성을 가지는 유효성분 탑재용 나노 크기의 진단 제제를 제공할 수 있다.
[20]
본 발명의 일 실시예에 따른 나노 진단 제제의 제조 방법에 의하면, 종양에 국소적으로 도포를 하고 세척하면, 다른 장기에 비해 더 많은 양의 염색 물질을 종양에 전달하고, 종양을 염색하여, 우수한 종양 진단 기능성을 가지는 유효성분 탑재용 나노 크기의 진단 제제를 제공할 수 있다.
[21]
본 발명의 일 실시예에 따른 나노 진단 제제의 제조 방법에 의하면, 정상 조직, 염증에 의해 변형된 비 정상적인 조직 및 종양에 국소적으로 골고루 도포하고 세척하는 경우, 일반 정상 조직에 비해 더 많은 양의 염색 물질이 변형된 비정상 조직과 종양 조직에 흡수 및 투과되어, 비정상 조직과 종양조직을 염색하여, 이를 진단 또는 구분할 수 있는 기능을 가지는 유효성분 탑재용 나노 크기의 진단 제제를 제공할 수 있다.
[22]
본 발명의 일 실시예에 따른 나노 진단 제제의 제조 방법에 의하면, 복수의 염색 물질을 탑재할 수 있는 유효성분 탑재용 나노 크기의 진단 제제를 제공할 수 있다.

도면의 간단한 설명

[23]
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 진단 제제의 제조 방법에 관한 플로우 차트이다.
[24]
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 비 수용성의 염색 물질 또는 비 수용성의 복합체가 탑재된 진단 제제를 형성하는 방법에 대한 모식도이다.
[25]
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 수용성의 두 염색 물질을 각각 수용액에 용해하여 수득한 양이온과 음이온으로 이온화된 염색 물질들을 이온 결합을 통해 결합시킨 비 수용성의 복합체를 형성하는 방법에 대한 모식도이다.
[26]
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 (A) 양이온과 음이온으로 이온화된 염색 물질들을 서로 이온 결합으로 결합시킨 비 수용성의 복합체가 탑재된 진단 제제와 (B) 비 수용성 염색 물질이 탑재된 진단 제제의 수용액에 안정하게 분산된 상태를 나타낸 이미지이다.
[27]
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 수용액에 분산된 (A) 양이온과 음이온으로 이온화된 염색 물질들을 서로 이온 결합으로 결합시킨 비 수용성의 복합체가 탑재된 진단 제제와 (B) 비 수용성 염색 물질이 탑재된 진단 제제에 대하여, 자외선-가시광선 분광기를 이용한 측정하여 수득한 흡광도에 대한 그래프이다.
[28]
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 염색 물질이 탑재된 진단 제제를 다양한 농도의 FBS가 포함된 완충 용액(pH 7.4)에서 용해한 후, FBS 함량에 따른 입자 안정성을 확인하기 위해 입자분석기로 시간대 별로 관찰한 결과 그래프이다.
[29]
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양액에 분산된 염색 물질이 포함되어 있지 않은 나노 기반 물질을 다양한 세포에 처리한 후, 시간대 별로 독성 정도를 관찰한 결과 그래프이다.
[30]
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양액에 분산된 염색 물질이 탑재된 진단 제제를 다양한 종양세포에 처리한 후, 세포 내로의 유입 정도를 형광현미경을 이용하여 시간대 별로 측정한 이미지이다.
[31]
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 주사 용수에 분산된 염색 물질이 탑재된 나노 기반 표지 제제를 종양 세포가 이식된 종양 유발 마우스 모델에 정맥 투여한 후, 실시간 체내 분포도와 종양으로의 축적 정도를 근적외선 형광 장비로 측정한 이미지이다.
[32]
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 주사 용수에 분산된 염색 물질이 탑재된 진단 제제를 종양 세포가 이식된 종양 유발 마우스 모델에 정맥 투여한 후, 48시간 후 얻은 각 마우스의 주요 적출된 장기에서 염색 물질의 축적 정도를 근적외선 형광 장비로 측정한 이미지이다.
[33]
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 주사 용수에 분산된 염색 물질이 탑재된 진단 제제를 종양 세포가 이식된 종양 유발 마우스 모델 종양에 직접 도포 및 세척한 후, 물질의 투과 및 흡수 정도를 근적외선 형광 장비로 측정한 이미지이다.
[34]
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 주사 용수에 분산된 염색 물질이 탑재된 진단 제제를 종양에 직접 도포 및 세척 (A) 전과 (B) 후를 전자 현미경을 통해 측정한 이미지이다.
[35]
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 주사 용수에 분산된 염색 물질이 탑재된 진단 제제의 조직 투과 기전을 확인하기 위해, 3차원 배양된 세포에서 물질을 처리한 후 형광 현미경을 통해 측정한 이미지이다.
[36]
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 주사 용수에 분산된 비 수용성 커큐민(Curcumin)이 탑재된 진단 제제를 염증 유발에 의해 대장에 자발적으로 형성된 종양에 직접 도포 및 세척한 후 근적외선 형광 장비로 측정한 이미지이다.
[37]
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 주사 용수에 분산된 비 수용성 염색 물질인 나일 레드(Nile red)가 탑재된 진단 제제를 염증 유발에 의해 대장에 자발적으로 형성된 종양에 직접 도포 및 세척한 후 근적외선 형광 장비로 측정한 이미지이다.
[38]
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 주사 용수에 분산된 이온 결합에 의해 비 수용화된 복합체가 탑재된 진단 제제를 염증 유발에 의해 대장에 자발적으로 형성된 종양에 직접 도포 및 세척한 후 근적외선 형광 장비로 측정한 이미지이다.

발명의 실시를 위한 최선의 형태

[39]
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 구성요소 등이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 구성요소 등이 존재하지 않거나 부가될 수 없음을 의미하는 것은 아니다.
[40]
본 명세서에서 사용된 "제1" 및 "제2"의 용어는 순서를 의미하는 것이 아니라, 두 구성요소를 구분하기 위하여 사용된 것이기 때문에, 두 구성요소를 한정하는 것이 아니다. 특히, "제 1 혼합물", "제 2 혼합물" 및 "제 3 혼합물" 각각은 각 용어가 출현하기 전에 제시된 혼합요소를 포함한 혼합물을 의미하는 것으로서, 3가지 혼합물을 구분하기 위하여, "제 1", "제 2" 및 "제 3"이란 용어를 사용한다.
[41]
본 명세서에서 사용된 용어 "나노"는 나노 미터(nm) 단위의 크기를 의미할 수 있고, 예를 들어, 1 내지 1,000nm의 크기를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에서 용어 "나노 복합체"는 나노 미터(nm) 단위의 평균 크기를 갖는 복합체를 의미할 수 있고, 예를 들어, 1 내지 1,000nm의 평균 크기을 갖는 복합체를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[42]
본 명세서에서 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 명세서에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
[43]
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 진단 제제의 제조 방법을 설명하며, 첨부된 도면은 예시적인 것으로, 본 발명의 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 진단 제제의 제조 방법의 범위가 첨부된 도면에 의해 제한되는 것은 아니다.
[44]
도 1은 본 발명의 일 실시예인 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 진단 제제의 제조 방법에 관한 플로우 차트이다. 또한, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 비 수용성의 염색 물질 또는 비 수용성의 복합체가 탑재된 진단 제제를 형성하는 방법에 대한 모식도이다.
[45]
도 1 및 도 2에 도시한 바와 같이, 먼저 폴리소르베이트 80(polysorbate 80), 대두 오일(soybean oil) 및 비수용성 염색 물질을 혼합하여, 제 1 혼합물을 형성한다(S10).
[46]
본 발명은 특히, 종래에 사용되지 않았던 폴리소르베이트 80 (polysorbate 80) 과 대두 오일(soybean oil)을 사용하여 제제를 구성하는 것을 특징으로 하며, 이를 통하여, 후술하는 바와 같이, 1nm 내지 100nm의 미세 나노 복합체를 제공할 수 있다.
[47]
폴리소르베이트 80는 친수성과 소수성을 모두 가지고 있어, 의약품 또는 화장품에 사용시 계면활성제로 많이 활용되고 있으며, 유화공정에서 입자가 안정하게 분산될 수 있도록 도움을 주는 안정화제 또는 비 수용성의 유효 성분을 용해시키는 용해제로써의 특징도 갖는다. 또한, 대두 오일은 물과 전혀 섞이지 않는 비수용성의 성질을 가지고 있으며 유화공정에서 비 수용성 유효성분과 서로 소수성 결합을 통해 입자 내부에 탑재되도록 하는 특징을 갖는다.
[48]
일 실시예에서, 비수용성 염색 물질은 단파장부터 장파장까지 고유의 흡광 파장을 발생하는 물질 또는 특정 빛에 의해 형광을 발생시킬 수 있는 다양한 물질들이다. 본 발명에서는 단일 물질이거나 복합 물질로 구분할 수 있다.
[49]
단일 물질인 경우, 여기에 한정되는 것은 아니지만, 일 예시로서, 커큐민(curcumin), FITC(fluorescein isothiocyanate), 나일 레드 (Nile red), Ce6 (Chlorin e6) 및 PpIX (Protoporphyrin IX)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 염색 물질일 수 있다.
[50]
커큐민은 항염증, 항산화, 항암, 혈액순환 개선에 도움이 되는 천연물질로 알려져 있고, 분광학적으로 340~534nm 의 고유 흡광도의 특징을 갖는다. 나일 레드는 세포나 조직을 염색하는 비 수용성의 염색 물질로 사용되고 있고, 분광학적으로 최대 여기 파장 (excitation maximum)은 549nm 이고 최대 방사 파장 (emission maximum)은 628nm 의 특징을 갖는다.
[51]
다른 실시예에서, 비수용성의 복합물 염색 물질은 양이온성 제 1 염색 물질과 음이온성 제 2 염색 물질을 용매에 각각 용해한 후 혼합하여, 이온 결합을 통해 수득된 비수용성 염색 물질 복합체일 수 있다.
[52]
여기서, 제 1 염색 물질과 제 2 염색 물질은 전술한 바와 같이 특별히 순서를 나타내는 것은 아니며, 이종의 염색 물질을 지칭하기 위하여 사용된 용어이다. 제 1 염색 물질은 수용성 물질로서, 수용액에서 양이온성(염기성)의 특성을 가지는 염색 물질이고, 제 2 염색 물질은 수용성 물질로서, 수용액에서 음이온성(산성)의 특성을 가지는 염색 물질이다.
[53]
제 1 염색 물질은 이에 한정되는 것은 아니지만, 일 예시에서 인디고 카민(indigo carmine), 메틸렌 블루(Methylene Blue), 인도시아닌 그린(Indocyanine Green), 톨로이딘 블루(Toluidine Blue) 및 로다민 B(Rhodamine B)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 염색 물질을 포함한다.
[54]
제 2 염색 물질은 이에 한정되는 것은 아니지만, 일 예시에서 인도시아닌 그린(Indocyanine Green) 및 메틸렌 블루(Methylene Blue)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 염색 물질이다.
[55]
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 수용성의 두 염색 물질을 각각 수용액에 용해하여 수득한 양이온과 음이온으로 이온화된 염색 물질들을 이온 결합을 통해 결합시킨 비 수용성의 복합체를 형성하는 방법에 대한 모식도이다. 도 3에 도시한 바와 같이, 예를 들어, 제 1 염색 물질을 용매에 용해하고, 제 2 염색 물질을 용매에 용해한 후, 두 용액을 혼합하여, 복합체를 형성한다. 또한, 복합체의 형성으로 하층에 침전된 형성물을 제외한 상층액의 미 반응 용액을 제거한 다음, 신선한 3차 증류수로 재분산과 원심 분리를 반복 수행하여, 침전물에 포함된 미 반응물을 세척한다. 이 후, 동결 건조를 수행하여 염색 물질 복합체를 수득한다.
[56]
즉, 본래 수용성 성질을 가지고 있었지만, 수용액 내에서 이온화되어 양이온 또는 음이온의 특성을 가지는 염색 물질들을 서로 이온 결합으로 결합시켜 비수용성 성질로 바뀐 복합체를 제조하는 것이다.
[57]
또한, 일 예시에서, 폴리소르베이트 80(polysorbate 80)과 대두 오일(soybean oil)은 중량비로 99:1 내지 60:40로 혼합되는 것이 바람직하고, 폴리소르베이트 80 및 대두 오일 전체 100 중량부 대비 비수용성 염색 물질은 0.01 내지 0.1 중량부로 포함되는 것이 바람직하다. 이러한 혼합비율는, 본 발명이 의도하는 전술한 효과를 발휘할 수 있는 혼합비의 일 예시이다.
[58]
이를 통하여, 제 1 혼합물을 형성할 수 있다. 제 1 혼합물은 전술한 폴리소르베이트 80(polysorbate 80), 대두 오일(soybean oil) 및 비수용성 염색 물질이 혼합된 용액으로서, 이물감이 없이 투명하고 균일한 특징을 갖는다.
[59]
그리고, 제 1 혼합물과 삼중 블록 공중합체를 혼합한 후 가열하여, 제 2 혼합물을 형성한다(S20).
[60]
여기서, 삼중 블록 공중합체는 친수성 그룹과 소수성 그룹이 결합된 공중합체이며, 폴락사머 188인 것이 바람직하다. 폴록사머(Poloxamer)는 Poly(oxyethylene)-poly(oxypropylene)-poly(oxyethylene)[POE-POP-POE]의 중합체이다. 폴락사머는 실온에서 고체이고, 물과 에탄올에 용해성이며, 폴록사머 용액은 낮은 온도에서는 액상이나 온도가 올라가면 점도가 올라가고 농도가 높은 경우 온도에 따른 졸(sol)-겔(gel)의 요변성을 나타내고 점막세포막을 손상하지 않는다. 폴락사머 68, 127, 188, 237, 338, 및 407 등이 시판되고 있다. 예를 들어 폴락사머 188이란 b가 30이고 a 및 c의 합이 약 75인 화학식 1의 화합물로서 분자량은 약 8350인 폴락사머를 의미한다.
[61]
일반적으로, 친수성 그룹의 도입은 수용액 상태에서 오랜 시간 동안 물질과 유효 성분의 응집없이 균일하고 안정하게 분산되도록 하는 기능성을 부여하기 위한 것이며, 추가로 혈관에 투여시 체 순환성 (body circulation) 을 높여 원하는 질환 부위로 전달하는 중요한 기능성을 부여하기 위해 필수적이다. 그러나 본 발명은 혈관으로 투여하는 제제 보다는 세포나 조직에 투과 및 흡수될 수 있도록, 친수성 그룹이 도입되는 것으로, 수용액에서 초 미립 나노 크기(8nm 내지 10nm)를 갖는 입자가 안정하고 균일하게 분산되도록 하는 기능을 부여하기 위한 깃이다. 그리고, 소수성 그룹의 도입은 같은 물리적 성질을 가지고 있는 비 수용성의 유효 성분(다양한 약물 또는 염색 물질)을 나노 플랫폼 내부(core)에 탑재하기 위해 필수적인 요소이다.
[62]
또한, 가열 온도는 55℃ 내지 65℃인 것이 바람직하다. 가열 온도가 55℃도 미만인 경우에는 삼중 블록 공중합체의 용융점보다 낮아 용융이 되지 않아 제 1 혼합물과 섞이지 못하는 문제점이 있고, 65℃를 초과하는 경우에는 삼중 블록 공중합체와 유효 성분이 분해되는 문제점이 있다.
[63]
이를 통하여, 제 2 혼합물을 형성할 수 있다. 제 2 혼합물은 전술한 폴리소르베이트 80(polysorbate 80), 대두 오일(soybean oil) 및 비수용성 염색 물질이 혼합된 용액에 삼중 블록 공중합체를 투입한 것으로, 이 역시 투명하고 균일한 특징을 갖는다.
[64]
그리고, 제 2 혼합물을 냉각하여, 나노 플랫폼 고형물을 형성한다(S30).
[65]
여기서, 냉각 온도는 0℃ 내지 10℃인 것이 바람직하다. 냉각 온도가 10℃를 초과하는 경우에는 제 2 혼합물이 서서히 냉각되어 입자의 결정화도 낮아져 입자 크기의 균일성이 낮아지는 문제점이 있다.
[66]
이를 통하여, 나노 플랫폼 고형물을 형성할 수 있다. 나노란 의미는 전술한 바와 같이, 1 내지 1,000nm의 크기를 의미할 수 있다. 나노 플랫폼은 전술한 비수용성 염색 물질이 탑재할 수 있는 전달체 또는 비히클(vehicle)이 될 수 있다. 이는 본 발명이 속한 기술 분야에서 적용될 수 있는 약물 또는 조영제 등의 전달체를 포함할 수 있다.
[67]
그리고, 나노 플랫폼 고형물을 용매에 혼합하여, 제 3 혼합물을 형성한다(S40).
[68]
여기서, 용매는 3차 증류수이다. 이 용매는 나노 플랫폼 고형물이 용해되며, 유효 성분이나 함께 포함된 물질들이 응집되어 대부분 이물감이 발생되지 않고 균일하고 안정하게 분산되는 특징을 갖는다.
[69]
본 발명에서는 유기 용매를 이용하지 않는 것이 특징 중 하나이다. 유기 용매를 사용할 경우 유효성분이 탑재된 제제의 형태가 붕괴되어 사용할 수 없게 된다. 또한, 붕괴가 발생하지 않더라도, 유기용매를 제거해야하는 단계가 필수로 포함되어야 하고 혹시 사용된 용매의 잔류에 따른 체내 독성 유발의 가능성이 있다.
[70]
3차 증류수를 사용할 경우 제조 과정에서의 용매에 의한 독성 유발의 가능성이 전혀 없기 때문에, 생체 친화성이 높으며, 리포좀이나 고분자 기반의 나노 플랫폼을 제조하기 위해 많이 활용되고 있는 기존의 유기용매를 사용하는 방법(자기조립 유화 공정(self-assembly emulsification)과 차별성이 있다.
[71]
이를 통하여, 제 3 혼합물을 형성할 수 있다. 제 3 혼합물은 투명하고 균일한 특징을 갖는다.
[72]
그리고, 제 3 혼합물로부터 불순물을 제거한다(S50). 불순물을 제거하는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속한 기술분야에서 적용되는 방법이라면 어떠한 방법도 적용될 수 있다. 예를 들어, 0.2㎛ 내지 1.2㎛ 필터, 0.5㎛ 내지 1.1㎛ 필터, 0.6㎛ 내지 1.0㎛ 필터, 0.7㎛ 내지 0.9㎛ 필터, 0.8㎛ 필터로 불순물을 제거할 수 있다.
[73]
그리고, 불순물이 제거된 제 3 혼합물을 동결건조하여, 나노 복합체를 형성한다(S60).
[74]
동결건조는 수분을 제거하는 방법으로서, 물체를 얼린 다음에 주위의 기압을 낮춰서 고체 상태의 물이 기체로 승화하도록 제어하는 방법이다. 여기서, 동결건조의 구체적을 제시하지 않았으나, 본 발명이 속한 기술 분야에서 적용가능한 동결건조 방법을 적용할 수 있음은 자명하다.
[75]
이를 통하여, 고체 형태의 나노 복합체를 형성할 수 있다. 나노 복합체는 유효 성분 고유의 색상을 가지고 있고 분광학적 고유 특성을 유지하는 특징을 갖는다.
[76]
본 발명의 다른 실시예는 이러한 나노 복합체로 이루어지며, 구체적으로, 유기 발광 염료 및 이의 탑재를 위한 나노플랫폼을 포함하며, 1nm 내지 100nm, 바람직하게는 1nm 내지 90nm, 바람직하게는 1nm 내지 80nm, 바람직하게는 1nm 내지 70nm, 바람직하게는 1nm 내지 60nm, 바람직하게는 1nm 내지 50nm, 바람직하게는 1nm 내지 40nm, 바람직하게는 1nm 내지 30nm, 바람직하게는 1nm 내지 20nm, 바람직하게는 3nm 내지 15nm, 바람직하게는 5nm 내지 12nm, 바람직하게는 7nm 내지 10nm, 가장 바람직하게는 8nm 내지 9nm의 평균 직경을 갖는 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 진단 제제를 제공할 수 있다.
[77]
전술한 바와 같이, 나노 복합체의 평균 직경이 지나치게 큰 경우, 예를 들어 100nm를 초과하는 경우에는 종양 등의 조직에서의 직접 흡수가 어려워 본 발명이 의도하는 도포방식에 적용될 수 없다. 즉, 본 발명은 전술한 바와 같이, 나노 복합체의 평균 직경을 초미립으로 제어하여, 종래의 일부 문헌에 기재된 나노 크기의 전달체에서 구현할 수 없었던 직접 도포 방식에 최적화된 나노플랫폼을 제공할 수 있다.
[78]
진단 제제 물질이 나노 크기를 가지지 못할 경우, 조직 내로 투과 및 흡수율이 높지 않기 때문에, 전술한 범위의 평균 직경을 갖는 것은 중요한 요소이다. 전술한 크기를 통하여, 때문에 일반 조직에 비해 종양 조직에 더 많이 흡수 및 투과되어 종양을 구분할 수 있다.
[79]
또한, 나노 플랫폼에 탑재되는 물질의 필수 조건은 앞서 전술한 바와 같이, 비 수용성의 성질을 가지고 있어야 하며, 비 수용성 유효 물질은 에탄올, 메탄올, 아세톤 및 DMSO 등의 유기 용매를 사용하지 않으면 거의 녹지 않는다. 또한 3차 증류수에서는 전혀 섞이지 못하고 부유하거나 가라앉기 때문에 불균일하다.
[80]
또한, 본 발명의 다른 실시예는 전술한 진단 제제가 주사 용액 또는 완충 용액에 분산된 진단 제제 용액을 제공할 수 있다. 진단 제제 용액은 균일하고 투명한 특징을 갖는다.
[81]
이를 통하여, 염증에 의해 변형된 비 정상조직 또는 종양에만 선택적으로 전달되어 염색이 가능한 나노 기반의 진단 제제를 제공할 수 있다.
[82]
또한, 진단 제제를 질환이 발생된 특정 부위와 무관하게 전체적으로 도포하고, 생리 식염수로 세척하면 일반 정상 조직에 비해 염증에 의해 변형된 비정상 조직 및 종양 조직에 표지 제제의 투과 및 흡수율이 높아 선택적 염색이 가능하여 질환 부위의 정밀 염색(진단)이 가능하다.
[83]
또한, 진단 제제를 목적에 맞는 용액(주사 용수, 완충 용액, 증류수 등)에 균일하게 분산시킨 후 혈관을 통해 투여하거나 종양 조직에 직접 도포를 함으로써, 일반 정상 조직과 종양 조직을 정밀하게 구분할 수 있다.
[84]
여기서, 주사 용수의 일 예시로서, 0.5% 내지 1.3%의 NaCl 용액, 바람직하게는 0.6% 내지 1.2%의 NaCl 용액, 바람직하게는 0.7% 내지 1.1%의 NaCl 용액, 바람직하게는 0.8% 내지 1.0%의 NaCl 용액, 가장 바람직하게는 0.9%의 NaCl 용액을 사용할 수 있다. 또한, 2% 내지 8%의 glucose 용액, 바람직하게는 3% 내지 7%의 glucose 용액, 바람직하게는 4% 내지 6%의 glucose 용액, 가장 바람직하게는 5%의 glucose 용액을 사용할 수 있다.
[85]
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세히 설명한다.
[86]
[87]
실험예 1. 수용성의 메틸렌 블루(methylene blue)와 인도시아닌 그린(indocyanine green)의 이온쌍결합(이온 결합)을 이용한 비수용성 염색 물질 복합체의 제조
[88]
상온에서 20mL의 3차 증류수에 0.1g의 메틸렌 블루와 0.1g의 인도시아닌 그린을 각각 완전히 용해시킨 다음, 메틸렌 블루 수용액을 교반 상태에서 인도시아닌 그린 수용액을 첨가한 후 원심 분리를 수행하였다. 복합체가 형성되었으며, 하층에 침전된 형성물을 제외한 상층액의 미 반응 용액을 제거한 다음, 신선한 3차 증류수로 재 분산과 원심 분리를 반복 수행하여, 침전물에 포함된 미 반응물을 세척하였다. 그 후, 동결 건조를 수행하여, 조직 염색을 위한 비수용성의 메틸렌 블루/인도시아닌 그린 염색 물질 복합체를 제조하였다.
[89]
[90]
실험예 2. 고분자 용융 상전이 현상을 이용한 비 수용성 염색 물질이 탑재된 나노 기반 표지 제제의 제조
[91]
고분자의 용융 상전이 현상을 이용하여 비 수용성 염색 물질이 탑재된 나노 기반 표지 제제를 제조하기 위해, 실험예 1에서 제조된 0.01g의 비수용성 염색 물질을 0.6g 에 해당되는 soybean oil 과 Tween 80 을 첨가한 후 균일하고 투명한 상태가 되도록 상온에서 충분히 교반하였다. 그 다음, 0.4g의 F68 을 첨가하고 60℃로 가열한 상태에서 균일하고 투명한 용액이 제조되도록 충분히 교반하여 혼합하고, 냉각시켜 고체 형태로 제조하였다. 제조된 고형물을 3차 증류수에 녹이고 0.8㎛ 필터로 여과시켜, 나노 기반 진단 제제에 탑재되지 못한 비수용성의 응집된 염색 물질을 제거하였다. 또한, 추후 진행될 실험 예정에 따라 0.2㎛ 여과 멸균도 진행하였으며, 여과된 용액은 동결 건조를 진행하여 최종적으로 안정하게 염색 물질이 탑재된 진단 제제를 얻었다.
[92]
이렇게 제조된 염색 물질이 탑재된 진단 제제는 수용액에서 쉽게 용해되어 평균 입자 크기를 측정하였으며, 그 측정 결과 약 10nm의 직경을 갖는 것을 확인하였다.
[93]
상기 동일한 방식으로 수용성 염색 물질들의 이온쌍 결합(이온 결합)을 이용한 비 수용성 복합체 뿐만 아니라, 물질 고유의 수용액에서의 용해도가 비 수용성인 커큐민 (curcumin)과 나일 레드 (Nile red) 등을 사용하여 나노 제제에 탑재를 통해 범용성을 확인하였다. 그 결과, 비 수용성의 염색 물질 복합체 뿐만 아니라, 다양한 비 수용성 염색 물질도 나노 제제 내에 탑재가 가능함을 확인하였고, 수용액에서 분산도 잘 되기 때문에 특정 물질만 탑재되지 않고 다양한 물질이 탑재될 수 있어 범용성이 높음을 확인하였다.
[94]
[95]
실험예 3. 염색 물질이 탑재된 진단 제제가 수용액에 안정하게 분산되는지 확인
[96]
본 발명의 염색 물질이 탑재된 진단 제제가 수용액 등에 안정하게 분산되는지 확인하기 위하여, 실험예 1과 2에서 제조된 염색 물질이 탑재된 진단 제제의 순수 유효 물질과 이를 포함한 진단 제제가 수용액에 분산된 상태의 이미지를 도 3에 나타내었다.
[97]
도 3에 도시한 바와 같이, 각각의 진단 제제가 수용액 내에 안정하게 분산되었음을 확인하였다.
[98]
[99]
실험예 4. 염색 물질이 탑재된 진단 제제의 분광학적 특성 분석
[100]
염색 물질이 탑재된 진단 제제는 외부에서 물질 고유 파장에 맞는 광원에 의해서 활성화되어야 하므로 분광학적 특성이 유지되는지가 중요하다. 따라서 실험예 1 및 2에서 염색 물질이 탑재된 진단 제제를 3차 증류수에 분산 한 후 자외선-가시광선 분광기를 이용하여 흡광도를 확인하였으며, 도 5에 나타내었다.
[101]
도 5(A) 및(B)에 도시한 바와 같이, 진단 제제 내에 탑재된 염색 물질의 종류에 따라서 고유 흡수 파장이 잘 유지됨을 확인하였다.
[102]
[103]
실험예 5. 염색 물질이 탑재된 진단 제제의 혈장이 포함된 안정성 평가
[104]
염색 물질이 탑재된 진단 제제는 기본적으로 수용액에 균일하게 잘 분산되어야 하고, 일정 시간 동안 입자 크기 크게 변화하지 않고 유지되어야 한다. 또한, 체내에 전달할 경우에는 투여 경로에 따라 혈장에 접촉할 가능성이 높아 혈장(fetal bovine serum, FBS)이 존재하는 환경에서도 입자 크기가 유지되는 것이 전달하고자 하는 물질의 체내 안정성 확보를 위해 추가적으로 고려되어야 한다.
[105]
따라서 다양한 농도의 혈장이 포함된 전해질 용액(Phosphate buffered saline, PBS, pH7.4)에 실험예 1에서 제조된 염색 물질이 탑재된 진단 제제를 분산한 후, 입도분석기를 이용하여 입자 크기가 변화되는지 확인하였고, 그 측정 결과는 도 6에 나타내었다. 도 6에 도시한 바와 같이, 염색 물질이 탑재된 진단 제제는 다양한 혈장이 포함된 전해질 용액에서 입자 크기가 크게 증가되지 않고, 초기 입자 크기가 잘 유지되어 수용액 내 안정성이 확보되었음을 확인하였다.
[106]
[107]
실험예 6. 염색 물질이 탑재된 진단 제제의 다양한 세포에서 독성 평가
[108]
염색 물질이 탑재된 진단 제제는 치료 기능성이 없고 단순 세포 또는 조직을 염색하기 위한 기능성을 가지고 있기 때문에 낮은 독성을 가지고 있는 것이 중요하다. 실험예 1에서 제조된 염색 물질이 탑재된 진단 제제의 세포 수준에서 독성을 평가하기 위해 정상세포(NIH3T3)와 다양한 종양 세포(AGS, CT-26 및 HT-29)에서 다양한 농도와 처리 시간에 따른 변화를 확인하였고, 그 측정 결과를 도 7에 나타내었다.
[109]
도 7에 도시한 바와 같이, 다양한 농도와 세포 처리 시간에서 저 독성을 가지는 것을 확인하였다.
[110]
[111]
실험예 7. 염색 물질이 탑재된 진단 제제의 종양 세포내 유입 거동 평가
[112]
다양한 종양 세포 (AGS, CT-26 및 HT-29)를 사용하여 실험예 1에서 제조된 염색 물질이 탑재된 진단 제제의 세포 내로 유입 거동을 평가하기 위해, 일정 시간 동안 처리 후에 형광 현미경을 사용하여 영상을 얻었고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
[113]
도 8에 도시한 바와 같이, 염색 물질이 탑재된 진단 제제는 단 시간 안에 세포 내로 유입이 가능함을 확인하였고, 더욱이, 짧은 시간임에도 불구하고 세포질 뿐만 아니라 세포핵까지 전달이 되는 것을 확인하였다.
[114]
[115]
실험예 8. 종양 유발 동물 모델에서 염색 물질이 탑재된 진단 제제의 종양 축적성(표적성) 및 체내 분포 거동 평가
[116]
본 발명을 통해 제공하고자 하는 염색 물질이 탑재된 진단 제제는 종양 조직에 효과적으로 축적이 되어야 하고, 정상조직으로의 전달은 낮아 물질에 의한 부작용을 최소화하고자 한다. 종양 유발 동물 모델은 SCC-7 (squamous cell carcinoma) tumor cell-line (1x10^6개/head)을 쥐의 허벅지 피하에 이식하고 약 10일 후에 150mm^3 크기의 종양이 잘 형성된 그룹을 실험에 사용하였다. 그 다음 종양 유발 동물 모델의 꼬리 정맥을 통해 실험예 1에서 제조된 진단 제제를 투여하고 전신 순환 후 시간에 따른 종양의 축적성(표적성)과 최종 분석 평가 종료 후 주요 장기를 적출하고 염색 물질이 포함된 나노 기반 제제의 축적된 정도를 각각 실시간 형광 분석 장비(IVIS Spectrum In Vivo Imaging System, PerkinElmer)와 ex vivo 형광 분석 장비(KODAK Image Station 4000MM Digital Imaging System, Bruker BioSpin)를 통해 확인하였고, 그 결과를 도 9과 도 10에 각각 나타내었다.
[117]
도 9에 도시한 바와 같이, 종양 유발 동물 모델의 꼬리 정맥을 통해 투여된 염색 물질이 탑재된 진단 제제는 전신 순환을 거쳐 종양으로 빠른 시간 내에 축적되는 것을 확인하였다.
[118]
또한, 도 10에 도시한 바와 같이, 평가 종료 후 적출된 주요 장기에서 일반 정상 장기에는 거의 축적되지 않고 종양에 많이 축적되는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 신장에서도 물질이 검출이 되었는데, 이것은 투여된 염색 물질이 탑재된 진단 제제가 신장을 통해 제거되는 것을 확인함으로써, 체내에 불필요하게 축적되어 부작용을 발생시킬 문제점을 가지고 있는 않는다는 것을 알 수 있어, 전술한 기본 조건이 충족 가능함을 확인하였다.
[119]
[120]
실험예 9. 종양 유발 동물 모델의 종양에 염색 물질이 탑재된 진단 제제의 직접 도포를 통한 조직 염색 가능성 평가
[121]
종래의 국내외 나노 기반의 플랫폼을 이용한 진단 또는 진단/치료 관련 연구들에서는 의약품 개발을 목표로 이해하고 있기 때문에, 체내 전달 경로를 크게 경구, 비 경구로 진행하고 있고, 대부분의 경우 경구 흡수율이 거의 없거나 매우 낮아 보다 효율적인 비 경구 투여 방식을 선호하고 있다. 그러나 본 발명에서 제공하는 염색 물질이 탑재된 진단 제제는 기존 방식에 제한적으로 적용되는 것은 아니기 때문에, 사용자 편의성을 높이기 위해 직접 도포 방식도 함께 가능성을 평가하고자 하며 추후에 물질의 사용방법에 도포 방식을 추가로 포함하고자 한다.
[122]
이러한 특성을 확인하기 위하여, 동물의 꼬리 정맥을 통해 투여된 염색 물질이 탑재된 진단 제제의 종양 축적성 및 주요 장기 분포도 등의 평가 뿐만 아니라, 물질을 직접 도포했을 때에도 종양에 투과 및 흡수되어 종양 조직을 염색할 수 있는지 가능성을 평가하였다.
[123]
종양 유발 동물 모델에 형성된 종양의 피하를 제거하고, 그 위에 실험예 2에서 제조된 염색 물질이 탑재된 진단 제제를 도포하고 2~3회 정도로 3차 증류수를 사용하여 세척한 후 형광 영상장비(IVIS Spectrum In Vivo Imaging System, PerkinElmer)를 사용하여 조직에서 발현되는 형광 변화를 도 11에 나타내었다.
[124]
도 11에 도시한 바와 같이, 메틸렌 블루/인도시아닌 그린 형광 물질 복합체가 탑재된 나노 기반 표지 제제가 물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 형광 발현량이 현저 높음을 확인하였다. 이를 통하여, 본 발명에 따른 염색 물질이 탑재된 진단 제제는 정맥 투여 방법을 통한 종양의 진단 뿐만 아니라, 단순히 조직에 도포하는 것 만으로도 충분이 종양을 진단하여 정상 조직과의 구분이 가능하다는 것을 확인하였다.
[125]
[126]
실험예 10. 염색 물질이 탑재된 진단 제제의 종양 조직 내 흡수 기전 평가
[127]
염색 물질이 탑재된 진단 제제의 종양 조직으로의 흡수 기전을 알아보기 위해, 먼저 종양의 구조적 변화를 확인해 보았다.
[128]
FE-SEM(JSM-6700F, JEOL Ltd, Japan)을 이용하여 진단 제제가 처리되기 전/후의 조직의 형태를 40, 100, 500, 1000 배율로 각각 확인하였고, 그 결과는 도 12에 나타내었다. 도 12에 도시한 바와 같이, 종양이 생성되기 전에는 조직이 미세 기공이 존재하지만 조밀하고 기공 사이의 조직 벽들이 넓은 반면, 종양이 형성될 경우에는 많은 큰 기공들이 관찰되었고 조직 벽들은 정상과 비교해도 확실히 좁게 형성되었음이 확인하였다. 큰 기공들과 좁은 조직 벽을 갖는 종양 조직에 염색 물질이 탑재된 진단 제제를 도포할 경우 기공 내부 뿐만 아니라, 조직 벽에도 흡착되어 덮고 있는 형태가 관찰되었다. 조직 형태학적인 관점에서 실험 결과를 고려할 때 정상 조직에 비해 종양 형성에 따른 구조적 변이로 인해 본 발명의 나노 기반 제제가 흡수 및 흡착 될 수 있음을 확인하였다.
[129]
또한, 조직 형태학적 구조 측면에서 나노 기반 제제의 흡수 기전 뿐만 아니라, 살아있는 세포수준에서 흡수 기전을 평가하고자 하였다. 평가를 위해 5x10^4/well 의 Caco-2 cells 을 24-well plate 크기의 trans-wells (BD Biosciences)을 사용하여 세포를 3차원 배양하고 나노 기반의 진단 제제를 처리하여 흡수 기전을 확인하였고, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
[130]
도 13에 도시한 바와 같이, 어떠한 물질도 처리하지 않은 대조 군의 세포에서 auto-fluorescence 가 나타나지만, 나노 기반의 진단 제제를 처리한 그룹에 비해 상당히 낮으며, 나노 기반의 진단 제제를 처리한 경우 그물망 형태로 강한 형광이 발현되는 것을 확인하였다. tight junction 의 action 을 염색할 수 있는 FITC-phalloidin marker 를 사용하여 염색된 영상과 나노 기반의 진단 제제에 의해 염색된 영상을 겹쳐보니 일치하는 것으로 보아 본 발명에서 제공된 염색 물질이 탑재된 진단 제제는 tight junction 을 통해 흡수 가능한 것으로 확인되었다.
[131]
이러한 결과를 토대로 정리하면, 본 발명에서 제공된 염색 물질이 탑재된 진단 제제는 염증에 의해 변형된 종양 조직의 형태학적 차이와 작은 입자 크기로 인해 tight junction 을 통해 물질이 흡수되는 기전인 para-cellular pathway 를 통해 종양 조직을 효과적으로 진단 가능하다는 것을 확인하였다.
[132]
[133]
실험예 11. 종양에 직접 도포 방법을 통해 종양 조직 진단을 위해 진단 제제에 다양한 물질을 탑재함으로써 기술의 다양성 평가
[134]
종양이 염색될 경우 특정 염색 물질의 성질에 의존하지 않고 다양한 파장을 가지는 물질이 가능할 경우 여러 원하는 파장을 선별하여 염색이 가능하기 때문에 실험예 1에서 제조된 커큐민(curcumin, λ = 340~534nm)과 메틸렌 블루/인도시아닌 그린 형광 물질 복합체(λex = 700, 805nm) 뿐만 아니라, 광 역학적 치료제로 사용되는 Chlorin e6 (Ce6, λex = 408nm)를 나노 기반 제제에 탑재한 후 염증성 대장암 유발 동물 모델에 직접 도포하여 종양 진단이 가능한지 평가하였다.
[135]
Azoxymethane (AOM)/Dextran sulfate sodium (DSS)를 이용한 염증성 대장암 유발 동물 모델을 위한 실험을 실시하였으며, 5 내지 6 주령 C57BL/6 mice 에 AOM 10mg/kg 을 생리 식염수(또는 PBS (pH 7.4))에 용해하여 복강 (Intraperitoneal injection)에 5ml/kg 용량으로 투여하였고, AOM 투여 후 1 주일이 된 시점에 2 w/v. % Dextran sulfate sodium (DSS, Sigma, USA)을 음수에 용해시켜 1 주일간 투여하였다. 그리고 2 주일간의 휴식기를 가진 후, 2% DSS를 1 주간 음수로 투여한 다음 다시 2 주간의 휴식기를 가지는 방법으로 실시하였으며, 동물의 대장에 염증성 종양이 형성될 수 있도록 총 12 주 정도 기간 동안 사육을 한 후 실험을 진행하였다.
[136]
염증성 대장 종양 조직에 다양한 파장과 성질을 가지는 각각의 염색 물질을 탑재한 진단 제제를 처리하고, 형광 영상장비(IVIS Spectrum In Vivo Imaging System, PerkinElmer)를 사용하여 조직에서 발현되는 형광 변화를 도 14 내지 도 16에 각각 나타내었다. 도 14 내지 도 16 각각에 도시한 바와 같이, 나노 기반 제제 내에 탑재된 물질의 특성에 의존하지 않고, 염증성 비 정상 조직과 염증 유발에 의해 형성된 대장 종양 조직을 효과적으로 염색이 되는 것을 확인하였다. 이를 통하여, 본 발명에 따라 제조된 염색 물질이 탑재된 진단 제제는 세포 이식을 통해 형성된 종양, 염증성 비 정상 조직 및 염증 유발에 의해 형성된 종양 조직을 기존 정맥 투여 방식을 통한 진단 뿐만 아니라 단순 도포 방식을 통해 효과적으로 염색이 가능함을 확인하였다.
[137]
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

청구범위

[청구항 1]
폴리소르베이트 80(polysorbate 80), 대두 오일(soybean oil) 및 비수용성 염색 물질을 혼합하여, 제 1 혼합물을 형성하는 단계; 제 1 혼합물과 삼중 블록 공중합체를 혼합한 후 가열하여, 제 2 혼합물을 형성하는 단계; 상기 제 2 혼합물을 냉각하여, 나노 플랫폼 고형물을 형성하는 단계; 상기 나노 플랫폼 고형물에 용매를 혼합하여, 제 3 혼합물을 형성하는 단계; 상기 제 3 혼합물로부터 불순물을 제거하는 단계; 및 상기 불순물이 제거된 제 3 혼합물을 동결건조하여, 나노 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 나노 진단 제제의 제조 방법.
[청구항 2]
제1항에 있어서, 상기 비수용성 염색 물질은 커큐민(curcumin), FITC(fluorescein isothiocyanate), 나일 레드 (Nile red), Ce6 (Chlorin e6) 및 PpIX (Protoporphyrin IX)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 염색 물질인, 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 나노 진단 제제의 제조 방법.
[청구항 3]
제1항에 있어서, 상기 비수용성 염색 물질은 양이온성 제 1 염색 물질과 음이온성 제 2 염색 물질을 용매에 각각 용해한 후 혼합하여, 이온 결합을 통해 수득된 비수용성 염색 물질 복합체인, 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 나노 진단 제제의 제조 방법.
[청구항 4]
제3항에 있어서, 상기 제 1 염색 물질은 인디고 카민(indigo carmine), 메틸렌 블루(Methylene Blue), 인도시아닌그린(Indocyanine green), 톨로이딘 블루(Toluidine Blue) 및 로다민 B(Rhodamine B)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 염색 물질인, 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 나노 진단 제제의 제조 방법.
[청구항 5]
제3항에 있어서, 상기 제 2 염색 물질은 인도시아닌 그린(Indocyanine Green) 및 메틸렌 블루(Methylene Blue)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 염색 물질인, 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 나노 진단 제제의 제조 방법.
[청구항 6]
제1항에 있어서, 상기 제 2 혼합물을 형성하는 단계에서 가열 온도는 55℃ 내지 65℃인, 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 나노 진단 제제의 제조 방법.
[청구항 7]
제1항에 있어서, 상기 나노 플랫폼 고형물을 형성하는 단계에서 냉각 온도는 0℃ 내지 10℃인, 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 나노 진단 제제의 제조 방법.
[청구항 8]
제1항에 있어서, 상기 용매는 3차 증류수인, 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 나노 진단 제제의 제조 방법.
[청구항 9]
마이셀 구조의 나노 복합체로서, 상기 마이셀 구조의 내부 코어는 비수용성 염색 물질이 용해된 폴리소르베이트 80(polysorbate 80) 및 대두 오일(soybean oil)을 포함하고, 상기 마이셀 구조의 외부 쉘은 수용액에서 상기 내부 코어에 포함된 성분의 석출로 인한 응집없이, 균일한 입자를 형성하기 위한 삼중 블록 공중합체를 포함하며, 상기 나노 복합체의 평균 직경은 1nm 내지 100nm인 염증성 비정상 조직 또는 종양 조직의 선택적 염색이 가능한 나노 진단 제제.
[청구항 10]
제9항의 진단 제제가 주사 용액 또는 완충 용액에 분산된 진단 제제 용액.

도면

[도1]

[도2]

[도3]

[도4]

[도5]

[도6]

[도7]

[도8]

[도9]

[도10]

[도11]

[도12]

[도13]

[도14]

[도15]

[도16]