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1. WO2020117019 - ANTICORPS AGONISTE ANTI-C-MET ET UTILISATION ASSOCIÉE

Document

명세서

발명의 명칭

기술분야

1   2   3   4  

배경기술

5   6   7   8  

발명의 상세한 설명

기술적 과제

9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29   30   31   32  

과제 해결 수단

33   34   35   36   37   38   39   40   41   42   43   44   45   46   47   48   49   50   51   52   53   54   55   56   57   58   59   60   61   62   63   64   65   66   67   68   69   70   71   72   73   74   75   76   77   78   79   80   81   82   83   84   85   86   87   88   89   90   91   92   93   94   95   96   97   98   99   100   101   102   103   104   105   106   107   108   109   110   111   112   113   114   115   116   117   118   119   120   121   122   123   124   125   126   127   128   129   130   131   132   133   134   135   136   137   138   139   140   141   142   143   144   145   146   147   148   149   150   151   152   153   154   155   156   157   158   159   160   161   162   163   164   165   166   167   168   169   170   171   172   173   174   175   176   177   178   179   180   181   182   183   184   185   186   187   188   189   190   191   192   193   194   195   196   197   198   199   200   201   202   203   204   205   206   207   208   209   210   211   212   213   214   215   216   217   218  

발명의 효과

219   220  

도면의 간단한 설명

221   222   223   224   225   226   227   228   229   230  

발명의 실시를 위한 형태

231   232   233   234   235   236   237   238   239   240   241   242   243   244   245   246   247   248   249   250   251   252   253   254   255   256   257   258   259   260   261   262   263   264   265   266   267   268   269   270   271   272   273   274   275   276   277   278   279   280   281   282   283   284   285   286   287   288   289   290   291   292   293   294   295   296   297   298   299   300   301   302   303   304   305   306   307   308   309   310   311   312   313   314   315  

산업상 이용가능성

316  

청구범위

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16  

도면

1a   1b   2   3   4a   4b   5   6a   6b   6c   7   8a   8b   9a   9b   9c   9d  

명세서

발명의 명칭 : 항 c-Met 아고니스트 항체 및 이의 용도

기술분야

[1]
본 출원은 2018년 12월 7일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2018-0157355호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
[2]
[3]
본 발명은 항 c-Met 아고니스트 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인간 유래 c-Met 단백질에 특이적으로 결합하는 아고니스트 항체 또는 그 단편, 이의 생산방법, 이를 이용한 c-Met 특이적 검출 방법, 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물, 줄기세포 분화 유도용 조성물 및 줄기세포용 배양 배지에 관한 것이다.
[4]

배경기술

[5]
c-Met는 세포 표면에 존재하는 대표적인 RTK(Receptor Tyrosine Kinase)로써, 그 리간드인 HGF/SF(Hepatocyte Growth Factor/Scattering Factor)와 결합하여 세포 내 신호전달을 촉진시켜 세포의 성장을 촉진할 뿐 아니라 많은 종류의 암세포에 과 발현되어 암 발생, 암 전이, 암세포 이동, 암세포 침투, 신생 혈관 형성에도 광범위하게 관여한다. 또한 리간드의 이름이 의미하듯, HGF/SF를 통한 c-Met signaling은 거의 모든 종류의 epithelial tumor의 cell-cell contact를 약화시켜 scattering을 야기하는 대표적인 암 전이 초기단계의 단백질이다(Nat Rev Cancer. 2012 Jan 24;12(2):89-103). 특히, c-Met 유전자의 upstream에는 hypoxiaresponse element들이 존재하여, 산소결핍 상황에서 그 유전자의 발현이 증가함은 잘 알려져 있다 (Oral Oncol. 2006 Jul; 42(6):593-8). 또한, c-Met는 개시로부터 진행을 통해 전이까지 암 발생의 여러 단계에 기여하기 때문에, c-Met 및 그의 리간드 HGF는 표적화 암 요법을 위한 선도적인 후보가 되어 왔다([Comoglio et al. 2008. Nat Rev Drug Discov 7:504]; [Knudsen and Vande Woude 2008. Curr Opin Genet Dev 18:87]). 특히 c-Met는 기존에 알려진 항암제의 작용 기작에서 약물 내성에 관여됨이 알려지면서 더욱 더 개인맞춤형 치료에 중요성이 인식되고 있으며, c-Met는 항암제와 관련하여 다수의 제약사들이 주목하고 있는 표적 분자가 되고 있다.
[6]
[7]
최근에는 c-Met에 대한 항체는 길항제(antagonist)로서 항암제로의 개발이 많이 이루어져 왔으나, c-Met에 보다 높은 친화도를 가지고 특이적으로 결합할 수 있고, 인간 유래 서열로 이루어져 체내 투여 시 면역반응 유발 가능성이 낮으며, 보다 다양한 활성을 나타내는 c-Met 항체에 대한 개발이 요구된다.
[8]

발명의 상세한 설명

기술적 과제

[9]
이에, 본 발명자들은 c-Met을 표적으로 하면서도 다양한 생리활성을 나타내는 항체를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, c-Met을 표적으로 하도록, c-Met에 특이적으로 결합하는 인간으로부터 유래된 상보성 결정영역(CDR)과 프레임 워크 영역(FR)으로 구성된 인간항체가 HGF와 유사한 활성을 나타내며, 세포표면 분자인 c-Met과 결합하여 신호전달을 유도하는 아고니스트 항체로서의 기능을 수행할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
[10]
[11]
따라서 본 발명의 목적은 인간 유래 c-Met 단백질에 특이적으로 결합하는 아고니스트 항체 또는 그 단편을 제공하는 것이다.
[12]
[13]
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 벡터 및 벡터로 형질 전환된 세포를 제공하는 것이다.
[14]
[15]
본 발명의 또 다른 목적은 인간 c-Met에 결합하는 아고니스트 항체 또는 그 단편의 생산방법 및 c-Met 특이적 검출 방법을 제공하는 것이다.
[16]
[17]
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
[18]
또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그 단편으로 이루어지는 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
[19]
또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그 단편으로 필수적으로 이루어지는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
[20]
[21]
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 포함하는 줄기세포 분화 유도용 조성물 및 이를 포함하는 줄기세포용 배양 배지를 제공하는 것이다.
[22]
또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체로 이루어지는 줄기세포 분화 유도용 조성물 및 이를 포함하는 줄기세포용 배양 배지를 제공하는 것이다.
[23]
또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체로 필수적으로 이루어지는 줄기세포 분화 유도용 조성물 및 이를 포함하는 줄기세포용 배양 배지를 제공하는 것이다.
[24]
[25]
본 발명의 또 다른 목적은 암 예방 또는 치료용 제제를 제조하기 위한 상기의 항체 또는 그 단편의 용도를 제공하는 것이다.
[26]
[27]
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공하는 것이다.
[28]
[29]
본 발명의 또 다른 목적은 줄기세포 분화 유도용 제제를 제조하기 위한 상기의 항체의 용도를 제공하는 것이다.
[30]
[31]
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 항체를 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 줄기세포 분화 유도 방법을 제공하는 것이다.
[32]

과제 해결 수단

[33]
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L3를 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL) 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H3를 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH)을 포함하는 인간 유래 c-Met 단백질에 특이적으로 결합하는 아고니스트 항체 또는 그 단편을 제공한다.
[34]
[35]
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
[36]
[37]
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
[38]
[39]
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 벡터로 형질 전환된 세포를 제공한다.
[40]
[41]
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 세포를 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건하에서 배양하여, 경쇄 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계 및 상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 인간 c-Met에 결합하는 아고니스트 항체 또는 그 단편의 생산방법을 제공한다.
[42]
[43]
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키는 단계 및 상기 아고니스트 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는 c-Met 특이적 검출 방법을 제공한다.
[44]
[45]
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[46]
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편으로 이루어지는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[47]
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편으로 필수적으로 이루어지는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[48]
[49]
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항체를 포함하는 줄기세포 분화 유도용 조성물을 제공한다.
[50]
또한, 본 발명은 상기 항체로 이루어지는 줄기세포 분화 유도용 조성물을 제공한다.
[51]
또한, 본 발명은 상기 항체로 필수적으로 이루어지는 줄기세포 분화 유도용 조성물을 제공한다.
[52]
[53]
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기의 조성물을 포함하는 줄기세포용 배양 배지를 제공한다.
[54]
또한 본 발명은 상기의 조성물로 이루어지는 줄기세포용 배양 배지를 제공한다.
[55]
또한 본 발명은 상기의 조성물로 필수적으로 이루어지는 줄기세포용 배양 배지를 제공한다.
[56]
[57]
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 암 예방 또는 치료용 제제를 제조하기 위한 상기의 항체 또는 그 단편의 용도를 제공한다.
[58]
[59]
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기의 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.
[60]
[61]
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 줄기세포 분화 유도용 제제를 제조하기 위한 상기의 항체의 용도를 제공한다.
[62]
[63]
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기의 항체를 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 줄기세포 분화 유도 방법을 제공한다.
[64]
[65]
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
[66]
[67]
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L3를 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL) 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H3를 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH)을 포함하는 인간 유래 c-Met 단백질에 특이적으로 결합하는 아고니스트 항체 또는 그 단편을 제공한다.
[68]
[69]
본 발명의 ‘c-Met 단백질’은 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF)의 수용체이며, HGF는 c-Met 수용체 티로신 키나제의 세포외 부위에 결합하여 다양한 정상세포와 종양세포에서 분열, 운동, 형태발생, 혈관형성을 유발하는 사이토카인의 일종이다. c-Met은 세포 표면에 존재하는 대표적인 수용체 티로신 키나제(receptor tyrosine kinase)로, 그 자체가 암유발 유전자이며, 때로는 리간드인 HGF와 상관 없이도 암발생, 암전이, 암세포 이동, 암세포 침습, 신생혈관 생성 등과 같은 종양과 관련된 여러 가지 기작에 관여하는 단백질이다. 상기 단백질은 서열번호 7(NCBI Reference Sequence: NM_001127500.2)로 표시되는 뉴클레오타이드 서열(mRNA)에 의해 암호화된 폴리펩타이드, 또는 그의 세포외 도메인을 포함하며, 서열번호 8(NCBI Reference Sequence: NP_001120972.1)로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다.
[70]
[71]
본 발명의 ‘항체’, ‘항 c-Met 항체’, ‘인간화 항 c-Met 항체’ 및 ‘변형 인간화 항 c-Met 항체’, ‘anti-c-Met antibody’는 본 발명에서 가장 광의의 의미로 사용되며, 구체적으로 단일클론 항체(모노클로날 항체, 완전 길이 단일클론항체 포함), 다클론 항체(폴리클로날 항체), 다중특이 항체(예를 들어 이중특이 항체), 및 항체 단편(예를 들어. 가변 영역 및 목적하는 생물 활성(예를 들어 c-Met와의 결합)을 나타내는 항체의 다른 부분)을 포함한다.
[72]
[73]
본 발명의 항체는 c-Met와 선택적으로 결합할 수 있도록 특정 아미노산 서열이 경쇄 및 중쇄 CDR에 포함되어 있는 항체로 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 모두 포함하며, 바람직하게는 모노클로날 항체일 수 있다. 또한 본 발명의 항체는 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간항체를 모두 포함하며 바람직하게는 인간항체 일 수 있다.
[74]
[75]
본 발명의 모노클로날 항체는 실질적으로 동질 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 나타내며, 즉, 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연적으로 존재하는 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원 에피토프에 매우 특이적으로 결합한다.
[76]
[77]
본 발명에서 ‘모노클로날’이라는 말은 항체가 실질적인 상동성 집단으로부터 수득되는 것과 항체의 특성을 나타내는 말이며, 반드시 항체를 특정 방법에 의해 생산해야 한다는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명의 모노클로날 항체는 문헌(Kohler et al.(1975) Nature 256: 495))에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법(참조: 미국 특허 제4,816,567호)에 의해 제조할 수 있다. 또한, 예를 들어, 당업계에 공지된 기술을 사용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 분리할 수 있다.
[78]
[79]
본 발명의 항체는 구체적으로 키메라 항체를 포함하며, 이 경우 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 기원하거나 또는 특정 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성을 보이지만, 나머지 부분은 본 발명의 항체가 바람직한 생물학적 활성(예를 들어 NRS와의 선택적 결합)을 나타내는 한, 다른 종으로부터 기원하거나 또는 다른 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성을 나타내는 것이어도 무방하다(미국 특허 제4,816,567호).
[80]
[81]
인간화된 항체는 인간 및 비-인간(예: 쥐, 랫트) 항체의 서열을 모두 포함하는 항체로 일반적으로, 에피토프와 결합하는 부위(CDR)를 제외한 나머지 부분은 인간 항체의 것이며, 에피토프와 결합하는 부위(CDR)는 비-인간 유래의 서열을 포함할 수 있다. 완전한 인간항체는 사람 면역글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체를 말하며, 마우스, 마우스 세포, 또는 마우스 세포로부터 기원한 하이브리도마에서 생산하거나, 파지 디스플레이 방법으로 생산할 수 있다.
[82]
[83]
생체에서 생산되는 천연 항체는 통상적으로, 2개의 동일한 경쇄(L)와 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종-사량체성 당단백질이다. 각 경쇄는 1개의 공유 디설파이드 결합에 의해 중쇄와 연결되지만, 디설파이드 연쇄수는 상이한 면역글로불린 이소형의 중쇄들 간에 다양하다. 각 중쇄 및 경쇄는 규칙적으로 이격된 쇄내 디설파이드 브릿지를 또한 갖고 있다. 각 중쇄는 한 말단에 가변 도메인(VH)에 이어 수많은 불변 도메인을 갖는다. 각 경쇄는 한 말단에 가변 도메인(VL)을 갖고, 그의 다른 말단에 불변 도메인을 갖는데; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특별한 아미노산 잔기가 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 간에 계면을 형성하는 것으로 여겨진다. 항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 중쇄의 가변 영역은 "VH"로 기재하며, 경쇄의 가변 영역은 "VL"로 기재한다. 이들 도메인은 일반적으로, 항체의 가장 가변 부분이고, 항원 결합 부위를 포함한다.
[84]
[85]
본 발명에서 ‘초가변성(hypervariable)’은 상기 가변 영역 내의 몇몇 서열들이 항체들간 서열에 있어서 광범위하게 상이하며 그의 특이적인 항원 결정인자들에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 직접적으로 관련되는 잔기들을 포함한다는 사실을 지칭한다. 경쇄 및 중쇄 가변 영역 모두에 있어서 초가변성은 상보성 결정부위(CDR) 또는 초가변성 루프(HVL)로서 공지된 3 개의 분절들에 집중된다. CDR은 문헌(Kabat 등, 1991, In: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.)에서의 서열 비교에 의해 한정되는 반면, HVL은 문헌(Chothia and Le나 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917)에 개시된 바와 같이, 상기 가변 영역의 3차원 구조에 따라 구조적으로 한정된다.
[86]
[87]
상기 중쇄 및 경쇄 각각 내의 3 개의 CDR들은 틀 부위(FR)에 의해 분리되며, 상기 부위는 덜 가변적인 경향이 있는 서열들을 포함한다. 상기 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노 말단에서부터 카복시 말단까지, 상기 FR 및 CDR은 하기의 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 상기 FR의 큰 β 시트 배치는 상기각각의 쇄 내부의 CDR을 서로뿐만 아니라 다른 쇄로부터의 CDR에 가깝게 한다. 생성되는 형태는 항원 결합 부위에 기여하지만, 모든 CDR 잔기들이 항원 결합에 직접 관여할 필요는 없다.
[88]
[89]
본 발명의 상기 단편은 디아바디, Fab, Fab′, F(ab)2, F(ab′)2, Fv 및 scFv로 이루어진 군에서 선택되는 단편인 것을 특징으로 한다.
[90]
[91]
본 발명에서 항체의 단편은 전체 항체의 항원 특이적 결합력을 유지하고 있는 항체의 단편을 의미하며, 바람직하게 상기 단편은 모항체의 인간 유래 c-Met 단백질 친화도의 적어도 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 또는 그 이상을 보유한다. 구체적으로는 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디(diabody), scFv 등의 형태일 수 있다.
[92]
Fab(fragment antigen-binding)는 항체의 항원 결합 단편으로, 중쇄와 경쇄 각각의 하나의 가변 도메인과 불변 도메인으로 구성되어 있다. F(ab')2는 항체를 펩신으로 가수분해시켜서 생성되는 단편으로, 두 개의 Fab가 중쇄 경첩(hinge)에서 이황결합(disulfide bond)으로 연결된 형태를 하고 있다. F(ab')는 F(ab')2 단편의 이황결합을 환원하여 분리시킨 Fab에 중쇄 경첩이 부가된 형태의 단량체 항체 단편이다. Fv(variable fragment)는 중쇄와 경쇄 각각의 가변영역으로만 구성된 항체 단편이다. scFv(single chain variable fragment)는 중쇄가변영역(VH)과 경쇄가변영역(VL)이 유연한 펩티드 링커로 연결되어 있는 재조합 항체 단편이다. 디아바디(diabody)는 scFv의 VH와 VL가 매우 짧은 링커로 연결되어 서로 결합하지 못하고, 동일한 형태의 다른 scFv의 VL와 VH와 각각 결합하여 이량체를 형성하고 있는 형태의 단편을 의미한다.
[93]
[94]
본 발명의 목적상 항체의 단편은 인간 유래 c-Met 단백질에 대한 결합특이성을 유지하고 있는 것이라면 구조나 형태의 제한을 받지 않지만, 바람직하게 scFv일 수 있다. 본 발명에 따른 scFv는 상기한 인간 유래 c-Met 단백질에 특이적인 CDR 구성, 또는 VH와 VL의 구성을 갖는 것으로서 VH의 C-말단과 VL의 N-말단이 링커를 통해 연결된 것이라면 그 서열이 특별히 제한되지 않는다. 상기 링커는 당 업계에 scFv에 적용되는 링커로서 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않는다.
[95]
[96]
본 발명의 항체 또는 그 단편은 이의 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않는 보존적 아미노산 치환(항체의 보존적 변이체라고 함)을 포함할 수 있다.
[97]
[98]
또한 전술한 본 발명의 항체 또는 그 단편은 효소, 형광 물질, 방사선 물질 및 단백질 등과 접합된 것일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 항체에 상기 물질을 접합하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
[99]
[100]
본 발명의 항체는 인간을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함한 임의의 동물로부터 유래한 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 인간, 생쥐, 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니피그, 낙타, 말 또는 닭의 항체일 수 있으며, 가장 바람직하게는 인간 또는 생쥐일 수 있다.
[101]
[102]
인간 항체는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 가진 항체로서, 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 분리된 항체 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대하여 형질 이식되고 내재적 면역글로불린은 발현하지 않는 동물로부터 분리된 항체가 포함된다(미국특허 제 5,939,598호 참조).
[103]
[104]
본 발명의 항체는 효소, 형광 물질, 방사선 물질 및 단백질 등과 접합된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 항체에 상기 물질을 접합하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
[105]
[106]
본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
[107]
[108]
본 발명에서 ‘폴리뉴클레오티드’는 올리고뉴클레오티드 또는 핵산으로 기재될 수도 있으며, DNA분자들(예를 들어, cDNA 또는 유전체(genomic DNA), RNA 분자들(예를 들어, mRNA), 뉴클레오티드 유사체들을 사용하여 생성된 상기 DNA 또는 RNA의 유사체들(예를 들어, 펩티드 핵산들 및 비-자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 유사체들) 및 이들의 하이브리드들이 포함된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥(single-stranded) 또는 이중-가닥(doublestranded)이 될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 상기한 KRS N-말단 영역에 특이적인 CDR 구성, 또는 VH와 VL의 구성을 갖는 중쇄 및 경쇄로 이루어지는 항체를 암호화하는 염기서열을 의미한다.
[109]
[110]
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 것이면 그 서열이 특별히 제한되지 아니하는 것으로서, 앞서 설명한 본 발명에 따른 항체에서 전술한 CDR 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 그 서열이 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 서열번호 1(중쇄 CDR1), 서열번호 2(중쇄 CDR2), 서열번호 3(중쇄 CDR3), 서열번호 4(경쇄 CDR1), 서열번호 5(경쇄 CDR2), 서열번호 6(경쇄 CDR3)으로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한 본 발명에 따른 항체에서 전술한 VH와 VL을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 그 서열이 특별히 제한되지 않는다.
[111]
[112]
본 발명의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 당 업계에 잘 알려진 방법에 의하여 얻어질 수 있다. 예를 들어, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄의 일부분 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열 또는 해당 아미노산 서열에 근거하여, 당 분야에 잘 알려진 올리고뉴클레오타이드 합성기법, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(PCR)법 등을 사용하여 합성할 수 있다.
[113]
[114]
본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
[115]
[116]
본 발명의 ‘벡터(vector)’는 본 발명의 항체 또는 그 단편의 재조합 생산을 위하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 복제 또는 발현의 목적으로 이용되며, 일반적으로 시그날 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 벡터는 바람직하게는 발현벡터일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 조절시퀀스, 예를 들어 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터일 수 있다.
[117]
[118]
벡터의 일종인 플라스미드(plasmid)는 외부의 폴리뉴클레오티드 단편들이 결합될 수 있는 선형 또는 원형의 이중 나선의 DNA 분자를 의미한다. 벡터의 다른 형태는 바이러스성 벡터(viral vector; 예를 들어, 복제-결핍 레트로바이러스(replication defective retroviruses), 아데노바이러스들 및 아데노-연관 바이러스들(adeno associated viruses))이며, 여기에서 부가의 DNA 단편들은 상기 바이러스성 게놈(viral genome) 내로 도입될 수 있다. 특정의 벡터들은 그 안으로 이들이 도입되는 숙주세포(예를 들어, 박테리아 유래(bacterial origin) 및 에피좀의 포유류 벡터(episomal mammalian vectors)를 포함하는 박테리아성 벡터들(bacterial vectors)) 내에서의 자가복제(autonomous replication)를 할 수 있다. 다른 벡터들(예를 들어, 비-에피좀의 포유동물 벡터들(non-episomal mammalian vectors))이 숙주세포 내로의 도입에 의한 숙주세포의 게놈 내로 통합(integrated)되고 그리고 그에 의하여 상기 숙주 게놈과 함께 복제된다.
[119]
[120]
본 발명에서 ‘발현벡터(expression vector)’는 선택된 폴리뉴클레오티드의 발현할 수 있는 벡터의 한 형태이다. 하나의 폴리뉴클레오티드 시퀀스는, 조절 시퀀스가 상기 폴리뉴클레오티드 시퀀스의 발현(예를 들어, 수준, 타이밍 또는 발현의 위치)에 영향을 주는 경우, 상기 조절 시퀀스(regulatory sequence)에 "작동가능하게 연결"된다. 상기 조절 시퀀스는 그것이 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현(예를 들어, 수준, 타이밍 또는 발현의 위치)에 영향을 주는 서열이다. 상기 조절 시퀀스는, 예를 들어, 조절된 핵산에 직접적으로 또는 하나 또는 그 이상의 다른 분자들(예를 들어, 상기 조절 시퀀스 및/또는 상기 핵산에 결합하는 폴리펩티드들)의 작용을 통하여 그의 영향이 미치도록 할 수 있다. 상기 조절 시퀀스에는 프로모터(promoters), 인핸서(enhancers) 및 다른 발현 조절 요소들이 포함된다. 본 발명의 벡터는 바람직하게는 pOptiVEC™-TOPO 및 pcDNA™3.3-TOPO일 수 있다.
[121]
[122]
본 발명은 상기 벡터로 형질 전환된 세포를 제공한다.
[123]
[124]
본 발명의 세포는 본 발명의 발현 벡터에 포함된 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는데 사용될 수 있는 세포라면 그 종류는 특별히 제한되지 아니한다. 본 발명에 따른 발현 벡터로 형질 전환된 세포(숙주세포)는 원핵생물(예를 들어, 대장균), 진핵생물(예를 들어, 효모 또는 다른 균류), 식물 세포(예를 들어, 담배 또는 토마토 식물 세포), 동물 세포(예를 들어, 인간 세포, 원숭이 세포, 햄스터(hamster) 세포, 랫 세포(rat cell), 마우스 세포(mouse cell), 곤충 세포 또는 이들에서 유래한 하이브리도마일 수도 있다. 바람직하게는 인간을 포함하는 포유류에서 유래한 세포일 수 있다.
[125]
[126]
본 목적에 적합한 원핵생물은 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아새(Enterobacteriaceae), 예를 들어 에스케리치아(Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이( E. coli), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무륨( Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스( Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella), 및 바실리(Bacilli), 예를 들어, 비. 섭틸리스( B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스( B. licheniformis), 슈도모나스(Pseudomonas), 예를 들어 피.애루기노사( P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 본 발명의 세포는 본 발명의 벡터를 발현가능 한 것이면, 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 이. 콜라이일 수 있다.
[127]
[128]
본 발명의 세포로서 진핵생물은 사카로마이세스 세레비지아에( Saccharomyces cerevisiae)가 가장 흔히 사용된다. 그러나, 많은 다른 속, 종 및 균주, 이에 한정되지 아니하나, 예를 들어 쉬조사카로마이세스폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 숙주, 예를 들어 케이. 락티스( K. lactis ), 케이. 프라길리스( K. fragilis)(ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스( K. bulgaricus)(ATCC 16,045), 케이. 위커라미( K.wickeramii)(ATCC 24,178), 케이. 왈티( K. waltii)(ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸( K. drosophilarum)(ATCC 36,906), 케이. 테르모톨레란스((K. thermotolerans) 및 케이. 마르시아누스( K. marxianus); 야로위아(yarrowia)(EP 402,226); 피키아 파스토리스( Pichia pastoris)(EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코데르마 레에시아( Trichoderma reesia(EP 244,234)); 뉴로스포라 크라사( Neurospora crassa); 쉬바니오마이세스(Schwanniomyces), 예를 들어 쉬바니오마이세스 옥시덴탈리스(occidentalis); 및 필라멘트성 진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스( A. nidulans) 및 에이. 니거( A. niger)가 사용가능 하다.
[129]
[130]
상기 용어 ‘형질전환(transformation)’은 외래성 폴리뉴클레오티드가 도입됨에 의한 숙주 세포의 유전자형의 변형을 의미하며, 그 형질전환에 사용된 방법과 상관없이 외래성 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포 내로 도입된 것을 의미한다. 숙주 세포 내로 도입된 외래성 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어 유지되거나 통합되지 않고 유지될 수 있는데, 본 발명은 양자 모두 포함한다.
[131]
[132]
본 발명에 따른 인간 유래 c-Met 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터는 당 업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기천공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 공지의 방법에 의해 항체 또는 그 단편을 생산하기 위한 세포 내부로 도입하여 형질 전환할 수 있다.
[133]
[134]
또한, 본 발명의 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 벡터로 형질전환되거나 또는 형질감염(transfected)될 수 있는 배양된 세포이고, 이는 계속해서 상기 숙주세포 내에서 발현될 수 있다. 재조합 세포는 발현되어야 할 폴리뉴클레오티드로 형질전환되거나 또는 형질감염된 세포를 말한다. 본 발명의 세포는 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하나, 조절 시퀀스가 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되도록 상기 세포 내로 도입되지 않는 한 이를 원하는 수준으로 발현하지 않는 세포가 될 수 있다.
[135]
[136]
본 발명의 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예컨대 햄(Ham's) F1O(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO), 최소 필수 배지(MEM, Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640(Sigma-Aldrich Co.), 및 둘베코(Dulbecco's) 개질 이글(Eagle's) 배지(DMEM, Sigma-Aldrich Co.)가 세포를 배양하기에 적합하다. 상기 배지는 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장 인자, 염, 완충액, 뉴클레오티드, 항생제, 미량 원소 및 글루코스 또는 동등 에너지원이 추가될 수 있다.
[137]
[138]
본 발명은 상기 세포를 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건하에서 배양하여, 경쇄 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계 및 상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 인간 c-Met에 결합하는 아고니스트 항체 또는 그 단편의 생산방법을 제공한다.
[139]
[140]
본 발명에서 생산방법의 세포에 대하여는 상기 기술한 바와 같으며, 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있다. 상기 생산방법의 폴리펩타이드는 본 발명의 항체 또는 그 단편 그 자체일 수 있으며, 본 발명의 항체 또는 그 단편 외 다른 아미노산서열이 추가로 결합된 것일 수 있다.
[141]
이 경우 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 본 발명의 항체 또는 그 단편으로부터 제거할 수 있다. 상기 배양은 상기 세포의 종류에 따라 배지조성 및 배양 조건이 달라질 수 있으며, 이는 본 기술분야의 통상의 기술자가 적절히 선택 및 조절할 수 있다.
[142]
[143]
상기 항체 분자는 세포의 세포질 내에 축적되거나, 세포로부터 분비되거나, 적절한 신호 서열에 의하여 페리플라즘 또는 세포외 배지(supernatant)로 표적화(targeted)될 수 있으며, 페리플라즘 또는 세포외 배지로 표적화되는 것이 바람직하다. 또한, 생산된 항체 분자를 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 리폴딩(refolding)시키고 기능적 형태(conformation)를 갖도록 하는 것이 바람직하다. 상기 폴리펩타이드의 회수는 생산된 폴리펩타이드의 특성 및 세포의 특성에 따라 달라질 수 있으며, 이는 본 기술분야의 통상의 지식을 가진자가 적절히 선택 및 조절할 수 있다.
[144]
[145]
상기 폴리펩타이드는 세포내, 주변 세포질 공간에 생산되거나 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 만약 폴리펩타이드가 세포 내에서 생산되면, 이 세포는 제1단계로서 단백질을 방출하기 위하여 파괴될 수 있다. 입자형 파편, 숙주 세포 또는 용해된 단편은 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상등액을 일반적으로 먼저 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 유닛을 사용하여 농축시킨다. 단백분해를 억제하기 위하여 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF가 임의의 선행 단계에 포함될 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위하여 항생제가 포함될 수 있다. 세포로부터 제조된 항체는 예를 들어 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있고, 본 발명의 항체는 바람직하게는 친화도 크로마토그래피를 통하여 정제할 수 있다.
[146]
[147]
본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키는 단계 및 상기 아고니스트 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는 c-Met 특이적 검출 방법을 제공한다.
[148]
[149]
본 발명의 상기 검출 방법은 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키기 전에, 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 이용하여 KRS(또는 세포 외막으로 노출된 KRS N-말단 펩타이드)의 유무와 농도를 측정하기 위한 시료를 준비하는 단계((1) 단계)를 포함할 수 있다.
[150]
통상의 기술자는 항체를 이용하여 단백질을 검출하는 공지의 방법을 적절하게 선택하고, 선택된 방법에 적합하게 시료를 준비할 수 있다. 또한 시료는 암 또는 암전이 여부를 진단하고자 하는 피검체에서 채취된 생검 등으로 얻어진 세포나 조직, 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 등일 수도 있다. 상기 항체를 이용하여 단백질을 검출하는 방법이란 여기 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 웨스턴 블랏, 면역 블랏, 닷 블랏, 면역조직화학염색(immunohistochemistry), 효소면역분석(ELISA), 방사능면역검정법(radioimmunoassay), 경쟁적 결합 분석, 면역침전 등이 있다. 예를 들어 웨스턴 블랏을 실시하기 위하여서는 시료 또는 세포의 용해물에 전기영동에 적합한 버퍼를 첨가하여 끓이는 등의 방법으로 준비할 수 있으며, 면역조직화학염색을 위해서는 세포나 조직의 절편을 고정하고 블락킹(blocking)하는 등의 전처리를 할 수 있다.
[151]
[152]
다음으로 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 전술한 단계에서 준비한 시료와 접촉시키는 단계((2) 단계)를 수행한다.
[153]
본 발명에 따른 항체는 앞서 서술한 CDR, 또는 VH와 VL의 구성을 가지며 인간 유래 c-Met 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편으로서, 그 구체적 종류와 서열 구성에 대해서는 전술한 바와 같다.
[154]
상기 항체 또는 그 단편은 이의 ‘검출’을 위하여, 일반적으로 검출가능 모이어티(moiety)로 표지될 수 있다. 예를 들어, 당업계에 공지된 기술을 이용하여, 방사성 동위원소 또는 형광표지로 표지될 수 있다. 또는 다양한 효소-기질 표지가 이용가능하며, 상기 효소적 표지의 예는 초파리 루시퍼라제 및 세균 루시퍼라제(미국 특허 제4,737,456호)와 같은 루시퍼라제, 루시페린(luciferin), 2,3-다이하이드로프탈라진디오네스, 말레이트 디하이드로게나제, 유라제(urase), 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRPO)와 같은 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제(예를 들어 글루코스옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제), 헤테로사이클릭 옥시다제(예를 들어 유리카제 및 잔틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 항체에 효소를 접합시키는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 표지는 다양한 공지된 기술을 이용하여 항체에 직접 또는 간접적으로 접합될 수 있다. 예를 들어, 항체는 바이오틴(biotin)에 접합될 수 있고 상기에 언급된 3종의 광범위한 카테고리에 속하는 임의의 표지들이 아비딘과, 또는 그 반대로 접합될 수 있다. 바이오틴은 아비딘(avidin)에 선택적으로 결합하고, 따라서 이 표지는 이러한 간접적 방식으로 항체에 접합될 수 있다. 또는, 항체에 표지의 간접적 접합을 달성하기 위하여, 항체는 작은 합텐(hapten)(예를 들어, 딕옥신 [digoxin])과 접합될 수 있고 상기에 언급된 서로 다른 유형의 표지들의 하나가 항-합텐 항체에 접합될 수 있다(예컨대, 항-딕옥신 항체). 따라서, 항체에 대한 표지의 간접적 접합이 달성될 수 있다.
[155]
[156]
본 발명에서 ‘접촉(contacting)’이라 함은 이의 일반적인 의미로 사용되는 것으로서, 2개 이상의 물질을 혼합, 결합, 또는 서로 맞닿게 하는 것을 의미한다. 상기 접촉은 시험관 내(in vitro) 또는 다른 컨테이너(container) 상에서 수행될 수 있고, 또한 인 시투(in situ), 생체 내, 개체 내, 조직 내, 세포 내에서 수행 될 수 있다.
[157]
[158]
다음으로는 상기(2) 단계 수행 후의 시료에서 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계((3) 단계)를 수행한다.
[159]
[160]
상기 ‘검출’은 시료 내에서 형성된 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편과 항원의 복합체를 대상으로 하는 것으로서, 인간 c-Met의 펩타이드(또는 이를 포함하는 단백질)의 존재 유무의 감지 또는 상기 펩타이드의 수준을 측정(정성적 또는 정량적 측정을 모두 포함)하는 것을 의미한다. 따라서 상기(2) 단계 수행 후 후술하는 검출 단계((3) 단계) 전에, 인간 유래 c-Met 단백질과 복합체를 형성하지 않은 여분의 항체 또는 그 단편들을 제거하는 단계가 추가로 포함될 수 있다.
[161]
전술한(2) 단계에서 사용된 항체 또는 그 단편이 형광, 방사성 동위원소, 효소 등으로 직접 표지되는 등의 검출 가능한 모이어티를 포함하는 경우에는 해당 모이어티를 검출하는 당 업계에 공지된 방법에 따라 검출을 수행할 수 있다. 일례로 방사능은, 예를 들어, 신틸레이션 계수(scintillation counting)에 의해 측정될 수 있으며, 형광은 형광계를 이용하여 정량될 수 있다.
[162]
또한 전술한(2) 단계에서 사용된 항체 또는 그 단편이 자체로서 전술한 검출 모이어티를 포함하지 않는 경우에는, 당업계에 알려진 바와 같이 형광, 방사능, 효소 등으로 표지된 2차 항체를 이용하여 간접적으로 감지할 수 있다. 상기 2차 항체는 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편(1차 항체)에 결합한다.
[163]
[164]
최근 연구를 통해, HGF/SF는 또한 신경계에도 작용을 하며 특히 운동신경세포 보호 기능에 대한 많은 연구들이 보고되어 있다(Novak et al., Journal of Neuroscience. 20:326-337, 2000). 또한 심장 손상 회복(Nakamura et al., J Clin Invest. 106:1511-1519, 2000)등의 일반적인 장기 손상이후의 방어적 생리학적 기작에도 중요한 기능을 담당하고 있음이 제안되었고 실제로 HGF/MET 경로가 신경 경색, 진행성 신장염, 간경화와 폐섬유증의 과정에 관계하며 HGF가 이러한 퇴행성 질병의 병변에 과발현되어 조직손상의 생리학적 방어기전으로 보호활성을 나타냄이 입증되었다(Comoglio et al., Nature Review Drug Discovery. 7:504-516, 2008). 또한, HGF/c-Met 신호전달의 과다활성이 내피계열의 다양한 세포의 악성종양화와 혈관형성에 관련되고, 이러한 관점에서 c-Met을 표적으로 하는 길항성 c-Met 항체가 항암제로서의 사용될 수 있을 것이라는 가능성이 제시되었다(Comoglio et al., Nature Review Drug Discovery. 7:504-516, 2008). 예를 들어, 하나의 가지를 갖는 c-Met항체가 HGF의 c-Met 이량체화에 의한 활성화를 음성적으로 조절하여 이식 마우스 모델에서 효율적으로 종양 성장을 억제함이 보고된 바 있다(Jin et al, Cancer Research 68(11): 4360-4368, 2008; Comoglio et al., Nature Review Drug Discovery. 7:504-516, 2008). 또한 T-세포 치료법에서 암세포 표면 항원을 선택적으로 인식하는 T-세포 유전자조작에도 암세포에 과발현되는 항원에 대한 항체가 T 세포의 연결을 위한 종양 표적화에 활용되고 있다(Sadelain, The Cancer Journal 15(6):451-455, 2009).
[165]
[166]
본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[167]
[168]
본 발명에 따른 상기 항체 및 그 단편들은 상기 c-Met 단백질에 특이적 결합능력이 뛰어나고, c-Met 항체 또는 그 단편은 HGF의 활성화를 음성적으로 조절하여 종양 성장을 억제하는 효과가 있어, 암 치료제로서 사용할 수 있다. 또한 상기 항체 또는 그 단편에 암 치료제를 결합하여 암 예방 또는 치료에 사용할 수 있으며, 상기 항체 또는 단편을 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제조하여 암 예방 또는 치료에 사용할 수 있다.
[169]
[170]
본 발명의 상기 ‘암(cancer)’은 이에 제한되지는 않으나, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 담관암종, 결장직장암, 대장암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 두경부암, 신장암, 간암, 폐암, 비인두암, 난소암, 췌장암, 담낭암, 전립선암, 갑상선암, 골육종, 횡문근육종, 윤활막 육종, 카포시(Kaposi) 육종, 평활근육종, 악성 섬유성 조직구종, 섬유육종, 급성 골수성 백혈병, 성인 T 세포 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 교모세포종, 성상세포종, 흑색종, 중피종, 윌름 종양, 및 투명 세포 육종(CCS), 포상 연부 육종(ASPS) 및 전위-연관 신세포 암종을 포함할 수 있다.
[171]
[172]
본 발명에 따른 약학적 조성물은 c-Met 단백질에 특이적으로 결합하는 아고니스트 항체 또는 그 단편을 단독으로 함유하거나 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.
[173]
[174]
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 당업계에 공지되어 있는 것을 참고로 할 수 있다.
[175]
[176]
본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
[177]
[178]
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
[179]
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈,메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
[180]
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서에 기재되어 있다.
[181]
[182]
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 500mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
[183]
[184]
본 발명은 상기 항체를 포함하는 줄기세포 분화 유도용 조성물을 제공한다.
[185]
[186]
본 발명의 상기 ‘줄기세포’는 각종 세포로 분화(differentiation)할 수 있는 줄기성(stemness)을 가지고 있는 미분화 세포들을 총칭하며, 줄기세포는 특정 분화 인자 및/또는 환경에 의해 특정 세포로의 분화가 진행된다. 줄기세포의 종류에는 배아줄기세포(embryonic stem cell), 배아생식세포(embryonic germ cell), 성체줄기세포(adult stem cell), 암줄기세포(cancer stem cell) 등이 있다. 줄기세포를 이용하여 손상된 조직의 재생, 당뇨병, 백혈병, 파킨슨병, 심장병, 척수외상 등을 비롯한 다양한 질환을 치료하는데 사용할 수 있으며, 본 발명에서 가장 바람직하게는 지방 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다.
[187]
[188]
본 발명은 상기 줄기세포 분화 유도용 조성물을 포함하는 줄기세포용 배양 배지를 제공한다.
[189]
[190]
본 발명의 ‘줄기세포용 배양 배지’는 상기 c-Met 항체를 포함하는 줄기세포 분화 유도용 조성물을 포함하는 배지로, 줄기세포를 배양 또는 분화시키는 성분을 포함하고 있는 배지이다. 상기 배지는 줄기세포를 지방, 연골, 골, 신경 등 모든 세포로 분화시킬 수 있는 배지를 포함하며, 바람직하게는 줄기세포를 지방 세포, 연골 세포 또는 연골 세포로 분화시키는 배지일 수 있다.
[191]
[192]
본 발명의 일실시예에서 인간 재조합 c-Met 항체를 사용하여 인간 scFv 라이브러리 스크리닝을 실시하여 출력이 증가하는 샘플을 획득한 다음, ELISA 방법을 통해 결합력을 확인하여 결합신호를 나타내는 샘플을 선별하여 염기서열 분석을 실시하였다. 그 다음, 이중 상이한 서열을 갖는 hit를 선택하여 ELISA 방법으로 결합력을 확인하여 가장 강력하게 결합하는 10개 hit를 선별하여 인간 IgG 형태로 전환하였다(실시예 1, 도 1a, 도 1b 및 도 2 참조).
[193]
[194]
본 발명의 또 다른 일실시예에서 인간 IgG가 천연 c-Met에 결합하는 것을 확인하기 위하여, 293F 세포에 플라스미드로 형질감염시킨 후, 세포를 수득하여 단백질 A 비드로 항체를 정제하여 SDS-PAGE를 실시한 결과, 상기의 10개 hit가 인간 IgG 형태로 변환되어 세포에서 발현되는 것을 확인하였으며, 경쇄 및 중쇄의 크기를 확인할 수 있었다. 그 다음 c-Met 양성 세포를 이용하여 유동세포분석을 실시한 결과, 항체의 결합 패턴(binding pattern)이 세포에서 나타나는 가장 높은 변화와 c-Met의 발현 수준이 일치하는 4가지 항체를 선별하였다(실시예 2, 도 3, 도 4a 및 도 4b 참조).
[195]
[196]
본 발명의 또 다른 일실시예에서 항원인 인간 c-Met 재조합 단백질을 바이오표면(biosurface)에 고정시킨 다음 항체(A8, A11 및 C8)를 흐르게 하여 항원과 반응 시킨 다음 결합 계소를 측정하였고, Octat 플랫폼으로 분석을 실시한 결과, 모두 기존의 c-Met 항체와 비교하여 3개의 항체 모두 높은 친화도 및 해리값을 갖는 것을 확인할 수 있었다(실시예 3 및 도 5 참조).
[197]
[198]
본 발명의 또 다른 일실시예에서 c-Met에 양성인 세포주를 배양하여 단백질을 수득한 다음 웨스턴 블랏 방법으로 c-Met 신호 패턴을 확인한 결과, H596 세포주에서만 c-Met 촉매의 인산화가 일어나지 않는 것을 확인하여, H596 세포에 HGF를 다른 농도로 처리한 다음 웨스턴 블랏을 실시한 결과, Tyr1234 및 Tyr1349 발현량이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 그 다음 H596 세포에 HGF, c-Met 항체인 A8, A11, B10, C8을 농도별로 처리하여 웨스턴 블랏을 실시한 결과, HGF, A8, A11은 p-Erk 및 p-Akt와 같은 주요 하류 신호를 포함하는 인산화 신호를 유도하는 것을 확인하였다(실시예 4 및 도 6a 내지 도 6c 참조)
[199]
[200]
본 발명의 또 다른 일실시예에서 H596 세포에 HGF, A8 또는 A11을 농도를 다르게 하여 WST assay 방법으로 세포 증식을 분석한 결과, 항체를 처리한 경우가 HGF를 처리한 경우와 세포 증식 속도가 동일하게 나타나지는 않았으나, 포화점이 더 높은 것을 확인하였다(실시예 5 및 도 7 참조).
[201]
[202]
본 발명의 또 다른 일실시예서 HGF 없는 배지, HGF, A8 또는 A11의 각기 다른 농도로 함유하고 있는 배지를 사용하여 간엽 줄기세포를 배양하였고, 배양하면서 배양 시간, 생존력 및 세포 형태를 관찰한 결과, 모든 그룹에서 세포의 평균 생존율이 90% 이상인 것으로 나타났고, 이에 c-Met 항체는 줄기세포의 배양 형태에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다(실시예 6-1, 도 8a 및 도 8b 참조).
[203]
[204]
본 발명의 또 다른 일실시예에서 HGF, A8 또는 A11을 처리하여 지방 유래 간엽 줄기세포를 배양한 다음 지방, 연골 및 골 분화를 유도하였다. 분화시킬 세포 계통에 따라 각기 다른 배지 조건으로 줄기세포의 분화를 유도하였고, 각 세포를 염색하여 관찰한 결과, 줄기세포는 모든 배지 조건에서 지방 세포로 분화하였으며, HGF가 없는 배지에서는 연골 및 골 분화가 나타나지 않았고, A8 또는 A11은 HGF와 유사한 결과를 나타내는 것을 확인하였다. 이에 A8 또는 A11이 줄기세포에서 HGF와 동일한 역할을 하는 것을 확인할 수 있었다(실시예 6-2 및 도 9a 내지 도 9d 참조).
[205]
[206]
또한, 본 발명은 암 예방 또는 치료용 제제를 제조하기 위한 상기 항체 또는 그 단편의 용도를 제공한다.
[207]
[208]
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.
[209]
[210]
본 발명은 줄기세포 분화 유도용 제제를 제조하기 위한 상기 항체의 용도를 제공한다.
[211]
[212]
본 발명은 상기 항체를 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 줄기세포 분화 유도 방법을 제공한다.
[213]
[214]
본 발명의 상기 ‘유효량’이란 개체에게 투여하였을 때, 암의 개선, 치료, 예방, 검출, 진단 또는 암의 억제 또는 감소 효과를 나타내는 양을 말하고, 줄기세포 분화를 유도하는 효과를 나타내는 양을 말하며, 상기‘개체’란 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한 환자(patient) 일 수 있다.
[215]
본 발명의 상기 ‘치료’는 암 또는 암의 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고, 이는 암을 치유하거나, 실질적으로 예방하거나, 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며, 암으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나, 치유하거나 예방하는 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[216]
[217]
본 발명의 용어 ‘~을 포함하는(comprising)’이란 ‘함유하는’ 또는 ‘특징으로 하는’과 동일하게 사용되며, 조성물 또는 방법에 있어서, 언급되지 않은 추가적인 성분 요소 또는 방법 단계 등을 배제하지 않는다. 용어 ‘~로 이루어지는(consisting of)’이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 ‘필수적으로 이루어지는(essentially consisting of)’이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 성분 요소 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 성분 요소 또는 단계 등을 포함하는 것을 의미한다.
[218]

발명의 효과

[219]
따라서, 본 발명은 항 c-Met 아고니스트 항체 및 이의 용도을 제공한다. 본 발명의 방법은 c-Met 항체를 검출하고, 항체를 이용하여 줄기세포 분화를 유도하고, 암을 치료 또는 예방하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.
[220]

도면의 간단한 설명

[221]
도 1a 및 도 1b는 인간 c-Met 재조합 단백질을 항원으로 이용한 파지 디스플레이(도 1a) 및 ELISA에 의한 스크리닝한 결과(도 1b)를 나타낸 것이다.
[222]
도 2는 ELISA 결과에 따라 선택된 히트의 결합 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
[223]
도 3은 정제한 항체의 중쇄 및 경쇄 크기를 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 실시한 결과를 나타낸 것이다.
[224]
도 4a 및 도 4b는 A549 세포 및 MDA-MB-231 세포를 이용하여 유세포 분석(flow cytometry)으로 10가지 c-Met 항체의 결합력을 확인한 결과(도 4a) 및 A549, H596 및 SKBR-3 세포를 이용하여 유세포 분석(flow cytometry)으로 c-Met 항체(A8, A11, B10, C8)의 결합력을 확인한 결과(도 4b)를 나타낸 것이다.
[225]
도 5는 옥텟(Octet) 분석을 이용한 c-Met 항체(A8, A11, B10, C8)의 결합 친화력을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
[226]
도 6a 내지 도 6c은 웨스턴 블랏(western blot)방법을 이용하여 c-Met 양성 세포주에서 c-Met 신호 패턴을 확인한 결과(도 6a), H596 세포에서 각기 다른 농도의 HGF를 처리하여 c-Met 신호 패턴을 확인한 결과(도 6b) 및 H596 세포에 HGF, c-Met 항체(A8, A11, B10, C8)를 처리하여 c-Met 신호 패턴을 확인한 결과(도 6c)를 나타낸 것이다.
[227]
도 7은 WST 분석 방법을 이용하여 c-Met 항체 및 HGF가 세포 증식에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
[228]
도 8a 및 도 8b는 HGF 또는 c-Met 항체(A8)가 간엽줄기세포의 population doubling time(도 8a) 및 생존력(도 8b)에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
[229]
도 9a 내지 도 9d는 간엽줄기세포의 배양 조건에 따른 배양 형태(도 9a)와 지방 분화(도 9b), 연골 분화(도 9c) 및 골 분화(도 9d)에 HGF 또는 c-Met 항체(A8)가 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
[230]

발명의 실시를 위한 형태

[231]
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
[232]
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[233]
[234]
실험방법
[235]
시약
[236]
A549 세포주, MDA-MB231 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection, USA)에서 구입하였고, H596 세포, SKBR-3 세포는 한국세포주은행(Krean Cell Line Bank, KCLB)에서 구입하였다. 지방 유래 중간엽 줄기세포(adipose derived mesenchymal cell)는 Xcell Therapeutics(서울)에서 제공하였다. 또한 중간엽 줄기세포 배양을 위한 배양 배지는 Xcell Therapeutics에서 구입하였다. 선별에 사용된 항원은 수용체의 1-932 아미노산(amino acid, aa)을 포함하는 인간 c-Met 재조합 단백질이며, Sinobiological(중국)에서 구입하였다. 또한 대조군으로는 Abcam(미국)에서 구입한 항-c-Met 항체를 사용하였다.
[237]
[238]
파지 디스플레이
[239]
인간 재조합 c-Met 단백질을 항원으로 사용하였고, 인간 scFv 라이브러리는 c-Met 세포외 영역에 결합하는 히트(hits) 스크리닝에 사용하였다. 항원을 농도 10㎍/㎕의 면역 튜브(Nunc, USA)에 코팅하고 O/N로 배양하여 결합시켰다. 면역튜브와 파지를 블로킹 버퍼(3% milk in PBST)로 활성을 억제하였다. 파지를 항원이 코팅된 면역튜브에 넣고 결합시켰으며, 1시간 후 PBST로 4번, PBS로 1번 세척하였다. 파지를 7~8분 동안 100mM TEA에 용출시킨 다음 Tris-HCl(pH 8) 용액으로 중화시켰다. 용출된 파지를 대장균에 감염시켰고, 일부는 고형 LA 플레이트에서 O/N으로 배양하여 출력 역가(output titer)를 확인하였다. 남은 파지는 헬퍼 파지(helper phage)를 사용하여 구제하였고, 동일한 실험을 3번 반복하였다.
[240]
[241]
ELISA 스크리닝
[242]
4번째 패닝 후, 단일 콜로니를 각각 96웰 플레이트에서 암피실린을 포함하는 SB 150μl에 주입하였다. 그 다음 배지가 뿌옇게 될 때까지 37℃ 진탕배양기에서 배양하였다. 배양 후, 배양액을 원판에 넣고 1nM IPTG로 유도한 후 30℃에서 밤새 배양하였다. c-Met 재조합 단백질을 항원으로 사용하였고, ELISA 플레이트(corning 3690)에 1μg/ml 농도로 PBS에 녹여 코팅하였고 4℃에서 밤새 배양하였다. 그 다음 날, 클론이 주입된 플레이트를 15분 동안 3000 rpm에서 원심분리하였다. 상층액을 제거하고, 펠렛을 37℃에서 1X TES 버퍼에서 5~7분 동안 재현탁시킨 다음 0.2X TES 버퍼를 첨가하여 4℃에서 30분동안 반응시켜 세포를 용해시켰다. 항원 코팅된 플레이트를 150μl의 TBST로 3회 세척하고, 3% 스킴 밀크를 사용하여 반응을 억제하였다. 페리플라스믹(periplasmic) 추출물을 용해된 세포에서 수득하였고, 새 플레이트에서 6% 스킴 밀크를 이용하여 1시간 동안 반응을 억제하였다. 그 다음 용액을 항원 코팅된 플레이트에 첨가하였고, 실온에서 1시간 동안 항온 배양한 뒤 TBST를 이용하여 3회 세척하였다. 그 다음 anti-HA Hrp 2차 항체를 첨가하여 1시간 동안 배양한 뒤 TBST로 3회 세척하였다. 그 다음 30μl의 TMB를 처리하여 반응을 시작한 다음, 1N H2SO4를 사용하여 반응을 억제하였으며, 450nm에서 검출하였다.
[243]
[244]
염기서열 분석 및 IgG 전환
[245]
상기 ELISA 스크리닝에서 선별된 hits의 서열을 분석하였다(Cosmogenetech, Korea). 서열분석 및 ELISA 스크리닝 후에 선별된 최종 hits를 인간 IgG로 변환시켰다. scFv 서열을 인간 경쇄 및 중쇄 서열로 전환하였고, 클로닝에 의한 pOptiVEC™-TOPO 및 pcDNA™3.3-TOPO(Thermofisher, USA) 벡터에 융화시켰다. 그 다음 midi prep(Macherey Nagel, Germany)을 사용하여 플라스미드를 증폭시켰다.
[246]
[247]
과발현 및 항체 정제
[248]
증폭된 플라스미드를 Freestyle Expression System(Invitrogen, USA)을 이용하여 일시적으로 발현하였다. 삼각 플라스크(Corning, USA)에서 프리스타일 발현 배지(Freestyle Expression Medium)에서 프리스타일 세포(Freestyle cell)을 해동시켰고, 배양하였다. 세포가 3.0 x 10 6 cells/ml 농도가 될 때까지 배양하여 2~3일 마다 계대배양하였으며, 4번의 계대배양 후, FreeStyle™ MAX Transfection 시약(Invitrogen, USA)를 사용하여 중쇄 및 경쇄 플라스미드를 형질감염시켰다. 그 다음 8% CO 2, 37℃ 조건의 진탕기에서 세포를 배양하였다. 형질 감염 후 7일 째에 세포를 수득하였고, 상층액을 취득하여 여과하였다. 여과 후, 크로마토그래피 칼럼(Bio-rad, USA)에서 상층액을 MabSelect SuRe protein A beads(GE healthcare. USA)에 적용하였다. 그 다음 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루(coomassie blue) 염색으로 크기를 확인하였다.
[249]
[250]
유세포 분석
[251]
A549, MDA-MP231, H596 및 SKBR-3 세포를 이용하여 유세포 분석(flow cytometric analysis)을 실시하였다. 세포들은 세포 해리 버퍼(cell dissociation buffer, Hyclone, USA)로 세포를 떼어낸 뒤, PBS를 세척한 다음, 2.0×10 5 개의 세포로 분리하여 튜브에 넣었다. 항체를 1μg/tube의 농도가 되도록 2% FBS가 함유된 DBPS(Wellgene)용액으로 희석하여, 세포에 첨가하였고, 1시간 동안 반응시켰다. 대조군으로는 상업용 항-c-Met 항체를 사용하였다. 그 다음 세포를 2번 세척하고, FITC가 결합된 2차 항체로 40분 동안 반응시켰다. 3회 세척한 후, FACS BD Calibur(BD, USA)를 사용하여 분석하였다.
[252]
[253]
옥텟 분석(Octet analysis)
[254]
옥텟 서비스는 PALL corp, Fortebio에서 제공받았다. His가 태그된 인간 재조합 c-Met 단백질(Sinobiological, China)을 항원으로 사용하였다. 표적은 바이오 표면(bio-surface)에서 20ug/ml 농도의 12개 Ni-NTA 센서에 포획되었다. PBS를 리간드 버퍼로 사용하였고, 1×Fortebio Kinetic 버퍼를 분석물 버퍼로 사용하였다. 리간드가 고정된 후 c-Met, A8, A11 및 C8의 항체를 결합시키고, Kon and Koff 값을 분석하여 결합능을 평가하였다.
[255]
[256]
세포 배양 및 항체 치료
[257]
H596 세포를 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신(Hyclone)을 포함하고 있는 RPMI(Wellgene)를 사용하여 배양하였다. 항체가 인산화 신호를 유도할 수 있는지 관찰하기 위하여, 6웰 플레이트에 세포를 배양하였다. 그 다음 FBS에 의한 신호의 간섭을 제거하기 위해, 하룻밤 동안 FBS가 포함되지 않은 RPMI 배지에서 배양하였다. 다음날, 배지를 제거하고, 항체 또는 HGF를 다른 농도로 함유된 용액을 1시간 동안 처리하였다.
[258]
[259]
웨스턴 블랏
[260]
상기와 같이 세포를 배양한 다음, RIPA(Biosesang), 단백질 분해 효소 억제제(protease inhibitor, Roche) 및 인산화 효소 억제제(phosphatase inhibitor, Roche)를 함유하고 있는 용해 버퍼를 이용하여 세포를 수득하였고, 1ml 주사기를 이용하여 세포를 용해시켰다. 용해 후, 세포를 15분 동안 14000rpm으로 원심분리하였다. 그 다음 상층액을 수득하였고, BCA 분석(Thermofisher) 방법을 통해 단백질을 정량하였다. 상층액을 5x 샘플 로딩 버퍼와 혼합한 다음 10분 동안 열을 가했다. 그 다음 SDS-PAGE를 실시한 다음, 활성화된 PVDF(polyvinylidene difluoride) apa브레인(Bio-rad)에 단백질을 트랜스퍼(transfer) 하였다. 5% BSA로 멤브레인의 활성을 억제하였고, 1차 항체로 반응시킨 다음, Hrp가 결합된 2차 항체로 반응시켰다. 그 다음 암실에서 ECL(Amersham)을 사용하여 확인하였다.
[261]
[262]
세포 증식 분석
[263]
H596 세포를 96웰 플레이트에 1.0×10 4 cells/well의 농도로 밤새 배양하였다. 다음날, 배지를 제거하고, 39 피코몰 내지 10 나노몰의 농도로 HGF 또는 anti-c-Met 항체를 포함하는 용액을 처리하였다. 그 다음 세포를 72시간 동안 배양하였고, 배지를 WST 용액(DoGen)으로 교체하여 2-3시간 동안 배양하였다. 그 다음 멀티리더기(Tecan)를 사용하여 450nm에서 측정하였다.
[264]
[265]
실시예 1 : c-Met에 결합하는 scFv의 스크리닝 및 동정
[266]
c-Met에 결합하는 항체를 확인하기 위하여, 항원으로서 세포외 도메인(aa, 1-932)만 함유하는 인간 재조합 c-Met 항체를 사용하여, 상기에 기재된 방법에 따라 인간 scFv 라이브러리 스크리닝을 실시하였다. 항원을 면역튜브(immunotube)에 결합시키고 4 사이클을 반복하였다.
[267]
그 결과 도 1a에서 나타난 바와 같이, 3번째와 4번째 사이클에서 출력(output)이 증가하는 것으로 나타났고, 3번째와 4번째 사이클에서 획득한 샘플은 ELISA 방법을 통해 결합력을 확인하였으며, 그 결과를 도 1b에 나타냈다. 또한, 대조군 플레이트와 비교하여 신호를 나타내는 것을 선택한 뒤, 염기서열을 분석(sequencing)하였고, 이 중 상이한 서열을 갖는 31개 후보(hit)들을 선택하였고, 다시 ELISA를 실시하여 결합력을 확인한 다음 가장 강력하게 결합하는 10개의 후보(hit)를 선택하였다. 각 후보는 ELISA 결과를 토대로 A8, A9, A11, B8, B10, C8, C9, D7, D12, E10으로 명명하였다. 그 다음 10개의 hit를 인간 IgG 형태로 전환하였다(도 2).
[268]
[269]
실시예 2 : 인간 IgG 형태의 천연 c-Met 결합 여부 확인
[270]
상기 실시예 1에서 제조한 인간 IgG가 천연 c-Met에 결합하는 것을 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.
[271]
먼저 상기 실험 방법에 따라 293F 세포에 플라스미드로 형질감염시켜 7일 동안 배양하였다. 그 다음 세포를 수득하여 단백질 A 비드를 사용하여 항체를 정제하였고, SDS-PAGE를 실시하였다.
[272]
그 결과 도 3에서 보이는 바와 같이, 상기 실시예 1에서 가장 강력하게 결합하는 10개의 hit가 인간 IgG 형태로 변환되어 세포에서 발현되는 것을 확인하였으며, 경쇄 및 중쇄의 크기를 확인할 수 있었다.
[273]
[274]
IgG가 전환된 것을 확인한 다음, CCLE의 정보를 기초로 하여 c-Met에 대해 양성인 세포를 선택하여, 상기 실험 방법에 따라 유동세포분석(flow cytometry)을 실시하였다.
[275]
그 결과 도 4a에서 보이는 바와 같이, 항체의 결합 패턴(binding pattern)은 A549 세포에서 나타나는 가장 높은 변화와 c-Met의 발현 수준이 일치하는 것으로 나타났으며, 이중 가장 비슷하게 나타난 4가지 항체를 선별하여 다른 세포주를 이용하여 동일한 실험을 실시하였다. 이 때, H596 세포주는 중간 발현 세포주이며, SKBR-3 세포주는 음성 대조군으로 사용하였다.
[276]
그 결과 도 4b에서 보이는 바와 같이, 4가지 항체(A8, A11, B10, C8)의 결합 패턴은 c-Met 발현 수준과 관계가 있는 것으로 나타났고, c-Met 음성 세포주인 SKBR-3 세포주에서는 결합 이동이 잘 보이지 않는 것으로 나타났다. 이 중 A11은 A549, H596 세포주에서는 대조군인 Anti-c-Met 항체의 발현 패턴이 유사한 것을 확인하였고, SKBR-3 세포주에서는 대조군인 Anti-c-Met 항체의 발현율과 일치하는 것을 확인할 수 있었다.
[277]
이를 통해, 선별된 4가지 리드(leads)는 c-Met 수용체에 대하여 특이성이 있다는 것을 확인할 수 있었다.
[278]
[279]
실시예 3 : 리드 항체(lead antibody)의 결합 친화성 분석
[280]
상기 실시예 2에서 항체가 천연 c-Met와의 결합을 확인한 결과를 토대로 가장 높은 이동을 나타내는 리드(A8, A11 및 C8)를 사용하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.
[281]
상기 실험 방법에 따라 항원인 인간 c-Met 재조합 단백질을 바이오표면(biosurface)에 고정시킨 다음 항체를 흐르게 하여 항원과 반응시켰다. 그 다음 결합 계수 Kon 및 해리 계수 Koff를 사용하여 친화도에 대한 정량값인 KD를 계산하였다. 분석은 Octat 플랫폼에서 실시하였다. Kon 값이 높을수록 항체와 리간드가 더 빨리 결합하고, Koff 값이 낮을수록 더 느리게 해리된다. KD 값은 Kon 및 Koff 사이의 비율로 계산하였다.
[282]
그 결과 도 5에 나타난 바와 같이, 3개의 항체 모두 기존의 c-Met 항체와 비교하여 3개의 항체 모두 높은 친화도 및 해리값을 갖는 것으로 나타났다. 이 중 A11은 0.0244nM의 KD값을 가지며 anti-c-Met 항체에 비해 Kon 상수가 10배, Koff 값이 10정도 차이가 나는 것으로 나타났다.
[283]
이를 통해, 기존의 c-Met 항체와 비교하여 A11 항체는 수용체로부터 더 빠르게 결합하고 느리게 해리하는 것을 확인할 수 있었다.
[284]
[285]
실시예 4 : c-Met 항체의 효능제 효과
[286]
상기 실시예에서 선별한 c-Met 항체가 신호 전달에 미치는 영향을 확인하기 위하여, c-Met에 양성이며 HGF 신호 활성에 의존적인 세포주를 이용하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.
[287]
먼저 c-Met에 양성인 여러 세포주(Hs746T, H596, AsPC1, MKN45, SNU620, SNU5)를 각각 배양한 뒤, 단백질을 수득하였다. 그 다음 상기 실험 방법에 기재된 바에 따라 웨스턴 블랏을 실시하여, c-Met 신호 패턴에 대하여 확인하였다.
[288]
그 결과 도 6a에 나타난 바와 같이, H596 세포주에서만 c-Met 촉매의 인산화가 일어나지 않는 것으로 나타났다.
[289]
이에 H596 세포에 HGF를 50, 100, 200, 500 ng/ml을 첨가하여 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 실시하였다. 그 결과 도 6b에 나타난 바와 같이, HGF를 첨가하면 Tyr1234 및 Tyr1349 발현량이 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다.
[290]
[291]
또한, 6-웰 플레이트에 H596 세포를 RPMI 배지(serum free)에서 밤새 배양한 다음, 1시간 동안 HGF, c-Met 항체인 A8, A11, B10, C8을 나노몰 농도로 처리하였다. 그 다음 세포를 수득하여 상기와 동일하게 웨스턴 블랏을 실시하였다.
[292]
그 결과 도 6c에 나타난 바와 같이, HGF, A8, A11은 p-Erk 및 p-Akt와 같은 주요 하류 신호를 포함하는 인산화 신호를 유도하는 것으로 나타났으나, B10 및 C8은 유도하지 않는 것으로 나타났다. 또한 A11을 처리한 경우에 Tyr1234, Tyr1349 발현량이 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타났으며, p-Erk 및 p-Akt의 발현을 유도하는 것으로 나타났다.
[293]
[294]
실시예 5 : c-Met 항체가 세포 증식에 미치는 효과
[295]
상기 실시예 4에서 확인한 c-Met 항체의 신호 유도가 세포에 직접적으로 미치는 영향을 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.
[296]
먼저 96 웰 플레이트에 H596 세포를 배양하였고, 실시예 4에서 신호 활성을 유도한 HGF, A8 또는 A11을 0.039 내지 10 nM의 농도로 처리하였다. 그 다음 세포를 72시간 동안 추가로 배양하였고, WST assay 방법으로 세포 증식을 분석하였다. 수치는 대조군(untreated)의 세포 증가율에 비례하여 계산하였다.
[297]
그 결과 도 7에 나타난 바와 같이, HGF, A8 또는 A11을 처리한 경우 세포가 증식하는 것을 확인하였고, A11 항체를 처리한 경우에 높은 농도에서 HGF와 proliferation potency가 유사하게 나타났다. 이는 상기 실시예의 옥텟 실험 결과와 일치하는 경향인 것을 확인할 수 있었다.
[298]
[299]
실시예 6 : 간엽 줄기세포에 대한 c-Met 항체의 효과
[300]
c-Met 항체인 A8 및 A11이 간엽 줄기세포에서 HGF와 동일한 효과를 나타내는 것을 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.
[301]
6 웰 플레이트에 성장인자를 포함하며 화학적으로 안정된 배지를 넣고 간엽줄기세포를 접종하였다. 이 때, HGF 없는 배지, HGF, A8 또는 A11의 각기 다른 농도로 함유하고 있는 배지를 사용하였다.
[302]
[303]
6-1 : c-Met 항체의 세포 독성 효과
[304]
상기 실험방법에 따라, 지방 유래 간엽 줄기세포(Adipose derived mesenchymal stem cells)에 HGF, A8 또는 A11을 다른 농도로 처리하여 HGF가 제거된 배지에서 배양하였다. 배양하면서 배지 시간, 생존력, 및 세포 형태를 평가하였으며, Cedes 세포 계수기(Roche, USA)를 사용하여, 트리판 블루 염색(trypan blue staining) 후 계수법을 통해 population doubling time 및 생존력을 평가하였고, 세포 형태는 광학 현미경을 이용하여 영상을 찍어 관찰하였다.
[305]
그 결과 도 8a 및 도 8b에 나타난 바와 같이, population doubling time은 HGF를 처리하지 않은 경우와 HGF 및 c-Met 항체 A11을 처리한 경우에서 유의미한 차이를 나타내지 않았다. 또한 모든 그룹에서 세포의 평균 생존율이 90% 이상인 것으로 나타났다.
[306]
이를 통해, c-Met 항체인 A8은 줄기세포의 배양 형태에 영향을 미치지 않으며, HGF와 효과가 유사한 것을 확인할 수 있었다.
[307]
[308]
6-2 : c-Met 항체가 줄기세포 분화에 미치는 효과
[309]
상기 실험방법에 따라, 지방 유래 간엽 줄기세포(Adipose derived mesenchymal stem cells)를 passage 9까지 다양한 조절 배지에서 배양하였다. passage 9에서 세포를 6 웰 플레이트에 접종한 다음, 분화될 세포 계통에 따라 성장시켰다. 세포를 지방, 연골 및 골 분화로 유도하였다.
[310]
먼저 다음과 같은 방법으로 지방 세포로 분화시켰다. passage 10에서 세포가 약 90~100%로 자라면 배양 배지를 세포 분화용 배지로 교체하였다. StemPro adipogenesis differentiation 키트(Thermofisher, USA)를 분화 배지로 사용하였으며, 2~3일마다 배지를 교체하며 2~3주 동안 유지하였다. 지방으로 분화된 후 세포를 관찰하기 위해 Oil red O로 염색하여 관찰하였다.
[311]
또한 다음과 같은 방법으로 줄기세포를 연골 세포로 분화시켰다. passage 10에서 세포가 약 50%로 자라면 배양 배지를 세포 분화용 배지로 교체하였다. FBS(Hyclone, USA), 1% ITS-X, 50ug/ml 아스코르브산(ascorbic acid), 100nM 덱사메타손(dexamethasone) 및 10ng/ml TGF-β1을 포함하고 있는 DMEM 저포도당 배지(Wellgene, Korea)를 분화 배지로 사용하였으며, 2~3일마다 배지를 교체하며 2~3주 동안 유지하였다. 3주 후 , 세포를 고정시키고, Alcian Blue로 염색하여 관찰하였다.
[312]
또한 다음과 같은 방법으로 줄기세포를 골 세포로 분화시켰다. passage 10까지 세포를 배양한 후, 배양 배지를 세포 분화용 배지로 교체하였다. FBS, 100nM 덱사메타손(dexamethasone), 10nM 글리세롤-2-인산염(glycerol-2-phosphate), 50ug/ml 아스크로브 산 및 1% 글루타멕스(Glutamax)를 포함하고 있는 DMEM 저포도당 배지(Wellgene, Korea)를 분화 배지로 사용하였으며, 2~3일마다 배지를 교체하며 3주 동안 유지하였다. 3주 후 , 세포를 고정시키고 Alizarin Red 용액으로 염색하여 관찰하였다.
[313]
그 결과 도 9a 내지 도 9d에 나타난 바와 같이, 줄기세포는 모든 배지 조건에서 지방 세포로 분화하는 것으로 나타났으나, 연골 및 골 분화는 HGF가 없는 배지에서 분화하지 않는 것으로 나타났다. 또한, A11을 함유하는 배지에서 배양된 세포는 HGF 대조군과 유사한 밀도로 염색된 것으로 나타났다.
[314]
이를 통해, 줄기세포 다분화능을 유지하는데 HGF가 중요한 역할을 하는 것을 확인할 수 있었으며, A11이 줄기세포에서 HGF와 동일한 역할을 하는 것을 확인할 수 있었다.
[315]

산업상 이용가능성

[316]
이상 살펴본 바와 같이 본 발명은 항 c-Met 아고니스트 항체 및 이의 용도를 제공한다. 본 발명의 방법은 c-Met 항체를 검출하고, 항체를 이용하여 줄기세포 분화를 유도하고, 암을 치료 또는 예방하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.

청구범위

[청구항 1]
서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L3를 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL) 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H3를 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH)을 포함하는 인간 유래 c-Met 단백질에 특이적으로 결합하는 아고니스트 항체 또는 그 단편.
[청구항 2]
제1항에 있어서, 상기 단편은 디아바디, Fab, Fab′, F(ab)2, F(ab′)2, Fv 및 scFv로 이루어진 군에서 선택되는 단편인 것을 특징으로 하는 아고니스트 항체 또는 그 단편.
[청구항 3]
제1항의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
[청구항 4]
제3항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
[청구항 5]
제4항의 벡터로 형질 전환된 세포.
[청구항 6]
제5항의 세포를 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건하에서 배양하여, 경쇄 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계 및 상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 인간 c-Met에 결합하는 아고니스트 항체 또는 그 단편의 생산방법.
[청구항 7]
제1항의 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키는 단계 및 상기 아고니스트 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는 c-Met 특이적 검출 방법.
[청구항 8]
제1항의 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[청구항 9]
제8항에 있어서, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 담관암종, 결장직장암, 대장암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 두경부암, 신장암, 간암, 폐암, 비인두암, 난소암, 췌장암, 담낭암, 전립선암, 갑상선암, 골육종, 횡문근육종, 윤활막 육종, 카포시(Kaposi) 육종, 평활근육종, 악성 섬유성 조직구종, 섬유육종, 급성 골수성 백혈병, 성인 T 세포 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 교모세포종, 성상세포종, 흑색종, 중피종, 윌름 종양, 및 투명 세포 육종(CCS), 포상 연부 육종(ASPS) 및 전위-연관 신세포 암종을 포함하는 MiT 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[청구항 10]
제1항의 항체를 포함하는 줄기세포 분화 유도용 조성물.
[청구항 11]
제10항에 있어서, 상기 줄기세포는 지방 유래 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 유도용 조성물.
[청구항 12]
제10항의 조성물을 포함하는 줄기세포용 배양 배지.
[청구항 13]
암 예방 또는 치료용 제제를 제조하기 위한 제1항의 항체 또는 그 단편의 용도.
[청구항 14]
제1항의 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법.
[청구항 15]
줄기세포 분화 유도용 제제를 제조하기 위한 제1항의 항체의 용도.
[청구항 16]
제1항의 항체를 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 줄기세포 분화 유도 방법.

도면

[도1a]

[도1b]

[도2]

[도3]

[도4a]

[도4b]

[도5]

[도6a]

[도6b]

[도6c]

[도7]

[도8a]

[도8b]

[도9a]

[도9b]

[도9c]

[도9d]