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1. WO2020108485 - FORME SOLIDE, FORME CRISTALLINE ET FORME CRISTALLINE A D'AGONISTE DE FXR, SON PROCÉDÉ DE PRÉPARATION ET SON UTILISATION

Document

说明书

发明名称 0001   0002   0003   0004   0005   0006   0007   0008   0009   0010   0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061   0062   0063   0064   0065   0066   0067   0068   0069   0070   0071   0072   0073   0074   0075   0076   0077   0078   0079   0080   0081   0082   0083   0084   0085   0086   0087   0088   0089   0090   0091   0092   0093   0094   0095   0096   0097   0098   0099   0100   0101   0102   0103   0104   0105   0106   0107   0108   0109   0110   0111   0112   0113   0114   0115   0116   0117   0118   0119   0120   0121   0122   0123   0124   0125   0126   0127   0128   0129   0130   0131   0132   0133   0134   0135   0136   0137   0138   0139   0140   0141   0142   0143   0144   0145   0146   0147   0148   0149   0150   0151   0152   0153   0154   0155   0156   0157   0158   0159   0160   0161   0162   0163   0164   0165   0166   0167   0168   0169   0170   0171   0172   0173   0174   0175   0176   0177   0178   0179   0180   0181   0182   0183   0184   0185   0186   0187   0188   0189   0190   0191   0192   0193   0194  

权利要求书

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23   24   25   26   27  

附图

1   2   3   4   5  

说明书

发明名称 : 一种FXR激动剂的固体形式、结晶形式、A晶型及其制备方法和应用

[0001]
本申请要求申请日为2018年11月26日的中国专利申请CN201811418346.8的优先权。本申请引用该中国专利申请的全文。

技术领域

[0002]
本发明涉及一种作为FXR受体激动剂的式(I)化合物的固体形式、结晶形式、A晶型及其制备方法,还包括式(I)化合物的在制备治疗非酒精性脂肪肝炎(NASH)药物中的应用。。

背景技术

[0003]
法尼酯X受体(farnesoid X receptor,FXR)是核受体超家族的成员,最初在大鼠肝脏cDNA文库中克隆发现。FXR具有典型的核受体结构,由配体非依赖性的转录激活域、DNA结合域、铰链区和配体结合区组成。FXR在肝,肠,肾,和肾上腺中大量表达,与视黄酸受体(retinoid X receptor,RXR)形成异源二聚体,同DNA结合来调控基因的转录。FXR/RXR异源二聚体优先与由共有AG(G/T)TCA的双核受体半位点组成的成分结合,其形成反向重复并被单一核苷分离(IR-1模体)。FXR作为一种胆汁酸激活的核受体,参与多种机体生理活动的调节,包括胆汁酸代谢、脂代谢、糖代谢、肝脏保护等过程,与代谢综合症、肝胆疾病、Ⅱ型糖尿病等疾病之间存在了密切的关系。作为FXR内源性配体的胆酸包括鹅脱氧胆酸(CDCA),脱氧胆酸(DCA),石胆酸(LCA),以及这些胆酸的牛磺酸及甘氨酸共轭物。PX104是FXR受体激动剂。
[0004]
[0005]
发明内容
[0006]
本发明提供式(I)化合物的固体形式。
[0007]
[0008]
本发明提供式(I)化合物的结晶形式。
[0009]
本发明提供式(I)化合物的A晶型,其特征在于其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰:3.54±0.2°,12.72±0.2°,25.27±0.2°。
[0010]
在本发明的一些方案中,上述式(I)化合物的A晶型的X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰:3.54±0.2°,11.86±0.2°,12.72±0.2°,16.15±0.2°,17.40±0.2°,19.72±0.2°,24.18±0.2°,25.27±0.2°。
[0011]
在本发明的一些方案中,上述式(I)化合物的A晶型的X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰:3.54±0.2°,11.86±0.2°,12.72±0.2°,16.15±0.2°,17.40±0.2°,19.72±0.2°,20.38±0.2°,22.60±0.2°,23.80±0.2°,24.18±0.2°,25.27±0.2°。
[0012]
在本发明的一些方案中,上述式(I)化合物的A晶型的X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰:3.54±0.2°,11.86±0.2°,12.72±0.2°,13.67±0.2°,16.15±0.2°,17.40±0.2°,19.72±0.2°,20.38±0.2°,22.60±0.2°,23.80±0.2°,24.18±0.2°,25.27±0.2°,26.57±0.2°。
[0013]
在本发明的一些方案中,上述式(I)化合物的A晶型,其XRPD图谱如图1所示。
[0014]
在本发明的一些方案中,上述式(I)化合物的A晶型的XRPD图谱解析数据如表1所示:
[0015]
表1
[0016]
[0017]
[0018]
注:3.541为基线峰。
[0019]
在本发明的一些方案中,上述式(I)化合物的A晶型,其XRPD图谱如图5所示。
[0020]
在本发明的一些方案中,上述式(I)化合物的A晶型的差示扫描量热曲线在223.58℃±3℃处具有吸热峰的起始点。
[0021]
在本发明的一些方案中,上述式(I)化合物的A晶型的DSC图谱如图2所示。
[0022]
在本发明的一些方案中,上述式(I)化合物的A晶型的热重分析曲线在111.29℃±3℃时失重达0.7427%±0.2%,在202.79℃±3℃时失重达3.6977%±0.2%。
[0023]
在本发明的一些方案中,上述式(I)化合物的A晶型的TGA图谱如图3所示。
[0024]
本发明还提供式(I)化合物的A晶型的制备方法,包括:
[0025]
(a)将式(I)化合物加入溶剂中;
[0026]
(b)30~50℃下搅拌40~55小时;
[0027]
(c)离心后挥发溶剂得到A晶型;
[0028]
其中所述的溶剂为醇类、四氢呋喃、水、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、醇类与水的混合溶剂或丙酮与水的混合溶剂。
[0029]
在本发明的一些方案中,上述醇类选自甲醇、乙醇、异丙醇和正丙醇。
[0030]
在本发明的一些方案中,上述溶剂为醇类和水的混合溶剂,醇类与水的体积比为1:0.6~1.5。
[0031]
在本发明的一些方案中,上述溶剂为醇类和水的混合溶剂,醇类与水的体积比为1:1。
[0032]
在本发明的一些方案中,上述溶剂为丙酮和水的混合溶剂,丙酮和水的体积比为1:1.5~2.5。
[0033]
在本发明的一些方案中,上述溶剂为丙酮和水的混合溶剂,丙酮和水的体积比为1:2。
[0034]
本发明还提供了式(I)化合物的制备方法,其包含如下步骤:
[0035]
[0036]
其中,R 1选自C 1-3的烷基。
[0037]
本发明的一些方案中,上述制备方法包含如下步骤:
[0038]
[0039]
其中,
[0040]
溶剂A选自DMF;
[0041]
碱B选自磷酸钾;
[0042]
溶剂C选自甲苯;
[0043]
碱D选自碳酸铯;
[0044]
催化剂E选自三(二亚苄基丙酮)二钯;
[0045]
配体F选自1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦;
[0046]
溶剂G选自四氢呋喃;
[0047]
碱H选自氢氧化钠。
[0048]
本发明的一些方案中,上述的制备方法,其中,溶剂C与中间体c的体积:质量为10:1,碱D与中间体c的摩尔比为2:1,催化剂E与中间体c的摩尔比为0.025:1,配体F与中间体c的摩尔比为0.05:1。
[0049]
本发明还提供了式e所示化合物或其药学上可接受的盐,
[0050]
[0051]
其中,R 1选自C 1-3的烷基。
[0052]
本发明的一些方案中,其中,R 1选自CH 3
[0053]
本发明还提供上述固体形式的式(I)化合物在制备治疗FXR相关疾病的药物中的应用。
[0054]
本发明还提供上述结晶形式的式(I)化合物在制备治疗FXR相关疾病的药物中的应用。
[0055]
本发明还提供上述式(I)化合物的A晶型在制备治疗FXR相关疾病的药物中的应用。
[0056]
在本发明的一些方案中,上述FXR相关疾病是非酒精性脂肪肝病。
[0057]
定义和说明
[0058]
除非另有说明,本文所用的下列术语和短语旨在含有下列含义。一个特定的短语或术语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的,而应该按照普通的含义去理解。当本文出现商品名时,旨在指代其对应的商品或其活性成分。
[0059]
本发明的中间体化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备,包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式,优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。
[0060]
本发明具体实施方式的化学反应是在合适的溶剂中完成的,所述的溶剂须适合于本发明的化学变化及其所需的试剂和物料。为了获得本发明的化合物,有时需要本领域技术人员在已有实施方式的基础上对合成步骤或者反应流程进行修改或选择。
[0061]
除非另有规定,术语“C 1-3烷基”用于表示直链或支链的由1至3个碳原子组成的饱和碳氢基团。所述C 1-3烷基包括C 1-2和C 2-3烷基等;其可以是一价(如甲基)、二价(如亚甲基)或者多价(如次甲基)。C 1-3烷基的实例包括但不限于甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(包 括n-丙基和异丙基)等。
[0062]
下面会通过实施例具体描述本发明,这些实施例并不意味着对本发明的任何限制。
[0063]
本发明所使用的所有溶剂是市售的,无需进一步纯化即可使用。
[0064]
本发明采用下述缩略词:r.t.代表室温;THF代表四氢呋喃;NMP代表N-甲基吡咯烷酮;MeSO 3H代表甲烷磺酸;DME代表乙二醇二甲醚;DCM代表二氯甲烷;Xphos代表2-双环己基膦-2’4’6’-三异丙基联苯;EtOAc代表乙酸乙酯;MeOH代表甲醇;acetone代表丙酮;2-Me-THF代表2-甲基四氢呋喃;IPA代表异丙醇。
[0065]
化合物经手工或者 软件命名,市售化合物采用供应商目录名称。
[0066]
本发明粉末X-射线衍射(X-ray powder diffractometer,XRPD)方法
[0067]
仪器型号:布鲁克D8 advance X-射线衍射仪
[0068]
测试方法:大约10~20mg样品用于XRPD检测。
[0069]
详细的XRPD参数如下:
[0070]
光管:Cu,kα,
[0071]
光管电压:40kV,光管电流:40mA
[0072]
发散狭缝:0.60mm
[0073]
探测器狭缝:10.50mm
[0074]
防散射狭缝:7.10mm
[0075]
扫描范围:3-40deg或4-40deg
[0076]
步径:0.02deg
[0077]
步长:0.12秒
[0078]
样品盘转速:15rpm
[0079]
本发明差热分析(Differential Scanning Calorimeter,DSC)方法
[0080]
仪器型号:TA Q2000差示扫描量热仪
[0081]
测试方法:取样品(~1mg)置于DSC铝锅内进行测试,在50mL/min N 2条件下,以10℃/min的升温速率,加热样品从30℃到300℃(或350℃)。
[0082]
本发明热重分析(Thermal Gravimetric Analyzer,TGA)方法
[0083]
仪器型号:TA Q5000IR热重分析仪
[0084]
测试方法:取样品(2~5mg)置于TGA铂金锅内进行测试,在25mL/min N 2条件下,以10℃/min的升温速率,加热样品从室温到350℃或失重20%。
[0085]
本发明动态蒸汽吸附分析(Dynamic Vapor Sorption,DVS)方法
[0086]
仪器型号:SMS DVS Advantage动态蒸汽吸附仪
[0087]
测试条件:取样品(10~15mg)置于DVS样品盘内进行测试。
[0088]
详细的DVS参数如下:
[0089]
温度:25℃
[0090]
平衡:dm/dt=0.01%/min(最短:10min,最长:180min)
[0091]
干燥:0%RH下干燥120min
[0092]
RH(%)测试梯级:10%
[0093]
RH(%)测试梯级范围:0%-90%-0%
[0094]
引湿性评价分类如下:
[0095]
[表0001]
吸湿性分类 ΔW%
潮解 吸收足量水分形成液体
极具吸湿性 ΔW%≥15%
有吸湿性 15%>ΔW%≥2%
略有吸湿性 2%>ΔW%≥0.2%
无或几乎无吸湿性 ΔW%<0.2%

[0096]
注:ΔW%表示受试品在25±1℃和80±2%RH下的吸湿增重。
[0097]
技术效果
[0098]
式(I)化合物A晶型稳定、略有吸湿性、受光热影响小。
[0099]
式(I)化合物可显著性降低NAS分值;改善炎症并具有一定的剂量依赖性;对肝脏脂肪变性的显著改善作用,可明显改善肝脏功能,降低肝损;改善肝脏纤维化并有一定的剂量依赖性。

附图说明

[0100]
图1为式(I)化合物A晶型的Cu-Kα辐射的XRPD谱图;
[0101]
图2为式(I)化合物A晶型的DSC谱图;
[0102]
图3为式(I)化合物A晶型的TGA谱图;
[0103]
图4为式(I)化合物A晶型的DVS谱图;
[0104]
图5为式(I)化合物A晶型的Cu-Kα辐射的XRPD谱图。

具体实施方式

[0105]
为了更好的理解本发明的内容,下面结合具体实施例来做进一步的说明,但具体的实施方式并不是对本发明的内容所做的限制。
[0106]
实施例1:式(I)化合物制备
[0107]
[0108]
步骤1:中间体c的合成
[0109]
称取a(500.62克,1.65摩尔),b(323.84克,1.98摩尔),加入DMF(5.0升)中,搅拌溶清后加入磷酸钾(877.10克,4.13摩尔)。反应液升温至50摄氏度,搅拌反应16小时。反应液冷却至20摄氏度。将反应液缓慢倒入搅拌的水(40升)中,有大量白色固体析出。搅拌15分钟后,过滤,滤饼用少量水淋洗。将滤饼转移旋干,得到粗品c(927.65克)。将粗品c(927.65克)加入乙醇(2.5升)中,升温至100摄氏度。搅拌1小时。缓慢降温至20摄氏度,继续搅拌16小时。将悬浊液过滤,得到白色固体。转移固体,旋干。得到中间体c(584.63克)。 1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ=8.62(br s,1H),7.43-7.38(m,2H),7.36-7.30(m,1H),6.71-6.54(m,3H),4.76(s,2H),2.94-2.82(m,2H),2.64-2.54(m,2H),2.16(tt,J=5.1,8.5Hz,1H),1.33-1.24(m,2H),1.17-1.09(m,2H).
[0110]
步骤2:中间体e的合成
[0111]
在氮气流保护下,向10升的三口反应瓶中加入甲苯(5.5升)。20摄氏度依次加入中间体c(551.12克,1.28摩尔),d(396.12克,1.92摩尔)和碳酸铯(834.98克,2.56摩尔),最后加入三(二亚苄基丙酮)二钯(29.42克,32.13毫摩尔)和1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦 (39.98克,64.21毫摩尔)。体系置于油浴中加热。油浴温度115摄氏度,机械搅拌反应48小时。反应液降温至20摄氏度。硅藻土(1.0公斤)过滤,滤液(约5升)加乙酸乙酯(8升)稀释,水洗(6升×2次),饱和食盐水洗(6升×1次)。有机相旋干,得到黄色油状物(1.12公斤)。将黄色油状物(1.12公斤)加入甲醇(1.2升)中,搅拌2小时。有大量黄色固体出现。过滤,滤饼用少量冷的甲醇淋洗。转移滤饼,旋干。得到中间体e的粗品(492克)。
[0112]
将上述中间体e的粗品(492克,粗品)悬浮于5.0升的乙酸乙酯中。体系置于油浴中加热,油浴温度为100摄氏度。搅拌2小时,体系澄清。自然降温至20摄氏度,有黄色固体析出,继续搅拌16小时。体系过滤,滤饼用少量乙酸乙酯淋洗,固体旋干,得到黄色固体1(221.56克)。
[0113]
将上述黄色固体1(221.56克)溶于2.5升四氢呋喃中,加入活性炭(110.78克)。体系于50摄氏度搅拌16小时。体系降温至20摄氏度,硅藻土(250克)过滤,滤液旋干,得到中间体e(220.11克)。
[0114]
LCMS(ESI):C 29H 22Cl 3N 3O 5[M+H] +:597.9,599.8
[0115]
1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ=9.11(d,J=2.01Hz,1H)8.49(d,J=2.01Hz,1H)7.28-7.40(m,3H)6.69(d,J=2.76Hz,1H)6.50(dd,J=8.91,2.89Hz,1H)6.03(d,J=8.78Hz,1H)4.74(s,2H)3.99(s,3H)2.95-3.10(m,2H)2.75-2.85(m,2H)2.13(tt,J=8.41,5.02Hz,1H)1.62(s,1H)1.22-1.29(m,2H)1.06-1.18(m,2H)。
[0116]
步骤3
[0117]
将中间体e(220.11克,367.55毫摩尔)溶于2.5升四氢呋喃中,溶液降温至5摄氏度。将氢氧化钠(13.97克,349.17毫摩尔)的水(650毫升)溶液缓慢滴加至上述体系中。约40分钟滴毕,内温维持在4-8摄氏度。继续搅拌反应1小时。向反应液中加入5升水,用甲叔醚萃取(3升×3),分液,弃去有机相。水相用1摩尔/升的盐酸调pH=3-4.用乙酸乙酯萃取(6升×1次),分液,弃去水相。有机相旋干,得到237.65克粗品。将粗品加入500毫升乙腈中,于20摄氏度搅拌24小时。过滤,滤饼用乙腈(200毫升)淋洗。将滤饼旋干,得到式(I)化合物。 1H NMR(400MHz,d 4-MeOH)δ=9.09(d,J=2.0Hz,1H),8.59(d,J=2.0Hz,1H),7.52-7.41(m,3H),6.75(d,J=2.8Hz,1H),6.53(dd,J=2.9,8.7Hz,1H),6.07(d,J=9.0Hz,1H),4.85(s,2H),3.10-3.00(m,2H),2.83-2.72(m,2H),2.30(quin,J=6.8Hz,1H),1.20-1.16(m,4H)
[0118]
实施例2:式(I)化合物A晶型的制备
[0119]
称50毫克式(I)化合物加入1.5毫升液相小瓶中,分别加入500微升的甲醇,超声混匀,将悬浊液样品置于恒温振荡仪上(40℃)搅拌2天。将溶解样品快速离心,取上清液于离心管中,铝箔纸包扎管口,扎小孔,挥发。得式(I)化合物的A晶型。
[0120]
称50毫克式(I)化合物加入1.5毫升液相小瓶中,分别加入500微升的乙醇,超声混匀。将悬浊液样品置于恒温振荡仪上(40℃)搅拌2天。将溶解样品快速离心,取上清 液于离心管中,铝箔纸包扎管口,扎小孔,挥发。得式(I)化合物的A晶型。
[0121]
称50毫克式(I)化合物加入1.5毫升液相小瓶中,分别加入500微升的丙酮,超声混匀。将悬浊液样品置于恒温振荡仪上(40℃)搅拌2天。将溶解样品快速离心,取上清液于离心管中,铝箔纸包扎管口,扎小孔,挥发。得式(I)化合物的A晶型。
[0122]
称50毫克式(I)化合物加入1.5毫升液相小瓶中,分别加入500微升的乙腈,超声混匀。将悬浊液样品置于恒温振荡仪上(40℃)搅拌2天。将溶解样品快速离心,取上清液于离心管中,铝箔纸包扎管口,扎小孔,挥发。得式(I)化合物的A晶型。
[0123]
称50毫克式(I)化合物加入1.5毫升液相小瓶中,分别加入500微升的乙酸乙酯,超声混匀。将悬浊液样品置于恒温振荡仪上(40℃)搅拌2天。将溶解样品快速离心,取上清液于离心管中,铝箔纸包扎管口,扎小孔,挥发。得式(I)化合物的A晶型。
[0124]
称50毫克式(I)化合物加入1.5毫升液相小瓶中,分别加入200微升的四氢呋喃,超声溶解。将悬浊液样品置于恒温振荡仪上(40℃)搅拌2天。将溶解样品快速离心,取上清液于离心管中,铝箔纸包扎管口,扎小孔,挥发。得式(I)化合物的A晶型。
[0125]
称50毫克式(I)化合物加入1.5毫升液相小瓶中,分别加入500微升的水,超声混匀或溶解。将悬浊液样品置于恒温振荡仪上(40℃)搅拌2天。将溶解样品快速离心,取上清液于离心管中,铝箔纸包扎管口,扎小孔,挥发。得式(I)化合物的A晶型。
[0126]
称50毫克式(I)化合物加入1.5毫升液相小瓶中,分别加入加入甲醇:水体积比为1:1的混合溶液(500微升),超声混匀或溶解。将悬浊液样品置于恒温振荡仪上(40℃)搅拌2天。将溶解样品快速离心,取上清液于离心管中,铝箔纸包扎管口,扎小孔,挥发。得式(I)化合物的A晶型。
[0127]
称50毫克式(I)化合物加入1.5毫升液相小瓶中,分别加入乙醇:水体积比为1:1的混合溶液(500微升),超声混匀或溶解。将悬浊液样品置于恒温振荡仪上(40℃)搅拌2天。将溶解样品快速离心,取上清液于离心管中,铝箔纸包扎管口,扎小孔,挥发。得式(I)化合物的A晶型。
[0128]
称50毫克式(I)化合物加入1.5毫升液相小瓶中,分别加入丙酮:水体积比为1:2的混合溶液(500微升),超声混匀或溶解。将悬浊液样品置于恒温振荡仪上(40℃)搅拌2天。将溶解样品快速离心,取上清液于离心管中,铝箔纸包扎管口,扎小孔,挥发。得式(I)化合物的A晶型。
[0129]
实施例3:式(I)化合物A晶型的吸湿性研究
[0130]
实验材料:
[0131]
SMS DVS Advantage动态蒸汽吸附仪
[0132]
实验方法:
[0133]
取式(I)化合物A晶型10~15mg置于DVS样品盘内进行测试。
[0134]
实验结果:
[0135]
式(I)化合物A晶型的DVS谱图如图所示,△W=0.5834%。
[0136]
实验结论:
[0137]
式(I)化合物A晶型在25℃和80%RH下的吸湿增重为0.5834%,略有吸湿性。
[0138]
实施例4:式(I)化合物A晶型的固体稳定性试验
[0139]
依据《原料药与制剂稳定性试验指导原则》(中国药典2015版四部通则9001),考察化合物A晶型分别在高温(60℃,敞口)、高湿(室温/相对湿度92.5%,敞口)及强光照(5000lx,敞口)条件下的稳定性。
[0140]
称取式(I)化合物A晶型5mg,置于玻璃样品瓶的底部,摊成薄薄一层。高温及高湿条件下放置的样品用铝箔纸封瓶口,并在铝箔纸上扎些小孔,保证样品能与环境空气充分接触;强光照条件下放置的样品用铝箔纸密封。不同条件下放置的样品于第5天,10天取样检测XRPD,检测结果与0天的初始检测结果进行比较,试验结果见下表3所示:
[0141]
表2化合物A晶型的固体稳定性试验结果
[0142]
[0143]
结论:化合物A晶型在高温、高湿、强光照条件下具有良好的稳定性。
[0144]
实施例5:式(I)化合物的体内药效实验
[0145]
1、实验设计
[0146]
本试验的造模包括高脂饲料喂养和CCl 4诱导两个步骤,首先以高脂饲料喂养小鼠诱导产生非酒精性脂肪肝,挑选体重>35g的小鼠,继续饲喂高脂饲料的同时,腹腔注射给与25%CCl 4,0.5mg/kg,每周两次,共四周。
[0147]
将开始给CCl 4的当天定为第0天,开始CCl 4的时间定为第0小时,在开始给CCl 4的当天,开始灌胃给药,健康对照组,1%羟丙基甲基纤维素(HPMC)模型组及PX104对照组的给药体积为5mL/kg,每天一次,持续4周(28天),而式(I)化合物给药组及相应溶媒(40%PEG400/10%solutol/50%水)模型组前13天(Day0-Day12)的给药体积为5mL/kg,后15天(Day13-Day27)的给药体积为10mL/kg,每天一次。CCl 4的注射时间应与当天的第一次给药时间点间隔4小时以上。
[0148]
实验一共分为7组,即健康对照组、1%HPMC模型组、参比化合物组(PX104)、受试化合物组(式(I)化合物,三个剂量)和相应的溶媒模型组。
[0149]
健康对照组为6只正常小鼠,实验期间给予普通饲料喂养,不注射CCl 4
[0150]
48只肥胖小鼠用于模型组及给药组,每组为8只小鼠,分组后开始腹腔注射CCl 4并分别给予不同剂量的药物或溶媒。
[0151]
试验数据以Mean±SEM表示,采用分析软件Graphpad Prism6中,两组之间比较,选择T-test分析。#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001与健康对照组比较;*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001与模型组作比较,PX-104组与模型组(1%HPMC)组比较,式(I)化合物组与溶媒模型组比较。
[0152]
2、式(I)化合物对NAS评分的改善
[0153]
对于非酒精性脂肪肝炎动物模型肝脏病理学的分析,参照NAFLD临床病理学诊断和评估标准,运用NAFLD活动度积分(NAFLD activity score,NAS),在肝细胞脂肪变、肝细胞气球样变和肝小叶炎症聚集三方面综合评价化合物对NAFLD的治疗药效。
[0154]
表3.非酒精性脂肪性肝炎评价标准
[0155]
[0156]
与健康对照组相比,两组模型组NAS分值显著性升高(p<0.001);阳性对照PX104在15mg/kg(p<0.001vs 1%HPMC模型组)剂量下可以显著性降低NAS分值;与溶媒模型组(40%PEG400/10%solutol/50%water)相比,受试化合物式(I)化合物在测试剂量7.5mg/kg,15mg/kg和45mg/kg下均可显著性降低NAS分值。结果见表4。
[0157]
表4.NAS评分
[0158]
[0159]
与健康对照组相比,两组模型组炎症分值显著性升高;参比化合物PX-104在15mg/kg(p<0.001vs 1%HPMC模型组)剂量下可以显著性改善炎症。与溶媒模型组相比,受试化合物式(I)化合物在测试剂量7.5mg/kg,15mg/kg和45mg/kg下均表现出对炎症的改善作用,且具有一定的剂量依赖性。结果见表5。
[0160]
表5.炎症改善实验
[0161]
[0162]
与健康对照组相比,两组模型组脂肪变性程度显著性升高;参比化合物PX-104在15mg/kg剂量下表现出对肝脏脂肪变性的显著性改善作用(p<0.001vs 1%HPMC模型组)。与溶媒模型组相比,受试化合物式(I)化合物在测试剂量7.5mg/kg和45mg/kg下均表现出对肝脏脂肪变性的显著改善作用。结果见表6。
[0163]
表6.肝脏脂肪变性实验
[0164]
[0165]
所有试验小鼠均没有表现出肝脏气球样变。结果见表7
[0166]
表7.肝脏气球样变实验
[0167]
[0168]
注:0.021 @的产生是该组中有只小鼠的气球样变数据为0.17,经G检验,该数值为异常值。
[0169]
3、式(I)化合物对肝脏纤维化的改善
[0170]
所有天狼星红染色的切片经Digital pathscope 4S切片扫描仪进行整片扫描,在5倍视 野下随机选取2个视野,2个视野覆盖肝组织的85%面积,再利用Image pro-plus6.0软件进行定量分析,计算切片中纤维化沉积面积。与健康对照组相比,两组模型组纤维化程度显著性升高(p<0.001);参比化合物PX-104在15mg/kg剂量下表现出对肝脏纤维化的显著性改善作用(p<0.05vs 1%HPMC模型组)。与溶媒模型组相比,受试化合物式(I)化合物在测试剂量15mg/kg和45mg/kg下均表现对肝脏纤维化的改善作用,且具有一定的剂量依赖性。结果见表8。
[0171]
表8.肝脏纤维化实验
[0172]
[0173]
结论:
[0174]
本次试验形成了以NAS分值显著性升高、肝脏明显纤维化为特征的典型NASH模型。
[0175]
本实验结果显示式(I)化合物可显著性降低NAS分值;改善炎症并具有一定的剂量依赖性;对肝脏脂肪变性的显著改善作用,可明显改善肝脏功能,降低肝损;改善肝脏纤维化并有一定的剂量依赖性。
[0176]
实施例6:式(I)化合物的体外生物活性测试
[0177]
FXR生化实验
[0178]
实验目的:
[0179]
通过均相邻近发光放大实验(alphascreen)检测化合物对FXR结合反应的激活作用。
[0180]
实验材料:
[0181]
1.蛋白:谷胱甘肽-S-转移酶标记的FXR人源蛋白(Invitrogen)
[0182]
2.共激活因子:生物素标记的类固醇受体辅活化子(Anaspec)
[0183]
3.检测试剂:均相邻近发光放大实验(alphascreen)检测试剂盒(PerkinElmer)
[0184]
实验方法:
[0185]
1.化合物稀释:将待测化合物制备为40μM的DMSO溶液,随后将化合物3倍稀释至10个浓度点。参照化合物制备为400μM的DMSO溶液,随后以1.5倍稀释至10个浓度点。将稀释好的DMSO溶液以每孔150nl的体积加入384孔板的微孔中。
[0186]
2.将谷胱甘肽-S-转移酶标记的FXR人源蛋白和生物素标记的类固醇受体辅活化子配置浓度分别为0.4nM和30nM的混合溶液。以每孔15μL的体积加入384孔板的微孔中。室温孵育1小时。
[0187]
3.将均相邻近发光放大实验(alphascreen)检测试剂盒中的受体小球混合液稀释125倍,以每孔7.5μL体积加入384孔板的微孔中。实验过程避光操作。室温孵育1小时。
[0188]
4.将均相邻近发光放大实验(alphascreen)检测试剂盒中的供体小球混合液稀释125倍,以每孔7.5μL体积加入384孔板的微孔中。实验过程避光操作。室温孵育1小时。
[0189]
5.EC50测试:采用Envision于680nm波长处激发,读取520-620nm处的吸收信号。
[0190]
6.分析数据:用Prism 5.0来分析数据,计算化合物的激活作用EC 50值。
[0191]
表9.式(I)化合物对FXR的激活作用
[0192]
[表0002]
化合物 EC50(nM)均值±标准偏差
式(I)化合物 13.85±0.89(N=3)
PX-104 65.17(N=1)

[0193]
结论:
[0194]
本实验结果显示式(I)化合物对FXR有显著激动作用。

权利要求书

[权利要求 1]
式(I)化合物的固体形式。
[权利要求 2]
式(I)化合物的结晶形式。
[权利要求 3]
式(I)化合物的A晶型,其特征在于其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰:3.54±0.2°,12.72±0.2°,25.27±0.2°。
[权利要求 4]
根据权利要求3所述的式(I)化合物的A晶型,其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰:3.54±0.2°,11.86±0.2°,12.72±0.2°,16.15±0.2°,17.40±0.2°,19.72±0.2°,24.18±0.2°,25.27±0.2°。
[权利要求 5]
根据权利要求4所述的式(I)化合物的A晶型,其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰:3.54±0.2°,11.86±0.2°,12.72±0.2°,16.15±0.2°,17.40±0.2°,19.72±0.2°,20.38±0.2°,22.60±0.2°,23.80±0.2°,24.18±0.2°,25.27±0.2°。
[权利要求 6]
根据权利要求5所述的式(I)化合物的A晶型,其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰:3.54±0.2°,11.86±0.2°,12.72±0.2°,13.67±0.2°,16.15±0.2°,17.40±0.2°,19.72±0.2°,20.38±0.2°,22.60±0.2°,23.80±0.2°,24.18±0.2°,25.27±0.2°,26.57±0.2°。
[权利要求 7]
根据权利要求6所述的式(I)化合物的A晶型,其XRPD图谱如图1所示。
[权利要求 8]
根据权利要求3所述的式(I)化合物的A晶型,其XRPD图谱如图5所示。
[权利要求 9]
根据权利要求2所述的式(I)化合物的结晶形式或权利要求3~7任意一项所述的式(I)化合物的A晶型,其差示扫描量热曲线在223.58℃±3℃处具有吸热峰的起始点。
[权利要求 10]
根据权利要求7所述的式(I)化合物的A晶型,其DSC图谱如图2所示。
[权利要求 11]
根据权利要求2~7任意一项所述的式(I)化合物的A晶型,其热重分析曲线在111.29℃±3℃时失重达0.7427%±0.2%,在202.79℃±3℃时失重达3.6977%±0.2%。
[权利要求 12]
根据权利要求11所述的式(I)化合物的A晶型,其TGA图谱如图3所示。
[权利要求 13]
式(I)化合物的A晶型的制备方法,包括: (a)将式(I)化合物加入溶剂中; (b)30~50℃下搅拌40~55小时; (c)离心后挥发溶剂得到式(I)化合物的A晶型; 其中所述的溶剂为醇类、四氢呋喃、水、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、醇类与水的混合溶剂或丙酮与水的混合溶剂。
[权利要求 14]
根据权利要求13所述的制备方法,其中,所述醇类选自甲醇、乙醇、异丙醇和正丙醇。
[权利要求 15]
根据权利要求13所述的制备方法,其中,所述溶剂为醇类与水的混合溶剂,醇类与水的体积比为1:0.6~1.5。
[权利要求 16]
根据权利要求15所述的制备方法,其中,所述溶剂为醇类与水的混合溶剂,醇类与水的体积比为1:1。
[权利要求 17]
根据权利要求13所述的制备方法,其中,所述溶剂为丙酮与水的混合溶剂,丙酮与水的体积比为1:1.5~2.5。
[权利要求 18]
根据权利要求17所述的制备方法,其中,所述溶剂为丙酮与水的混合溶剂,丙酮与水的体积比为1:2。
[权利要求 19]
式(I)化合物的制备方法,其包含如下步骤: 其中,R 1选自C 1-3的烷基。
[权利要求 20]
根据权利要求19所述的式(I)化合物的制备方法,其包含如下步骤: 其中, 溶剂A选自DMF; 碱B选自磷酸钾; 溶剂C选自甲苯; 碱D选自碳酸铯; 催化剂E选自三(二亚苄基丙酮)二钯; 配体F选自1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦; 溶剂G选自四氢呋喃; 碱H选自氢氧化钠。
[权利要求 21]
根据权利要求19或20所述的式(I)化合物的制备方法,其中,溶剂C与中间体c的体积:质量为10:1,碱D与中间体c的摩尔比为2:1,催化剂E与中间体c的摩尔比为0.025:1,配体F与中间体c的摩尔比为0.05:1。
[权利要求 22]
式e所示化合物或其药学上可接受的盐, 其中,R 1选自C 1-3的烷基。
[权利要求 23]
根据权利要求21所示的化合物或其药学上可接受的盐,其中,R 1选自CH 3
[权利要求 24]
根据权利要求1所述的固体形式的式(I)化合物在制备治疗FXR相关疾病的药物中的应用。
[权利要求 25]
根据权利要求2所述的结晶形式的式(I)化合物在制备治疗FXR相关疾病的药物中的应用。
[权利要求 26]
根据权利要求3~12任意一项所述式(I)化合物的A晶型在制备治疗FXR相关疾病的药物中的应用。
[权利要求 27]
根据权利要求24~26任意一项所述的应用,所述FXR相关疾病是非酒精性脂肪肝病。

附图

[ 图 1]  
[ 图 2]  
[ 图 3]  
[ 图 4]  
[ 图 5]