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1. WO2020108237 - MILIEU DE CULTURE CHROMOGÈNE POUR LA DÉTECTION DE SOUCHES DE E. COLI O157 ET NON-O157

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说明书

发明名称 0001   0002   0003   0004   0005   0006   0007   0008   0009   0010   0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061   0062   0063   0064   0065   0066   0067   0068   0069   0070   0071   0072   0073   0074   0075   0076   0077   0078   0079   0080   0081   0082   0083   0084   0085   0086   0087   0088   0089   0090   0091   0092   0093   0094   0095   0096   0097   0098  

权利要求书

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  

附图

1   2   3   4   5  

说明书

发明名称 : 一种用于检测大肠杆菌O157与非O157大肠杆菌的显色培养基

技术领域

[0001]
本发明涉及微生物检测技术领域,具体涉及一种用于检测大肠杆菌O157与非O157大肠杆菌的显色培养基。

背景技术

[0002]
大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)被普遍视为与食品、水、饲料、临床和环境样本卫生质量、清洁程度或致病风险密切相关的粪便污染指示菌。其中,E.coli O157可导致人类无症状的排泌、非血性腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合症甚至死亡等不同后果的病症,是肠道出血性(或产志贺毒素)E.coli(EHEC或STEC)中最主要的致病血清型,已成为引起世界范围内广泛关注的一种重要致病菌。然而,除了E.coli O157之外,non-O157 E.coli包括non-O157 EHEC(或STEC)以及其它如肠道致病性E.coli(EPEC)、产肠毒素E.coli(ETEC)、肠道侵袭性E.coli(EIEC)、肠道集聚性E.coli(EAEC)以及其它仍需进一步流行病学研究的致病型如弥散粘附性E.coli(DAEC)等也能导致人类腹泻等病症爆发,也是需要引起重视的(Gomes et al.,Brazilian Journal of Microbiology,2016,47:3-30;Mead et al.,Lancet,1998,352:1207-1212;Pennington et al.,Lancet,2010,376:1428-1435;Yang et al.,Archives of Microbiology,2017,199:811-825.)。因此,检测E.coli O157与non-O157 E.coli,对于保障食品安全等公共卫生安全是必不可少的。
[0003]
尽管目前已有多种关于检测E.coli的显色培养基被发展出来,但是它们仍然难以满足这样的“一款多用”目的,即在相对较高特异地检测E.coli O157与non-O157 E.coli上均可应用。例如,TBX琼脂(Tryptone Bile X-glucuronide agar)已被国际标准(ISO 16649-3:2015和ISO/TS 13136:2012)推荐应用于计数具有β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase)活性的E.coli与分离包括无β-葡萄糖醛酸苷酶活性E.coli O157在内等STEC,但它只含有X-glucuronide一种显色底物,只能使具有β-葡萄糖醛酸苷酶活性的non-O157 E.coli显蓝绿色,而不具有β-葡萄糖醛酸苷酶活性的E.coli O157与很多种杂菌均显无色,导致E.coli O157难以被辨别,使检测、鉴定工作量大幅度增加。Chromocult(Merck,德国)、Coli ID(bioMérieux,法国)、CHROMagar ECC(Chromagar,法国)、HiCrome ECC(Union Carbide,美国)等这些显色培养基添加了两种不同酶(β-半乳糖苷酶与β-葡萄糖醛酸苷酶)显色底物,可用于检测大肠菌群和具有β-葡萄糖醛酸苷酶活性的non-O157 E.coli;但在它们上面,E.coli O157与其它大肠菌群均显相同的颜色而难以被区分(Manafi M.,International Journal of Food Microbiology,2000,60:205-218.)。而E.coli O157显色培养基又只适用于特异性检测E.coli O157,对non-O157 E.coli的检测效果比较差,例如CHROMagar O157(Chromagar,法国)、Rainbow Agar O157(Biolog Inc.,美国)和Rapid E.coli O157:H7(Bio-Rad)等等(Verhaegen et al.,International Journal of Environmental Research and Public Health,2015,12:6965-6978;Fan et al.,International Journal of Food Microbiology,2018,266:295-300.)。
[0004]
发明内容
[0005]
本发明的目的在于提供一种用于检测大肠杆菌O157与非O157大肠杆菌的显色培养基。
[0006]
本发明通过以下技术方案来实现:
[0007]
一种用于检测大肠杆菌O157与非O157大肠杆菌的显色培养基,不含有山梨醇、也不含有中性红,但含有两种能产生无扩散性的不同颜色信号的显色底物和一种不显色但能产生无扩散性的非蓝色荧光信号的荧光底物,所述的显色底物和荧光底物中除了含有β-葡萄糖醛酸苷酶底物和β-半乳糖苷酶底物外,还至少含有β-葡萄糖苷酶底物、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶底物、纤维二糖苷酶底物这三种所产颜色或荧光信号相同或相近底物中的一种底物。
[0008]
优选地,所述的显色底物为基于3-吲哚酚衍生物的吲哚酚基显色底物,所述的3-吲哚酚衍生物的结构如下式(I)所示:
[0009]
[0010]
上式中的R可以为单取代基团,也可为多取代基团。
[0011]
优选地,所述的3-吲哚酚衍生物为5-溴-4-氯-3-吲哚酚、5-溴-6-氯-3-吲哚酚或6-氯-3-吲哚酚等。
[0012]
优选地,所述的基于3-吲哚酚衍生物的吲哚酚基显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸苷环己胺盐或5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸苷环己胺盐。
[0013]
优选地,所述的荧光底物为基于2-(苯并噻唑-2'-基)苯酚衍生物的的荧光底物,所述的2-(苯并噻唑-2'-基)苯酚衍生物的结构如下式(2)所示:
[0014]
[0015]
上式中的R1和R2代表卤原子或烷氧基等基团。
[0016]
优选地,所述的2-(苯并噻唑-2'-基)苯酚衍生物为2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯酚等。
[0017]
优选地,所述的基于2-(苯并噻唑-2'-基)苯酚衍生物的荧光底物为2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷、2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-半乳糖苷或2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖苷。
[0018]
优选地,所述的荧光物2-(苯并噻唑-2'-基)苯酚衍生物是根据文献[Otsubo et al.Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,2013,23(7):2245-2249]报道的方法合成。而基于2-(苯并噻唑-2'-基)苯酚衍生物的荧光底物的合成方法包括两步反应,具体步骤为:
[0019]
S1:以2-(苯并噻唑-2'-基)苯酚衍生物为糖基受体,相应的乙酰卤代糖为糖基供体,氧化银或碳酸铯为催化剂,乙腈为溶剂,进行糖基化反应,得到含保护基团乙酰基的目标糖苷底物;
[0020]
S2:将得到的含保护基团乙酰基的目标糖苷底物置于含氢氧化钾或氢氧化锂的甲醇和四氢呋喃混合体系中进行脱保护基反应,得到目标荧光底物。
[0021]
上述合成方法中,对于相应的β-葡萄糖醛酸苷合成时,优选氢氧化锂作为碱;而对于其它糖苷合成时,优选氢氧化钾作为碱。
[0022]
优选地,所述的催化剂(氧化银或碳酸铯)与糖基供体(乙酰卤代糖)在投料摩尔量上均多于糖基受体(2-(苯并噻唑-2'-基)苯酚衍生物),优选,所述的催化剂:糖基供体:糖基受体的投料摩尔比为1.5:1.5:1.0。
[0023]
优选地,本发明用于检测大肠杆菌O157与非O157大肠杆菌的显色培养基,还含有十二烷基硫酸钠(SDS)和(或)胆盐(3号胆盐、脱氧胆酸钠等)、细菌存活和生长所需的成分(如蛋白胨、酵母提取粉、氯化钠等)、琼脂、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)以及可能含有的少量乳糖、水杨苷或纤维二糖、吐温80或曲拉通X-100。需要说明的是,通过适当地控制显色培养基中SDS和胆盐的用量等措施,可更好地抑制背景菌的生长,从而提高对O157/non-O157 E.coli的选择性。
[0024]
优选地,所述的显色培养基中显色底物和荧光底物的浓度均为0.01~0.30g/L。
[0025]
优选地,所述的显色培养基还含有十二烷基硫酸钠0.05~0.25g/L和/或胆盐0~1.50g/L、蛋白胨1~20g/L、酵母提取粉0~6g/L、氯化钠4~8g/L、琼脂10~20g/L、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷0.01~0.10g/L。
[0026]
优选地,所述的显色培养基还含有乳糖、水杨苷或纤维二糖0.01~0.15g/L。
[0027]
优选地,所述的显色培养基还含有吐温80 0~0.60mL/L或曲拉通X-100 0~0.20mL/L。
[0028]
所述的β-葡萄糖醛酸苷酶底物为羧酸形式或羧酸盐形式。
[0029]
与现有技术相比,本发明的优势在于:
[0030]
本发明用于检测大肠杆菌O157与非O157大肠杆菌的显色培养基可以在显色培养基种类选择以及相关处理工作(如显色培养基使用前的平板制备工作等)上投入减少的情况下,仍然可以满足既 能用于检测E.coli O157、也能用于检测非O157 E.coli的多重目的,并且检测的特异性相对较高。

附图说明

[0031]
图1为荧光底物2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷、2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-半乳糖苷或2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖苷的合成路线。
[0032]
图2为实施例4的用于检测大肠杆菌O157与非O157大肠杆菌的显色培养基对E.coli O157 ATCC 35150、E.coli ATCC 25922、阪崎肠杆菌ATCC 29544和鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028四种不同致病菌在37℃下有氧培养18h后的检测效果。其中,平板中右上方、左上方、左下方、右下方依次为E.coli O157 ATCC 35150、E.coli ATCC 25922、阪崎肠杆菌ATCC 29544和鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028,A为可见光下,B为365nm紫外光下,C为可见光和手电筒375nm紫外光下。
[0033]
图3为实施例4、5、6的用于检测大肠杆菌O157与非O157大肠杆菌的显色培养基对E.coli O157、non-O157 E.coli以及非大肠杆菌在37℃下分别有氧培养12h、18h后的检测效果。其中,A:实施例4组,B:实施例5组,C:实施例6组;下标1表示在可见光下观察,下标2表示在365nm紫外灯光下观察,Ⅰ为A至C显色培养基平板中各菌对应的编号。
[0034]
图4为实施例7的用于检测大肠杆菌O157与非O157大肠杆菌的显色培养基对E.coli O157、non-O157 E.coli以及非大肠杆菌在37℃下分别有氧培养12h、18h后的检测效果。其中,左图表示在可见光下观察,右图表示在365nm紫外灯光下观察;Ⅰ为显色培养基平板中各菌对应的编号。
[0035]
图5为一些已有培养基对E.coli O157、non-O157 E.coli以及非大肠杆菌在37℃下分别有氧培养12h、18h后的检测效果。其中,D:TBX琼脂组,E:CHROMagar E.coli组,F:CHROMagar O157组;G:山梨醇-麦康凯培养基(SMAC)组,下标1表示在可见光下观察,下标2表示在365nm紫外灯光下观察;Ⅰ为D至G显色培养基平板中各菌对应的编号。

具体实施方式

[0036]
以下实施例是对本发明的进一步说明,而不是对本发明的限制。
[0037]
实施例1 2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷的合成
[0038]
(1)糖基化反应
[0039]
将0.612g(2.00mmol)荧光物2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯酚(1)、0.695g(3.00mmol,1.5e.q.)氧化银、1.192g(3.00mmol,1.5e.q.)三乙酰基-α-D-溴代葡萄糖醛酸甲酯(2a)置于含2.0g 4A分子筛的16mL干燥乙腈中,并于氩气氛围、避光和室温条件下搅拌反应32h。然后,将反应混合物用装填有致密的300-400目柱层层析硅胶层的砂芯漏斗抽滤,用二氯甲烷和乙酸乙酯混合液(v/v=2/1)洗涤,合并洗脱液并减压旋蒸去除溶剂,依次用无水乙醇、乙酸乙酯重结晶,抽滤,干燥后可得约0.348g(产率约28%)含保护基的目标糖苷底物(3a)。
[0040]
或者,将0.306g(1.00mmol)荧光物2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯酚(1)、0.652g(2.00mmol)碳酸铯置于10mL干燥乙腈中搅拌10min后,加入0.596g(1.50mmol)三乙酰基-α-D-溴代葡萄糖醛酸甲酯(2a),室温下搅拌反应2h。然后,将反应混合物用装填有致密的300-400目柱层层析硅胶层的砂芯漏斗抽滤,用二氯甲烷和乙酸乙酯混合液(v/v=2/1)洗涤,合并洗脱液并减压旋蒸去除溶剂,依次用无水乙醇、乙酸乙酯重结晶,抽滤,干燥可得到约0.137g(产率约22%)含保护基的目标糖苷底物(结构式见式3a)。
[0041]
[0042]
1H-NMR(500MHz,CDCl 3):δ=8.65(s,1H),8.10(d,J=8.0Hz,1H),7.94(d,J=8.0Hz,1H),7.55(d,J=8.7Hz,1H),7.51(t,J=7.6Hz,1H),7.41(t,J=7.5Hz,1H),7.11(d,J=8.8Hz,1H),5.52(t,J=8.0Hz,1H),5.45(t,J=9.3Hz,1H),5.39(d,J=7.5Hz,1H),5.35(t,J=9.3Hz,1H),4.27(d,J=9.4Hz,1H),3.71(s,3H),2.06(s,3H),2.05(s,3H),1.81(s,3H)ppm. 13C-NMR(126MHz,CDCl 3):δ=170.12,169.29,166.59,160.77,153.03,151.80,136.10,134.35,132.49,126.37,125.41,125.19,123.14,121.39,116.95,116.55,98.97,72.85,72.08,71.10,68.70,53.11,20.61,20.55,20.52ppm.HRMS(ESI):m/z[M+H] +Calcd.for C 26H 25BrNO 10S:622.0377;found:622.0375。
[0043]
(2)脱保护基反应
[0044]
取0.200g(0.32mmol)上述步骤(1)所得含保护基的目标糖苷底物(3a)置于12mL无水的甲醇和四氢呋喃混合溶剂(v/v=1/2)中,冰水浴冷却下加入8mg(0.32mmol,1.0e.q.)LiOH,于2~8℃下搅拌反应6h,然后加入Amberlite IR-120(H +)氢型阳离子交换树脂中和,过滤,将滤液于40±2℃水浴下减压旋蒸去除溶剂后,加入12mL甲醇和四氢呋喃混合溶剂(v/v=1/1),冰水浴冷却后,加入0.96mL LiOH(0.5mol/L)水溶液,于冰水浴下搅拌反应6h,然后加入6mL四氢呋喃,并加入Amberlite IR-120(H +)氢型阳离子交换树脂调pH值至4~5,过滤,将滤液置于30~35℃水浴下减压旋蒸去除有机溶剂,再真空冷冻干燥,然后加入二氯甲烷充分搅拌,过滤,再将固体置于二氯甲烷中充分搅拌,过滤,重复3次后,用乙腈洗涤,干燥后得到约79mg(产率约51%)最终目标产物2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷(结构式见式4a)。
[0045]
[0046]
1H-NMR(500MHz,DMSO-d 6):δ=8.55(s,1H),8.13(d,J=8.1Hz,1H),8.10(d,J=8.0Hz,1H),7.73(d,J=8.4Hz,1H),7.57(t,J=7.2Hz,1H),7.48(t,J=6.7Hz,1H),7.38(d,J=8.5Hz,1H),5.55(d,J=4.5Hz,1H),5.46(d,J=7.5Hz,1H),5.39(s,1H),4.03(d,J=9.5Hz,1H),3.65–3.68(m,1H),3.45(t,J=9.3Hz,1H),3.42–3.35(m,2H)ppm. 13C-NMR(126MHz,DMSO-d 6):δ=169.98,160.68,153.49,151.34,135.92,134.39,130.63,126.45,125.38,123.69,122.76,121.87,117.22,113.94,99.77,76.02,75.45,72.89,71.25ppm.HRMS(ESI):m/z[M+H] +Calcd.for C 19H 17BrNO 7S:481.9904;found:481.9906。
[0047]
上述实施例的目标荧光底物2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷(4a)的合成路线见图1。
[0048]
实施例2 2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-半乳糖苷的合成
[0049]
2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-半乳糖苷(4b)的合成路线见图1,具体步骤如下:
[0050]
(1)糖基化反应
[0051]
将0.306g(1.00mmol)荧光物2-(苯并噻唑-2′-基)-4-溴苯酚(1)、0.652g(2.00mmol)碳酸铯置于10mL干燥乙腈中搅拌10min后,加入0.617g(1.50mmol)四乙酰基-α-D-溴代半乳糖(2b),室温下搅拌反应2h。过滤,二氯甲烷洗涤滤渣,合并滤液,将滤液置于40~45℃水浴下加压旋蒸去除溶剂,用无水乙醇重结晶,干燥可得到约0.600g(产率约94%)含保护基的目标糖苷底物(结构式见式3b)。
[0052]
[0053]
1H-NMR(500MHz,CDCl 3):δ=8.69(d,J=2.5Hz,1H),8.13(d,J=8.0Hz,1H),7.94(d,J=8.0Hz,1H),7.55(dd,J=8.6,2.3Hz,1H),7.52(d,J=7.5Hz,1H),7.42(t,J=7.5Hz,1H),7.12(d,J=8.8Hz,1H),5.72(dd,J=10.0,8.5Hz,1H),5.49(d,J=3.0Hz,1H),5.30(d,J=8.0Hz,1H),5.14(dd,J= 10.2,3.2Hz,1H),4.28–4.21(m,1H),4.20–4.13(m,2H),2.22(s,3H),2.08(s,3H),2.02(s,3H),1.81(s,3H)ppm. 13C NMR(126MHz,CDCl 3):δ=170.43,170.33,170.23,169.43,161.11,153.31,151.74,136.19,134.41,132.64,126.56,125.56,125.10,123.22,121.48,116.88,116.45,99.38,71.66,71.41,68.69,66.92,61.51,20.86,20.81,20.70ppm。
[0054]
(2)脱保护基反应
[0055]
将0.500g(0.78mmol)上述步骤(1)所得含保护基的目标糖苷底物(3b)置于15mL无水的甲醇/四氢呋喃混合溶剂(v/v=1/1)中,加入11.8μL氢氧化钾甲醇溶液(1.0mol/L;0.15e.q.),室温下搅拌反应1h。然后于40~45℃水浴中旋蒸去除溶剂,然后加入二氯甲烷搅拌,抽滤,用二氯甲烷洗涤多次,接着用冷水洗涤2次,最后用少量乙腈洗涤2次,干燥后可得到约0.364g(产率约99%)最终目标产物2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-半乳糖苷(结构式见式4b)。
[0056]
[0057]
1H-NMR(500MHz,DMSO-d 6):δ=8.55(s,1H),8.12(d,J=8.0Hz,1H),8.10(d,J=8.5Hz,1H),7.70(dd,J=9.0,2.0Hz,1H),7.56(t,J=7.5Hz,1H),7.47(t,J=7.3Hz,1H),7.36(d,J=9.0Hz,1H),5.23(s,1H),5.22(s,1H),5.01(d,J=5.5Hz,1H),4.70(t,J=5.2Hz,1H),4.66(d,J=4.0Hz,1H),3.94(dd,J=14.1,8.1Hz,1H),3.76(s,1H),3.71(t,J=5.5Hz,1H),3.61–3.47(m,3H)ppm. 13C-NMR(126MHz,DMSO):δ=160.85,153.98,151.34,135.98,134.30,130.46,126.38,125.28,123.54,122.69,121.81,117.42,113.52,100.96,75.82,73.51,70.10,68.02,60.30ppm。
[0058]
实施例3 2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖苷的合成
[0059]
2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖苷(4c)的合成路线见图1,具体步骤如下:
[0060]
(1)糖基化反应
[0061]
将0.306g(1.00mmol)荧光物2-(苯并噻唑-2′-基)-4-溴苯酚(1)、0.652g(2.00mmol)碳酸铯置于10mL干燥乙腈中搅拌10min后,加入0.617g(1.50mmol)四乙酰基-α-D-溴代葡萄糖(2c),室温下搅拌反应2h。过滤,二氯甲烷洗涤滤渣,合并滤液,将滤液置于40~45℃水浴下加压旋蒸去除溶剂,用无水乙醇重结晶,干燥可得到约0.523g(产率约82%)含保护基的目标糖苷底物(结构式见式3c)。
[0062]
[0063]
1H-NMR(500MHz,DMSO-d 6):δ=8.52(d,J=2.5Hz,1H),8.11(d,J=8.0Hz,1H),8.05(d,J=8.0Hz,1H),7.81(dd,J=9.0,2.5Hz,1H),7.60–7.56(m,1H),7.51–7.48(m,1H),7.35(d,J=9.0Hz,1H),5.99(d,J=8.0Hz,1H),5.43(t,J=9.5Hz,1H),5.36(dd,J=9.5,8.0Hz,1H),5.10(t,J=9.5Hz,1H),4.35(ddd,J=10.0,5.5,2.5Hz,1H),4.21(dd,J=12.5,5.5Hz,1H),4.11(dd,J=12.4,2.3Hz,1H),2.03,1.99,1.98,1.88(4×s,4×3H)ppm. 13C-NMR(126MHz,DMSO-d 6):δ=170.42,170.14,169.79,169.54,160.44,153.20,151.80,135.97,135.05,131.51,127.13,126.20,124.41,123.43,122.02,118.17,115.43,97.18,72.87,71.64,71.20,68.11,61.94,20.93,20.88,20.85,20.76ppm。
[0064]
(2)脱保护基反应
[0065]
将0.300g(0.47mmol)上述步骤(1)所得含保护基的目标糖苷底物(3c)置于9mL无水的甲醇/四氢呋喃混合溶剂(v/v=1/1)中,加入7.0μL氢氧化钾甲醇溶液(1.0mol/L;0.15e.q.),室温下搅拌反应1h。然后于40~45℃水浴中旋蒸去除溶剂,然后加入二氯甲烷搅拌,抽滤,用二氯甲烷洗涤多次,接着用冷水洗涤2次,最后用少量乙腈洗涤2次,干燥后可得到约0.219g(产率约99%)最终目标产物2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖苷(结构式见式4c)。
[0066]
[0067]
1H-NMR(500MHz,DMSO-d 6):δ=8.55(d,J=2.5Hz,1H),8.11(dd,J=12.3,8.0Hz,2H),7.70(dd,J=9.0,3.0Hz,1H),7.58–7.54(m,1H),7.49–7.45(m,1H),7.36(d,J=9.5Hz,1H),5.42(d,J=5.5Hz,1H),5.29(d,J 1,2=7.5Hz,1H),5.26(s,1H),5.13(d,J=3.5Hz,1H),4.62(t,J=5.3Hz,1H),3.71(dd,J=10.5,5.5Hz,1H),3.62(dd,J=13.7,8.2Hz,1H),3.53–3.45(m,2H),3.37(d,J=9.5Hz,1H),3.26(dt,J=13.2,6.7Hz,1H)ppm. 13C-NMR(126MHz,DMSO-d 6):δ=161.31,154.34,151.81,136.44,134.79,130.95,126.86,125.76,124.04,123.17,122.32,117.88,114.10,100.71,77.72,77.31,73.63,69.98,61.01ppm。
[0068]
实施例4
[0069]
一种用于检测大肠杆菌O157与非O157大肠杆菌的显色培养基,其每1000mL含有10g蛋白胨、3g酵母提取粉、5g氯化钠、0.1g SDS、0.1g脱氧胆酸钠、0.5mL吐温80、0.15g荧光底物2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷(于365~375nm紫外光下能产黄绿色荧光)、0.05g显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖苷(能产蓝至蓝绿色)、0.05g显色底物5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(能产紫红色)、0.05g IPTG、15g琼脂。(注:该显色培养基可以于121℃下高温蒸汽灭菌15min)。
[0070]
实施例5
[0071]
一种用于检测大肠杆菌O157与非O157大肠杆菌的显色培养基,其每1000mL含有10g蛋白胨、3g酵母提取粉、5g氯化钠、0.1g SDS、0.1g脱氧胆酸钠、0.045g荧光底物2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖苷(于365~375nm紫外光下能产黄绿色荧光)、0.20g显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸苷环己胺盐(能产蓝至蓝绿色)、0.05g显色底物5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(能产紫红色)、0.05g IPTG、0.01g水杨苷、0.01g纤维二糖、15g琼脂。(注:该显色培养基也可以于121℃下高温蒸汽灭菌15min)。
[0072]
实施例6
[0073]
一种用于检测大肠杆菌O157与非O157大肠杆菌的显色培养基,其每1000mL含有10g蛋白胨、3g酵母提取粉、5g氯化钠、0.1g SDS、0.1g脱氧胆酸钠、0.5mL吐温80、0.045g荧光底物2-(苯并噻唑-2′-基)-4-溴苯基-β-D-半乳糖苷(于365~375nm紫外光下能产黄绿色荧光)、0.20g显色底物5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸苷环己胺盐(能产紫红色)、0.055g显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖苷(能产蓝至蓝绿色)、0.025g IPTG、0.025g乳糖、15g琼脂。(注:该显色培养基也可以于121℃下高温蒸汽灭菌15min)。
[0074]
实施例7
[0075]
一种用于检测大肠杆菌O157与非O157大肠杆菌的显色培养基,其每1000mL含有10g蛋白胨、3g酵母提取粉、5g氯化钠、0.20g SDS、0.20g脱氧胆酸钠、0.10mL曲拉通X-100、0.15g荧光底物2-(苯并噻唑-2′-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷(于365~375nm紫外光下能产黄绿色荧光)、0.05g显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖苷(能产蓝至蓝绿色)、0.05g显色底物5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(能产紫红色)、0.05g IPTG、琼脂15g。(注:该显色培养基可以于121℃下高温蒸汽灭菌15min)。
[0076]
实施例8
[0077]
一种用于检测大肠杆菌O157与非O157大肠杆菌的显色培养基,其每1000mL含有1g蛋白胨、 6g酵母提取粉、4g氯化钠、0.05g SDS、1.5g 3号胆盐、0.20mL曲拉通X-100、0.05g荧光底物2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖苷(于365~375nm紫外光下能产黄绿色荧光)、0.20g显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸苷环己胺盐(能产蓝至蓝绿色)、0.05g显色底物5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(能产紫红色)、0.1g IPTG、0.15g水杨苷、10g琼脂。(注:该显色培养基也可以于121℃下高温蒸汽灭菌15min)。
[0078]
实施例9
[0079]
一种用于检测大肠杆菌O157与非O157大肠杆菌的显色培养基,其每1000mL含有20g蛋白胨、8g氯化钠、0.25g SDS、0.60mL吐温80、0.05g荧光底物2-(苯并噻唑-2′-基)-4-溴苯基-β-D-半乳糖苷(于365~375nm紫外光下能产黄绿色荧光)、0.30g显色底物5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸苷环己胺盐(能产紫红色)、0.01g显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖苷(能产蓝至蓝绿色)、0.05g显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-N-乙酰氨基葡萄糖苷(能产蓝至蓝绿色)、0.20g显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-纤维二糖苷(能产蓝至蓝绿色)、0.15g乳糖、0.15g纤维二塘、20g琼脂。(注:该显色培养基也可以于121℃下高温蒸汽灭菌15min)。
[0080]
实施例10
[0081]
评价本发明实施例4的用于检测大肠杆菌O157与非O157大肠杆菌的显色培养基对E.coli O157:H7 ATCC 35150、E.coli ATCC 25922、阪崎肠杆菌ATCC 29544和鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028这四种不同致病菌的检测效果,使用1μL蓝色接种环蘸取相应的纯菌培养液并划线接种于显色培养基中,于37℃下有氧培养18h。然后分别在可见光、365nm紫外光、可见光和手电筒375nm紫外光下观察显色培养基对四种不同致病菌的区分度,结果见图2。
[0082]
图2平板中右上方、左上方、左下方、右下方依次为E.coli O157:H7 ATCC 35150、E.coli ATCC 25922、阪崎肠杆菌ATCC 29544和鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028,A为可见光下,B为365nm紫外光下,C为可见光和手电筒375nm紫外光下。如图2所示,实施例4的用于检测大肠杆菌O157与非O157大肠杆菌的显色培养基对以下这四种致病菌能给出良好的区分度:E.coli O157:H7 ATCC 35150(右上方)显粉色且无荧光,E.coli ATCC 25922(左上方)显粉色且有黄绿色荧光,阪崎肠杆菌ATCC 29544(左下方)显蓝绿色且无荧光,鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028(右下方)显无色且无荧光。
[0083]
实施例11
[0084]
分别评价本发明实施例4、5、6的用于检测大肠杆菌O157与非O157大肠杆菌的显色培养基对E.coli O157、non-O157 E.coli以及非大肠杆菌的检测效果。接种方法为使用2.5μL移液枪吸取相应的纯菌培养液并通过反向移液法小心点种0.2μL至平板上相应的位置;于37℃下有氧培养12h、18 h。然后分别在可见光、365nm紫外灯光下观察。结果见图3。
[0085]
图3中,A:实施例4组,B:实施例5组,C:实施例6组;下标1表示在可见光下观察,下标2表示在365nm紫外灯光下观察;Ⅰ为A至C显色培养基平板中各菌对应的编号,实验菌株有:①肠道集聚性E.coli(EAEC)分离株(No.1288-1),②EAEC分离株(No.3476B3),③AEC分离株(No.3164A1),④肠道侵袭性E.coli(EIEC)分离株(No.2968A1),⑤EIEC分离株(No.2987A2),⑥肠道致病性E.coli(EPEC)分离株(No.2684-2),⑦EPEC分离株(No.2627-2),⑧EPEC分离株(No.545-1),⑨产志贺毒素(或肠道出血性)E.coli(STEC或EHEC)分离株(No.T1 4259B3),⑩STEC或EHEC分离株(No.T5 3424A1), STEC或EHEC分离株(No.T7 4274A1), STEC或EHEC分离株(No.T18 3724C1), STEC或EHEC分离株(No.T91 1964-1), STEC或EHEC分离株(No.T111 1122-3), E.coli O157:H7 ATCC 35150, E.coli O157:H7NCTC 12900, E.coli O157:H7 882364, E.coli O157:H7 ATCC 43895, E.coli O157:H7 ATCC 43888, E.coli CMCC(B)44102, E.coli CMCC(B)44103, E.coli ATCC 8739, E.coli ATCC 25922, E.coli ATCC 8099, E.coli ATCC 35218, E.coli CMCC(B)44113, E.coli HK 70115, 产气肠杆菌CMCC(B)45103, 阴沟肠杆菌CMCC(B)45301, 肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117, 肺炎克雷伯氏菌广临检-57, 阪崎肠杆菌ATCC 29544, 阪崎肠杆菌分离株(No.10Ta), 阪崎肠杆菌分离株(No.2864C1), 阪崎肠杆菌分离株(No.1541A1-1), 鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028, 鼠伤寒沙门氏菌分离株(No.81-8), 鼠伤寒沙门氏菌分离株(No.97-1), 肠炎沙门氏菌CMCC(B)50335, 伤寒沙门氏菌CMCC(B)50071, 普通变性杆菌CMCC(B)49027, 奇异变性杆菌CMCC(B)49005, 铜绿假单胞菌CMCC(B)10104, 铜绿假单胞菌ATCC 15442, 铜绿假单胞菌ATCC 27853, 铜绿假单胞菌ATCC 9027, 铜绿假单胞菌GIM 1.46, 蜡样芽胞杆菌ATCC14579。
[0086]
如图3所示,在实施例4(A)中,E.coli O157:H7全部显粉色且无荧光,non-O157 E.coli全部显粉色且有黄绿色荧光,non-E.coli显绿色(见阪崎肠杆菌)、蓝紫色(见产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、1株肺炎克雷伯菌)、金属蓝色(见1株肺炎克雷伯菌)、或不显色(见鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌),革兰氏阳性菌受抑制(见蜡样芽胞杆菌ATCC14579)。
[0087]
在实施例5(B)中,E.coli O157:H7全部显粉色且无荧光,non-O157 E.coli全部显金属蓝色且无荧光,non-E.coli显粉色或淡紫红色且有黄绿色荧光(见产气肠杆菌、阴沟肠杆菌和肺炎克雷伯菌)、无色且无荧光(见沙门氏菌、变形杆菌和部分铜绿假单胞菌)、或无色且有蓝色荧光(见部分铜绿假单胞菌),革兰氏阳性菌受抑制(见蜡样芽胞杆菌ATCC 14579)。
[0088]
在实施例6(C)中,E.coli O157:H7全部显无色且有米黄色荧光,non-O157 E.coli全部显紫红色且无明显荧光,non-E.coli显绿色或蓝绿色(见阪崎肠杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌)、不显色且无荧光或有蓝色荧光(见部分铜绿假单胞菌、变形杆菌),革兰氏阳性菌受抑制(见蜡样芽胞杆菌ATCC 14579)。
[0089]
由此可见,对于更多的E.coli O157、non-O157 E.coli以及非大肠杆菌,实施例4、5和6的用于检测大肠杆菌O157与非O157大肠杆菌的显色培养基也都能给出良好的检测特异性。
[0090]
实施例12
[0091]
评价本发明实施例7的用于检测大肠杆菌O157与非O157大肠杆菌的显色培养基对E.coli O157、non-O157 E.coli以及非大肠杆菌的检测效果。接种方法为使用2.5μL移液枪吸取相应的纯菌培养液并通过反向移液法小心点种0.2μL至平板上相应的位置;于37℃下有氧培养12h、18h。然后分别在可见光、365nm紫外灯光下观察。结果见图4。
[0092]
图4中,左图表示在可见光下观察,右图表示在365nm紫外灯光下观察;Ⅰ为显色培养基平板中各菌对应的编号,实验菌株有:①肠道集聚性E.coli(EAEC)分离株(No.1288-1),②EAEC分离株(No.3476B3),③AEC分离株(No.3164A1),④肠道侵袭性E.coli(EIEC)分离株(No.2968A1),⑤EIEC分离株(No.2987A2),⑥肠道致病性E.coli(EPEC)分离株(No.2684-2),⑦EPEC分离株(No.2627-2),⑧EPEC分离株(No.545-1),⑨产志贺毒素(或肠道出血性)E.coli(STEC或EHEC)分离株(No.T1 4259B3),⑩STEC或EHEC分离株(No.T5 3424A1), STEC或EHEC分离株(No.T7 4274A1), STEC或EHEC分离株(No.T18 3724C1), STEC或EHEC分离株(No.T91 1964-1), STEC或EHEC分离株(No.T111 1122-3), E.coli O157:H7 ATCC35150, E.coli O157:H7NCTC 12900, E.coli O157:H7 882364, E.coli O157:H7 ATCC43895, E.coli O157:H7 ATCC 43888, E.coli CMCC(B)44102, E.coli CMCC(B)44103, E.coli ATCC 8739, E.coli ATCC 25922, E.coli ATCC 8099, E.coli ATCC 35218, E.coli CMCC(B)44113, E.coli HK 70115, 产气肠杆菌CMCC(B)45103, 阴沟肠杆菌CMCC(B)45301, 肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117, 肺炎克雷伯氏菌广临检-57, 阪崎肠杆菌ATCC29544, 阪崎肠杆菌分离株(No.10Ta), 阪崎肠杆菌分离株(No.2864C1), 阪崎肠杆菌分离株(No.1541A1-1), 鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028, 鼠伤寒沙门氏菌分离株(No.81-8), 鼠伤寒沙门氏菌分离株(No.97-1), 肠炎沙门氏菌CMCC(B)50335, 伤寒沙门氏菌CMCC(B)50071, 普通变性杆菌CMCC(B)49027, 奇异变性杆菌CMCC(B)49005, 铜绿假单胞菌CMCC(B)10104, 铜绿假单胞菌ATCC 15442, 铜绿假单胞菌ATCC 27853, 铜绿假单胞菌ATCC 9027, 铜绿假单胞菌GIM 1.46, 蜡样芽胞杆菌ATCC 14579。
[0093]
如图3和图4所示,对比实施例4和实施例7可知,通过适当地控制显色培养基中SDS和胆盐的用量等措施,可更好地抑制背景菌的生长,从而提高对O157/non-O157 E.coli的选择性。
[0094]
实施例13
[0095]
分别评价TBX琼脂、CHROMagar E.coli、CHROMagar O157、山梨醇-麦康凯培养基这四种现有的市售培养基对E.coli O157、non-O157 E.coli以及非大肠杆菌的检测效果。接种方法为使用2.5μL移液枪吸取相应的纯菌培养液并通过反向移液法小心点种0.2μL至平板上相应的位置;于37℃下有氧培养12h、18h。然后分别在可见光、365nm紫外灯光下观察。结果见图5。
[0096]
图5中,D:TBX琼脂组,E:CHROMagar E.coli组,F:CHROMagar O157组;G:山梨醇-麦康凯培养基(SMAC)组,下标1表示在可见光下观察,下标2表示在365nm紫外灯光下观察;Ⅰ为D至G显色培养基平板中各菌对应的编号,实验菌株有:①肠道集聚性E.coli(EAEC)分离株(No.1288-1),②EAEC分离株(No.3476B3),③AEC分离株(No.3164A1),④肠道侵袭性E.coli(EIEC)分离株(No.2968A1),⑤EIEC分离株(No.2987A2),⑥肠道致病性E.coli(EPEC)分离株(No.2684-2),⑦EPEC分离株(No.2627-2),⑧EPEC分离株(No.545-1),⑨产志贺毒素(或肠道出血性)E.coli(STEC或EHEC)分离株(No.T1 4259B3),⑩STEC或EHEC分离株(No.T5 3424A1), STEC或EHEC分离株(No.T7 4274A1), STEC或EHEC分离株(No.T18 3724C1), STEC或EHEC分离株(No.T91 1964-1), STEC或EHEC分离株(No.T111 1122-3), E.coli O157:H7 ATCC 35150, E.coli O157:H7NCTC 12900, E.coli O157:H7 882364, E.coli O157:H7 ATCC 43895, E.coli O157:H7 ATCC 43888, E.coli CMCC(B)44102, E.coli CMCC(B)44103, E.coli ATCC 8739, E.coli ATCC 25922, E.coli ATCC 8099, E.coli ATCC 35218, E.coli CMCC(B)44113, E.coli HK 70115, 产气肠杆菌CMCC(B)45103, 阴沟肠杆菌CMCC(B)45301, 肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117, 肺炎克雷伯氏菌广临检-57, 阪崎肠杆菌ATCC 29544, 阪崎肠杆菌分离株(No.10Ta), 阪崎肠杆菌分离株(No.2864C1), 阪崎肠杆菌分离株(No.1541A1-1), 鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028, 鼠伤寒沙门氏菌分离株(No.81-8), 鼠伤寒沙门氏菌分离株(No.97-1), 肠炎沙门氏菌CMCC(B)50335, 伤寒沙门氏菌CMCC(B)50071, 普通变性杆菌CMCC(B)49027, 奇异变性杆菌CMCC(B)49005, 铜绿假单胞菌CMCC(B)10104, 铜绿假单胞菌ATCC 15442, 铜绿假单胞菌ATCC 27853, 铜绿假单胞菌ATCC 9027, 铜绿假单胞菌GIM 1.46, 蜡样芽胞杆菌ATCC 14579。
[0097]
如图5所示,在TBX琼脂和CHROMagar E.coli上,除了E.coli ATCC 8739不显色或蓝绿色较淡外,其余non-O157 E.coli均呈现明显的蓝绿色,而E.coli O157:H7与全部non-E.coli菌株均显无色而难以区分。在CHROMagar O157上,E.coli O157:H7显淡紫红色,鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门 氏菌显粉色,而其余non-O157 E.coli与产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌以及阪崎肠杆菌均显金属蓝或蓝绿色而难以区分。在山梨醇-麦康凯培养基(SMAC)上,E.coli O157:H7与阪崎肠杆菌、普通变形杆菌、奇异变性杆菌以及铜绿假单胞菌都显无色而难以区分,而non-O157 E.coli与产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌以及伤寒沙门氏菌都显红色而难以区分,并且随着培养时间的延长,也会导致部分non-O157 E.coli菌株红色褪去。由此可见,对于更多的E.coli O157、non-O157 E.coli以及非大肠杆菌,现有的市售培养基TBX琼脂、CHROMagar E.coli、CHROMagar O157和山梨醇-麦康凯培养基(SMAC)均不能给出良好的检测特异性。
[0098]
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出的是,上述优选实施方式不应视为对本发明的限制,本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明的精神和范围内,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

权利要求书

[权利要求 1]
一种用于检测大肠杆菌O157与非O157大肠杆菌的显色培养基,其特征在于,所述的显色培养基含有两种能产生无扩散性的不同颜色信号的显色底物和一种不显色但能产生无扩散性的非蓝色荧光信号的荧光底物,所述的显色底物和荧光底物中除了含有β-葡萄糖醛酸苷酶底物和β-半乳糖苷酶底物外,还至少含有β-葡萄糖苷酶底物、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶底物、纤维二糖苷酶底物这三种所产颜色或荧光信号相同或相近底物中的一种底物。
[权利要求 2]
根据权利要求1所述的用于检测大肠杆菌O157与非O157大肠杆菌的显色培养基,其特征在于,所述的显色底物为基于3-吲哚酚衍生物的吲哚酚基显色底物,所述的3-吲哚酚衍生物的结构如下式(I)所示: 其中,R为单取代基团或多取代基团。
[权利要求 3]
根据权利要求2所述的用于检测大肠杆菌O157与非O157大肠杆菌的显色培养基,其特征在于,所述的基于3-吲哚酚衍生物的吲哚酚基显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸苷环己胺盐或5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸苷环己胺盐。
[权利要求 4]
根据权利要求1所述的用于检测大肠杆菌O157与非O157大肠杆菌的显色培养基,其特征在于,所述的荧光底物为基于2-(苯并噻唑-2'-基)苯酚衍生物的荧光底物,所述的2-(苯并噻唑-2'-基)苯酚衍生物的结构如下式(2)所示: 其中,R1、R2代表卤原子或烷氧基基团。
[权利要求 5]
根据权利要求4所述的用于检测大肠杆菌O157与非O157大肠杆菌的显色培养基,其特征在于,所述的基于2-(苯并噻唑-2'-基)苯酚衍生物的的荧光底物为2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷、2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-半乳糖苷或2-(苯并噻唑-2'-基)-4-溴苯基-β-D-葡萄糖苷。
[权利要求 6]
根据权利要求1所述的用于检测大肠杆菌O157与非O157大肠杆菌的显色培养基,其特征在于,所述的显色培养基中显色底物和荧光底物的浓度均为0.01~0.30g/L。
[权利要求 7]
根据权利要求6所述的用于检测大肠杆菌O157与非O157大肠杆菌的显色培养基,其特征在于,所述的显色培养基还含有十二烷基硫酸钠0.05~0.25g/L和/或胆盐0~1.50g/L、蛋白胨1~20g/L、酵母提取粉0~6g/L、氯化钠4~8g/L、琼脂10~20g/L、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷0.01~0.10g/L。
[权利要求 8]
根据权利要求7所述的用于检测大肠杆菌O157与非O157大肠杆菌的显色培养基,其特征在于,所述的显色培养基还含有乳糖、水杨苷或纤维二糖0.01~0.15g/L。
[权利要求 9]
根据权利要求7或8所述的用于检测大肠杆菌O157与非O157大肠杆菌的显色培养基,其特征在于,所述的显色培养基还含有吐温80 0~0.60mL/L或者曲拉通X-100 0~0.20mL/L。
[权利要求 10]
根据权利要求1所述的用于检测大肠杆菌O157与非O157大肠杆菌的显色培养基,其特征在于,所述的β-葡萄糖醛酸苷酶底物为羧酸形式或羧酸盐形式。

附图

[ 图 1]  
[ 图 2]  
[ 图 3]  
[ 图 4]  
[ 图 5]