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1. WO2020107728 - FACTEUR DE TRANSCRIPTION ZMNLP5 DE ZEA MAYS NLP ET SON UTILISATION

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说明书

发明名称 0001   0002   0003   0004   0005   0006   0007   0008   0009   0010   0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061   0062   0063   0064   0065   0066   0067   0068   0069   0070   0071   0072   0073   0074   0075  

权利要求书

1   2   3   4   5   6   7   8  

经修改的权利要求 (条约第19条)

1  *   2  *   3  *   4  *   5  *   6  *  

附图

1   2   3   4   5  

说明书

发明名称 : 玉米NLP转录因子ZmNLP5及其应用

技术领域

[0001]
本发明涉及分子遗传学技术领域,更具体地,涉及玉米NLP转录因子技术领域,特别是指一种玉米NLP转录因子ZmNLP5及其应用。

背景技术

[0002]
氮素(Nitrogen,N)为植物生长发育所必需的大量营养元素,玉米产量的高低极大程度依赖于外界氮肥的施用量。然而氮肥的过度施用不仅增加了农民的经济成本,也对环境造成了不同程度的污染。因此研究提高玉米植株自身对氮素营养的高效利用对可持续化提高玉米产量具有重要意义。
[0003]
NLP为植物特有的一类转录因子,对植物氮素代谢途径具有重要调控作用。Marchive等利用ChIP-chip发现AtNLP7与下游约851个基因结合且优先结合于靶基因转录起始位点,下游基因中富含氮信号传导和代谢途径的相关基因,例如LBD37/38、NRT1.1和NIA1等(Marchive C,Roudier F,Castaings L,et al.2013.Nuclear retention of the transcription factor NLP7 orchestrates the early response to nitrate in plants.Nature Communications 4,1713)。Yan等发现AtNLP8为种子萌发期间硝酸盐信号传导的关键调节因子,能直接与脱落酸分解代谢酶基因(CYP707A2)的启动子结合并激活该基因的转录(Yan D,Easwaran V,Chau V,et al.2016.NIN-like protein 8 is a master regulator of nitrate-promoted seed germination in Arabidopsis.Nature Communications 7,13179)。Guan等发现低氮环境下,重要的转录因子TCP20能与AtNLP6/AtNLP7异二聚体相互作用,形成TCP20-AtNLP6&7复合物并累积于细胞核中,调控有丝分裂周期素基因(CYCB1;1)和硝酸盐信号传导和同化基因的表达(Guana PZ,Ripolla JJ,Wang RH,et al.2017.Interacting TCP and NLP transcription factors control plant responses to nitrate availability.Proc Natl Acad Sci USA 114(9):2419-2424)。此外,在拟南芥中发现了NO 3--CPK-NLP调控网络,其中NO 3-触发特异的Ca 2+-CPK信号传导,并且该信号导致NLP的磷酸化,并且NO 3--CPK-NLP信号传导通路在植物营养生长网络调控中发挥至关重要的作用(Liu KH,Niu Y,Konishi M,et al. 2017.Discovery of nitrate-CPK-NLP signaling in central nutrient-growth networks.Nature,545(7654):311-316)。
[0004]
综上所述,NLP基因在调控氮素营养代谢中发挥非常重要的作用。然而在玉米这种对氮素高度依赖的作物中,NLP基因功能的研究报道甚少。因此,需要对该基因的功能予以解明,以便于在源头提高玉米对氮素的同化利用效率并最终提高玉米产量。
[0005]
发明内容
[0006]
为了克服上述现有技术中的缺点,本发明的一个目的在于提供一种玉米NLP转录因子ZmNLP5,其能够促进氮代谢关键酶基因的表达,提高玉米氮素营养同化利用,并在低氮环境下促进玉米根部伸长生长,适于大规模推广应用。
[0007]
本发明的另一目的在于提供一种玉米NLP转录因子ZmNLP5在促进氮代谢关键酶基因ZmNIR1.1表达中的应用,从而促进氮代谢关键酶基因ZmNIR1.1的表达,提高玉米氮素营养同化利用,并在低氮环境下促进玉米根部伸长生长,适于大规模推广应用。
[0008]
本发明的另一目的在于提供一种玉米NLP转录因子ZmNLP5在促进氮代谢关键酶基因ZmNIR1.2表达中的应用,从而促进氮代谢关键酶基因ZmNIR1.2的表达,提高玉米氮素营养同化利用,并在低氮环境下促进玉米根部伸长生长,适于大规模推广应用。
[0009]
本发明的另一目的在于提供一种玉米NLP转录因子ZmNLP5在促进氮代谢关键酶基因ZmNR1.1表达中的应用,从而促进氮代谢关键酶基因ZmNR1.1的表达,提高玉米氮素营养同化利用,并在低氮环境下促进玉米根部伸长生长,适于大规模推广应用。
[0010]
本发明的另一目的在于提供一种玉米NLP转录因子ZmNLP5在促进氮代谢关键酶基因ZmNR1.2表达中的应用,从而促进氮代谢关键酶基因ZmNR1.2的表达,提高玉米氮素营养同化利用,并在低氮环境下促进玉米根部伸长生长,适于大规模推广应用。
[0011]
本发明的另一目的在于提供一种玉米NLP转录因子ZmNLP5在提高玉米氮素营养同化利用中的应用,从而能够提高玉米氮素营养同化利用,适于大规模推广应用。
[0012]
本发明的另一目的在于提供一种玉米NLP转录因子ZmNLP5在低氮环境下促进玉米根部伸长生长中的应用,从而能够在低氮环境下促进玉米根部伸长生长,适于大规模推广应用。
[0013]
为达到以上目的,在本发明的第一方面,提供了一种玉米NLP转录因子ZmNLP5,其特点是,所述玉米NLP转录因子ZmNLP5的编码序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所 示。
[0014]
编码如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列可以有多种,较佳地,所述玉米NLP转录因子ZmNLP5的编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0015]
在本发明的第二方面,提供了上述的玉米NLP转录因子ZmNLP5在促进氮代谢关键酶基因ZmNIR1.1表达中的应用。
[0016]
在本发明的第三方面,提供了上述的玉米NLP转录因子ZmNLP5在促进氮代谢关键酶基因ZmNIR1.2表达中的应用。
[0017]
在本发明的第四方面,提供了上述的玉米NLP转录因子ZmNLP5在促进氮代谢关键酶基因ZmNR1.1表达中的应用。
[0018]
在本发明的第五方面,提供了上述的玉米NLP转录因子ZmNLP5在促进氮代谢关键酶基因ZmNR1.2表达中的应用。
[0019]
在本发明的第六方面,提供了上述的玉米NLP转录因子ZmNLP5在提高玉米氮素营养同化利用中的应用。
[0020]
在本发明的第七方面,提供了上述的玉米NLP转录因子ZmNLP5在低氮环境下促进玉米根部伸长生长中的应用。
[0021]
本发明的有益效果在于:
[0022]
a.本发明的玉米NLP转录因子ZmNLP5的编码序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,能够促进氮代谢关键酶基因的表达,提高玉米氮素营养同化利用,并在低氮环境下促进玉米根部伸长生长,适于大规模推广应用。
[0023]
b.本发明的玉米NLP转录因子ZmNLP5在促进氮代谢关键酶基因ZmNIR1.1表达中的应用,从而促进氮代谢关键酶基因ZmNIR1.1的表达,提高玉米氮素营养同化利用,并在低氮环境下促进玉米根部伸长生长,适于大规模推广应用。
[0024]
c.本发明的玉米NLP转录因子ZmNLP5在促进氮代谢关键酶基因ZmNIR1.2表达中的应用,从而促进氮代谢关键酶基因ZmNIR1.2的表达,提高玉米氮素营养同化利用,并在低氮环境下促进玉米根部伸长生长,适于大规模推广应用。
[0025]
d.本发明的玉米NLP转录因子ZmNLP5在促进氮代谢关键酶基因ZmNR1.1表达中的应用,从而促进氮代谢关键酶基因ZmNR1.1的表达,提高玉米氮素营养同化利用,并在低氮环境下促进玉米根部伸长生长,适于大规模推广应用。
[0026]
e.本发明的玉米NLP转录因子ZmNLP5在促进氮代谢关键酶基因ZmNR1.2表达中的 应用,从而促进氮代谢关键酶基因ZmNR1.2的表达,提高玉米氮素营养同化利用,并在低氮环境下促进玉米根部伸长生长,适于大规模推广应用。
[0027]
f.本发明的玉米NLP转录因子ZmNLP5在提高玉米氮素营养同化利用中的应用,从而能够提高玉米氮素营养同化利用,适于大规模推广应用。
[0028]
g.本发明的玉米NLP转录因子ZmNLP5在低氮环境下促进玉米根部伸长生长中的应用,从而能够在低氮环境下促进玉米根部伸长生长,适于大规模推广应用。
[0029]
本发明的这些和其它目的、特点和优势,通过下述的详细说明,附图和权利要求得以充分体现,并可通过所附权利要求中特地指出的手段、装置和它们的组合得以实现。

附图说明

[0030]
图1是玉米NLP转录因子ZmNLP5在不同组织中的表达模式分析结果,其中A:RT-PCR检测不同组织中ZmNLP5基因mRNA的表达量,ZmUPF1为内参基因;B:WB检测不同组织中ZmNLP5蛋白的表达量,UDPGP为内参蛋白;C:qPCR检测ZmNLP5基因在根部不同区域mRNA的表达量,ZmUPF1为内参基因;D:WB检测ZmNLP5在根部不同区域蛋白的表达量,UDPGP为内参蛋白。
[0031]
图2是玉米NLP转录因子ZmNLP5调控氮代谢关键酶基因ZmNIR1.1启动子的瞬时表达载体与结果,其中A:效应载体和报告载体的载体示意图;B:ZmNLP5调控ZmNIR1.1启动子的瞬时表达活性分析结果。
[0032]
图3是玉米NLP转录因子ZmNLP5对玉米苗期氮代谢关键酶基因表达量的影响结果,其中NR为硝酸还原酶,NIR为亚硝酸还原酶,一周龄的植物幼苗水培N饥饿处理两周,然后进行氮处理(15mM KNO 3),并分别在0、30、60和120min对植株的根部取样提取RNA,利用qPCR检测样品中ZmNR1.1、ZmNR1.2、ZmNIR1.1和ZmNIR1.2基因的表达量,ZmUPF1为内参基因,*P≤0.05,**P≤0.01(t测验,n=3)。
[0033]
图4是玉米NLP转录因子ZmNLP5对玉米成熟期穗位叶和籽粒氮含量的影响结果,其中A:两种氮处理下zmnlp5突变体和野生型穗位叶和籽粒总氮含量的比较图,*P≤0.05,**P≤0.01(t测验,n=3);B:两种氮处理下zmnlp5突变体和野生型穗位叶表型比较图。
[0034]
图5是玉米NLP转录因子ZmNLP5对玉米苗期根长的影响结果,其中A:不同亚硝酸盐浓度处理下zmnlp5突变体和野生型表型比较图,标尺=2cm;B:不同亚硝酸盐浓度处理下zmnlp5突变体和野生型根长比较图,*P≤0.05;C:不同亚硝酸盐浓度处理下zmnlp5 突变体和野生型根尖亚硝酸盐含量比较图,**P≤0.01;D:两种氮处理下zmnlp5突变体和野生型表型比较图,标尺=2cm;E:两种氮处理下zmnlp5突变体和野生型根长比较图,**P≤0.01;E:两种氮处理下zmnlp5突变体和野生型表型比较图,标尺=2cm;E:两种氮处理下zmnlp5突变体和野生型根部不同区域亚硝酸盐含量比较图,*P≤0.05。

具体实施方式

[0035]
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容,特举以下实施例详细说明。
[0036]
本发明中所使用的术语,除非有另外说明,一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。实施实例中,未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。以下以ZmNLP5基因突变的玉米材料zmnlp5为例,对本发明的优选实施方式进行描述,但并不限定本发明。
[0037]
实施例1 玉米ZmNLP5基因的克隆与鉴定
[0038]
基于本发明人前期的研究工作(Ge M,Liu YH,Jiang L,et al.2018.Genome-wide analysis of maize NLP transcription factor family revealed the roles in nitrogen response.Plant Growth Regul,84:95-105),在玉米NLP家族中挑选氮响应最为敏感的ZmNLP5基因为研究对象,以玉米优良自交系B73(获得于江苏省农业科学院农业生物技术研究所作物分子育种研究室)为实验材料。根据Phytozome网站上预测的基因ZmNLP5(GRMZM2G042278)的序列信息设计引物,进一步分离克隆ZmNLP5基因cDNA全长序列,具体方案如下:
[0039]
对玉米B73苗期(V3期)植株进行取样,液氮研碎后利用RNA Isolation System(Promega)试剂盒提取总RNA,利用反转录试剂盒prime ScriptTM RT Reagent kit(Takara)进行反转录。以得到的cDNA为模板,利用扩增ZmNLP5开放阅读框的引物对进行PCR反应,该引物对包括ZmNLP5-cDNA的正向引物和反向引物,分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。PCR扩增反应体系:总反应体积为50.0μl,包括:4.0μl cDNA模板(0.05μg),5.0μl 10×PCR buffer,正反向引物各2μl(10μmol/L),4.0μl 2.5mmol/L dNTPs,4.0μl 25mmol/L MgCl 2,0.2μl 5U/μl rTaq,28.8μl ddH 2O。PCR扩增条件:94℃ 3min;94℃ 40s,58℃ 40s,72℃ 3min,38个循环;72℃ 5min。PCR产物经回收、测序后,进行序列分析。结果表明该ZmNLP5的开放阅读框具有序列表中 SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列(全长2268bp),编码SEQ ID NO:2所示的755个氨基酸。
[0040]
实施例2 ZmNLP5在玉米不同组织中的表达特征
[0041]
利用RT-PCR、实时荧光定量PCR技术(qPCR)和蛋白质免疫印记技术(Western blot,WB),对ZmNLP5在玉米不同组织及组织不同部位中的mRNA和蛋白的表达情况进行研究。实验材料玉米自交系W22(获得自美国玉米遗传资源联合存储中心-UniformMu转座子资源库)水培培养于江苏省农科院设施大棚,基础营养液为改良Hoagland营养液(5mM CaCl 2,2mM MgSO 4,0.05mM EDTA-Fe-Na Salt,0.5mM KH 2PO 4,50μM H 3BO 4,10μM MnCl 2,1μM ZnSO 4,0.3μM CuSO 4,and 0.5μM Na 2MoO 4)。足氮和低氮营养液是分别在基础营养液中分别添加15mM KNO 3和0.15mM KNO 3(KCl补齐钾离子浓度),营养液2天更换一次,常规管理。对足氮营养液中生长至V3期玉米植株的不同组织进行取样(根、茎、叶组织,及根部根尖、中部和上部组织),液氮速冻研磨并提取总RNA和总蛋白。
[0042]
总RNA的提取同实施例1。以玉米持家基因ZmUPF1(GRMZM2G163444)为RT-PCR及qPCR分析的内参基因,其扩增引物对包括ZmUPF1正向引物和ZmUPF1反向引物,分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。以玉米不同组织的cDNA为模板进行RT-PCR分析,以玉米根部不同部位cDNA为模板进行qPCR分析,ZmNLP5-qPCR的扩增引物对包括ZmNLP5-qPCR正向引物和ZmNLP5-qPCR反向引物,分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示,RT-PCR分析的扩增引物对同ZmNLP5-qPCR的扩增引物对。
[0043]
总蛋白利用Plant Nuclei Isolation/Extraction kit(Sigma)试剂盒进行提取,总蛋白浓度利用BCA Protein Assay Kit(Beyotime)试剂盒进行定量分析。以玉米不同组织及根部不同部位的总蛋白为样品,利用SDS-PAGE对总蛋白进行分离,分离后的蛋白转移至PVDF膜上(0.2μm,Millipore,USA)。然后对附着分离蛋白的PVDF膜进行封闭,及初级抗体和次级抗体的孵育。最后利用BeyoECL Plus(Beyotime)对化学发光进行检测。ZmNLP5特异性的抗体(抗体由上海英基生物科技有限公司ABclonal technology制备,兔源为实验级日本大耳白兔)的稀释比例为1:1000,标签抗体UDPGP(Agrisera)的稀释比例为1:2000,次级抗体(羊抗兔)的稀释比例为1:3000。
[0044]
结果分析表明,ZmNLP5mRNA在根、茎、叶中均有表达,其中根部的积累量最多(图1A)。ZmNLP5蛋白主要在根部检测到,茎和叶中未检测到可见的ZmNLP5蛋白信号(图 1B)。此外ZmNLP5mRNA在根尖的积累量显著高于根的中部和上部(图1C),ZmNLP5蛋白也主要在根尖部位检测到(图1D)。
[0045]
实施例3 ZmNLP5调控氮代谢关键酶基因ZmNIR1.1启动子的瞬时表达活性分析
[0046]
3.1载体构建:
[0047]
效应载体(Effector):将实施例1中分离克隆到的ZmNLP5cDNA利用同源重组法构建到pMDC83-35S载体上,形成35S启动子驱动的ZmNLP5作为效应载体,pMDC83-35S空白载体为阴性对照(图2A)。效应载体构建引物对序列包括ZmNLP5-pMDC83正向引物和ZmNLP5-pMDC83反向引物,分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。
[0048]
报告载体(Reporter):按照实施例1中的方法分离克隆亚硝酸还原酶基因ZmNIR1.1(GRMZM2G079381)起始密码子上游约1200bp的DNA片段,克隆引物对包括ZmNIR1.1-HindIII-F和ZmNIR1.1-BamHI-R,序列分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示,测序鉴定得到如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列,利用同源重组法将包含ZmNIR1.1启动子区域的DNA片段构建到pGreenII0800-LUC载体上,载体构建引物序列如SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示,以构建的载体作为报告载体(ZmNIR1.1::LUC),其含有35S启动子启动的海肾荧光素酶基因(REN:内参基因)和ZmNIR1.1启动子启动的萤火虫荧光素酶基因(LUC:报告基因)(图2A)。
[0049]
3.2基因枪法转化洋葱表皮细胞观测双荧光素酶活性
[0050]
利用包裹DNA质粒(35S::ZmNLP5和ZmNIR1.1::LUC,对照为35S和ZmNIR1.1::LUC)的金粉轰击洋葱(Allium cepa)表皮细胞,基因枪型号:PDS-1000system(Bio-Rad,Hercules,CA)。轰击后的样品25℃暗培养8h,按利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(碧云天)说明书方法分别检测LUC和REN的活性,最后利用化学发光酶标仪(Tecan M200)进行发光强度的测定。
[0051]
瞬时双荧光素酶活性检测结果发现:相对对照试验,共表达载体35S::ZmNLP5和ZmNIR1.1::LUC,引起LUC活性显著上调(P≤0.01,t测验)(图2B)。上述实验证明,ZmNLP5可以激活ZmNIR1.1基因的转录。
[0052]
实施例4 玉米NLP转录因子ZmNLP5在提高玉米氮素营养同化利用中的应用
[0053]
以下以ZmNLP5基因突变的玉米材料zmnlp5(编号:UFMu-01175, http:// www.maizegdb.org/uniformmu,W22背景,突变体及野生型种子均获得于美国玉米遗传资源联合存储中心-UniformMu转座子资源库Maize Genetics Cooperation Stock Center UniformMu Transposon Resource)为例,对本发明的优选实施方式进行描述,但并不限定本发明。
[0054]
硝酸盐是旱地作物(例如玉米)主要的氮源,其进入植物根部细胞后由硝酸还原酶(NR)和亚硝酸还原酶(NIR)还原为铵盐,铵盐经过一系列的连续反应最终同化为氨基酸。因此,NR和NIR是玉米氮素同化利用的关键酶。实施例3中已证明ZmNLP5对亚硝酸还原酶基因(ZmNIR1.1)的表达具有转录激活作用,为了进一步阐明ZmNLP5对氮响应及氮同化途径的影响,我们检测了氮刺激后野生型(WT)和突变体(zmnlp5)苗期植株中ZmNR和ZmNIR基因的表达水平,ZmNR1.1基因的qPCR引物对如SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示,ZmNR1.2基因的qPCR引物对如SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19所示,ZmNIR1.1基因的qPCR引物对如SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示,ZmNIR1.2基因的qPCR引物对如SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所示。将一周龄的WT和zmnlp5植物幼苗进行短期N饥饿处理(两周),然后进行瞬时氮处理(15mM KNO 3),并利用qPCR技术监测处理后0、30、60和120min各时间点基因的表达量的变化情况,每个时间点两种处理保证3个生物学重复。如图3所示,我们对ZmNR1.1(GRMZM5G878558),ZmNR1.2(GRMZM2G428027),ZmNIR1.1和ZmNIR1.2(GRMZM2G102959)4个基因的转录进行了检测。结果表明:氮刺激60min后zmnlp5突变体中4个基因的表达量均显著低于WT植物(P≤0.05),氮刺激120min后相对野生型植株,zmnlp5突变体植株中ZmNR1.1,ZmNR1.2,ZmNIR1.1和ZmNIR1.2基因的转录水平分别显著下调6.2、1.6、1.8和8.6倍(图3)。氮同化关键基因响应氮刺激表达量上调在zmnlp5突变植物中受阻,表明ZmNLP5功能的丧失严重影响植株的氮响应和氮同化途径。
[0055]
此外,将zmnlp5突变体和野生型材料种植于足氮(SN:15mM KNO 3)和低氮(DN:0.15mM KNO 3)两种环境,利用凯氏定氮法测定穗位叶和籽粒总氮含量,探究ZmNLP5对成熟期植株氮同化利用的影响。结果发现:zmnlp5突变体植株穗位叶的总氮含量在足氮和低氮两种环境下均显著低于野生型植株(P≤0.05),分别下降了14.53%和21.31%(图4)。足氮环境下突变体和野生型籽粒总氮含量差异不明显,但在低氮环境下zmnlp5突变体籽粒总氮含量显著低于野生型植株(P≤0.05),下降21.09%。突变体材料在氮素营养同化利用的能力上明显减弱(图4)。
[0056]
实施例5 玉米NLP转录因子ZmNLP5在低氮环境下促进玉米根部伸长生长中的应用
[0057]
实施例3中已显示ZmNLP5直接激活ZmNIR1.1表达(图2),并且实施例2中显示ZmNLP5主要在根尖区域表达(图1)。由于氮素同化过程中ZmNIR1.1是将亚硝酸盐还原为铵盐的关键酶,并且亚硝酸盐对根尖区域快速生长的细胞具有一定的细胞毒性(Hachiya T,Ueda N,Kitagawa M,et al.2016.Arabidopsis root type ferredoxin:NADP(H)oxidoreductase 2 is involved in detoxification of nitrite in roots.Plant and Cell Physiology,57(11):2440-2450)。推测ZmNLP5对植物的根部的伸长生长具有一定贡献。
[0058]
为了验证这一假设,我们首先研究不同亚硝酸盐浓度(0、0.5、1、2和5Mm KNO 2)下,突变体和野生型植株根长和根尖亚硝酸盐含量之间的关系。对水培营养液(除亚硝酸盐浓度不同,其他成分同实施例2)培养2周的玉米幼苗的根长和根尖亚硝酸盐含量进行测定。结果表明:在亚硝酸盐浓度达到2mM之前,WT和zmnlp5之间的根长没有显著差异;但当亚硝酸盐的浓度高于2mM时,zmnlp5突变体植株根尖比WT中积累更多的亚硝酸盐(P≤0.01),并且根长也显著降低(P≤0.05)(图5)。说明zmnlp5突变体中由于ZmNLP5功能异常不能激活ZmNIR1.1的表达致使根尖亚硝酸还原酶的表达量降低而不能及时地将亚硝酸盐同化为铵盐,从而导致亚硝酸盐在zmnlp5突变体根尖积累,当积累到达一定浓度便对根尖细胞产生毒性,最终导致根部的伸长生长遭到抑制。
[0059]
为了进一步检查不同硝酸盐浓度下ZmNLP5对植物根长的影响,我们对足氮(SN)和低氮(DN)水培营养液中生长的3周的野生型和突变体幼苗的根长和亚硝酸含量进行测定。结果显示:SN条件下WT和zmnlp5突变体材料的根长没有显著差异,分别为142.333±2.517mm和145.000±3.606mm(图5),但在低氮(DN)条件下zmnlp5植株根长显著短于野生型材料(zmnlp5为166.667±8.622mm,WT为218.333±7.095mm,P≤0.01,图5),降低了23.66%。并且zmnlp5植物较野生型植株在根尖中积累了更多的亚硝酸盐(zmnlp5中为1.106±0.077μg/g,WT中为0.861±0.036μg/g,图5),增加了28.5%。
[0060]
综上所述,足氮环境下,高NO 3 -浓度传达给植物外界氮源充足的信号,植株根系不需要进一步的伸长生长(高NO 3 -浓度对植物根部的生长有一定的抑制作用)。所以即使足氮环境下突变体材料根尖亚硝酸盐的积累量高于野生型,但总体根长与野生型无显著性差异。但在氮素缺乏的环境,低NO 3 -浓度传达给植物环境缺氮信号,植株根系需要进一步伸长生长以便于尽可能的吸收环境中的氮素营养,然而此时zmnlp5突变体根尖中过 量积累的亚硝酸盐对低氮环境下植株的正常伸长生长产生抑制,导致低氮环境下zmnlp5突变体出现根长伸长受阻的表型。这也最终影响了低氮环境下zmnlp5突变体成熟植株的氮同化利用能力(图3)。
[0061]
本发明从玉米中克隆了一个在氮素营养同化利用中发挥重要调控作用的基因ZmNLP5,该基因的开放阅读框具有SEQ ID NO:1所示的DNA序列。ZmNLP5基因所编码转录因子蛋白具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。本发明的转录因子ZmNLP5主要在玉米根尖组织表达,通过促进氮素同化途径关键酶(亚硝酸还原酶ZmNIR1.1)基因启动子的驱动表达活性从而提高玉米氮素同化效率,进而提高玉米籽粒总氮含量。本发明对培育氮素高效利用的玉米新品种具有重要价值。
[0062]
综上所述,本发明的玉米NLP转录因子ZmNLP5能够促进氮代谢关键酶基因的表达,提高玉米氮素营养同化利用,并在低氮环境下促进玉米根部伸长生长,适于大规模推广应用。
[0063]
在此说明书中,本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是,很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此,说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。
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权利要求书

[权利要求 1]
一种玉米NLP转录因子ZmNLP5,其特征在于,所述玉米NLP转录因子ZmNLP5的编码序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[权利要求 2]
根据权利要求1所述的玉米NLP转录因子ZmNLP5,其特征在于,所述玉米NLP转录因子ZmNLP5的编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[权利要求 3]
根据权利要求1所述的玉米NLP转录因子ZmNLP5在促进氮代谢关键酶基因ZmNIR1.1表达中的应用。
[权利要求 4]
根据权利要求1所述的玉米NLP转录因子ZmNLP5在促进氮代谢关键酶基因ZmNIR1.2表达中的应用。
[权利要求 5]
根据权利要求1所述的玉米NLP转录因子ZmNLP5在促进氮代谢关键酶基因ZmNR1.1表达中的应用。
[权利要求 6]
根据权利要求1所述的玉米NLP转录因子ZmNLP5在促进氮代谢关键酶基因ZmNR1.2表达中的应用。
[权利要求 7]
根据权利要求1所述的玉米NLP转录因子ZmNLP5在提高玉米氮素营养同化利用中的应用。
[权利要求 8]
根据权利要求1所述的玉米NLP转录因子ZmNLP5在低氮环境下促进玉米根部伸长生长中的应用。

经修改的权利要求 (条约第19条)
[ 国际局收到日: 25 9月 2019 (25.09.2019)]

[1]
[已修改] 
玉米NLP转录因子ZmNLP5在促进氮代谢关键酶基因ZmNIR1.1表达中的应用,所述玉米NLP转录因子ZmNLP5的编码序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[2]
[已修改] 
玉米NLP转录因子ZmNLP5在促进氮代谢关键酶基因ZmNIR1.2表达中的应用,所述玉米NLP转录因子ZmNLP5的编码序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[3]
[已修改] 
玉米NLP转录因子ZmNLP5在促进氮代谢关键酶基因ZmNR1.1表达中的应用,所述玉米NLP转录因子ZmNLP5的编码序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[4]
[已修改] 
玉米NLP转录因子ZmNLP5在促进氮代谢关键酶基因ZmNR1.2表达中的应用,所述玉米NLP转录因子ZmNLP5的编码序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[5]
[已修改] 
玉米NLP转录因子ZmNLP5在提高玉米氮素营养同化利用中的应用,所述玉米NLP转录因子ZmNLP5的编码序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[6]
[已修改] 
玉米NLP转录因子ZmNLP5在低氮环境下促进玉米根部伸长生长中的应用,所述玉米NLP转录因子ZmNLP5的编码序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

附图

[ 图 1]  
[ 图 2]  
[ 图 3]  
[ 图 4]  
[ 图 5]