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1. (WO2018046521) PROCÉDÉ DE DÉTECTION DE NUCLÉOTIDES SIMPLES ET SONDES ASSOCIÉES
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N° de publication :    WO/2018/046521    N° de la demande internationale :    PCT/EP2017/072308
Date de publication : 15.03.2018 Date de dépôt international : 06.09.2017
CIB :
C12Q 1/68
Déposants : BASE4 INNOVATION LIMITED [GB/GB]; Broers Building JJ Thomson Avenue Cambridge Cambridgeshire CB3 0FA (GB)
Inventeurs : BALMFORTH, Barnaby; (GB).
FRAYLING, Cameron Alexander; (GB)
Mandataire : BRISCOE, Paul Brian; (GB)
Données relatives à la priorité :
16187493.8 06.09.2016 EP
1618918.5 09.11.2016 GB
Titre (EN) SINGLE NUCLEOTIDE DETECTION METHOD AND ASSOCIATED PROBES
(FR) PROCÉDÉ DE DÉTECTION DE NUCLÉOTIDES SIMPLES ET SONDES ASSOCIÉES
Abrégé : front page image
(EN)A method of sequencing a nucleic acid is provided. It is characterised by the steps of (1) generating a stream of single nucleoside triphosphates by progressive enzymatic digestion of the nucleic acid; (2) producing at least one substantially double-stranded primary oligonucleotide used probe by reacting, in the presence of a polymerase and a ligase, at least one of the single nucleoside triphosphates with a corresponding primary probe comprising (a) a first single- stranded oligonucleotide including a restriction endonuclease nicking-site, a single nucleotide capture site for capturing the single nucleoside triphosphate and oligonucleotide flanking regions juxtaposed either side of the capture site and (b) second and third single-stranded oligonucleotides capable of hybridising to the first oligonucleotide flanking regions; (3) nicking the first oligonucleotide strand of the used primary probe at the nicking-site with a nicking restriction endonuclease to create separate first oligonucleotide components; (4) separating the first oligonucleotide components generated in step (3) from the complementary strand of the used probe; (5) producing at least one substantially double-stranded secondary used probe by reacting, in the presence of a ligase, at least one of the separated first oligonucleotide components with a corresponding secondary probe comprising (c) a complementary fourth oligonucleotide bearing fluorophores in a substantially undetectable state and optionally (d) a fifth oligonucleotide at least in part complementary to the fourth oligonucleotide; (6) digesting the used secondary probe with an enzyme having double-stranded exonucleolytic activity to yield the fluorophores in a detectable state and a single-stranded sixth oligonucleotide which is at least in part the sequence complement of the fourth oligonucleotide and (7) detecting the fluorophores released in step (6). The method is advantageously carried out in microdroplets. Corresponding biological probe systems comprised of the primary and secondary probes are also described.
(FR)L'invention concerne un procédé de séquençage d'un acide nucléique. Ce procédé est caractérisé par les étapes de (1) génération d'un flux de nucléoside triphosphates uniques par digestion enzymatique progressive de l'acide nucléique ; (2) production d'au moins une sonde utilisée oligonucléotidique primaire sensiblement double brin en faisant réagir, en présence d'une polymérase et d'une ligase, au moins l'un des nucléoside triphosphates uniques avec une sonde primaire correspondante comprenant (a) un premier oligonucléotide simple brin comprenant un site de coupure d'endonucléase de restriction, un site de capture de nucléotide unique pour capturer le nucléoside triphosphate unique et des régions oligonucléotidiques flanquantes juxtaposées de part et d'autre du site de capture et (b) des deuxième et troisième oligonucléotides simple brin aptes à s'hybrider aux premières régions oligonucléotidiques flanquantes ; (3) coupure du premier brin oligonucléotidique de la sonde primaire utilisée au niveau du site de coupure par une endonucléase de restriction de coupure pour créer des premiers constituants oligonucléotidiques séparés ; (4) séparation des premiers constituants oligonucléotidiques générés à l'étape (3) à partir du brin complémentaire de la sonde utilisée ; (5) production d'au moins une sonde utilisée secondaire sensiblement double brin par réaction, en présence d'une ligase, d'au moins l'un des premiers constituants oligonucléotidiques séparés avec une sonde secondaire correspondante comprenant (c) un quatrième oligonucléotide complémentaire portant des fluorophores dans un état sensiblement indétectable et éventuellement (d) un cinquième oligonucléotide au moins en partie complémentaire du quatrième oligonucléotide ; (6) digestion de la sonde secondaire utilisée avec une enzyme ayant une activité exonucléolytique de double brin pour produire les fluorophores dans un état détectable et un sixième oligonucléotide simple brin qui est au moins en partie le complément de séquence du quatrième oligonucléotide et (7) détection des fluorophores libérés à l'étape (6). Le procédé est avantageusement mis en œuvre dans des micro-gouttelettes. L'invention concerne également des systèmes de sonde biologique correspondants comprenant les sondes primaires et secondaires.
États désignés : AE, AG, AL, AM, AO, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BH, BN, BR, BW, BY, BZ, CA, CH, CL, CN, CO, CR, CU, CZ, DE, DJ, DK, DM, DO, DZ, EC, EE, EG, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, GT, HN, HR, HU, ID, IL, IN, IR, IS, JO, JP, KE, KG, KH, KN, KP, KR, KW, KZ, LA, LC, LK, LR, LS, LU, LY, MA, MD, ME, MG, MK, MN, MW, MX, MY, MZ, NA, NG, NI, NO, NZ, OM, PA, PE, PG, PH, PL, PT, QA, RO, RS, RU, RW, SA, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, ST, SV, SY, TH, TJ, TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VC, VN, ZA, ZM, ZW.
Organisation régionale africaine de la propriété intellectuelle (ARIPO) (BW, GH, GM, KE, LR, LS, MW, MZ, NA, RW, SD, SL, ST, SZ, TZ, UG, ZM, ZW)
Office eurasien des brevets (OEAB) (AM, AZ, BY, KG, KZ, RU, TJ, TM)
Office européen des brevets (OEB) (AL, AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, HR, HU, IE, IS, IT, LT, LU, LV, MC, MK, MT, NL, NO, PL, PT, RO, RS, SE, SI, SK, SM, TR)
Organisation africaine de la propriété intellectuelle (OAPI) (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GQ, GW, KM, ML, MR, NE, SN, TD, TG).
Langue de publication : anglais (EN)
Langue de dépôt : anglais (EN)