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1. WO2005064016 - PROCÉDÉ DE DÉTECTION MULTIPLEX DE MICRO-ORGANISMES

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明 細書

微生物の多重検出方法

技術分野

[0001] 本発明は、食品に存在する病原性大腸菌 0157、リステリアモノサイトゲネス、サル モネラ属菌等の微生物を、 1本の PCR反応チューブで複数の標的遺伝子の増幅を 行い、それを解析することで、公定法と同等又はそれ以上の高い感度で検出すること ができる微生物の多重検出方法に関する。

背景技術

[0002] 従来、マルチプレックス PCRを利用する微生物の多重検出方法は、よく知られてい る。例えば、野菜'果実を対象として病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリ ァモノサイトゲネスの各菌を多重検出する方法 (例えば、非特許文献 1参照)、食品 中の病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌を多重検出する方法 (例えば、非特許文 献 2参照)、牛乳を対象として病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリアモノ サイトゲネス、カンピロバクタ一属菌の各菌を多重検出する方法 (例えば、非特許文 献 3参照)、食品中のサルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスを多重検出する方 法 (例えば、非特許文献 4参照)、食品中の病原性大腸菌 0157等の大腸菌を多重 検出する方法 (例えば、非特許文献 5参照)、牛乳を対象として病原性大腸菌 0157 、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスの各菌を多重検出する方法 (例えば、 非特許文献 6参照)などが報告されている。また、マルチプレックス PCR用のプライマ 一として、大腸菌の検出用プライマー (例えば、特許文献 1参照)、病原性大腸菌 Ol 57の O抗原検出用プライマー(例えば、特許文献 2参照)も知られている。

[0003] 他方、微生物の DNAを抽出する方法として、結核菌等のマイコバクテリゥムに溶菌 酵素ァクロモぺプチダーゼ等を用いる方法 (例えば、特許文献 3参照)、グラム陰性、 陽性菌に溶菌酵素ァクロモぺプチダーゼ等を用いる方法 (例えば、特許文献 4参照) 、レジオネラ菌にプロテアーゼ Kゃァクロモぺプチダーゼ等を用いる方法 (例えば、 特許文献 5参照)、大腸菌などにタンパク変性剤、還元剤、界面活性剤、キレート剤 等を用いる方法 (例えば、特許文献 6参照)などが知られてヽる。

[0004] 特許文献 1 :特開 2001— 95576号公報

特許文献 2:特開平 11-332599号公報

特許文献 3:特開平 6—165676号公報

特許文献 4:特表平 9— 500793号公報

特許文献 5 :特開平 5— 317033号公報

特許文献 6:特開平 6— 289016号公報

非特許文献 1 : Japanese Journal of Food Microbiology, Vol.19, No2, 47-55, 2002 非特許文献 2 : Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 21, 92-98, 1998 非特許文献 3 : Milchwissenschaft, 55 (9), 500-503, 2000

非特許文献 4 Journal of Food Protection, Vol.64, Nol l, 1744-1750, 2001 非特許文献 5 : Molecular and Cellular Probes, 13, 291-302, 1999

非特許文献 6 : Food Microbiology, 20, 345-350, 2003

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] 1種類の微生物を PCR法によって検出する方法は既に確立されている力複数の 微生物を PCR法で同時に検出する方法は、食品分野で検討されつつあるものの、 未だ十分に信頼できる方法は確立されて、な、と、うのが現状である。本発明の課 題は、食品に存在する病原性大腸菌 0157、リステリアモノサイトゲネス、サルモネラ 属菌等の汚染微生物を、 1本の PCR反応チューブで複数の標的遺伝子の増幅を行 い、それを解析することで、公定法と同等又はそれ以上の高い感度で検出することが できる微生物の多重検出方法を提供することにある。すなわち、複数の対合プライマ 一を組み合わせて行う PCR法として知られて!/、るマルチプレックス PCRを用いて、病 原性大腸菌 0157、リステリアモノサイトゲネス、サルモネラ属菌等の汚染微生物を簡 便に、かつ高い感度で再現性よく検出することができる微生物の多重検出方法を提 供することにある。

課題を解決するための手段

[0006] (培養)

危害の高い病原菌は、食品中で「陰性」(25g中に含まれていないこと)であることが

定められており、その検出には、公定法と同等以上の精度が求められる。食品 25g中 1CFUレベルの微量に汚染した微生物を検出するためには、増菌培養が不可欠で ある。増菌培養する場合、通常、対象の病原菌ごとに個別に選択性のある培地を使 用して培養する力同時に数種の微生物を検出するために、増菌についても、 1種の 培地で複数の微生物を同時に増殖させるための検討を行った。なるべく短時間(例 えば、 24時間以内)で検出できる培養条件を設定するが好ましぐそのためには、特 に培地の選択が重要となる。同時に増菌することは、対象微生物同士が同科あるい は同属菌種、または発育特性が似ていれば比較的容易であるが、異種で発育特性 が異なる微生物の場合は難しい。例えば、病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リ ステリアモノサイトゲネスを検出対象とした場合、これら病原菌 3菌種中で、サルモネ ラ、 0157に比べて、低温発育性であるリステリアは増殖が遅いという問題があった。

[0007] そこで、他の細菌が混在した中でも、特にリステリアが十分に増殖できるように、リス テリアにとって好ましい栄養源を持つ培地で、炭水化物が少なぐ緩衝能が高い培地 について検討したところ、培地 No. 17 (トリプトース 10g、肉エキス 5g、酵母エキス 5g 、塩化ナトリウム 5g、グルコース 0. 5g、リン酸-ナトリウム 7g、リン酸一カリウム 15g/ 1L中)は、トリプトソーャブイヨンや BHI (ブレインハートインフュージョン)、 BPW( Buffered peptone Water)よりも 3種混在中でリステリアの増殖が最も良ぐサルモネラ と 0157もリステリアより増殖が早力つた。このことから、 3種同時に検出するためには 培地 No. 17が良いと考えられた。

[0008] (DNA)

PCR反応を行う際、 DNAの抽出を行うが、 DNAの抽出では溶菌操作が必要とな る。グラム陽性細菌の溶解は、より厚くより高密度なペプチドダリカン層が主要細菌細 胞壁成分であるため、グラム陰性細菌よりもかなり困難である。今回の技術ではサル モネラ、 0157などのグラム陰性菌に加え、リステリアというグラム陽性菌も同時に検 出する、という点で困難であった。また、食品からの抽出という点では、食品残渣は多 様性なものであり、溶菌法を 1種類に特定するのは困難である。特に畜肉などに代表 される検体では高タンパク、高脂肪、かつ個体差があるので、溶菌が一定の効率で 行われないという、 DNA抽出の上での困難性が存在した。さらに検討したところ、トリ

プトソーャブイヨン、ミューラーヒントンブロスなど、培養する培地の違いによって、リゾ チームだけでは細胞が壊れない( = DNAが抽出できない)リステリアがあった。培養 条件は、たとえ同じ培地を使用しても食品の種類が異なったり、損傷程度が異なるこ とで変わってくると考えられる。また、場合によっては、より回復の良い培地を用いる 必要性があるため、どのような場合でも細胞が壊れる抽出方法が必要であった。

[0009] 一般的な DNA抽出法として、ボイル法やアルカリ— SDS法が知られている力ボイ ル法ではリステリアが高感度に抽出できないことを確認した。 SDSは、 DNA抽出に ぉ 、て使用しやす、界面活性剤として知られて、るが、強力な PCR阻害剤であるた め、抽出に用いた後には、完全に除去しなければならない。未習熟な実験者におい ても熟練者と同様の効果と結果が得られるようにするためには、 SDSのように低濃度 の混入でも反応に影響を与える物質は好ましくなぐ SDSは熟練者との抽出効率差 が現われる原因になりうる危害要因と判断した。また、フエノール、クロ口ホルムは、危 険で人体に有害な有機溶媒であり、この処理を行うことによって DNAの精製度は良 くなるが、抽出効率に技術的な個人差が現われることが容易に想像でき、一定の感 度が保障できない。また、特別な廃液処理が必要となることから、食品製造現場での 検査法には適合しない抽出法であるということもできる。そこで、未習熟'熟練者にお いても操作が容易であり、かつ DNAの抽出効率 (言い換えれば検出感度)が一定で あることが期待でき、さらに、食品製造現場で実行できる簡便さ'安全さを備えており 、畜肉に代表される高タンパクな食品からも DNA抽出が可能な方法を開発する必要 性があった。

[0010] 培養液を 5 μ mのフィルターを通すことで大きな食品くずを取り除き、その後溶菌酵 素液 (ァクロモぺプチターゼとリゾチームの混合液)を混合し、 37°Cで 1時間処理後、 界面活性剤 [ツイーン 20 (Tween20) ]とタンパク質変性剤(グァ二ジンイソチオシァネ ート)の混合液をカ卩えて完全に菌体を溶解できることがわ力つた。また、ァクロモぺプ チダーゼの代わりにェンテロリシンのような溶菌活性を持つバクテリオシンを利用して も完全に菌体を溶解できることがわ力つた。遠心分離により不溶画分を取り除き、ァ ルコール沈殿を行ヽ DNAを抽出した。処理の順番はァクロモぺプチターゼがリゾチ ームより先、もしくは一緒に行い、あるいはェンテロリシンがリゾチームより先、もしくは 一緒に行い、その後ツイーン 20処理後、グァ-ジンイソチオシァネート処理、もしくは ツイーン 20とグァ-ジンイソチオシァネート処理を一緒に行うことが極めて好ましいこ とがわかった。ツイーン 20は粘性が高ぐ単独で加えることが難しいため混合添加す ることが望ま U、こともわ力つた。

[0011] また、フエノール、クロ口ホルム処理を行わなくても、アルコール沈殿や DN A抽出液 添カ卩量 (PCR反応液 50 1に対し 2 1)によって、 PCRで問題なく検出できる程度に 可溶ィ匕したタンパク質を除くことができた。ツイーン 20は PCR反応液にも使われるも ので、 SDSに比べ阻害が少なぐ未習熟な実験者でも扱いが容易であると考えられ た。また、もちろん、この抽出法はおのおの単独菌種での抽出においても可能である 。さらに、(1)ァクロモぺプチターゼ単独、(2)リゾチーム単独、(3)ェンテロリシン単 独、(4)ァクロモぺプチターゼ処理後グァ-ジンイソチオシァネート +ツイーン 20処 理、(5)リゾチーム処理後グァ-ジンイソチオシァネート +ツイーン 20処理、(6)ェン テロリシン処理後グァ-ジンイソチオシァネート +ツイーン 20処理、(7)プロティナ一 ゼ 、 (8)プロティナーゼ K処理後グァ-ジンイソチオシァネート +ツイーン 20処理、 (9)グァ-ジンイソチオシァネート +ツイーン 20処理、(10)グァ-ジンイソチオシァネ ート +ツイーン 20処理 +加熱処理、の各方法についても試みた力これらいずれの 方法も、ァクロモぺプチターゼとリゾチームで併用処理し、あるいはェンテロリシンとリ ゾチームで併用処理し、その後ツイーン 20とグァ-ジンイソチオシァネートで処理す る前記方法の方が、リステリアの高感度の抽出にぉ、て優れて!/、た。

[0012] (PCR反応)

数種の菌を同時に検出する方法としてマルチプレックス PCRを採用した。複数の対 合プライマーを組み合わせて行う PCR法であるマルチプレックス PCR法には、互!ヽ にプライマーダイマーを生成したり、識別バンドが互いに干渉したり、重複したりする ことがなぐ融解温度の近い対合プライマーを選定して用いた。プライマーの選択や 混合割合により、反応のしゃすさ、検出限界に差が出てくることもわ力つた。マルチプ レックス PCRを行う場合には、その後の判定に用いる電気泳動像に 3菌種のバンドが 同じような濃さで検出するようにプライマーの混合割合を調整する必要がある。 3菌種 が同じ DNA濃度(20pg)のとき、 3種菌のバンドが同様の濃さで検出できるよう、調整 した。例えば、プライマーとして、配列番号 1一 6で示される塩基配列からなる DNAを 使用した場合、 6種のプライマーの混合割合は、サルモネラ用プライマー各 120nM 、リステリア用プライマー各 100nM、 0157用プライマー各 80nM力配列番号 5— 1 0で示される塩基配列カゝらなる DNAを使用した場合、サルモネラ用プライマー各 60 nM、リステリア用プライマー各 60nM、 0157用プライマー各 240nMが最も理想的 な配合量であった。さらに低濃度の混合割合である、サルモネラ用プライマー各 30η Μ、リステリア用プライマー各 25ηΜ、 0157用プライマー各 20ηΜ (配列番号 1一 6 で示される塩基配列力もなる DNA使用時)、あるいは、サルモネラ用プライマー各 1 5ηΜ、リステリア用プライマー各 15ηΜ、 0157用プライマー各 60ηΜ (配列番号 5— 10で示される塩基配列からなる DNA使用時)においても検討した力電気泳動によ る目視での検出が可能ではあるが困難であったことから、上記濃度が好ましいことが わかった。

また、 PCR反応では、最終産生量が 10— 8Μ程度まで標的遺伝子を増幅できること が知られて、る。 PCR反応では通常 1菌種にっき 200ηΜ程度のプライマーをカ卩えて 行う力多重検出の場合、各菌種についてこのプライマー量をカ卩えることは明らかに 過剰であることがわかった。特にマルチプレックス反応の場合、その過剰なプライマ 一による生成産物 (これは非標的産物を含む)により優位な反応のみが結果として得 られる可能性が高い。このため、 PCR反応においてプライマー量を制限することで最 終産物量を制限することとマルチプレックス反応との関係を考慮した。もちろん、 PCR 反応にはプライマーダイマーなどを代表とする非増幅産物もプライマーを消費するた め、下限の濃度は存在するが、検出器の感度最低限のプライマー濃度を設定するこ とにより、より複数のマルチプレックス反応を成功させる可能性が期待できることもわ かった。言い換えれば、プライマーの下限の濃度を検出器の感度に合わせることで、 より複数の検出が期待できる。電気泳動や蛍光プローブ法、キヤビラリ一電気泳動法 などによる検出器の限界を考慮した上で、 50ηΜ程度以上での反応を行わざるを得 ず、 3種類の病原菌の検出を確認したが、検出器の感度上昇によってこの濃度を低 く設定することができ、より多くの標的を一度に検出できると考えられる。より高感度な 増幅産物検出法が実現した際には上記の考えを踏まえた上で最終産物量を制御す

ることにより、より多数のマルチプレックス PCRによる多重同時検出を実現できることも わかった。

[0014] すなわち本発明は、(1)食品中の 2種以上の異なる特性の微生物を、 1本の PCR 反応チューブで複数の標的遺伝子の増幅を行ヽ、それを解析することで公定法と同 等、又はそれ以上の高い感度で検出する方法であって、

(A)少なくとも、溶菌酵素及び Z又は溶菌活性を持つバクテリオシンと界面活性剤と タンパク質変性剤とで処理することにより、検出対象微生物の DNAを抽出する工程 と、

(B)検出対象微生物に特異的なプライマーを混合し、マルチプレックス PCRを行うェ 程と

を含むことを特徴とする微生物の多重検出方法や、(2)検出対象微生物の DNAを 抽出する工程の前に、 1CFUZ lOOgの微生物が 24時間培養後に 103CFUZml以 上となる培養条件下で培養する工程を含むことを特徴とする請求項 1記載の微生物 の多重検出方法や、(3) 2種以上の異なる特性の微生物が、リステリアモノサイトゲネ スを含むことを特徴とする上記(1)又は(2)記載の微生物の多重検出方法や、(4)特 異的なプライマーカ、配列番号 5及び 6に示される塩基配列からなるプライマーであ ることを特徴とする上記(3)記載の微生物の多重検出方法や、 (5) 2種以上の異なる 特性の微生物が、病原性大腸菌 0157を含むことを特徴とする上記(1)又は(2)記 載の微生物の多重検出方法や、(6)特異的なプライマーが、配列番号 1及び 2、又 は配列番号 7及び 8に示される塩基配列力なるプライマーであることを特徴とする請 求項 5記載の微生物の多重検出方法や、(7) 2種以上の異なる特性の微生物力サ ルモネラ属菌を含むことを特徴とする上記(1)又は(2)記載の微生物の多重検出方 法や、(8)特異的なプライマーが、配列番号 3及び 4、又は配列番号 9及び 10に示さ れる塩基配列からなるプライマーであることを特徴とする上記(7)記載の微生物の多 重検出方法に関する。

[0015] また本発明は、(9)培養後の pHが 5. 1以上となる培養条件下で培養することを特 徴とする上記(1)一(8)のいずれか記載の微生物の多重検出方法や、(10)ダルコ ース濃度が 0. 15%以下の培地、及び Z又は、リン酸緩衝液の濃度が 50mM以上

若しくはそれと同等の緩衝能を有する培地で培養することを特徴とする上記(1)一 (9 )の、ずれか記載の微生物の多重検出方法や、(11)溶菌酵素及び Z又は溶菌活 性を持つバクテリオシンを作用させた後、界面活性剤とタンパク質変性剤で処理し、 遠心分離により不溶画分を取り除き、アルコール沈殿により DNAを析出して抽出す ることを特徴とする上記(1)一(10)のいずれか記載の微生物の多重検出方法や、( 12)溶菌酵素力ァクロモぺプチダーゼ及び Z又はリゾチームであることを特徴とす る上記(1)一(11)のいずれか記載の微生物の多重検出方法や、(13)溶菌活性を 持つバクテリオシン力ェンテロリシンであることを特徴とする上記(1)一(12)のいず れか記載の微生物の多重検出方法や、(14)界面活性剤が、ソルビタンモノラウラー トのエチレンォキシド縮合物であることを特徴とする上記( 1)一( 13)のヽずれか記載 の微生物の多重検出方法や、(15)タンパク質変性剤力グァ-ジンイソチオシァネ ートであることを特徴とする上記(1)一(14)のいずれか記載の微生物の多重検出方 法や、(16)プライマーとして、配列番号 1一 6で示される塩基配列からなる DNAを合 計 750nM以下の濃度で組み合わせてマルチプレックス PCRを行うことを特徴とする 上記( 1)一( 15)の、ずれか記載の微生物の多重検出方法や、( 17)プライマーとし て、配列番号 5— 10で示される塩基配列力もなる DNAを合計 750nM以下の濃度 で組み合わせてマルチプレックス PCRを行うことを特徴とする上記(1)一(15)のいず れか記載の微生物の多重検出方法や、(18)食品が、食肉又は食肉加工品であるこ とを特徴とする上記(1)一(17)のいずれか記載の微生物の多重検出方法に関する

発明の効果

[0016] 本発明によると、食品に存在する病原性大腸菌 0157、リステリアモノサイトゲネス、 サルモネラ属菌等の微生物を、 1本の PCR反応チューブで複数の標的遺伝子の増 幅を行い、それを解析することで公定法と同等又はそれ以上の高い感度で簡便に検 出することができる。

発明を実施するための最良の形態

[0017] 本発明の微生物の多重検出方法としては、食肉、食肉加工品、牛乳、野菜等の食 品中の 2種以上の異なる特性の微生物を、 1本の PCR反応チューブで複数の標的

遺伝子の増幅を行い、それを解析することで公定法と同等、又はそれ以上の高い感 度で検出する方法であって、(A)少なくとも、溶菌酵素及び Z又は溶菌活性を持つ ノクテリオシンと界面活性剤とタンパク質変性剤とで処理することにより、検出対象微 生物の DNAを抽出する工程と、(B)検出対象微生物に特異的なプライマーを混合 し、マルチプレックス PCRを行う工程とを含む方法であれば特に制限されないが、上 記 (A)の検出対象微生物の DNAを抽出する工程の前に、 lCFUZlOOgの微生物 が 24時間培養後に 103CFU/ml以上となる培養条件下で培養する工程を含むこと が好ましい。また、検出対象の微生物としては、食品の汚染微生物であればどのよう なものでもよく、リステリアモノサイトゲネス、病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、 カンピロバクタ一属菌、腸炎ビブリオ、黄色ブドウ球菌、エルシニア属菌、大腸菌群、 セレウス菌、コレラ菌、赤痢菌、ボツリヌス菌などを具体的に例示することができる。ま た、公定法としては、「食品衛生検査指針」(1990年社団法人日本食品衛生協会 )に説明されている方法をいい、具体例が実施例 9において説明されている。

[0018] 本発明の微生物の多重検出方法によると、食品 25g中 1CFUレベルの微量に汚染 した微生物を検出することが可能となるが、本発明の微生物の多重検出方法におい ては、食品汚染微生物の培養工程が極めて重要である。食品汚染微生物の増菌培 養における培養条件としては、 lCFUZlOOgの微生物が 48時間培養後、好ましく は 30時間培養後、特に好ましくは 24時間培養後、中でも 18時間培養後に 103CFU Zml以上となる培養条件を挙げることができるが、さらに緩衝能を有する培地を用い て培養後の pHが 5. 1以上となる培養条件下で培養することや、グルコース濃度が 0 . 15%以下の培地、及び Z又は、リン酸緩衝液の濃度が 50mM以上若しくはそれと 同等の緩衝能を有する培地で培養するのが好ましヽ。リン酸緩衝液以外の緩衝液と しては、クェン酸緩衝液、酢酸緩衝液、乳酸緩衝液、酒石酸緩衝液、リンゴ酸緩衝液 、トリス緩衝液、 MOPS緩衝液、 MES緩衝液を挙げることができる。

[0019] 本発明の微生物の多重検出方法においては、培養増殖させた食品汚染微生物か らの DNA抽出工程が必須とされる。カゝかる DNA抽出工程としては、少なくとも、溶菌 酵素及び Z又は溶菌活性を持つバクテリオシンと界面活性剤とタンパク質変性剤と で処理することにより、検出対象微生物の DNAを抽出する工程であれば特に制限さ れないが、溶菌酵素及び Z又は溶菌活性を持つバクテリオシンを作用させた後、界 面活性剤とタンパク質変性剤で処理し、遠心分離により不溶画分を取り除き、アルコ ール沈殿により DNAを析出して抽出する方法を好適に例示することができる。上記 溶菌酵素としては、ァクロモぺプチダーゼ、リゾチーム、プロテア一ゼ、キトサナー ゼ、キチナーゼ、 13— 1 , 3—ダルカナーゼ、ザィモリアーゼ、セルラーゼ等を挙げるこ とができ、溶菌活性を持つバクテリオシンとしては、ェンテロリシン、ヘルべティシンを 挙げることができる。これらは 1種又は 2種以上用いることができるが、中でもァクロモ ぺプチダーゼ、リゾチーム、ェンテロリシンやこれらの組合せ、例えば、ァクロモぺプ チダーゼとリゾチームとの併用、ェンテロリシンとリゾチームとの併用を好適に例示す ることができる。上記界面活性剤としては、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性 剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤を挙げることができ、中でも非イオン界面 活性剤であるソルビタンモノラウラートのエチレンォキシド縮合物、より具体的には、ッ ィーン 20を好適に挙げることができる。上記タンパク質変性剤としては、グァ-ジンィ ソチオシァネート、尿素、塩酸グァ-ジン、トリクロ口酢酸、 SDS、 Triton X— 100、 デォキシコール酸等を挙げることができ、これらは 1種又は 2種以上用いることができ るが、中でも溶菌効果や取扱、易さの点でグァニジンイソチオシァネートが好ましヽ 。溶菌物力の DNAの抽出 ·析出は、遠心分離により不溶画分を取り除き、アルコー ル沈殿を行うなど、公知の方法により行うことができる。

本発明の微生物の多重検出方法においては、前記抽出した DNAと、検出対象微 生物に特異的なプライマーを混合し、マルチプレックス PCRを行う工程が必須とされ る。使用するプライマーとしては、検出対象微生物特異的なプライマーであって、互 いにプライマーダイマーを生成したり、識別バンドが互いに干渉したり、重複したりす ることがなく、融解温度の近い対合プライマーを選択することが好ましい。また、その 後の判定に用いられる電気泳動像に出現するバンドが同じような濃さで検出しうるよ うにプライマーの混合割合を調整することが好ましい。例えば、病原性大腸菌 0157 に特異的なプライマーセットとしては、配列番号 1及び 2、配列番号 7及び 8、配列番 号 11及び 12、配列番号 13及び 14などに示される塩基配列からなる DNA力サル モネラ属菌に特異的なプライマーセットとしては、配列番号 3及び 4、配列番号 9及び 10、配列番号 15及び 16などに示される塩基配列からなる DNA力リステリアモノサ イトゲネスに特異的なプライマーセットとしては、配列番号 5及び 6、配列番号 17及び 18、配列番号 19及び 20などに示される塩基配列からなる DNAを挙げることができ、 これらを組み合わせて用いることができる力中でも配列番号 1一 6又は配列番号 5 一 10で示される塩基配列力もなる DNAの組み合わせが最も好ましぐこの場合、合 計 750nM以下の濃度でプライマーを混合することが好ましぐまた配列番号 1一 6を 用いた場合、 6種のプライマーの混合割合はサルモネラ用プライマー各 120nM、リ ステリア用プライマー各 100nM、 0157用プライマー各 80nM力配列番号 5— 10 を用いた場合、サルモネラ用プライマー各 60nM、リステリア用プライマー各 60nM、 0157用プライマー各 240nMが最も好まし!/、。

[0021] PCR後の検出法としては、電気泳動法、蛍光プローブ法、キヤビラリ一電気泳動法 、定量 PCR法などにより行うこともできる。特に、定量 PCRの場合は、プライマーとし て配列番号 5— 10で示される塩基配列からなる DNAを用い、蛍光プローブに配列 番号 21— 23で示される塩基配列からなる DNAを用いることにより検出することがで きる。

[0022] 以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこ れらの例示に限定されるものではない。

実施例 1

[0023] (既存培地での同時培養)

病原性大腸菌 0157は Escherichia coli 0157 : H7 ATCC43894、サルモネラ属 菌は Salmonella enteritidis IF03313、リステリアモノサイトゲネスは Listeria monocytogenes ATCC49594を用いた。また、肉由来菌には、シユードモナス( Pseudomonas fragi)、ントロノ、クタ1 ~~ (Citrobacter freundn)、フクトノ、チノレス、

Lactobacillus viriaescens)、ロイコノストック (Leuconostoc mesenteroidesノの 4株を用 いた。試験培地にはトリブトソーャブイヨン (TSB ;日水製薬社製)、及び、 Buffered Peptone Water (BPW;ペプトン 10g、塩ィ匕ナ卜リウム 5g、リン酸一水素ナトリウム 3. 5g 、リン酸-水素カリウム 1. 5gZlL)の 2つの培地を用いた。

[0024] 病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスを各 1CFUZ10

Oml、肉由来菌を各 104CFUZl00mlになるように試験培地に接種した。 35°Cで培 養し、経時的に一般生菌数、 0157数、サルモネラ数、リステリア数を計測した。一般 生菌数は標準寒天培地(日水製薬社製)を用い、 35°Cで 48時間培養後の総コ口- 一数、 0157数はデソキシコレート寒天培地(日水製薬社製)を用い、 35°Cで 24時 間培養後の大腸菌様のコロニー数、サルモネラ数は MLCB寒天培地(日水製薬社 製)を用い、 35°Cで 24時間培養後のサルモネラ様のコロニー数、リステリア数は PA LCAM寒天培地(Merck社製)を用い、 35°Cで 48時間培養後のリステリア様のコ口- 一数をそれぞれ測定した。結果を図 1に示す。その結果、いずれの培地でも特にリス テリアモノサイトゲネスの増殖が弱力つた。培養液の pHを測定したところ、 pHの低下 が認められた。

実施例 2

[0025] (培地の緩衝能および糖濃度の影響)

実施例 1でリステリアモノサイトゲネスの増殖が弱力つたのは培養後の培地の pHが 低下したことが原因と考えられたため、各菌の増殖に及ぼす培地の緩衝能および糖 濃度の影響を調査した。基本培地(トリプトース 10g、肉エキス 5g、酵母エキス 5g、塩 化ナトリウム 5gZlL中)に、リン酸-ナトリウムおよびリン酸一カリウムをカ卩えてリン酸 濃度を 15mMから 200mMまで調整し(pH6. 3)、グルコースの濃度を 0%力も 0. 2 5%まで変化させて加えて、試験培地を作製した。実施例 1で使用した、病原性大腸 菌 0157、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスを各 lCFUZl00ml、肉由来 菌を各 104CFUZmlになるように各試験培地に接種した。 35°Cで培養し、 18、 24、 30、 48時間後の一般生菌数、 0157数、サルモネラ数、リステリア数、 pHを計測した 。結果を表 1に示す。

[0026] その結果、グルコース濃度 0. 15%以下の培地、またはリン酸濃度 50mM以上の 培地、または培養後の pHを 5. 1以上に保持する培地を用いることによって病原性大 腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスとも 18時間以上培養するこ とで 103CFUZml以上 (PCRでの検出に必要な菌数)に増殖した。以降の試験には 表 1の No. 17の培地(トリプトース 10g、肉エキス 5g、酵母エキス 5g、塩化ナトリウム 5 g、グルコース 0. 5g、リン酸-ナトリウム 7g、リン酸一カリウム 15g/lL中)を選定した 。培地成分については、検出の目的とする細菌の存在環境や損傷程度に応じて、ト リプトース、肉エキス、酵母エキス以外の窒素源、グノレコース以外の炭素源、リン酸以 外の緩衝能を持つ物質も有効であり、また、増殖を促進する物質として無機塩類ゃピ ルビン酸もしくはピルビン酸塩、ツイーンなどの界面活性剤を添加した方がより好まし かった。

[0027] [表 1]


実施例 3

[0028] (DNA抽出方法 1)

病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスの各菌を No. 17 培地 10mlに接種し、 35°Cで 18時間培養した。各培養液をそれぞれ lmlチューブに 取り、 15, OOOr. p. mで 5分間遠心分離を行い、菌体を回収した。その菌体回収物 に溶菌酵素液 {20mg//mlのァクロモぺプチダーゼ 10 μ 1と 20mgZmlのリゾチーム 10 1と TEバッファー [ImM EDTAを含む lOmMトリス(ヒドロキシメチル)ァミノメタ ン-塩酸緩衝液、 ρΗ8] 180 /ζ 1の混合液 }をカ卩え、 37°Cで 1時間処理後、溶菌剤(ッ ィーン 20を 1一 2%添加した 4Mグァ-ジンイソチオシァネート溶液)を 300 μ 1加えて 完全に菌体を溶解した。この溶液を光学顕微鏡で観察したところ、溶菌が十分に行 われていることが確認できた。この溶液を 15, OOOr. p. mで 5分間遠心分離し、上澄 み 400 μ 1を別のチューブに移し、溶液中の DNAをイソプロパノールで沈殿させた後 、遠心分離して目的の DNAを得た。また、ァクロモぺプチダーゼの代わりに、ェンテ 口リシンを用いても、同様に溶菌が十分に行われていることが確認できた。

実施例 4

(DNA抽出方法 2)

同様に、病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスの各菌 を No. 17培地 10mlに接種し、 35°Cで 18時間培養した。各培養液をそれぞれ lml チューブに取り、 15, 000r. p. mで 5分間遠心分離を行い、菌体を回収した。その 菌体回収物に溶菌剤(ツイーン 20を 1一 2%添カ卩した 4Mグァ-ジンイソチオシァネ ート溶液)を 500 1カ卩え、回収物を溶解した。 100°Cで 10分間加熱し、 5分間氷冷し た。この溶液を光学顕微鏡で観察したところ、病原性大腸菌 0157やサルモネラ属 菌は溶菌できていた力実施例 3の DNA抽出方法に比べるとリステリアモノサイトゲ ネスの溶菌の程度が少し劣っていた。また、リステリアモノサイトゲネスの溶菌を、 1)菌 体回収物に 20mgZmlのァクロモぺプチダーゼ 10 μ 1と ΤΕバッファー 190 μ 1の混合 液を加え、 37°Cで 1時間処理した液、 2)菌体回収物に 20mgZmlのリゾチーム 10 1 と TEバッファー 190 1の混合液をカ卩え、 37°Cで 1時間処理した液、 3)菌体回収物に ェンテロリシン 10 1と TEバッファー 190 1の混合液を加え、 37°Cで 1時間処理した 液、 4)上記 1)液に、溶菌剤(ツイーン 20を 1一 2%添カ卩した 4Mグァ-ジンイソチオシ ァネート溶液)を 300 1加え混合した液、 5)上記 2)液に、溶菌剤(ツイーン 20を 1一 2 %添カ卩した 4Mグァ-ジンイソチオシァネート溶液)を 300 μ 1加え混合した液、 6)上 記 3)液に、溶菌剤(ツイーン 20を 1一 2%添カ卩した 4Μグァ-ジンイソチオシァネート 溶液)を 300 1カ卩ぇ混合した液、 7)菌体回収物に 20mgZmlのプロティナーゼ K1 1と TEバッファー 200 1の混合液を加え、 37°Cで 1時間処理した液、 8)上記 7)液 に、溶菌剤(ツイーン 20を 1一 2%添カ卩した 4Mグァ-ジンイソチオシァネート溶液)を 300 1加え混合した液、 9)菌体回収物に溶菌剤(ツイーン 20を 1一 2%添カ卩した 4M グァ-ジンイソチオシァネート溶液) 500 μ 1をカロえ混合した液をそれぞれ用いて行!ヽ 、光学顕微鏡で観察を行ったが、いずれもリステリアモノサイトゲネスの溶菌の程度が 実施例 3の DNA抽出方法に比べると少し劣っていた。

実施例 5

[0030] (PCR反応の条件設定)

実施例 3で得た DNA抽出液を用いて PCR反応を行った。 PCRは、次のプライマー から、検出対象微生物毎に特異的なプライマーを 1セットずつ選択して用いた。 配列番号 1 : GGC GGA TTA GAC TTC GGC TA

配列番号 2 : CGT TTT GGC ACT ATT TGC CC

配列番号 3: GGG AGT CCA GGT TGA CGG AAA ATT T

配列番号 4 : GTC ACG GAA GAA GAG AAA TCC GTA CG

配列番号 5 : CGG AGG TTC CGC AAA AGA TG

配列番号 6 : CCT CCA GAG TGA TCG ATG TT

配列番号 7 :ATC ATT GAC GAT TGT AGC ACC

配列番号 8 : ACA TGA GGA GCA TTA ACT TCG

配列番号 9 : GGG TCG TTC TAC ATT GAC AG

配列番号 10 : TTC CCT TTC CAG TAC GCT TC

配列番号 11 : GTA TTT GGA GAC ATG GGA GC

配列番号 12 : ACT AAT GAC ACG ATT CGT TCC

配列番号 13 : CGG ACA GTA GTT ATA CCA C

配列番号 14 : CTG CTG TCA CAG TGA CAA A

配列番号 15 : AGC TTT GGT CGT AAA ATA AGG

配列番号 16 : GAT GCC CAA AGC AGA GAG AT

配列番号 17 : CAA ACT GCT AAC ACA GCT ACT

配列番号 18 : GCA CTT GAA TTG CTG TTA TTG

配列番号 19 : ACC AAT GGG ATC CAC AAG A

配列番号 20 : GAG CTG AGC TAT GTG CGA T

[0031] PCR反応液は、 10 X Buffer5 μ 1、 dNTP溶液 4 μ 1、 UNGO. 5 1、 AmpliTaq G old 0. 25 μ 1、 MgCl lO ^ K 、ずれも、アプライドバイオシステムズジャパン社製)、 プライマー、 DNA抽出液 2 /z lに滅菌水をカ卩えて合計 50 /z lとした。反応条件は 50°C で 2分保持後、 95°Cで 10分反応させた後、 95°C ' 20秒、 60°C ' 30秒、 72°C ' 30秒 を 40回繰り返し、 72°Cで 7分保持後、 4°Cで保管した。 PCR産物は 2. 5%ァガロー スゲル電気泳動で確認した。配列番号 1一 6で示される塩基配列からなる DNAを組 み合わせる場合、プライマーの混合割合は病原性大腸菌 0157用プライマー (配列 番号 1、 2)各 80nM、サルモネラ属菌用プライマー(配列番号 3、 4)各 120nM、リス テリアモノサイトゲネス用プライマー(配列番号 5、 6)各 ΙΟΟηΜが最も理想的な配合 量であった。例えば、さらに低濃度の混合割合である、病原性大腸菌 0157用プライ マー各 20nM、サルモネラ属菌用プライマー各 30nM、リステリアモノサイトゲネス用 プライマー各 25nMにおいても検討した力ァガロース電気泳動による目視での検 出は可能ではあるが多少困難であった。また、配列番号 5— 10で示される塩基配列 カゝらなる DNAを用いた場合、プライマー混合割合は病原性大腸菌 0157用プライマ 一(配列番号 7、 8)各 240nM、サルモネラ属菌用プライマー(配列番号 9、 10)各 60 nM、リステリアモノサイトゲネス用プライマー(配列番号 5、 6)各 60nMが最も理想的 な配合量であった。その他の病原性大腸菌 0157用プライマー(配列番号 11、 12も しくは配列番号 13、 14)、サルモネラ属菌用プライマー(配列番号 15、 16)、リステリ ァモノサイトゲネス用プライマー(配列番号 17、 18又は配列番号 19、 20)についても それぞれ混合割合を調整することにより利用できることがわ力つた。

[0032] また、配列番号 5— 10の組み合わせでは、それぞれの内部配列に特異的な配列 番号 21— 23を蛍光色素で標識したプローブを用いることによって、定量 PCRもしく はハイブリダィゼーシヨン等による検出手法において検出できることがわ力つた。 配列番号 21 : CGG ATG ATT TGT GGC ACG AGA AA

配列番号 22 :TCT GGC ATT ATC GAT CAG TAC CAG CC

配列番号 23 : AGT TCA AAT CAT CGA CGG CAA CCT CGG A

実施例 6

[0033] (反応特異性の確認)

表 2に示した病原性大腸菌 0157を 4株、サルモネラ属菌 4株、リステリアモノサイト ゲネス 10株、病原性大腸菌 0157以外の Escherichia coli4株、リステリアモノサイトゲ ネス以外のリステリア属 4株を用いて特異性の確認を行った。各菌株をトリブトソーャ ブイヨン(日水製薬社製)で 35°C18時間培養し、方法 1として、実施例 3記載の DNA 抽出のうち、溶菌酵素にァクロモぺプチダーゼとリゾチームを用、た抽出法を行!、、 実施例 5記載の PCR反応のうち、配列番号 1一 6の組み合わせを用いた方法を行つ た。また、方法 2として、実施例 3記載の DNA抽出のうち、溶菌酵素にヱンテロリシン とリゾチームを用いた抽出法を行い、実施例 5記載の PCR反応のうち、配列番号 5— 10の組み合わせを用いた方法を行った。 PCR反応の結果を 2. 5%ァガロースゲル 電気泳動で確認したところ、病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリアモノサ イトゲネスでは電気泳動像の所定の位置にバンドが検出し、陽性であることが示され た。一方、病原性大腸菌 0157以外の Escherichia coli、リステリアモノサイトゲネス以 外のリステリア属では、バンドが検出せず、陰性菌であることが示され、特異性に問題 がないことを確認した。結果を表 2に示した。

[表 2]


実施例 7

[0035] (肉成分混在系での検出限界の確認)

実施例 1記載の病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネス を用いた。各菌を前記 No. 17培地 10mlに接種し、 35°Cで 18時間培養を行い、菌 株培養液を得た。また、鶏もも挽肉 25gに No. 17培地 225mlをカ卩え、 30秒間ストマ ッカーで粉砕し、 35°Cで 18時間培養した。この時の培養液の一般生菌数は 3. 1 X 1 08CFUZmlであった。鶏もも挽肉の培養液を 9mlずつ分注し、これに各菌株培養液 の 10倍段階希釈液 lmlをそれぞれ添加し、各菌株培養液の各希釈系列の肉試料 液を作製した。それぞれの試料液を 5 mのフィルターを通し大きな食品くずを取り 除いた後、方法 1として、実施例 3記載の DNA抽出のうち、溶菌酵素にァクロモぺプ チダーゼとリゾチームを用いた抽出法を行い、実施例 5記載の PCR反応のうち、配列 番号 1一 6の組み合わせを用いた方法を行った。また、方法 2として、実施例 3記載の DNA抽出のうち、溶菌酵素にェンテロリシンとリゾチームを用いた抽出法を行い、実 施例 5記載の PCR反応のうち、配列番号 5— 10の組み合わせを用いた方法を行つ た。それぞれ 2. 5%ァガロースゲル電気泳動により確認した結果、肉試料液での病 原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスの検出限界は、いず れも 103CFUZmlであることを確認した。代表して方法 1の結果の電気泳動図を図 2 に示した。

実施例 8

[0036] (接種した食品からの病原菌の検出)

実施例 1記載の病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネス を用いた。豚挽肉に各菌株が 102CFU/25g、 10CFUZ25g、 lCFU/25g、 10—
接種した豚挽肉 25gに No. 17培地を 22 5mlカ卩え、ストマッカ一で 30秒粉砕し、 35°Cで 24時間培養した。各培養液を 5 μ m のフィルターを通すことで大きな食品くずを取り除いた後、方法 1として、実施例 3記 載の DNA抽出のうち、溶菌酵素にァクロモぺプチダーゼとリゾチームを用いた抽出 法を行い、実施例 5記載の PCR反応のうち、配列番号 1一 6の組み合わせを用いた 方法を行った。また、方法 2として、実施例 3記載の DNA抽出のうち、溶菌酵素にェ ンテロリシンとリゾチームを用いた抽出法を行い、実施例 5記載の PCR反応のうち、 配列番号 5— 10の組み合わせを用いた方法を行った。それぞれ、 2. 5%ァガロース ゲル電気泳動により確認した。代表して方法 1の結果を図 3に示す。その結果、いず れの菌株も lCFUZ25g存在すればいずれの方法でも検出できることを確認した。 病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスなどの危害の高い 病原菌は、食品中で「陰性」(25g中に含まれていないこと)であることが定められてお り、その検出には、公定法と同等以上の精度が求められる。本多重検出法は、公定 法と同等以上の精度があることが確認された。

実施例 9

[0037] (公定法と多重検出法との比較試験;市販食品からの病原菌の検出)

鶏肉や鶏肝など、 20検体をスーパーから購入し、病原性大腸菌 0157、サルモネ ラ属菌、リステリアモノサイトゲネスの検査を多重検出法により行うとともに公定法と比 較した。また、公定法は、次の通りに行った。

[0038] 病原性大腸菌 0157については、検体 25gにノボピオシン加 mECブロス(極東製 薬工業社製) 225mlを加え、ストマッカ一で 30秒粉砕した後、 42°Cで 18時間培養し 、クロモアガー 0157培地(関東ィ匕学社製)およびマッコンキーソルビトール寒天培地 (日水製薬社製)に画線し、 35°Cで 18— 24時間培養した。クロモアガー 0157培地 で藤色、マッコンキーソルビトール培地で半透明のピンク色を示したものを病原性大 腸菌 0157擬陽性とし、 CLIG寒天培地 (極東製薬工業社製)に画線し、 35°Cで 18 一 24時間培養した。下層が黄色ぐ上層がピンクでかつ紫外放射により発光しないも のを病原性大腸菌 0157擬陽性とし、インドール反応を行い、陽性 (赤)のものにつ いて凝集反応を行った。凝集反応は大腸菌 0157検出キット「UNI」(Oxoid社製)を 用いて行った。凝集反応で疑わしいコロニーをクロモアガー 0157培地、マッコンキ 一ソルビトール寒天培地、 TSI寒天培地(日水製薬社製)、 LIM培地(日水製薬社製 )に画線し、 35°Cで 24時間培養した。クロモアガー 0157培地で藤色、マッコンキー ソルビトール寒天培地で半透明のピンク色、 TSI寒天培地で黄色、 LIM培地で無変 化のものについて PCR反応により病原性大腸菌 0157であることを確認した。

[0039] サルモネラ属菌については、検体 25gに EEMブイヨン(日水製薬社製) 225mlを 加え、ストマッカ一で 30秒粉砕した。 35°Cで 18時間培養し、セレナイトシスチン基礎 培地(日水製薬社製) 10mlに lmlカ卩え、 43°Cで 15— 18時間培養した。全体あるい は沈殿が赤色を呈したものにっ、て、 1白金耳を MLCB寒天培地(日水製薬社製) に画線し、 35°Cで 24時間培養後、黒色のコロニーを生じたものをサルモネラ属菌擬 陽性とし、確認試験として、 TSI寒天培地、 LIM培地に画線した。 35°C、 24— 48時 間培養し、 TSI培地で斜面が赤く高層が黒色で、 LIM培地で無変化のものをサルモ ネラ属菌陽性とした。

[0040] リステリアモノサイトゲネスについては、検体 25gに UVMリステリア選択増菌ブイョ ン(Merck社製) 225mlを加え、ストマッカ一で 30秒粉砕した。 30°Cで 48時間培養し 、 PALCAMリステリア選択寒天培地 (Merck社製)に 1白金耳画線した。 35°Cで 48 時間培養し、リステリア属陽性と判定されたものについて、馬血液寒天培地(日水製 薬社製)、標準寒天培地(日水製薬社製)に画線して、 35°C、 24— 48時間培養した 。溶血性が陽性のものについてォキシダーゼ反応、カタラーゼ反応、グラム染色、顕 微鏡観察、アビリステリア(日本ピオメリュー社製)を行い、リステリアモノサイトゲネスと 同定されたものをリステリアモノサイトゲネス陽性とした。

[0041] 多重検出法については次のように行った。検体 25gに、 No. 17培地を 225ml加え 、ストマッカ一で 30秒粉砕し、 35°Cで 24時間培養した。培養液を 5 μ mのフィルター を通すことで大きな食品くずを取り除いた後、方法 1として、実施例 3記載の DNA抽 出のうち、溶菌酵素にァクロモぺプチダーゼとリゾチームを用いた抽出法を行い、実 施例 5記載の PCR反応のうち、配列番号 1一 6の組み合わせを用いた方法を行った 。また、方法 2として、実施例 3記載の DNA抽出のうち、溶菌酵素にェンテロリシンと リゾチームを用いた抽出法を行い、実施例 5記載の PCR反応のうち、配列番号 5— 1 0の組み合わせを用いた方法を行った。それぞれ、 2. 5%ァガロースゲル電気泳動 により確認した。結果を表 3に示す。

[0042] その結果、病原菌が検出した検体は、公定法では病原性大腸菌 0157 0検体、 サルモネラ属菌 3検体、リステリアモノサイトゲネス 6検体、多重検出法ではいずれ の方法でも病原性大腸菌 Ol 57 0検体、サルモネラ属菌 3検体、リステリアモノサ イトゲネス 8検体であり、公定法で陽性であった検体はいずれも多重検出法で陽性 であった。また、公定法で陰性、多重検出法で陽性であったリステリアモノサイトゲネ ス 2検体(表 3、検体 No.5、 15)【こつ!/ヽて、 No.17での培養液を PALC AMリステリ ァ選択寒天培地 (Merck)に画線培養後、形成したコロニーの同定試験を行ったとこ ろ、リステリアモノサイトゲネスであることを確認した。このことから、本多重検出法では 公定法に比べて同等以上の精度があることを確認した。

[0043] [表 3]


図面の簡単な説明

[0044] [図 1]トリプトソーャブイヨン(TSB)および Buffered Peptone Water (BPW)培地を用い た 35°C培養での病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネス および一般生菌数の挙動を示す図である。

[図 2]病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスの各菌株を 接種した肉試料液中(一般生菌数: 3.1 X 108CFU/ml)での各菌株の多重検出 法による検出限界を示す電気泳動像の図である。

[0045] M:分子量マーカー

レーン 1一 7は、病原性大腸菌 0157接種区 (一般生菌数 :3. lX108CFU/ml) を示し、 0157接種量は次の通り。

1:1. lX107CFU/ml、 2:1.1 X 106CFU/ml、 3: 1.1 X 105CFU/ml、 4: 1. 1 X 104CFU/ml、 5:1. IX 103CFU/ml、 6:1. IX 102CFU/ml、 7: 11CFU

/ml

レーン 8— 14は、サルモネラ属菌接種区(一般生菌数: 3. lX108CFUZml)を示 し、サルモネラ接種量は次の通り。

8:5.0X106CFU/ml、 9:5.0X105CFU/ml、 10:5.0X104CFU/ml、 11: 5.0X103CFU/ml、 12:5.0X102CFU/mU 13:50CFU/mU 14:5CFU/ ml

レーン 15— 21は、リステリアモノサイトゲネス接種区(一般生菌数: 3.1 X 108CFU Zml)を示し、リステリア接種量は次の通り。

15:1. lX107CFU/ml、 16:1. lX106CFU/ml、 17:1. lX105CFU/ml、 1 8:1. lX104CFU/ml、 19:1. lX103CFU/ml、 20:1. 1 X 102CFU/ml、 21 :HCFU/ml

圆 3]病原性大腸菌 0157、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスの各菌株を 接種した豚挽肉を用い、多重検出法により各菌株を検出した結果を示す電気泳動像 の図である。

M:分子量マーカー

レーン 1一 4は、リステリアモノサイトゲネス接種区を示し、リステリア接種量は次の通 り。

l:16CFU/25g, 2:1.6CFU/25g, 3:0.16CFU/25g, 4:0.02CFU/25 g

レーン 5— 8は、サルモネラ属菌接種区を示し、サルモネラ属菌接種量は次の通り。 5: 110CFU/25g, 6: 1 lCFU/25g, 7:1. lCFU/25g, 8:0. HCFU/25g レーン 9一 12は、病原性大腸菌 0157接種区を示し、 0157接種量は次の通り。 9:850CFU/25g, 10:8.5CFU/25g 、11:8.5CFU/25g 、12:0.85CF U/25g