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1. (WO2005062057) CONJUGUES ET LEUR UTILISATION DANS DES PROCEDES DE DETECTION
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Konjugate und deren Verwendung in Nachweisverfahren

Die Erfindung betrifft Verfahren zum quantitativen oder qualitativen Nachweis eines Analyten in einer Probe und geeignete Reagenzien hierfür.

Zum Nachweis von Analyten werden häufig Bindungsteste eingesetzt, bei denen durch eine spezifische Bindung von nachzuweisenden Analyt an analytspezifische Bindungspartner auf die Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge des Analyten in einer Probe geschlossen werden kann. Immunoassays oder auch Verfahren, bei denen Oligo- oder Polynukleotide hybridisiert werden, sind Beispiele für Bindungsteste.

Die sogenannten „heterogenen Bindungsteste" sind durch einen oder mehrere Trennungsschritte und/oder Waschschritte gekennzeichnet. Die Trennung kann beispielsweise durch Immunfällung, Fällung mit Substanzen wie Polyethylenglykol oder Ammoniumsulfat, Filtration, magnetische Abtrennung, Anbindung an eine Festphase erfolgen. Ein solche „Festphase" besteht aus porösem und/oder nicht porösem, in der Regel wasserunlöslichem Material. Sie kann die unterschiedlichsten Formen aufweisen wie z.B.: Gefäß, Röhrchen, Mikrotitrationsplatte, Kugel, Mikropartikel, Stäbchen, Streifen, Filter- oder Chromatographiepapier, etc. Bei heterogenen Bindungstesten im Sandwichformat ist in der Regel einer der analytspezifischen Bindungspartner an eine Festphase gebunden und dient zur Abtrennung des Bindungskomplexes „Analyt/analytspezifischer Bindungspartner" von der flüssigen Phase, während der andere analytspezifische Bindungspartner zum Nachweis des Bindungskomplexes ein nachweisbares Label (z.B. ein Enzym, ein Fluoreszenz- oder Chemilumineszenzlabel, etc.) trägt. Man unterteilt diese Testverfahren weiter in sogenannte Einschritt-Sandwich-Teste, bei denen die beiden spezifischen Bindungspartner simultan mit der Probe inkubiert werden und in Zweischritt-Sandwich-Teste, bei denen die Probe zunächst mit dem Festphasenreagenz inkubiert wird und nach einem Trenn- und Waschschritt der festphasengebundene Bindungskomplex aus Analyt und analytspezifischer Bindungspartner mit dem Nachweisreagenz inkubiert wird.

Bei „homogenen Bindungstesten" erfolgt keine Trennung zwischen freien und an den „Analyt analytspezifischer Bindungspartner"-Komplex gebundenen Komponenten des signalbildenden Systems. Der Testansatz, welcher die analytspezifischen Bindungspartner, die signalbildenden Komponenten und die Probe enthält, wird nach oder sogar während der Bindungsreaktion ohne einen weiteren Trenn- und/oder Waschschritt gemessen und das entsprechende Messsignal bestimmt. Beispiele für homogene Immunoassays (s.a. Boguslaski & Li (1982) Applied Biochemistry and Biotechnology, 7:401-414) sind viele turbidimetrische oder nephelometrische Methoden, wobei die zum Nachweis verwendeten analytspezifischen Bindungspartner mit Latexpartikel assoziiert sein können; EMIT®-Teste; CEDIA®-Teste; Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassays; Luminescent Oxygen Channeling Immunoassays („LOCI", s. EP-A2-0 515 194; Ullman et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei., 91:5426-5430; Ullman et al. (1996) Clinical Chemistry ,42:1518 - 1526); etc.. Bei einem homogenen Sandwich-Immunoassay, wie z.B. einem nephelometrischen Latextest, werden die Antikörperreagenzien mit der Probe zusammen inkubiert und die Messung des Signals während und/oder nach der Inkubation durchgeführt, ohne dass ein Trenn- oder Waschschritt vor der Messung durchgeführt wird. Mit anderen Worten ausgedrückt: Es folgt keine Trennung des Antikörper-gebundenen Analyten vom freien Analyten oder von Antikörpern, die keinen Analyten gebunden haben.

Homogene und heterogene Bindungsteste können auch in Form eines sogenannten „Sandwichassays" durchgeführt werden. Hierbei wird der Analyt z.B. bei einem heterogenen Bindungstest von einem Festphasen-assoziierten analytspezifischen Bindungspartner und einem analytspezifischen Bindungspartner, der mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziiert ist, gebunden. Bei Sandwichimmunoassays können Antikörper oder Antigene oder Haptene die analytspezischen Bindungspartner bilden.

Eine weitere spezielle Ausführungsform eines heterogenen oder homogenen Bindungstestes ist der „indirekte Immunoassay". Der Analyt ist in diesem Fall ein Antikörper. Einer der analytspezifischen Bindungspartner ist das Antigen oder ein modifiziertes Antigen des nachzuweisenden Antikörpers (= Analyt) und der andere analytspezifische Bindungspartner ist in der Regel ein Immunglobulin-bindendes Protein wie z.B. ein Antikörper, der den nachzuweisenden Antikörper (= Analyt) spezifisch zu binden vermag.

Bei einem homogenen oder heterogenen „kompetitiven Bindungstest" konkurriert Proben-Analyt und Reagenz-Analyt (beispielsweise ein „modifizierter Analyt" wie z.B. ein gelabelter oder markierter Analyt, Analytteilstück oder Analytanalogon), um die Bindung an eine limitierte Anzahl von analytspezifischen Bindungspartnern. Beispiele zur Illustration des Prinzips: (i) Proben-Analyt konkurriert mit Reagenz-Analyt, der mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziiert ist, um die Bindung an Festphasen-assoziierte analytspezifische Bindungspartner oder (ii) Proben-Analyt konkurriert mit Festphasen-assoziiertem Analyt (= Reagenz-Analyt) um die Bindung an analytspezifische Bindungspartner, die mit einer Komponente eines signalbildenden Systems assoziiert sind.

Bei vielen Bindungstesten treten jedoch große Schwierigkeiten bei der Herstellung der Reagenzien auf, da die Bindung der analytspezifischen Bindungspartner an Festphasen oder partikuläre Komponenten eines signalbildenden Systems (z.B. Mikropartikel) häufig bei den so gebundenen analytspezifischen Bindungspartnern Aktivitätsverluste und/oder Änderung der Eigenschaften (z.B. bezüglich Konformation oder Stabilität) verursacht. Dies gilt besonders, wenn es sich bei den gebundenen analytspezifischen Bindungspartnern um Proteine, wie z.B. Antikörper oder Enzyme, handelt.

Man hat daher versucht, dieses Problem durch die Einführung von sogenannten "Universalreagenzien" zu beheben (s. z.B. EP-0 105 714). So kann gemäß EP-0 245 926 der Nachweis eines Analyten dadurch geführt werden, dass als universelles Festphasenreagenz eine Avidin-beschichtete Festphase eingesetzt wird, an die der biotinylierte analytspezifische Bindungspartner gebunden wird. In anderen Verfahren wird ein biotinylierter analytspezifischen Bindungspartner eingesetzt, der z.B. an ein als universelles Nachweisreagenz eingesetzten Streptavidin/Enzym-Komplex zu binden vermag. Bei diesen Testen sind jedoch Trennungsschritte, wie z.B. Waschschritte, ein notwendiger Bestandteil der Testdurchführung.

Bei homogenen Bindungstesten treten in Bezug auf die Verwendung von universellen Reagenzien besondere Schwierigkeiten auf, insbesondere bei solchen, die auf der Verwendung von partikulären Universalreagenzien (z.B. Streptavidin-beschichtete Mikropartikel) beruhen. Wenn der analytspezifische Bindungspartner di- oder polyvalent ist, d.h. zwei und mehr Bindungstellen für das partikuläre Universalreagenz besitzt, (z.B. ein Antikörper, an den zwei und mehr Biotinmoleküle gebunden sind) würde dies zu einer Agglutination der Mikropartikel führen, auch ohne dass ein Analyt in der Probe vorhanden ist. Dies hätte Fehlbestimmungen zur Folge. Gemäß EP-0 356 964, EP-0 349 988 und EP-0 444 561 wird daher als wesentlich für die Durchführbarkeit eines solchen homogenen Testes angesehen, dass der analytspezifische Bindungspartner in Bezug auf das universelle Reagenz monovalent ist, d.h., dass letzterer- nur eine Bindungstelle für das universelle Reagenz (z.B. Streptavidin-Latexpartikel) besitzt. Auch bei homogenen LOCI-Testen (s. EP-0 515 194) wird von den Erfindern darauf hingewiesen, dass die Messsignalbildung abhängig ist von der Ausbildung von Partikelpaaren, die aus je einem Sensitizer- und einem Chemiluminescer-Partikel bestehen (Ullman et al. (1996) Clinical Chemistry, 42:1518 - 1526). Nachteilig ist bei solchen Verfahren, dass die Anzahl der Bindungsstellen auf dem entsprechenden analytspezifischen Bindungspartner genau kontrolliert werden muss.

Einen anderen Lösungssatz verfolgt EP-0 138 297. Hier wird die Zahl der biotinylierten Antikörper, die an Avidin-beschichtete Latexpartikel binden sollen, dadurch kontrolliert, dass freies Biotin hinzugefügt werden muss. Eine solche Maßnahme wirkt sich jedoch negativ sowohl auf die Reagenzstabilität als auch auf die analytische Sensitivität des Testes aus. Ferner wird hier das universelle Reagenz bereits vor dem eigentlichen Testverfahren mit dem entsprechenden analytspezifischen Bindungspartner umgesetzt, d.h. die über Biotin/Avidin-Brücke an die Latexpartikel gebundenen Antikörper stellen das im Test einzusetzende Reagenz dar. Dies hat den Nachteil, dass das universelle Reagenz nicht auf dem Analysegerät je nach durchzuführenden Test mit unterschiedlichen analytspezifischen Bindungspartnem eingesetzt werden kann.

Aufgabe war es daher, eine verbesserte Methode zum Nachweis eines Analyten, insbesondere mittels homogener Testverfahren, zu entwickeln, die die oben beschriebenen Nachteile nicht aufweist. Eine solche Methode läßt sich besonders vorteilhaft in automatisierten Analysegeräten nutzen.

Diese Aufgabe wird gelöst durch die Bereitstellung der in den Ansprüchen beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren und Gegenstände.

Das erfindungsgemäße Verfahren löst diese Aufgabe, in dem es Universalreagenzien (spezifische Bindungspartner X oder Y, der jeweils mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziiert ist) zur Verfügung stellt, die unabhängig von den analytspezifischen Reagenzien (analytspezifische Bindungspartner R1 und R2) auf die speziellen Belange hin eingestellt werden können, und den Nachweis von Analyten mit hoher Empfindlichkeit und Genauigkeit ermöglicht.

Da die analytspezifischen Bindungspartner von den signalerzeugenden Komponenten unabhängig voneinander eingesetzt werden können und da die analytspezifischen Bindungspartner und die signalerzeugenden Komponenten unabhängig voneinander optimal auf die jeweiligen Anforderungen eingestellt werden können, wird durch diese Erfindung auch folgendes generelles Problem von homogenen Bindungstesten gelöst, nämlich die einander entgegengesetzte Anforderungen für eine optimale Differenzierung und eine optimale Empfindlichkeit: Die Konzentration der Reagenzien soll einerseits limitiert sein, damit die Hinter-grundsignale möglichst gering sind und andererseits sollen die Reagenzien hochkonzentriert und hochmarkiert sein, um eine genügende Signaländerung pro Zeiteinheit zu erzielen.

Die analytspezifischen erfindungsgemäßen Bindungspartner R1 und/oder R2 sind dadurch gekennzeichnet, dass diese mehr als eine Bindungsstelle für den jeweiligen, mit Komponenten eines signalbildenden System assoziierten spezifischen Bindungspartner X bzw. Y aufweisen. Bevorzugt werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Universalreagenzien eingesetzt, die Komponenten eines signalbildenden Systems umfassen, welche über sehr kurze Entfernungen miteinander in Wechselwirkung treten können, z.B. in Form eines Energietransfers.

Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass der erfindungsgemäße Einsatz von analytspezifischen Bindungspartnern, die mehr als eine Bindungsstelle für das jeweilige Universalreagenz haben, in homogenen Testverfahren nicht zu Fehlmessungen führt sondern sogar zu einem verbessserten Verhältnis von Hintergrundsignal zu analytspezifischen Messsignal (s. z.B. Tabellen 3 und 4).

Da die Bindungstellen der analytspezifischen Bindungspartner für die jeweiligen Universalreagenzien bevorzugt aus kleinen Molekülen, z. B. Haptene wie Digoxigenin, Biotin, DNP oder FITC, bestehen, die an die analytspezifischen Bindungspartner bevorzugterweise kovalent gebunden wurden, wird die analytspezifische Aktivität bzw. Bindungskapazität von R1 bzw. R2 in der Regel nicht oder kaum beeinträchtigt. Die Bindungsstellen können auch Teil des unveränderten analytspezifischen Bindungspartners sein. So könnte der analytspezifische Bindungspartner z.B. ein menschlicher IgG-Antikörper sein, welcher mehrere Bindungstellen aufweist, die von Anti-Human IgG-Antikörpem einer anderen Spezies spezifisch erkannt werden.

Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist ein homogenes Verfahren zum quantitativen oder qualitativen Nachweis eines Analyten in einer. Probe, wobei der analytspezifische Bindungspartner R1 spezifische Bindungsstellen für den spezifische Bindungspartner X aufweist, der mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziiert ist, und der analytspezifische Bindungspartner R2 spezifische Bindungsstellen für den spezifischen Bindungspartner Y aufweist, der mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziiert ist, dadurch gekennzeichnet, dass R1 und/oder R2 mehr als eine Bindungsstelle für den jeweiligen, mit Komponenten eines signalbildenden System assoziierten spezifischen Bindungspartner aufweist. Ein besonderer Vorteil der Erfindung ist, dass die spezifischen Bindungspartner X und/oder Y (z.B. Avidin, Streptavidin, etc.) nicht wie in EP-0 138 297 beschrieben durch die Zugabe von freien „spezifischen Bindungsstellen" (z.B. Biotin) abgesättigt werden müssen.

Besonders bevorzugt handelt es sich bei diesem erfindungsgemäßen Verfahren um einen homogenen Bindungstest, insbesondere um einen homogenen Immunoassay. Dieser homogene Bindungstest kann wie bereits weiter oben erläutert u.a. in Form eines Sandwichassays, eines indirekten Immunoassays oder eines kompetitiven Bindungstestes durchgeführt werden.

Im folgenden werden einige Begriffe, die zur Beschreibung der Erfindung herangezogen wurden, näher erläutert:

Bei einem "quantitativen Nachweis" wird die Menge, Konzentration oder Aktivität des Analyten in der Probe gemessen. Von dem Begriff des „quantitativen Nachweises" sind auch semiquantitative Methoden umfaßt, die nur die ungefähre Menge, Konzentration oder Aktivität des Analyten in der Probe erfassen oder nur zu einer relativen Mengen-, Konzentrations- oder Aktivitätsangabe dienen können. Unter einem "qualitativen Nachweis" ist der Nachweis des Vorhandenseins oder Fehlens des Analyten oder dessen Aktivität in der Probe überhaupt oder das Anzeigen, dass die Menge, Konzentration oder Aktivität des Analyten in der Probe unterhalb oder oberhalb eines bestimmten oder mehrerer bestimmter Schwellenwerte liegt, zu verstehen.

Unter dem Begriff „Analyt" ist die im erfindungsgemäßen Verfahren nachzuweisende Substanz zu verstehen. Beispiele für einen Analyten sind in EP-A2-0 515 194 auf den Seiten 8-15 aufgeführt. Der Analyt kann ein Mitglied ' eines spezifischen Bindungspaars sein. Der Analyt mag eine Bindungsstelle (monovalent, üblicherweise ein Hapten) oder mehrere Bindungsstellen (polyvalent) aufweisen. Bei immunchemischen Testen wird eine solche Bindungsstelle häufig auch als Epitop bezeichnet. Ferner kann der Analyt eine einzelne Substanz sein oder eine Gruppe von Substanzen, die wenigstens eine einzige gemeinsame Bindungsstelle aufweisen.

Ein monovalenter Analyt hat üblicherweise ein Molekulargewicht von etwa 100 bis 2000, insbesondere von 125 bis 1000. Viele Oligopeptide, Oligonukleotide, Oligosaccharide, Arzneimittel, Drogen, Metaobolite, Pestizide etc. werden vom Begriff eines monovalenten Analyten umfaßt. Ein poylvalenter Analyt hat üblicherweise ein Molekulargewicht von über 2000, meistens über 10 000. Beispiele für polyvalente Analyte sind Polypeptide, Polysaccharide, Nukleinsäuren, Zellen, Zellbestandteile inklusive Chromosomen, Gene, Mitochondrien und andere Zellorganelle, Zellmembranen, etc. Häufig sind Proteine die nachzuweisenden Substanzen. Solche Proteine mögen Mitglieder einer Proteinfamilie sein, deren Mitglieder durch ähnliche strukturelle Merkmale und/oder durch eine ähnliche biologische Funktion gekennzeichnet sind. Beispiele für analytisch interessante Proteinfamilien sind Proteine von Krankheitserregern, Immunoglobuline, Cytokine, Enzyme, Hormone, Tumormarker, Stoffwechselmarker, gewebespezifische Antigene, Histone, Albumine, Globuline, Skieroproteine, Phosphoproteine, Mucine, Chromoproteine, Lipoproteine, Nukleoproteine, Glykoproteine, Proteoglykane, Rezeptoren, HLA, Gerinnungsfaktoren, Herzinfarktmarker (z.B. Myoglobin, Troponin, pro-BNP, etc.), etc. Andere analytisch interessante Substanzen sind beispielsweise einzel- oder doppelsträngige Oligo- und Polynukleotide

Unter einer „Probe" ist im Sinne der Erfindung das Material zu verstehen, das die nachzuweisende Substanz („Analyt") vermutlich enthält. Der Begriff Probe umfaßt beispielsweise biologische Flüssigkeiten oder Gewebe insbesondere von Menschen und Tieren wie Blut, Plasma, Serum, Sputum, Exudat, bronchoalveoläre Lavage, Lymphflüsigkeit, Synovialflüssigkeit, Samenflüssigkeit, Vaginalschleim, Feces, Urin, Liquor, Haare; Haut, Gewebeproben oder -schnitte. Ferner werden umfaßt Zellkulturproben, pflanzliche Flüssigkeiten oder Gewebe, forensische Proben, Wasser- und Abwasserproben, Nahrungsmittel, Arzneimittel.

Ferner unfasst der Begriff „Probe" auch eine vorbehandelte Probe, die die nachzuweisende Substanz („Analyt") ggf. in einer von Trägerstoffen freigesetzten oder amplifizierten Form vermutlich enthält: Manche Proben müssen vorbehandelt werden, um den Analyten für das Nachweisverfahren zugänglich zu machen oder um störende Probenbestandteile zu entfernen. Solche Vorbehandlung von Proben mag die Abtrennung und/oder Lyse von Zellen beinhalten, das Präzipitieren, die Hydrolyse oder die Denaturierung von Probenbestandteilen wie z.B. Proteinen, die Zentrifugation von Proben, das Behandeln der Probe mit organischen Lösungsmitteln wie z.B. Alkohole, insbesondere Methanol; das Behandeln der Probe mit Detergenzien. Häufig wird die Probe in ein anderes, meistens wässriges, Medium überführt, welches mit dem Nachweisverfahren möglichst nicht interferieren soll. Der Analyt kann auch amplifiziert werden. Eine Amplifizierung von Nukleinsäuren führt beispielsweise zur Generierung von einer oder mehreren Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäurekette. Solche Amplifizierungsmethoden sind dem Fachmann gut bekannt, z.B. „polymerase chain reaction" (PCR), „ligase chain reaction" (LCR), „amplification using Q beta replicase", „nucleic acid sequence based amplification" (NASBA), „Single primer amplification" (ASPP) und andere.

Unter einem „analytspezifischen Bindungspartner" ist entweder ein spezifischer Bindungspartner zu verstehen, der spezifisch an den Analyten zu binden vermag, oder ein spezifischer Bindungspartner (z.B. ein modifizierter Analyt), der an einen anderen analytspezifischen Bindungspartner zu binden vermag. Bei einem "modifizierten Analyt" handelt es sich in der Regel um einen Stoff der zumindest an einen analytspezifischen Bindungspartner zu binden vermag, der sich jedoch von dem Proben-Analyt durch fehlende oder zusätzliche Bindungsstellen unterscheidet, z.B. ein biotinylierter Analyt oder ein Analyt, der mit einer Komponente eines signalbildenden Systems assoziiert ist. Ein modifizierter Analyt wird beispielsweise bei kompetitiven Testen eingesetzt.

Unter einem „spezifischen Bindungspartner" ist ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars zu verstehen. Bei den Mitgliedern eines spezifischen Bindungspaars handelt es sich um zwei Moleküle, die jeweils mindestens eine zu einer Struktur des anderen Moleküls komplementäre Struktur aufweisen, wobei die beiden Moleküle sich über eine Bindung der komplementären Strukturen spezifisch zu binden vermögen. Der Begriff Molekül umfaßt hierbei auch Molekülkomplexe wie z.B. Enzyme, die aus Apo- und Coenzym bestehen, Proteine, die aus mehreren Untereinheiten bestehen, Lipoproteine bestehend aus Protein und Lipiden, etc.. Spezifische Bindungspartner können natürlich vorkommende aber auch z.B. mittels chemischer Synthese, mikrobiologischer Techniken und/oder gentechnologischer Verfahren hergestellte Substanzen sein. So lassen sich mittlerweile mit Hilfe von Phage Display Bibliotheken, über synthetische Peptiddatenbanken oder mittels „Recombinatorial Antibody Libraries" spezifische Bindungspartner selektieren (Larrick & Fry (1991) Human Antibodies and Hybridomas, 2:172-189). Zur Illustration des Begriffs spezifischer Bindungspartner, aber nicht als Einschränkung zu verstehend, sind z.B. zu nennen: Thyroxinbindendes Globulin, steroidbindende Proteine, Antikörper, Antigene, Haptene, Enzyme, Lektine, Nukleinsäuren, Repressoren, Oligo- und Polynukleotide, Protein A, Protein G, Avidin, Streptavidih, Biotin, Komplementkomponente C1q, nukleinsäurebindende Proteine, etc.. Spezifische Bindungspaare sind beispielsweise: Antikörper-Antigen, Antikörper-Hapten, Digoxigen/Anti-Digoxigen-Antikörper, Fluorescin/Anti-Fluorescein-Antikörper,

Operator-Repressor, Nuclease-Nukleotid, Biotin-Avidin, Biotin/Streptavidin, Lektin-Polysaccharid, Steroid-steroidbindendes Protein, Wirkstoff-Wirkstoffrezeptor, Hormon-Hormonrezeptor, Enzym-Substrat, IgG-Protein A, komplementäre Oligo-oder Polynukleotide, etc.. Bei den sogenannten homogenen Gensondentesten sind die spezifischen Bindungspartner in der Regel Nukleinsäureketten, die zumindest teilweise komplementär sind ' zu Abschnitten . der nachzuweisenden Nukleinsäurekette.

Unter dem Begriff „Antikörper" ist im Sinne dieser Erfindung ein Immunglobulin, z.B. ein Immunglobulin der Klasse bzw. Subklasse IgA, IgD, IgE, IgGi, lgG2a, lgG2b, lgG3, lgG4, IgM, zu verstehen. Ein Antikörper weist mindestens eine Bindungsstelle (häufig Paratop genannt) für ein Epitop (häufig auch antigene Determinante genannt) auf einem Antigen oder Hapten auf. Ein solches Epitop ist z.B. durch seine räumliche Struktur und/oder durch das Vorhandensein von polaren und/oder apolaren Gruppen gekennzeichnet. Die Bindungsstelle des Antikörpers ist komplementär zum Epitop. Die Antigen-Antikörper-Reaktion bzw. die Hapten-Antikörper-Reaktion funktioniert nach dem sogenannten „Schlüssel-Schlüsselloch-Prinzip", und ist in der Regel in einem hohen Grad spezifisch, d.h. die Antikörper vermögen kleine Abweichungen in der Primärstruktur, in der Ladung, in der räumlichen Konfiguration und der sterischen Anordnung des Antigens oder Haptens zu unterscheiden. Insbesondere die sogenannten „complementarity determining regions" des Antikörpers tragen zur Bindung des Antikörpers an das Antigen oder Hapten bei.

Der Begriff „Antigene" umfaßt monovalente und polyvalente Antigene. Ein polyvalentes Antigen ist ein Molekül oder ein Molekülkomplex, an das/den mehr als ein Immunglobulin gleichzeitig binden kann, während bei einem monovalenten Antigen jeweils nur ein einziger Antikörper zur selben Zeit binden kann. Als Hapten wird üblicherweise ein Molekül bezeichnet, das nicht für sich allein immunogen ist, - I I - sondern das zu Immunisierungszwecken üblicherweise an einen Träger gebunden wird.

Unter dem Begriff Antikörper sind im Sinne dieser Erfindung nicht nur komplette Antikörper zu verstehen sondern ausdrücklich auch Antikörperfragimente, wie z.B.

Fab, Fv, F(ab')2, Fab'; sowie auch Chimäre, humanisierte, bi- oder oligospezifische, oder „Single chain" Antikörper; des weiteren auch Aggregate, Polymere und

Konjugate von Immunglobulinen und/oder deren Fragmenten, sofern die

Bindungseigenschaften an das Antigen oder Hapten erhalten sind. Antikörperfragmente lassen sich beispielsweise durch enzymatische Spaltung von

Antikörpern mit Enzymen wie Pepsin oder Papain herstellen. Antikörperaggregate, -polymere und -konjugate können durch vielfältige Methoden generiert werden, z.B. durch Hitzebehandlung, Umsetzung mit Substanzen wie Glutaraldehyd, Reaktion mit immunglobulin-bindenden Molekülen, Biotinylierung von Antikörpern und anschließende Reaktion mit Streptavidin oder Avidin, etc..

Bei einem Antikörper im Sinne dieser Erfindung kann es sich um einen monoklonalen oder um einen polyklonalen Antikörper handeln. Der Antikörper kann nach den üblichen Verfahren hergestellt worden sein, z.B. durch Immunisierung des Menschen oder eines Tieres, wie z.B. Maus, Ratte, Meerschweichen, Kaninchen, Kamel, Pferd, Schaf, Ziege, Huhn (s.a. Messerschmid (1996) BlOforum, 11:500-502), und anschließender Gewinnung des Antiserums; oder durch die Etablierung von Hybridomazellen und der anschließenden Reinigung der sekretierten Antikörper; oder durch Klonierung und Expression der Nukleotidsequenzen bzw. modifizierter Versionen davon, die die Aminosäuresequenzen kodieren, die für die Bindung des natürlichen Antikörpers an das Antigen und/oder Hapten verantwortlich sind. Antikörper sind auch herstellbar ggf. unter Zuhilfenahme gentechnologischer Methoden in pflanzlichen - wie z.B. Hefezellen - (Fischer et al. (1999) Biol. Chem., 380:825-839; Hiatt et al. (1992) Genetic Engineering, 14:49-64)), tierischen und prokaryontischen Zellen (s. z.B. WO 95/25172) sowie isolierten menschlichen Zellen.

Bei einem „signalbildenden System" kann es sich um eine oder mehrere Komponenten handeln, wobei es sich wenigstens bei einer Komponente um ein nachweisbares Label handelt. Als Label ist jedes Molekül zu verstehen, das selbst ein Signal produziert oder die Produktion eines Signals induzieren kann wie z.B. eine fluoreszierende Substanz, eine radioaktive Substanz, ein Enzym, oder eine chemilumineszierende Substanz. Das Signal kann beispielsweise anhand der Enzymaktivität, der Lumineszenz, der Lichtabsorption, der Lichtstreuung, der ausgestrahlten elektromagnetischen oder radioaktiven Strahlung, oder einer chemischen Reaktion nachgewiesen oder gemessen werden.

Ein „Label" vermag selbst ein nachweisbares Signal zu erzeugen, so daß keine weiteren Komponenten notwendig sind. Viele organische Moleküle absorbieren ultraviolettes und sichtbares Licht, wobei durch die Lichtabsorption übertragene Energie diese Moleküle in einen angeregten Energiezustand kommen können, und die absorbierte Energie in Form von Licht einer anderen Wellenlänge als der des eingestrahlten Lichts abgeben. Wieder andere Label können direkt ein nachweisbares Signal erzeugen wie z.B. radioaktive Isotope, Farbstoffe oder magnetische und nicht-magnetische Mikropartikel.

Wieder andere Label benötigen zur Signalerzeugung weitere Komponenten, d.h. das signalproduzierende System schließt in einem solchen Fall all die für die Signalbildung benötigten Komponenten mit ein wie z.B. Substrate, Coenzyme, Quencher, Beschleuniger, zusätzliche Enzyme, Substanzen die mit Enzymprodukten reagieren, Katalysatoren, Aktivatoren, Cofaktoren, Inhibitoren, Ionen etc..

Geeignete Label (s.a. EP-A2-0 515 194; US 5,340,716; US 5,545,834; Bailey et al. (1987) J. Pharmaceutical & Biomedical Analysis 5:649-658) sind beispielsweise Enzyme einschließlich Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, Glukose-6- Phosphatdehydrogenase, Alkoholdehydrogenase, Glucoseoxidase, ß-Galactosidase, Luciferase, Urease und Acetylcholinesterase; Farbstoffe; fluoreszierende Substanzen einschließlich Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Ethidiumbromid, 5-Dimethylaminonapthalen-1-sulfonylchlorid und fluoreszierende Chelate von seltenen Erden; chemilumineszierende Substanzen einschließlich Luminol, Isoluminol, Acridiniumverbindungen, Olefin, Enolether, Enamin, Arylvinylether, Dioxen, Arylimidazol, Lucigenin, Luciferin und Aequorin; Sensitizer einschließlich Eosin, 9,10-Dibromoanthracen, Methylen Blau, Porphyrin, Phthalocyanin, Chlorophyll, Rose Bengal; Coenzyme; Enzymsubstrate; radioaktive Isotope einschließlich 125l, 131l, 14C, 3H, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 59Fe, 67Co und 75Se; Partikel einschließlich magnetische Partikel oder Partikel, bevorzugt Latexpartikel, die selbst beispielsweise mit Farbstoffen, Sensitizern, fluoreszierenden Substanzen, chemilumineszierenden Substanzen, Isotopen oder anderen nachweisbaren Labein markiert sein können; Solpartikel einschließlich Gold- oder Silbersolen; Liposomen oder Zellen, die selbst mit nachweisbaren Labein markiert sein können; etc.

Ein signalbildendes System kann auch Komponenten umfassen, die bei räumlicher Nähe miteinander in eine nachweisbare Wechselwirkung treten können, z.B. in Form von Energiespendern und Energieempfängern wie beispielsweise Photosensitizer und chemolumineszierende Substanzen (EP-A2-0 515 194), Photosensitizer und Fluorophore (WO 95/06877), radioaktives lod125 und Fluorophore (Udenfriend et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. 82:8672-8676), Fluorophore und Fluorophore (Mathis (1993) Clin. Chem. 39:1953-1959) oder Fluorophore und Fluoreszenz-Quencher (US 3,996,345).

Unter einer Wechselwirkung zwischen den Komponenten ist die direkte Übertragung von Energie zwischen den Komponenten, z.B. durch Licht- oder Elektronenstrahlung sowie über kurzlebige reaktive chemische Moleküle,- miteingeschlossen. Ferner umfaßt sind hiervon auch Vorgänge, bei denen die Aktivität einer Komponente durch eine oder mehrere andere inhibiert oder verstärkt wird, beispielsweise die Hemmung oder Steigerung der Enzymaktivität oder die Hemmung, Steigerung oder Veränderung (z.B. Wellenlängenverschiebung, Polarisation) der von der beeinflußten Komponente ausgesendeten elektromagnetischen Strahlung. Die Wechselwirkung zwischen den Komponenten umfaßt auch Enzymkaskaden. In diesem Fall sind die Komponenten Enzyme, von denen mindestens eines das Substrat für ein anderes liefert, so daß eine maximale oder minimale Reakionsgeschwindigkeit der gekoppelten Substratumsetzung resultiert.

Eine effektive Wechselwirkung zwischen den Komponenten findet in der Regel statt, wenn diese räumlich benachbart vorliegen, also ' z.B. innerhalb eines Abstandbereiches von wenigen μm, insbesondere innerhalb eines Abstandbereiches von unter 600 nm, bevorzugt unter 400 nm, ganz besonders bevorzugt von unter 200 nm.

Bei einem ganz besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren umfaßt das signalbildende System an Mikropartikel assoziierte Photosensitizer und an Mikropartikel assoziierte chemolumineszierende Substanzen.

Mikropartikel werden häufig als Festphase und/oder als Label genutzt. Unter dem Begriff „Mikropartikel" sind im Sinne dieser Erfindung Teilchen zu verstehen, die einen ungefähren Durchmesser von wenigstens 20 nm und nicht mehr als 20 μm aufweisen, üblicherweise zwischen 40 nm und 10 μm, bevorzugt zwischen 0,1 und 10 μm, besonders bevorzugt zwischen 0,1 und 5 μm, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,15 und 2 μm. Die Mikropartikel können regelmäßig oder unregelmäßig geformt sein. Sie können Kugeln, Spheroide, Kugeln mit mehr oder weniger großen Kavitäten oder Poren darstellen. Die Mikropartikel können aus organischem, aus anorganischem Material oder aus einer Mischung oder Kombination von beiden bestehen. Sie können aus einem porösen oder nicht porösen, einem schwellfähigen oder nicht schwellfähigen Material bestehen. Prinzipiell können die Mikropartikel jegliche Dichte haben, bevorzugt sind jedoch Partikel mit einer Dichte, die der Dichte des Wassers nahekommt wie etwa 0,7 bis etwa 1,5 g/ml. Die bevorzugten Mikropartikel sind in wässrigen Lösungen suspendierbar und möglichst lange suspensionsstabil. Sie mögen durchsichtig, teilweise durchsichtig oder undurchsichtig sein. Die Mikropartikel können aus mehreren Schichten bestehen wie beispielsweise die sogenannten „core-and-shell" Partikel mit einem Kern und einer oder mehreren umhüllenden Schichten. Der Begriff Mikropartikel umfaßt beispielsweise Farbstoffkristalle, Metallsolen, Silica-Partikel, Glaspartikel, Magnetpartikel, Polymerteilchen, Öltropfen, Lipidpartikel, Dextran, und Proteinaggregate. Bevorzugte Mikropartikel sind in wässrigen Lösungen suspendierbare und aus wasserunlöslichem Polymermaterial bestehende Partikel, insbesondere aus substituierten Polyethylenen. Ganz besonders bevorzugt sind Latexpartikel z.B. aus Polystyrol, Acrylsäurepolymeren, Methacrylsäurepolymeren, Acrylnitril-Polymeren, Acrylnitril-Butadien-Styrol, Polyvinylacetat-Acrylat,

Polyvinylpyridin, Vinylchlorid-Acrylat. Von besonderem Interesse sind Latexpartikel mit reaktiven Gruppen an ihrer Oberfläche wie beispielsweise Carboxyl-, Amino- oder Aldehydgruppen, die eine kovalente Bindung z.B. von spezifischen Bindungspartnem an die Latexpartikel erlauben. Die Herstellung von Latexpartikeln ist beispielsweise in EP 0 080 614, EP 0 227 054 und EP 0 246 446 beschrieben.

Der Begriff „assoziiert" ist breit zu verstehen und umfaßt beispielsweise eine kovalente und eine nicht-kovalente Bindung, eine direkte und eine indirekte Bindung, die Adsorption an eine Oberfläche und den Einschluß in eine Vertiefung oder einen Hohlraum, etc.. Bei einer kovalenten Bindung ist beispielsweise der spezifische Bindungspartner über eine chemische Bindung an ein Label gebunden. Üblicherweise spricht man von einer kovalenten Bindung zwischen zwei Molekülen, wenn wenigstens ein Atomkern des einen Moleküls Elektronen mit wenigstens einem Atomkern des zweiten Moleküls teilt. Beispiele für eine nicht-kovalente Bindung sind die Oberflächenadsorption, der Einschluß in Hohlräume oder die Bindung von zwei spezifischen Bindungspartnern. Neben einer direkten Bindung an ein Label können die spezifischen Bindungspartner auch indirekt über spezifische Wechselwirkung mit weiteren spezifischen Bindungspartnern an das Label gebunden sein. Dies soll anhand eines Beispiels näher illustriert werden: Ein biotinylierte Anti-Fluorescein-Antikörper kann über labelgebundenes Avidin an das Label gebunden werden.

Ein Mikropartikel kann einen Überzug aus einer oder mehreren Schichten aufweisen, z.B. aus Proteinen, Kohlehydraten, Biopolymeren, organischen Polymeren oder Mischungen hiervon, um beispielsweise die unspezifische Bindung von Probenbestandteilen an die Partikeloberfläche zu unterdrücken oder zu verhindern, oder um beispielsweise Verbesserungen zu erreichen hinsichtlich der Suspensionsstabilität der Lagerstabilität, der formgebenden Stabilität oder der Resistenz gegen UV-Licht, Mikroben oder sonstige zerstörend wirkender Agenzien. So kann dieser Überzug insbesondere aus Proteinschichten oder Polymerschichten, wie z. B. Cyclodextrine, Dextrane, Hydrogele, Albumin oder Polyalbumine bestehen, die kovalent oder adsorptiv auf die Mikropartikel aufgebracht wurden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können R1 und/oder R2 vorher, während oder nach der Bindungsreaktion mit dem Analyten über X und/oder Y an Komponenten des signalbildenden System gebunden werden. Die Probe kann zunächst mit den analytspezifischen Bindungspartnern R1 und R2 inkubiert werden und dann werden die spezifischen Bindungspartner X und Y hinzugegeben. Es kann jedoch auch eine andere Reihenfolge der Reagenzzugabe erfolgen.

Bei der Durchführung einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen homogenen Bindungstests wird die Probe zuerst mit den analytspezifischen Bindungspartnern R1 und R2 in sequentieller oder simultaner Abfolge gemischt und danach die Komponenten des signalbildenden Systems mit den Bindungspartnern X und Y in sequentieller oder simultaner Abfolge zum Gemisch dazu gegeben.

Die Anzahl der Bindungstellen des erfindungsgemäßen analytspezifischen Bindungspartners R1 für den spezifischen Bindungspartner X sollte mindestens 2, bevorzugt mindestens 5, besonders bevorzugt mindestens 10 und ganz besonders bevorzugt mindestens 15 betragen und die Anzahl der Bindungstellen des erfindungsgemäßen analytspezifischen Bindungspartners R2 für den spezifischen Bindungspartner Y sollte mindestens 2, bevorzugt mindestens 5, besonders bevorzugt mindestens 10 und ganz besonders bevorzugt mindestens 15 betragen.

Bei den erfindungsgemäßen analytspezifischen Bindungspartnern R1 und R2 kann es sieh auch um den gleichen oder um verschiedene analytspezifischen Bindungspartner handeln. So kann z.B. bei einem Sandwich-Immunoassay ein monoklonaler Antikörper sowohl als analytspezifischer Bindungspartner R1 als auch als analytspezifischer Bindungspartner R2 eingesetzt werden, wenn der Analyt mehr als ein Epitop für diesen Antikörper aufweist.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren vermögen im Falle eines Sandwichassays oder eines indirekten Immunoassays die analytspezifischen Bindungspartnern R1 und R2 beide den Analyten spezifisch zu binden. Bei den analytspezifischen Bindungspartnern kann es sich z.B. im Fall eines Sandwich-Immunassays um analytspezifische Antikörper handeln oder, wenn der Analyt selbst ein Antikörper ist, um dessen Antigen oder um ein „modifiziertes Antigen" oder um ein Antigenanalogon. Bei einem kompetitiven Testaufbau sollte es sich bei einem der erfindungsgemäßen analytspezifischen Bindungspartner R1 und R2 um einen modifizierten Analyten handeln.

Bei den . Bindungsstellen des erfindungsgemäßen analytspezifischen Bindungspartners R1 für den spezifische Bindungspartner X handelt es sich bevorzugt um Haptene. Besonders bevorzugt als Bindungsstellen des erfindungsgemäßen analytspezifischen Bindungspartners R1 sind Biotin, Digoxigenin, Fluorescein, einzelsträngige Nukleinsäureketten, Dinitrophenol. Es können aber auch ander Moleküle verwendet werden, die ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars sind.

Bei den Bindungsstellen des erfindungsgemäßen analytspezifischen Bindungspartners R2 für den spezifische Bindungspartner Y handelt es sich bevorzugt um Haptene. Besonders bevorzugt als Bindungsstellen des erfindungsgemäßen analytspezifischen Bindungspartners R2 sind Biotin, Digoxigenin, Fluorescein, einzelsträngige Nukleinsäureketten, Dinitrophenol. Es können aber auch ander Moleküle verwendet werden, die ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars sind.

Bei den erfindungsgemäßen spezifischen Bindungspartnern X und Y kann es sich um den gleichen oder um verschiedene spezifische Bindungspartner handeln. Bei dem erfindungsgemäßen spezifischen Bindungspartner X handelt es sich bevorzugt um Avidin, Streptavidin, Anti-Digoxigenin-Antikörper, Anti-Dinitrophenol-Antikörper, einzelsträngige Nukleinsäurekette oder Anti-Hapten-Antikörper. Es kann sich aber auch um ein Enzym, ein Enzym-Substrat oder um einen Antikörper, der spezifisch bestimmte Polypeptide, Oligopeptide oder Enzyme zu binden vermag, handeln. Bei dem erfindungsgemäßen spezifischen Bindungspartner Y kann es sich auch um Avidin, Streptavidin, Anti-Digoxigenin-Antikörper, Anti-Dinitrophenol-Antikörper, einzelsträngige Nukleinsäurekette oder Anti-Hapten-Antikörper. Es kann sich aber auch um ein Enzym, ein Enzym-Substrat oder um einen Antikörper, der spezifisch bestimmte Polypeptide, Oligopeptide oder Enzyme zu binden vermag, handeln.

Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird infolge der Bindung des Analyten an R1 und/oder R2 Komponenten des signalbildenden Systems in einen Abstand zueinander gebracht werden, der eine Wechselwirkung, insbesondere einen Energietransfer, zwischen diesen Komponenten erlaubt. Das Ausmaß dieser Wechselwirkung wird dann zum quantitativen oder qualitativen Nachweis des Analyten in der Probe gemessen. Das Verfahren ist besonders für Sandwichassays und indirekte Immunoassays geeignet.

Bei einer, anderen besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird infolge der Bindung des Analyten an R1 oder R2 Komponenten des signalbildenden Systems in einen Abstand zueinander gebracht werden, der keine oder nur eine sehr geringe Wechselwirkung, insbesondere keinen oder nur sehr geringen Energietransfer, zwischen diesen Komponenten erlaubt. Das verbleibende Ausmaß dieser Wechselwirkung wird dann zum quantitativen oder qualitativen Nachweis des Analyten in der Probe gemessen. Dieses Verfahren ist besonders für kompetitive Bindungsteste geeignet.

Um die Anzahl der Bindungsstellen der analytspezifischen Bindungspartner für die spezifischen Bindungspartner X oder Y erhöhen zu können, ohne die Spezifität oder

Sensitivität der analytspezifischen Bindungspartner zu verringern, können

Trägermolekuele eingeführt werden, an die sowohl die analytspezifischen

Bindungspartner als auch die Bindungsstellen gebunden werden können. Vorteilhaft ist es daher bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, wenn es sich bei R1 um einen oder mehre analytspezifische Bindungspartner handelt, die mit einem Trägermolekül assoziiert sind, wobei das Trägermolekül Bindungsstellen für den spezifischen

Bindungspartner X aufweisen kann. Ferner ist es von Vorteil, wenn es sich auch bei

R2 um einen oder mehre analytspezifische Bindungspartner handelt, die mit einem

Trägermolekül assoziiert sind, wobei das Trägermolekül Bindungsstellen für den spezifischen Bindungspartner Y aufweisen kann.

Bei einer besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist R1 und/oder R2 jeweils mit einem solchen Trägermolekül assoziiert. Geeignete Trägermolekül sind z.B. Proteine, beispielsweise Antikörper, Enzyme, Albumine wie z.B. Rinderserumalbumin oder Humanserumalbumin, oder Proteinpolymere, Dextrane, Cylclodextrine, Dendrimere oder ähnliche Strukturen. Besonders bevorzugte Proteinpolymere oder -aggregate können aus mit einander assoziierten, bevorzugt kovalent gebundenen, Antikörpern, Albuminmolekülen, Enzymen oder Mischungen derselben bestehen. Ganz besonders bevorzugt sind als Trägermolekül biotinyliertes Dextran und biotinylierte Proteinpolymere (z.B. biotinylierte Antikörperpolymere).

Ein besonders bevorzugtes Trägermolekül läßt sich wie in Beispiel 7 beschrieben herstellen. Hierbei werden murine Antikörper, bevorzugt murine IgG Antikörper, mit Hilfe eines Kopplungsreagenzes kovalent miteinander verbunden. Analog lassen sich auch erfindungsgemäße Trägermoleküle aus Enzymen, Antikörpern (z.B. Antikörper, insbesondere IgG Antikörper, von der Maus oder der Ziege), Albuminen oder Gemischen derselben herstellen. Die Bindungsstellen für den spezifischen Bindungspartner X oder Y,. z.B. Biotin, Digoxigenin, Fluorescein, einzelsträngige Nukleinsäureketten, Dinitrophenol, etc., können mit dem Fachmann- bekannten Methoden an diese Proteinpoymere gebunden werden, wobei eine kovalente Bindung bevorzugt ist.

Ein mit einem Trägermolekül assoziierter, analytspezifischer Biπdungspartner läßt sich beispielsweise wie folgt herstellen: Der analytspezifische Bindungspartner, bevorzugt ein Antikörper, besonders bevorzugt ein Antikörperfragment, wird nach dem Fachmann bekannten Methoden, z.B. mittels Kopplungsreagenzien, an das Trägermolekül gebunden. Diese Bindung sollte möglichst kovalent sein. Als Trägermolekül kommt zum Beispiel biotinyliertes Dextran (s. Beispiel 5) in Frage oder die weiter oben beschriebenen anderen Trägermoleküle, insbesondere solche wie das im Beispiel 7 beschriebenen Antikörperpolymere. Die Bindungsstellen für den spezifischen Bindungspartner X oder Y können wie im Fall des biotinyliertes Dextrans vor oder wie im Beispiel 7 beschrieben nach der Bindungsreaktion zwischen analytspezifischer Bindungspartner und Trägermolekül eingeführt werden. An ein Trägermolekül kann nicht nur einer sondern auch mehrere analytspezifische Bindungspartner gebunden werden. Neben dieser bevorzugten, erfindungsgemäßen Ausführungsform können aber auch mehrere Trägermoleküle an einen analytspezifischer Bindungspartner gebunden werden.

Eine weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist ein Trägermolekül, das mit einem oder mehreren analytspezifischen Bindungspartner assoziiert ist, bevorzugt kovalent verbunden ist. Bei einer Ausführungsform dieses Gegenstandes handelt es sich bei dem Trägermolekül um ein Proteinpolymer, z.B. kovalent miteinander verbundene Antikörper (s. Beispiel 7), Albuminmoleküle, Enzyme oder Mischungen derselben, welches zusätzlich Bindungsstellen, z.B. Biotin, Digoxigenin, Fluorescein, einzelsträngige Nukleinsäureketten, Dinitrophenol, etc., für einen spezifischen Bindungspartner X oder Y aufweisen kann. Die Zahl der Bindungsstellen sollte mindestens 2, besser mehr als 5, bevorzugt mehr als 10, besonders bevorzugt mehr als 15, ganz besonders bevorzugt mehr als 18 pro Trägermolekül, das mit einem oder mehreren analytspezifischen Bindungspartner assoziiert ist, betragen. Bei dem analytspezifischen Bindungspartner handelt es sich bei dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform bevorzugt um einen Antikörper oder um ein Antikörperfragment, ein Antigen, ein Hapten oder eine Nukleinsäurekette.

Erfindungsgemäß ist auch die Verwendung des oben beschriebenen Trägermoleküls, das mit einem oder mehreren analytspezifischen Bindungspartnern assoziiert ist, in einem homogenen oder heterogenen Bindungstest zum quantitativen oder qualitativen Nachweis eines Analyten in einer Probe, insbesondere in einem homogenen oder heterogenen Immunassay.

Analytspezifische Bindungspartner, die mit den erfindungsgemäßen Trägermolekülen assoziiert sind, werden im folgenden auch Konjugat genannt. Diese können natürlich nicht nur in homogenen Bindungstesten sondern auch vorteilhaft bei heterogenen Bindungstesten eingesetzt werden.

Ein erfindungsgemäßes Konjugat besteht aus einem Trägermolekül, das mit einem oder mehreren analytspezifischen Bindungspartnern assoziiert ist, wobei dieses Konjugat zusätzliche Bindungsstellen für einen spezifischen Bindungspartner X oder Y aufweist. Bei einer speziellen Ausführungsform eines Konjugats besteht das Trägermolekül aus Dextran, Cylclodextrin, Dendrimeren oder aus miteinander verbundenen Antikörpern, miteinander verbundenen Albuminmolekülen, miteinander verbundenen Enzymen oder miteinander verbundenen Mischungen derselben. Deren Bindung sollte bevorzugt kovalent sein. Bei den zusätzlichen Bindungsstellen des erfindungsgemäßen Konjugates kann es sich um Biotin, Digoxigenin, Fluorescein, Dinitrophenol oder einzelsträngige Nukleinsäureketten handeln. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Konjugates ist das Trägermolekül kovalent an ein oder mehrere analytspezifische Bindungspartner gebunden. Das erfindungsgemäße Konjugat sollte mindestens 2, bevorzugt mehr als 5, besonders bevorzugt mehr als 10, ganz besonders bevorzugt mehr als 15 und optimal mehr als 18 zusätzliche Bindungsstellen für den spezifischen Bindungspartner X oder Y aufweisen. Ganz besonders bevorzugt ist ein Konjugat, bei dem das Trägermolekül aus kovalent miteinander verbundenen Antikörpern, bevorzugt IgG-Antikörpem von der Maus oder der Ziege, besteht. Ein andere Ausgestaltung der Erfindung ist ein Reagenz, welches ein oder mehrere dieser Konjugate enthält, sowie ein Testkit, welcher ein solches Reagenz enthält.

Die erfindungsgemäßen Konjugate können in einem homogenen oder heterogenen Bindungstests (z.B. einem Immunoassay) zum quantitativen oder qualitativen Nachweis eines Analyten in einer Probe verwendet werden. Bei einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Bindungstests, insbesondere eines homogenen Bindungstestes, wird ein erfindungsgemäßes Konjugat, das spezifische Bindungsstellen für den spezifischen, mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziierten Bindungspartner X aufweist, zum quantitativen oder qualitativen Nachweis eines Analyten in einer Probe verwendet. Bei einer anderen Ausführungsform wird zusätzlich ein weiteres erfindungsgemäßes Konjugat, das spezifische Bindungsstellen für den spezifischen, mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziierten Bindungspartner Y aufweist, zum quantitativen oder qualitativen Nachweis eines Analyten in einer Probe verwendet. Die Anzahl der Bindungstellen für den spezifischen Bindungspartner X bzw. Y sollte mindestens 2, bevorzugt mindestens 5, besonders bevorzugt mindestens 10 und ganz besonders bevorzugt mindestens 15 betragen. Bei X und Y kann es sich um den den gleichen oder um einen verschiedenen spezifischen Bindungspartner handeln. Bevorzugt werden als Bindungspartner X bzw. Y Avidin, Streptavidin, Anti-Digoxigenin-Antikörper, Anti-Dinitrophenol-Antikörper, einzelsträngige Nukleinsäurekette, Anti-Hapten-Antikörper, Enzym, Enzym-Substrat oder Antikörper, der spezifisch bestimmte Polypeptide, Oligopeptide oder Enzyme zu binden vermag, eingesetzt. Ganz besonders bevorzugt im Sinne dieser Erfindung ist ein Bindungstest, bevorzugt ein homogener Bindungstest, unter Verwendung eines oder mehrerer der erfindungsgemäßen Konjugate, wobei infolge der Bindung der analytspezifischen Bindungspartner Komponenten des signalbildenenden Systems in einen Abstand zueinander gebracht werden, der eine Wechselwirkung, insbesondere einen Energietransfer, zwischen diesen Komponenten erlaubt und das Ausmaß dieser Wechselwirkung gemessen wird oder wobei infolge der Bindung der analytspezifischen Bindungspartner Komponenten des signalbildenden Systems in einen Abstand zueinander gebracht werden, der keine oder nur sehr geringe Wechselwirkung, insbesondere keinen oder nur sehr geringen Energietransfer, zwischen diesen Komponenten erlaubt und das verbleibende Ausmaß dieser Wechselwirkung gemessen wird. Als Komponenten des signalbildenden Systems werden bei einem solchen Test bevorzugt Mikropartikel, insbesondere Latexpartikel, eingesetzt. Ganz besonders bevorzugt werden bei einem solchen Testverfahren an Mikropartikel assoziierte Photosensitizer und an Mikropartikel assoziierte chemolumineszierende Substanzen als Komponenten des signalbildenden Systems eingesetzt.

Bei den erfindungsgemäßen Verfahren können Mikropartikel, insbesondere Latexpartikel, als Komponenten des signalbildenden Systems eingesetzt werden. Ganz besonders bevorzugt sind als Komponenten des signalbildenden Systems an Mikropartikel assoziierte Sensitizer, insbesondere Photosensitizer, und an Mikropartikel assoziierte chemolumineszierende Substanzen.

Folglich ist ein Mikropartikel ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung, insbesondere ein Latexpartikel, an den über einen an den Mikropartikel gebundenen spezifischen Bindungspartner X oder Y ein erfindungsgemäßes Konjugat gebunden ist und dessen Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren. Bevorzugt wird hierbei ein Mikropartikel, der als Komponente eines signalbildenden Systems mit Photosensitizern oder mit chemolumineszierende Substanzen assoziiert ist.

Eine besonders bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Test auf Basis des LOCI-Verfahrens, welches im Detail in EP-0 515 194 beschrieben ist. Dieses beruht auf der Verwendung von Photosensitizern und sogenannten Akzeptoren als signalerzeugende Komponenten. Die Photosensitizer generieren bei Belichtung Singulett-Sauerstoff, der mit den Akzeptoren, die chemilumineszierende Komponenten sind, reagiert. Die aktivierte chemilumineszierende Komponente produziert Licht, welches gemessen wird. Anhand eines erfindungsgemäßen Sandwichassays soll dieses bevorzugte Verfahren näher erläutert werden: Der Analyt wird bespielsweise an einen analytspezifischen Bindungspartner R1 , der mit einem Trägermolekül assoziiert sein kann, gebunden, der mittels des spezifischen Bindungspartner X an sogenannte Sensitizer-Partikel gebunden wird. Die mit dem Sensitizer-Partikel assoziierten Sensitizer-Moleküle können im angeregten Zustand Singlet-Sauerstoff erzeugen. Dieser Singlet-Sauerstoff kann mit den Chemilumineszenzverbindungen, die mit sogenannten Chemiluminescer-Partikeln assoziiert sind, reagieren, wobei die gebildete metastabile Verbindung unter Erzeugung eines Lichtblitzes wieder zerfällt. Der analytspezifische Bindungspartner R2, der mit einem Trägermolekül assoziiert sein kann, wird mittels des spezifischen Bindungspartner Y an die Chemiluminescer-Partikel gebunden. Da Singlet-Sauerstoff in wässrigen Lösungen nur kurze Zeit stabil ist, werden die mit analytspezifischen Bindungspartner assoziierten Chemiluminescer-Partikel, die durch die Ausbildung eines Sandwichkomplexes in unmittelbarer Nähe zu den z.B. per Licht angeregten Sensitizer-Partikel gelangt sind, angeregt, Licht abzustrahlen. Durch entsprechende Fluoreszenzfarbstoffe in den Chemiluminescer-Partikeln kann die Wellenlänge des zu messenden abgestrahlten Lichts verändert werden. Bevorzugt wird bei diesem Verfahren die Probe zunächst mit den analytspezifischen Bindungspartnern R1 und R2 inkubiert und dann die spezifischen Bindungspartner X und Y, die mit den Sensitizer- bzw. Chemiluminescer-Partikeln assoziiert sind, hinzugegeben.

Andere Energie-Transfer-Verfahren die ebenfalls bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden könnten, beruhen auf dem Energie-Transfer nach Förster (Mathis, G. (1993) Clin. Chem. 39: 1953 - 1959; US 5,527,684) oder auf der Verwendung von Photosensitizern und Fluorophoren (WO 95/06877) oder auf der Kombination radioaktiver Strahlung und Fluorophoren (S.Udenfriend et al. (1985) Proc. Math. Acad. Sei 82: 8672 - 8676) oder der Verwendung von geeigneten Enzymkaskaden (US 4,663,278).

Bei einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der analytspezifische Bindungspartner R1 mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziiert und der analytspezifische Bindungspartner R2 weist spezifische Bindungsstellen für den spezifischen Bindungspartner Y auf, der mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziiert ist, wobei R2 mehr als eine Bindungsstelle für den jeweiligen, mit Komponenten eines signalbildenden System assoziierten spezifischen Bindungspartner Y aufweist.

Ferner ist ein Reagenz in flüssiger oder lyophilisierter Form ein Gegenstand dieser Erfindung, welches eines oder mehrere der weiter oben beschriebenen erfindungsgemäßen Trägermoleküle, die jeweils mit einem oder mehreren analytspezifischen Bindungspartnern assoziiert sind, enthält oder die erfindungsgemäßen Mikropartikel enthält. Ebenso ist ein Testkit, der ein solches Reagenz enthält, von dieser Erfindung umfasst. Dies gilt ebenso für die Verwendung dieses Reagenzes und/oder des Testkits zur Durchführung eines homogenen oder heterogenen Bindungstests zum quantitativen oder qualitativen Nachweis eines Analyten in einer Probe, bevorzugt zur Durchführung eines der in den Patentansprüchen beschriebenen homogenen Verfahrens.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Testkit zur Durchführung des erfindungsgemäßen homogenen Bindungstestes. Dieser Testkit ist dadurch gekennzeichnet, dass er einen analytspezifischen Bindungspartner R1 enthält, der mehr als eine spezifische Bindungsstelle für den spezifischen Bindungspartner X aufweist, der mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziiert ist, und dass dieser einen analytspezifischen Bindungspartner R2 enthält, der mehr als eine spezifische Bindungsstelle für den spezifischen Bindungspartner Y aufweist, der mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziiert ist.

Der erfindungsgemäße Testkit kann auch zusätzlich die mit Komponenten eines signalbildenden System assoziierten spezifischen Bindungspartner X und/oder Y enthalten. Ferner können die erfindungsgemäßen Testkits auch eine Packungsbeilage, Verdünnungspuffer, Standards, Kontrollen, Systemreagenzien und/oder weitere für die Testdurchführung benötigte Reagenzien und Materialien (z.B. Küvetten, Probenabnahmebestecke) enthalten.

Bevorzugterweise enthalten die erfindungsgemäßen ' Testkits einen analytspezifischen Bindungspartner R1, der aus einem oder mehreren analytspezifischen Bindungspartner besteht, die mit biotinylierten Dextran, biotinylierten Proteinpolymeren, biotinylierten Antikörperpolymeren oder einem anderen Trägermolekül assoziiert sind und/oder einen analytspezifischen Bindungspartner R2, der aus einem oder mehreren analytspezifischen Bindungspartner besteht, die mit biotinylierten Dextran, biotinylierten Proteinpolymeren, biotinylierten Antikörperpolymeren oder einem anderen Trägermolekül assoziiert sind.

Die im folgenden beschriebenen Beispiele dienen zur exemplarischen Beleuchtung einzelner Aspekte dieser Erfindung und sind nicht als Einschränkung zu verstehen.

Beispiele

Beispiel 1 : Herstellung von Sensitizer- bzw. Chemiluminescer-Partikel

Die Herstellung von Sensitizer- und Chemiluminescer-Partikeln ist im Detail in EP 0 515 194, Clin. Chem. (1996) 42:1518-1526 und Proc. Natl. Acad. Sei. (1994) 91:5426-5430 beschriebenen. Die Partikel können z.B. Dextranumhüllungen tragen und zusätzlich gebundes Streptavidin aufweisen (s.a. Proc. Natl. Acad. Sei. (1994) 91 :5426-5430). Exemplarisch ist im folgenden die Herstellung einer Variante von Sensitizer- und Chemiluminescer-Partikeln beschrieben (s.a. EP 0 515 194, Beispiel 8, für weitere Details):

Herstellung von Sensitizer-Partikeln:
Eine Lösung von Chlorophyll-a in Benzylalkohol (1,0 ml; 0,6 mM) wird zu 8,0 ml Benzylalkohol gegeben, der auf 105°C erhitzt worden ist. Eine Suspension von Latex-Beads (175 nm, carboxyl-modifiziertes Latex, Bangs Laboratories, Carmel, IN) in Wasser (10%; 1 ,0 ml) wird zu der Benzylalkohol-Lösung gegeben. Das Gemisch wird für 5 Minuten bei 105°C gerührt und dann auf Raumtemperatur gekühlt. 10 ml Ethanol werden hinzugegeben und das Gemisch zentrifugiert. Das Pellet wird in einem 1 :1 Wasser-Ethanol Gemisch (10 ml) resuspendiert und anschließend wieder zentrifugiert. Das gleiche Verfahren wird mit Wasser wiederholt und anschließend das Pellet in physiologischer Kochsalz-Lösung aufgenommen.

Herstellung der Chemiluminescer-Partikel (= Acceptor-Partikel):
20 ml der carboxyl-modifizierten Latex-Partikel-Suspension (10% Suspension in Wasser) werden mit 20 ml 2-Ethoxyethanol gemischt. Die Mischung wird auf 90°C erhitzt. 20 ml einer Lösung aus 10 mM Dioxen, 20 mM Europiumchelat mit dem Agenz 3-(2-thienoyl)-1 ,1 ,1trifluoroaceton (Kodak, CAS # 14054-87-6) (EuTTA) und 60 mM Trioctylphosphinoxid (TOPO) in 2-Ethoxyethanol werden der Partjkel-Suspension zugegeben. Das Gemisch wird weiter bei 97°C für 7 Minuten erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur werden 40 ml Ethanol zugegeben und das Gemisch zentrifugiert. Das Pellet wird dann in 80% Ethanol resuspendiert und zentrifugiert. Dieser Waschprozess wird mit 10% Ethanol wiederholt. Zum Abschluß werden die Partikel in physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen.

Beispiel 2: Herstellung von Universalreagenzien

Chemiluminescencer-Partikel (=Acceptor-Partikel) mit Streptavidin:
Es wurden 20 mg Aceeptor-Partikel mit 2,0 mg Streptavidin (Fa. Gerbu, High purity, #3058) und 0,2 mg Natriumcyanoborhydrid (Fa. Sigma, S 8628) in einem Kopplungspuffer (0,05 M ß-Morpholino-ethansulfonsäure; Fa. Serva, Art. 29834) zusammengegeben und 24 Stunden bei +37°C inkubiert. Die Kopplungsbedingungen während der Inkubation: 50mg Partikel/ml Kopplung, 0,5 mg Natriumcyanoborhydrid/ml Kopplung, 2 mg Streptavidin/20 mg Partikel.

Nach der Inkubation wurde 65,6 μl einer 0,48 M Carboxymethoxylamin Hemihydrochlorid (Fa. Aldrich, 98%-ig, Cat.Nr. C1 , 340-8) Lösung zugegeben, gemischt und für weitere 2 Stunden bei +37° inkubiert.

Der Überstand wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und die Partikel in Kopplungspuffer (mit 0,6 M NaCI, Fa. Merck), resupendiert. Danach wurde der Überstand nochmals durch Zentrifugieren abgetrennt und die Partikel in Lagerpuffer (0,1 M Tris HCI, 0,3 M NaCI, 25 mM EDTA, 0,1% BSA, 0,1% Dextran T-500, 0,1% Zwittergent 3-14, 0,01 % Gentamycin, 15 ppm ProClin-300, pH 8,0) aufgenommen und resupendiert.

Sensitizer-Partikel mit Streptavidin:
Es wurden Sensitizer-Partikel analog der Kopplung "Chemiluminescencer-Partikel (=Acceptor-Partikel) mit Streptavidin" gekoppelt.

Sensitizer-Partikel mit Anti-Digoxioenin:
Es wurden 15mg Sensitizer-Partikel mit 3 mg Anti-Digoxigenin Antikörper (Mab DIG 2H6, Fa. Dade Behring Inc.) und 0,15 mg Natriumcyanoborhydrid (Fa. Sigma, S 8628) in einem Kopplungspuffer (0,05 M ß-Morpholino-ethansulfonsäure; Fa. Serva, Art. 29834) zusammengegeben und 24 Stunden bei +37°C inkubiert. Die Kopplungsbedingungen während der Inkubation: 32,8 mg Partikel/ml Kopplung, 6,6 mg Antikörper/ml Kopplung, 0,33 mg Natriumcyanoborhydrid/ml Kopplung, 3mg Antikörper/15 mg Partikel.

Nach der Inkubation wurde 49,2 μl einer 0,48 M Carboxymethylamin Hemihydrochlorid Lösung (Fa. Aldrich, 98%-ig, Cat.Nr. C1, 340-8) zugegeben, gemischt und für weitere 2 Stunden bei +37° inkubiert.

Der Überstand wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und die Partikel in Kopplungspuffer (mit 0,6 M NaCI, Fa. Merck), resupendiert. Danach wurde der Überstand nochmals durch Zentrifugieren abgetrennt und die Partikel in Lagerpuffer (0,1 M Tris HCI, 0,3 M NaCI, 25 mM EDTA, 0,1% BSA, 0,1% Dextran T-500, 0,1% Zwittergent 3-14, 0,01 % Gentamycin, 15ppm ProClin-300, pH 8,0) aufgenommen und resupendiert.

Chemiluminescencer-Partikel (=Acceptor-Partikel) mit Anti-Digoxigenin oder Anti-Troponin:
Es wurden Aceeptor-Partikel analog der Kopplung "Sensitizer-Partikel mit Anti-Digoxigenin" mit gegen Digoxigenin bzw. Troponin gerichtete Antikörper gekoppelt.

Universalreagenz A (Aceeptor-Partikel mit Streptavidin) wird in Kombination mit Universalreagenz B (Sensitizer-Partikel mit Anti-Digoxigenin) oder Universalreagenz A (Aceeptor-Partikel mit Anti-Digoxigenin) wird in Kombination mit Universalreagenz B (Sensitizer-Partikel mit Streptavidin) in den folgenden Beispielen eingesetzt.

Beispiel 3: PSA-Assay

Herstellung von PSA spezifischen Reagenzien

Konjugat K1 (Biotinylierter Anti-PSA-Antikörper):
Zu 2,3 mg Anti-PSA-Antikörper (MAK <PSA> 92-284/03, Dade Behring Marburg GmbH, in 0,1 M Natriumcarbonat (Fa. RdH, 31432) wurden 0,23 mg Biotin-LC-NHS (Fa. Pieree, Art. 21336, Immuno Pure), gelöst in DMSO (Fa. RdH, 34943), zugegeben, gemischt und 16 Stunden bei +4°C inkubiert. Molares Einsatzverhältnis [AK] : [Biotin-LC-NHS] = 1:35.

Das Konjugat wurde über eine PD-10 Column Sephadex G-25M ( Fa. Pharmacia Biotech, Code 17-0851-01) mit Phosphatpuffer (0,05 M Natriumdihydrogenphosphat mit 0,15 M Natriumchlorid, pH 7,5) aufgereinigt.

Konjugat K2 (mit Digoxigenin markierter Anti-PSA-Antikörper):
Der Anti-PSA-Antikörper (MAK <PSA> 92-283/029 Dade Behring Marburg GmbH) wurde mit Digoxigenin laut Vorschrift / Gebrauchsanweisung DIG-Antibody Labeling Kit (Fa. Boehringer Mannheim Biochemica, Best. Nr. 1367200, Durchführung: Protein-Markierung mit DIG-NHS LMonoklonale Antikörper) markiert.

Assav-Puffer .
0,1 mol/l Tris plus 0,3 mol/l NaCI plus 25 mmol/l EDTA plus 0,1%' RSA plus 0,1% Dextran T-500 plus 0,1% Zwittergent 3-14 plus 0,01% Gentamycin plus 15 ppm ProClin-300, pH-Wert 8,00.

Durchführung eines PSA-Assav

Zur Testdurchführung wurden die Komponenten wie folgt gemischt und inkubiert:
10 μl Probe
75 μl Assay Puffer
25 μl Konjugat K1 (biotinyiierter Anti-PSA-Antikörper) und Konjugat K2
(digoxigenierter Anti-PSA-Antikörper), je 0,96 μg /ml
371 Sekunden Inkubationszeit bei +37°C
100 μl Assay-Puffer
20 μl Sensitizer-Partikel mit Anti-Digoxigenin (0,2 mg/ml )
20 μl Aceeptor-Partikel mit Streptavidin (0,2mg/ml)
762,5 Sekunden Inkubationszeit bei +37°C
Messung

Die Durchführung und Messung erfolgte an einem modifizierten Sample Processor der Firma Tecan, siehe Ullman et al. (Clinical Chemistry 42:1518-1526. 1996, EP 0515194 A2), die Signale wurden aufgezeichnet.

Ergebnisse
Tabelle 1 : Standardkurve im PSA Assay:


Tabelle 2: Proben, die mit dem erfindungsgemäßen PSA Assay gemessen wurden:

Die obige Tabelle zeigt, daß die im erfindungsgemäßen Verfahren bestimmten Werte mit dem im Vergleichsverfahren (Abbott IMx Total PSA, List-Nr.1 D85), innerhalb üblicher Abweichungen, übereinstimmt. Dies belegt, daß das erfindungsgemäße Verfahren funktioniert.

Beispiel 4: Variation der Anzahl der Biotin-Label pro Antikörper

Gemäß dem im Beispiel 3 beschriebenen Biotinylierungs-Verfahren wurde der anti- PSA Antikörper (MAK<PSA>92-284/03, Dade Behring Marburg GmbH) mit verschieden Mengen an Biofinmolekülen und der anti-PSA Antikörper (MAK<PSA>92-283/029, Dade Behring Marburg GmbH) mit verschiedenen Mengen an Digoxigenin-Molekülen konjugiert. In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse der Antikörperpaare dargestellt.

Tabelle 3: PSA Assay auf Basis von Antikörpern, mit einer unterschiedlichen Anzahl an Bindungsstellen für die spezifischen Bindungspartner X und Y. Messsignal angegeben in „Counts".


Beispiel 5: Herstellung von Dextran-Antikörper-Biotin Konjugaten

Aktivieren von Antikörpern mit N-Succinimidyl S-Acetylthioacetat (SATA)

10,4 mg Anti-PSA Antikörper (MAK<PSA>92-284/03, Dade Behring Marburg GmbH) in 0,1 M Natriumcarbonat Puffer (Fa. Riedel de Haen, 31432) werden in Mischpuffer (LiBO3/20% Dioxan), pH 8,5, umgepuffert und mit 104 μL SATA (Fa. Pieree) in DMF (2 mg/mL) gemischt. Nach einer Inkubation von 1,5 Stunden bei 37 °C wird 45 Minuten mit 200 μL NH2OH inkubiert.

Anschließend wird das Konjugat über eine PD-10 Säule mit Phosphatpuffer 0,1 M pH 6,0 entsalzt.

Herstellen von aktiviertem Biotin-Dextran

3,9 mg (1,95 mL) FlukaBioDex (70000 kDa, Product Nummer 14402, Biotin Substitution 20 mol/mol) werden in Mischpuffer (2 mg/mL) aufgenommen und mit 26 μL GMBS-Lösung (N- maleimidobutyryloxysuccinimide ester, Fa. Pieree) in Dioxan (6 mg/mL) gemischt. Dieses Gemisch wird eine Stunde bei 18 °C inkubiert.
Anschliessend wird das Konjugat über eine PD-10 Säule mit Phosphatpuffer 0,1 M, pH 6,0 entsalzt.

Kopplung des aktivierten Antikörpers mit dem aktivierten Biotin-Dextran

Konjugat 1 :
1 ,7 mL der Antikörper-SATA Lösung (1 mg/mL) werden mit 509 μL der FlukaBioDex-GMBS Lösung (1,32 mg/mL) gemischt. Dieses Gemisch wird 2 Stunden bei 37 °C inkubiert und anschliessend mit 220 μL 0,1 M n-Ethylmaleimid-Lösung abgestoppt. Die Aufreinigung/Entsalzung erfolgt über Sephacryl S300 (Durchmesser 1 ,6 cm, Gelbetthöhe 90 cm, Auftragungsmenge ca. 2 mL) mit 0,1 M TRIS/HCI, 150 mM NaCI pH 7,4. Die das Konjugat enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt und auf 1 ,7 mL ankonzentriert (« 0,65 mg/mL).

Konjugat 2:
1,7 mL der Antikörper-SATA Lösung (1 mg/mL) werden mit 102 μL der FlukaBioDex-GMBS Lösung (1,32 mg/mL) gemischt. Dieses Gemisch wird 2 Stunden bei 37 °C inkubiert und anschliessend mit 180 μL 0,1 M n-Ethylmaleimid-Lösung abgestoppt. Die Aufreinigung/Entsalzung erfolgt über Sephacryl S300 der Fa. Fluka (Durchmesser 1,6 cm, Gelbetthöhe 90 cm, Auftragungsmenge ca. 2 mL) mit 0,1 M TRIS/HCI, 150 mM NaCI pH 7,4. Die das Konjugat enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt und auf 1 ,7 mL ankonzentriert (« 0,64 mg/mL).

Auf Grund der unterschiedlichen Ansätze ergibt sich für Konjugat 1 ein Verhältnis von ca. 18 Biotin-Molekülen pro Antikörper und für Konjugat 2 ein Verhältnis von ca. 3 Biotin-Molekülen pro Antikörper.

Diese Konjugate wurden im weiter oben beschriebenen PSA Assay in Kombination mit den oben beschriebenen digoxigenierten Anti-PSA-Antikörpem mit ansteigenden Antikörper/Dioxigenin Verhältnissen eingesetzt. Die Konzentration der Dextran- Konjugate lag bei 9,75 μg/mL und die digoxigenierten Anti-PSA-Antikörper wurden mit einer Konzentration von 8,8 μg/mL eingesetzt. In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse dargestellt.

Tabelle 4: PSA Assay unter Verwendung von Dextran-Antikörper-Biotin Konjugaten. Messsignal angegeben in „Counts".


Beispiel 6: Rubelia IgM Assay

Herstellung von Rubella IgM spezifischen Reagenzien

Konjugat K1(Biotinylierter Anti-Human IgM-Antikörper):
Die biotinylierung von Anti-Human IgM-Antikörper von der Ziege (PAK <h-lgM> 62FX022, Dade Behring Marburg GmbH) erfolgte analog der Biotinylierung der Anti-PSA-Antikörper (s. Beispiel 3).

Konjugat K2 (mit Digoxigenin markierter Anti-Rubella-Antikörper):
Der Anti-Rubella-Antikörper (MAK <Rubella> 93-9/08, Dade Behring Marburg GmbH) wurde mit Digoxigenin laut Vorschrift / Gebrauchsanweisung DIG-Antibody Labeling Kit (Fa. Boehringer Mannheim Biochemica, Best. Nr. 1367200, Durchführung: Protein-Markierung mit DIG-NHS LMonoklonale Antikörper) markiert.

Assav-Puffer:
0,1 mol/l Tris plus 0,3 mol/l NaCI plus 25 mmol/l EDTA plus 0,1 % RSA plus 0,1% Dextran T-500 plus 0,1% Zwittergent 3-14 plus 0,01% Gentamycin plus 15ppm ProClin-300, pH-Wert 7,3.

Rheuma Faktor (RF) Absorbens:
Rheuma Faktor (RF) Absorbens der Firma Dade Behring Marburg GmbH, Produkt

Nummer OUCG.

Rubella Antigen:
Firma Intergen, CDP (Lot.8320)

Durchführung eines Rubella IgM Assav

Zur Testdurchführung wurden die Komponenten wie folgt gemischt und inkubiert:
10 μl Probe, 1+9 Teile in RF Absorbens verdünnt
40 μl Assay Puffer
25 μl Konjugat K1 (biotinylierter Anti-Human IgM-Antikörper, 8 μg/ml) und Konjugat K2 (digoxigenierter Anti-Rubella-Antikörper, 2 μg/ml) 25 μl Rubella Antigen, 4 μg/ml)
453,5 Sekunden Inkubationszeit bei +37°C
75 μl Assay Puffer
25 μl Aceeptor-Partikel mit Anti-Digoxigenin (0,05 mg/ml )
50μl Sensitizer-Partikel mit Streptavidin (0,4 mg/ml)
432,5 Sekunden Inkubationszeit bei +37°C
Messung

Die Durchführung und Messung erfolgte an einem modifizierten Sample Processor der Firma . Tecan, siehe Ullman et al. (Clinical Chemistry 42:1518-1526. 1996, EP 0515 194 A2), die Signale wurden aufgezeichnet.

Ergebnis eines Rubella IgM Assavs

Tabelle 5: Messung von Proben im Rubella IgM Assay. Messsignal angegeben in „Counts" bzw. in „mE" (Messung der Extinktion).

Wie aus der obigen Tabelle ersichtlich ist, stimmen die mittels des erfindungsgemäßen Verfahren erzielten Ergebnisse mit dem im Vergleichsverfahren (DiaSorin, ETI-RUBEK-M reverse, P2471) gewonnenen, innerhalb üblicher Abweichungen, überein. Dies belegt, dass auch bei einem indirekten Testverfahren das erfindungsgemäßen Verfahren funktioniert.

Beispiel 7: Vergleich eines Biotin-Standard-Konjugates mit einem biotinylierten Trägermolekül-Fab' Konjugat anhand eines Troponin Assays

Herstellung eines biotinylierten Trägermolekül-Fab' Koniuoat.es ("M-lgG-Biotin Anti-Troponin-Konjugat"):

Eine Lösung von murinen IgG-Antikörpem ("M-IgG") (15,0 mL, 2,6 mg/mL M-IgG, 0,26 mmol) in 0,1 M Phosphatpuffer (5 mM EDTA, pH 7.0) wird mit einer wässerigen Sulfosuccinimidyl(4-iodoacetyl)aminobenzoat Lösung (0,66 mL, 2,0 mg/mL) gemischt. Nach einer Reaktionszeit von 1 Stunde bei 25 °C wird das Gemisch mit einer Gelfiltrationssäule (AcA22, Ciphergen, Fremont, CA) ankonzentriert und aufgereinigt. Die Fraktionen mit dem monomeren, aktivierten M-IgG (mit HPLC getested) werden gepoolt.

Eine Lösung (3,0 mL, 10 mg/mL) eines F(ab')2 Fragments eines Anti-Troponin Antikörpers in einem 0,1 M Phosphatpuffer (5 mM EDTA, pH 6.0) werden mit 0,091 mL eines Gemisches von Dithiothreitol (15,4 mg/mL) und 2-Mercaptoethanol (15,6 uL/mL) gemischt. Nach einer Reaktionszeit von 1 Stunde bei 37 °C wird das Gemisch mit einer Gelfiltrationssäule (AcA22, Ciphergen, Fremont, CA) ankonzentriert und aufgereinigt. Die Fraktionen mit dem Fab' Antikörperfragment werden gepoolt.

Eine Mischung des aktivierten M-IgG (20,5 mg; 0,14 mmol) und des Fab' Fragments (20,5 mg; 0,41 mmol) werden über eine Amicon Ultrafiltratipnszelle in einen Phosphatpuffer pH 7,0 umgepuffert (5 mM EDTA). Die Mischung wird auf 5.0 mg/mL Protein ankonzentriert und für 24 - 70 Stunden bei 2 - 8 °C inkubiert. Danach wird eine wässrige Lösung von N-Ethylmaleimid (20 mg/mL; 50 μL per mL Proteinlösung) hinzugegeben. Nach einer Stunde Raumtemperatur wird die Lösung mit einer Gelfiltrationssäule (AcA22, Ciphergen, Fremont, CA) in 10 mM Phosphatpuffer (300 mM NaCI, pH 7.0) ankonzentriert und aufgereinigt. Die Proteinfraktionen werden gepoolt.

Das Fab' -M-lgG-Konjugat in dem Phosphatpuffer pH 7.0 (6 mL; 0.8 mg/mL; 16 umol) wird mit einer wässrigen Lösung des NHS-PEO4-Biotin (Pieree Chemical Company, Rockford, ILL; 0,095 mL, 0,5 mg/mL) versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 4 Stunden bei Raumtemperatur wird das Gemisch gegen den pH 7.0 Phosphatpuffer diafiltriert.

Herstellung eines Fab'-Biotin Konjugates ("Standard-Biotin Anti-Troponin-Koniugat")

Eine Lösung des Fab'-Fragmentes des Anti-Troponin Antikörpers (2 mL einer 5 mg/mL Proteinlösung) in 10 mM Phosphatpuffer (300 mM NaCI, pH 7.0) wird mit 0,22 mL einer PEO-iodoacetylbiotin-Lösung (10 mg/mL; 4 mmol in DMF) der Fa. Pieree Chemical Company, Rockford, III. gemischt. Nach einer Reaktionszeit von 4 Stunden bei Raumtemperatur wird das Gemisch gegen den pH 7.0 Phosphatpuffer diafiltriert. Die Proteinkonzentration wurde mit dem BCA Protein Assay der FA. Pieree Chemical Company bestimmt.

Troponin-lmmunoassavs

A) Testdurchführung

Zur Testdurchführung wurden die Komponenten wie folgt gemischt und inkubiert: 20 μl Probe
10 μl Wasser
15 μl Konjugat (Standard-Biotin Anti-Troponin-Konjugat: 12,5 μg /ml oder M- IgG-Biotin Anti-Troponin-Konjugat: 8 μg/mL)
13 μl Aceeptor-Partikel mit Anti-Troponin-Antikörper (210 μg/mL)
435 Sekunden Inkubationszeit bei +37°C
13 μl Sensitizer-Partikel mit Streptavidin (1 ,5 mg/ml )
10 μl Wasser
87 Sekunden Inkubationszeit bei +37°C
169 μl Wasser
Messung

Die Durchführung und Messung erfolgte an einem modifizierten Sample Processor der Firma Tecan, siehe Ullman et al. (Clinical Chemistry 42:1518-1526. 1996, EP 0515194 A2), die Signale wurden aufgezeichnet.

B Ergebnisse

Tabelle 6: Troponin-Immunoassay unter Verwendung von zwei unterschiedlichen Anti-Troponin-Konjugaten. Messsignal angegeben in „Counts".


Das mit biotinylierte Trägermolekül-Fab' Konjugat (= M-lgG-Biotin Anti-Troponin- Konjugat) zeigt eine deutlich steilere Kalibrationskurve, was ein verbesserte Präzion des Testes zur Folge hat.