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1. (WO2002012474) PROCEDE POUR LA SELECTION CONCERNANT DES CELLULES HOTES A SEQUENCES D'ADN ELIMINEES
Dernières données bibliographiques dont dispose le Bureau international   

N° de publication :    WO/2002/012474    N° de la demande internationale :    PCT/DE2001/002511
Date de publication : 14.02.2002 Date de dépôt international : 04.07.2001
Demande présentée en vertu du Chapitre 2 :    31.01.2002    
CIB :
C12N 15/82 (2006.01)
Déposants : MPB COLOGNE GMBH [DE/DE]; Molecular Plant & Protein Biotechnology, Neurather Ring 1, 51063 Köln (DE) (Tous Sauf US).
BÜLOW, Lorenz [DE/DE]; (DE) (US Seulement).
DÜRING, Klaus [DE/DE]; (DE) (US Seulement)
Inventeurs : BÜLOW, Lorenz; (DE).
DÜRING, Klaus; (DE)
Mandataire : HUBER, Bernard; Huber & Schüssler, Truderinger Strasse 246, 81825 München (DE)
Données relatives à la priorité :
100 38 573.7 03.08.2000 DE
Titre (DE) VERFAHREN ZUR SELEKTION AUF WIRTSZELLEN MIT ELIMINIERTEN DNA-SEQUENZEN
(EN) METHOD OF SELECTION IN HOST CELLS WITH ELIMINATED DNA SEQUENCES
(FR) PROCEDE POUR LA SELECTION CONCERNANT DES CELLULES HOTES A SEQUENCES D'ADN ELIMINEES
Abrégé : front page image
(DE)Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Selektion auf Wirtszellen, in denen eine gesteuerte Eliminierung einer gewünschten DNA-Sequenz erfolgt, und zur Abtötung von Wirtszellen, in denen eine gesteuerte Eliminierung einer gewünschten DNA-Sequenz erfolgt, und zur Abtötung von Wirtszellen, in denen dies nicht erfolgt, über die Expression eines toxischen Proteins oder Peptids, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß in Schritt (I) die Wirtszellen mit (a) der später zu eliminierenden, 5' und 3' von Rekombinations-DNA-Sequenzen flankierten DNA-Sequenz, wobei zwischen den Rekombinations-DNA-Sequenzen auch eine unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors stehende, für das toxische Protein oder Peptid kodierende DNA vorliegt, unter Bedingungen transformiert werden, unter denen der induzierbare Promotor reprimiert wird, und die Wirtszellen mit (b) einer diese Rekombinations-DNA-Sequenzen erkennenden Rekombinase kodierenden, unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors stehenden DNA-Sequenz unter Bedingungen transformiert werden, unter denen der induzierbare Promotor reprimiert wird, wobei die induzierbaren Promotoren von (a) und (b) nicht gleich sind oder gleiche Induktoren haben; in Schritt (II) die Eliminierung der gewünschten DNA-Sequenz über die Expression der Rekombinase durch Aktivierung des induzierbaren Promoter (b) erfolgt; und Schritt (III) die Abtötung der Wirtszellen, in denen Schritt (II) nicht oder nicht vollständig erfolgt ist, über die Expression des toxischen Proteins oder Peptids durch Aktivierung des induzierbaren Promotors von (a) erfolgt. In bevorzugter Ausführungsform liegt die Rekombinase als ein Ligandenbindungsdomäne-Rekombinase-Fusionsprotein (Rec-LBD) vor. Ferner ist es bevorzugt, wenn die gewünschte DNA-Sequenz für ein Markergen kodiert oder als Transkriptions- bzw. Translations-stopp-Sequenz wirkt. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorstehenden Sequenzen (a) und (b) enthaltende Vektoren und Wirtszellen, wobei es sich vorzugsweise um transgene Pflangzenzellen bzw. transgene Pflanzen handelt.
(EN)The invention relates to a method for selection in host cells, in which a controlled elimination of a desired DNA sequence occurs and in which the cells in which the above does not occur are sacrificed, by means of the expression of a toxic protein or peptide. The method is characterised in that in step (I), the host cells with (a) the 5' and 3' DNA sequence which is to be subsequently eliminated, flanked by recombinant DNA sequences with a DNA sequence also lying between the recombinant DNA sequences which codes for the toxic protein or peptide and which is controlled by an inducible promoter, are transformed under conditions which lead to the inhibition of the promoter which may be induced and the host cells with (b) a DNA sequence which encodes for a recombinase which recognises the above recombinant DNA sequences and which is under the control of an inducible promoter are transformed under conditions which lead to inhibition of the inducible promoter. The inducible promoters in a) and b) are not the same, or don't have the same inductors. In step (II), elimination of the desired DNA sequence occurs by expression of the recombinase through activation of the inducible promoter (b) and in step (III), the sacrifice of the host cells, in which step (II) has not or not completely taken place, occurs by expression of the toxic protein or peptide through activation of the inducible promoter from (a). In a preferred embodiment the recombinase is a ligand binding domain-recombinase-fusion protein (Rec-LBD). It is further preferred that the desired DNA sequence codes for a marker gene or works as transcription or translation stop sequence. The invention further relates to vectors and host cells containing the sequences (a) and (b), preferably in transgenic plant cells and transgenic plants.
(FR)L'invention concerne un procédé pour la sélection concernant des cellules hôtes dans lesquelles une élimination commandée d'une séquence d'ADN désirée a lieu et pour la destruction de cellules hôtes dans lesquelles cette élimination commandée n'a pas lieu, au moyen de l'expression d'une protéine ou d'un peptide toxique. Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que, à l'étape (I), les cellules hôtes sont transformées à l'aide (a) de la séquence d'ADN à éliminer ultérieurement, flanquée en 5' et 3' de séquences d'ADN de recombinaison un ADN codant pour la protéine ou le peptide toxique et sous le contrôle d'un promoteur inductible étant également présent entre les séquences d'ADN de recombinaison , dans des conditions dans lesquelles le promoteur inductible est réprimé, et les cellules hôtes sont transformées à l'aide (b) d'une séquence d'ADN reconnaissant ces séquences d'ADN de recombinaison, codant pour une recombinase et sous le contrôle d'un promoteur inductible, dans des conditions dans lesquelles le promoteur inductible est réprimé, les promoteurs inductibles de (a) et (b) étant différents ou n'ayant pas les mêmes inducteurs. A l'étape (II) a lieu l'élimination de la séquence d'ADN désirée au moyen de l'expression de la recombinase par activation du promoteur inductible de (b). A l'étape (III) se produit la destruction des cellules hôtes dans lesquelles l'étape (II) n'a pas été exécutée ou a été exécutée de manière incomplète, au moyen de l'expression de la protéine ou du peptide toxique par activation du promoteur inductible de (a). Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la recombinase est une protéine hybride recombinase-domaine de liaison du ligand (Rec-LBD). On préfère également que la séquence d'ADN désirée code pour un gène marqueur ou agisse comme séquence d'arrêt de transcription ou de translation. L'invention concerne également les vecteurs et les cellules hôtes contenant les séquences précédentes (a) et (b) ; il s'agit de préférence de cellules végétales transgéniques ou de plantes transgéniques.
États désignés : AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, BZ, CA, CH, CN, CO, CR, CU, CZ, DK, DM, DZ, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, MZ, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW.
Organisation régionale africaine de la propriété intellectuelle (ARIPO) (GH, GM, KE, LS, MW, MZ, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW)
Office eurasien des brevets (OEAB) (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM)
Office européen des brevets (OEB) (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE, TR)
Organisation africaine de la propriété intellectuelle (OAPI) (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG).
Langue de publication : allemand (DE)
Langue de dépôt : allemand (DE)