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1. WO2001075040 - NOUVEAU POLYPEPTIDE, PTERINE-MOLYBDENE OXYDOREDUCTASE HUMAINE 12, ET POLYNUCLEOTIDE CODANT POUR CE POLYPEPTIDE

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[ ZH ]
一种新的多肽 人蝶呤钼氣化还原酶 12和编码这种多肽的多核苷酸

本发明属于生物技术领域,具体地说,本发明描述了一种新的多肽——人 蝶呤钼氧化还原酶 12,以及编码此多肽的多核苷酸序列。本发明还涉及此多 核苷酸和多肽的制备方法和应用。

#术背景

钼酶在原始细菌到高等植物和动物,包括人类中都有重要作用。

钼酶中的钼原子通过一个小分子与酶蛋白结合,这个小分子可以是一个铁 -钼协同因子 ( i ron-molybdenum cofac tor ) 或蝶呤—钼协同因子(pter in-molybdenum cof actor)。除了一种把氮原子转变成氨的固氮酶(ni trogenase ) 结合铁-钼协同因子外,其余的钼酶都有蝶呤-钼协同因子,这些钼酶由于结构、 生物学功能和酶特性上的相似,可以归成一类,即蝶呤钼氧化还原酶。

钼酶催化氮、硫循环中的一些步骤,而遗传上的钼酶缺乏会导致严重的临 床异常。在动物体内,一种蝶呤钼氧化还原酶,肺亚硫酸盐氧化酶催化含硫化 合物代谢的最后一步,即硫酸盐的形成;而另一种黄嘌呤氧化酶则被怀疑与心 脏病如心肌梗塞有关。

通过基因芯片的分析发现,在胸腺、睾丸、肌肉、脾脏、肺、皮肤、甲状 腺、肝、 PMA+的 Ecv304 细胞株、 PMA -的 Ecv304 细胞株、未饥饿的 L02 细胞 株、砷刺激 1小时的 L02细胞株、砷刺激 6小时的 L02细胞株前列腺、心、肺 癌、胎膀胱、胎小肠、胎大肠、胎胸腺、胎肌、胎肝、胎肾、胎脾、胎脑、胎 肺以及胎心中,本发明的多肽的表达谱与人蝶呤钼氧化还原酶 11 的表达谱非 常近似,因此二者功能也可能类似。本发明被命名为人蝶呤钼氧化还原酶 12。

由于如上所述人蝶呤钼氧化还原酶 12 蛋白在调节细胞分裂和胚胎发育等 机体重要功能中起重要作用,而且相信这些调节过程中涉及大量的蛋白,因而 本领域中一直需要鉴定更多参与这些过程的人蝶呤钼氧化还原酶 12 蛋白,特 别是鉴定这种蛋白的氨基酸序列。新人蝶呤钼氧化还原酶 12 蛋白编码基因的 分离也为研究确定该蛋白在健康和疾病状态下的作用提供了基础。这种蛋白可 能构成开发疾病诊断和 /或治疗药的基础,因此分离其编码 DNA是非常重要的。

发明目的

本发明的一个目的是提供分离的新的多肽一人蝶呤钼氧化还原酶 12 以 及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一个目的是提供编码该多肽的多核苷酸。

本发明的另一个目的是提供含有编码人蝶呤钼氧化还原酶 12 的多核苷酸 的 ί组载体。

本发明的另一个目的是提供含有编码人蝶呤钼氧化还原酶 12 的多核苷酸 的基因工程化宿主细胞。

本发明的另一个目的是提供生产人蝶呤钼氧化还原酶 12的方法。

本发明的另一个目的是提供针对本发明的多肽——人蝶呤钼氧化还原酶 12 的抗体。

本发明的另一个目的是提供了针对本发明多肽——人蝶呤钼氧化还原酶 12 的模拟化合物、拮抗剂、激动剂、抑制剂。

本发明的另一个目的是提供诊断治疗与人蝶呤钼氧化还原酶 12 异常相关 的疾病的方法。

发明概要

本发明涉及一种分离的多肽,该多肽是人源的,它包含:具有 SEQ ID No. 2 氨基酸序列的多肽、或其保守性变体、生物活性片段或衍生物。较佳地,该 多肽是具有 SEQ ID NO: 2氨基酸序列的多肽。

本发明还涉及一种分离的多核苷酸,它包含选自下组的一种核苷酸序列或 其变体:

(a)编码具有 SEQ ID No. 2氨基酸序列的多肽的多核苷酸;

(b)与多核苷酸 (a)互补的多核苷酸;

(c)与(a)或(b)的多核苷酸序列具有至少 70%相同性的多核苷酸。

更佳地,该多核苷酸的序列是选自下组的一种:(a)具有 SEQ ID NO: 1 中 143-469位的序列;和(b)具有 SEQ ID NO: 1中 1-1493位的序列。

本发明另外涉及一种含有本发明多核苷酸的载体,特别是表达载体;一种 用该载体遗传工程化的宿主细胞,包括转化、转导或转染的宿主细胞;一种包 括培养所述宿主细胞和回收表达产物的制备本发明多肽的方法。

本发明还涉及一种能与本发明多肽特异性结合的抗体。

本发明还涉及一种筛选的模拟、激活、拮抗或抑制人蝶呤钼氧化还原酶 12 蛋白活性的化合物的方法,其包括利用本发明的多肽。本发明还涉及用该方法 获得的化合物。

本发明还涉及一种体外检测与人蝶呤钼氧化还原酶 12蛋白异常表达相关的 疾病或疾病易感性的方法,包括检测生物样品中所述多肽或其编码多核苷酸序列 中的突变,或者检测生物样品中本发明多肽的量或生物活性。

本发明也涉及一种药物组合物,它含有本发明多肽或其模拟物、激活剂、拮 抗剂或抑制剂以及药学上可接受的载体。

本发明还涉及本发明的多肽和 /或多核苷酸在制备用于治疗癌症、发育性 疾病或免疫性疾病或其它由于人蝶呤钼氧化还原酶 12 表达异常所引起疾病的 药物的用途。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开,对本领域的技术人员而言是显而 易见的。

下列附图用于说明本发明的具体实施方案,而不用于限定由杈利要求书 所界定的本发明范围。

图 1是本发明人蝶呤钼氧化还原酶 12和人蝶呤钼氧化还原酶 1 1的基因芯片 表达谱比较图。上图是人蝶呤钼氧化还原酶 12的表达谱折方图,下图是人蝶呤 钼氧化还原酶 1 1的表达谱折方图。其中, 1表示胎肾, 2表示胎大肠, 3表示胎 小肠, 4表示胎肌, 5表示胎脑, 6表示胎膀胱, 7表示未饥饿 L02 , 8表示 L02+ , l hr, As 3+, 9表示 ECV304 PMA-, 1 0表示 ECV 304 PMA+ , 1 1表示胎肝, 12表示正常 肝, 1 3表示甲状腺, 14表示皮肤, 15表示胎肺, 16表示肺, 17表示肺癌, 18表 示胎脾, 19表示脾脏, 20表示前列腺, 21表示胎心, 22表示心脏, 2 3表示肌肉, 24表示睾丸, 25表示胎胸腺, 26表示胸腺。

图 2 为分离的人蝶呤钼氧化还原酶 12 的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE ) 。 12kDa为蛋白质的分子量。箭头所指为分离出的蛋白条带。

发明内容

本说明书和权利要求书中使用的下列术语除非特别说明具有如下的含义: "核酸序列" 是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分,也可以 指基因组或合成的 DNA或 RNA , 它们可以是单链或双链的,代表有义链或反义链。 类似地,术语 "氨基酸序列" 是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列及其片段或部

分。当本发明中的 "氨基酸序列" 涉及一种天然存在的蛋白质分子的氨基酸序 列时,这种 "多肽" 或 "蛋白质" 不意味着将氨基酸序列限制为与所述蛋白质 分子相关的完整的天然氨基酸。

蛋白质或多核苷酸 "变体" 是指一种具有一个或多个氨基酸或核苷酸改变 的氨基酸序列或编码它的多核苷酸序列。所述改变可包括氨基酸序列或核苷酸 序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入或替换。变体可具有 "保守性" 改变,其 中替换的氨基酸具有与原氨基酸相类似的结构或化学性质,如用亮氨酸替换异 亮氨酸。变体也可具有非保守性改变,如用色氨酸替换甘氨酸。

"缺失" 是指在氨基酸序列或核苷酸序列中一个或多个氨基酸或核苷酸的 缺失。

"插入" 或 "添加" 是指在氨基酸序列或核苷酸序列中的改变导致与天然存 在的分子相比,一个或多个氨基酸或核苷酸的增加。 "替换" 是指由不同的氨基酸 或核苷酸替换一个或多个氨基酸或核苷酸。

"生物活性" 是指具有天然分子的结构、调控或生物化学功能的蛋白质。类 似地,术语 "免疫学活性" 是指天然的、重组的或合成蛋白质及其片段在合适的 动物或细胞中诱导特定免疫反应以及与特异性抗体结合的能力。

"激动剂" 是指当与人蝶呤钼氧化还原酶 12结合时,一种可引起该蛋白质 改变从而调节该蛋白质活性的分子。激动剂可以包括蛋白质、核酸、碳水化合 物或任何其它可结合人蝶呤钼氧化还原酶 12的分子。

"拮抗剂" 或 "抑制物" 是指当与人蝶呤钼氧化还原酶 12结合时,一种可 封闭或调节人蝶呤钼氧化还原酶 12的生物学活性或免疫学活性的分子。拮抗剂 和抑制物可以包括蛋白质、核酸、碳水化合物或任何其它可结合人蝶呤钼氧化 还原酶 12的分子。

"调节" 是指人蝶呤钼氧化还原酶 12的功能发生改变,包括蛋白质活性的 升高或降低、结合特性的改变及人蝶呤钼氧化还原酶 12的任何其它生物学性 质、功能或免疫性质的改变。

"基本上纯" 是指基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它 物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化人蝶呤钼氧化还原酶 12。 基本上纯的人蝶呤钼氧化还原酶 12在非还原性聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主 带。人蝶呤钼氧化还原酶 12多肽的纯度可用氨基酸序列分析。

"互补的" 或 "互补" 是指在允许的盐浓度和温度条件下通过碱基配对的 多核苷酸天然结合。例如,序列 "C-T-G-A" 可与互补的序列 "G-A-C-T" 结合。 两个单链分子之间的互补可以是部分的或全部的。核酸链之间的互补程度对于 核酸链之间杂交的效率及强度有明显影响。

"同源性" 是指互补的程度,可以是部分同源或完全同源。 "部分同源" 是指一种部分互补的序列,其至少可部分抑制完全互补的序列与靶核酸的杂 交。这种杂交的抑制可通过在严格性程度降低的条件下进行杂交(Southern印 迹或 Nor thern印迹等)来检测。基本上同源的序列或杂交探针可竟争和抑制完 全同源的序列与靶序列在严格性程度降低的条件下的结合。这并不意味严格性 程度降低的条件允许非特异性结合,因为严格性程度降低的条件要求两条序列 相互的结合为特异性或选择性相互作用。

"相同性百分率" 是指在两种或多种氨基酸或核酸序列比较中序列相同或 相似的百分率。 可用电子方法测定相同性百分率, 如通过 MEGALIGN程序 ( Lasergene sof tware package, DNASTAR, Inc. , Mad i son Wi s. ) 。 MEGALIGN 程序可根据不同的方法如 C lus ter法比较两种或多种序列(H i gg ins , D. G. 和 P. M. Sharp (1988) Gene 73: 237-244) 0 Clus ter法通过检査所有配对之间的 距离将各组序列排列成簇。然后将各簇以成对或成组分配。两个氨基酸序列如 序列 A和序列 B之间的相同性百分率通过下式计算:

序列与序列之间匹配的残基个数

序列 ^的残基数 -序列 ^中间隔残基数 -序列 ^中间隔残基数 X

也可以通过 C lus ter法或用本领域周知的方法如 Jotun He in 测定核酸序列 之间的相同性百分率(He in J. , (1990) Me thods in enzymo l ogy 183: 625-645) .

"相似性" 是指氨基酸序列之间排列对比时相应位置氨基酸残基的相同 或保守性取代的程度。用于保守性取代的氨基酸,例如带负电荷的氨基酸可包 括天冬氨酸和谷氨酸;带正电荷的氨基酸可包括赖氨酸和精氨酸;具有不带电 荷的头部基团有相似亲水性的氨基酸可包括亮氨酸、异亮氨酸和纈氨酸;甘氨 酸和丙氨酸;天冬酰胺和谷氨酰胺;丝氨酸和苏氨酸;苯丙氨酸和酪氨酸。

"反义" 是指与特定的 DNA或 RNA序列互补的核苷酸序列。 "反义链" 是指 与 "有义链" 互补的核酸链。

"衍生物" 是指 HFP或编码其核酸的化学修饰物。这种化学修饰物可以是 用烷基、酰基或氨基替换氢原子。核酸衍生物可编码保留天然分子的主要生物 学特性的多肽。

"抗体" 是指完整的抗体分子及其片段,如 Fa、?(^') 2及? , 其能特异 性结合人蝶呤钼氧化还原酶 12的抗原决定簇。

"人源化抗体" 是指非抗原结合区域的氨基酸序列被替换变得与人抗体 更为相似,但仍保留原始结合活性的抗体。

"分离的" 一词指将物质从它原来的环境(例如,若是自然产生的就指其 天然环境)之中移出。比如说,一个自然产生的多核苷酸或多肽存在于活动物 中就是没有被分离出来,但同样的多核苷酸或多肽同一些或全部在自然系统中 与之共存的物质分开就是分离的。这样的多核苷酸可能是某一载体的一部分, 也可能这样的多核苷酸或多肽是某一组合物的一部分。既然载体或组合物不是 它天然环境的成分,它们仍然是分离的。

如本发明所用, "分离的" 是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天 然的物质,原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷 酸和多肽是没有分离纯化的,但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存 在的其他物质中分开,则为分离纯化的。

如本文所用, "分离的人蝶呤钼氧化还原酶 12" 是指人蝶呤钼氧化还原酶 12 基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技 术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化人蝶呤钼氧化还原酶 12。基本上纯的多 肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。人蝶呤钼氧化还原酶 12 多 肽的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明提供了一种新的多肽一人蝶呤钼氧化还原酶 12 , 其基本上是由 SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列组成的。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成 多肽,优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物,或是化学合成的产 物,或使用重组技术从原核或真核宿主 (例如,细菌、酵母、高等植物、昆虫和 哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主,本发明的多肽可以是糖 基化的,或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸 残基。

本发明还包括人蝶呤钼氧化还原酶 12 的片段、衍生物和类似物。如本发 明所用,术语 "片段" 、 "衍生物" 和 "类似物" 是指基本上保持本发明的人 蝶呤钼氧化还原酶 12 相同的生物学功能或活性的多肽。本发明多肽的片段、 衍生物或类似物可以是: ( I ) 这样一种,其中一个或多个氨基酸残基被保守 或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代,并且取代的氨基酸可 以是也可以不是由遗传密码子编码的;或者( Π ) 这样一种,其中一个或多个 氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代包含取代基;或者( Π Ι ) 这样一种, 其中成熟多肽与另一种化合物(比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇) 融合;或者( IV ) 这样一种,其中附加的氨基酸序列融合进成熟多肽而形成的 多肽序列 (如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)。 通过本文的阐述,这样的片段、衍生物和类似物被认为在本领域技术人员的知 识范围之内。

本发明提供了分离的核酸 (多核苷酸),基本由编码具有 SEQ ID NO: 2 氨 基酸序列的多肽的多核苷酸组成。本发明的多核苷酸序列包括 SEQ ID NO: 1 的 核苷酸序列。本发明的多核苷酸是从人胎脑组织的 cDNA 文库中发现的。它包 含的多核苷酸序列全长为 1493个碱基,其开放读框 143-469编码了 108个氨 基酸。根据基因芯片表达谱比较发现,此多肽与人蝶呤钼氧化还原酶 11 有相 似的表达谱,可推断出该人蝶呤钼氧化还原酶 12 具有人蝶呤钼氧化还原酶 11 相似的功能。

本发明的多核苷酸可以是 DNA形式或是 RNA形式。 D 形式包括 cDNA、基 因组 DNA 或人工合成的 D 。 DNA 可以是单链的或是双链的。 DNA 可以是编码 链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与 SEQ ID NO: 1所示的编码区 序列相同或者是简并的变异体。如本发明所用, "简并的变异体" 在本发明中 是指编码具有 SEQ ID NO: 2的蛋白质或多肽,但与 SEQ ID NO: 1所示的编码区 序列有差别的核酸序列。

编码 SEQ ID N0: 2的成熟多肽的多核苷酸包括:只有成熟多肽的编码序列; 成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列;成熟多肽的编码序列(和任选的附 加编码序列)以及非编码序列。

术语 "编码多肽的多核苷酸" 是指包括编码此多肽的多核苷酸和包括附加 编码和 /或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述描述多核苷酸的变异体,其编码与本发明有相同的氨基 酸序列的多肽或多肽的片断、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天 然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异 体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的,等位变异体是一个多核苷酸 的替换形式,它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入,但不会从实质 上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的多核苷酸(两个序列之间具有至 少 50%, 优选具有 70%的相同性)。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所 述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中, "严格条件" 是指:(1)在较低 离子强度和较高温度下的杂交和洗脱,如 0. 2xSSC, 0. 1%SDS, 60 'C ;或(2)杂交 时加用变性剂,如 50% (v/v)甲酰胺, 0. 1%小牛血清 / 0. l%F i co l l , 42 °C等;或 (3)仅在两条序列之间的相同性至少在 95%以上,更好是 97%以上时才发生杂 交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与 SEQ ID NO: 2 所示的成熟多肽有 相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的核酸片段。如本发明所用, "核 酸片段"的长度至少含 10个核苷酸,较好是至少 20-30个核苷酸,更好是至少 50-60个核苷酸,最好是至少 100个核苷酸以上。核酸片段也可用于核酸的扩 增技术(如 PCR)以确定和 /或分离编码人蝶呤钼氧化还原酶 12的多核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供,更佳地被纯化至均质。 本发明的编码人蝶呤钼氧化还原酶 12 的特异的多核苷酸序列能用多种方 法获得。例如,用本领域熟知的杂交技术分离多核苷酸。这些技术包括但不局 限于: 1)用探针与基因组或 cDNA 文库杂交以检出同源的多核苷酸序列,和 2) 表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的多核苷酸片段。

本发明的 DNA片段序列也能用下列方法获得: 1)从基因组 D 分离双链 DNA 序列; 2)化学合成 DNA序列以获得所述多肽的双链 DNA。

上述提到的方法中,分离基因组 DNA 最不常用。 DNA序列的直接化学合成 是经常选用的方法。更经常选用的方法是 cDNA序列的分离。分离感兴趣的 cDNA 的标准方法是从高表达该基因的供体细胞分离 mR 并进行逆转录,形成质粒 或噬菌体 cDNA文库。提取 mRNA的方法已有多种成熟的技术,试剂盒也可从商 业途径获得(Q i agene)。而构建 cDNA 文库也是通常的方法(Sambrook, e t a l . , Molecular C l on ing, A Labora tory Manua l , Co ld Spr ing Harbor Labora tory. New York , 1989)。还可得到商业供应的 cDNA文库,如 Clontech公司的不同 cDNA 文库。当结合使用聚合酶反应技术时,即使极少的表达产物也能克隆。

可用常规方法从这些 cDNA 文库中筛选本发明的基因。这些方法包括(但不 限于):(l) DNA- DNA 或 DNA-RNA 杂交; (2)标志基因功能的出现或丧失; (3)测 定人蝶呤钼氧化还原酶 12 的转录本的水平;(4)通过免疫学技术或测定生物学 活性,来检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单用,也可多种方法联合应用。

在第(1)种方法中,杂交所用的探针是与本发明的多核苷酸的任何一部分 同源,其长度至少 10个核苷酸,较好是至少 30个核苷酸,更好是至少 50个 核苷酸,最好是至少 100 个核苷酸。此外,探针的长度通常在 2000 个核苷酸 之内,较佳的为 1000 个核苷酸之内。此处所用的探针通常是在本发明的基因

序列信息的基础上化学合成的 DNA 序列。本发明的基因本身或者片段当然可以 用作探针。 DM探针的标记可用放射性同位素,荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。

在第(4)种方法中,检测人蝶呤钼氧化还原酶 12基因表达的蛋白产物可用 免疫学技术如 Western印迹法、放射免疫沉淀法、酶联免疫吸附法(ELISA)等。

应用 PCR 技术 扩增 DNA/RNA 的方法(Saiki, et al. Science 1985; 230: 1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得 到全长的 cDNA时,可优选使用 RACE法 (RACE - cDNA末端快速扩增法),用于 PCR 的引物可根据本文所公开的本发明的多核苷酸序列信息适当地选择,并可用常 规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的 DNA/RNA片段。

如上所述得到的本发明的基因,或者各种 DM 片段等的多核苷酸序列可用 常规方法如双脱氧链终止法(Sanger et al. PNAS, 1977, 74: 5463- 5467)测 定。这类多核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的 cDNA 序列,测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的 cDNA 序列,才能拼接成全 长的 cD 序列。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体,以及用本发明的载体或直接 用人蝶呤钼氧化还原酶 12 编码序列经基因工程产生的宿主细胞,以及经重组 技术产生本发明所述多肽的方法。

本发明中,编码人蝶呤钼氧化还原酶 12 的多核苷酸序列可插入到载体中, 以构成含有本发明所述多核苷酸的重组载体。术语 "载体" 指本领域熟知的细 菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆 转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体包括但不限于:在细菌中表达的 基于 T7 启动子的表达载体(Rosenberg, et al. Gene, 1987, 56: 125); 在哺 乳动物细胞中表达的 pMSXND 表达载体(Lee and Nathans, J Bio Chem. 263: 3521, 1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之,只要能 在宿主体内复制和稳定,任何质粒和载体都可以用于构建重组表达载体。表达 载体的一个重要特征是通常含有复制起始点、启动子、标记基因和翻译调控元 件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含编码人蝶呤钼氧化还原酶 12 的 DNA序列和合适的转录 /翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组 DNA 技术、 DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook, et al. Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory. New York, 1989)。 所述的 DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上,以指导 mRNA合成。

这些启动子的代表性例子有:大肠杆菌的 l ac 或 t rp 启动子; λ噬菌体的 PL 启动子;真核启动子包括 CMV 立即早期启动子、 HSV 胸苷激酶启动子、早期和 晚期 SV40启动子、反转录病毒的 LTR s 和其它一些已知的可控制基因在原核细 胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体 结合位点和转录终止子等。在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞 中的转录得到增强。增强子是 DNA表达的顺式作用因子,通常大约有 1 0到 300 个碱基对,作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚 期一侧的 1 00 到 270个碱基对的 SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤 增强子以及腺病毒增强子等。

此外,表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择 转化的宿主细胞的表型性状,如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗 性以及绿色荧光蛋白(GFP) , 或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体 /转录调控元件(如启动 子、增强子等)和选择性标记基因。

本发明中,编码人蝶呤钼氧化还原酶 12 的多核苷酸或含有该多核苷酸的 重组载体可转化或转导入宿主细胞,以构成含有该多核苷酸或重组载体的基因 工程化宿主细胞。术语 "宿主细胞" 指原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核 细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。代表性例子有:大 肠杆菌,链霉菌属;细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌;真菌细胞如酵母;植物细胞; 昆虫细胞如果蝇 S2或 Sf 9 ; 动物细胞如 CH0、 COS或 Bowes黑素瘤细胞等。

用本发明所述的 DNA序列或含有所述 D 序列的重组载体转化宿主细胞可 用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能 吸收 DNA 的感受态细胞可在指数生长期后收获,用 CaC l 2法处理,所用的步骤 在本领域众所周知。可供选择的是用 MgC l 2。如果需要,转化也可用电穿孔的 方法进行。当宿主是真核生物,可选用如下的 DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法, 或者常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

通过常规的重组 D 技术,利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产 重组的人蝶呤钼氧化还原酶 12 (Sc i ence, 1984 ; 224: 1431)。一般来说有以下 步骤:

(1) 用本发明的编码人人蝶呤钼氧化还原酶 12 的多核苷酸 (或变异体), 或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞;

(2) 在合适的培养基中培养宿主细胞;

(3) 从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

在步骤 ( 2 ) 中,根据所用的宿主细胞,培养中所用的培养基可选自各种 常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当 的细胞密度后,用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子,将 细胞再培养一段时间。

在步骤 (.3 ) 中,重组多肽可包被于细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌 到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法 分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法包括 但并不限于:常规的复性处理、蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、 超声波处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高 效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的多肽以及该多肽的拮抗剂、 激动剂和抑制剂可直接用于疾病治 疗,例如,可治疗恶性肿瘤、肾上腺缺乏症、皮肤病、各类炎症、 HIV 感染和 免疫性疾病等。

在人体内,钼酶主要以蝶呤 -钼协同因子形成即蝶呤钼氧化还原酶。

钼酶可催化氮、硫循环中的一些步骤,而遗传上的钼酶缺乏会导致严重的 临床异常。在动物体内,一种蝶呤钼氧化还原酶,肺亚硫酸盐氧化酶催化含硫 化合物代谢的最后一步,即硫酸盐的形成;而另一种黄嘌呤氧化酶催化氮循环 则被怀疑与心脏病如心肌梗塞有关。蝶呤钼氧化还原酶特异的保守序列是形成 其活性 mo t i f 所必需。

由此可见,特异的蝶呤钼氧化还原酶 mo t i f 的表达异常,将致使本发明的 含此 mo t i f 的多肽的功能异常,从而导致氮、硫循环的异常,并产生相关的疾 病如心脏病、肺病、炎症、肿瘤、生长发育障碍等。

由此可见,本发明的人蝶呤钼氧化还原酶 12 的表达异常将产生各种疾病 尤其是心脏病、肺病、炎症、肿瘤、生长发育障碍,这些疾病包括但不限于: 心脏病:心绞痛,心肌梗塞,隐匿型冠心病,心力衰竭和心律失常型冠心 病

肺病:肺弥漫性间质性疾患,变态反应性疾病,肺癌,成人呼吸窘迫综合 症

生长发育障碍性疾病:精神发育迟缓,脑性瘫痪,脑发育障碍,智力障碍, 家族性脑神经核发育不全综合症,斜视,皮肤、脂肪和肌肉发育不良性疾病如 先天性皮肤松弛症、早老症、先天性角化不良,各种代谢缺陷病如各种氨基酸 代谢缺陷症,呆小症,侏儒症,性发育迟缓症

各种组织的肿瘤:胃癌、肝癌、肺癌、食管癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤、 甲状腺肿瘤、子宫肌瘤、成神经细胞瘤、星形细胞瘤、室管膜瘤、胶质细胞瘤、 结肠癌、黑色素瘤、肾上腺癌、膀胱癌、骨癌、骨肉瘤、骨髓瘤、骨髓癌、脑 癌、子宫癌、子宫内膜癌、胆囊癌、胸腺肿瘤、鼻腔及鼻窦肿瘤、鼻咽癌、喉 癌、气管肿瘤、纤维瘤、纤维肉瘤、脂肪瘤、脂肪肉瘤、平滑肌瘤

炎症:变应性反应、支气管哮喘、过敏性肺炎、结节病、风湿样关节炎、 类风湿样关节炎、骨关节炎、胆囊炎、肾小球性肾炎、免疫复合物型肾小球 炎、皮肤肌炎、荨麻疹、血色素沉着症、多肌炎、慢性活动性肝炎、肠应急性 综合症、萎缩性胃炎、系统性红斑狼疮、脑脊髓多发性硬化、格林-巴利综合 症、颅内肉芽肿、胰腺炎、心肌炎、以及感染和外伤引起的炎症

本发明的人蝶呤钼氧化还原酶 12 的表达异常还将产生某些遗传性,血液性 疾病及免疫系统疾病等。

本发明也提供了筛选化合物以鉴定提高(激动剂)或阻遏(拮抗剂)人蝶呤钼 氧化还原酶 12 的药剂的方法。激动剂提高人蝶呤钼氧化还原酶 12刺激细胞增 殖等生物功能,而拮抗剂阻止和治疗与细胞过度增殖有关的紊乱如各种癌症。 例如,能在药物的存在下,将哺乳动物细胞或表达人蝶呤钼氧化还原酶 12 的 膜制剂与标记的人蝶呤钼氧化还原酶 12 —起培养。然后测定药物提高或阻遏 此相互作用的能力。

人蝶呤钼氧化还原酶 12 的拮抗剂包括筛选出的抗体、化合物、受体缺失 物和类似物等。人蝶呤钼氧化还原酶 12的拮抗剂可以与人蝶呤钼氧化还原酶 12 结合并消除其功能,或是抑制该多肽的产生,或是与该多肽的活性位点结合使 该多肽不能发挥生物学功能。

在筛选作为拮抗剂的化合物时,可以将人蝶呤钼氧化还原酶 12 加入生物 分析测定中,通过测定化合物对人蝶呤钼氧化还原酶 12 和其受体之间相互作 用的影响来确定化合物是否是拮抗剂。用上述筛选化合物的同样方法,可以筛 选出起拮抗剂作用的受体缺失物和类似物。能与人蝶呤钼氧化还原酶 12 结合 的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽 库而获得。筛选时,一般应对人蝶呤钼氧化还原酶 12分子进行标记。

本发明提供了用多肽,及其片段、衍生物、类似物或它们的细胞作为抗原 以生产抗体的方法。这些抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。本发明还提供 了针对人蝶呤钼氧化还原酶 12 抗原决定簇的抗体。这些抗体包括(但不限于): 多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、 Fab 片段和 Fab 表达文库产 生的片段。

多克隆抗体的生产可用人蝶呤钼氧化还原酶 12 直接注射免疫动物(如家 兔,小鼠,大鼠等)的方法得到,多种佐剂可用于增强免疫反应,包括但不限 于弗氏佐剂等。制备人蝶呤钼氧化还原酶 12 的单克隆抗体的技术包括但不限 于杂交瘤技术(Kohl er and Mi l s te in. Na ture, 1975, 256: 495-497) , 三瘤技 术,人 Β-细胞杂交瘤技术, EBV-杂交瘤技术等。将人恒定区和非人源的可变区 结合的嵌合抗体可用已有的技术生产(Morr i son et a l , PNAS, 1985, 81: 6851)„ 而已有的生产单链抗体的技术(U. S. Pa t No. 4946778)也可用于生产抗人蝶呤 钼氧化还原酶 12的单链抗体。

抗人蝶呤钼氧化还原酶 12 的抗体可用于免疫组织化学技术中,检测活检 标本中的人蝶呤钼氧化还原酶 12。

与人蝶呤钼氧化还原酶 12 结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记, 注入体内可跟踪其位置和分布。这种放射性标记的抗体可作为一种非创伤性诊 断方法用于肿瘤细胞的定位和判断是否有转移。

抗体还可用于设计针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如人蝶呤钼氧化还 原酶 12 高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素,蓖麻蛋白, 红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如 SPDP , 攻击抗体的氨 基,通过二硫键的交换,将毒素结合于抗体上,这种杂交抗体可用于杀灭人蝶 呤钼氧化还原酶 12阳性的细胞。

本发明中的抗体可用于治疗或预防与人蝶呤钼氧化还原酶 12 相关的疾病。 给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断人蝶呤钼氧化还原酶 12的产生或活性。

本发明还涉及定量和定位检测人蝶呤钼氧化还原酶 12 水平的诊断试验方 法。这些试验是本领域所熟知的,且包括 FISH 测定和放射免疫测定。试验中 所检测的人蝶呤钼氧化还原酶 12 水平,可以用作解释人蝶呤钼氧化还原酶 12 在各种疾病中的重要性和用于诊断人蝶呤钼氧化还原酶 12起作用的疾病。

本发明的多肽还可用作肽谱分析,例如,多肽可用物理的、化学或酶进行 特异性切割,并进行一维或二维或三维的凝胶电泳分析,更好的是进行质谱分 析。

编码人蝶呤钼氧化还原酶 12 的多核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治 疗技术可用于治疗由于人蝶呤钼氧化还原酶 12 的无表达或异常 /无活性表达所 致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体 (如病毒载体)可设计用

于表达变异的人蝶呤钼氧化还原酶 12 , 以抑制内源性的人蝶呤钼氧化还原酶 12 活性。例如,一种变异的人蝶呤钼氧化还原酶 12 可以是缩短的、缺失了信号 传导功能域的人蝶呤钼氧化还原酶 12 , 虽可与下游的底物结合,但缺乏信号传 导活性。因此,重组的基因治疗载体可用于治疗人蝶呤钼氧化还原酶 12 表达或 活性异常所致的疾病。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒 相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将编码人蝶呤钼氧化还原酶 12 的多核苷酸转移至细胞内。构建携带编码人蝶呤钼氧化还原酶 12 的多核苷酸 的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook, et a l. )。另外^重组编码人 蝶呤钼氧化还原酶 12的多核苷酸可包装到脂质体中转移至细胞内。

多核苷酸导入组织或细胞内的方法包括:将多核苷酸直接注入到体内组织 中;或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多核苷酸导入细胞中, 再将细胞移植到体内等。

抑制人蝶呤钼氧化还原酶 12 mRNA的寡核苷酸(包括反义 RNA和 DNA)以及 核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定 RNA 的酶样 RNA分 子,其作用机制是核酶分子与互补的靶 RNA 特异性杂交后进行核酸内切作用。 反义的 RNA和 DNA及核酶可用已有的任何 RNA或 DNA合成技术获得,如固相磷 酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义 R 分子可通过编码 该 RNA的 DNA序列在体外或体内转录获得。这种 DNA序列已整合到载体的 RNA 聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性,可用多种方法对其进行修 饰,如增加两侧的序列长度,核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非 磷酸二酯键。

编码人蝶呤钼氧化还原酶 12 的多核苷酸可用于与人蝶呤钼氧化还原酶 12 的相关疾病的诊断。编码人蝶呤钼氧化还原酶 12 的多核苷酸可用于检测人蝶 呤钼氧化还原酶 12 的表达与否或在疾病状态下人蝶呤钼氧化还原酶 12 的异常 表达。如编码人蝶呤钼氧化还原酶 12 的 DNA 序列可用于对活检标本进行杂交 以判断人蝶呤钼氧化还原酶 I 2 的表达状况。杂交技术包括 Southern 印迹法、 Nor thern 印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术,相关的试 剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定 在微阵列(Mi croarray)或 DNA 芯片(又称为 "基因芯片" )上,用于分析组织中 基因的差异表达分析和基因诊断。用人蝶呤钼氧化还原酶 12 特异的引物进行 RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测人蝶呤钼氧化还原酶 12 的转录 产物。

检测人蝶呤钼氧化还原酶 12 基因的突变也可用于诊断人蝶呤钼氧化还原 酶 12相关的疾病。人蝶呤钼氧化还原酶 12 突变的形式包括与正常野生型人蝶 呤钼氧化还原酶 12 DNA 序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异 常等。可用已有的技术如 Southern 印迹法、 DNA序列分析、 PCR和原位杂交检 测突变。另外,突变有可能影响蛋白的表达,因此用 Nor thern印迹法、 Wes tern 印迹法可间接判断基因有无突变。

本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。该序列会特异性地针对某条 人染色体具体位置并且可以与其杂交。目前,需要鉴定染色体上的各基因的具 体位点。现在,只有很少的基于实际序列数据(重复多态性)的染色体标记物可 用于标记染色体位置。根据本发明,为了将这些序列与疾病相关基因相关联, 其重要的第一步就是将这些 DNA序列定位于染色体上。

简而言之,根据 cD 制备 PCR引物(优选 15- 35bp) , 可以将序列定位于染 色体上。然后,将这些引物用于 PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。 只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。

体细胞杂合细胞的 PCR定位法,是将 DNA定位到具体染色体的快捷方法。 使用本发明的寡核苷酸引物,通过类似方法,可利用一组来自特定染色体的片 段或大量基因组克隆而实现亚定位。可用于染色体定位的其它类似策略包括原 位杂交、用标记的流式分选的染色体预筛选和杂交预选,从而构建染色体特异 的 cDNA库。

将 cDNA克隆与中期染色体进行荧光原位杂交(FISH) , 可以在一个步骤中 精确地进行染色体定位。此技术的综述参见 Verma等, Human Chromosomes: a Manua l of Bas ic Techniques, Pergamon Press , New York (1988)。

一旦序列被定位到准确的染色体位置,此序列在染色体上的物理位置就 可 以与基因图数据相关联。 这些数据可见于 V. Mckus ick, Mende l i an Inher i tance in Man (可通过与 Johns Hopkins Univers i ty Welch Medica l Library联机获得)。然后可通过连锁分析,确定基因与业已定位到染色体区域 上的疾病之间的关系。

接着, 需要测定患病和未患病个体间的 cDNA或基因组序列差异。如果在 一些或所有的患病个体中观察到某突变,而该突变在任何正常个体中未观察 到,则该突变可能是疾病的病因。比较患病和未患病个体,通常涉及首先寻找 染色体中结构的变化,如从染色体水平可见的或用基于 cDNA序列的 PCR可检测 的缺失或易位。根据目前的物理作图和基因定位技术的分辨能力,被精确定位

至与疾病有关的染色体区域的 cDNA, 可以是 50至 500个潜在致病基因间之一种 (假定 1兆碱基作图分辨能力和每 20kb对应于一个基因)。

可以将本发明的多肽、多核苷酸及其模拟物、激动剂、拮抗剂和抑制剂与 合适的药物载体组合后使用。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲 液、甘油以及它们的组合。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响 药物效果的载体和赋形剂。这些组合物可以作为药物用于疾病治疗。

本发明还提供含有一种或多种容器的药盒或试剂盒,容器中装有一种或多 种本发明的药用组合物成分。与这些容器一起,可以有由制造、使用或销售药 品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示,该提示反映出生产、使用 或销售的政府管理机构许可其在人体上施用。此外,本发明的多肽可以与其它 的治疗化合物结合使用。

药物组合物可以以方便的方式给药,如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、 皮下、鼻内或皮内的给药途径。人蝶呤钼氧化还原酶 12 以有效地治疗和 /或预 防具体的适应症的量来给药。施用于患者的人蝶呤钼氧化还原酶 12 的量和剂 量范围将取决于许多因素,如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判 断。

实施例

下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法,通常按照常规条件如 Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York: Cold Spr ing Harbor Laboratory Pres s, 1989)中所述的条件,或按照制造厂 商所建议的条件。

实施例 1 人蝶呤钼氧化还原酶 12的克隆

用异硫氰酸胍 /酚 /氯仿一步法提取人胎脑总 RM。用 Quik mRM I solat ion Ki t ( Qiegene 公司产品)从总 RNA中分离 poly (A) mRM。 2ug poly (A) mRNA经逆转录 形成 cDNA。用 Smart cDNA克隆试剂盒(购自 Clontech )将。0 片段定向插入到 pBSK (+) 载体(Clontech公司产品)的多克隆位点上,转化 DH5 α,细菌形成 cDNA文库。用 Dye terminate cycle react ion sequencing ki t (Perkin-Elmer公司产品) 和 ABI 377 自动测序仪 (Perkin- Elmer公司)测定所有克隆的 5'和 3'末端的序列。将测定的 cDNA 序列与已有的公共 DNA序列数据库(Genebank )进行比较,结果发现其中一个克隆 0640e04的 cDNA序列为新的 DNA。通过合成一系列引物对该克隆所含的插入 cDNA片

段进行双向测定。结果表明, 0640e04克隆所含的全长 cDNA为 1493bp (如 Seq IDN0: 1 所示),从第 143bp至 469bp有一个 326bp的开放阅读框架( 0RF ) ,编码一个新的 蛋白质 (如 Seq ID NO: 2所示)。我们将此克隆命名为 pBS-0640e04, 编码的蛋白 质命名为人蝶呤钼氧化还原酶 12。

实施例 2 用 RT-PCR方法克隆编码人蝶呤钼氧化还原酶 12的基因

用胎脑细胞总 RNA为模板,以 oligo-dT为引物进行逆转录反应合成 cDNA,用 Qiagene的试剂盒纯化后,用下列引物进行 PCR扩增:

Primerl: 5,一 ATTGAAAAATAACTCCACATCTGT-3' (SEQ ID NO: 3)

Primer2: 5,- ACAGAGTCTCGCTCTATTGCCCAG- 3, (SEQ ID NO: 4)

Primerl为位于 SEQ ID NO: 1的 5,端的第 lbp开始的正向序列;

Primer2为 SEQ ID NO: 1的中的 3,端反向序列。

扩增反应的条件: 在 50μ1的反应体积中含有 50mmol/L C1, 10mmol/L Tris—HCl, pH8.5, 1.5mmol/L MgCl2, 200 mol/L dNTP, lOpmol引物, 1U的 Taq DM 聚合酶(Clontech公司产品)。在 PE9600型 D 热循环仪(Perkin- Elmer公司)上按下 列条件反应 25个周期: 94°C 30sec; 55°C 30sec; 72°C 2min。在 RT- PCR时同时设 p-actin为阳性对照和模板空白为阴性对照。扩增产物用 QIAGEN公司的试剂盒纯 化,用 TA克隆试剂盒连接到 PCR载体上( Invitrogen公司产品)。 D 序列分析结 果表明 PCR产物的 DM序列与 SEQ ID NO: 1所示的 l-1493bp完全相同。

实施例 3 Northern 印迹法分析人蝶呤钼氧化还原酶 12基因的表达 用一步法提取总 RNA[Anal. Biochem 1987, 162, 156-159] 0 该法包括酸性硫 氰酸胍苯酚 -氯仿抽提。即用 4M异硫氰酸胍- 25m柠檬酸纳, 0.2M乙酸钠( pH4.0 ) 对组织进行匀浆,加入 1倍体积的苯酚和 1/5体积的氯仿-异戊醇(49: 1) ,混合 后离心。吸出水相层,加入异丙醇(0.8体积)并将混合物离心得到 RNA沉淀。将 得到的 RNA沉淀用 70%乙醇洗涤,干燥并溶于水中。用 20μΕ RNA, 在含 20mM 3- ( N-吗啉代)丙磺酸 ( pH7.0 ) - 5raM乙酸钠 -IraM EDTA- 2.2M甲醛的 1.2%琼脂糖凝胶上进 行电泳。然后转移至硝酸纤维素膜上。用 a-32P dATP通过随机引物法制备 32Ρ-标记 的 DNA探针。所用的 D 探针为图 1所示的 PCR扩增的人蝶呤钼氧化还原酶 12编码区 序列(143bp至 469bp)。将 32P-标记的探针 (约 2 χ 106cpm/ml ) 与转移了 RNA的硝酸 纤维素膜在一溶液中于 42°C杂交过夜,该溶液包含 50%甲酰胺 - 25mMKH2P04 ( pH7.4 ) - 5 χ SSC- 5 χ Denhardt's溶液和 20(^g/ml鲑精 DNA。杂交之后,将滤膜在 1 x SSC- 0. 1%SDS中于 55。C洗 30min。然后,用 Phosphor Imager进行分析和定量。

实施例 4 重组人蝶呤钼氧化还原酶 12的体外表达、分离和纯化

根据 SEQ ID N0: 1和图 1所示的编码区序列,设计出一对特异性扩增引物,序 列如下:

Pr imer3: 5'-CATGCTAGCATGAGCCCAAGGCACAGACTAAGC-3' ( Seq ID No: 5 ) Pr imer4: 5'-CATGGATCCTTATTTCACCAAGATTAGGCCGAA-3' ( Seq ID No: 6 ) 此两段引物的 5,端分别含有 Nhel和 BamHI酶切位点,其后分别为目的基因 5'端 和 3'端的编码序列, Nhel和 BamHI酶切位点相应于表达载体质粒 pET-28b (+) (Novagen公司产品, Cat. No. 69865. 3)上的选择性内切酶位点。以含有全长 目的基因的 pBS-0640e04质粒为模板,进行 PCR反应。 PCR反应条件为:总体积 50μ1 中含 pBS-0640e04质粒 10pg、弓 |物 Pr imer - 3和 Pr imer - 4分另 'J为 l Opmol 、 Advantage polymerase Mix ( Clontech公司产品 ) 1μ1。循环参数: 94。C 20s, 60°C 30s, 68°C 2 rain,共 25个循环。用 Nhel和 BamHI分别对扩增产物和质粒 pET-28 (+)进行双酶切,分 别回收大片段,并用 T4连接酶连接。连接产物转化用氯化钙法大肠杆细菌 DH5 ct,在 含卡那霉素(终浓度 3(^g/ml ) 的 LB平板培养过夜后,用菌落 PCR方法筛选阳性克 隆,并进行测序。挑选序列正确的阳性克隆(pET-0640e04 )用氯化钙法将重组质 粒转化大肠杆菌 BL21 (DE3) plySs (Novagen公司产品)。在含卡那霉素(终浓度 3(Vg/ml ) 的 LB液体培养基中,宿主菌 BL21 ( pET-0640e04 ) 在 37。C培养至对数生 长期,加入 IPTG至终浓度 1隱 ol/L, 继续培养 5小时。离心收集菌体,经超声波破 菌,离心收集上清液,用能与 6个组氨酸(6Hi s-Tag ) 结合的亲和层析柱 Hi s. Bind Quick Cartr idge ( Novagen公司产品)进行层析,得到了纯化的目的蛋白人蝶呤 钼氧化还原酶 12。经 SDS-PAGE电泳,在 12kDa处得到一单一的条带(图 2 ) 。将该 条带转移至 PVDF膜上用 Edams水解法进行 N-端氨基酸序列分析,结果 N-端 15个氨基 酸与 SEQ ID NO: 2所示的 N-端 15个氨基酸残基完全相同。

实施例 5 抗人蝶呤钼氧化还原酶 12抗体的产生

用多肽合成仪(PE公司产品)合成下述人蝶呤钼氧化还原酶 12特异性的多肽: NH2-Met-Ser-Pro-Arg-Hi s-Arg-Leu-Ser-I le-I le-Asp-Ser-Ser-Phe-Leu-C00H (SEQ ID NO: 7)。将该多肽分别与血蓝蛋白和牛血清白蛋白耦合形成复合 物,方法参见: Avrameas, et a l. Imraunochemi s t ry, 1969; 6: 43。用 4mg上述 l 蓝蛋白多肽复合物加上完全弗氏佐剂免疫家兔, 15天后再用血蓝蛋白多肽复合

物加不完全弗氏佐剂加强免疫一次。釆用经 15 g/ml牛血清白蛋白多肽复合物 包被的滴定板做 ELISA测定兔血清中抗体的滴度。用蛋白 A-Sepharose从抗体阳 性的家兔血清中分离总 IgG。将多肽结合于溴化氰活化的 Sepha r 0 Se4B柱上,用 亲和层析法从总 IgG中分离抗多肽抗体。免疫沉淀法证明纯化的抗体可特异性 地与人蝶呤钼氧化还原酶 12结合。

实施例 6 本发明的多核苷酸片段用作杂交探针的应用

从本发明的多核苷酸中挑选出合适的寡核苷酸片段用作杂交探针有多方面的 用途,如用该探针可与不同来源的正常组织或病理组织的基因组或 cDNA 文库杂 交以鉴定其是否含有本发明的多核苷酸序列和检出同源的多核苷酸序列,进一步 还可用该探针检测本发明的多核苷酸序列或其同源的多核苷酸序列在正常组织或 病理组织细胞中的表达是否异常。

本实施例的目的是从本发明的多核苷酸 SEQ ID NO: 1 中挑选出合适的寡核 苷酸片段用作杂交探针,并用滤膜杂交方法鉴定一些组织中是否含有本发明的多 核苷酸序列或其同源的多核苷酸序列。滤膜杂交方法包括斑点印迹法、 Southern 印迹法、 Northern印迹法和复印方法等,它们都是将待测的多核苷酸样品固定在 滤膜上后使用基本相同的步骤杂交。这些相同的步骤是:固定了样品的滤膜首先 用不含探针的杂交缓冲液进行预杂交,以使滤膜上样品的非特异性的结合部位被 载体和合成的多聚物所饱和。然后预杂交液被含有标记探针的杂交缓冲液替换, 并保温使探针与靶核酸杂交。杂交步骤之后,未杂交上的探针被一系列洗膜步骤 除掉。本实施例利用较高强度的洗膜条件(如较低盐浓度和较高的温度),以使 杂交背景降低且只保留特异性强的信号。本实施例选用的探针包括两类:第一类 探针是完全与本发明的多核苷酸 SEQ ID NO: 1 相同或互补的寡核苷酸片段;第 二类探针是部分与本发明的多核苷酸 SEQ ID NO: 1 相同或互补的寡核苷酸片段。 本实施例选用斑点印迹法将样品固定在滤膜上,在较高强度的的洗膜条件下,第 一类探针与样品的杂交特异性最强而得以保留。

一、 探针的选用

从本发明的多核苷酸 SEQ ID NO: 1 中选择寡核苷酸片段用作杂交探针,应 遵循以下原则和需要考虑的几个方面:

1 , 探针大小优选范围为 18-50个核苷酸;

2 , GC含量为 30%-70%, 超过则非特异性杂交增加;

3, 探针内部应无互补区域;

4, 符合以上条件的可作为初选探针,然后进一步作计算机序列分析, 包括将该初选探针分别与其来源序列区域(即 SEQ ID NO: 1 )和其它巳知的 基因组序列及其互补区进行同源性比较,若与非靶分子区域的同源性大于 85% 或者有超过 15个连续碱基完全相同,则该初选探针一般就不应该使用;

5, 初选探针是否最终选定为有实际应用价值的探针还应进一步由实 验确定。

完成以上各方面的分析后挑选并合成以下二个探针:

探针 1 (probel), 属于第一类探针,与 SEQ ID NO: 1 的基因片段完全同源 或互补 (41Nt):

5'-TGAGCCCAAGGCACAGACTAAGCATTATCGACTCTTCCTTT-3' ( SEQ ID NO: 8 ) 探针 2 (probe2), 属于第二类探针,相当于 SEQ ID NO: 1 的基因片段或其 互补片段的替换突变序列(41Nt):

5-TGAGCCCAAGGCACAGACTACGCATTATCGACTCTTCCTTT-3' (SEQ ID NO: 9) 与以下具体实验步骤有关的其它未列出的常用试剂及其配制方法请参考文 献: DNA PROBES G. H. Keller; M. M. Manak; Stockton Press, 1989 (USA)以及更常 用的分子克隆实验手册书籍如《分子克隆实验指南》 U998 年第二版) [美]萨姆 布鲁克等著,科学出版社。

样品制备:

1,从新鲜或冰冻组织中提取 DNA

步骤: 1 ) 将新鲜或新鲜解冻的正常肝组织放入浸在冰上并盛有磷酸盐缓冲 液 (PBS) 的平皿中。用剪刀或手术刀将组织切成小块。搡作中应保持组织湿润。

2 )以 lOOOg离心切碎组织 10分钟。 3 )用冷匀浆缓冲液( 0.25mol/L蔗糖; 25mmol/L Tris-HCl,pH7.5; 25ramol/L NaCl; 25薩 ol/L MgCl2 ) 悬浮沉淀(大约 10ral/g )„ 4)在 4°C 用电动匀浆器以全速匀浆组织悬液,直至组织被完全破碎。 5) lOOOg 离心 10分钟。 6)用重悬细胞沉淀(每 0. lg最初组织样品加 l-5ml ), 再以 lOOOg 离心 10分钟。 7 )用裂解缓冲液重悬沉淀(每 0. lg最初组织样品加 1ml ), 然后 接以下的苯酚抽提法。

2, DNA的苯酚抽提法

步骤: 1)用 l-10ml冷 PBS洗细胞, 1000g离心 10分钟。 2)用冷细胞裂解 液重悬浮沉淀的细胞(Ι χ ΙΟ8细胞 /ml ) 最少应用 lOOul 裂解缓冲液。 3)加 SDS 至终浓度为 1%, 如果在重悬细胞之前将 SDS直接加入到细胞沉淀中,细胞可能会 形成大的团块而难以破碎,并降低总产率。这一点在抽提 >107细胞时特别严重。

4)加蛋白酶 K至终浓度 200ug/ml。 5) 50°C保温反应 1小时或在 37°C轻轻振摇 过夜。 6)用等体积苯酚:氯仿:异戊醇( 25: 24: 1 )抽提,在小离心机管中离 心 10 分钟。两相应清楚分离,否则重新进行离心。 7) 将水相转移至新管。 8) 用等体积氯仿:异戊醇(24: 1)抽提,离心 10分钟。 9)将含 DNA 的水相转移 至新管。然后进行 DNA的纯化和乙醇沉淀。

3, DNA的纯化和乙醇沉淀

步骤: 1 )将 1/10体积 2mol/L醋酸钠和 2倍体积冷 100%乙醇加到 DNA溶液 中,混匀。在 -20。C放置 1小时或过夜。 2) 离心 10分钟。 3)小心吸出或倒出乙 醇。 4)用 70%冷乙醇 500ul 洗涤沉淀,离心 5分钟。 5)小心吸出或倒出乙醇。 用 500ul 冷乙醇洗涤沉淀,离心 5 分钟。 6)小心吸出或倒出乙醇,然后在吸水 纸上倒置使残余乙醇流尽。空气干燥 10-15分钟,以使表面乙醇挥发。注意不要 使沉淀完全干燥,否则较难重新溶解。 7) 以小体积 TE或水重悬 D 沉淀。低速 涡旋振荡或用滴管吹吸,同时逐渐增加 TE, 混合至 DNA 充分溶解,每 l-5 x lOfi 细胞所提取的大约加 lul。

以下第 8-13步骤仅用于必须除去污染时,否则可直接进行第 14步骤。

8)将 RNA酶 A加到 DNA溶液中,终浓度为 100ug/ml , 37°C保温 30分钟。 9) 加入 SDS和蛋白酶 K, 终浓度分别为 0.5%和 100ug/ml。 37。C保温 30分钟。 10) 用等体积的苯酚:氯仿:异戊醇( 25: 24: 1)抽提反应液,离心 10分钟。 11) 小心移出水相,用等体积的氯仿:异戊醇(24: 1)重新抽提,离心 10分钟。 12) 小心移出水相,加 1/10体积 2mol/L醋酸钠和 2.5体积冷乙醇,混匀置 - 20。C 1 小时。 13)用 70%乙醇及 100%乙醇洗涤沉淀,空气干燥,重悬核酸,过程同第 3-6步骤。 14)测定 A26。和 A28。以检测 DM的纯度及产率。 15)分装后存放于 -20。 (:。

样膜的制备:

1)取 4 x 2 张适当大小的硝酸纤维素膜(NC膜),用铅笔在其上轻轻标出 点样位置及样号,每一探针需两张 NC 膜,以便在后面的实验步骤中分别用高强 度条件和强度条件洗膜。

2)吸取及对照各 15微升,点于样膜上,在室温中晾干。

3 )置于浸润有 0. lmol/L NaOH, 1.5mol/L NaCl的滤纸上 5分钟 (两次 ), 晾干置于浸润有 0.5mol/L Tris-HCl ( pH7.0 ), 3mol/L NaCl的滤纸上 5分钟 (两 次),晾干。

4)夹于干净滤纸中,以铝箔包好, 60- 80°C真空干燥 2小时。

探针的标记

1) 3μ1 Probe ( 0.10D/10口 1 ), 加入 2μ1 Kinase缓冲液, 8-10 uCi γ- 32P-dATP+2U Kinase, 以补加至终体积 20μ1。

2) 37 °C 保温 2小时。

3)加 1/5体积的溴酚蓝指示剂 (BPB)。

4 )过 Sephadex G-50柱。

5) 至有 32P-Probe洗出前开始收集第一峰(可用 Monitor监测)。

6) 5滴 /管,收集 10-15管。

7)用液体闪烁仪监测同位素量。

8) 合并第一峰的收集液后即为所需制备的 32P-Pn)be (第二峰为游离 γ-32P-dATP )。

预杂交

将样膜置于塑料袋中, 加入 3-10mg 预杂交液( lOxDenhardt's; 6xSSC, 0. lmg/ral CT DNA (小牛胸腺 DM ))β 封好袋口后, 68°C水浴摇 2小时。

杂交

将塑料袋剪去一角,加入制备好的探针,封好袋口后, 42°C水洛摇过夜。 洗膜:

高强度洗膜:

1)取出已杂交好的样膜。

2 ) 2xSSC, 0.1%SDS中, 40。C洗 15分钟( 2次)。

3 ) 0. lxSSC, 0.1%SDS中, 40。C洗 15分钟 ( 2次)。

4) 0. lxSSC, 0.1%SDS中, 55°C洗 30分钟( 2次),室温晾干。

低强度洗膜:

1)取出已杂交好的样膜。

2) 2xSSC, 0.1觸中, 37。C洗 15分钟(2次)。

3) 0. lxSSC, 0.1%SDS中, 37。C洗 15分钟( 2次)。

4) 0. lxSSC, 0.1%SDS中, 40°C洗 15分钟( 2次),室温晾干。

X-光自显影:

-70 , X-光自显影(压片时间根据杂交斑放射性强弱而定)。

实验结果:

釆用低强度洗膜条件所进行的杂交实验,以上两个探针杂交斑放射性强弱没 有明显区别;而采用高强度洗膜条件所进行的杂交实验,探针 1 的杂交斑放射性 强度明显强于另一个探针杂交斑的放射性强度。因而可用探针 1 定性和定量地分 析本发明的多核苷酸在不同组织中的存在和差异表达。

实施例 7 DNA Microarray

基因芯片或基因微矩阵(DNA Microarray )是目前许多国家实验室和大制药 公司都在着手研制和开发的新技术,它是指将大量的靶基因片段有序地、高密度 地排列在坡璃、硅等载体上,然后用荧光检测和计算机软件进行数据的比较和分 析,以达到快速、高效、高通量地分析生物信息的目的。本发明的多核苷酸可作 为靶 DNA用于基因芯片技术用于高通量研究新基因功能;寻找和筛选组织特异性 新基因特别是肿瘤等疾病相关新基因;疾病的诊断,如遗传性疾病。其具体方法 步驟在文献中已有多种报道,如可参阅文献 DeRi s i , J. L. , Lyer, V. &Brown, P. 0. (1997) Science 278, 680-686.及文献 Hel le, R. A., Schema, M. , Chai , A. , Sha lom, D., (1997) PNAS 94: 2150-2155.

(一)点样

各种不同的全长 cDNA共计 4000条多核苷酸序列作为靶 DNA,其中包括本发 明的多核苷酸。将它们分别通过 PCR进行扩增,纯化所得扩增产物后将其浓度调 到 500ng/ul左右,用 Car tes ian 7500点样仪(购自美国 Car tes ian公司)点于玻 璃介质上,点与点之间的距离为 280μπι。将点样后的玻片进行水合、干燥,置于 紫外交联仪中交联,洗脱后干燥使 DNA 固定在玻璃片上制备成芯片。其具体方法 步骤在文献中已有多种报道。本实施例的点样后处理步骤是:

1. 潮湿环境中水合 4小时;

2. 0. 2%SDS洗涤 1分钟;

3. ddH20洗涤两次,每次 1分钟;

4. NaBH4封闭 5分钟;

5. 95°C水中 2分钟;

6. 0. 2%SDS洗涤 1分钟;

7. ddH20冲洗两次;

8. 凉干, 25°C储存于暗处备用。

(二)探针标记

用一步法分别从人体混合组织与机体特定组织(或经过刺激的细胞株)中抽

提总 mRNA, 并用 Ol igotex mRNA Midi Ki t (购自 QiaGen公司)纯化 mRNA,通过反 转录分别将荧光试剂 Cy3dUTP (5-Amino— propargy卜 2'— deoxyur idine 5'— tr iphate coupled to Cy3 f luorescent dye, 购自 Amersham Phamacia Biotech 公司)标 记人体混合组织的 mRNA , 用荧光试剂 Cy5dUTP (5- Amino- propargyl-2'-deoxyuridine 5'-triphate coupled to Cy5 f luorescent dye , 购自 Amersham Phamacia Biotech 公司)标记机体特定组织(或经过刺激的细胞株) mRNA, 经纯 化后制备出探针。具体步骤参照及方法见:

Sc ena, M., Shalon, D. , Heller, R. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 93: 10614-10619.

Schena, M. , Shalon, Dar i. , Davi s, R. W. (1995) Science. 270. (20) : 467-480.

(三)杂交

分别将来自以上两种组织的探针与芯片一起在 UniHyb™ Hybr idizat ion Solut ion (购自 TeleChem公司)杂交液中进行杂交 16 小时,室温用洗涤液(1 >< SSC, 0. 2%SDS ) 洗涤后用 ScanArray 3000 扫描仪(购自美国 Genera l Scanning 公司)进行扫描,扫描的图象用 Imagene 软件(美国 Biodi scovery公司)进行 数据分析处理,算出每个点的 Cy3/Cy5比值。

以上机体特定组织(或经过刺激的细胞株)分别为胸腺、睾丸、肌肉、脾脏、 肺、皮肤、甲状腺、肝、 PMA+的 Ecv304细胞株、 PMA -的 Ecv304细胞株、未饥饿的 L02细胞株、砷刺激 1小时的 L02细胞株、砷刺激 6小时的 L02细胞株前列腺、心、肺 癌、胎膀胱、胎小肠、胎大肠、胎胸腺、胎肌、胎肝、胎肾、胎脾、胎脑、胎肺 以及胎心。根据这 26个 Cy3/Cy5比值绘出折方图(图 1 ) 。由图可见本发明所述的 人蝶呤钼氧化还原酶 12和人蝶呤钼氧化还原酶 11表达谱很相似。