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1. WO1999003890 - NOUVEAUX PEPTIDES ET POLYPEPTIDES UTILES DANS LA REGENERATION DU SYSTEME NERVEUX

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NOUVEAUX PEPTIDES ET POLYPEPTIDES UTILES DANS LA
REGENERATION DU SYSTEME NERVEUX.

La présente invention concerne notamment de nouveaux peptides et polypeptides utiles notamment à titre de médicaments dans les thérapies impliquant la régénération des cellules du système nerveux, dans le traitement des neuroblastomes, et utiles également comme additifs dans les cultures de cellules nerveuses.
De très nombreuses protéines comportants des motifs répétés que l'on appelle motifs de type 1 des thrombospondines (TSRs) ont été identifiées ces dernières années. On peut dire que ces protéines ont des activités très variées selon le système biologique dans lequel elles interviennent. Citons comme exemples les mieux étudiés et donc les plus connus, les protéines CS (de circumsporozoïte) qui permettent la fixation aux cellules hépatiques de l'agent de la propagation de la malaria, le sporozoïte de plasmodium falciparum (WO 94/06646) et la thrombospondine sécrétée par les plaquettes sanguines qui intervient dans les phénomènes de thrombose et d'angiogénèse (EP 443 404).
En fait, ce motif de type 1 des thrombospodines (TSR) comporte, dans toutes les protéines étudiées jusqu'alors et évoquées précédemment, environ 60 acides aminés (AA) dont un certain nombre comme des cystéines (C), des tryptophanes (W), des serines (S), des glycines (G), des arginines (R) et des prolines (P) sont très conservés (voir ci-dessous l'alignement de ces AA conservés dans quelques protéines).
Certains peptides synthétiques, déduits de ces motifs TSRs, ont des propriétés biologiques intéressantes. Ainsi, les motifs CSVTCG permettent l'adhésion des sporozoïtes du plasmodium aux cellules hépatiques, les motifs CSVTCG et WXXW permettent l'attachement cellulaire dans d'autres modèles biologiques, BBXB (B étant un acide aminé basique) lie l'héparine et enfin WSXWS lie certains facteurs de croissance.
La F-spondine a été décrite et sa séquence a été alignée avec celle de la thrombospondine dans Klar et al, ( 1992), Cell, 69, 95- 1 10.
Les caractéristiques générales de la SCO-spondine sont décrites notamment dans l'article de Monnerie et al. (soumis) et l'article de

Gobron et al, (1996), Journal of Cell Science, 109, 1053- 1061 , 1996.

En particulier, l'alignement de la séquence de la SCO-spondine a mis en évidence des homologies avec des protéines telles que la thrombospondine 1 et 2 (Voir séquence, alignement page 1057 de

Gobron et al, (1996), J. of Cell Science 109, 1053- 1061 , incorporée dans la description par référence.).
L'originalité de la présente invention porte sur l'identification et la sélection d'un nouveau peptide actif dans la régénération du système nerveux, dont la séquence dérive de l'un des TSRs de la SCO-spondine.

Plus particulièrement, la présente invention concerne un peptide ou polypeptide ayant la formule :

-W-S-Ai-C-S-A2-C-G- (SEQ ID n° l)

dans laquelle Aï et A2 sont des séquences d'acides aminés comportant de 1 à 5 acides aminés, à l'exception des peptides ou polypeptides ayant l'une des séquences suivantes -W-S-P-C-S-V-T-C-G- (SEQ ID n°2)
-W-S-S-C-S-V-T-C-G- (SEQ ID n°3)
-W-S-Q-C-S-V-T-C-G- (SEQ ID n°4)

Il convient de rappeler que dans l'ensemble de la description, on entend désigner par « acide aminé » aussi bien les acides aminés naturels que les acides aminés non naturels. Par « acide aminé naturel » on entend désigner les acides aminés sous forme L que l'on peut trouver dans les protéines naturelles, c'est-à-dire alanine, arginine, asparagine, acide aspartique, cystéine, glutamine, acide glutamique, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, méthionine, phénylalanine, proline, serine, thréonine, tryptophane, tyrosine et valine. Mais, la présente invention concerne également les acides aminés non naturels, c'est-à-dire les acides aminés précédents sous leur forme D, ainsi que les formes homo de certains acides aminés comme l'arginine, la lysine, la phénylalanine et la serine ou les formes nor de la leucine ou de la valine.
II est également possible d'envisager l'utilisation d'autres acides aminés comme, par exemple :
Abu : acide alpha-aminobutyrique
Agm : agmatine
Aib : acide alpha-aminoisobutyrique
F-trp : N-formyle-trp
la sarcosine
la statine
l'ornithine
la désaminotyrosine.
La désaminotyrosine est incorporée à l'extrémité N-terminale alors que l'agmatine et la statine sont incorporées à l'extrémité C-terminale de ces peptides.
De façon préférée, les peptides selon la présente invention Ai est la proline ou X1-W-X2-X3 (SEQ ID n°5), où Xi, X2, X3 sont choisis indépendamment l'un des l'autres parmi G, S et C, c'est-à-dire de petits aminoacides.
De façon encore préférée, Ai est X1-W-S-X3 (SEQ ID n°6) et A2 est choisi parmi RS, VS et VT.
Les raisons de ces choix apparaîtront à la lecture de certains exemples.

De préférence, le polypeptide selon la présente invention a la structure suivante :
-W-S-X1-W-S-X2-C-S-A2-C-G- (SEQ ID n°7)
Le peptide préféré a la structure suivante :
-W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G- (SEQ ID n°8)
De façon préférée, les peptides et polypeptides selon la présente invention auront la structure suivante :
Y-W-S-A1-C-S-A2-C-G-Z (SEQ ID n°9)
dans laquelle Y et Z constituent les extrémités N et C-terminales du peptide, ou comportent des chaînes d'acides aminés ayant moins de 6 acides aminés, ou comportent des chaînes de composés qui ne sont pas des acides aminés.
Ceci correspond au peptide en lui-même ou à un peptide dans lequel les extrémités Z et Y améliorent l'activité pharmacologique ou assurent une meilleure pénétration ou biodisponibilité du principe actif, ainsi il est possible de prévoir dans les extrémités Y et Z l'utilisation de composants hydrophiles permettant éventuellement de passer certaines barrières biologiques, ou bien, au contraire, de prévoir des séquences plus hydrophiles qui permettront une meilleure solubilisation des produits en cause.
Enfin, la modification des extrémités peut faciliter l'incorporation de ces produits dans des formes galéniques particulières comme, par exemple, des liposomes ou des microparticules.
La présente invention concerne également des vecteurs d'expression d'ADN caractérisés en ce qu'ils sont capables d'exprimer les peptides ou polypeptides précédents.
Les séquences d'ADN codant pour les peptides ou les polypeptides précédents peuvent être aisément déterminées à partir des séquences en amino-acides ou en s'appuyant, par exemple, sur les séquences naturelles telles qu'elles seront décrites dans la présente demande.

Les vecteurs d'administration pourront être constitués soit par des vecteurs d'ADN nus, soit par des vecteurs plasmidiques, soit encore par des vecteurs viraux ou bien des vecteurs synthétiques.
Il s'agit là de technologies connues qui ne seront pas décrites dans le détail.
L'utilisation de ces vecteurs d'expression permet d'exprimer in situ les peptides ou polypeptides en cause et, dans certains cas, est susceptible d'améliorer leur activité.
On choisira, bien entendu, des constructions qui présentent si possible une spécificité pour les cellules nerveuses, dans la mesure où il s'agit des cibles préférées pour les polypeptides selon la présente invention.
Les peptides et polypeptides selon la présente invention peuvent être préparés par tout procédé approprié, notamment ils peuvent être obtenus par synthèse chimique mais également il est possible de les obtenir par voie biologique en utilisant notamment les vecteurs mentionnés précédemment dans les cultures cellulaires appropriées.
Il convient d'ailleurs de remarquer à ce propos que les polypeptides et peptides selon la présente invention peuvent se présenter sous forme déglycosylée ou bien glycosylée si cela est nécessaire. Il convient également de remarquer que dans certains cas et suivant la méthode de préparation il pourra être nécessaire de renaturer certaines structures tertiaires du peptide.
Enfin, les polypeptides selon la présente invention sont plus particulièrement utilisables pour la fabrication d'un médicament et ceci dans le but d'être administrés in vivo, notamment dans toutes les pathologies et traumatismes nécessitant une régénération des cellules du système nerveux, et plus particulièrement de leurs prolongements et synapses.

Il peut s'agir de pathologies ou de traumatismes dans lesquels on observe une neurodégénérescence, mais il peut également s'agir de pathologies ou de traumatismes dans lesquels la régénération du système nerveux central, notamment des axones, ou des nerfs périphériques est nécessaire.
Parmi les pathologies neurodégénératives dans lesquelles les composés selon la présente invention peuvent apporter un support, il faut citer notamment la maladie d'Alzheimer, la sclérose en plaques, la maladie de Parkinson et les différents types de myopathies.
Pour ce qui concerne la régénération des prolongements neuronaux, notamment des axones, il peut s'agir en particulier de problèmes de type accidentel ou traumatique (section de moelle épinière ou de nerfs périphériques).
De même, les composés selon la présente invention peuvent être utilisés comme additifs dans certaines cultures cellulaires avec les mêmes effets que ceux mentionnés précédemment sur la croissance des cellules.
Plus particulièrement, les composés selon la présente invention augmentent la pousse neuritique (incluant les axones) dans les neurones du cortex cérébral. Sur les neurones de la moelle épinière on note une inhibition de l'agrégation et une défasciculation des neurites, on note aussi une augmentation des contacts synaptiques.
La « pousse neuritique » est définie comme un allongement, c'est-à-dire une croissance des prolongements des neurones, que ce soit le prolongement dendritique ou axonal.
L'« agrégation » est définie comme un regroupement des cellules formant un amas.
La « défasciculation » est définie comme le résultat d'une diminution de l'adhésivité entre neurites, conduisant à un réseau lâche de prolongements neuronaux.

Le « contact synaptique » est défini comme la capacité pour une cellule neuronale de communiquer avec une autre cellule, celle-ci pouvant être également neuronale.
Dans un autre aspect de la présente invention, lesdits peptides ou polypeptides peuvent être utiles pour induire la régression de la tumorogénicité lors de neuroblastome.
La nomenclature utilisée pour décrire la séquence du présent peptide est la nomenclature internationale utilisant le code à trois lettres ou le code à une lettre et où l'extrémité amino-terminale est présentée à gauche et l'extrémité carboxy- terminale est présentée à droite.
Les compositions selon la présente invention peuvent se présenter sous une forme quelconque habituelle pour l'administration pharmaceutique, c'est-à-dire par exemple des formes d'administration liquide en gel ou tout autre support permettant, par exemple, la libération contrôlée.
Parmi les compositions utilisables, il faut citer notamment les compositions injectables plus particulièrement destinées aux injections dans les espaces méningés et sous arachnoïdiens.

Le peptide le plus actif selon la présente invention a la formule suivante :

Trp-Ser-Gly-Trp-Ser-Ser-Cys-Ser-Arg-Ser-Cys-Gly (SEQ ID n°8)

Il est soluble en milieu aqueux basique, présente un poids moléculaire de 1301 Da et présente une composition en amino-acide de :
N N(%) P.M. P.M.(%)

C Cys Cystéine 2 16,7 206 15,8

G Gly Glycine 2 16,7 1 14 8,8 R Arg Arginine 1 8,3 156 12,0
S Ser Serine 5 41 ,7 435 33,4
W Trp Tryptophane 2 16,7 372 28,6

II a été obtenu par synthèse chimique en phase solide.
Mais, comme cela a été indiqué précédemment, il peut être obtenu par génie génétique en utilisant un système hôte-vecteur comprenant l'ADN codant pour le peptide en tenant compte, par exemple, de la dégénérescence afin de le produire en grande quantité.
La séquence d'ADNc codant pour le peptide peut être présentée de la façon suivante (SEQ ID n° 10) :

5' TGG WSN GGN TGG WSN WSN TGY WSN MGN WSN TGY GGN 3'

A = Adénosine W = A ou T
C = Cytosine S = G ou C
G = Guanosine Y = C ou T
T = Thymidine M = A ou C
N = A, C, G ou T

Le peptide ainsi obtenu a été identifié par microséquençage, analyse HPLC, spectrométrie de masse et séquençage de l'ADN complémentaire .
C'est sur ce peptide (SEQ ID N°8) que l'on a réalisé les expériences décrites ci-après.

Exemple 1 : effet du peptide SEQ ID n° 8 sur la croissance des neurones

Matériel et méthode

Cultures cellulaires dissociées d'hémisphères cérébraux d'embryons de poulet âgés de 8 jours
Les cultures neuronales sont obtenues à partir d'embryons de poulet âgés de 8 jours. Les hémisphères cérébraux, après enlèvement des méninges, sont coupés en petits morceaux et dissociés enzymatiquement avec 0,25 % de trypsine dans un tampon salin PBS exempt de calcium et de magnésium pendant 15 minutes à 37°C.
Les cellules sont centrifugées à 200 g pendant 5 minutes en milieu DMEM à 20 % de SVF pour l'inactivation trypsique. Les cellules sont ensuite filtrées sur membrane de nylon (dimension des pores : 48 microns) et collectées dans un milieu chimiquement défini exempt de sérum contenant un mélange 1 / 1 de DMEM et de milieu Ham's F12 supplémenté avec de la glutamine (4 mM), du glucose (33 mM), de la pénicilline G (50 U/ml), du sulfate de streptomycine (50 μg/ml) et un supplément N2 de Bottenstein et Sato ( 1979) : putrescine ( 100 μM), sélénite de sodium (30 nM), transferrine humaine (50 μg/ml), progestérone (20 nM), insuline (5 μg /ml) et β-estradiol ( 1 pM). Tous les suppléments N2 sont achetés chez Sigma.
Les cellules sont étalées avec une densité de 7,5 x ÎO'' cellules/cm2 sur des boîtes en plastique à 24 puits. Pour certaines expérimentations, les boîtes en plastique sont revêtues soit de fibronectine (24 μg/ml) soit de thrombospondine (20 μg/ml). Les cultures sont incubées à 37°C et sous air à 10 % de C02. Le milieu n'est pas changé au cours de l'expérience. Ces cultures consistent en près de 95 % de neurones.

Cultures cellulaires de neurones spinales

Les moelles épinières d'embryons de poulet âgés de 6 jours sont disséquées, débarrassées de leur membrane méningée et coupées en petits morceaux dans un tampon phosphate (PBS) exempt de calcium et de magnésium. Après incubation avec 0,25 % de trypsine pendant 10 minutes à 37°C, le tissu est centrifugé à 200 g pendant 4 minutes dans un milieu de croissance contenant 20 % de sérum de veau foetal pour stopper la trypsination. Les cellules sont alors dissociées par trituration répétée en utilisant une pipette Pasteur et resuspendues dans un milieu chimiquement défini exempt de sérum comme précédemment.
Les cellules sont étalées avec une densité de 7,5 x 104 cellules/ cm2 sur des boîtes de culture en plastique à 24 puits. Les cultures sont incubées à 37°C et sous air à 10 % de CO2. Le milieu n'est pas changé durant les expériences et l'on a déjà démontré que ce type de population cellulaire contenait plus de 93 % de neurones.
Les peptides testés sont, outre le peptide selon la présente invention mentionné précédemment (peptide SEQ ID n°8) , un second peptide selon l'invention ayant la structure :
W-G-P-C-S-V-S-C-G- (SEQ ID n° l l)
puis 3 peptides de comparaison :
D-C-K-D-G-S-D-E- (SEQ ID n° 12)
R-K-A-R- (SEQ ID n° 13)
et une séquence mélangée du peptide SEQ ID n°8 :
S-S-C-R-S-G-C-W-G-S-S-W- (SEQ ID n° 14).
L'ensemble de ces peptides a été obtenu par synthèse.
Résultats
En présence du peptide SEQ ID n°8, les neurones s'agrègent et sont essentiellement connectés par des faisceaux de neurites longs et épais après 5 jours de culture. En plus, ces cellules adhèrent bien au substrat revêtu du peptide avec aucun détachement des agrégats. Au contraire, les cultures cellulaires contrôles, en l'absence du peptide, se détachent rapidement du substrat plastique à 5 jours de culture.

Toutefois, sur le plastique, seules les neurones corticaux forment des agrégats à partir desquels très peu de neurites peuvent être observées, ce qui indique que le substrat est insuffisamment adhésif. Le nombre des agrégats neuronaux augmente de 9,3 % entre la culture contrôle et la culture traitée avec le peptide selon l'invention.
L'analyse morphométrique révèle un accroissement significatif, à la fois dans le nombre des neurites par agrégat et dans la longueur des neurites par agrégat. D'autre part, des puits de plastique revêtu avec de la BSA sont très peu adhésifs pour les cellules neuronales.
Les essais effectués avec d'autres peptides en comparaison avec le peptide SEQ ID n°8 dans le désordre ne donnent aucun résultat significatif.
Le peptide SEQ ID n° l l donne des résultats plus faibles mais, néanmoins, significatifs.
De même, les essais réalisés avec le peptide SEQ ID n° 13 qui est une séquence consensus de fixation des glycosamino-glycanes présente dans un grand nombre de protéines se fixant à l'héparine, de même que les peptides correspondant à des récepteurs de LDL type A n'ont donné aucun résultat représentatif.
D'autre part, on a étudié l'effet des peptides selon la présente invention SEQ ID n°8 et n° l l sur des cultures à faible densité. En effet, il a déjà été démontré que la forte agrégation pouvait influencer la croissance neuritique de la même façon que la force d'adhésion des cellules au substrat.
Les essais réalisés à faible densité ont montré qu'en l'absence d'agrégation les deux peptides augmentaient de façon significative le pourcentage des cellules neuronales portant des neurites. Dans les contrôles, seuls 24,4 % des cellules adhérantes présentaient des neurites à 4 jours de culture tandis que respectivement 2 et 2,5 fois plus apparaissaient en présence des peptides SEQ ID n°8 et n° l 1.
Les analyses morphométriques ont révélé une augmentation significative dans chacun d'eux à la fois du nombre de neurites par cellule et de la longueur des neurites en présence du peptide SEQ ID n°8 et non pas du peptide SEQ ID n° l l . Dans ces conditions, ceci démontre que, même en l'absence d'agrégation neuronale, le peptide SEQ ID n°8 et à moindre degré le peptide SEQ ID n° 1 1 sont capables de promouvoir l'adhésion et la croissance neuritique des cellules neuronales corticales.
On a également étudié l'effet du peptide SEQ ID n°8 invention dans différentes conditions expérimentales :
En présence de différents substrats, on a pu démontrer par exemple que le peptide selon l'invention augmentait de façon significative le nombre des neurites par agrégat dans des plaques à puits revêtues avec la thrombospondine ou la fibronectine et ceci par rapport aux contrôles, de même que la longueur des neurites par agrégat.
L'activité du peptide SEQ ID n°8 sur les cultures de cellules de moelle épinière par rapport à des contrôles montre que les neurones demeurent distribués pendant au moins une semaine in vitro. Les neurones montrent des croissances neuritiques proéminentes formant un réseau sans fasciculation des neurites. On note une augmentation du nombre des contacts synaptiques entre les neurites. Au contraire, les cellules neuronales des contrôles forment, en général, de petits agrégats interconnectés par de longs filaments. Les neurites croissant à partir des agrégats forment des faisceaux relativement raides le long desquels des neurones essentiellement simples, bi ou tripolaires peuvent être vus.
Les autres peptides testés dans les mêmes conditions ne montrent pas de différence notable par rapport aux contrôles.

Exemple 2 : Effet du peptide SEQ ID n°8 sur le neuroblastome dérivé de NIB104

Matériel et méthode

Les cellules dérivées du neuroblastome NIB 104 ont été cultivées dans des boîtes plastique 24 puits préalablement recouvertes par un film de polyl-L-ysine, dans des conditions similaires à celles des cultures primaires.

Résultats

En présence du peptide SEQ ID n°8 selon la présente invention, les cellules de neuroblastomes NIB104 sont nettement moins nombreuses que dans les cultures témoins. L'aspect des cellules est considérablement modifié car elles acquièrent un phénotype neuronal caractéristique. L'analyse morphométrique révèle qu'en présence de concentration croissantes de peptide dans le milieu de culture la pousse neuritique augmente progressivement. Cette réponse est donc dose-dépendant et significative d'un effet physiologique spécifique.