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1. WO1993018134 - MICROORGANISME, SOUCHE W, COMPOSITION ENZYMATIQUE QU'IL PERMET D'OBTENIR, UTILISATION DU MICRO-ORGANISME ET PROCEDE D'HYDROLYSE, NOTAMMENT DE LA KERATINE

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[ DE ]
Mikroorganismus Stamm W, von diesem erhältliche
Enzymzusammensetzung, Verwendung des Mikroorganismus und Verfahren zur Hy rolyse insbesondere von Keratin

Beschreibung

Technisches Gebiet der Erfindung

Oie Erfindung betrifft einen neuen Mikroorganismus mit proteolytischen Eigenschaften, eine von dem
Mikroorganismus erhältliche Enzymzusammensetzung, die Verwendung des Mikroorganismus sowie Verfahren zur Hydrolyse insbesondere von Keratin-

Beschreibung des Stands der Technik

Es ist bekannt, daß spezielle Enzyme, die Proteasen, Proteine hydrolysiere , wobei Oligopeptide und
schließlich Aminosäuren entstehen. Diese Enzyme werden auch von Mikroorganismen gebildet, wie z. B. von
Bakterien der Gattung Pseudomonas, Bacillus oder
Proteus. Einige Enzyme, die sogenannten thermophilen Enzyme, zeigen die o. g. Aktivität auch bei
Temperaturen > 70°C und ermöglichen hierdurch
insbesondere industriell interessante Hydrolysen. Eine Quelle für solche thermophilen Enzyme sind z. B.
thermophile Mikroorganismen. Einen Überblick hierüber gibt BFE 9_ , No . 7/8, S. 46fi - 470 (1992) in dem
Artikel " Thermophilic Enzymes as Industrial Catalysts?" von K. Peek et a . Ein weiteres Enzym, das oberhalb 70°C noch eine gewisse Aktivität zeigt, ist aus Biosci. Biotech. Biochem-, _______ (10), S. 1667 - 9

(1992) bekannt- Dieses Enzym zeigt neben gewöhnlichen proteolytischen Eigenschaf en auch eine gewisse
Kera tinase-Aktivit t - So wurden mit diesem Enzym zwar Haare bei einer Temperatur bis zu 90°C angegriffen, dies jedoch bei einem pH von 11,0 und über den
Zeitraum von 1 h, obwohl das Enzym unter den
angegebenen Bedingungen nach bereits 10 min die Hälfte seiner Aktivität eingebüßt hat (vgl. Appl. Microbiol. Biotechnol. (1989) 3.0, S. 120 - 124). Da die in
Biosci. in Fig. 2b wiedergegebene Zersetzung von menschlichem Haar selbst bei Temperaturen oberhalb 80°C sogar noch eine höhere Zersetzung ausweist, m .. diese Zersetzung wegen der Enzymdesaktivierung
chemischer und nicht enzymatischer Natur sein.
Aufgrund der bei 70°C stark abfallenden Stabilität dieses beschriebenen Enzyms ist dieses nicht geeignet. Keratin, wie es z. B. in Federn, Hörn oder Haaren vorkommt, im industriellen Maßstab, d. h. innerhalb einiger Stunden bis wenige Tage, abzubauen, da für einen vollständig enzymatischen Abbau nur solche
Keratin engen zugesetzt werden können, die in weniger als 3 h, insbesondere deutlich schneller als in 1 h, abgebaut sind.

Darstellung der Erfindung

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist das Isolieren und Bereitstellen eines Mikroorganismus, der über proteolytische Eigenschaften verfügt und auch Keratin in Naturprodukten in verhäl ni mäßig kurzer Zeit abbauen kann. Au gabe der vorliegenden Erfindung ist daher auch eine von diesem M kroorganismus erhältliche kera tinabbauende Enzymzusammensetzung und ein
Verfahren zum Abbau insbesondere von Keratin.

Hinsichtlich des Mikroorganismus wird die gestellte Aufgabe durch den Gegenstand des Anspruchs 1 gelöst.

Der Mikroorganismus, Stamm W, wurde bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-3300 Braunschweig, am 12.03.1992 hinterlegt und hat die Eingangsnummer DSM 7003
erhalten. Aufgrund seiner Eigenschaften hat der
Mikroorganismus die Bezeichnung Fervidobacterium pennavorans erhalten.

Der Mikroorganismus ist lebensfähig und gemäß dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren hinterlegt und freigegeben.
Entsprechende Unterlagen, Erklärungen und Formblatt PCT/RO/134 sind der Anmeldung beigefügt.

Der Mikroorganismus wie auch die von diesem
Mikroorganismus gebildeten Proteasen verfügen über eine gute Aktivität, so daß auch eine
Enzymzusammensetzung, die aus dem Mikroorganismus erhältlich ist, eine gute in vitro- Aktivit t gegenüber Proteinen, insbesondere gegenüber Keratin bzw.
kera tinhaltigen Substanzen, verfügt. Somit ist auch diese Enzymzusammensetzung isoliert von dem
Mikroorganismus einsetzbar.

F. pennavorans ist der erste -bekannte thermophi.le Mikroorganismus, der Federn (z. B. Hühner edern) als Substrat verwertet, und das sehr gut.

Sowohl mit dem neuen Mikroorganismus als auch mit der Enzymzusammensetzung lassen sich nicht nur unlösliche Strukturproteine, sondern auch lösliche Proteine behandeln- Der Abbau kann vollständig erfolgen, i- d. R. entstehen jedoch neben einzelnen Aminosäuren auch kurze Peptidsequenzen , die gewünschtenfalls auch industriell wεiterverwertet werden können- Gegenüber herkömmlichen Verfahren hat der biologische Abbau vor allem den Vorteil, daß auf eine chemische und/oder mechanische Behandlung der Proteine verzichtet werden kann. Ein weiterer Vorteil bei der Anwendung des neuen Mikroorganismus bzw. der Enzymzusammensetzung besteht darin, daß infolge der thermischen Stabilität der Enzyme die hydrol tische Spaltung der peptidischen Bindung günstig bei hoher Temperatur erfolgen kann, und daß der biologische Prozeß hierdurch insgesamt kontaminationssicherer wird, so daß vor allem auch einer Kontamination mit patogenen Mikroorganismen entgegengewirkt werden kann. Da die beim
pro eolytischen Abbau erhaltenen Oligopeptide bzw. einzelnen Aminosäuren ein hervorragendes Substrat für viele Mikroorganismen darstellen, ist die
er indungsgemäß mögliche Ver ahrensweise insbesondere für die industrielle Anwendung sehr vorteilhaft. Durch die höhere Temperatur erhält man auch eine bessere Substra tlöslichkeit und einen leichteren Angriff des Enzyms am Substrat. Außerdem ist die er indungsgem ße Enzymzusammensetzung auch sonst sehr stabil, z. B.
gegen SDS und Harnstoff.

Neben der bevo ugten Zersetzung n keratinhaltigen Substanzen kann der neue Mi roo ganismus bzw. die Enzymz sammensetzung z. B. auch zur Beseitigung proteinhaltiger Abfälle eingesetzt werden, wobei sich in Kombination mit anderen Mikroorganismen, wie z. B. methanogenen Bakterien, weitere Vorteile ergeben.
Werden die gebildeten Peptide oder Aminosäuren weiter zu Methan umgesetzt, kann gleichzeitig eine
Energieeinsparung erfolgen. Darüber hinaus können auch z. B. Alkohole oder andere Säuren gebildet werden.

Die zur Erfindung gehörige Enzymzusammensetzung ist erhältlich aus einer den Mikroorganismus Stamm W enthaltenden Kultur, wobei der Kulturüberstand
abgetrennt und ggf. konzentriert wird. Ebenso ist eine Enzymzusammensetzung aus einer den Mikroorganismus Stamm W enthaltenden Kultur erhältlich, wobei die Zellen aufgeschlossen werden. Zur Gewinnung der
Enzymzusammensetzung der genannten Art ist es
vorteilhaft, wenn der Mikroorganismus Stamm W zur En∑ymproduktion bzw. zur Enzyminduktion in einem
Tryptonmedium kultiviert wird.

Zur Erfindung gehört auch eine Enzymzusammensetzung, die insbesondere wie oben beschrieben zugänglich ist, wobei die Enzymzusammensetzung ein oder mehrere Enzyme beinhalten kann und Protea sea k tivitä t besitzt, und wobei

- das Temperaturoptimum (bei pH 10) im Bereich von 70 bis 90°C, insbesondere bei 80°C liegt;

das pH-Optimum (bei 80°C) im Bereich von pH 7 bis pH 11, insbesondere im Bereich von pH 9 bis pH 10 liegt;

Gelfiltration ein proteolytisches Enzym oder Enzymkomplex mit einem Molekulargewicht von ca. 200 000 Dalton und darüber ausweist und eine Molekulargewichtsbestimmung mit einem
SDS- Aktivitätsgel zwei Banden im Bereich zwischen ca. 200.000 und ca. 330.000 zeigt;

der E405-Wert (gegen Bliπdwert) nach 17 h
Inkubation bei 60°C, 0,2 mM Substrat in
Phosphatpuffer pH 7 und 0,3 mg/ml
Enzymrohextrakt, Meßstrecke ' cm, bei
N-Succinyl-Phe-pNA, N-Succin l-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA und Z-Arg-pNA > 0,5, bei H-Gly-Glu-pNA zwischen 0,3 und 0,5, bei Acetyl-Ala-pNA zwischen 0,1 und 0,3, und bei
Benzoyl-DL-Arg-pNA, Z-Gly-Pro-pNA,
Benzoyl-Lys-pNA , Z-Arg-pNA und Acetyl-Tyr-pNA unter 0,1 liegt;

die folgenden Inhibitoren bei den angegebenen Konzentrationen etwa die folgenden
Restaktivitäten ergeben:

Inhibitor Restakt. Restakt.
( 1 mM ) ( 5 mM )
ohne
Pefabloc SC (Ser . )
PMSF (Ser. )
EDTA (Metallo.)
lodoacetat (Cyst.)
die Thermo tabili t ten wie folgt sind:

- bei pH 7 und 8,5 über 20 h bei 70°C und 80°C
stabil ,
- bei 90°C nach 6 h weniger als 10 7.
Restaktivität ,

- bei pH 10, 80°C und 90°C nach 15 min
Totalverlust der Aktivität
- bei 70°C etwa 40 7. Restaktivit t nach 6 h,
nach 20 h Totalverlust.

Die Bezeichnung "Enzymzusammensetzung", die für ein oder mehrere Enzyme stehen kann, wurde gewählt, da der proteolytisch aktive Extrakt ein sehr hohes
Molekulargewicht hat (ca. 200 000 bei Gelfiltration auf Superdex 200 und zwischen ca. 200 000 und ca.
330 000 bei SDS-PAGE (sodium dodecylsulfat-polyacrylamid gradientgel slab electrophoresis ) auf amido black stained gel mit 0,1 7. Gelantine als
Substrat). Dies deutet auf die mögliche Existenz eines Enzymkomplexes hin, der möglicherweise, unter den beschriebenen Bedingungen jedoch nicht auftrennbar, gleiche oder unterschiedliche Untereinheiten enthält.

Prinzipiell lassen sich die erfindungsgemäßen
Enzymzusammensetzungen sowie die erfindungsgemäßen Verfahren mit weiteren Enzymen bzw. -Zusammenset ungen - bei entsprechender Stabilität - unmittelbar,
ansonsten vor- oder nachgeschaltet kombinieren.
Hierdurch kann z. B. der Abbau von Oligopeptiden, die erfindungsgem ß durch Abbau größerer Peptide, insbesondere unlöslicher Peptide, entstehen, zu
Aminosäuren gefördert werden-

Der Mikroorganismus Stamm W und/oder die beschriebenen Enzymzusammensetzungen finden Verwendung zum Abbau von Proteinen wie insbesondere, auch Keratin bzw. von solchen Stoffen, die diese Proteine beinhalten, insbesondere von Federn, Hörn oder Haaren. Besonders günstig ist dabei der Abbau von Federn, da gerade dieser Abbau aufgrund des besonderen Aufbaus von
Federn und deren Zusammensetzung bislang enzyma tisch besondere Schwierigkeiten bereitete.

Da von Hühnerfarmen mehr als 10 000 t/a Federabfall produziert wird, und Federn zu ca. 95 Gew. -7. aus ß-Keratin bestehen, bietet die Erfindung eine günstige Alternative zum rein chemischen Abbau von Federn zu Aminosäuren .

Der Mikroorganismus Stamm W findet außerdem Verwendung zur Isolierung eines eine Keratinase codierenden Gens und/oder zur Insertion eines eine Keratinase
codierenden Gens in einen anderen Mikroorganismus.
Hierbei handelt es sich um routinemäßig durchgeführte bzw. durch ührbare Verfahren analog Winnaker E. L-, Gene und Klone: Eine Einführung in die Gentechnologie, VCH , Weinheim, 1985; Maniatis, Fritsch, Sambrock:
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Lab- New York, 1989, wobei das eine Keratinase codierende Gen aus dem Mikroorganismus Stamm W z- B. in ein E. coli oder Bacillus insertiert wird und der E. coli dann zur Gewinnung der Keratinase gezüchtet wird. Die Keratinase kann aufgrund ihrer Tempera tur s abili a l dann leicht aus diesem E. coli oder Bacillus durch Erhitzen abgetrennt werden. Da der Mikroorgatiir.mil'! Stamm W als anaerober Mikroorganismus nur langsam gezüchtet werden kann, erlaubt die
erfindungsgemäße Insertion in den leicht zu
kultivierenden E. coli oder Bacillus eine schnellere Anzucht und höhere Enzymausbeuten.

Ein zur Erfindung gehörendes Verfahren zur Hydrolyse von Peptiden, insbesondere von Keratin oder
keratinhaltiger Substanz, wie Federn, Haare oder Hörn, in Oligopeptide und/oder Aminosäuren bei einer
Temperatur > 50°C mittels eines oder mehrerer Enzyme wird derart durchgeführt, daß die Hydrolyse bei einer Temperatur zwischen 50°C und 105°C erfolgt, wobei der pH zwischen 4 und < 11 eingestellt wird und wobei durch die Wahl der zugegebenen Enzymmenge,
insbesondere aber durch Wahl der Temperatur und des pHs Sorge getragen wird, daß der enzymatische Abbau ein mehrfaches von einem eventuell begleitenden chemischen Abbau beträgt. Besonders vorteilhaft ist dabei ein pH von höchstens 10,5. Je höher der pH liegt, desto höher ist auch der Anteil des chemischen Abbaus, wobei gleichzeitig auch die Menge an
racemisierten Aminosäuren oder an Oligopeptiden mit racemisi erten Aminosäuren zunimmt.

Desweiteren kann gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Hydrolyse von Peptiden, insbesondere von Keratin oder keratinhaltiger Substanz, wie Federn, Haare oder Hörn, in Oligopeptiden und/oder Aminosäuren mittels eines oder mehrerer Enzyme bei einer
Temperatur > 70°C durchgeführt werden, bei dem der 1 o

enzymatische Abbau anaerob ist. Besonders günstig ist eine Übertragung des anaeroben Abbaus auf die zuerst beschriebene Verfahrensweise. Grundsätzlich läßt sich die anaerobe Verfahrensweise bei einem pH zwischen 4 und 12 durchführen, wobei wiederum der pH unter 11 und insbesondere bis 10,5 bevorzugt ist- Mit dem anaeroben Abbau lassen sich besonders saubere Aminosäuren gewinnen, insbesondere schwefelhaltige Aminosäuren, wie Cystin und Cystein, werden nicht oxidiert.

Günstig ist auch eine dritte Verfahrensvariante, bei der Peptide, insbesondere Keratin oder keratinhaltige Substanz, wie Federn, Haare oder Hörn, in Oligopeptide und/oder Aminosäuren mittels eines oder mehrerer
Enzyme hydrolysiert werden, wobei ein mesophiler
Mikroorganismus eingesetzt wird, der wie oben
beschrieben zugänglich ist und der ein Gen enthält, das eine bei > 70°C aktive Protease, insbesondere Keratinase codiert, wobei der mesophile
Mikroorganismus bei > 70°C in wässrigem Medium mit dem Protein, insbesondere Keratin oder keratinhaltiger Substanz umgesetzt wird, oder wobei der mesophile Mikroorganismus, der das beschriebene Gen enthält, in wässrigem Medium auf > 70°C erhitzt und das wässrige Medium, ggf. nach Abtrennen ausgefallener Komponenten, wie z. B. Teile des mesophilen Mikroorganismus, mit dem Protein, insbesondere Keratin oder der
keratinhaltigen Substanz versetzt wird- Das die
Protease, insbesondere Keratinase codierende Gen ist insbesondere ein - wie oben beschrieben - in den mesophilen Mikroorganismus insertiertes Gen. Diese Verfahrensweise ist insbesondere für die industrielle Peptidhydrolyse , insbesondere von Federn, geeignet.

D e Verfahrensweise erlaubt ein praktisch
kontaminationsfreies Arbeiten, wobei die erhaltenen Aminosäuren und/oder Oligopeptide verhältnismäßig sauber anfallen bzw. von eventuellen Verunreinigungen, wie z. 8. Teilen des Mikroorganismus, einfach, z. B. durch Filtration, abgetrennt werden können.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein weiteres Verfahren zur Hydrolyse speziell unlöslicher Proteine, wie Keratin oder kera inhaltiger Substanz, wie Federn, Haare oder Hörn, in Oligopeptide und/oder Aminosäuren bei einer Temperatur > 50°C und mittels eines oder mehrerer Enzyme, vorteilhaft, wobei die Hydrolyse mit einer solchen Enzymmenge, bei einem solchen pH und einer solchen Temperatur durchgeführt wird, daß ein zugegebenes unlösliches Substrat, insbesondere Federn, Haare oder Hörn, frühestens nach 3 h aufgelöst ist, wobei besonders vorteilhaft dieses Substrat nach 24 h zumindest zu 50 Gew.-Z aufgelöst ist. Vorteilhaft wird dieses Verfahren nach 1 bis 4 Tagen abgebrochen, wobei dann insbesondere mindestens 80 Gew. -7., vorzugsweise über 90 Gew. -7. und besonders günstig praktisch das gesamte Substrat aufgelöst ist.

Wenn bei den vorgenannten Verfahren Keratin oder kera tinhaltige Substanz, insbesondere Federn,
eingesetzt werden, kann vorteilhaft auf eine
Vorbehandlung, wie z. B. ein Autoklavieren,
insbesondere auf ein Behandeln bei einer Temperatur > 130°C und besonders vorteilhaft auch auf eine
Vorbehandlung > 120°C, verzichtet werden. Solche
Vorbehandlungen sind bei der Hydrolyse von Federn bislang üblich gewesen, hierbei wird jedoch ein beträchtlicher Anteil der Aminosäuren racemisiert.

Erf ndungsgemäß können die vorgenannten Verfahren auch zweistufig durchgeführt werden, d. h. nach Auflösen zumindest eines Teils des eingesetzten Substrats, insbesondere nach Auflösen von mehr als 50 Gew. -7 des eingesetzten Substrats, wird das Hydrolysat. ggf.
unter anderen Bedingungen (Temperatur, pH), mit einer oder mehreren anderen Peptidasen weiterbehandelt. Dies dient der schnelleren oder überhaupt weitergehenden Hydrolyse entstandener Oligopeptide.

Mit zur Erfindung gehört auch ein Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Proteinen, insbesondere von Keratin bzw. von solchen Stoffen, die diese
Proteine beinhalten, insbesondere von Federn, Horπ oder Haaren, wobei die Hydrolyse mit einer der ober beschriebenen Enzymzusammensetzungen und/oder mit dem Mikroorganismus Stamm W durchgeführt wird.
Grundsätzlich sind die oben beschriebenen
Enzymzusammensetzungen in allen erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbar.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen und Figuren näher erläutert.

Es zeigen:

Fig. 1 das pH-Optimum einer erfindungsgemäßen
Enzymzusammensetzung -,

Fig. 2 das Temperatur-Optimum der Enzymzusammensetzung gemäß Fig . 1 ;

Fig. 3 die Enzymakti it t dieser Enzymzusammensetzung;

Fig. 4 die Enzymaktivität analog Fig. 3 unter Zusatz
von Tryptoπ ;

Fig. 5 den enzymatischen Abbau löslicher Substrate;

Fig. 6 den enzymatischen Abbau unlöslicher Substrate
und

Fig. 7 den Abbau von Federn innerhalb von 2 Tagen

Ausführliche Beschreibung / Wege zur Ausführung der Erfindung

Stammcharakterisierung

Der neue Mikroorganismus Stamm W wurde aus einer heißen Quelle der Azoren isoliert. Er läßt sich unter Stickstoff bei 70°C kultivieren. Hierzu lassen sich Hungate-Röhrchen verwenden, die mit einem Medium folgender Zusammensetzung befüllt werden:

K2HP04
NaH2P04
(NH4 ) 2S04
NaCl
CaCl2 x 2 H20
MgS04 x 7 H20
FeCl2 x 6 H20
Trypton
Hefeextra kt
Spurenelemente 1 , 0 ml
Vitamine 1 , 0 ml
Resazurin (1 mg/ml) 1.0 ml
NaHC03 1,0 g
Cystein HCl 0.5 g
aqua dest ad 1,0 1
pH (mit 6 N HCl) 6,0 (nach dem Autoklavieren etwa 6,3)

Spurenelemente :

MnCl2 x 4 H20
CoCl2 x 6 H20
NiCl2 x 6 H20
ZnCl
CuS0
H3BO4
2Mo04 x 2 H20
Na2Se03 x 5 H20

aqua dest ad

Vitaminlösung :

V i tami n B . 2 0,01 g
p-Aminobenzoa t 0,5 g
Liponsä ure 0,5 g
aqua dest ad 1,0 1
pH mit 1 N NaOH 7 , 0

Als Substrat wird dem Medium entweder 0,2 7. Trypton oder unlösliches Protein z. B. in Form einer Feder zugegeben. Die Hunga te-Röhrchen werden anschließend mit Stickstoff begast. Danach erfolgt eine
Sterilisation unter allgemein üblichen Bedingungen wie z. B. bei 120°C für 30 min. Werden allerdings
Strukturproteine eingesetzt, wird bei niedrigeren Temperaturen z. B. bei 100°C für 60 min sterilisiert, damit die natürlichen Proteine nicht denaturieren. Die anschließende Inkubation kann bei hohen Temperaturen erfolgen, insbesondere bei 70°C. Unter anaeroben
Bedingungen wachsen die Zellen in ca. 8 bis 12 h an, wobei ein Abbau der Strukturproteine nach 3 Tagen festgestellt werden kann.

Eine Sporenbildung konnte bei Anzucht auf Sporenmedium mit und ohne Glucose nicht nachgewiesen werden. Über einen Peroxida setest war keine Katalase nachweisbar.

Darüber hinaus weist der neue Mikroorganismus Stamm W folgende Abbaueigenschaften auf:

Substrat Abbau

Lactose
Glucose
Fructose Maltose
Xylose
Amylase
Arabinose
Inulin
Tween 80
HEC (Cellulose)
Pullulan
Glycogen
Stärke
Gelantine
Pepton
Bactopepton
Collagen
Casein
Trypton
Amylopectin
Succinat
Hefeextrakt
Grameigenschaft gramnegativ
KOH-Test keine Reaktion
Xylanaleban

nicht eindeutig

Eine Bestimmung des Guanosin+Cytosin-Gehalts der DNA mittels HPLC ergab durchschnittlich
G + C = 40,0 i 0,6 mol-Z (drei Bestimmungen).
Die Bestimmung erfolgte analog wie in Anal. Biochem.

81. (1977), 461 - 6 für die DNA- Isolierung ; Int. 3 .

Syst. Bact. 19., (1989), 159 - 167 für den DNA-Abbau,

Referenz-DNA sowie G+C-Bestimmung und FEMS Microbiology Letters ____[__ , (1984), 125 - 8 für die chromatographischen Bedingungen beschrieben.

Analytische Säule NUCLEOSIL 100-5C18 (250 x 4 mm) mit Vorsäule NUCLEOSIL 100-5C18 (20 x 4 mm); Temperatur 26°C, Laufmittel 0,6 M (NH4)H2P04) Acetonitril
80 : 6 (v/v), pH 4,4, 0,7 ml/min, Druck ca. 120 bar, Calibrierung mit nichtmethylierter LAMBDA-DNA (Sigma), G + C-Gehalt 49,858 mol-7-, DNA-Abbau mit P1 Nuclease und Dephosphoxylierung mit alkalischer Phosphatase aus Kälberserum (bovine alkaliπe phosphatase).

Herstellung eines Rohextraktes

Zellen einer Fermenterkultur werden (ca. 1 g / 20 ml Na-Phosphat 50 mM pH 6,8-Puffer) per Ultraschall aufgeschlossen. (15 min, 50 7., Sufe 6 - 7, mittlere Beschallungs spitze , Branson Sonifier). Nach
mikroskopischer Kontrolle auf gelungenen Aufschluß wird der Rohextrakt für 20 min, 4°C, 35.000 xg , zentrifugier t . Der so gewonnene Überstand wird für die Enzymtests eingesetzt.

Aktivität: etwa 0.3 - 0.8 U/ml, je nach Aufschluß.

Protein: etwa 1 - 2 mg /ml.

Bestimmung der proteol tischen Aktivität

Bestimmung der proteol tischen Aktivität gegenüber löslichen Proteinen

Das Prinzip der Messung proteoly tischer Aktivität gegenüber löslichen Proteinen beruht darauf, daß durch enzymatische Aktivität aus Proteinen, wie z. B. Casein oder Rinderserumalbumin aromatische Aminosäuren freigesetzt werden. Diese lassen sich photometrisch nach Abstoppen der Reaktion und Ausfällen des
nichtgespaltenen Proteins mit Trichloressigsäure im Überstand bei 280 nm detektieren.

Reaktionsansatz:

0,45 ml 0,25 '/ige (w/v) Caseinlösung (Hammersten
Quality) in einem entsprechenden B t. R-Puffer
(Britton Z* Robinson, 3 . Chem. Soc. (1931). p. 1456. Eine Lösung enthaltend je 0,4 M H3PO4, CH3COOH und H3BO3 in Wasser wird mit 0,2 N NaOH auf den
gewünschten pH eingestellt.) werden auf Eis mit
0,05 ml enzymhaltiger Probe in E-Cups pipettiert und je nach Aktivität bis zu 60 min bei der für das Enzym optimalen Temperatur (80°C) und pH-Wert (10)
inkubiert. Anschließend wird der Ansatz zum Abstoppen und Ausfällen der Proteine mit 0,5 ml 10 Ziger (w/v) Trichloressigsäure (TCA) versetzt, für 15 - 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und dann für 10 min bei
13000 Upm in einer Eppendorf-Zentrifuge (Heraeus
Sepatech, Osterode) zentrifugiert . Die Extinktion des klaren Überstands wird bei 280 nm in einer
Quarzküvette gegen einen nichtinkubierten Leerwert gemessen .

Zur Bestimmung der Enzymaktivit t wird eine
Tyrosin-Eichkurve im Bereich von 0 - 1 μM/Ansatz aufgenommen. Eine Enzyma k tivi t.ä t (1 Unit) wird als diejenige Menge definiert, die 1 μmol aromatische Aminos uren /min freisetzte. Aus der Steigung der Eichkurve ergibt sich folgende Berechnung:

ΔE x 1 x 20.000
U/l =
t [min]

Herstellung der Enzymzusammensetzung

Um die erfindungsgem ße Enzymzusammensetzung zu erhalten, werden die in einer Reinkultur oder
Mischkultur angezogenen Zellen bei 10.000 x g
abgetrennt, so daß sich die Enzymzusammensetzung im Überstand befindet. Von hier aus kann eine
Konzentration z. B. mittels Cros s-flow-Filtra tion oder über Amicon- Kammern vorgenommen werden.

Allerdings hat sich gezeigt, daß ein Teil der in der Enzymzusammensetzung befindlichen Enzyme
membrangebunden ist, so daß zur Enzymgewinnung die Zellen vorteilhaft aufgeschlos en werden. Dieser
Aufschluß kann z. B. mittels Ultraschall oder einer Freπ h-Press erfolgen. Anschließend kann, wie oben beschrieben, eine weitere Konzentration der Enzyme vorgenommen werden.

Charakterisierung der Enzymzusammensetzung

Die erfindungsgemäße Enzymzusammensetzung kann aus einem Enzym oder mehreren Enzymen bestehen. Wird diese Zusammensetzung aus einer den neuen Mikroorganismus enthaltenden Mischkultur gewonnen, können auch
Fremdenzyme anderer Mikroorganismen enthalten sein.

In mehreren Versuchen wurde die Protea seaktivitä t der Enzymzusammensetzung bestimmt (Klingeberg M.,
Haswa F., Antranikian G., (1990), Properties . of extremely thermostable protease from anaerobic
hyperthermophilic bacteria. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 43: 715 - 719). Hierbei werden 0,25 Zige Substratlösungen (Casein in B & R-Pu-Pfer des .
gewünschten pH-Wertes) eingesetzt und die Aktivität wie oben angegeben bestimmt. Fig. 1 zeigt das
pH-Optimum bei 80°C. Dieses liegt im Bereich von pH 4 bis pH 12, vorzugsweise im Bereich von pH 7 bis pH 11, insbesondere im Bereich von pH 9 bis pH 10. Das
Temperaturoptimum gemäß Fig. 2 wurde bei pH 10
ermittelt. Man erkennt eine Enzymaktivitä im weiten Bereich von 50 bis 105°C, vorzugsweise im Bereich von 70 bis 90°C, insbesondere bei 80°C. Zur Bestimmung der Thermostabilit werden nach 15", 30", 1 h, stündlich bis 6 h und nach 20 h Proben entnommen und die
Aktivität bestimmt. Stabil bedeutet, daß zwischen 6 h und 20 h kein nennenswerter (> 10 7) Aktivitätsverlust eintritt .

Einfluß verschiedener Inhibitoren auf die
Proteaseaktivität

Die Hemmwirkung verschiedener Inhibitoren auf die Proteaseaktivität gibt Aufschluß über das aktive Zentrum und den Reaktionsmechanismus der Enzyme, Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und
Diisopropylfluorophosphat (DFP) binden an die
OH-Gruppe des Serins im aktiven Zentrum von
Serinproteasen und hemmen letztere irreversibel.
Ethylendiamintetraacetat Na2-Salz (EDTA) ist ein Metallchelator und hemmt Metalloproteasen . Proteasen, bei denen Cystein im aktiven Zentrum vorliegt, lassen sich durch Jodacetat irreversibel hemmen. Zur
Bestimmung des aktiven Zentrums der thermostabilen Proteasen werden diese zusammen mit entsprechenden Inhibitoren bei Raumtemperatur und pH 7,0 inkubiert, um eine Hydrolyse von DFP und PMSF zu vermeiden.

Reak ionsansatz:
470 μl 0,25 7. (w/v) Casein in 50 mM . pH 10 - Puffer (B R)
25 μl Enzymlösung
5 μl InhibitorStammlösung (s. u.)

Bei Einsatz von 5 μl Inhibitorstammlösung entspricht die Endkonzentration 1 mM . Bei Einsatz von 25 μl
In ibitor."Lösung (Endkonzentration 5 m ) werden
entsprechend nur 450 μl Substratlösung eingesetzt. Die Ansätze werden zunächst ohne Substrat bei
Raumtemperatur (1 h) und anschließend mit Substrat 1 h bei der für das Enzym optimalen Temperatur inkubiert.

Nach der InkuLiation wird die Reaktion mit 500 μl einer 10 Zigen (w/v) Trichlores sigsäurelö sung gestoppt und die verbleibende Aktivität, wie oben beschrieben, bestimmt. Folgende Inhibitorlösungen werden
eingesetzt :

PMSF 17.3 7 (w/v) in Ethanol EDTA 3,56 Z (w/v) in H20 bidest Jodacetat 14.4 Z (w/v) in H20 bidest

Hydrolyse chromogener Peptidsubstra te durch Proteasen des Kulturüberstands (E4os-Wert)

Zur Bestimmung der Substratspezifitä t der Proteasen werden die genannten chromogenen Peptidsubs träte in einer Endkonzentration von 0,2 mM zusammen mit
zellfreiem Rohextrakt inkubiert.

Die Inkubation erfolgt unterhalb der Temperatur- und pH-Optima der Proteasen, um eine thermische bzw.
pH-abhängige, πichtenzymatischee Hydrolyse der
Peptidsubstrate zu vermeiden.

Reaktionsansatz :
900 μl 0,2 mM (w/v) Substra lösung in 50 mM
Na-P-Puffer, pH 7,0
100 μl Enzymprobe
Inkubation für 17 h bei 60°C

Anschließend wird das freigesetzte p-Nitroaπilin sofort gegen einen nicht inkubierten Leerwert bei einer Extinktion von 405 nm gemessen.

SOS-Gelelektrophorese

Das SDS-Gel hat e ne Schichtdicke von 1,5 mm . Die Konzentration des Sammelgels beträgt 4,5 Z (w/v), die des Trenngels 11,5 7. (w/v). Zur Herstellung der G e werden folgende Lösungen eingesetzt:

A r lamidlösung:
Acrylamid 29,2 g
N , -Methylen-Bisacrylamid 0,8 g
H20 dest. a 100 ml

Zur Entfernung ungelöster Partikel wird diese Lösung filtri t.

Trennαelouffer:
Tris (α , ex , α-Tris ( hydroxymethy ) -methylamin ) 18,15 g

SDS 0,40 g

H20 dest. ad 100 ml

Vor der Zugabe von SDS wird der pH-Wert mit
konzentrierter HCl auf 8,9 eingestellt.

Sammelpuffer :
Tris 6,05 g
SDS 0,40 g
H20 dest. ad 100 ml

Vor der Zugabe von SOS wird der pH-Wert mit
konzentrierter HCl auf 6,8 eingestellt.

Ammoniumpersulfat -Lösung :
Ammoniumper sul a 0,10 g
H 20 de s . 0,94 g El trophoresepuffer:
Tris 3.00 g
Glycin 14,40 g
SDS 1,00 g
H20 dest. ad 1000 ml

Die Ammoniumpersulfatlösung wird entweder vor Gebrauch frisch angesetzt oder aber portionsweise in
Eppendorf-Reaktionsgef ßen bei -20°C gelagert und erst kurz vor Gebrauch aufgetaut. Während der
Elektrophoresepuffer stets frisch angesetzt wird, können alle anderen Lösungen mehrere Wochen bei 4°C gelagert werden.

Herstellung der Gele

Zur Herstellung der Plattengele wird zunächst das Trenngel gegossen. Dazu werden

Trenngelpuffer 1 , 4 ml
Acrylamid-Lösung 2,1 ml
H20 dest. 2,6 ml

gut vermischt und mit Hilfe einer Wasserstrahlpumpe entgast. Durch Zugabe von

Ammoniumpersulfatlösung 40 μl
TEMED 6 μl

wird die Polymerisation gestartet und die Lösung so weit in die Kammer gefüllt, bis noch 1 ,5 cm Raum für das Sammelgel verbleibt. Das Über schichten des Gels mit 1 ml H20 dest. verhinder ein Austrocknen. Nach ca. 60 min ist der Polymer isa tions Vorgang
abgeschlossen, und das Sammelgel kann gegossen werden, dazu werden

Sammeigelpuffer 0,70 ml
Acrylamid-Lösung 0,26 ml
H20 dest. 1,04 ml

vermischt, entgast und die Polymerisation durch Zugabe von

Ammoniumper sulfa tlösung 10 μl

TEMED (N , N , N ' , N ' -Tetramethylethylendiamin ) 2 μl

gestartet. Vor dem Gießen des Sammelgels wird zunächst das Wasser vom Trenngel dekantiert. Ein luftblasenfrei in das noch flüssige Gel eingesetzter Kamm dient der Taschenformung .

Vorbereitung der Proben

Bis zu 50 μl Proteinlösung mit bis zu 50 μg Protein werden mit 10 μl Dena urierungspuffer versetzt, der folgende Komponenten enthält:

SDS 2,00 g
2-Mercaρtoethanol 3,00 g
10 M NaP-Puffer, pH 7,0 ad 100 ml

Der Ansatz wird 5 min bei 100°C inkubiert,
anschließend mit 2 μl Bromphenolblau-Lösung sowie einer Spatelspitze Saccharose versetzt und mit einer Hamilton-Spritze auf das Gel aufgetragen.

Durchführung der Elektrophorese

Zum Einwandern der Proben wird zunächst eine konstante Stromstärke von 10 mA/1,5 mm Geldicke und 10 cm
Gelbreite angelegt. Nachdem die Proben in das
Sammelgel eingewandert sind, wird die Stromstärke auf 20 mA erhöht.

Silberf rbung

Bei der gelelektrophoretischen Auftrennung sehr geringer Proteinmengen erfolgt die Detektion der
Proteinbanden durch Anfärben mit Silber, das Gel wird dazu nach der Elektrophorese in den nachfolgend aufgeführten Lösungen auf einem Schüttler inkubiert

Fixierer 60 min
50 7. (v/v) EtOH 3 x 20 min
0,03 7. (w/v) Na2S205 1 min
H20 dest. (3 x gewechselt) 1 min
Silberlösung 20 min

und zweimal mit H20 dest. gespült. Anschließend wird das Gel so lange unter leichtem Schwenken in
Entwicklerlösung inkubiert, bis die Proteirtbanden deutlich sichtbar werden. Die Färbereaktion wird durch Einlegen des Gels in eine 50 mM EDTA-Lösung gestoppt.

In der letztgenannten Lö ung läßt sich das Gel übe mehrere Woche lagern.

Fixierer: Ethanol 30 ml
Essigsäure ' 10 ml
Formaldeh dlösu g (37 7) 50 μl
H20 dest. ad 100 ml

Silbe lösung: AgN03 0,1 g
Formaldehydlösung (37 7) 75 μl
H 20 d es t . ad 100 ml

Entwickler Na2C03 6 g
Na 2S2O5 0,4 mg
Formaldehydlösung (37 7.) 50 μl
HjO dest. ad 100 ml

Nachweis proteolytischer Aktivität im
SDS-Polyacrylamidgel

Enzyme mit proteolytischer Aktivität können indirekt, über die Färbung von Gelatine nachgewiesen werden, die in das Gel eingegossen wird. Dazu wird, wie oben beschrieben, ein 11 Ziges SOS-Trenngel gegossen. In Abweichung wird jedoch anstatt 2,6 ml H20 lediglich 2,0 ml eingesetzt, und die restlichen 0,6 ml durch 1 7 Gelatine in 100 mM Glycinpuffer , pH 8,5 ersetzt.
Dadurch ergibt sich im Gel eine Endkonzentration von 0,1 7. Gelatine. Das Sammelgel wird, wie oben
beschrieben, ohne Gelatine gegossen. Die Vorbereitung der P oben und die Durchfü rung der Elektrophorese erfolgt wie oben. An die Elektrophorese schließt sich eine 60minütige Inkubation des Gels in einer 2,5 Zigen Triton X-100-Lösung bei 4°C an, um SDS aus dem Gel herauszulösen. Anschließend wird das Gel je nach aufgetragener Aktivität für 5 - 30 min in einem 50 mM Puffer unter optimalen Bedingungen (pH 10, 80°C) inkubiert und anschließend für 60 min in Färbelösung fixiert und gefärbt. Banden mit proteolytischer
Aktivität werden nach ca. 3stündigem Entfärben als helle Banden im blau angefärbten Gel sichtbar.

Färbelösung Amidoschwarz 0,1 g
Ethanol 30 ml
Eises sig 10 ml
H20 dest. ad 100 ml

Ent ärber: Ethanol 30 ml
Eisessig 10 ml
H20 dest. ad 100 ml

Gelfiltration auf Superdex 200 (HPLC)

Enz mrohextra t :
1 mg/ml Protein
0,6 U/ml

Säule: Superdex high-load 200 16/60 (120 ml)

Puffe : NaP pH 6.8 Flußrate: 0,5 ml /min

aktiver Pr teinpeak: Im Ausschlußvolumen, ist
(größtes Eichprotein: 200.000)
also größer als 200.000

Einfluß von Metallionen auf die proteolytische
Aktivit t

Metallion ca. 7 Aktivität 1 mM ca. 7. Aktivität 5 mM

AgCl2 0 0

CaCl2 85 117
CoCl2 143 187
CuCl2 17 0
FeCl2 127 0
FeCl3 93 0
MgCl2 171 125
MnCl2 110 120
NaCl 86 116
NaMo04 91 95
NaSe203 96 136
NaW04 75 134
NiCl2 72 44
VOSO4 87 44
ZnCl2 57 37

Die Metallionen werden in einem Puffer, 50 mM Na-P; pH 6,8, gelöst. 50 μl dieser Lösung werden mit 50 μl Rohextrakt für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert, dann werden 400 μl Substrat (0,25 7, pH 10) zugegeben und für 1 h bei 80°C inkubiert. TCA-Fällung und
Aktivitä tsbes timmung wird wie oben beschrieben
durchg führt .

In einem weiteren Versuch wurde das Wachstum des neuen Mikroorganismus auf Komplexmedium mit 0,25 7 Federn als Substrat untersucht und gleichzeitig die
Enzymaktivität ermittelt (Fig. 3). Wird dem
Komplexmedium 0,25 7 Trypton zugesetzt (Fig. 4), steigt die Enzymaktivität deutlich an.

Fig. 5 und 6 zeigen schließlich den Abbau löslicher und unlöslicher Substrate. Nach Zugabe einer
definierten Enzymmenge (0,1 U/ml) wurde der
prozentuale Substratabbau ermittelt, wobei jeweils auf Federsubstrat gewachsene Zellen des neuen
Mikroorganismus (linker Balken, F 1) mit auf Trypton gewachsenen Zellen (rechter Balken, F 2) verglichen wurden .

Ein enzymatischer Proteinabbau kann nach allem mit ganzen Zellen des neuen Mikroorganismus Stamm W durchgeführt werden oder in vitro in Gegenwart einer erfindungsgemäßen Enzymzusammensetzung. Die
in- vitro-Behandlung hat hierbei noch die Möglichkeit, daß eine Proteolyse auch unter anaeroben Bedingungen bei 50 bis 100°C und z. B. bei pH 10 durchführbar ist, wobei die anaerobe Variante (s. o.) bevorzugt wird.

Formblatt für die Hinterlegung von Mikroorganismen

Internationales Aktenzeichen: PCT/


B UDAPESTEΠ VERTR AG ÜB ER DIE INTERNATIONALE
ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN

FÜR. DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN

INTERNATIONALES FORMBLATT

Prof. Dr- G. Antranikian
Dahlienweg 20
2105 Seevetal 1
LEBENSFÄHIGKEITSBESCHEINIGUNG
ausgestellt gemäß Regel 10.2 von der unten angegebenen
INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE

I- HINTERLEGER II- KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS

Name: Prof . Dr. G- Antranikian Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE Dahlienweg 20 zugeteilte EINGANGSNUMMER:
Adresse: 2105 Seevetal 1 DSM 7003
Datum der Hinterlegung oder Weiterieitung :
1992-03-12

in. LEBENSFÄHIGKEITSBESCHEINIGUNG

Die Lebensfähigkeit des unter II genannten Mikroorganismus ist am 1992—03—23 geprüft worden.
Zu diesem Zeitpunkt war der Mikroorganismus
( X )3 lebensfähig
C } nicht mehr lebensfähig

IV. BEDINGUNGEN. UNTER DENEN DIE LEB ENSFÄHIGKEITS PRÜFUNG DURCHGEFÜHRT WORDEN IST4

IV. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE

Name: DSM DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschrif (en) der zur Vertretung der internationalen
MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH Hinterlegungsstelle befugten Person(en) oder des (der) von
ihr ermächtigten Bediensteten:
Anschrift: Mascheroder Weg 1 B
0-3300 Braunschweig
Datum: 1992-03-26
Angabe des Datums der Eπthϊnterlegung- Wenn eine erneute Hinterlegung oder eine Weiterleitung vorgenommen worden ist, Angabe des

Datums der jeweils letzten erneuten Hinterlegung oder Wetterleitung.
' In den in Regel 10.2 Buchstabe a ZifTer iϊ und iä vorgesehenen Fällen Angabe der letzten Lebensfähigkettsprüfung..
Zutreffendes ankreuzen.
Ausfüllen, wenn die Angaben beantragt worden sind und wenn die Ergebnisse der Prüfung negativ waren.
Formblatt DSM-BP/9 (einzige Seite) 0787 HUDAPESTER VERTRAG I DER DIE INTERNATIONALE
ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN

FÜR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN

INTERNATIONALES FORMBLATT

Prof . Dr . G . Antranikian
Dahlienweg 20
2105 Seevetal 1
EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG,
ausgestellt gemäß Regel 7.1 von der unten angegebenen
INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE

I. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS

Vom HINTERLEGER zugeteiltes Betugszeichen: Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
»geteilte EINGANGSNUMMER:
Stamm DSM 7003
i II. WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG

Mit dem unter I. bezeichneten Mikroorganismus wurde
( } eine wissenschaftliche Beschreibung
( X } eine vorgeschlagene taxonomische Bezeichnung
eingereicht.
(Zutreffendes ankreuzen).
III. EINGANG UND ANNAHME

Diese internationale Hinterlegungssteile nimmt den unter I bezeichneten Mikroorganismus an, der bei ihr
am 1992 — 03 -12 (Datum der Ersthinterlegung) eingegangen ist.

IV. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG

! Der unter I bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Internationalen Hinterlegungsstelle am
eingegangen (Datum der Ersthinterlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Ersthinterlegung in eine Hinterlegung gemäß Budapester Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung).
V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE

Name: DSM-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschrift(en) der zur Vertretung der internationalen
MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH Hinterlegungsstelle befugten Person(en) oder des (der) von
ihr ermächtigten Bediensteten:
Adresse: Mascheroder Weg 1 B
D-3300 Braunschweig 3>

Datum: 1992-03-26
I Falls Regel 6.4 Buchstabe d zutrifft, ist dies der Zeitpunkt, zu dem der Status einer internationalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist.

Formblatt DSM-BP/4 (einzige Seite) 0291 3 -,
Zur Vorlage beim Deutschen Patentamt

I- Freigabeerklärung
Hiermit wird das Hϊnterlcgungsϊnstitut Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH
Mascheroder Weg lb
D-3300 Braunschweig
unwiderruflich ermächtigt, Proben des Mikroorganismus
Stamm W (Bezeichnung des Anmelders)
ab der ersten Veröffentlichung der Anmeldungsumerlagcn (durch Offenlegung oder Patenterteilung) auf Anforderung an jeden Dritten abzugeben- Für die mit dem Patenterteilungsverfähien befaßten Behörden und Gerichte gilt die Freigabeeikl-ärung auch schon vor der eisten Veröffentlichung der Anmeldungsuntcrlagen.
Auf das Recht zur Rückforderung oder Zσstörong der Kultur des Mikroorganismus ab der ersten Veröffentlichung der Anmeldungsunteriagen wird unwiderruflich vcrzϊchte
Die Abgabe der Probe soll -tu folgenden Bedingungen erfolgen:
Soweit nicht Bestimmungen des -ffinteriegungslaπdes oder Hintelegungsüistituts eine Freigabe ohne Bedingungen vorsehen, muß der Empfänger gegenüber einer Hinterlegungsstelle Namen und Adresse angeben, die dem Hinterleger von der Hinteriegungsstelle auf Wunsch mitgeteilt werden sowie eine verpflichtende Eiklä-nmg gegenüber dem Hinterleger abgeben, bis zum Ablauf des Patentschutzes
a) die Probe nicht an andere Personen weiterzugeben,
b) die Probe nichtaus dem Geltungsbereich des Patentgesetztes zu bringen.



EL Bestätigung
Es wüd folgendes bestätigt:
Der oben bezeichnete Mikroorganismus ist in vermehrungsfähigem Zustand
am hier hinterlegt worden und hat die Hinterlegungsbezeichnung erhalten- Die Dauer der Hinterlegung beträgt mindestens 20 Jahre, gerechnet von dem auf den Anmeldetag der oben genannten Patentanmeldung folgenden Tag, d.h. vom . 19 , zuzüglich einer Nachfrist von fünf Jahren nach Eingang des letzten Antrags auf Abgabe einer Probe bzw. nach Ablauf der gesetzlichen Laufdauer des auf die oben genannte Patentanmeldung erteilten Patents- Vermehrungsfähige Proben dieser Kultur weiden während des gesamten Zeitraums unter den oben genannten Voraussetzungen nach Maßgabe der nationalen Bestimmungen über den Verkehr mit den Mikroorganismen an den abgegeben, der die hierfür vorgesehene Gebühr entrichtet. Vor Ablauf der genannten Fristen kann die Hinterlegung durch uns beendet weiden, wenn der M---αoorganismus in eine andere Sammlung überführt wird, die die angegebene Aufbewah-rangsdauer und den freien Zugang zum Mto-torganismus gewährleistet.
Für die Ausfuhr der Kultur in die Bundesrepublik Deutschland bestehen
derzeit keine Beschränkungen,
die folgenden Beschränkungen;

Datum
(Hinte-flegungsinstitut) 3LOAPESTER VERTRAG ÜBER DIE I TERNATIONALE
ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN

FÜR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN

ERKLÄRUNG BEI ERSTH1NTERLEGUNG
(REGEL 6.1)
Von der Hinterlegungsstel le auszufül len:
An DSM-Aufnahπ-enuimer:
DEUTSCHE SAMMLUNG VON M1KR0ORGANISHEN
UND ZELLKULTUREN GubH Eingangsdatuπ der Kul tur:
Mascheroder Weg 1b
3300 Brai-nschueig

BAKTERIEN/PILZE

DER UNTERZEICHNETE HINTERLEGT DEN NACHSTEHEND BEZEICHNETEN MIKROORGANISMUS AUFGRUND DES BUOAPESTER VERTRAGES UND VERPFLICHTET SICH, DIE HINTERLEGUNG WÄHREND DER IN REGEL 9.1 GENANNTEN DAUER NICHT ZURÜCKZUNEHMEN"2



1 Die DSM nii-mt zur Hinterlegung ausschlieβlich Mikroorganismen an, die gemäß DIN 58956 (Beiblatt 1) Teil 1, Medizinische Mikrobiologie, ISBN 3-410-12028-9, zu den Risikogruppen I oder II gehören, bzw. unter Anwendi-ng der LaborsicherheitsnaBnah en L1 oder L2 entsprechend den "Richtlinien zu» Schutz vor Gefahren durch in-vitro neukontoinierte Nukleinsäuren" (5. überarbeitete Fassung, BMFT) bearbeitet werden können. Dieses Fomblatt kam auch verwendet werden, wenn der Unterzeichnete eine Hinterlegung eines Mikroorganis- nus, die er selbst oder sein Rechtsvorgänger auβerhalb des Budapester Vertrags bei derselben Hinterleguigs- stelle vorgenommen hat, in eine Hinterlegung nach dem Budapester Vertrag uπuandelt. Dabei ist unerheblich, ob die Ersthinterlegt-ng vor (Regel 6.4 Buchstabe d) oder nach dem Zeitpunkt stattgefunden hat, zu dem die Stelle den Status einer internationalen Hinterlegungsstelle erworben hat.
Num-er, Symbole usw., die der Hinterleger dem Mikroorganismus zugeteilt hat.
Es wird dringend empfohlen, die taxonomische Bezeichnung und/oder die wissenschaftliche Beschreibung des Mikroorganismus (unter VII.) anzugeben.
Ankreuzen, wenn auf einem besonderen Blatt weitere Angaben eingereicht werden.
Formblatt DSM-BP/1-Bakterien/Pilze (erste Seite) 0288 A I-AGS 1

II - Züch-t-ungsbedingungen

Mediu :


Substrat: 1 Feder pro Hungate-Röhrchen [Trypton 0,2 %]

Die Hungates werden beim Abfüllen mit N2 begas .
Sterilisation erfolgt bei 100 °C für 60 min, bei höheren Temperaturen wird die Federstruktur zu stark
denaturiert .
Inkubation: bei 70 °C anaerob. Die Zellen wachsen in 8-12 h an. Federabbau kann nach 3 Tagen festgestellt werden.

Spurenelemente :



CuS04 0,5 0,2 g
0, : g
0, 1 g
0,03 g
1,0 1

Vitaminlösung :



pH mit 1 N NaOH 7,0

ERSATZBLATT III. AUFBEUAHRUNGS8EDINGUNGEN c .-

Als Flüssigkultur unter N -Atmosphäre bei 4°C im Komplexmedium. Das Substrat ist entweder Feder oder Trypton.
Tryptonmedium + 1,5 % Agar. Wachstum auf Λgarplatten bei 70°C unter —Atmosphäre.

IV. BEDINGUNGEN FÜR DIE LEBENSFÄHIGKEITSPRÜFUNG C y

Trübung- Zellzahl auf Agarplatten. Mikroskopische Kontrolle .

V. BESTANDTEILE DER HISCHKULTUR C enn zutreffend) C i- Beschreibtng der Bestandteile:

Verfahren, die die Prüfing auf Lebensfähigkeit der Bestandteile ermöglichen:

Ankreuzen wem auf einem gesonderten Blatt weitere Angaben eingereicht werden-

Formblatt DSM-BP/1 BakterienPilze Czueite Seite) 0288

ERSATZBLATT VI. EIGENSCHAFTEN, DIE FÜR DIE GESUNDHEIT OOER DIE UHUELT GEFÄHRLICH SIND
Risikogruppe des unter 1. genannten Hikroorganismjs gemass DIN 58956 (Beiblatt 1) Teil 1, Medizinische Hikrobiologie, ISBN 3-410-12028-9:

Der zu hinterlegende Hikroorganismjs darf -nter folgenden Sicherheitsmassnah-nen gehanc-habt werden:
( ) L1 ( ) L2
C ) L3 ( ) L4
Der Mikroorganisπus hat folgende Eigenschaften, die für die Gesundheit oder die Umwelt gefährlich sind oder sein können:
Bitte angeben:

( X) Dem Unterzeichneten sind derartige Eigenschaften nicht bekannt.
Uenn der Mikroorganismus genetisch manipuliert ist:
1. Bitte alle relevanten genetischen Eigenschaften angeben:
generelle genetische
Rekombination (rec):
Modifikation:
Restriktionen:
Sensitivi täten:
Resistenzen:
Auxotrophien:
2- Bezeichnung der Spenderorganismen, deren Nukleinsäure in das Plasmid kloniert wurde:

3. Unbedingt angeben (ohne diese Angaben kann die Hinterlegung in der .DSM nicht in Kraft treten), ob die klonierten subgenomisehen Fragmente des Spenders (der Spender) nachqewiesenermassen kein pathogenes Potential haben
trifft zu ( )
oder ob die subgenomisehen Fragmente des Spenders (der Spender) ein pathoge es Potential haben
trifft zu ( )
falls letzteres zutrifft gilt folgendes:
Die Hinterlegung des Plasmids in der DSM kann gemäss Verpflichtung durch die ZKBS^ nur in Kraft treten, wem der DSM eine Kopie der Ergebnisse der Sicherheitsüberprüfung durch die ZKBS
vom Hinterleger zugesandt wird.
Die DSM nimmt zur Hintertegi- g aussc lief!lieh Mikroorganismen an, die gemäß OIN 58956 (Beiblattl ) Teil 1, Medizinische Mikrobiologie, ISBN 3-410-12028-9, zu den Risikogπ-ppen I oder II gehören, bzw. inter Anwendung der LaborsicherheitsmaSmahmen L1 oder L2 entsprechend den "Richtlinien zun Sc-hutz vor Gefahren durch in-vitro neukombinierte Nukleinsäure" (S. überarbeitete Fassung, BMFT) bearbeitet werden können.
5 Ankreuzen, wem auf einem besonderen Blatt weitere Angaben eingereicht werden.
ZKBS = Zentrale Komnission für Biologische Sicherheit

Forablatt 0SM-BP/1-8akterien/Pilze (dritte Seite) 0288

ERSATZBLATT

Forublatt DSH-BP/1-Bakterϊeπ/Pilze (vierte und letzte Seite) 0288 ANLAGE 2

VII . Wissenschaf liche Beschreibung

Das Ba terium ist in der Lage auf Komplexmedium bei 70°C zu wachsen. Nach 10 h Wachstum wird die stationäre Phase erreicht. Proteaseprodukrion nimmc ebenfalls zu. 90% des Enzyms ist zeiigebunden. Die Kultivierung wird unter N2~ Begasung und Rühren (ca. 200 upm) durchgeführt. Die
Zellen sind stäbchenförmig.

Substra Abbau
Lactose
Glucose
Fructose +
Maltose +
Xylose +
Arabinose
Inulin
Tween 80
HEC (Cellulose)
Pullulan +
Glycogen +
Stärke +
Gelatine
Pep on +
Bactopepton +
Collagen
Casein +
Trypton +

Grameigenschaft :
Nach KOH-Test und L-Aminopeptidasetest handelt es sich um keine Gramnegativen Organismen. Die Gramfärbung ist bislang nicht gelungen.

ERSATZBLATT Sporen :
Sporen konncen nach Anzucht: auf Sporenmedium mir und ohne Glucose nicht: gefunden werden . Auch in alten Kulturen nicht .

Katalase:
Mit dem Peroxidasetest konnte keine Katalase nachgewiesen werden.

ERSATZBLATT