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1. WO1993018134 - MICROORGANISME, SOUCHE W, COMPOSITION ENZYMATIQUE QU'IL PERMET D'OBTENIR, UTILISATION DU MICRO-ORGANISME ET PROCEDE D'HYDROLYSE, NOTAMMENT DE LA KERATINE

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[ DE ]
Patentansprüche

1. Mikroorganismus Stamm W, hinterlegt unter
DSM 7003.

2. Enzymzusammensetzuny , erhältlich aus einer den Mikroorganismus nach Anspruch 1 beinhaltenden Kultur, wobei der Kulturüberstand abgetrennt und gegebenenfalls konzentriert wird.

3. Enzymzusammensetzung , erhältlich aus einer den Mikroorganismus nach Anspruch 1 beinhaltenden Kultur, wobei die Zellen au geschlossen werden

4. Enzymzusammensetzung nach Anspruch 2 oder 3, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß die Mikroorganismen zur Enzymproduktion bzw. Enzyminduktion in einem Tryptonmedium kultiviert werden .

5. Enzymzusammensetzung, insbesondere nach einem der Ansprüche 2 bis 4,
d a d u r c h g e k e n n z e i c n e t, daß diese ein Enzym oder mehrere Enzyme enthält und Proteaseaktivit t besitzt, wobei

das Temperaturoptimum (bei pH 10) im Bereich von 70 bis 90°C, insbesondere bei 80°C liegt;

das pH-Optimum (bei 80°C) im Bereich von pH 7 bis pH 11, insbesondere im Bereich von pH 9 bis pH 10 liegt;

Gel-filtra tion ein Enzym oder Enzymkomplex mit einem Molekulargewicht von ca. 200 000 Dalton ausweist und eine Molekulargewich sbestimmung mit einem SDS-Aktivitä tsgel zwei Banden im Bereich zwischen ca. 200.000 und ca. 330.0 P. '-zeigt;

der E o5~Wert (gegen Blindwert) nach 17
Inkubation bei 60°C, 0,2 M Substrat in
Phosphatpu er pH 7 und 0,3 mg/ml
Enzymrohextrakt, Meßstrecke 1 cm bei
N-Succinyl-Phe-pNA, N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA und Z-Arg-pNA > 0,5, bei H-Gly-Glu-pNA zwischen 0,3 und 0,5, bei Acetyl-Ala-pNA zwischen 0,1 und 0,3 und bei Benzoyl-DL-Arg-pNA Z-Gly-Pro-pNA , Benzoyl-Lys-pNA , Z-Arg-pNA unα Acetyl-Tyr-pNA unter 0,1 liegt;

die folgenden Inhibitoren bei den angegebenen Konzentra ionen etwa die folgenden
Res aktivit ten ergeben:

Inhibitor Restakt. Restakt- ( 1 M) ( 5 mM)

ohne
Pefabloc SC (Ser. )
PMSF (Ser. )
EDTA (Metallo. )
odoacetat (Cyst.J
die Thermos tabilitä ten wie folgt sind:

- bei pH 7 und 8,5 über 20 h bei 70°C. und 80°C
stabil ,
- bei 90°C nach 4 h weniger als 10 '/
Restaktivit ,

- bei pH 10, 80°C und 90°C nach 15 min
Totalverlust deι~ Aktivität
- bei 70°C etwa 40 '/ Restaktivit t nach 6 h
nach 20 h Totalverlust.

Verwendung des Mikroorganismus nach Anspruch 1 und/oder der Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 5 zum Abbau von Proteinen
insbesondere Keratin bzw. von solchen Sto fen, die diese Proteine beinhalten, insbesondere von
Federn, Hörn oder Haaren.

7. Verwendung des Mikroorganismus nach Anspruch 1 zur Isolierung eines eine Keratinase codierenden Gens und/oder zur Insertion eines eine Keratinase codierenden Gens in einen anderen Mikroorganismus.

8. Verfahren zur Hydrolyse von Peptiden, insbesondere von Keratin oder keratinhaltiger Substanz, wie Federn, Haare oder Hörn, in Oligopeptide und/oder Aminosäuren bei einer Temperatur > 50°C und mittels eines oder mehrerer Enzyme, a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t,
daß die Hydrolyse bei einer Temperatur zwischen
50°C und 105°C und bei einem pH zwischen 4 und
< 11 erfolgt, wobei der enzymatische Abbau ein
Mehrfaches von einem eventuell begleitenden
chemischen Abbau beträgt-

9. Verfahren zur Hydrolyse von Peptiden, insbesondere von Keratin oder keratinhaltiger Substanz, wie
Federn, Haare oder Hörn, in Oligopeptide und/oder Aminosäuren mittels eines oder mehrerer Enzyme bei einer Temperatur > 70°C,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß der Abbau anaerob durchgeführt wird.

10- Verfahren nach Anspruch 8,
d a d u r c g e k e n n z e i c h n e t daß die Hydrolyse anaerob durchgeführt wird .

11- Verfahren nach Anspruch 9,
d a d u r c h g e k e n n z e i c n e t, daß die Hydrolyse bei einem pH zwischen 4 und 12 durchgeführt wird.

12. Verfahren zur Hydrolyse von Peptiden, insbesonder von Keratin oder keratinhaltiger Substanz, wie Federn, Haare oder Hörn, in Oligopeptide und/oder Aminosäuren mittels eines oder mehrerer Enzyme, d a d u r c h g e e n n z e i c h n e t,
daß man einen mesophilen Mikroorganismus, der ein inse tiertes Gen enthält, das eine bei > 70° C
aktive Peptidase, insbesondere Keratinase kodiert, bei > 70°C in wässrigem Medium mit einem Peptid , insbesondere mit Keratin oder ker tinhaltig
Substanz umsetzt, oder daß man den Mikroorganismus im wässrigen Medium auf > 70°C erhitzt und das
wässrige Medium, gegebenfalls nach Abtrennen
ausgefallener Komponenten, mit einem Peptid,
insbesondere mit Keratin oder der kera tinhaltigen Substanz versetzt.

13. Verfahren zur Hydrolyse gemäß .einem der Ansprüche 8 - 12 ,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß das Keratin oder die keratinhaltige Substanz, insbesondere Federn, vor der Hydrolyse nicht bei einer Temperatur 120°C vorbehandelt werden.

14. Verfahren zur Hydrolyse gemäß einem der Ansprüche 8 - 13 ,
d a d u r c h g e k e n n z e i c n e t, daß das Hydrolysat nach Auflösen von ind.
50 Gew. -7. des eingesetzten Substrats mit einer oder mehreren anderen Peptidasen weiterbehandelt wird .

15. Verfahren zur Hydrolyse von Keratin oder
keratinhaltiger Substanz, wie Federn, Haare oder
Hörn, in Oligopeptide und/oder Aminosäuren bei einer Temperatur > 50°C und mittels eines oder mehrerer Enzyme, insbesondere nach einem der
Ansprüche 8 - 14,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß die Hydrolyse mit einer solchen Enzymmenge, einem solchen pH und einer solchen Temperatur durchgeführt wird, daß ein zugegebenes unlösliches Substrat frühestens nach 3 h aufgelöst ist.

16. Verfahren zur Hydrolyse gemäß Anspruch 15, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß die Hydrolyse mit einer solchen Enzymmenge, einem solchen pH und einer solchen Temperatur durchgeführt wird, daß ein zugegebenes unlösliches Substrat nach 24 h zu mindestens 50 Gew.-Z
aufgelöst, ist.

17. Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von
Proteinen, insbesondere Keratin bzw. von solchen Stoffen, die diese Proteine beinhalten,
insbesondere von Federn, Hörn oder Haaren,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e , daß die Hydrolyse mit einer Enzymzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 2 bis 5 und/oder mit dem Mikroorganismus gemäß Anspruch 1 durchgeführt wird .