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1. (WO1993010257) PROCEDE DE DETERMINATION DE LA QUANTITE D'UN FRAGMENT D'ADN D'INTERET PAR UNE METHODE D'AMPLIFICATION ENZYMATIQUE D'ADN
Dernières données bibliographiques dont dispose le Bureau international   

N° de publication :    WO/1993/010257    N° de la demande internationale :    PCT/FR1992/001059
Date de publication : 27.05.1993 Date de dépôt international : 13.11.1992
Demande présentée en vertu du Chapitre 2 :    07.06.1993    
CIB :
C12Q 1/68 (2006.01)
Déposants : INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM) [FR/FR]; 101, rue de Tolbiac, F-75013 Paris (FR) (Tous Sauf US).
INSTITUT PASTEUR [FR/FR]; 28, rue du Docteur-Roux, F-75015 Paris (FR) (Tous Sauf US).
PANNETIER, Christophe [FR/FR]; (FR) (US Seulement).
COCHET, Madeleine [FR/FR]; (FR) (US Seulement).
DARCHE, Sylvie [FR/FR]; (FR) (US Seulement).
KOURILSKY, Philippe [FR/FR]; (FR) (US Seulement)
Inventeurs : PANNETIER, Christophe; (FR).
COCHET, Madeleine; (FR).
DARCHE, Sylvie; (FR).
KOURILSKY, Philippe; (FR)
Mandataire : WARCOIN, Jacques; Cabinet Regimbeau, 26, avenue Kléber, F-75116 Paris (FR)
Données relatives à la priorité :
91/14089 15.11.1991 FR
Titre (EN) METHOD FOR DETERMINING THE QUANTITY OF A DNA FRAGMENT OF INTEREST BY ENZYMATIC AMPLIFICATION OF DNA
(FR) PROCEDE DE DETERMINATION DE LA QUANTITE D'UN FRAGMENT D'ADN D'INTERET PAR UNE METHODE D'AMPLIFICATION ENZYMATIQUE D'ADN
Abrégé : front page image
(EN)The present invention relates to a method for determining the quantity of a DNA fragment of interest in a sample to be analysed by enzymatic amplification in vitro of said fragment, characterized in that: 1) their is added to the sample to be analysed containing the DNA fragment of interest a standard DNA fragment different from the DNA fragment of interest but which may be amplified by the same primer oligonucleotides, the standard DNA fragment and the DNA fragment of interest differing in sequence and/or in size by not more than 10 %, and preferably not more than 5 nucleotides per strand; 2) the DNA fragment of interest and the standard DNA fragment are co-amplified with the same primers, preferably up to saturation of amplification of the DNA fragment of interest; 3) there is added to the reaction medium obtained in step 2): either two types of specific marked probe nucleotides, each respectively of the DNA fragments of interest and standard, and differing from the amplification primer oligonucleotides of step 2), or one or a plurality of marked primer oligonucleotides specific to the interest and standard DNA fragments and different from the primers of step 2), and one or more additional amplification cycles are carried out with the primer or primers so that, after denaturation of DNA, the primer or primers are hybridized with said fragment in a site appropriate for an extension by DNA polymerase generates marked DNA fragments having different sizes and/or sequences or with different markers whether they originate from DNA fragments of interest or standard fragments respectively, and 4) the initial quantity of DNA fragment of interest is determined as being the product of the initial quantity of standard DNA fragment and the ratio between the quantity of interest DNA fragment amplified and the quantity of standard DNA fragment amplified, ratio which is similar to that of quantities of marked DNA fragments originating respectively from amplified interest and standard DNA fragments obtained in step 3).
(FR)La présente invention a pour objet un procédé de détermination de la quantité d'un fragment d'ADN d'intérêt dans un échantillon à analyser par une méthode d'amplification enzymatique in vitro dudit fragment, caractérisé en ce que: 1) on ajoute à l'échantillon à analyser contenant le fragment d'ADN d'intérêt, un fragment d'ADN standard différent du fragment d'ADN d'intérêt mais amplifiable par les mêmes oligonucléotides amorces, les fragments d'ADN standards et d'intérêt ne différant en séquence et/ou en taille de pas plus de 10 % de préférence pas plus de 5 nucléotides par brin, 2) on co-amplifie les fragments d'ADN d'intérêt et standard avec les mêmes amorces, de préférence jusqu'à saturation de l'amplification du fragment d'ADN d'intérêt, 3) on ajoute dans le milieu réactionnel obtenu à l'étape 2): soit deux types d'oligonucléotides marqués sondes spécifiques, chacun respectivement des fragments d'ADN d'intérêt et standards et différents des oligonucléotides amorces d'amplification de l'étape 2), soit un ou plusieurs oligonucléotide(s) amorce(s) marqué(s), spécifique(s) aux fragments d'ADN d'intérêt et standards, et différents des amorces de l'étape 2), et on effectue un ou quelques cycle(s) d'amplification supplémentaire(s) avec la ou lesdites amorce(s), de sorte que, après dénaturation de l'ADN, la ou lesdites amorce(s) s'hybride(nt) avec lesdits fragments en un site approprié pour qu'une élongation par l'ADN polymérase génère des fragments d'ADN marqués de tailles et/ou de séquences différentes ou avec des marqueurs différents selon qu'ils proviennent des fragments d'ADN d'intérêt ou standards respectivement, puis 4) on détermine la quantité initiale de fragment d'ADN d'intérêt comme étant le produit de la quantité initiale de fragment d'ADN standard et du rapport entre la quantité de fragment d'ADN d'intérêt amplifié et la quantité de fragment d'ADN standard amplifié, rapport qui est identique à celui des quantités des fragments d'ADN marqués provenant respectivement des fragments d'ADN d'intérêt et standards amplifiés obtenus à l'étape 3).
États désignés : CA, JP, US.
Office européen des brevets (OEB) (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, SE).
Langue de publication : français (FR)
Langue de dépôt : français (FR)