Traitement en cours

Veuillez attendre...

Paramétrages

Paramétrages

1. WO1988003407 - PROCEDE POUR L'OBTENTION DU PHOSPHATIDILINOSITE A PARTIR D'UNE SUBSTANCE BIOLOGIQUE

Note: Texte fondé sur des processus automatiques de reconnaissance optique de caractères. Seule la version PDF a une valeur juridique

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Ф0(Ш ТИДИЛИНОЗИТА

ИЗ ОЛОГИЧЕСКаГО ОБЪЕКТА

Область техники

Настоящее изобретение относится к области полу- чения липидов и более точно к способу получения ф ос- фа тидилинозита из биологического объекта.

Фосфа ТИДИЛЙН ОЗЙТ относится к классу фосфолипидов и используется в качестве биохимического реактива : для приготовления мембранных систем, моделирующих процессы живых организмов ; для создания липосом, слу- жащих для переноса в клетки живых организмов чужерод- ной генетической информации ; для переноса через мем- бранные барьеры организма чу еродных белков, вакцин и ферментов; для доставки в ткани - мишени лекарствен- ных препаратов и- других агентов.

Предшествующий уровень техники

Известен ряд способов получения фосфа тидилинози- та из различных биологических объектов, например моз- га и сердца животных, из бактерий, семян. Известен также способ получения фосфа идилинозита из дрожжей ( Препаративная химия липидов под редакцией Бергельсо- на Л.Д. и Дятловицкой Э.В. , 1981, Наука (Москва) , с. 178) .

Способ получения фосфа тидилинозита из дрожжей включает автолиз дрожжей с помощью толу ола в течение 5 часов, экстракцию фосфолипидов смесью хлороформ-метанол ( 1: 1) в течение 7 часов; фильтрацию экстракта с промывкой на фильтре осадка указанной смесью орга-нических растворителей; перемешивание в течение 20 часов фильтрата с дистиллированной водой; разделение фильтрата на водную фазу и хлороформную фазу ; упари-вание - хлороформной фазы; обработку упаренной хлоро-формной фазы изопропиловым спиртом и. последующее ее фильтрование через стеклянный фильтр. Далее из полу-ченного фильтрата фосфолипиды разделяют на колонке с силикагелем путем последовательного смыва их сначала 5-7 литрами смеси хлороформ : метанол : аммиак ( 80: 20:2) , а затем 1-2 литрами этилового спирта и таким образом выделяют аммониевую о оль фосфатидилинозита, которую затем переводят в натриевую соль.

Указанный способ требует большого расхода доро-гостоящих органических растворителей. 1ак, для получе-ния I г фосфатидилинозита необходимо более пяти лят-ров хлороформа, более тре литров метанола, около ли-тра этилового спирта и других растворителей. Способ включает много трудоемких операций, требующих больших затрат времени. Все это значительно удорожает стои-мость конечного продукта ( 1 г фосфатидилинозита стоит по каталогу Galbiociiem 1986 г. 6950 долларов). Работа с большим количеством органических растворите-лей создает вредные условия труда, что затрудняет со-здание нормальных условий для обслуживающего персояа-ла.

Раскрытие изобретения

Задача настоящего изобретения состояла в разра-ботке такого способ получения фосфатидилинозита, ко-торый позволил бы существенно уменьшить расход орга-нических рас ворителей, уменьшить трудоемкость и за-траты времени, улучшить условия труда и значительно снизить стоимость продукта.

Поставленная задача была решена способом получе-ния фосфатидилинозита из биологического объекта путем его гомогенизации я экстракции продукта, который, со-гласно изобретению, характеризуется тем, что включа-ет:

- гомогенизацию биологического объекта в водно-солевом растворе с молярно концентрацией от 0,005 до I М при рН в пределах от 5,0 до 11, 0;

- разделение полученного гомогената на бесклето-чную водно-солевую фазу , содержащую частицы белок-фосфатядилияозитяого комплекса, и осадок, содержащий неразрушенные клетки и частицы других фосфолипядов, путем центрифугирования при ускорении силы тяжести в пределах от 3000 до 30000 g или фильтрацией на фильтре с размером пор от З' до 50 мкм;

- выделение из бесклеточной водно-солевой фазы частиц белок-фосфатидилинозитного комплекса ;

- экстракцию фосфатидилинози а из выделенных ча- стиц белок-фосфатидилинозитного комплекса.

Выделение частиц белок £осфатидилинозитного ком- плекса , из бесклеточной водно-солевой фазы можно осу- ществлять гельхроматографией на сорбенте , спос обным разделять вещества с молекулярной массой более I мил- лиона Дальтон или ультрафильтрацией на фильтре с раз- мером пор не менее 0, 2 мкм. Кроме того, выделение час- тиц белок-фосфатидилинозитного комплекса из указанной водно-солевой фазы можно осуществлять путем обра ботки ее щелочными или нейтральными протеазами , при этом названные частицы слипаются и легко отделяются. Этот вариант выделения частиц белок-фосфатидилинозитного комплекса является предпочтительным, так как прост в реализации , а указанный реагент - протеазы доступны и сравнительно недорогие.

Из выделенных частиц белок-фосфатидилднозитного к омплекса целевой продукт выделяют экстракцией мета- нолом или его смесью с хлороформом или дистиллирован- ной водой. В качестве биологического объекта рекомея-ду ется использовать продукты переработки семян злако-вых растений, так как это сырье является более доступ-. ным, дешевым и дает высокий выход продукта.

Предлагаемый способ позволяет по сравнению с из-вестным способом в сотни раз уменьшить расход органи-ческих растворителей, в 2-4 раза уменьшить время про-цесса , значительно снизить стоимость продукта и улуч-шить условия труда.

Способ может быть легко реализован в промышлен-ных условиях.

указанные преимущества изобретения будут понятны из нижеследующего подробного описания способа получе-яия фосфатидилинозита.

В качестве биологического объекта можно исполь-зовать семена растений, продукты их переработки, кор- ни, листья, стебли, а также животные ткани и микро-организмы, но предпочтительно использовать семена зла-ковых культур и продукты их переработки, например от-руби. Это предпочтение объясняется тем, что указанное сырье доступно и дешево и оно. позволяет получать вы-сокий выход фосфатидилинозита.

Биологический объект подвергают гомогенизации путем его растирания в ступке или в ножевом гомогени-заторе или в другом подходящем устройстве.

Согласно изобретению, гомогенизацию биологичес-кого объекта проводят в водно-солевом растворе с мен лярной концентрацией от 0, 005 до I М. Это предел концентраций соли определяется тем, что концентрация соли в воде менее, чем 0, 005 М. нежелательна, потому что приводит к растворению белок- осфатидилияозитного комплекса и получение продукта Судет затруднено. Вер-хяий предел молярно концентрации соли может сыть вы-ше I М вплоть до предела растворимости взятой соли при комнатной температуре. Однако целее оооразно верх-ний предел соли ограничить I М. Увеличени е молярно концентрации соли выше I М не увеличивает выхода про-дукта, затрудняет его получение и приводит к яеоправ-данному расходу реагента. Сптимальной молярной концен-трацией соли является 0, 05-0, 1 М.

Для приготовления водно-солевого раствора можно использовать любые органические или неорганические соли^кроме солей, обладающих хаотропными свойствами, способными разрушать оелок-фосфатидилинозитный комп-леке. Наиболее предпочтительно использовать соли с нейтральными или слабощелочными свойствами, например хлористый натрий, натриевые или калиевые соли фосфор-ной кислоты, а также хлористые, фосфатные или сульфат-ные соли трисоксиаминометана.

Согласно изобретению, гомогенизацию биологичес-кого объекта проводят в водно-солевом растворе, имею-ющйм рН, равный 5- II. Этот предел рН водно-солевого раствора определяется тем, что при рН ниже,- чем 5 и выше II происходит разрушение частиц белок-фосфатпди- ЛПЯОЗЙТЯОГО комплекса, что недопустимо.

фи гомогенизации названного объекта в указанном водно-солевом растворе происходит разрушение клеток биологического объекта с выделением в водно-солевую фазу частиц белок-фосфатидилинозитяого комплекса. Для отделения частиц белок-фосфатидилинозитяого комплекса от неразрушенных клеток и частиц, содержащих другие фосфолипиды, гомогенат, согласно изобретению, подвер- гают центрифугированию или фильтрации. Центрпфугиро- вание гомогената проводят при ускорении силы тяжести в пределах от 3000 до 30000 g . Указанный предел опре- деляется тем, что при центрифугировании менее 3000 частицы, содержащие другие фосфолипиды, не будут оса- ждаться и останутся в водно-солевой фазе, что приве- дет к загрязнению фосфатидилинозита другими фосфоли- пидами.

При центрифугировании выше 30000 g происходит осаждение частиц белок-фосфатидилинозитного комплек- са, что существенно снижает выход продукта. Сптималь- ным пределом ускорения силы тяжести при цеятрифугиро- вании является 8000-10000 g .

Разделение гомогената можно осуществлять фильт-рацией на фильтре с размером пор 3-50 мкм. Фильтрова- ни е гомогената на фильтре с размером пор менее 3 мкм нежелательно, так как приводит к задержке на фильтре частиц белок-фосфатидилинозитного комплекса, что сня-жает выход целевого продукта. Фильт ование гомогената на фильтре с размером пор выше 50 мкм также яежела-тельно, так как в водно-солевую фазу оудут проходить частицы, содержащие другие фосфолипиды, что существен-но снижает' качество целевого продукта»

В результате разделения гомогената указанными при емами получают бесклеточную водно-солевую фазу , с одержащую частицы белок-фосфатидилинозитного омп-лекса, и оса док , содержащий другие фосфолипиды, кото-рый отбрасывают.

Из бесклеточной водно-солевой фазы частицы бе-локч^осфатйдилинозйтяого комплекса можно выделять гельхроматографие на сорбентах, позволяющих разде-лять вещества с молекулярной массой более I миллиона Дальтон. Сорбенты, разделяющие вещества с молекуляр-ной массой менее I миллиона ДЗ льтон, - непригодны, так как они не позволяют выделять частицы белок-фосфат-ЙДИЛЙНОЗИТЯОГ о комплекса. Лучшими сорбентами являют-СЯ Гели типа "Сефароза" , "Сефакрил" фирмы Pharmacia

(Швеция), " льтрогель" фирмы "ь в " (Швеция) , "Био- Гель А" фирмы Biorad (СШ) , Тойёпёрл (Тоуареаг! ) фирмы "Тоуа - soda" (Япония).

Выделение частиц белок-фосфатидилинозитного ком-плекса из бесклеточной водно-солевой фазы можно осу-ществлять ультрафильтрацией на фильтре с размером пор не более 0, 2 мкм. Фильтры с размером пор более 0,2. мкм использовать нежелательно, так ка частицы белок-фос-фатидилинозитного комплекса будут уходить (проникать) в фильтрат, что снижает выход целевого продукта.

Выделение частиц белок-фосфатидилинозитного ком-плекса из бесклеточной водно-солевой фазы можно также осуществлять п ем их осаждения в ультрацентрифуге при ускорении силы тяжести от 30000 до 100000 g .

Зтот предел определяется тем, что при значениях менее 30000 s Судет происходить неполное осаждение упомя-нутых частиц, а при значениях более 100000 g ультра-фильтрация нецелесообразна, та как это уже не увели-чивает выход продукта , а приводит к неоправданному расходу электроэнергии.

Кроме указанных вариантов выделения частиц белок-фосфатидилинозитного комплекса предлагается также ва-риант их выделения путем обработки бесклеточной вод- . яо-солевой фазы щелочными или нейтральными протеазами. В присутствии названных протеаз большая часть белка с указанных частиц удаляется, в результате чего частицы слипаются и их легко отделяют простым фильтрованием на бумажном или стеклянном фильтре или и осаждают центрифугировани ем при невысоких значениях ускорения силы тяжести от 500 до 10000 g . Для данного вариая- та используют протеазы в количестве от 5 до 100 мкг на I мл водно-солевой фазы. Указанный предел опреде- ляется тем, что количество протеазы менее 5 мкг/мл Судет недостаточным для полного выделения частиц бе- лок-фосфатйдилияозйтного комплекса, а количество их выше 100 мкг/мл нецелесообразно, так как дополнитель- ного эффекта не дает, а приводит к неоправданному ра- сходу реагента.

Выделение частиц белок^осфатидилянозитного ком- плекса названными протеазами является предпочти е л ь- ным по сравнению с другими вариантами их выделения. Это объясняется тем, что в присутствии щелочных или нейтральных протеаз происходит слипание частиц белок- фосфатид шнозитного комплекса, которые легко и про- сто отделяются на бумажном или стеклянном фильтре. Протеазы сравнительно недорогие и доступные.

Далее выделенные частицы белок-фосфатидилянозит-н ого комплекса обрабатывают диэтяловым эфиром или ацетоном или другим подобным органическим растворите-лем для удаления из него липидных примесей. После че-го продукт экстрагируют метанолом или его смесью с хлороформом или дистиллированной водой. Выход фосфат-идилинозята достигает 90%. от его содержания в исход-ном биологическом объекте.

Как видно из подробного описания изобретения, предлага емый способ прост в технологическом оформле-нии , не требу ет большого расхода органических раство-рителей, улучшает условия труда и сокращает время процесса примерно в 2-4 раза и значительно удешевляет стоимость продукта.

j-учпшй вариант осуществления изобретения

в качестве биологического объекта используют от-ру би зерна , например пшеницы. Гомогенизацию отру бей проводят путем их растирания в водном 0, 05-0, 1 М ра-створе хлористой соли трисоксиаминометана при рН=8, 3- -8,5 до получения гомогената. При этом происходит раз- рушение клеток отрубей и выделение частиц белок-фосфа-тидилинозитного комплекса в водно-солевую фазу. Получен-ный гомогенат подвергают центрифгированию при ускорении силы тяжести, равной 10000 g в течение 10 ин* При этом происходит отделение бесклеточной водно-солевой фазы, содержащей частицы белок-фосфатидилинозиного комплекса, от неразрушенных клеток и частиц, содержащих другие фос-фолипиды. Из полученной бесклеточной водно-солевой фазы частицы белок-фосфатидилинозитного комплекса выделяют путем обработки этой фазы щелочными или нейтральными протеазами в количестве 0,05 мг(или 50 мкг) на I мл указанной фазы. При этой обработке частицы белок-фосфа-тидилинозитного комплекса слипаются и и выделяют из указанной фазы путем центрифугирования при ускорении силы тяжести 10000 g . Полученный осадок частиц белок-фосфатидилинозитного комплекса промывают диэтиловым эфиром для удаления загрязняющих продукт липидны приме-сей. Из очищенного осадка частиц белок-фосфатидилинозит-ного комплекса продукт экстрагируют метанолом. Выход продукта составляет около 93$ от исходного его содержа-ния в отрубях пшеницы.

Для лучшего понимания настоящего изобретения приво-дятся пример! конкретного осуществления способа получе-ния фосфатидилшюзита.

Пример I

10 г кукурузной муки растирают в 0,05 М водном растворе динатриевой соли фосфорной кислоты с рй 9,0 в фарфоровой ступке до гомогенного состояния. Для вы-деления бесклеточной водно-солевой фазы гомогенат фильт-рую на фильтре с размером пор 5 мкм. Бесклеточную вод-но-солевую фазу подвергают гель-хроматографии по колон-ке с сефарозой 4 В для выделения фракции, содержащей частицы белок-фосфатидилинозитного комплекса. Эту фрак- ю концентрируют досуха на вакуумном испарителе, Су-хой остаток обрабатывают 50 мл ацетона для удаления ли-пидных примесей. Целевой продукт экстрагируют бидистил- лированной водой. Выход полученного продукта - 0,09 г (8,9$).

Пример 2

10 г семян гороха перемалывают на мельнице, за- тем перемолотую массу гомогенизируют в ножевом гомо- генизаторе в 0,1 М растворена 2СО3 при рН 11,0. Го- могенат центрифугируют при 10000 g 10 минут. Полу- ченную бесклеточную водно-солевую фазу подвергают ультрацентрийугированию при 30000 g . Осадок промывают 50 мл диэтилового эфира. Продукт экстрагируют 5 мл ме- танола. Выход продукта 0,02 г (65$).

Пример 3

10 г желудей размалывают в мельнице. Полученную муку растирают в водном растворе ацетата натрия кон- центрацией 0,1 при рй = 5. Полученный гомогенат центрифугируют при ускорении силы тяжести, равной

10000 g , в течение 10 мин. Бесклеточную водно-соле- ву фазу подвергают гель-хроматографии на сорбенте тойёпёрле Н w 65. Фракции, содержащие частицы белок- фосфатидилинозитного комплекса, упаривают на вакуумном испарителе и обрабатывают 50 мл диэтилового эфира для удаления лш ных примесей. Продукт экстрагируют 5 мл метанола. Выход продукта 0,01 г (20$).

Пример 4

10 г отрубей зерна ячменя растирают в 0,005 М водном растворе хлористого калия с рН = 7. Полученный гомогенат центрифутируют при ускорении силы тяжести, равной 10000 g , в течение 10 мин. Бесклеточную вод-но-солевую фазу, содержащую частицы белок-фосфатиди-линозитного комплекса", обрабатывают папаином в коли-честве 50 мкг на I мл названной фазы в течение 4-х часов. Слипшиеся частицы белок-фосфатидилинозитного комплекса осаждают центрифугированием при 10000 g

10 мин. Осадок промывают 50 мл диэтилового эфира для удаления липидных примесей и продукт экстрагируют

5 мл смеси метанол : хлороформ (2 : I). Выход продук- та 0, 05 г ( 5( .

Пример 5

10 г семян кукурузы перемалывают и гомогенизиру-ют в 0,05 М водном растворе хлористого натрия при рН,-равном 7. Полученный гомо енат центрифугируют при ус-корении силы тяжести 3000 g в течение 10 мин. Бес-клеточную водно-солевую фазу отделяют и обрасатывают. трипсином в количестве 50 мкг на I мл указанной фазы» Слипшиеся частицы белок-ф>осфатидилпяозитного комплек-са осаждают фильтровани ем на бумажном фильтре. Осадок на фильтре промывают 50 мл. петролейного эфира для удаления- липидных примесей. Продук экстрагируют 5 мл метанола. Выход продукта 0,7 г { 90%) .

Пример 6

10 г отру бей зерна кукурузы гомогенизируют в водном растворе фосфатной соли трисоксиаминометана концентрацией 0, 05 М в фарфоров ой ступке. Подученный гомогенат центрифугируют при ускорении силы тяжести, равной 30000 g , в течение 10 мин. Бесклеточную вод-но-солевую фазу обрасатывают химотрипсином в оличе-стве 50 мкг/мл в течение 8 часов. Слипшиеся частицы белок-фосфатйдилйяозйтного комплекса осаждают центри-фугировани ем при ускорении силы тяжести , равной

10000 g , в течение 10 мин. Осадок обрабатывают 50 мл диэтилового эфира для удаления липидных примем сей. Продукт экстрагируют 5 мл метанола. Выход прод к-та 0, 02 г ( 18 ) .

Пример 7

10 г отру бей пшеницы гомогенизируют в водном ра-створе сульфатной соли трисоксиаминометана концентра-цией 0, 1 М при рН = 8, 5 в течение 10 мин. По ученный-гомогенат фильтруют на фильтре с размером пор 50 мкм. Отделенную бесклеточную водно-солевую фазу обрасаты-вают папаином в количестве 50 мкг на I мл указанной фазы в течение -х часов. Слипшиеся частицы белок-фосфатидилйяози тного комплекса осаждают центрифугиро-ваяием при ускорении силы тяжести, равно 10000 s , - II - в течени е 10 мин.

Полученный осадок промывают 20 мл да этилового эфира для удаления липидных примесей. Продукт экстра гируют 2 мл метанола. Выход продукта 0, 07 г ( 85%) .

Пример 8

10 г отру бей зерна пшеницы растирают в водном растворе хлористой соли трисоксиамин сметана концент- рацией 0, 05 М при рН, равном 8, 5. Полученный гомоге- нат центрифугируют при ускорении силы тяжести , равной 10000 g , в течение 10 мин. Бесклеточную водно-соле- вую фазу обра батывают папаином в количестве 50 мкг/мл в течение 8 час. Слипшиеся частицы белок-фосфатидили- нозитного комплекса осаждают центрифугированием при ус орении силы тяжести, равной 10000 s , в течение 10 мин . Осадок промывают 50 мл диэтилового эфира для . удаления липидных примесей. Продукт из осадка экстра-гируют 5 мл метанола. Выход продукта 0, 11 г ( 95$) .

Пример 9

10 г отру бей зерна пшеницы гомогенизируют в вод-ном растворе хлористого натрия концентрацией 0, 05 М при рН, равном 7 , в гомогенизаторе. Полученный гомо-генат центрифугируют при ускорении силы тяжести , рав-ной 10000 g , в течение 10 мин. Отделенную бесклето-чную водно-солевую фазу подвергают фильтрации на уль-трафильтре с размером пор 0, 2 мкм. Осадок снимают с фильтра и промывают 50 мл диэтилового эфира для уда-ления липидных примесей, фодукт из осадка экстраги-руют 2 мл метанола. Выход продукта 0, 06 г (63$) .

Промышленная применимость

Настоящее изобретение может быть реализовано в химической промышленности , в биотехнологии и в меди-цине.