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1. WO1981001412 - COMPOSITION ADHESIVE FIXATEUR DE MOLECULES BIOFONCTIONNELLES

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[ DE ]

COMPOSITION ADHESIVE FIXATEUR DE MOLECULES BIOFONCTIONNELLES

Domaine technique

La présente invention concerne le domaine des prcduits syntbé tiques biologiquem ent actifs et, plus particulièrement, celui des Substrats dont la surface possède une activité biologique, notamment enzymatique ou autre .
Des travaux considér ables ont été effectués ces dernières an nées pour mettre au point des matériaux, sous forme divisée ou non, dont la surface perm et de fixer , de façon permanente ou temporaire, des molécules biolog iquement actives. Par "molécules biologiquement actives" on entend, en général, des molécules qui ont un rôle à jouer dans les processus chimiques dont dépendent les êtres vivants. Parmi de telles substances ont peut citer les enzymes, les inhibiteurs d' enzymes, les ferments, les hormones, les antigènes, les anticorps, les inhibiteurs biologiques, l ' héparine, les lectines, etc . Ces molécules présentent généralement un ou plusieurs sites réactifs spéci fique de teile ou teile réaction ou processus particulier et, par extension, on désignera également dans la présente description par le terme de molécules biologiques ou biofoncticnnelles les substances d'origine synthétique ayant un comportement an alogue, et pouvant foctionner comm e biocatalyseurs , biosorbants , etc
Ainsi, de tels matériaux supports contenant une substance bio fonctionnelle peuvent agir, vis à vis d' un substrat, comme le ferait la substance biofonctionnelle elle-mêm e à l' état libre; cependant, à la fin de la réaction, de tels matériaux peuvent généralement être isolés du milieu réactionnel par les moyens habituels sans difficul tés particulières alors que ce n' est pas nécessairement le cas pour une substance biolog iquement active à l' etat libre.
Un exemple particulièrernent connu de tels matériaux biologique ment actifs est celui des résines recouvertes ou imprégnées d'une enzyme; ces matériaux, une fois activés, sont mis en présence d' un Substrat à mcdifier biochimiquement de rnanière qu' une réaction enzymatique entre celui-ci et la couche active du matériau s' effe ctus.

Une fois la réaction terminée, le matériau actif est. séparé du mi lieu de réaction par les moyens habituels et il peut être réutili sé généralement sans autre ou, si besoin est, son activité peut être restaurée par un traitement de régénération appproprié. Ainsi, lorsque de telles substances biofonctionnelles sont fixées à un support inerte et que, dans cet état, elles peuvent agir sur un substrat à trans former, on les appelle souvent du ncm de "biocatalyseur". De façon analogue un "biosorbant" est un substrat sur lequel on a fixé des molécules biofonctionnelles capable de capturer une substance que l'on. désire séparer d'un mélange.

Etat de la technique

Parmi les publications récentes les plus marquantes dans ce do ne on peut citer, à titre d'exemple, les documents suivants :
1. Pellicular Immobilized enzymes par C. Horwath, Biochim. & Biophys. Acta 338 (1974), 164-177. Cette référence souligne les avan tages résultant de I'utilisation de pellicules minces d'un substrat contenant une enzyme par rapport à I' utilisation d'une enceinte rem plie de particules d'un tel substrat à l'état divisé, par exemple colonnes chargées de particules de résine contenant des enzymes im mobilisées dans la masse de celle-ci. En effet, l'action d'un tel substrat sur une solution avec laquelle il est en contact est essen tiellement de nature superficielle et l'emploi de pellicules minces de matière active déposée sur un support rigide est avantageux pour des raisons évidentes d'économie de matière et de stabilité mécani que. Cette référence indique, notamment, que les matières en couches minces déposées sur un support rigide, une bille de verre par exemple, activées par des enzymes peuvent être classées dans trois catégories principales, à savoir :
a) l' enzyme est immobilisée dans une matrice à consistance de gel, l'enzyme étant liée au gel avant ou après le dépôt de celui-ci sur le support.
b) Le Substrat consiste en une couche raicro-poreuse formée, par exemple, d'un absorbant minéral ou organique (silice, alumine, car bone, nylon poreux, etc..) et I'enzyme est fixée sur ce substrat par couplage ou par réticulation à la surface de celui-ci, (voir éga lement USP 4, 025,669)
c) Le Substrat pelliculaire minéral organique est macroporeux (pores de l'ordre de 100-200 nm) il est possible de l'impregner par une solution d'un couple ("conjugate)" enzyme-polymère après quoi on fait évaporer ce solvant de façon que ledit couple se dépose sur le substrat. Dans un tel cas, le Système comporte donc, dans son en semble, trois phases distinctes : (i) un support inerte (bille de verre) recouvert (ii) d'un premier substrat (par exemple, polymère inerte macroporeux), la surface des pores de celui-ci étant eile même (iii) recouverte d'une couche d'un autre polymère contenant l'enzyme.
Par ailleurs, la même référence décrit, dans le cadre des ma térilaux de la catégorie (b) ci-dessus, une méthode pour revêtir des billes de verre au moyen d'une solution d'un polymere riche en grou pe -COOH (un copolymère d'anhydride maléique et d'éther méthyl-vi-nylique) et, après séchage, pour activer cette pellicule de polymère par contact avec des solutions aqueuses d'enzymes telles que tryp sine, chymotrypsine, protéase, ribonucléase, papaϊne, etc..
2. Les brevets français Nos 2.028.702 et 2.035.774 décrivent la fixation de molé cules biologiquement actives, telles que des enzymes, antigènes, allergènes, hormones, etc., sur des supports or ganiques ou minéraux tels que cellulose, amidon, alginates, colla gène, polysilanes, résines polyacryliques, verre, métcϊl, etc., en utilisant des agents de pentage, tels que composés diazo, époxides, carbcdiimides, chlorure de sulfonyle et dialdéhydes, le glutaraldéhy de par exemple. Le glutaraldéhyde agit également comme réticulant de telles molécules biologiquement actives.
Une méthode similaire est aussi décrite dans l'article suivant :

Preparation and Properties of Urease Chemically Attached to Nylon Tubes par P.V SUNDARAM et al, FEBS letters 10 5 , 325 (1970), ainsi que dans la publication de demande de brevet allemand DOS 2.636.206.
3. Le brevet d'Allemagne de l'Est No 106.856 (CA 82, 82332q) décrit la fabrication d'un gel de polyacroléine dans lequel on a in corporé, par mé lange, de l'uréase.
4. Le brevet USP 3 844 892 (CA, 82 82328 t) décrit l'immobili sation de la glucose oxidase par réaction avec un copolymère époxy dique obtenu par copolymérisatien de nitriles acryliques et d'esters époxyacryliques. La fixation de l'enzyme se fait donc là par réac tion de celle-ci avec le groupe oxirane du copolymère.
5. La demande de brevet japonais Kokai 75/10.585 (CA 83, 159962 a) décrit la Polymérisation d'un mélange d'asparaginase, d'acryla mide, de stabilisateur et d'initiateur de polymérisation, le tout déposé, sous forme d'une couche mince, sur la paroi d'un tube de verre.
6. La demande de brevet japonais Kokai 75/70.584 (CA 83, 159 963 b) décrit également un film de polymère dans lequel est noyée une enzyme. Ce polymère est constitué d'un mélange de l'enzyme (ami noacylase) avec de l'acrylamide, du N,N'-méthylène-bis-acrylamide, duß aminopropionitrile et du K2S2D7 qu'on a déposé et fait polymé riser sur un support hydrophile fritté.
7. La demande de brevet japonais Kokai 76/63.985 (CA 85, 107 494 w) décrit la formation d'un copolymère similaire à celui mention né au point (5) ci-dessus et son utilisation pour décomposer l'aci de aspartique d'une solution sanguine qu'on fait circuler au contact de ce copolymère actif.
8. La demande de brevet japonais Kokai 77/145,592 (CA 88, 117 050 z) décrit la préparation d'un film de nitrocellulose contenant une enzyme, ce film étant obtenu par adjonction de l'enzyme à une solution de polymère dans un solvant organique, puis dépôt du mélange sur un support réticulé en nylon et séchage du revêtement ainsi obtenu.
Certaines méthodes font appel à des prccesus de photopolyméri sation; ainsi :
9. La demande de brevet allemand DOS 2.305.320 (CA 80, 24327 q) décrit l'incorporation d'enzyme (urease) à du poly (2-hydroxyéthyl) métacrylate puis le dépôt de ce mélange sur un support de polyéthy-lène, le durcissement de ce dépôt per irradiation (UV) et la protec tion de oe dépôt par une nouvelle couche de poly- (2-hydroxyéthyl)-mé thacrylate de manière à fournir un film enzymatiquement actif et sta ble au stockage.
10. A. TANAKA et al, J. Ferment. Technol. 1977, 55 (1), 71-5 décrivent le piégeage d'enzymes ou de cellules microbiennes par des résines photoréticulables, telles que le dirnéthacrylate de polyéthy lène glycol.

11. La demande de brevet japonais Kokai 77/151.788 (CA 88, 117 046 c) décrit le piègeage d'enzymes dans une dispersion de résine photodurcissable. Suivant cette référence, on melange une résine ob tenue à partir de polyéthylèneglycol, de 2-hydroxyéthylrnéthacryla te et de xylene diisocyanate avec une poudre de diatomées et un pho to-initiateur , puis on ajoute une solution aqueuse d'enzyme (inver tase) et on irradie le mélange au moyen d'une lampe UV de manière à obtenir une masse enzymatiquement active.
12. La demande de brevet japonais Kokai 77/143.279 décrit la mise en suspension d'une protéine biologiquement active dans une résine photosensible liquide contenant un photosensibilisateur hydro soluble, le tout étant ensuite émulsifié dans une phase aqueuse et irradié de manière à réaliser le piègeage ("immobilisation") de la dite protéine par photopolymérisation des particules de résine con tenant celle-ci.
13. La demande de brevet japonais Kokai 77/143.282 (CA 88, 117048 e) décrit une méthode suivant laquelle on irradie, par rayonnement UV, un mélange d'une enzyme et d'une résine ptotopolymérisable , ce mélange étant préalablement utilisé pour imprégner un support poreux, par exemple un réseau de fils textiles, le tout formant alors une bande souple recouverte d'une pellicule enzymatiquement active.
14. Dans la demande de brevet japonais Kokai 75/78.641 (CA 84, 3309 c), on décrit le mélange d'une enzyme en solution aqueuse (glu cose isomérase) et d'un monomère acrylique ptotopolymérisable puis la transformation, par irradiation UV de ce mélange, en une poudre de polymère contenant, "imrnobilisee", l'enzyme sous forme active.
15. Dans la demande de brevet japonais Kokai 78/34.984 (CA 89 , 19234 p), on décrit une méthode suivant laquelle on mélange une enzyme ( ß -Glucosidase) avec une solution aqueuse de gélatine et d'un monomère photoréticulant fixateur de l'enzyme (le 4,4'-diazidostil bène-2,2'-disulfonate), puis on dépose un film de ce mé lange (50 m) sur une plaque de verre et on irradie le tout afin de préparer un film enzymatiquement actif.
Les références suivantes concernent la préparation de matériaux de forme divisée dont les particules sont recouvertes d'une préparation biologiquement active, les molécules actives étant généralement fixées au substrat par pontage.

16. Le brevet DSP 4,070,246 (CA 88, 117052 b, 1978) décrit un procédé suivant lequel on met en suspension une poudre métallique dans un mélange aqueux d'acide p-aminobenzoϊque et de formaldéhyde, après quoi on filtre la poudre enrobée du polymére résultant de la condensation de oss composés, on soumet celle-ci à une diazotation et on fait copuler le substrat ainsi diazoté avec une enzyme de maniere à fixer celle-ci sur le polymère.
17. Dans le brevet USP 4,071,409 (CA 88, 117053 c, 1978), on décrit le traitement d'un substrat tel que la silice ou le rutile en poudre par un di-isocyanate, ce dernier servant en l'occurence de pont pour la fixation, sur le substrat, d'une enzyme teile que la papaϊne.
18. Le brevet USP 4,072,566 (CA 88, 117054 d) divulgue une méthode suivant laquelle on adsorbe de la p-phénylènediamine sur des particules de verre poreux, on diazote l'amine aromatique et on fait copuler le produit diazoté avec de la papaïne.
19. Le brevet USP 4,007,089 (CA 86, 116834 a) décrit l'utilisation de 1-N(2-nitro-4-azidophényl)-6-N' (4,6-dichloro-triazinyl)-dia-minohexane pour ponter des enzymes et des anticorps sur des supports organiques non solubles dans l'eau, le groupement azido se transfor mant en groupe nitrène par irradiation UV et se fixant au support tandis que le groupe triazinyl se lie à la molécule protéinique en zymatique.
20. La demande de brevet japonais Kokai 76/31.689 (CA 55, 47 837 y) décrit le traitement de substrat hydroxylés (par exemple si licagel) par des aminosilanes et des polymères contenant des grou pes dinitrobenzène-pyridinium afin de rendre ces substrats aptes à fixer des enzymes de façon stable.
21. Le brevet français No 2.235.133 (CA 83, 74687 q) décrit la fixation d'enzymes (aminotransférase) sur des films ou fibres de col lagène par activaticn préalable au HCl puis pentage par traitement au moyen d'hydrazine en présence d'acide nitreux.
22. La demande de brevet allemand DOS 2.323.422 décrit la préparation de copolymères de méthacrylate de 2-hydroxyethyle et de di méthacrylate d'éthylène-glycol contenant, liés de manière covalen te, des molécules biologiquement actives telles que, respectivement, des inhibiteurs d'enzymes, des enzymes, des antigènes, des anticorps, etc.. Des résines particulaires constituées par de tels polymères fournissent des charges actives permettant de fixer, par contact avec leurs Solutions, les substances conjuguées de celles qui sont fixées sur ledit polymàre, à savoir, respectivement, des enzymes, des inhi biteurs d'enzymes, des anticorps des antigènes, etc..
Outre les pontages chimiques réalisés par les méthodes mention nées ci-dessus, on peut citer la fixation des enzymes sur des supports par des méthodes de greffage faisant intervenir des radiations plus ou moins énergétiques. Ainsi :
23. H. BARKER et al, Proc. Int. Congr. Catal., 6th 1976, Publ. Chem. Soc Letchworth, Engl., (CA 87, 196426 g) décrivent le greffage sous irradiation de monomères, tels que le p-nitrostyrène, sur des supports tels que les polyoléfines et le PVC, le groupe NO2 étant ensuite converti en isothiocyanate, un groupe fixateur d'enzymes (try psine). Comme type possible de sources d'irradiation, la référence cite les rayons
, un faisceau d'électron et les UV.
24. Dans l'article de A.S. HOEFMAN et al, Trans., Am. Soc. Artif. Intern. Organs. 1972, 18, 10-18, il est indiqué qu'on a pu greffer, par irradiation
sur des supports de caoutchouc silicone, des hy drogels de photopolymères contenant du méthacrylate de 2-hydroxye-thyle et de la N-vinyl-pyrrolidone, ce greffage étant réalisé direc tement ou par l'intermédiaire d'acide
- aminocaproϊque. Ces hydro gels ont ensuite permis de fixer chimiquement des molécules biologiques telles que l'alnuminr , l'héparine et la streptokinase, le tout constituant des substrats biologiquement actifs.
25. De même, A.S. HOFEMAN et al dans Am. Chem. Soc Div. Org. Coat. Plast. Chem. Pap. 1974, 34 [1] , 568-73 passent en revue les méthodes connues parmettant de fixer, par les techniques d'irradiation, des polymères hydrophiles sur des supports inertes, des molé cules biologiquement actives pouvant ensuite être fixées chimique ment sur les groupements -OH, -COOH, etc. libres de ces polymères hydrophiles.
26. De telles méthodes sont également décrites par A.S. HOEF MAN dans les références suiveintes :
Polym. Prepr. Amer. Chem. Soc, Div. Polym. Chem. 1972, 13 [2] 740-6 et 723-8; USP 3,826,678.
Un perfecticnnement dans la réalisation de polynères aptes à fixer des moléc ules biologiquement actives consiste, non pas à im mobiliser celles-ci par piègeage dans la masse du polymère ou à les greffer sur un substrat donnè, mais bien à préparer un copolymère entre un monomère de base assurant la formation de l'assise propre ment dite du copolymère et un autre monomère lié à une molécule bio logiquement active ou porteur d'un groupe réactif apte à fixer, ul térieurement, une molécule biologiquement active, cette liaison étant réalisée, soit directement, soit par l'intermédiaire d'une chaîne additionnelle (spacer) permettant de maintenir la molécule active à une distance choisie du substrat; cette distance est généralement adaptée de manière que les déplacements des portions de molécules mises en jeu pendant la réaction biologique ne soient pas entravés par la trop grande proximité de ce substrat.
27. Le brevet français 2.212.340 décrit ainsi une méthode sui vant laquelle on polymérise ou copolymérise un monomère porteur d'une enzyme en présence d'un réticulant et d'un initiateur, l'enzyme fixée étant, par exemple, l'uréase, l'amyloglucosidase, la glucose oxida se, la fumarase, l'aspartase et la pénicilline aspartase.
28. Dans la demande de brevet allemand DOS 2,426,988, on décrit la fixation d'enzymes à des substrats par liaison covalente en fai sant copolymériser un polysaccharide activé et un monomère, celui-ci possédant un groupement susceptible de se lier à une enzyme. On décrit également, en Variante, la fixation d'une enzyme à un copolymère par réticulation de celui-ci au moyen d'un agent réticulant au quel on a préalablement fixé ladite enzyme.
I1 est utile à ce stade de donner quelques précisions sur les applications des substrats biologiquement actifs, notamment lorsque ceux-ci se présentent sous formes de couches minces sur des supports minéraux ou organiques. Une des applications majeures de tels subs trats est constituée par l'analyse automatique de certains fluides biologiques dont un exemple type est représenté par le dosage de glucose dans le sang et le sérum. L'échantillon à analyser est mis en circulation, après dilution appropriée et dialyse éventuelle, dans un circuit comprenant, en tant qu' élément réactif, un tube ou une batterie de tubes dont la paroi interne est recouverte d'un revête ment enzymatiquement actif vis à vis de la solution à analyser. A la sortie dudit élément, les produits de la réaction entre la solu tion et le revêtement sont analysés par les méthodes habituelles, par exemple par spectrophotométrie en continu. L'élément actif d'un tel dispositif d'analyse doit donc ccnserver intactes, avec le temps, ses propriétés enzymatiques et, de plus, posséder une spécificité et une stabilité suffisantes pour garantir la reproductibilité des résultats au cours d'une période prolongée de travail. Par ailleurs, l'activité spécifique du revêtement actif doit être élevée pour que l'élément actif ne soit pas trop encombrant au point de vue de ses dimensions. L'état de la technique dans ce domaine peut être illus tré par les références suivantes :
29. Open Tubular Heterogeneous Enzyme Reactors : C. HORWATH et B.A. SOLOMON , Biotechnology & Bioengineering 14, 885-914 (1972).
30. L.P. LEON & al, Clin. Chem. 22/7, 1017-1023 (1976); 23/9, 1556-1562 (1977).
Au vu des références précitées, on peut conclure que, à l'heu re actuelle, la technologie des revêtements enzymatiquement actifs en couches minces sur des supports rigides se resume aux procédés suivants :
A. Gels contenant, immobilisée, la molécule biofonctionnelle, ces gels étant déposés, sous forme d'un revêtement sur un support.
B. Substrats poreux déposés, sous forme d'une couche mince, sur un support et contenant l'enzyme à l'état adsorbé ou fixée de maniére covalente.
C. Support dont la surface elle-même (généralement lisse ou ru gueuse) a été activée, soit chimiquement soit par irradiation, de manière à devenir apte à fixer l'enzyme, soit directement soit par l'intermédiaire d'un agent de pontage.
D. Revêtement de résine polymère contenant l'enzyme, soit piégée dans la masse, soit fixée par liaison covalente.
Dans tous les cas, les problàmes principaux liés à l'obtention de couches d'une efficacité satisfaisante sont les suivants.
a) Surface de contact effective entre la solution à traiter et le substrat actif aussi grande que possible, d'cù bonne pénétration de ladite solution dans le revêtement actif; porosité élevée des gels ou substrats poreux; faculté de gonflement des matrices de résines polymères; hydrophilie süffisante des polymères utilisés.
b) Spécificité déterminée dans la nature des sites récepteurs et fixateurs des molécules bioactives suivant les buts recherchés : obtention d'un substrat d'activité biologique permanente ou extraction temporaire de substance active avec relargage ultérieur (purification d'enzymes ou chromatographie d'affinité).
c) Possibilité d'utiliser la totalité ou presque de la masse active, certaines substances biofonctionnelles étant très onéreuses, d'où possibilité de produire des revêtements actifs dont seules les portions accessibles à la solution à traiter contiendront des molécules actives.
d) Adhésion irréprochable du substrat actif sur son support.
Or, a l'heure actuelle aucune des techniques connues ne permet de concilier simultanément ces exigences à un degré élevé. En effet, les gels et les substrats poreux sont difficiles à faire adhérer so lidement à un support inerte et, par ailleurs, leur perméabilité et leur porosité sont difficiles à contrôler de manière à assurer une circulation libre et efficace entre les sites actifs et la solution à traiter.
D'autre part, le traitement direct des supports par voie chi mique ou par irradiation manque souvent d'efficacité (taux de fixa tion superficiel insuffisant); de plus, les irradiations très énergi ques (rayons
) peuvent avoir un effet destructeur sur lesdits supports.
Par ailleurs, les méthodes actuelles manquent de versatilité en ce sens que chaque cas particulier réclame une technique indivi duelle souvent très différente de celle qu'exige un cas apparemment similaire et n'en différant que par un caractére d'aspect anodin. Ainsi, par exemple, il n'est pas possible, au moyen de techniques connues, de préparer une composition enzymatiquement active unique qui convienne à la fois au verre poreux et au poyéthyléne lisse, c'est à dire qui puisse s'appliquer directement sur l'un de ces supports, au choix, sans traitement particulier propre à l'un ou l'autre de ces supports.

Description de l'invention

La présente invention remédie à ces inconvénients et met en oeu vre une technique à la fois simple et d'une très grande versatili té en ce sens qu'elle s'applique pratiquement à tous les supports envisageables et que, par des modifications mineures et facilement prévisibles, elle peut s'appliquer à l'obtention de substrats biofonc tionnels en couche mince d'une variété pratiquement illimitée.
Pour cela l'invention met en oeuvre une composition photo-adhé sive (I). Cette composition est adhésive pratiquement vis à vis de la totalité des supports solides minéraux et organiques usuels : verre, céramiques, métaux, bois, résines artificielles, etc.. c.à.d. tous supports pouvant être raisonnablement envisagés pour une teile application et, cela, sans qu'il soit nécessaire de procéder a un traitement particulier quelconque de la surface de ces supports. La compositon de l'invention est à base d'acide acrylique; eile contient, bien entendu, (i) un photo-initiateur et, en outre, (ii) un agent activateur de ptotopolymérisation (pour permettre une photo-adhésion et un photo-durcissement rapide) et promoteur d'adhésion (pour garantir une adhésion suffisante du revêtement ptotopolymérisé sur le support). La composition contient encore (iii) au moins un monomère comprenant un groupement apte à fixer, par liaison directe avec celui-ci ou par l'entremise d'un pont intermédiaire préalablement relié à ce groupement, une substance biologiquement active ou poten tiellement biologiquement active.
On entend par "potentiellement biologiquement active" (par opposition à "directement ou cinétiquement active") une molécule nor malement biofonctionnelle mais qui, dans certaines conditions, peut être inactivée, par exemple par couplage avec un inhibiteur ou par blocage de son ou ses sites bioactifs.
Lorsqu'on a appliqué la composition photo-adhésive de l'invention sur un support, on soumet le tout à une photo-irradiation, par exemple au moyen de rayons UV, ce qui provoque la copolymérisation de l'acide acrylique, du monomère (iii) et d'autres substances copo lymérisables éventuellement encore présentes dans la composition. On obtient ainsi un revêtement photopolymérise (II) de résine hydrophile adhérant fermement aux supports minéraux ou organiques synthé tiques ou naturels, superficiellement perméable à l'eau et gonflant en présence de celle-ci, cette résine contenant, à l'etat copolymé risé, au moins un type de maillon apte à fixer, par liaison directe ou par l'entremise d'un pont préalablenent ou ulteriéurement relié à celui-ci, une ou piusieurs substances macromoléculaires actives (ou potentiellement actives) et, cela, de façon stable et sans que l'activité réelle ou potentielle de ces substances soit sensiblement altérée ou modifiée. Bien entendu, un tel revêtement photopolyméri sé (II) fait également partie de l'invention de même que le support revêtu d'un tel revêtement.
Une fois le revêtement pfaotopolymérisé obtenu sur son support, on peut y fixer les substances biologiquement actives, soit par con tact direct avec celles-ci, soit par fixation préalable d'un pont intermédiaire (pi), dont l'extrémité libre contiendra une fonction susceptible de fixer la substance biofonctionnelle, soit de manière permanente (covalence), soit de maniere temporaire (complexation). Dans ce dernier cas, le pont intermédiaire sera considéré comme li gand spécifique de la molécule à capturer. Le revêtement photopoly mérisé porteur de mo lécules biofonctionnelles (ou potentiellement biofonctionnelle) (III) fait également partie de l'invention, de même que le support recouvert d'un tel revêtement.

Modes de réalisation et mise en oeuvre

Lorsque les molécules biofonctionnelles ont été liées sur le substrat de l' invention, on obtient ainsi un produit bioactif (ou potentiellement bioactif) qu'on peut mettre en oeuvre dans les diverses applications auxquelles il est destiné. Par exemple, s' il s' agit d'un revêtement (III) porteur d'une enzyme, le substrat est mis en contact avec une solution de matières à traiter au moyen de cette enzyme, de maniére que la réaction désirée s'effectue, en continu ou en discontinu. Puis on sépare le milieu réactionnel du substrat actif, on récupère celui-ci et on ln réutilise autant de fois qu'on le désire. Suivant un autre exemple, s' il s' agit de la capture spécifique par complexation d' une molécule biofonctionnelle dans un mélange de celle-ci avec d' autres substances, on procède comme ci-des sus au moyen du substrat (II) , puis on sépare le substrat (III) Chargé de ladite molé cule et, par un traitement approprié , on provoque la scission du complexe et la libération de la molécule capturée. II est également entendu que la présente invention s' étend à l' utilisation des revêtements (II) et (III) comme agents actifs dans les réactions de transformation biochimiques propres aux substances biofonctionnelles fixées sur lesdits revêtements ou substrats. De tels ingrédients peuvent parfois être désignés sous le nom de "biocata lyseurs".
Comme on l'a vu plus haut, la composition (I) de l'invention est à base d'acide acrylique. Ce monomère convient particulièrernent bien car il donne aux copolymères qu'on en obtient des propriétes hydrophiles favorables et, de plus, il polymérise facilement et ra pidement sous l'influence de photo-initiateurs convenables. Par con tre l'acide méthacrylique n'est pas à recommander pour la composition (I) car il ne photopolymérise pas assez rapidement.
Conme photo-initiateurs (i), on peut utiliser, dans la compo sition (I) des oétones aromatiques habituellement utilisées comme photo-promoteurs de polymérisation (voir par exemple le brevet USP 3,759,807). On peut citer, par exemple, la benzophénone, l'acétophé none et les composés halogénés correspondants. On peut également utiliser des composés anthraquinoniques comme la 2-éthyl-anthraquino ne, l'acide anthraquinone-2-carboxylique, de même que d'autres photo initiateurs tels que la benzoϊne, le 2,5-diéthyl-aminophényl-l-oxy 3,4-diazole et le sulfochlorure de naphtalène.
Comme activateur de Polymérisation et promoteur d'adhésion (ii), on utilise de préférence un acrylate ou méthacrylate d'amino-alcool tel que le méthacrylate de dimethylamiroéthyle (DMAEMA) . Cependant, on peut également utiliser des métacrylates d'autres amino-alcools, tels que le N-diethylaminoéthanol ou le N-éthyl-N-ter butyl-aminoé thanol. L' utilisation de tels activateurs dans les compositions d'adbé sifs est d' ailleurs, en soi, connue (voir brevet Franςais No 2.881.968 et demande suisse CH 9815/78).
Outre l'acide acrylique en tant que monomère de base du présent copolymère, la composition peut encore contenir d'autres monomères oléfiniques tels que l'acrylamide, des esters acryliques et métacry liques, des acrylates polyfonctionnels et des prépolymères acryliques. Les esters acryliques monofonctionnels et l'acrylamide peuvent être ajoutés dans le but de donner plus de liant et une viscosité plus adéquate à la composition adhésive et, en outre, de régier l'hy grophilie du copolymère après photodurcissement. Les quantités de tels adjuvants sont dono à faire varier par l'homme de métier, sui vant les besoins en fonction des propriétés à donner au copolymère envisagé. Parmi les esters qui peuvent être utilisés avantageusement, on citera les acrylates et méthacrylates d'alcoyles inférieurs (mé thyle, éthyle, propyle, butyle, isobutyle, tert.butyle, etc..), de dodécyle, d'éthyl-hexyle, de méthoxyéthyle, etc. Les acrylates poly fonctionnels peuvent être utilisés pour donner plus de rigidité au présent copolymére suivant les besoins. Comme tels, on peut citer le triacrylate de triméthylol-propane (TMPTA) , le triacrylate de pen taerythrite (PETRA) et le tetraacrylate correspondant (PEIEA) . Les prépolymères acryliques ou vinyliques peuvent être ajoutés en peti te quantité à la composition de l'invention lorsqu' on césire lui con férer plus de souplesse et d'élasticité. Comme tels prépolymères, on peut citer les composés connus sous les nons commerciaux de UVT THAISE THIOKOL Corporation, EBECRYL (Union Chimique Beige). Par ail leurs; des polymères similaires sont décrits dans le brevet brita nnique NO 1.430.422 et la demande de brevet allemand DOS 25.42.314.
Les monomères (iii) possèdant une fonction réactive susceptible de lier, directement ou par l'intermédiaire d'un pont, des molécules bio-fonctionnelles sont extrêmement variés et peuvent être choi sis, suivant les besoins, de cas en cas. De manière générale, il de vront comporter une double liaison oléfinique (par exemple acrylique ou vihylique) et, lorsqu'il s'agit de fixer directement, par exemple, une grosse molecule peptidique (enzyme, inhibiteur d' enzyme, antigène, anticorps,. etc.), un groupe fonctionnel susceptible de réagir avec, par exemple, un groupement amine de ladite molécule à capturer. Des composés contenant de tels groupes fonctionnels (agents acylants, groupes protecteurs, composés porteurs de "leaving groups") sont abondairment décrits dans la littérature consacrée aux synthé ses de polypeptides. La plupart des monomères oléfiniques pourvus de tels groupes fonctionnels peuvent convenir à la présente invention. A titre d'exemple, on peut citer les composés suivant :
acrylate de N-hydroxysuccinimide, acrylamido-caproate de N-hydroxy-succinimide, acrylate d'époxypropanol, acrylate de 2-isocyanato-éthy le. De manière générale, d'autres monomères semblables, mais dans lesquels la double liaison et le groupe fonctionnel seront séparés par une chaîne hydrocarbonée d'une longueur supérieure à celle des monomères susmentionnés peuvent être avantageux dans le cas où on désire donner plus de liberté à la molécule bio-fonctiomelle, c'est à dire à la maintenir, pour des raisons d'encombrement stérique, à une distance plus grande du substrat. De manière générale une teile chaîne hydrocarbonée pourra avoir de 5 à 15 atomes de carbone.
Lorsqu'il s'agit de fixer des molécules bioactives sur le substrat par l'entremise du monomère (iii) et par l'intermédiaire d'un pont intercalaire (pi), ledit monomère (iii) comporte, outre la double liaison, un groupe réactif susceptible de former facilement, avec un composé approprié, ledit pont intercalaire. Comme tels groupes réactifs on peut citer les groupes -CH, esters, -COOH, -NE2, etc..

En conséquence, comme monomères convenant à l'introduction de tels groupes, on peut citer le monoacrylate d'éthylène-glycol, l'acryla te du monoacétate de glycol, l'acrylate de 2-aminoéthanol, l'anhy dride maléique et d'autres mono mères similaires.
A titre d'exemple, on précisera que comme ponts intermédiaires (pi) on peut utiliser des carbodiimides (réaction sur les groupes -COOH avec formation d'acylurees, elles mêmes réactives avec les molécules protéiniques); l'hydrazine (réagissant sur les esters et formant, avec HNO2, des groupes azides réactifs avec les enzymes); des diisocyanates (se liant, d'un côté sur les groupes -OH (uréthannes) ou -NH2 (urée) et, de l'autre, sur les molécules biofonctionnelles à pièger). De manière générale, lesdits ponts intercalaires compor tent, à leur extrémité libre un groupement fonctionnel capable de réagir avec la molécule biofonctionnelle et de fixer celle-ci au subs trat, la définition d'un tel groupement étant la même que celle don née plus haut.
De manière plus détaillée, on peut encore ajouter les exemples suivants de ligands terminaux susceptibles de fonctionner comme bit tes de fixation de molécules biofonctionnelles sur le revêtement de l'invention : l'aminobenzamidine spécifique de la trypsine; la 4-phé nylbutylamine spécifique de la chymotrypsine; les colorants tels que le CIBA CHRON BLUE F3G-A et le PROCION RED HE-3B spécifique des des hydrogénases; les sucres tels que le maltose qui est spécifique de certaines lectines ainsi que la D-galactosamine spécifique des ga lactosidases; l'acide imnodiacétique (IDA) qui, sous la forme de sei de Zn, complexe spécifiquement certaines protéines plasmatiques ( -globulines,
2-macroglobulines, etc.), la lysine ainsi que le p-a- minobenzoate de butyle qui sont spécifique du pl-asminogène. D'autres exemples figurent dans l'ouvrage "Methods in Enzymology, Vol 34.
Les proportions des divers ingrédients que peut contenir la présente composition sont extrêmement variées et peuvent facilement être adaptées, suivant les besoins, par le technicien compétent. En règle générale, cependant, les proportions d'acide acrylique ne devraient pas être trop faibles pour que le polymère présente une hygrophilie suffisante et pourront être comprise entre environ 10 et 70 % en poids de la composition et, de préférence, entre 20 % et 50 % en poids. Le photo-initiateur (i) est en concentration de 0,5 à 10 %, de préférence aux alentours de 1 à 5 % pour assurer une photopolymèrisa tion efficace et la proportion de l'activateur et promoteur (ii) est comprise entre environ 0,5 et 15 %, la gamme préférée se situant entre 4 et 8 % en poids. La quantité du mononère (iii) est essentiel lament dépendante de l'activité spécifique qu'on désire impartir au copolymère une fois que celui-ci est déposé sur son support. Une teile activiée commence à etre significative lorsque la composition ne con tient que des quantités relativement faibles de monomère (iii) mais, souvent, dans la pratique, on cherche à parvenir à des activités spé cifiques (par unité de surface) aussi élevées que possible. Dans un tel cas, on incorpore à la composition jusqu' à 30 et même 50 % du monomère (iii), la limite supérieure étant dictée par les propriétés physiques du revêtement obtenu par copolymérisation.
En effet, des quantités. trop importantes du monomère (iii) peu vent engendrer l'appariticn de défauts du revêtement : manque d'hy drophilie, manque d'adhésion, friabilité, etc.
Lorsque la présente composition contient, en plus, un ester acrylique, celui-ci pourra remplacer une partie de l'acide acrylique et sa concentraticn pourra être comprise entre 0 et 60 % environ. Les autres acrylates (polyfonctionnels ou prépolymères) décrits plus hauts seront éventuellement ajoutés en faibles quantités, ne dépassant pas, en général, 5 à 10 %. Il reste cependant à noter que les concentra tions ci-dessus ne sont pas critiques et peuvent être outrepassées, si besoin est, dans certains cas spéciaux.
En ce qui concerne la préparation de la présente composition adhésive, eile peut être réalisée facilement par mélange des divers ingrédients choisis, étant bien entendu que ceux-ci doivent être com patibles entre-eux. Ce mélange peut être effectué par les moyens ha bituels, notamment au moyen d'un malaxeur. Une fois le mélange obtenu, on le laisse reposer quelques heures elfin de le laisser s'é quilibrer puis on peut le stocker à l'obscurité ou 1'utiliser direc tement à la préparation de revêtements adhésifs. Pour préparer de tels revêtements, on dépose la composition sur un support suivant les technique habituelles : pinceau, pulvérisation, lame d'étalement, etc. Comme on l'a dèjà dit, pratiquement tous les supports convien nent : plaques, billes, tubes supports lisses ou rugueux, verre, mé taux, plastiques, polyoléfines, nylon, PVC, résines expansées, etc. Dans la pratique, on préfère, par exemple, traiter des billes de verre ou en matière synthétique, de telles billes pouvant, par la suite, être utilisées comme bio-catalyseurs dans divers dispositifs de la boratoire ou industriels : colonnes de purification, eneeintes de traitements de liquides biologiques, ete On peut aussi recouvrir des films très minces de polyéthylène qui, une fois repliés ou en roulés, offrent une grande surface de contact dans un volume réduit; ou encore imprègner une mousse de polyuréthanne (transparente aux UV) de manière à obtenir une strueture poreuse dont la surface in terne, recouverte d'un film de la composition, est très étendue. Suivant une autre forme d'application, on pulvérise la composition sur la surface interne d'un tube, le revêtement ainsi obtenu servant, par la suite, d'élément d'analyse dans un appareil de mesure auto matique de certains constituants de fluides biologiques.
La quantité de composition qu'on utilise par unité de surface du support peut être très faible. En effet, il a été constaté que lors du contact entre un fluide à traiter et la surface du revêtement, activé, obtenu à partir de la présente composition, seule une profondeur correspondant à quelques couches monooléculaires était mise en jeu (10 à 20 nm environ). Aussi, la couche efficace des revêtements obtenus à partir de la présente composition peut-elle être très mince (de l'ordre de 0,1 à 5g/m2) ce qui constitue un avanta ge économique non négligeable.
Une fois la présente composition étalée en couche sur tout ou partie du substrat porteur, on procède à son durcissement par photo irradiation. Lorsque le support est transparent celle-ci peut se faire recto ou, de préférence, verso, l'adhésion étant améliorée dans ce cas,
Comme source de rayonnement, on peut utiliser toute source de rayonnement électrαnagnétique dont le spectre d'émission est cons titué au moins en majeure partie par le domaine spectral situé au-des sus de 0,3 micron, par exemple une lampe à vapeur de mercure. On uti lise, de préférence, une ou plusieurs lampes à vapeur de mercure ayant une puissance comprise entre 20 Watts et 10 kilowatts.
Par exemple, on peut utiliser une lampe à vapeur de mercure ayant une puissance nominale de 2 kilowatts comme une lampe de marque PHI-LIPS vendue sous la désignation HTQ7 ou encore une lampe à vapeur de mercure ayant une puissance noninale de 5 kilowatts comme une lampe à vapeur de mercure à haute pression délivrant une énergie de 80 Watts/cm, de marque HANOVIA. Des lampes à argon ou à krypton peuvent également convenir.
La durée d' irradiation nécessaire pour obtenir la polymérisa tion de l'adhésif correspond à l'obtention d'une dose minimale d' irradiation de longueur d'onde appropriée reçue par la couche d'adhé sif. Elle varie donc essentiellement en fonction de la puissance, de la distribution spectrale de la source de rayonnement et de la distance entre cette source et l'adhesif.
Cependant, la mise en oeuvre de la composition selon l'invention permet d'obtenir avec des durées d'irradiations très courtes (comprises, par exemple, entre 0,5 seconde et quelques minutes suivant la puissance de la source de rayonnement utilisée et ses carac téristiques d'émission spectrale) une polymérisation et une adhésion satisfaisantes sur la presque totalité des supports envisageables. De plus, cette adhésion n'est que peu ou pas affectée lorsque le substrat, activé, est mis en contact avec les Solutions aqueuses, notamment les Solutions avec lesquelles on le fait réagir.
Une fois le revêtement photopolymérisé (II) obtenu, on procède à l'activation de celui-ci. Pour cela, il faut considérer, soit l'activation directe par mise en contact du substrat avec la ou les molécules biofonctionnelles à lier, soit l'activation par l' intermédiaire du pont intercalaire évoqué plus haut.
Dans le premier cas, on procède de manière tres simple, généralement en immergeant le support muni du substrat réactif dans une solution de la substance à fixer et en l'y laissant, sous agitation, le temps voulu pour atteindre un taux de fixation suffisant. Dans la pratique, on trempe le substrat dans une solution aqueuse, par exemple d'une enzyme, et on laisse ces éléments en contact de quelques minutes à plusieurs heures, après quoi on lave le substrat ac tivé jusqu'à disparition, dans les eaux de lavage, de l'enzyme libre.
Dans le second cas, on commence par procéder à la fixation du pont intercalaire, cela suivant les méthodes déjà évoquées plus haut ou suivant les méthodes abondamm ent décrites dans les références ci tées dans l'introduction. Puis on procède à la fixation des molécules biofonctionnelles oomme décrit plus haut. Dans les exemples qui sont donnés plus loin on donne des précisions sur la manière de réa liser plusieurs formes d'exécution de l'invention.
En résumé, la présente invention présente, sur les techniques de l'art antérieur, les avantages suivants :
Mise en oeuvre très simple et très rapide. Degré de specificite des sites fixateurs très élevé et excellent σontrôle du taux d'ac tivation et de la nature des molécules fixées. Extrême versatilité de la méthode, sur la base d'une composition adhésive commune, par simple Variation de la nature du monomère à copolymériser. Structure simple et bien définie du polymère, ainsi que du catalyseur biolo gique qu'on en obtient. Degré d'hygrophilie et perméabilité du polymère réglable à volonté. Adaptation à, pratiquement, tous les supports.
Suivant un exemple d' application typique d' un substrat activé (III) suivant l'invention, on revêt par pulvérisation la paroi interne de tubes de verre d' une couche d' environ l um d'une composi tion (I) contenant, comme monomère (iii), de l'acrylate de N-hydro xysuccinimide et cn irradie 10 sec au moyen d'une source UV de 2 KW placée à 15-20 cm du tube. Puis on active une portion du revêtement par immersion de la première moitié du tube dans une solution aqueuse de glucose oxydase et une seconde portion dudit revêtement par inmersion de la seconde moitié du tube dans une solution de pero xydase. Le tube ainsi activé est ensuite disposé, comme élément ac tif, dans un appareil de mesure autcmatique de glucose dans un flui de biologique, la solution traversant le tube dans le sens glucose oxydase → peroxydase. Lors de l'analyse, le glucose contenu dans la solution passant dans la première moitié du tube est décomposé en présence de glucose oxydase avec libération de F2O2 et celle-ci est mise en évidence, par son action oxydante sur un indicateur (p-to lidine, coloration bleue), cette action étant catalysée par la pe roxydase de la seconde moitié du tube actif.
Une méthode voisine permet de déterminer la quantité d'antigé ne d'un fluide biologique, ceci, en raison du degré de reproductibilité et fiabilité élevé de l'activite spécifique des revêtements suivant l'invention. On procède comme suit : On prépare un revête ment d' activité spécifique contrôlee en pulvérisant, à l'intérieur d'un tube donné, une quantité connue de composition et, après irradiation, on active le revêtement ainsi obtenu à un taux déterminé et reproductible par contact avec une solution d' anticorps. Puis, on mélange à la solution à analyser une proportion connue d'antigè ne marqué (+) (radioactif) et on met celle-ci en contact avec le substrat activé le temps voulu pour saturer les sites actifs de ce dernier. On mesure alors le taux de radioactivité de la solution rési duelle ce qui permet, par soustraction, de déterminer la quantité d'antigène marqué capturé et, par cela et en fonction de la quanti té théorique devant être absorbé par le revêtement, la proportion d'antigène non marqué originalement présente dans l'échantillon.
Les exemples suivants illustrent l'invention en détail.

Applications de laboratoire et industrielles

Exemple 1

Préparation d'une composition adhésive (I)
Dans un malaxeur, on a mélangé intimement les ingrédients sui vants: Acide acrylique 58,4 %, méthacrylate de 2 (diméthylamino) -é-thyle (DMAEMA) 13 %, acrylate de N-hydroxysuecinimide 26 %, benzo phénone 2,6 %.
On a laissé reposé ce mélcinge plusieurs heures à température ambiante, puis on a étalé une couche mince de la composition sur une plaquette de verre surfacé au moyen d'un outil de couchage manuel

(Hand Coater) puis, pour abriter l'enduit de l'air ambiant, on a ap pliqué sur celui-ci une feuille de polyester non traité qu'on a éta lée, sans la presser, au moyen d'un rouleau de caoutchouc.

Irradiation et préparation du revêtement (II)
On a soumis la plaque de verre ainsi préparée à 2 min. d'irra diation sous une lampe PHILIPS (Type HTQ7, 28W/cm) placée à 15 cm du substrat. Puis on a détaché la feuille de polyester qui s'est sé parée facilement. Le revêtement ainsi obtenu était incolore, ferme et non cassant; son épaisseur était d' approximativement 8 μm.

Activation et préparation du substrat activé (III)
On a plongé la plaquette dans une solution aqueuse à 100 mg/ml de trypsine (SIGMA) à pH 7,5 (tampon phosphate 0,5 M) et on l'a lais sé immergée 4 h dans cette solution à température ambiante. Puis on l'en a retirée et on a constaté que le revêtement avait sensiblement gonflé mais qu'il adhérait toujours parfaitement à son support. On a soigneusement lavé la plaquette au tampon phosphate 0,5 M puis on a déterminé l'activité spécifique du substrat en la plongeant dans une solution aqueuse 10-3M de p-nitroanilide de benzoyl-arginine (BAP NA) . Sous l'action enzymatique de la plaquette activée, ce composé a libéré de la p-nitroaniline qu'on a dosée spectroprotomètriquement à 410 nm. La vitesse d'hydrolyse enzymatique de ce substrat en solution était de 22 μmole/min à température ordinaire.
On en a déduit que l'activité spécifique du revêtement actif était de 50 ug de trypsine/cm2.

Exemple 2
On a procédé comme décrit à l' exemple 1 et on a préparé une composition (I) photo-adhésive à partir de :
Acide acrylique 32,5 %; acrylate de butyle 32,5 %; DMAMA 6 ,5 %; acrylamidocaproate de N-hydroxysuccini_nide 26 %; benzophénone 2,5 % .
On appliqué cette composition (stockée vers 40°C de manière à empêcher sa cristallisation par refroidissement) à l'intérieur d'un tube de polyamide 6.6 (CELLPACK A.G. , CH-5610, WOHL EN+ PG) de dimen sions suivantes : longueur utile 5 cm; diamètre 0 ,15 cm; surface in térieure utile 2,35 cm2, pour ce faire, on a d' abord rempli le tube de la composition adhésive, on l' a laissé se vider par gravité puis cn a chassé l' excès de liquide au noyen d' un jet d' air compri mé qu'on a fait circuler 3-5 sec dans le tube. Puis cn a fait circuler un lent courant d'azote dans le tube tout en le soumettant 6 min à l'action d'une lampe UV de 2 KW placée à 15 cm et en le faisant lentement tourner axialement sur lui-même pendant le temps d'irra diation. Puis, comm e à l'exemple précédent, on a immerge le tube ainsi préparé (phase (II) ) dans une solution aqueuse de trypsine et, après 4 h à température ambiante, on a constaté que l'activité spécifique du revêtement (phase III) était de 36 μg de trypsine par cm2.
Une série de 12 tubes similaires a été préparée de la même ma nière et on a constaté que, a peu de cbose près, l' activité spécifique de chacun de ceux-ci était identique. Ces tubes ont été groupés en un faisceau et réunis dans un tube de verre de diamètre environ 1,2 cm de manière a constituer un élément actif dont l'activité totale était d'environ 1000 ug de trypsine.

Exemple 3
On a procédé comme décrit aux exemples précédents et on a préparé une composition adhésive contenant : acide acrylique 35 %, acrylate d'isopropyle 30 %; DMAEMA 65 %; acrylate de 2-hydroxyéthyle 26 %; benzophénone 2,5 %.
On a dilué 100 g de cette composition dans 100 ml de méthyl-é-thyl-cétone et on a pulvérisé ce mélange sous forme d'un brouillard très fin à l'interieur de tubes de polyamide (de même type qu'à l' exemple 2) de manière à déposer, à la surface de ceux-ci, un film d'en viron 1 um. Puis on a rapidament séché les tubes sous courant d'azote, après quoi on a irradié le revêtement comme décrit dans l'exemple 2. Puis on a immergé ces tubes 15 min à température ordinaire dans une solution à 60 % de butylène diisocyanate dans du CHCL3 aprés quoi on a rincé les tubes au chloroforme de manière à éliminer l'ex cès de diisocyanate et on les a rapidement séchés sous N2.
Pour rendre le revêtement biofonctionnel, on a procédé comme suit : On a disposé deux tubes en série et on y a fait circuler 2 h à température ambiante à la cadence de 1 ml/min 10 ml d'une solution à 1,5 % d'heparine (SIGMA, 170 unites USP/mg). Puis on a lavé les tubes par une solution de NaCl à 0,9 % et on y a fait circuler à 37°C une solution constituée d'un mélange de 0,3 ml de plasma,
0,3 ml d'une solution de thrombine (
2,4 unités NIH (National Ins titute of Health, USA)) et 0,3 ml de solution physiologique. Aprés 1 min. de circulation, on a déterminé le temps de coagulation de cette solution suivant la technique Standard, la valeur trouvée étant de 44 secondes. A titre comparatif, on a fait circuler un échantillon ténoin de la solution ci-dessus dans un jeu de deux tubes identiques, placés en série, mais dont le revêtement n' avait pas été activé à l'héparine et on a mesuré, alors, un temps de coagulation de 18 sec L'héparine s'est donc bien fixée au revêtement suivant l'invention et le tube ainsi préparé présentait une action anticoagulante signi ficative.

Exemple 4
On a utilisé la même composition adhésive que celle décrite à l'exemple 2 et, au moyen d'un dispositif de couchage à lame traînan te, on a déposé un film d' environ 2-3 μm sur une feuille de polypro pylène biorienté de 12 μm d'épaisseur.
On a fait circuler cette feuille, sous protection d'un courant d'azote projeté, à sa surface, sous forme d'un flux laminaire, en regard d'une lampe UV de 28 W/cn, de manière que chaque portion de cette feuille soit irradiée 3 sec à une distance de 8 cm. Puis on a découpé la feuille en bande de 5X10 cm et on a enroulé ces bandes en spirale dans le sens de la longeur de manière à obtenir des cy lindres qu'on a ensuite introduit dans des tubes de polyamide sem blable à celui décrit dans l'Exemple 2. Une fois le cylindre intro duit dans le tube, la spirale se détend de manière que soit ménagé, entre les spires, un passage libre d'environ 2 à 5 μ d'épaisseur. On a immergé alors les tubes dans une solution aqueuse de trypsine et, après avoir procédé comme décrit dans l'Exemple 2, on a obtenu un substrat activé dont l'activité spécifique était d'envi ron 30 μ g de trypsine/cm2. On a alors réuni les tubes par faisceaux de 12 comme décrit à l'Exemple 2 ce qui a permis d'obtenir des élé ments actifs d' environ 6 cm3 dont la surface active totale était de 600 cm2 et l' activité d'environ 18 mg de trypsine. On a testé cet élément en y faisant circuler à la cadence de 5 ml/min une solution 10-3M d'ester éthylique de la benzoylarginine (BAEE) ce qui a pro voqué la libération pratiquement quantitative de la benzoylarginine (déterminée par titration suivant les moyens habituels).

Exemple 5
On a préparé une composition adhésive identique à celle de l'Exemple 2, mais en remplaçant le monomère réactif de celle-ci par de la N-acryloyl-N'-t.butoxycarbonylhydrazine de formule
CH2=CH-CO-NH-CO-O-t.Bu. On a déposé cette composition sur une feuille de polypropylène comme décrit dans l'Exemple précédent et, après irradiation, on a préparé des tubes garnis d'une feuille enroulée en spirale de ce polymère, toujours comme à l'Exemple précédent.
Pour rendre ces tubes biofonctionnels, on a procédé comme suit : On y a fait circuler 2 h une solution d'HCl 2M à 30°C puis on les a rincés avec cette même solution refroidie à 0°. On y a alors in troduit et laissé agir 5 min à 0°C une solution d'HCl 1 M et de NaNO2

1 M; puis on a rincé rapidement les tubes avec un tampon berate, pH 7,5 à 0°C. On a alors fait circuler 2 h dans les tubes une solution 0,1 M de p-aminobenzamidine dans un tampon de berate, pH 8,5, à la cadence de 1 ml/min; puis cn a rincé les tubes au tampon berate seul. Par ailleurs, on a préparé, dans une solution 0,02 M d'ions Ca++ un extrait aqueux de pancréas de boeuf comme cécrit à l'Exemple 11 et on a activé celui-ci par adjonction d'une petite portion de try psine et lente agitation 3 h à pH 8,5. Il s'est alors formé un pré cipité qu'on a séparé par centrifugation. On a ensuite prélevé 50 ml du liquide surnageant clair et cn 1'a fait circuler 1 h dans un jeu de 10 tubes préparés comme décrit ci-dessus, ces tubes étant reliés en série, à la cadence de 2 ml/min. On a lavé les tubes par du tam pon 0,1 M Tris.HCl, pH 8,1 à 0°C, puis on y a fait circuler du HCl aqueux dilué, pH 1,7 à 0°C ce qui a eu pour effet de détachier la trypsine retenue par le revêtement des tubes. Finalement, on a dialy se l'extrait par une membrane Standard de cellulose régénérée et on a lyophilisé le concentrat ce qui a fourni 14 mg d'un produit riche en trypsine et correspondant à 64 % de la quantité de trypsine totale da liquide centrifugé de départ, teile que mesurée au moyen de BAPNA (cf. Exanple 1)

Exemple 6
Dans une plaque de polyéthylène expansé de 2 cm d'épaisseur (mous se à structure ouverte) on a découpé à l'emporte-pièce (perce-bou chon) un cylindre de 4 mm de diamètre. On a imprégné ce "bouchon" de meusse de la composition adhésive de l'Exemple 2 puis on l'a in troduit dans un tube de quartz de 4 mm de diamètre et on l'a pressé et trituré avec une baguette afin d'en exprimer le plus possible de liquide adhésif. Puis on a relié le tube à une source d'azote com primé et, tout en faisant circuler ce gaz dams le tube à un rythme très lent, on a irradié le tube 6 min tout en le faisant tourner sur lui même comme è l'exemple 2.
Après durcissement de l' adhésif on a activé le substrat en fai sant circuler dans le tube une solution de trypsine à 100 mg/ml. Après Saturation du revêtement par la trypsine, on a fait circuler dans le tube une solution Standard de BAPNA (voir Exemple 1). Par le do sage de la p-nitroaniline libérée par hydrolyse on a estimé l'activité de la trypsine fixée sur la mousse à 240 μg environ.

Exemple 7
Dans un récipient cylindrique en alumine, on a placé 100 g de billes de verre d'environ 1 mm de diamètre et environ 0, 6 g de la composition adhésive de l'Exemple 2. On a fait tourner le récipient 2 h sur un mélangeur à rouleaux horizontaux, après quoi on a intro duit environ 0,3-0,4 g de ces billes dans un tube de 5 mm de diamètre et d' environ 2 cm de long. Puis on a irradié ce tube 6 min. à température ambiante ocmme décrit aux exemples précédents tout en y faisant passer un lent courant d'azote. Après polymérisation, on a mesuré , par réfractométrie, l'épaisseur du depôt (phase II) sur les billes et on a constaté que cette épaisseur était de l'ordre de 3 μ m. Puis cn procédé à l' activation biofonctionnelle des billes (phase III) comme décrit à l'Exemple 2.

Exemple 8
On a sélectionné un tube de polyamide de même type que ceux décrits à l'Exemple 2 longueur 5 cm; diamètre 0,15 cm et on l'a revêtu intérieurement d'une couche (phase II) de copolymère au moyen de la composition adhésive de ce même Exemple 2.
On a fait circuler 3 h dans ce tube une solution aqueuse contenant les ingrédients suivants : tampon berate 0,5 M; pH 8,5; NaCl 0,5 M; glucose oxidase 100 mg/ml (MERCK 16 U/mg) On a placé le tube dans un bain à 25°C (température stabilisée par thermostat) et à l'aide d'une pompe péristaltique, on a progres sivement et successivement fait circuler des échantillons d'l ml cha cun de solution de glucose (dans un tampon phosphate 0,1 M à pH 7,0) de concentrations croissant, par bonds, de 0,5 à 2,5 g/1; entre le passage de chacun des échantillons de glucose on a intercalé des por tions séparatrices de 1 ml de tampon phosphate (0,1M, pH 7,0). Le débit dans le tube etait de 3 ml/min. Après passage dans le tube actif, les échantillons ont été recueillis, un à un, dans de petites cuves contenant chacune 0,1 ml de solution aqueuse d'o-dianisidine (0,7 mg/ml) et 0,1 ml de solution de peroxidase (1 mg/ml) dans du tampon phosphate 0,1M, pH 7,0. Après mélange, les solutions des cuves se sont colorées et l'intensité de cette coloration a été mesu rée par spectrophotomètrie à 436 nm. Les résultats des mesures (den sités optiques) sont rassemblés au Tableau I ci-dessous.

TABLEAU I
Analyse de glucose par la réacticn 02+ glucose (glucose-oxydase) →
H2O2 + o-dianisidine (peroxidase) → colorant



On remarque donc qu' une relation pratiquement linéaire existe entre la concentration en glucose et la densité optique de la solution de colorant. On peut donc utiliser le revêtement activé suivant l'invention comme élément analytique pour le dosage du glucose dans des solutions aqueuses de concentration inconnue.
Le revêtement enzymatiquement actif est particulièrernent sta ble et son activité se maintient pratiquement sans changement pen dant une longue période.
Par ailleurs , on a fait transiter , toujours dans le tube décrit plus haut, des échantillons sixoessifs d'l ml de solution de glucose, séparés par des portions d'l ml de tampon phosphate 0,1 M, pH 7,0, la concentration de ces échantillons étant, alternativement, de 0,2 g/1 et de 2 g/1. On a procédé à la mesure spectrophotométri que des colorations obtenues comme décrit ci-dessus et on a trouvé les résultats ci-dessous.


Les résultats ci-dessous indiquent qu'aucun pbénomène important de "ménoire" (carry-over) ne vient troubler la mesure lorsqu'on passe d'une forte concentration en glucose à une concentration 10 fois moindre, et vice-versa. La méthode présente donc des degrés de la titude de concentrations et de fiabilité élevés. De plus, le revêtement enzymatiquement actif est parfaitement stable et son activité se maintient pratiquement sans changement durant une longue Période.

Exemple 9
On a placé dans une pipette de 20 ml 21 g de billes de verre de 1 mm recouvertes d'un revêtement photopolymérisé (phase II) telles que déecrites à l'Exemple 7. Puis on a fait circuler 3 h en con tinu à température ambiante dans la pipette une solution aqueuse contenant 100 mg/ml de chymotrypsine (SIGMA) dans un tampon phosphate 0,5 M, pH 7,5. On a rincé ensuite soigneusement la pipette au tampon phosphate 0,5 M puis on a mesuré l'activité spécifique du reêetement ainsi enzymatiquement activé au moyen du p-nitroanilide de la N-glutaryl-L-phénylalanine (GLUPHEPA) . Cette m éthode, décrite par exemple par B.F. ERLANGER et eil, dans Arch. Biochim. et Biophys. 115, 206 (1966) est basée sur le clivage du nitroanilide ci-dessus avec libération de p-nitroaniline qu'on mesure spectrophotomètr iquement à 410 nm. On a ainsi établi que l' activité de la colonne était de 60 μ g de chymotrypsine/cm2 de revêtement des billes, la surface totale des ces billes était d' environ 300 cm2.
Au moyen de la colonne ci-dessus, on a procédé à l'hydrolyse en continu d' une solution à 1 % de caséine dans du tampon phosphate 0 ,1 M, pH 7, 6. On a fait passer 1 litre de cette solution à tra vers la colonne ci-dessus à la cadence de 2 ml par min et on a constaté, par analyse de l' hydrolysat suivant les rroyens habituels, que le taux de conversion dépassait 90 %. Cette analyse a été faite selon la méthode de KUNITZ , Methods in Enzymology, vol II, p. 33. Pour cela on ajoute de l' acide trichloracétique à un aliquot de solution à doser et, après séparation du précipité forme par centrifugation, on mesure l' absorbance du liquide à 280 nm.
Après avoir laissé reposer la colonne 48 h en présence de tampon phosphate 0,1 M, on a, à nouveau, fait passer 1 1 d' une solution de caséine à 1 % à travers le tube au même débit que précédemment et, par analyse de l'hydrolysat, on a constaté que le pouvoir enzymatique du tube activé était demeuré inchange.

Exemple 10
On a préparé un film de polyéthylène recouvert d'une couche de ccmposition adhésive comme décrit dans l'exemple 4.
Avant de soumettre le film ainsi couché à la photopolymérisa tion, on l'a saupoudré d'alumine en poudre de granulométrie environ 5 m aux taux de 0,5 à 1 g/m2. puis cn a irradié le film comme dé jà décrit et on l'a découpé en rubans qu'on a enroulés sur eux-même et glissés dans des tubes comme décrit à l'Exemple 4. Les grains d'alumine fixés à la surface de l'adhésif font en sorte d'empecher que les spires jointives du ruban n'adherent l'une à l'autre et qu'il subsiste un espace süffisant, entre chaque spire, pour qu'un liquide puisse aisément circuler dans le tube.
On a fait circuler 3 h à température ordinaire dans un des tubes ainsi préparés une solution aqueuse de tampon phosphate 0,5 M, pH 7,5, contenant 100 mg/ml de Trypsine (SIGMA, type IX). Puis on a rincé le tube au tampon phosphate et on a déterminé l'activité enzymatique du revêtement fonctionnel au moyen du p-nitroanilide de la benzoyl-arginine (BAPNA) de la manière suivante : On a fait circuler 5 min. dans le tube 5 ml de la solution 10-3M de BAPNA (débit 3 ml/min.) Puis on a analysé la solution ainsi traitée par spectro photonètrie à 410 nm (pic d' absorption de la p-nitroaniline). On a ensuite déterminé la grandeur de l'équivalent de trypsine fixée sur le substrat par comparaison avec une courbe d'étalonnage standard, cette courbe représentant le taux de p-nitroaniline en fonction de la quantite de trypsine agissant sur une solution äquivalente de BAPNA. Dans le présent cas, on a évalué l'activité du revêtement à en viron 30 μg de trypsine par cm2.

Exemple 11
Dans un tube en polyamide d'un diamètre de 1,5 mm et d'l m de long, on a fait circuler une solution à 30 % dans du CHCl3 de la compo sition adhésive de l'Exemple 3. On a soigneusement égoutté le tube par gravité puis on y a fait passer un lent courant d'azote chauf fé à 40°C. Après 10 minutes, période au cours de laquelle les tra ces de CHCl3 ont été évaporées, on a soumis le tube à une irradiation au moyen d'une lampe UV qu'on a déplacée parallèlement au tu be, tout en faisant tourner celui-ci sur lui-même, de manière que chaque portion du tube soit soumis au rayonnement de la lampe pen dant environ 4 min à une distance de 15 cm.
On a ensuite rempli ce tube, par aspiration, d'une solution à 25 % de toluène diisocyanate dans le chloroforme et, après une at tente de 15-20 min, on a vidé le tube et on l'a lavé au chloroforme anhydre. Après séchage du tube au moyen d'un courant d'azote sec, on a fait circuler 24 h dans celui-ci une solution à 50 mg/ml d'inhi biteur de soja (ETUKA) dans un tampon berate à pH 9. Puis cn a rincé le tube à l'eau distillée. Par ailleurs, on a broyé et homogénéisé dans 600 ml d'eau distillée un pancréas frais de boeuf; on a centri fugé la Suspension et fait circuler en continu le liquide surnageant dans le tube active comme decrit ci-dessus. Les traces de trypsine contenues dans cette solution ont été retenues par le revêtement interne du tube alors que les substances zymogènes (facilement trans formées par la trypsine) de l'extrait sont restées inchangées en solution. On a pu ensuite traiter cet extrait, débarrassé de la trypsine indésirable, de manière à en isoler les substances zymogènes de la manière habituelle, celles-ci ayant alors pu être obtenues avec un rendement particulièrement èlevé.