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1. (KR1020180035789) RNA 분자의 번역 효율을 증가시키는 UTR
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RNA 분자의 번역 효율을 증가시키는 UTR
기 술 분 야
 본  발명은  (a)  폴리펩티드를  코딩하는  코딩  영역;  및  (b)  상기  코딩  영역의  상류에  서열번호  1을  포함하는  UTR을  포함하는  RNA  분자와  동일하거나  더  높은  번역  효율을  갖는  RNA  분자를  결과하는,  서열번호  1과  비교하여  1  내지  4개의  치환을  나타내는  서열  또는  서열번호  1에  나타낸  바와  같은  서열을  포함하는  하나  이상의  UTR(들);  및/또는  (c)  상기  코딩  영역의  하류에  서열번호  2를  포함하는  UTR을  포함하는  RNA  분자와  동일하거나  더  높은  번역  효율을  갖는  RNA  분자를  결과하는,  서열번호  2와  비교하여  1  내지  7개의  치환을  나타내는  서열  또는  서열번호  2에  나타낸  바와  같은  서열을  포함하는  하나  이상의  UTR(들)을  포함하는  RNA  분자로서;  여기서  상기  코딩  영역에  의해  코딩된  상기  폴리펩티드가  시토크롬  b-245  알파  폴리펩티드  (CYBA)가  아닌,  RNA  분자에  관한  것이다.    게다가,  본  발명은  본  발명에  따른  RNA  분자를  코딩하는  핵산  분자에  관한  것이다.    추가로,  본  발명은  본  발명에  따른  핵산  분자를  포함하는  벡터  및  본  발명에  따른  벡터를  포함하는  숙주  세포에  관한  것이다.    추가로,  본  발명은  본  발명에  따른  RNA  분자  및  임의로  제약상  허용되는  담체를  포함하는  제약  조성물에  관한  것이다.    게다가,  본  발명은  본  발명에  따른  RNA  분자를  포함하는  키트에  관한  것이다.    마지막으로,  본  발명은  RNA  분자의  코딩  영역을  상기  코딩  영역에  의해  코딩된  폴리펩티드  또는  단백질로  번역하는  효율을  증가시키기  위한  (b)에  정의된  바와  같은  하나  이상의  UTR(들)  및/또는  (c)에  정의된  바와  같은  하나  이상의  UTR(들)의  용도에  관한  것이다.
배경기술
 최근에,  전령  RNA  (mRNA)가  신약  실재(new  drug  entity)로서  점점  더  관련성이  높아졌다.    DNA  기반  유전자  치료제와는  대조적으로,  mRNA는  핵으로  수송될  필요가  있는  것이  아니라  세포질에서  단백질로  직접  번역된다  (1,2).    이로  인해,  DNA  유전자  의약의  있을  법하지는  않으나  현존하는  위험인  잠재적인  삽입  돌연변이  유발을  피하는데  있어서  mRNA가  더  안전하게  된다.    결과적으로,  mRNA  치료제는  폭넓은  다양한  의학적  적응증에서  유전자  및  단백질  대체  요법의  유망한  대안으로  드러나고  있다  (1-4).    그러나,  통상적인  mRNA의  강한  면역원성뿐만  아니라  제한된  안정성은  극복되어  그의  임상  적용성을  추가로  확립하여야  한다.    이와  관련하여,  mRNA  안정성  및  특히  mRNA의  번역률(translation  rate)은  이것이,  예를  들어,  mRNA  약물의  투여  및  투여  간격을  결정하기  때문에  예상되는  의학적  적용에  필수적인  매개  변수이다.  
 몇몇  전략이  안정성을  증가시키는  것뿐만  아니라  세포  또는  유기체에게  투여된  mRNA에  의해  촉발된  면역원성  반응을  감소시키는데도  성공적인  것으로  입증되었다.    이들  중에는  화학적으로  변형된  뉴클레오티드를  포함시키는  것이  있다  (5).    코르만(Kormann)  등은  단지  25%의  우리딘  및  시티딘  잔기를  2-티오우리딘  및  5-메틸-시티딘으로  대체하는  것이  시험관내에서  외부  투여된  mRNA에  의해  촉발된  선천  면역의  활성화를  감소시키는  것뿐만  아니라  mRNA  안정성을  증가시키기에  충분하다는  것을  보여주었다  (WO2012/0195936  A1;  WO2007024708  A2).
 또한,  mRNA에서의  비번역  영역(untranslated  region)  (UTR)은  mRNA  안정성  및  mRNA  번역  둘  다를  조절하는데  중추적인  역할을  하는  것으로  보고되었다.    UTR은  RNA  결합  단백질과의  그의  상호  작용을  통해  mRNA  안정화  및  세포내  국소화뿐만  아니라,  번역  개시,  신장(elongation),  및  종결에  영향을  미치는  것으로  공지되어  있다  (6,7).    UTR  내에  특정  모티프에  따라,  이는  mRNA  회전율(turnover)을  높이거나  낮출  수  있다  (8-11).    최근에,  mRNA  반감기  및  상응하는  UTR  서열에  대한  데이터가  공개되었다  (12,  43).
발명의 상세한 설명
 따라서, 비록 선행 기술에 mRNA의 안정성을 증가시키고, 세포 또는 유기체에게 투여된 mRNA에 의해 촉발된 면역원성 반응을 감소시키고 번역 효율을 증가시키기 위한 수단 및 방법이 이미 기재되어 있긴 하지만, 특히 번역 효율을 증가시키기 위한 추가 또는 대체 수단에 관한 개선이 여전히 필요한데 그 이유는 번역 효율은 이것이, 예를 들어, mRNA 약물의 투여 및 투여 간격을 결정하고, 궁극적으로는, 최종 생성물, 즉, 코딩된 펩티드 또는 단백질의 생체이용률을 결정하기 때문에 예상되는 의학적 적용에 필수적인 매개 변수이기 때문이다.
 본 출원은 청구범위에 정의된 바와 같은 실시양태를 제공함으로써 이러한 필요성을 해결한다.
 특히,  본  출원은  놀랍게도,  특정한  UTR이  주어진  (외래)  mRNA에  융합될  때  증가된  번역상  효율을  부여한다는  것을  밝혀냈다.    UTR은  인간   시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드  (CYBA)  유전자의  mRNA로부터  유래된다.    CYBA  유전자는  특정  5'  및  3'  UTR을  포함한다.    일반적으로,  5'  UTR  모티프  예컨대  상류  개방형  해독틀(upstream  open  reading  frame)  (uORF)  또는  내부  리보솜  진입  부위(internal  ribosomal  entry  site)  (IRES)가  유전자  조절,  특히  번역  개시에  관여한다는  것은공지되어  있다  (13).    3'  UTR은  5'  UTR보다  훨씬  더  많은  조절  기능을  포함할  수  있으며,  이들  중  일부는  mRNA  번역을  심지어  방해한다  (14).
 선행  기술에  CYB5'  UTR  단위에  대하여  어떠한  조절  모티프도  기재된  바가  없기  때문에,  본  발명의  발견은  더욱더  놀랍다.    비록  CYBA의  3'  UTR이  두  가지  조절  모티프를  함유하는  것으로  공지되어  있긴  하지만,  CYBA  UTR이  주어진  mRNA에  융합될  때  증가된  번역상  효율을  부여한다는  본  발명의  발견은  그럼에도  불구하고  놀라운데,  그  이유는  이들  두  가지  모티프는  mRNA의  안정성의  맥락에서  기재되며  번역상  효율의  증가의  맥락에서  기재되지  않기  때문이다.    보다  구체적으로,  CYBA의  3'  UTR은  세포질의  폴리아데닐화  요소  결합  단백질(cystoplasmic  polyadenylation  element  binding  protein)  (CPEB)과,  뿐만  아니라  절단  및  폴리아데닐화  신호전달  인자(cleavage  and  polyadenylation  signaling  factor)  (CPSF)와  상호  작용하는  것으로  공지된  폴리아데닐화  신호  (PAS)를  보유하는  것으로  공지되어  있다  (11).    CPEB는  세포질에서  폴리-A  테일(poly-A  tail)의  연장의  원인이  되는  것으로  공지되어  있으며,  한편  CPSF는  폴리-A의  다가오는  첨가를  위해  특정  부위에서  절단을  통해  pre-mRNA를  프라이밍한다  (11,  14).    CYB3'  UTR에  함유된  제2  조절  모티프는  인슐린  3'  UTR  안정성  요소  (INS_SCE)이다  (15).    INS_SCE  서열은  환원  조건하에  폴리피리미딘  트랙  결합  단백질(polypyrimidine  tract  binding  protein)  (PTB)에  결합하여,  인슐린의  mRNA  반감기를  증가시키는  것으로  나타났다  (15).    따라서,  CYBA의  3'  UTR의  조절  모티프  둘  다  mRNA  안정성과  주로  관련되어  있다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
 인간 CYBA 유전자의 코딩 가닥 상에 존재하는 인간 CYBA 유전자의 5'- 및 3' UTR의 뉴클레오티드 서열을 표시하는 DNA 서열을 하기 표 1에 나타냈다.
 
표 1
 
  표 1은  인간  CYBA  유전자  UTR의  정확한  유전  코드를  나타낸다.    DNA  서열은  5'에서  3'  말단으로  표시된다.    3'  UTR의  폴리아데닐화  신호  (PAS)는  볼드체로  표시되고  인슐린  3'UTR  안정성  요소  (INS_SCE)는  밑줄이  그어졌다.    5  'UTR은  71개의  염기쌍으로  이루어지며,  한편  3'  UTR은  70개의  염기  쌍을  함유한다.    UTR  둘  다  5'UTR의  경우에  약  200개의  뉴클레오티드  및  3'UTR의  경우에  대략  1000개의  뉴클레오티드로  이루어진  평균  인간  UTR보다  더  짧다.
 상기 표 1에서, 인간 CYBA 유전자 5'- 및 3' UTR을 표시하는 DNA 서열은 각각 서열번호 5 및 서열번호 6으로서 나타내진다.
 본 발명이 주로 RNA 분자에 관한 것이라는 사실을 고려하여, 상응하는 RNA 서열이 하기에 언급된다.
 상기 DNA 서열로부터 유래된 서열번호 5는 RNA 수준에서 하기 UTR 서열에 상응한다:
 5'-CGCGCCUAGCAGUGUCCCAGCCGGGUUCGUGUCGCC-3' (서열번호 1).
 이 5'UTR 서열은 인간 CYBA 유전자의 시작 코돈 바로 앞에 있다.
 상기 DNA 서열로부터 유래된 서열번호 6은 RNA 수준에서 하기 UTR 서열에 상응한다:
 5'-CCUCGCCCCGGACCUGCCCUCCCGCCAGGUGCACCC ACCUGCAAUAAAUGCAGCGAAGCCGGGA-3' (서열번호 2).
 mRNA  번역  효율에  영향을  미치는  또  다른  중요한  특징은  3'  말단에  위치하는  폴리-A  테일이다.    폴리-A  테일의  120개의  뉴클레오티드로의  연장은,  짐작컨대  더  긴  폴리-A  테일의  mRNA  분해에  대한  보호  효과  때문에,  단백질  발현에  유익한  영향을  미치는  것으로  나타났다  (16).    긴  폴리-A  테일과  대조적으로,  50개의  뉴클레오티드보다  더  짧은  폴리-A  테일을  가진  mRNA는  전혀  번역되지  않는다고  주장된다    (11,  17).    그러므로,  mRNA  요법에서,  재조합  mRNA  구축물에는  유리하게는  120개의  뉴클레오티드  또는  그  초과의  폴리-A  테일이  제공되어야  한다.    진핵  세포에서  대부분의  mRNA  전사물의  분해는  3'에서  5'  엑소뉴클레오리틱  탈아데닐화(exonucleolytic  deadenylation)로  시작하여,  대부분의  폴리  A-테일의  제거를  결과한다.    그  후에,  mRNA  바디(body)의  나머지의  분해의  원인이  되는  두  가지  주요  경로가  작동하기  시작하는  것으로  공지된다.    한편으로는,  5'  말단은  Dcp1/Dcp2  복합체에  의해  탈캐핑(decapping)된  후에,  Xrn1p에  의해  촉매되는  5'-3'  엑소뉴클레오리틱  분해가  뒤따른다.    다른  한편으로는,  엑소솜은  3'-5'  엑소리보뉴클레오리틱  분해를  가능하게  하며  5'  캡(cap)은  유지된다  (18).    게다가,  3'  폴리-A  테일과의  5'  캡  상호  작용은  mRNA의  원형  형태(circular  form)를  결과한다는  것이  공지되어  있다.    mRNA의  원형  형상은  첫  번째  정지  코돈을  번역한  후에  리보솜의  개시율(initiation  rate)을  증가시키고  분해에  대하여  mRNA를  또한  보호하는  것으로  추정된다  (19).  
 본  출원은,  그  중에서도,  놀랍게도,  천연  CYBA  mRNA의  번역상  효율의  증가는  단축된  CYB5'-  및  3'-UTR의  조합으로  그의  코딩  서열을  플링킹(flanking)함으로써  외래  mRNA에  부여될  수  있다는  것을  밝혀냈다.    이  점에서  각각  서열번호  1  및  서열번호  2에  나타낸  바와  같은,  본  발명의  5'  UTR  및  3'UTR  둘  다가  각각  서열번호  5  및  서열번호  6으로서  나타낸  인간  CYBA  유전자  5'-  및  3'  UTR을  표시하는  상기  DNA  서열보다  더  짧다는  것은  주목할  만하다.
 이것은 mRNA 형질감염(transfection) 타임 랩스(time-lapse) 무비(movie)의 단세포 분석에 의해 행하여졌는데 이는 개별 발현 시간 과정을 평가할 수 있는 것으로 최근 밝혀졌으며 (26) 한편 부착 부위의 정규 격자(regular grid) 상에 세포를 위치시키기 위해 규칙적인 미세패턴을 사용할 수 있다고 보고되었다 (27).
 그러므로,  본  출원은  이  기술이  외래  mRNA에  대한  상이한  UTR  조합을  신속하게  스크리닝하고  비교하는  해결책을  제공한다는  것을  입증하였다.    이를  해결하기  위해,  불안정화된  증강된  녹색  형광  단백질(destabilized  enhanced  green  fluorescent  protein)  (d2EGFP)의  코딩  서열을  선택하여  인위적으로  세포  내부에서  리포터  단백질의  생명  주기를  단축시켰다  (28).    조합은  5'  또는  3'  말단에서,  각각,  5'-  및  3'  말단  둘  다에서,  3  '말단에서  3'  UTR의  2개의  반복부,  또는  5  'UTR  없이  3'  UTR의  2개의  반복부와  조합된  5'  말단에서  각각의  CYBA  UTR의  삽입을  포함하였다.    이들  모두는  UTR이  없는  대조군  구축물과  비교되었다.    비교된  전사물  각각으로부터의  발현률(expression  rate)  및  단백질  및  기능적  mRNA  수명을  평가하였다.    mRNA  형질감염  후  유전자  발현  역학에  대한  단세포  분석을  모집단  기반  방법  (유동  세포측정법,  형광  현미경검사  영상화,  및  루시퍼라제  활성의  생체발광  측정)과  비교하였다.    놀랍게도  대조군과  비교하여  모든  UTR  조합에  대해  3일의  기간에  걸쳐  전체  단백질  발현이  개선되는  것으로  나타났다.
 이러한  발견은  청구범위에서  특징지어지는  실시양태를  제공한다.    따라서,  본  발명은
 (a) 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역; 및
 (b) 상기 코딩 영역의 상류에 서열번호 1을 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 1과 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들); 및/또는
 (c) 상기 코딩 영역의 하류에 서열번호 2를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 2와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들)
 을 포함하는 RNA 분자로서;
 여기서 상기 코딩 영역에 의해 코딩된 상기 폴리펩티드가 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA)가 아닌, RNA 분자에 관한 것이다.
 본  발명에  따라  사용되는  바와  같은  리보핵산  (RNA)  분자는  G,  A,  U  및  C로  명명되는  뉴클레오티드의  쇄로서  어셈블리되는  중합체  분자에  관한  것이다.    RNA의  각각의  뉴클레오티드는,  1'부터  5'까지  넘버링되어  있는  탄소와  함께,  리보스  당을  함유한다.    1'  위치,  일반적으로,  아데닌  (A),  시토신  (C),  구아닌  (G)  또는  우라실  (U)에  질소  염기가  부착된다.    중합체  RNA  분자에서  포스페이트  기는  하나의  리보스의  3'  위치  및  그  다음의  리보스의  5'  위치에  부착된다.    따라서,  중합체  RNA  분자에서의  뉴클레오티드는  서로  공유  결합되며  여기서  하나의  뉴클레오티드로부터의  포스페이트  기가  후속  뉴클레오티드  상의  3'  탄소와  결합함으로써,  포스포디에스테르  결합을  형성한다.    따라서,  RNA  가닥은  5'  말단  및  3'  말단을  갖고  있어,  리보스  고리  상의  탄소에  대해  명명된다.    통상적으로,  상류  및  하류는  RNA  전사가  일어나는  5'에서  3'  방향에  관한  것이다.    바람직하게는,  RNA  분자는  전령  RNA  (mRNA)  분자이다.    mRNA는  DNA에서  리보솜으로  유전  정보를  전달하는  RNA  분자의  큰  패밀리이며,  여기서  RNA  분자들이  유전자  발현의  단백질  생성물의  아미노산  서열을  구체화한다.    RNA  폴리머라제에  의한  1차  전사물  mRNA  (pre-mRNA로  공지됨)의  전사  후에,  프로세싱된  성숙  mRNA는  분자  생물학의  기본  원리에  요약된  바와  같이  아미노산의  중합체:  단백질로  번역된다.    DNA에서와  같이,  mRNA  유전  정보는,  각각  3개의  염기로  이루어진  코돈으로  배열되는  뉴클레오티드의  서열에  있다.    각각의  코돈은  단백질  합성을  종결시키는  정지  코돈을  제외하고,  특정  아미노산을  코딩한다.
 이하에  더  상세히  개요를  서술하는  바와  같이,  본  발명의  리보핵산  (RNA)  분자는  두  가지  또는  심지어  세  가지  주요  모듈,  즉,  (a)  폴리펩티드를  코딩하는  코딩  영역,  (b)  상기  코딩  영역의  상류에  하나  이상의  UTR,  및/또는  (c)  상기  코딩  영역의  하류에  모듈  (b)의  UTR(들)과  상이한  하나  이상의  UTR을  포함한다.    따라서,  본  발명의  RNA  분자는  그  구조와  관련하여,  코딩  영역뿐만  아니라  (5'  및  3')  비번역  영역  (UTR)뿐만  아니라,  임의로,  폴리-A  테일을  보유하는,  자연에서  발생하는  "정상적인"  mRNA  분자와  유사하다.  
 본  발명에  따라  사용된  바와  같은  용어  "코딩  영역"은  코돈으로  구성된  중합체  RNA  분자에  관한  것으로,  코돈은  "유전  코드"에  의해  제공된  정보에  따라  리보솜에  의해  디코딩(decoding)되고  단백질로  번역된다.    코딩  영역은  통상적으로  시작  코돈으로  시작하여  정지  코돈으로  종료된다.    일반적으로,  시작  코돈은  AUG  트리플렛이며,  정지  코돈은  UAA,  UAG  또는  UGA이다.    단백질-코딩  이외에도,  코딩  영역의  부분은  엑손의  스플라이싱  인핸서(exonic  splicing  enhancer)  또는  엑손의  스플라이싱  사일런서(silencer)로서  pre-mRNA에서  조절  서열로서  역할을  할  수  있다.    본  발명에  따라  사용된  바와  같은  폴리펩티드  또는  단백질을  코딩하는  유전자  코딩의  코딩  영역은  또한  코딩  서열  또는  CDS  (코딩  DNA  서열로부터)로서  공지되어  있으며,  폴리펩티드  또는  단백질을  코딩하는,  엑손으로  구성된  유전자의  DNA  또는  RNA의  부분이다.    언급한  바와  같이,  상기  영역은  시작  코돈에  의해  5'  말단에  더  가까이  그리고  정지  코돈으로  3'  말단에  더  가까이  경계를  이룬다.    mRNA에서의  코딩  영역은,  또한  엑손의  부분인  5  프라임  비번역  영역  (5  'UTR)  및  3  프라임  비번역  영역  (3'  UTR)에  의해  플랭킹된다.    코딩  영역  또는  CDS는,  mRNA  전사물의  부분,  즉,  리보솜에  의해  폴리펩티드  또는  단백질로  번역되는,  본  발명에  따라  사용된  바와  같은  폴리펩티드를  코딩하는  코딩  영역의  부분이다.
 본  발명에  따라  사용된  바와  같은  용어  "비번역  영역"  또는  "UTR"은  번역되지  않고,  따라서  각각  5  프라임  비번역  영역  (5'  UTR)  및  3  프라임  비번역  영역  (3'  UTR)으로  칭해지는  mRNA  상류의  시작  코돈  및  하류의  정지  코돈의  절편(section)에  관한  것이다.    이들  영역은  코딩  영역으로  전사되며  따라서  이들은  성숙  mRNA에  존재함에  따라  엑손이다.  
 본  발명에서  사용된  바와  같이,  3'  비번역  영역  (3'-UTR)은  번역  종결  코돈을  바로  뒤따르는  전령  RNA  (mRNA)의  절편에  관한  것이다.    mRNA  분자는  DNA  서열로부터  전사되며  나중에  단백질로  번역된다.    mRNA  분자의  몇몇  영역은  5'  캡,  5'  UTR,  3'  UTR,  및  폴리-A  테일을  포함하여  단백질로  변역되지  않는다.
 본  발명에서  사용된  바와  같이,  5'  비번역  영역  (5'  UTR)  (선도  서열(Leader  Sequence)  또는  선도  RNA로도  공지됨)은  시작  코돈으로부터  직접  상류에  있는  mRNA의  영역이다.    5'  UTR은  전사  시작  부위에서  시작하며  코딩  영역의  시작  코돈  (통상  AUG)  전에  하나의  뉴클레오티드  (nt)로  종료된다.    원핵  생물에서,  5  'UTR의  길이는  3-10개의  뉴클레오티드  길이의  경향이  있으며  한편  진핵  생물에서  길이가  더  길어지는  경향이  있어,  일반적으로  100개에서  수천개의  뉴클레오티드  길이의  경향이  있지만  때때로  또한  더  짧은  UTR이  진핵  생물에서  발생한다.  
 본  발명에서  사용된  바와  같이,  3'UTR은  mRNA의  안정성  및  폴리아데닐화에  영향을  미치는  것으로  공지된  3'-비번역  영역  내에  조절  영역을  포함할  수  있다.    많은  3'-UTR은  AU  풍부  요소(AU-rich  element)  (ARE)를  또한  함유한다.    더욱이,  3'-UTR은  mRNA  전사물의  말단에  폴리(A)  테일로  칭해지는  수백개의  아데닌  잔기의  첨가를  지시하는  AAUAAA  서열을  함유한다.  
 이하에  추가로  더  상세히  개요를  서술하는  바와  같이,  본  발명에  따라  사용된  바와  같은  RNA  분자는  폴리-A  테일을  또한  함유할  수  있다.    폴리-A  테일은  폴리아데닐화로  칭해지는  과정에  의해  pre-mRNA의  3'  말단에  첨가된  아데닌  뉴클레오티드의  긴  서열  (종종  수백개)이다.    이  테일은  핵으로부터  유출(export)  및  번역을  촉진하고,  mRNA가  분해되지  못하도록  한다.    폴리아데닐화는  전령  RNA에  폴리(A)  테일을  첨가하는  것이다.    폴리(A)  테일은  다수의  아데노신  모노포스페이트로  이루어져  있으며;  환언하면,  이는  아데닌  염기만을  갖는  RNA의  신장(stretch)이다.    진핵  생물에서,  폴리아데닐화는  번역을  위해  성숙  전령  RNA  (mRNA)를  생산하는  과정의  부분이다.
 상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 RNA 분자는 바람직하게는 두 가지 또는 세 가지 주요 모듈, 즉, (a) 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역; 및 (b) 상기 코딩 영역의 상류에 서열번호 1을 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 1과 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들); 및/또는 (c) 상기 코딩 영역의 하류에 서열번호 2를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 2와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들)을 포함한다.
 따라서, 본 발명의 RNA 분자는 두 가지 주요 모듈, 즉, 상기 모듈 (a) 및 모듈 (b) 및 임의로 또한 모듈 (c)를 포함하는 것이 필수적이다.
 또  다른  바람직한  실시양태에서,  본  발명의  RNA  분자는  세  가지  주요  모듈,  즉,  상기  모듈  (a)  및  모듈  (b)  및  모듈  (c)를  포함한다.    그러나,  모듈  (a)는  필수적이지만,  RNA  분자는  또한  모듈  (b)  또는  (c)  중  하나가  결핍될  수  있다는  것이  또한  예상된다.
 RNA  분자의  한  모듈,  즉,  "폴리펩티드를  코딩하는  코딩  영역"  (모듈  (a))은  특히  제한되지는  않으며  주어진  세포에서  발현되는  임의의  원하는  코딩  영역일  수있다.    따라서,  이  모듈은  원하는  폴리펩티드,  즉,  원하는  최종  생성물을  코딩하는  코딩  영역일  수  있다.    본  발명은  "폴리펩티드를  코딩하는  코딩  영역"에  대하여  제한되지는  않으며  그  이유는  코딩  영역의  본성은  세포에서  생성되는  원하는  생성물에  따라  달라지기  때문이다.    이러한  코딩  영역은  또한  공지된  천연  서열과  상이하고  돌연변이  (즉  점  돌연변이,  삽입  돌연변이,  결실  및  그의  조합)를  함유하는  뉴클레오티드  서열일  수  있다.    게다가,  이러한  코딩  영역은  부분적으로  또는  전체  범위로  모듈  (a)로서  사용되는  천연  서열로부터  유래된  코돈  최적화된  서열일  수  있다.    코돈  최적화는  관심  유전자의  번역상  효율을  증가시킴으로써  단백질  발현을  최대화하는  기술이다.    천연  유전자는  이용  가능한  코돈을  무작위로  사용하는  것이  아니라,  동일한  아미노산에  대해  특정  코돈에  대해  특정  선호를  나타내는  것으로  공지되어  있다.    따라서,  유전  코드의  축퇴(degeneracy)  때문에  -  하나의  아미노산은  수개의  코돈에  의해  코딩될  수  있어  -  관심  유전자의  뉴클레오타이드  서열을  동일  또는  또  다른  종의  바람직한  코돈  세트로  형질전환시킨다.    그러나,  시토크롬  b-245  알파  폴리펩티드  (CYBA)  유전자의  코딩  영역  (모듈  (a))은  제외되며,  따라서,  본  발명의  RNA  분자는  모듈  (a),  즉,  폴리펩티드를  코딩하는  코딩  영역을  포함하는  RNA  분자이나,  여기서  (a)에서의  폴리펩티드를  코딩하는  상기  코딩  영역은  시토크롬  b-245  알파  폴리펩티드  (CYBA)를  코딩하는  코딩  영역이  아니다.    시토크롬  b-245  알파  폴리펩티드  (CYBA)를  코딩하는  코딩  영역뿐만  아니라  상응하는  아미노산  서열은  관련  기술분야에  공지되어  있다.    시토크롬  b-245  알파  폴리펩티드는  수퍼옥시드를  생성할  수  있는  것으로  공지되어  있으며  식균  작용에  관여하는  것으로  공지되어  있다.    시토크롬  b-245  알파  폴리펩티드  (CYBA)를  코딩하는  코딩  영역의  예는  서열번호  9에  나타냈다.    따라서,  바람직한  실시양태에서,  본  발명의  RNA  분자는  모듈  (a),  즉,  폴리펩티드를  코딩하는  코딩  영역을  포함하는  RNA  분자이며  여기서  (a)에서의  폴리펩티드를  코딩하는  상기  코딩  영역은  서열번호  9에  나타낸  바와  같은  시토크롬  b-245  알파  폴리펩티드  (CYBA)를  코딩하는  코딩  영역  또는  서열번호  9와  적어도  x%  동일한  아미노산  서열을  나타내는  코딩  영역이  아니며  여기서  x는  90  내지  100의  정수,  바람직하게는  95,  96,  97,  98  또는  99이다).    예로서,  DNA  수준에서,  시토크롬  b-245  알파  폴리펩티드  (CYBA)를  코딩하는  폴리펩티드의  코딩  영역을  나타내는  서열을  서열번호  8에  나타냈다.
 언급한  바와  같이,  모듈  (a)는  특히  제한되지는  않으며  주어진  세포에서  발현되는  임의의  원하는  코딩  영역일  수  있다.    따라서,  본  발명의  맥락에서,  "코딩  영역"은  세포  내로  도입되는  경우,  폴리펩티드/단백질  또는  그의  단편으로  번역가능한  임의의  폴리리보뉴클레오티드  분자를  의미하는  것으로  이해되어야  한다.    여기에서  용어  "폴리펩티드"  및  "단백질"은  임의의  종류의  아미노산  서열,  즉  펩티드  결합을  통해  각각  연결된  2개  이상의  아미노산의  쇄를  망라하며,  또한  펩티드  및  융합  단백질을  포함한다.
 바람직한  실시양태에서,  "폴리펩티드를  코딩하는  코딩  영역"은  세포  내  또는  세포  부근에서  기능이  필요하거나  유익한  폴리펩티드/단백질  또는  그의  단편,  예를  들어,  그의  결핍되거나  결함이  있는  형태가  질환  또는  질병의  촉발  인자이며,  이의  제공으로  질환  또는  질병을  완화시키거나  예방할  수  있는  단백질,  또는  세포  또는  그  부근에서  신체에  유익한  과정을  촉진할  수  있는  단백질을  코딩하는  리보뉴클레오티드  서열을  함유한다.    코딩  영역은  완전  단백질  또는  그의  기능적  변이체에  대한  서열을  함유할  수  있다.    추가로,  코딩  영역의  리보뉴클레오티드  서열은  인자,  유도  인자,  조절  인자,  자극  인자  또는  효소,  또는  그의  기능적  단편으로서  작용하는  단백질을  코딩할  수  있는데,  여기서  이  단백질은  장애,  특히  대사  장애를  치료하기  위해  또는  생체내에서의  과정,  예컨대  새로운  혈관,  조직  등의  형성을  시작하기  위해  기능이  필요한  단백질이다.    여기에서,  기능적  변이체는,  세포에서의  기능이  필요하거나  그의  결핍되거나  결함이  있는  형태가  병원성인  단백질의  기능을  세포에서  수행할  수  있는  단편을  의미하는  것으로  이해된다.  
 바람직한  실시양태에서,  "폴리펩티드를  코딩하는  코딩  영역"은  치료  또는  예방  효과를  갖는  치료상  또는  제약상  활성인  폴리펩티드  또는  단백질을  코딩한다.    이와  같이,  상기  "폴리펩티드를  코딩하는  코딩  영역"을  포함하는  본  발명의  RNA  분자는  핵산  요법  및  관련  적용에서  사용될  수  있다.    이  맥락에서,  본  발명에  따라,  도입된  외인성  RNA  분자의  상기  코딩  영역에  의해  코딩된  폴리펩티드  또는  단백질로  RNA  분자의  코딩  영역을  번역하는  증가된  효율은  내인성  유전자  발현을  보완하거나  보충하도록  의도될  수  있으며,  특히,  내인성  유전자가  결함이  있거나  침묵하여,  유전자  발현의  전혀  없거나,  불충분하거나  결함이  있거나  기능  장애가  있는  생성물을  야기하는  경우이며,  예컨대  많은  대사성  및  유전성  질환  예컨대  두서너  가지  예만  들면  낭성  섬유증,  혈우병  또는  근위축증이  있는  경우이다.    본  발명의  도입된  외인성  RNA  분자의  폴리펩티드로  RNA  분자의  코딩  영역을  번역하는  증가된  효율은  발현의  생성물이  유전자  발현,  신호  전달  및  기타  세포  과정의  조절과  같은  임의의  내인성  세포  과정과  상호  작용하거나  상기  과정에  지장을  주도록  또한  의도될  수  있다.    도입된  외인성  RNA  분자의  폴리펩티드로  RNA  분자의  코딩  영역을  번역하는  증가된  효율은  형질감염된  또는  형질도입된  세포가  거주하거나  거주하게  되는  유기체와  관련하여  면역  반응을  야기하도록  또한  의도될  수  있다.    예는  백신  접종을  목적으로  항원을  제시하게  하도록  수지상(dendritic)  세포와  같은  항원-제시  세포의  유전자  변형이다.    또  다른  예는  상기  코딩  영역이  시토카인을  코딩하는,  폴리펩티드로  RNA  분자의  코딩  영역을  번역하는  증가된  효율이다.    이는,  예를  들어,  종양-특이적  면역  반응을  도출하기  위해  종양에  바람직할  수  있다.    더욱이,  외인성  RNA  분자의  폴리펩티드로  RNA  분자의  코딩  영역을  번역하는  증가된  효율은  세포  요법을  위한  유전자  변형된  세포,  예컨대  재생  의학을  위한  변형된  T-세포  또는  전구체  또는  줄기  또는  기타  세포를  일시적으로  생체내  또는  생체외에서  생성하도록  또한  의도될  수  있다.
 다른  바람직한  실시양태에서,  "폴리펩티드를  코딩하는  코딩  영역"은,  예를  들어  제어된  재생에서  필수적인  성장  과정  및  혈관  형성에  관여하는  단백질을  코딩  할  수  있고,  그  다음에  본  발명에  따른  RNA  분자의  도입에  의해  특이적으로  형성  될  수  있다.    이는  예를  들어  성장  과정에서  또는  골  결함,  조직  결함의  치료에  그리고  착상  및  이식의  맥락에서  유용할  수  있다.
 언급한  바와  같이,  "폴리펩티드를  코딩하는  코딩  영역"을  포함하는  본  발명의  RNA  분자는  체내에  자연적으로  존재할  것이지만  유전자  결함  또는  질환  때문에  존재하지  않거나  부족한  형태로  존재하거나  너무  적은  양으로  존재하는  폴리펩티드  또는  단백질이  신체에  제공되어야  하는  임의의  경우에  적절하게  사용될  수  있다.    그의  결핍  또는  결함이  질환과  관련되어  있는,  단백질  및  이들을  코딩하는  유전자가  공지되어  있다.    무손상  폴리펩티드  또는  단백질을  코딩하는  코딩  영역의  각각의  무손상  버전은  본  발명에  따라서  사용될  수  있다.  
 단일  유전자의  돌연변이에  의해  유발되는,  수많은  유전적  장애가  공지되어  있으며  mRNA  치료  접근법에  대한  후보이다.    낭성  섬유증,  혈우병  및  많은  다른  것들과  같이  단일  유전자  돌연변이에  의해  유발된  장애는  특정  소질이  자손에  나타날  가능성에  관하여  우성  또는  열성이  될  수  있다.    우성  대립  유전자가  단지  하나의  카피의  대립  유전자를  갖는  개체에서  표현형을  나타내지만,  열성  대립  유전자의  경우  분명해지기  위해서는  개체는  각각의  부모로부터  하나씩  두  개의  카피를  가져야  한다.    그에  반해서,  다유전자  장애는  둘  이상의  유전자에  의해  유발되며,  각각의  질환의  징후는  종종  일정하지  않으며  환경  요인과  연관이  있다.    다유전자  장애의  예는  고혈압,  상승된  콜레스테롤  수준,  암,  신경변성  장애,  정신병  및  기타  장애이다.    또한  이들  경우에  이들  유전자  중  하나  이상을  나타내는  치료용  mRNA는  그러한  환자들에게  유익할  수  있다.    더욱이,  유전적  장애는  부모의  유전자로부터  대물림되었을  리는  없으나,  새로운  돌연변이에  의해  유발될  수도  있다.    또한  이들  경우에  정확한  유전자  서열을  나타내는  치료용  mRNA는  환자들에게  유익할  수  있다.
 인간  유전자  및  유전적  장애의  현재  22,993개  항목을  그  각각의  유전자  및  그  표현형에  대한  기재와  함께  가진  온라인  카탈로그는  ONIM  (Man  in  Online  Mendelian  Inheritance  in  Man)  웹  페이지  (http://onim.org)에서  이용  가능하고;  각각의  서열은  유니프로트  데이터베이스(Uniprot  database)  (http://www.uniprot.org)로부터  이용  가능하다.    비제한적  예로서,  하기   표 2는  선천성  질환,  및  상응하는  유전자(들)를  열거한다.    세포  신호  전달  경로의  상호  작용의  정도가  높기  때문에,  특정  유전자의  돌연변이는  병원성  증상을  배가시키며  그  중  특징적인  것만을   표 2에 열거하였다.
 본 발명의 일부 실시양태에서, 치료용 단백질은 표 2에  열거된  세포성  단백질로부터  선택된다.    따라서,  본  발명의  조성물은  치료용  세포성  단백질을  코딩하는  mRNA를  포함할  수  있으며,  여기서  코딩된  치료용  단백질은   표 2에 열거된 것 또는 그의 동족체이다.
 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 치료용 단백질은 표 2에  열거된  분비된  단백질로부터  선택된다.    따라서,  본  발명의  조성물은  치료용  융합  단백질을  코딩하는  mRNA를  포함할  수  있으며,  여기서  코딩된  치료용  단백질  또는  그의  동족체는   표 2에  열거된  것이며  제2  단백질은  치료용  단백질의  분비를  허용하는  신호  펩티드이다.    신호  펩티드는  짧고,  전형적으로  5-30개의  아미노산  길이의,  상기  치료용  단백질의  N-말단에  존재하는  아미노산  서열이며  특정  소기관  (즉  소포체,  골지체  또는  엔도솜)을  통해  세포의  분비  경로를  향해  융합  단백질을  야기한다.    따라서,  이러한  융합  단백질은  세포로부터  또는  세포성  소기관으로부터  분비되거나  세포성  구획에서  또는  세포  표면에서  세포성  막  (예를  들어  다중  폭(multi-spanning)  막관통  단백질)에  삽입된다.
 따라서,  본  발명의  바람직한  실시양태에서  "폴리펩티드를  코딩하는  코딩  영역"  (모듈  (a))은  질환을  유발하거나,  질환에  취약하게  하거나,  질환으로부터  보호하는  하기  유전자를  코딩할  수  있으나  이에  제한되지는  않는다.    치료  (또는  예방)될  수  있는  이러한  장애의  비제한적인  예는  상기  폴리펩티드,  단백질  또는  펩티드가  하기   표 2에 개요를 서술하는 바와 같은 것들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것들을 포함한다.
 일부  실시양태에서,  "폴리펩티드를  코딩하는  코딩  영역"은  천연  단백질의  것  이상의  수준에서  세포  활성을  포함하는  부분  또는  전체  길이의  단백질로  번역될  수  있다.    일부  실시양태에서,  "폴리펩티드를  코딩하는  코딩  영역"은  치료  또는  예방  효과를  갖는  치료상  또는  제약상  활성인  폴리펩티드,  단백질  또는  펩티드를  코딩하며,  여기서  상기  폴리펩티드,  단백질  또는  펩티드는   표 2에  개요를  서술한  바와  같은  것들로  이루어진  군으로부터  선택된다.    "폴리펩티드를  코딩하는  코딩  영역"은  은  천연  단백질의  것  이하의  수준에서  세포  활성을  가진  부분  또는  전체  길이의  단백질을  발현시키기  위해  사용될  수  있다.    이는  RNA  분자의  투여가  지시될  수  있는  질환의  치료를  허용할  수  있다.
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 상기 표 2는  유전자의  예를  나타내며  여기서  결함은  본  발명의  RNA  분자로  치료될  수  있는  질환을  야기하며  여기서  RNA  분자는  상기  개시된  결손  유전자의  단백질  또는  그의  기능적  단편의  무손상  버전을  코딩하는  "폴리펩티드를  코딩하는  코딩  영역"을  포함한다.    특히  바람직한  실시양태에서,  유전  질환이  언급될  수  있는데,  이는  예를  들어  폐에  영향을  미치는  것,  예컨대  SPB  (계면활성제  단백질  B)  결핍,  ABCA3  결핍,  낭성  섬유증  및  α1-항트립신  결핍,  또는  혈장  단백질에  영향을  미치고  (예를  들어  선천성  혈색소증  (헵시딘  결핍),  혈전성  혈소판감소성  자반병  (TPP,  ADAMTS  13  결핍))  응고  결함  (예를  들어  혈우병  a  및  b)  및  보체  결함  (예를  들어  단백질  C  결핍),  면역  결함  예컨대  예를  들어  SCID  (상이한  유전자  예컨대:  RAG1,  RAG2,  JAK3,  IL7R,  CD45,  CD3δ,  CD3ε에서  돌연변이에  의해  유발)  또는  예를  들어  아데노신  데스아미나제의  결핍으로  인한  결핍증  (ADA-SCID),  폐혈성  육아종증  (예를  들어  gp-91-phox  유전자,  p47-phox  유전자,  p67-phox  유전자  또는  p33-phox  유전자의  돌연변이에  의해  유발)  및  축적병  예컨대  고셰병,  파브리병,  크라베병(Krabbe's  disease),  MPS  I,  MPS  II  (헌터  증후군),  MPS  VI,  글리코겐  축적병  유형  II  또는  점액다당류증을  유발하는  것이다.
 "펩티드를 코딩하는 코딩 영역"을 포함하는 본 발명이 유용할 수 있는 기타 장애는 장애 예컨대 SMN1-관련 척수성 근위축 (SMA); 근위축 측삭 경화증 (ALS); GALT-관련 갈락토스혈증; 낭성 섬유증 (CF); SLC3A1-관련 장애, 예를 들어 시스틴뇨증; COL4A5-관련 장애, 예를 들어 알포트(Alport) 증후군; 갈락토세레브로시다제 결핍증; X-연관 부신백질이영양증 및 부신척수신경병증; 프리드라이히 운동실조; 펠리제우스-메르츠바하병(Pelizaeus-Merzbacher disease); TSC1 및 TSC2-관련 결절성 경화증; 산필립포 B 증후군(Sanfilippo B syndrome) (MPS IIIB); CTNS-관련 시스틴증; 취약 X 증후군, 취약 X-연관 진전/운동실조 증후군 및 취약 X 조기 폐경 증후군을 포함한 FMR1-관련 장애: 프라더-윌리 증후군; 유전성 출혈 모세혈관확장증 (AT); 니만-픽 병 유형 C1; 신경원성 세로이드 리포푸신증(neuronal ceroid lipofuscinosis)-관련 질환, 예를 들어 소아 신경원성 세로이드 리포푸신증(Juvenile Neuronal Ceroid Lipofuscinosis) (JNCL), 소아 바텐병(Juvenile Batten disease), 산타부오리-할티아병(Santavuori-Haltia disease), 얀스키-빌쇼스키병(Jansky-Bielschowsky disease), 및 PTT-1 및 TPP1 결핍증; EIF2B1, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B4 및 EIF2B5-관련, 중추신경계 저수초형성증/소멸 백색질을 가진 아동기 운동실조; CACNA1A 및 CACNB4-관련 2형 발작성 운동 실조(Episodic Ataxia Type 2); MECP2-관련 장애, 예를 들어 전형적 레트 증후군(Classic Rett Syndrome), MECP2-관련 중증 신생아 뇌병증(Severe Neonatal Encephalopathy) 및 PPM-X 증후군; CDKL5-관련 비전형 레트 증후군(Atypical Rett Syndrome); 케네디병(Kennedy's disease) (SBMA); 노치(Notch)-3 관련 대뇌 상염색체 우성 동맥병증 (피질하 경색 및 백색질 뇌증을 가짐) (CADASIL); SCN1A 및 SCN1B-관련 발작 장애; 폴리머라제 G-관련 장애, 예를 들어 알퍼스-후텐로처 증후군(Alpers-Huttenlocher syndrome), POLG-관련 감각 실조 신경병증(sensory ataxic neuropathy), 구음 장애, 및 안근마비, 및 상염색체 우성 및 열성 진행성 외 안근마비 (미토콘드리아 DNA 결실을 가짐); X-연관 부신 형성저하증; X-연관 무감마글로불린혈증; 파브리병; 및 윌슨병을 포함한다.
 모든  이들  질환에서,  단백질,  예를  들어  효소가  결함이  있으며,  이는  본  발명에  따른  RNA로  처리함으로써  치료될  수  있으며,  이는  이용  가능한  결손  유전자  또는  그의  기능적  단편에  의해  코딩된  단백질을  이용할  수  있게  한다.    전사물  대체  요법/효소  대체  요법은  근본적인  유전적  결함에  영향을  미치는  것이  아니라,  환자가  결핍된  효소의  농도를  증가시킨다.    예로서,  폼페병에서,  전사물  대체  요법/효소  대체  요법은  결핍  리소솜  효소  산  알파-글루코시다제  (GAA)를  대체한다.
 따라서,  본  발명에  따른  모듈  (a)의  "폴리펩티드를  코딩하는  코딩  영역"에  의해  코딩될  수  있는  단백질의  비제한적인  예는  에리트로포이에틴  (EPO),  성장  호르몬  (소마토트로핀,  hGH),  낭성  섬유증  막관통  전도도  조절  인자  (CFTR),  성장  인자  예컨대  GM-SCF,  G-CSF,  MPS,  단백질  C,  헵시딘,  ABCA3  및  계면활성제  단백질  B이다.    본  발명에  따른  RNA로  치료될  수  있는  질환의  추가  예는  혈우병  A/B,  파브리병,  CGD,  ADAMTS13,  헐러병(Hurler's  disease),  X  염색체-매개  A-γ-글로불린혈증,  아데노신  데아미나제-관련  면역결핍  및  신생아에서  호흡  곤란  증후군  (이는  SP-B와  연관됨)이다.    특히  바람직하게는,  본  발명에  따른  RNA  분자의  "폴리펩티드를  코딩하는  코딩  영역"은  계면활성제  단백질  B  (SP-B)에  대한  또는  에리트로포이에틴에  대한  서열을  함유한다.    본  발명에  따른  RNA  분자의  "폴리펩티드를  코딩하는  코딩  영역"에  의해  코딩될  수  있는  단백질의  추가  예는  성장  인자  예컨대  인간  성장  호르몬  hGH,  BMP-2  또는  혈관형성  인자이다.
 대안적으로  핵산은  전장  항체  또는  보다  작은  항체  (중쇄  및  경쇄  둘  다)를  코딩하여  대상체에게  면역을  부여할  수  있다.    또  다른  실시양태에서,  "폴리펩티드를  코딩하는  코딩  영역"은  기능적  모노클로날  또는  폴리클로날  항체를  코딩할  수  있으며,  이는  생물학적  표적  (예를  들어,  자극성  시토카인  예컨대  종양  괴사  인자)을  표적화  및/또는  불활성화하는데  유용할  수  있다.    유사하게,  "폴리펩티드를  코딩하는  코딩  영역"은,  예를  들어,  막증식  사구체  신염  제II형  또는  급성  용혈  요독  증후군의  치료에  유용한  기능성  항-신장  인자  항체를  코딩할  수  있거나,  대안적으로  VEGF-매개  질환,  예컨대  암의  치료에  유용한  항-혈관  내피  성장  인자  (VEGF)  항체를  코딩할  수  있다.
 모듈  (a),  즉,  "폴리펩티드를  코딩하는,  그의  5'  말단에서  시작  코돈을  포함하는  코딩  영역"은,  유전자  편집  기술에서  사용될  수  있는  폴리펩티드  또는  단백질을  코딩하는  코딩  영역일  수  있다.    게놈  편집은  뉴클레아제를  사용하는  유기체의  게놈에서  DNA가  삽입,  결실  또는  대체되는  유전  공학의  한  유형이다.    이들  뉴클레아제는  게놈에서  원하는  위치에서  부위-특이적  파단(break)을  생성한다.    유도된  파단은  비-상동성  말단  연결  또는  상동성  재조합에  의해  복구되어,  게놈에서  표적화된  돌연변이를  결과함으로써,  게놈을  "편집"한다.    파단은  단일  가닥  파단  또는  이중  가닥  파단  (DSB)일  수  있지만  이중  가닥  파단  (DSB)이  바람직하다.    상이한  폴리펩티드  또는  단백질을  이용하는  수많은  게놈  편집  시스템,  즉,  예를  들어,  CRISPR-Cas  시스템,  메가뉴클레아제(meganuclease),  아연  핑거  뉴클레아제(zinc  finger  nuclease)  (ZFN)  및  전사  활성화제-유사  이펙터-기반  뉴클레아제  (TALEN)가  관련  기술분야에  공지되어  있다.    게놈  공학을  위한  방법은  문헌  [Trends  in  Biotechnology,  2013,  31  (7),  397-405]에  검토되어  있다.
 따라서,  바람직한  실시양태에서,  "폴리펩티드를  코딩하는  그의  5'  말단에서  시작  코돈을  포함하는  코딩  영역"은  Cas  (CRISPR  연관  단백질)  단백질  패밀리,  바람직하게는  Cas9  (CRISPR  연관  단백질  9)의  폴리펩티드  또는  단백질을  코딩하는  뉴클레오티드  서열을  함유한다.    Cas  단백질  패밀리,  바람직하게는  Cas9의  단백질은,  CRISPR/Cas9  기반  방법  및/또는  CRISPR/Cas9  유전자  편집  기술에서  사용될  수  있다.    게놈  편집,  조절  및  표적화를  위한  CRISPR-Cas  시스템은  문헌  [Nat.  Biotechnol.,  2014,  32(4):347-355]에  검토되어  있다.
 또  다른  바람직한  실시양태에서,  "폴리펩티드를  코딩하는  그의  5'  말단에서  시작  코돈을  포함하는  코딩  영역"은  메가뉴클레아제를  코딩하는  뉴클레오티드  서열을  함유한다.    메가뉴클레아제는  "통상적인"  엔도데옥시리보뉴클레아제와  대조적으로,  큰  인식  부위  (예를  들어,  12  내지  40개  염기  쌍의  이중  가닥  DNA  서열)를  인식하는  엔도데옥시리보뉴클레아제이다.    결과적으로,  각각의  부위는,  임의의  주어진  게놈에서  단지  수회,  바람직하게는  단지  1회  발생한다.    따라서  메가뉴클레아제는  가장  특이적인  자연적으로  발생하는  제한  효소로  간주되며,  따라서  유전자  편집  기술에서  적합한  도구이다.
 또  다른  바람직한  실시양태에서,  "폴리펩티드를  코딩하는  그의  5'  말단에서  시작  코돈을  포함하는  코딩  영역"은  아연  핑거  뉴클레아제  (ZFN)를  코딩하는  뉴클레오티드  서열을  함유한다.    ZFN은  아연  핑거  DNA-결합  도메인을  DNA-절단  도메인에  융합시킴으로써  생성된  인위적인  제한  효소이다.    아연  핑거  도메인은  특정의  원하는  DNA  서열을  표적화하도록  조작될  수  있으며,  이로  인해  아연-핑거  뉴클레아제는  복잡한  게놈  내에서  특유한  서열을  표적화할  수  있게  된다.    내인성  DNA  복구  기계류를  이용함으로써,  ZFN은  고등  생물의  게놈을  정확하게  변경하는데  사용될  수  있으며,  따라서,  유전자  편집  기술에서  적합한  도구이다.
 또  다른  바람직한  실시양태에서,  "폴리펩티드를  코딩하는  그의  5'  말단에서  시작  코돈을  포함하는  코딩  영역"은  전사  활성화제-유사  이펙터  뉴클레아제  (TALEN)를  코딩하는  뉴클레오티드  서열을  함유한다.    TALEN은  DNA의  특정  서열을  커팅하도록  조작될  수  있는  제한  효소이다.    TALEN은  TAL  이펙터  DNA-결합  도메인이  뉴클레아제의  DNA  절단  도메인에  융합되어  있는  융합  단백질이다.    전사  활성화제-유사  이펙터  (TALE)는  실제적으로  임의의  원하는  DNA  서열을  결합하도록  조작  될  수  있다.    따라서,  뉴클레아제와  조합될  때,  DNA는  특정의  원하는  위치에서  커팅될  수  있다.
 제2 모듈 (b)는 서열번호 1을 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 1과 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들)이다.
 이  맥락에서  "하나  이상"은  RNA  분자의  모듈  (b)가  본  발명의  서열번호  1을  포함하는  UTR을  포함하는  RNA  분자와  동일하거나  더  높은  번역  효율을  갖는  RNA  분자를  결과하는,  서열번호  1과  비교하여  1  내지  4개의  치환을  나타내는  서열  또는  서열번호  1에  나타낸  바와  같은  서열을  포함하는  하나의  UTR을  보유할  수  있음을  의미한다.    RNA  분자는  본  발명의  이들  UTR  중  2개,  3개  또는  4개를  또한  보유할  수  있다.    대안적으로,  RNA  분자는  본  발명의  이들  UTR  중  5개  또는  심지어  그  초과를  또한  보유할  수  있다.  
 제3 모듈 (c)는 서열번호 2를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 2와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들) (즉, 상기 모듈 (c))이다.
 이  맥락에서  "하나  이상"은  RNA  분자의  모듈  (c)가  본  발명의  서열번호  2를  포함하는  UTR을  포함하는  RNA  분자와  동일하거나  더  높은  번역  효율을  갖는  RNA  분자를  결과하는,  서열번호  2와  비교하여  1  내지  7개의  치환을  나타내는  서열  또는  서열번호  2에  나타낸  바와  같은  서열을  포함하는  하나의  UTR을  보유할  수  있음을  의미한다.    RNA  분자는  본  발명의  이들  UTR  중  2개,  3개  또는  4개를  또한  보유할  수  있다.    대안적으로,  RNA  분자는  본  발명의  이들  UTR  중  5개  또는  심지어  그  초과를  또한  보유할  수  있다.  
 천연의 인간 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA) mRNA의 전장 서열은 관련  기술분야에  공지되어  있으며  서열번호  7에  나타낸  바와  같은  서열을  갖는다.    첨부된  실시예에서,  천연의  인간  시토크롬  b-245  알파  폴리펩티드  (CYBA)  mRNA의  뉴클레오티드  36  내지  71로부터의  서열이  CYBA  mRNA의  5'  UTR  단편으로서  사용되었으며  (즉,  뉴클레오티드  서열  5'-CGCGCCUAGCAGUGUCCCAGCCGGGUUCGUGUCGCC-3'  (서열번호  1))
 천연의 인간 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA) mRNA의 뉴클레오티드 657 내지 723으로부터의 서열이 CYBA mRNA의 3' UTR로서 사용되었다 (즉, 뉴클레오티드 서열
 5'-CCUCGCCCCGGACCUGCCCUCCCGCCAGGUGCACCC ACCUGCAAUAAAUGCAGCGAAGCCGGGA-3' (서열번호 2)).
 그러나,  본  발명에서  사용된  바와  같은  UTR은  서열번호  1의  상기  특정  서열로  특히  제한되지는  않으나  또한  서열번호  1과  비교하여  1  내지  4개의  치환을  나타내는  서열을  포함하는  UTR  서열일  수  있다.    대안적으로,  UTR  서열은  또한  서열번호  1과  비교하여  1  내지  3개의  치환을  나타내는  서열을  포함하는  서열일  수  있다.    UTR  서열은  또한  서열번호  1과  비교하여  1  내지  2개의  치환을  나타내는  서열을  포함하는  서열일  수  있다.    가장  바람직하게는,  UTR  서열은  또한  서열번호  1과  비교하여  1개의  치환을  나타내는  서열을  포함하는  서열일  수  있다.  
 바람직하게는,  서열번호  1과  비교하여  상기  뉴클레오티드  치환의  위치는  서열번호  1의  서열의  위치  32에서  수행된다.    바람직하게는,  이  위치에서  뉴클레오티드  "U"는  "C"에  의해  치환된다.    이  치환이  바람직한데  그  이유는  그것이  척추동물의  Kozak  공통  서열(consesus  sequence)에  더  가까이  서열번호  1에  (부분적으로)  존재하는  CYBA의  Kozak  요소를  가져오기  때문이다.    척추동물의  Kozak  공통  서열은  GCCRCC AUGG의 서열을 가지며 (시작 코돈은 밑줄이 그어져 있으며 한편 "R"은 임의의 푸린을 나타낸다) 한편 CYBA의 Kozak 요소는 GuCGCC AUGG의 서열을 가지며 (시작 코돈은 밑줄이 그어져 있으며 한편 척추동물 공통 서열로부터의 이탈은 소문자 "u"로 표시된다).
 서열번호  1과  비교하여  상기  치환  중  하나  이상을  갖는  UTR  서열(들)은  서열번호  1을  포함하는  UTR을  포함하는  RNA  분자와  번역  효율  면에서  동일하거나  유사한  능력,  바람직하게는  서열번호  1을  포함하는  UTR을  포함하는  RNA  분자와  번역  효율  면에서  더  높은  능력으로  RNA  분자를  결과할  수  있다.    번역  효율에  대하여  서열번호  1을  포함하는  UTR을  포함하는  RNA  분자와  번역  효율  면에서  비교하여  주어진  변형된  UTR  서열의  특성/능력은  관련  기술분야에  공지된  방법에  의해  및  첨부된  실시예에서  개요를  서술한  바와  같이  통상의  기술자에  의해  결정될  수  있다.  
 번역  효율은  세포  내에서  폴리펩티드  또는  단백질로의  mRNA  번역의  비율이다.    주어진  mRNA의  번역  효율은  시간  단위당  mRNA당  번역되는  단백질  또는  폴리펩티드의  수로서  측정된다.    번역은  세포  리보솜이  단백질을  생성시키는  과정이며  통상의  기술자에게  널리  공지되어  있다.    간단히  말하자면,  번역에서,  DNA로부터  전사에  의해  생성되는  전령  RNA  (mRNA)는  리보솜에  의해  디코딩되어  특정  아미노산  쇄  또는  폴리펩티드  또는  단백질을  생성시킨다.
 따라서,  변형된  UTR  서열을  보유하는  주어진  RNA  분자의  번역  효율은  바람직하게는,  서열번호  1의  UTR을  보유하는  것을  제외하고는  동일한  주어진  RNA의  번역  효율과  비교하여  더  높다.    따라서,  시간  단위당  RNA당  번역되는  변형된  UTR  서열을  보유하는  RNA  분자의  코딩  영역에  의해  코딩된  단백질  또는  폴리펩티드의  수는  시간  단위당  RNA당  번역되는  서열번호  1의  UTR을  보유하는  RNA  분자의  코딩  영역에  의해  코딩되는  단백질  또는  폴리펩티드의  수보다  높다.  
 변형된 UTR 서열을 보유하는 주어진 RNA 분자의 번역 효율이 서열번호 1의 UTR을 보유하는 것을 제외하고는 동일한 주어진 RNA의 번역 효율과 비교하여 유사하거나 동일한 경우에, 시간 단위당 RNA당 번역되는 변형된 UTR 서열을 보유하는 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 코딩된 단백질 또는 폴리펩티드의 수는 시간 단위당 RNA당 번역되는 서열번호 1의 UTR을 보유하는 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드의 수와 유사하거나 동일하다.
 "번역 효율"은, 예를 들어, 첨부된 실시예에서 기재되고 이하에 개요를 서술한 바와 같은 방법에 의해 결정될 수 있다.
 번역  효율은,  본  발명의  맥락에서,  동일한  시점에서  상기  세포에서  각각의  단백질을  코딩하는  mRNA의  양과  관련하여  특정  시점에서  세포  내에서  단백질로  번역된  mRNA의  비율이다.    따라서,  번역  효율은  특정  시점에서  세포  내에서  단백질로  번역된  mRNA의  몫(quotient)  및  각각의  단백질을  코딩하는  mRNA의  양이다.    매개  변수  둘  다,  즉,  단백질로  번역된  mRNA뿐만  아니라  각각의  단백질을  코딩하는  mRNA의  양은,  관련  기술분야에  공지된  방법에  의해  결정될  수  있다.    첨부된  실시예에서  비제한적  예로서  행해진  바와  같이,  세포  내에서  단백질로  번역된  mRNA의  양은,  예를  들어,  유동  세포측정법  (FC)에  의해  결정될  수  있으며  한편  각각의  단백질을  코딩하는  mRNA의  양은,  예를  들어,  qPCR에  의해  측정될  수  있다.
 본  발명에서  사용된  바와  같은,  서열번호  1을  포함하는  UTR을  포함하는  RNA  분자와  동일하거나  더  높은  번역  효율을  갖는  RNA  분자를  결과하는,  서열번호  1과  비교하여  1  내지  4개의  치환을  나타내는  서열  또는  서열번호  1에  나타낸  바와  같은  서열을  포함하는  UTR(들)은  상기  특정  서열  및  상기  기재된  치환에  특히  제한되지는  않으나  또한  서열번호  1과  비교하여  (하나의)  뉴클레오티드(들)  첨가(들)를  나타내는  서열을  포함하는  (하나의)  UTR  서열(들)에  관한  것일  수  있다.    (하나의)  뉴클레오티드(들)의  첨가는  플랭킹일  수  있다.    따라서,  추가적  뉴클레오티드(들)는  본  발명의  UTR(들)의  3'-말단  또는  5'-말단에  첨가될  수  있다.    추가적  뉴클레오티드(들)는  0  (변화  없음),  1,  2,  3,  4,  5,  6,  7,  8,  9  또는  10개까지의  뉴클레오티드,  바람직하게는  20개까지의  뉴클레오티드  또는  훨씬  더  바람직하게는  30개까지의  뉴클레오티드의  폴리뉴클레오티드  쇄를  포함한다.    뉴클레오티드의  첨가가  본  발명의  UTR(들)의  상기  기능적  특성을  변화시킬  가능성은  없을  것이라는  이론적  근거에  비추어,  뉴클레오티드의  첨가는  또한  40,  50,  60,  70,  80,  90,  또는  심지어  100개까지의  뉴클레오티드  또는  훨씬  더,  200,  300,  400  또는  500개까지의  뉴클레오티드  서열의  길이를  가질  수  있는데  이는  이들  서열이  서열번호  1과  유사한  능력  (상기-기재된  번역  효율의  면에서),  바람직하게는  상기  정의된  바와  같이  서열번호  1보다  더  높은  번역  효율을  갖는  한이다.
 대안적으로,  또는  (하나의)  뉴클레오티드(들)의  이들  플랭킹  첨가  이외에도  (하나의)  뉴클레오티드(들)의  첨가가  산재될  수  있다.    따라서,  추가적  뉴클레오티드(들)는  본  발명의  UTR(들)의  뉴클레오티드  서열에  첨가/삽입될  수  있다.    이들  뉴클레오티드(들)  삽입은  1,  2,  또는  3개의  뉴클레오티드를  포함하는데  이는  이들  서열이  서열번호  1과  유사한  능력  (상기-기재된  번역  효율의  면에서),  바람직하게는  상기  정의된  바와  같이  서열번호  1보다  더  높은  번역  효율을  갖는  한이다.
 본  발명에서  사용된  바와  같은  UTR은  서열번호  1의  상기  특정  서열  및  그의  변형에  특히  제한되지는  않는다.    더  정확히  말하면,  서열번호  1의  특정  서열  및  그의  변형은  CYB5'  코어  영역을  단지  정의한다.    따라서,  바람직한  실시양태에서,  서열번호  1에  나타낸  바와  같은  UTR은  적어도  1개의  뉴클레오티드에  의해  5'  말단  (즉,  상류)에서  연장된다.    또  다른  바람직한  실시양태에서,  서열번호  1에  나타낸  바와  같은  UTR은  1  내지  20개의  뉴클레오티드에  의해  5'  말단  (즉,  상류)에서  연장된다.    그러므로,  바람직한  실시양태에서,  서열번호  1의  서열은  서열번호  1에  대하여  서열번호  10의  뉴클레오티드  서열  (또는  서열번호  11의  상응하는  RNA  서열)에  나타낸  바와  같이  5'  말단  (즉,  상류)에서  20개의  뉴클레오티드에  의해  연장한다.    다른  바람직한  실시양태에서,  서열번호  1의  서열은  서열번호  1에  대하여  서열번호  10의  뉴클레오티드  서열  (또는  서열번호  11의  상응하는  RNA  서열)에  나타낸  바와  같이  5'  말단  (즉,  상류)에서  18,  15,  13,  10,  7  또는  5개의  뉴클레오티드에  의해  연장한다.    다른  바람직한  실시양태에서,  서열번호  1의  서열은  서열번호  1에  대하여  서열번호  10의  뉴클레오티드  서열  (또는  서열번호  11의  상응하는  RNA  서열)에  나타낸  바와  같이  5'  말단  (즉,  상류)에서  4,  5  또는  2개의  뉴클레오티드에  의해  연장한다.    다른  바람직한  실시양태에서,  서열번호  1의  서열은  서열번호  1에  대하여  서열번호  10의  뉴클레오티드  서열  (또는  서열번호  11의  상응하는  RNA  서열)에  나타낸  바와  같이  5'  말단  (즉,  상류)에서  1개의  뉴클레오티드에  의해  연장한다.
 서열번호 10은 서열번호 5 (DNA 수준에서 정의된 바와 같이)로 나타낸 인간 CYBA 유전자 5'UTR의 유전 코드의 부분이며 한편 서열번호 11은 상응하는 RNA 서열이다.
   5'  말단  (즉,  상류)에서  연장되는  이들  UTR  서열은  서열번호  1에  대해  상기  본원에  정의된  바와  같이  또한  변형될  수  있다.    따라서,  서열번호  1의  UTR의  맥락에서  상기  설명된  바와  같이  상기  정의된  바와  같이  5  '말단에서  연장되는  UTR에  필요한  변경을  가하여  동일하게  적용된다.
 게다가,  본  발명에서  사용된  바와  같은  UTR은  서열번호  2의  상기  특정  서열로  또한  특히  제한되지는  않으나  또한  서열번호  2와  비교하여  1  내지  7개의  치환을  나타내는  서열을  포함하는  UTR  서열일  수  있다.    대안적으로,  UTR  서열은  또한  서열번호  2와  비교하여  1  내지  6개의  치환을  나타내는  서열을  포함하는  서열일  수  있다.    UTR  서열은  또한  서열번호  2와  비교하여  1  내지  5개의  치환을  나타내는  서열을  포함하는  서열일  수  있다.    UTR  서열은  또한  서열번호  2와  비교하여  1  내지  4개의  치환을  나타내는  서열을  포함하는  서열일  수  있다.    UTR  서열은  또한  서열번호  2와  비교하여  1  내지  3개의  치환을  나타내는  서열을  포함하는  서열일  수  있다.    UTR  서열은  또한  서열번호  2와  비교하여  1  내지  2개의  치환을  나타내는  서열을  포함하는  서열일  수  있다.    UTR  서열은  또한  서열번호  2와  비교하여  1  내지  3개의  치환을  나타내는  서열을  포함하는  서열일  수  있다.    가장  바람직하게는,  UTR  서열은  또한  서열번호  2와  비교하여  1개의  치환을  나타내는  서열을  포함하는  서열일  수  있다.  
 서열번호  2와  비교하여  상기  치환  중  하나  이상을  갖는  UTR  서열(들)은  서열번호  2를  포함하는  UTR을  포함하는  RNA  분자와  번역  효율  면에서  동일하거나  유사한  능력,  바람직하게는  서열번호  2를  포함하는  UTR을  포함하는  RNA  분자와  번역  효율  면에서  더  높은  능력으로  RNA  분자를  결과할  수  있다.    번역  효율에  대하여  서열번호  2를  포함하는  UTR을  포함하는  RNA  분자와  번역  효율  면에서  비교하여  주어진  변형된  UTR  서열의  특성/능력은  관련  기술분야에  공지된  방법에  의해  및  첨부된  실시예에서  개요를  서술한  바와  같이  통상의  기술자에  의해  결정될  수  있다.  
 번역  효율은  세포  내에서  폴리펩티드  또는  단백질로의  mRNA  번역의  비율이다.    주어진  mRNA의  번역  효율은  시간  단위당  mRNA당  번역되는  단백질  또는  폴리펩티드의  수로서  측정된다.    번역은  세포  리보솜이  단백질을  생성시키는  과정이며  통상의  기술자에게  널리  공지되어  있다.    간단히  말하자면,  번역에서,  DNA로부터  전사에  의해  생성되는  전령  RNA  (mRNA)는  리보솜에  의해  디코딩되어  특정  아미노산  쇄  또는  폴리펩티드  또는  단백질을  생성시킨다.    
 따라서,  변형된  UTR  서열을  보유하는  주어진  RNA  분자의  번역  효율은  바람직하게는,  서열번호  2의  UTR을  보유하는  것을  제외하고는  동일한  주어진  RNA의  번역  효율과  비교하여  더  높다.    따라서,  시간  단위당  RNA당  번역되는  변형된  UTR  서열을  보유하는  RNA  분자의  코딩  영역에  의해  코딩되는  단백질  또는  폴리펩티드의  수는  시간  단위당  RNA당  번역되는  서열번호  2의  UTR을  보유하는  RNA  분자의  코딩  영역에  의해  코딩되는  단백질  또는  폴리펩티드의  수보다  높다.  
 변형된 UTR 서열을 보유하는 주어진 RNA 분자의 번역 효율이 서열번호 2의 UTR을 보유하는 것을 제외하고는 동일한 주어진 RNA의 번역 효율과 비교하여 유사하거나 동일한 경우에, 시간 단위당 RNA당 번역되는 변형된 UTR 서열을 보유하는 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드의 수는 시간 단위당 RNA당 번역되는 서열번호 2의 UTR을 보유하는 RNA 분자의 코딩 영역에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드의 수와 유사하거나 동일하다.
 "번역 효율"은, 예를 들어, 첨부된 실시예에서 기재되고 이하에 개요를 서술한 바와 같은 방법에 의해 결정될 수 있다.
 본  발명에서  사용된  바와  같은,  서열번호  2를  포함하는  UTR을  포함하는  RNA  분자와  동일하거나  더  높은  번역  효율을  갖는  RNA  분자를  결과하는,  서열번호  2와  비교하여  1  내지  7개의  치환을  나타내는  서열  또는  서열번호  2에  나타낸  바와  같은  서열을  포함하는  UTR(들)은  상기  특정  서열  및  상기  기재된  치환에  특히  제한되지는  않으나  또한  서열번호  2와  비교하여  (하나의)  뉴클레오티드(들)  첨가(들)를  나타내는  서열을  포함하는  (하나의)  UTR  서열(들)에  관한  것일  수  있다.    뉴클레오티드(들)의  첨가는  플랭킹이거나  산재될  수  있다.    따라서,  추가적  뉴클레오티드(들)를  본  발명의  UTR(들)의  3'-말단  또는  5'-말단에  첨가할  수  있다.    대안적으로,  또는  이들  플랭킹  추가적  뉴클레오티드(들)  이외에도,  추가적  뉴클레오티드(들)는  또한  본  발명의  UTR(들)의  뉴클레오티드  서열  내에  있을  수  있다.    추가적  뉴클레오티드(들)는  0  (변화  없음),  1,  2,  3,  4,  5,  6,  7,  8,  9  또는  10개까지의  뉴클레오티드,  바람직하게는  20개까지의  뉴클레오티드  또는  훨씬  더  바람직하게는  30개까지의  뉴클레오티드의  폴리뉴클레오티드  쇄를  포함한다.    뉴클레오티드의  첨가가  본  발명의  UTR(들)의  상기  기능적  특성을  변화시킬  가능성은  없을  것이라는  이론적  근거에  비추어,  뉴클레오티드의  첨가는  또한  40,  50,  60,  70,  80,  90,  또는  심지어  100개까지의  뉴클레오티드  또는  훨씬  더,  200,  300,  400  또는  500개까지의  뉴클레오티드  서열의  길이를  가질  수  있는데  이는  이들  서열이  서열번호  2와  유사한  능력  (상기-기재된  번역  효율의  면에서),  바람직하게는  상기  정의된  바와  같이  서열번호  2보다  더  높은  번역  효율을  갖는  한이다.
 본 발명의 UTR(들)뿐만 아니라 이러한 UTR(들)을 함유하는 RNA 분자는 재조합으로 (예를 들어, 생체내 또는 시험관내 시스템에서) 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 합성적으로 생성/합성될 수 있다.
 보다 구체적으로, 본 발명의 UTR 및 이러한 UTR(들)을 함유하는 RNA 분자는 재조합으로 생체내 시스템에서 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다.
 대안적으로,  본  발명의  UTR  및  이러한  UTR(들)을  함유하는  RNA  분자는,  예를  들어,  시험관내  전사  시스템을  사용하는  시험관내  시스템에서  생성될  수  있다.    시험관내  전사  시스템은  일반적으로  공지되어  있으며  이하에  더  상세히  개요를  서술한  바와  같이  모듈  (b)  및/또는  모듈  (c)를  "코딩하는"  DNA  서열을  함유하는  정제된  선형  DNA  주형을  통상  필요로  하며  여기서  상기  DNA  서열은  적절한  프로모터의  제어하에  있다.    게다가,  시험관내  전사  시스템은  또한  리보뉴클레오시드  트리포스페이트,  DTT  및  마그네슘  이온을  포함하는  완충제  시스템,  및  본  발명의  UTR(들)로  모듈  (b)  및/또는  모듈  (c)를  "코딩하는"  DNA  서열의  시험관내  전사에  효소  활성을  제공하는  적절한  RNA  폴리머라제를  통상적으로  필요로  한다.
 더욱이, 본 발명의 UTR 및 이러한 UTR(들)을 함유하는 RNA 분자는, 예를 들어, 고상 지지체 및 표준 기술을 사용하는 자동화된 뉴클레오티드 서열 합성기 상에서 통상적인 화학적 합성에 의해 또는 각각의 DNA-서열의 화학적 합성 및 동일한 DNA 서열의 후속 시험관내 또는 생체내 전사에 의해 화학적으로 합성될 수 있다.
 상기에  따르면,  본  발명은  RNA  분자/폴리리보핵산  분자,  바람직하게는  변형된  폴리리보핵산  분자를  제공하며,  상기  RNA  분자의  한  모듈,  즉,  "그의  5'  말단에서  시작  코돈을  포함하는  코딩  영역"  (모듈  (a))은  폴리펩티드를  코딩한다.    용어  핵산  및  폴리뉴클레오티드는  교대해서  사용되며  뉴클레오티드의  중합체를  포함하는임의의  화합물  및/또는  물질을  포함한다.    용어  뉴클레오티드는  데옥시뉴클레오티드  및  리보뉴클레오티드를  포함한다.    용어  리보핵산  및  폴리리보뉴클레오티드는  교대해서  사용되며,  특정  실시양태에서,  50%  초과의  뉴클레오티드가  리보뉴클레오티드인  뉴클레오티드의  중합체를  포함하는  임의의  화합물  및/또는  물질을  포함한다.    특정  실시양태에서,  폴리리보뉴클레오티드는  60%,  70%,  75%,  80%,  90%  초과,  95%  초과,  99%  초과  또는  100%의  뉴클레오티드가  리보뉴클레오티드인  뉴클레오티드의  중합체를  포함한다.    하나  이상의  뉴클레오티드가  변형된  뉴클레오티드인  폴리리보뉴클레오티드는  변형된  폴리리보뉴클레오티드로서  언급될  수  있다.    그러나,  용어  폴리리보뉴클레오티드는  변형된  폴리리보뉴클레오티드를  포함할  수  있다.  
 RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드의  서열은,  예를  들어,  관심  유전자의  유전  정보를  포함하는  임의의  적합한  핵산으로부터  유래될  수  있다.    핵산의  예는  관심  유전자(들)를  포함하는  임의의  박테리아  또는  고세균으로부터의  게놈  DNA,  RNA  또는  cDNA를  포함한다.    폴리뉴클레오티드는  돌연변이된  유전자  및  다형성을  갖는  핵산으로부터  유래될  수  있다.    본  발명의  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드는  특히  제한되지는  않으며  모듈  A로서,  주어진  세포에서  발현되는  임의의  원하는  코딩  영역을  포함할  수  있는  서열을  포함한다.    바람직한  실시양태에서,  상기  서열은  상기에서  개요를  서술한  바와  같이  원하는  폴리펩티드/단백질을  코딩하는  코딩  영역일  수  있다.    바람직하게는,  상기에  따라,  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드는  모듈  A의  시작  코돈의  상류에  (5')  위치된  비번역  서열,  모듈  A의  정지  코돈의  하류에  (3')  위치된  비번역  서열,  또는  모듈  A의  시작  코돈의  상류에  (5')  위치된  비번역  서열  및  모듈  A의  정지  코돈의  하류에  (3')  위치된  비번역  서열  둘  다를  추가로  포함한다.    바람직한  실시양태에서,  본  발명의  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드는  변형된  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드일  수  있다.  
 4가지  전통적인  리보뉴클레오티드,  즉,  아데노신,  구아노신,  시티딘  및  우리딘  이외에도,  이들  핵염기들  각각의  수많은  유사체가  존재한다.    때때로  문헌  전반에  걸쳐  그리고  문헌에서,  이들  유사체,  또는  이들  유사체  중  하나  이상을  포함하는  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드는  변형된  (예를  들어,  변형된  뉴클레오티드  또는  변형된  리보뉴클레오티드)  것으로서  언급된다.    일부  유사체는  상기  규범적인  핵염기와  상이하나,  자연에  존재할  수  있다.    기타  유사체는  자연적으로  발생하지  않는다.    둘  중  어느  유형의  유사체도  고려된다.
 특정  실시양태에서,  본  발명의  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드는  뉴클레오티드  유사체를  포함한다  (예를  들어,  폴리리보뉴클레오티드는  변형된  폴리리보뉴클레오티드를  포함한다).    예시적인  뉴클레오티드  유사체는  이하에  제공된다  (예를  들어,  U의  유사체;  C의  유사체;  A의  유사체;  G의  유사체).    게다가,  특정  실시양태에서,  본  개시내용의  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드  또는  기타  핵산은  포스포디에스테르  백본에서의  또는  핵염기  사이의  결합에서의  변형을  (추가적으로  또는  대안으로)  또한  포함할  수  있다.    본  개시내용의  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드의  부분  또는  전부를  형성할  수  있는  예시적인  핵산은  리보핵산  (RNA),  데옥시리보핵산  (DNA),  트레오스  핵산  (TNA),  글리콜  핵산  (GNA),  펩티드  핵산  (PNA),  잠김(locked)  핵산  (LNA,  베타-D-리보  배위를  갖는  LNA,  알파-L-리보  배위를  갖는  알파-LNA  (LNA의  부분입체  이성질체),  2'-아미노  관능화를  갖는  2'-아미노-LNA,  및  2'-아미노  관능화를  갖는  2'-아미노-알파-LNA)  또는  그의  하이브리드를  포함하나,  이에  제한되지는  않는다.
 특정  실시양태에서,  하나  이상의  뉴클레오시드(들)  상에서  또는  핵산/폴리뉴클레오티드  분자의  백본  상에서  일  수  있다.    특정  실시양태에서,  변형은  뉴클레오시드  상에서  및  백본  연결  상에서  둘  다일  수  있다.    특정  실시양태에서,  변형은  시험관내  폴리뉴클레오티드로  조작될  수  있다. 특정 실시양태에서, 변형된 리보뉴클레오티드/뉴클레오티드는 전통적/천연 뉴클레오티드/리보뉴클레오티드의 공유 변형에 의해 전사후에 또한 합성될 수 있다.
 본  발명의  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드는  변형된  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드일  수  있거나,  특정  실시양태에서,  푸린의  유사체  및/또는  피리미딘의  유사체를  포함할  수  있다.    특정  실시양태에서,  본  발명의  변형된  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드는  피리미딘  유사체,  예컨대  우리딘의  유사체  및/또는  시티딘의  유사체를  포함한다.    특정  실시양태에서,  본  발명의  변형된  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드는  우리딘의  유사체  및  시티딘의  유사체를  포함한다.    특정  실시양태에서,  변형된  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드는  아데노신의  유사체  및/또는  구아노신의  유사체를  포함하지  않는다.    특정  실시양태에서,  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드는  단일  유형의  우리딘  유사체  및  단일  유형의  시티딘  유사체  (예를  들어,  단일  분자의  유사체가  아닌,  한  유형의  유사체  -  단일  유사체는  본원에  기재된  몇몇  백분율  중  어느  하나로  존재할  수  있다)를  포함한다.    다른  실시양태에서,  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드는  우리딘  및/또는  시티딘의  하나  초과  유형의  유사체  및,  임의로  그리고  존재할  경우,  아데노신  및/또는  구아노신의  하나  이상의  유사체  (또는  둘  중  하나  또는  둘  다  없음)를  포함한다.  
 일부  경우에  변형된  우리딘  (예를  들어,  우리딘의  유사체)은  2-티오우리딘,  5'-메틸우리딘,  슈도우리딘,  5-아이오도우리딘  (I5U),  4-티오우리딘  (S4U),  5-브로모우리딘  (Br5U),  2'-메틸-2'-데옥시우리딘  (U2'm),  2'-아미노-2'-데옥시우리딘    (U2'NH 2), 2'-아지도-2'-데옥시우리딘 (U2'N 3),  및  2'-플루오로-2'-데옥시우리딘  (U2'F)로부터  선택된다.    일부  경우에,  변형된  시티딘  (예를  들어,  시티딘의  유사체)은  5-메틸시티딘,  3-메틸시티딘,  2-티오-시티딘,  2'-메틸-2'-데옥시시티딘  (C2'm),  2'-아미노-2'-데옥시시티딘  (C2'NH2),  2'-플루오로-2'-데옥시시티딘  (C2'F),  5-아이오도시티딘  (I5C),  5-브로모시티딘  (Br5C)  및  2'-아지도-2'-데옥시시티딘  (C2'N3)으로부터  선택된다.    유사체를  지칭할  때,  전술한  것은  또한  그의  5'  트리포스페이트  형태의  유사체를  지칭한다.    특정  실시양태에서,  시티딘  유사체는  5-아이오도시티딘이고  우리딘  유사체는  5-아이오도우리딘이다.
 일부  실시양태에서,  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드는  변형된  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드이다.    일부  경우에,  변형된  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드는  비-변형  (또는  비변형된)  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드와  비교하여  적어도  25%  더  안정적이다.    일부  경우에,  변형된  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드는  비-변형  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드와  비교하여  적어도  30%  더  안정적,  적어도  35%  더  안정적,  적어도  40%  더  안정적,  적어도  45%  더  안정적,  적어도  50%  더  안정적,  적어도  55%  더  안정적,  적어도  60%  더  안정적,  적어도  65%  더  안정적,  적어도  70%  더  안정적,  적어도  75%  더  안정적,  적어도  80%  더  안정적,  적어도  85%  더  안정적,  적어도  90%  더  안정적,  또는  적어도  95%  더  안정적이다.    특정  실시양태에서,  안정성은  생체내에서  측정된다.    특정  실시양태에서,  안정성은  시험관내에서  측정된다.    특정  실시양태에서,  안정성은  폴리리보뉴클레오티드의  반감기를  측정함으로써  정량화된다.  
 본  발명의  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드는  동일한  형태로  변형된  뉴클레오티드  또는  상이한  변형된  뉴클레오티드의  혼합물을  가질  수  있다.    변형된  뉴클레오티드는  전령  RNA에서  자연적으로  발생하거나  자연적으로  발생하지  않는  변형을  가질  수  있다.    다양한  변형된  뉴클레오티드의  혼합물이  사용될  수  있다.    예를  들어  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드  내에  하나  이상의  변형된  뉴클레오티드는  자연  변형을  가질  수  있으며,  한편  또  다른  부분은  mRNA에서  자연적으로  발견되지  않는  변형을  갖는다.    게다가,  일부  변형된  뉴클레오티드는  염기  변형을  가질  수  있으며,  한편  다른  변형된  뉴클레오티드는  당  변형을  갖는다.    동일한  방법으로,  모든  변형은  염기  변형이거나  모든  변형은  당  변형  또는  그의  임의의  적합한  혼합인  것이  가능한다.    일부  경우에,  변형된  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드의  안정성은  변형된  폴리리보뉴클레오티드  내에서  변형된  염기의  성질을  변화시킴으로써  선택적으로  최적화될  수  있다.
 <표 2>
 
 
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 특정 실시양태에서, 유사체 (예를 들어, 변형된 뉴클레오티드)는 피리딘-4-온 리보뉴클레오시드, 5-아이오도우리딘, 5-아이오도시티딘, 5-아자-우리딘, 2'-아미노-2'-데옥시시티딘, 2'-플루오르-2'-데옥시시티딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-히드록시우리딘, 3-메틸우리딘, 5-카르복시메틸-우리딘, 1-카르복시메틸-슈도우리딘, 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸우리딘, 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘, 1-타우리노메틸-4-티오-우리딘, 5-메틸-우리딘, 1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-l-메틸-슈도우리딘, 2-티오-l-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-l-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-l-데아자-슈도우리딘, 디히드로우리딘, 디히드로슈도우리딘, 2-티오-디히드로우리딘, 2-티오-디히드로슈도우리딘, 2-메톡시우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 5-아자-시티딘, 슈도이소시티딘, 3-메틸-시티딘, N4-아세틸시티딘, 5-포르밀시티딘, 5-메틸시티딘, N4-메틸시티딘, 5-히드록시메틸시티딘, 1-메틸-슈도이소시티딘, 피롤로-시티딘, 피롤로-슈도이소시티딘, 2-티오-시티딘, 2-티오-5-메틸-시티딘, 4-티오-슈도이소시티딘, 4-티오-l-메틸-슈도이소시티딘, 4-티오-l-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 1-메틸-l-데아자-슈도이소시티딘, 제불라린, 5-아자-제불라린, 5-메틸-제불라린, 5-아자-2-티오-제불라린, 2-티오-제불라린, 2-메톡시-시티딘, 2-메톡시-5-메틸-시티딘, 4-메톡시-슈도이소시티딘, 4-메톡시-l-메틸-슈도이소시티딘, 2-아미노푸린, 2,6-디아미노푸린, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-8-아자-아데닌, 7-데아자-2-아미노푸린, 7-데아자-8-아자-2-아미노푸린, 7-데아자-2,6-디아미노푸린, 7-데아자-8-아자-2,6- 디아미노푸린, 1-메틸아데노신, N6-메틸아데노신, N6-이소펜테닐아데노신, N6-(시스-히드록시이소펜테닐)아데노신, 2-메틸티오-N6-(시스-히드록시이소펜테닐) 아데노신, N6-글리시닐카르바모일아데노신, N6-트레오닐카르바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-트레오닐 카르바모일아데노신, N6,N6-디메틸아데노신, 7-메틸아데닌, 2-메틸티오-아데닌, 2-메톡시-아데닌, 이노신, 1-메틸-이노신, 와이오신, 와이부토신, 7-데아자-구아노신, 7-데아자-8-아자-구아노신, 6-티오-구아노신, 6-티오-7-데아자-구아노신, 6-티오-7-데아자-8-아자-구아노신, 7-메틸-구아노신, 6-티오-7-메틸-구아노신, 7-메틸이노신, 6-메톡시-구아노신, 1-메틸구아노신, N2-메틸구아노신, N2,N2-디메틸구아노신, 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8-옥소-구아노신, 1-메틸-6-티오-구아노신, N2-메틸-6-티오-구아노신, 및 N2,N2-디메틸-6-티오-구아노신을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
 특정  실시양태에서,  본  발명의  변형된  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드는  슈도우리딘을  포함하지  않는다.    특정  실시양태에서,  본  발명의  변형된  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드는  5-메틸  시티딘을  포함하지  않는다.    특정  실시양태에서,  본  발명의  변형된  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드는  5-메틸  우리딘을  포함하지  않는다.    특정  실시양태에서,  본  발명의  변형된  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드는  U의  유사체  및  C의  유사체를  포함하며,  여기서  이러한  U의  유사체는  모두  동일한  유사체일  수  있거나  상이한  유사체  (예를  들어,  하나  초과  유형의  유사체)일  수  있으며,  여기서  이러한  C의  유사체는  모두  동일한  유사체일  수  있거나  상이한  유사체  (예를  들어,  하나  초과  유형의  유사체)일  수  있다.    특정  실시양태에서,  본  발명의  변형된  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드는  아데노신의  유사체  및  구아노신의  유사체를  포함하지  않는다.
 본원에 상세히 기재된 바와 같이, RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드가 변형된 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 경우, 유사체는 화합물 내에 뉴클레오티드의 특정 비율로서 존재할 수 있다 (예를 들어, 주어진 핵염기의 주어진 백분율은 본원에 기재된 바와 같이 유사할 수 있다).
 적어도  하나의  변형된  뉴클레오티드를  포함하는  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드는  변형된  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드이다.    특정  실시양태에서,  적어도  약  5%의  변형된  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드는  변형되거나  자연적으로  발생하지  않는  (예를  들어,  아데노신,  시티딘,  구아노신,  또는  우리딘의  유사체  또는  변형된)  아데노신,  시티딘,  구아노신,  또는  우리딘,  예컨대  본원에  기재된  유사체  뉴클레오티드를  포함한다.    일부  경우에,  적어도  약  5%,  10%,  15%,  20%,  25%,  30%,  40%,  45%,  50%의  변형된  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드는  변형되거나  자연적으로  발생하지  않는  (예를  들어,  아데노신,  시티딘,  구아노신,  또는  우리딘의  유사체  또는  변형된)  아데노신,  시티딘,  구아노신,  또는  우리딘을  포함한다.    일부  경우에,  많아야  약  50%,  45%,  40%,  35%,  30%,  25%,  20%,  15%,  10%,  5%,  1%의  변형된  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드는  변형되거나  자연적으로  발생하지  않는  아데노신,  시티딘,  구아노신,  또는  우리딘을  포함한다.
 바람직한  실시양태에서  본  발명의  RNA  분자는  변형된  뉴클레오티드와  비변형된  뉴클레오티드의  조합을  함유한다.    바람직하게는,  본  발명의  RNA  분자는  WO 2011/012316에  기재된  바와  같이  변형된  뉴클레오티드와  비변형된  뉴클레오티드의  조합을  함유한다.    이러한  RNA  분자는  또한  "SNIM ?-RNA"로서  공지되어  상업화되어  있다.    WO 2011/012316에  기재된  RNA  분자는  증가된  안정성  및  감소된  면역원성을  나타내는  것으로  보고되어  있다.    바람직한  실시양태에서,  이러한  변형된  RNA  분자에서  5  내지  50%의  시티딘  뉴클레오티드  및  5  내지  50%의  우리딘  뉴클레오티드가  변형되어  있다.    아데노신-  및  구아노신-함유  뉴클레오티드는  비변형될  수  있다.    아데노신  및  구아노신  뉴클레오티드는  비변형되거나  부분  변형될  수  있고,  이들은  바람직하게는  비변형된  형태로  존재한다.    바람직하게는  10  내지  35%의  시티딘  및  우리딘  뉴클레오티드가  변형되며  특히  바람직하게는  변형된  시티딘  뉴클레오티드의  함량은  7.5  내지  25%  범위에  있고,  변형된  우리딘  뉴클레오티드의  함량은  7.5  내지  25%  범위에  있다.    실제로는  상대적으로  낮은  함량,  예를  들어,  각각  단지  10%의  변형된  시티딘  및  우리딘  뉴클레오티드는  원하는  특성을  달성할  수  있는  것으로  밝혀졌다.    변형된  시티딘  뉴클레오티드가  5-메틸시티딘  잔기이고  변형된  우리딘  뉴클레오티드가  2-티오우리딘  잔기인  것이  특히  바람직하다.    가장  바람직하게는,  변형된  시티딘  뉴클레오티드의  함량  및  변형된  우리딘  뉴클레오티드의  함량은  각각  25%이다.
 특정  다른  실시양태에서,  이러한  변형된  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드  분자에서,  5  내지  50%의  시티딘은  C의  유사체이며  5  내지  50%의  우리딘은  U의  유사체이다.    특정  실시양태에서,  이러한  변형된  폴리리보뉴클레오티드  분자에서  5  내지  40%의  시티딘은  C의  유사체이며  5  내지  40%의  우리딘은  U의  유사체이다.    특정  실시양태에서,  이러한  변형된  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드  분자에서  5  내지  30%의  시티딘은  C의  유사체이며  5  내지  30%의  우리딘은  U의  유사체이다.    특정  실시양태에서,  이러한  변형된  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드  분자에서  10  내지  30%의  시티딘은  C의  유사체이며  10  내지  30%의  우리딘은  U의  유사체이다.    특정  실시양태에서,  이러한  변형된  폴리리보뉴클레오티드  분자에서  5  내지  20%의  시티딘은  C의  유사체이며  5  내지  20%의  우리딘은  U의  유사체이다.    특정  실시양태에서,  이러한  변형된  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드  분자에서  5  내지  10%의  시티딘  뉴클레오티드및  5  내지  10%의  우리딘  뉴클레오티드는  변형된  것이다.    특정  실시양태에서,  이러한  변형된  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드  분자에서  25%의  시티딘  뉴클레오티드  및  25%의  우리딘  뉴클레오티드는  변형된  것이다.    특정  실시양태에서,  아데노신-  및  구아노신-함유  뉴클레오티드는  비변형될  수  있다.    특정  실시양태에서,  아데노신  및  구아노신  뉴클레오티드는  비변형되거나  부분적으로  변형될  수  있으며,  이들은  바람직하게는  비변형된  형태로  존재한다.  
 상기  언급된  바와  같이,  특정  실시양태에서,  U의  유사체는  단일  유형의  U의  유사체를  지칭한다.    특정  실시양태에서,  U의  유사체는  2종  이상의  유형의  U의  유사체를  지칭한다.    특정  실시양태에서,  C의  유사체는  단일  유형의  C의  유사체를  지칭한다.    특정  실시양태에서,  C의  유사체는  2종  이상의  유형의  C의  유사체를  지칭한다.  
 특정  실시양태에서,  시티딘의  유사체인  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드  중  시티딘의  백분율은  우리딘의  유사체인  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드  중  우리딘의  백분율과  동일하지  않다.    특정  실시양태에서,  시티딘의  유사체의  백분율은  우리딘의  유사체의  백분율보다  낮다.    상기  언급된  바와  같이,  이는  아데노신  및  구아노신의  유사체의  존재  또는  부재하에  있을  수  있으나,  특정  실시양태에서,  아데노신의  유사체  및  구아노신의  유사체의  부재하에  있다.    특정  실시양태에서,  본  개시내용의  폴리리보뉴클레오티드는  15%  미만,  10%  미만,  5%  미만  또는  2%  미만의  아데노신의  유사체,  구아노신의  유사체  또는  둘  다를  포함한다.  
 특정  실시양태에서,  본  발명의  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드는  시티딘의  유사체  및  우리딘의  유사체를  포함하며,  5  내지  20%의  시티딘은  시티딘의  유사체이며  25  내지  45%의  우리딘은  우리딘의  유사체이다.    환언하면,  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드는  변형된  및  비변형된  시티딘  및  변형된  및  비변형된  우리딘을  포함하며,  5  내지  20%의  시티딘은  시티딘의  유사체를  포함하며  한편  25  내지  45%의  우리딘은  우리딘의  유사체를  포함한다.    다른  실시양태에서,  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드는  5  내지  10%의,  시티딘의  유사체  및  30  내지  40%의,  우리딘의  유사체,  예컨대  7-9%의,  시티딘의  유사체,  예컨대  약  7,  7.5  또는  8%  및,  예컨대  32-38%의,  우리딘의  유사체,  예컨대  약  33,  34,  35,  36%를  포함한다.  
 특정  실시양태에서,  본원에  개시된  우리딘의  유사체  및  시티딘의  유사체  중  어느  한  유사체는,  임의로  슈도우리딘을  제외하고,  사용될  수  있다.    특정  실시양태에서,  시티딘의  유사체는  (예를  들어,  그로  이루어진  경우에,  그것은  사용된  단일  유사체  유형이다)  5-아이오도시티딘을  포함하거나  그로  이루어지며  우리딘의  유사체는  (예를  들어,  그로  이루어진  경우에,  그것은  사용된  단일  유사체  유형이다)  5-아이오도우리딘을  포함하거나  그로  이루어진다.  
 전술한  내용  중  어느  하나의  특정  실시양태에서,  주어진  뉴클레오티드의  유사체의  백분율은  투입(input)  백분율  (예를  들어,  출발  반응,  예컨대  출발  시험관내  전사  반응  중  유사체의  백분율)을  지칭한다.    전술한  내용  중  어느  하나의  특정  실시양태에서,  주어진  뉴클레오티드의  유사체의  백분율은  산출(output)  (예를  들어,  합성되거나  전사된  화합물  중의  백분율)을  지칭한다.
 본 발명의 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드 분자는 이하에 추가로 더 상세히 기재되는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 생체내 시스템에서 재조합으로 생성될 수 있다.
 대안적으로,  본  발명의  변형된  폴리리보뉴클레오티드  분자는  예를  들어,  이하에  추가로  더  상세히  기재되는  시험관내  전사  시스템을  사용하여  시험관내  시스템에서  생성될  수  있다.    RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드를  생성할  수  있는  시험관내  전사  시스템은  본  발명의  원하는  특성을  가진  변형된  RNA  분자/폴리리보뉴클레오티드를  생성시키기  위해  변형된  뉴클레오시드  트리포스페이트와  비변형된  뉴클레오시드  트리포스페이트의  투입  혼합물을  필요로  한다.    특정  실시양태에서,  5  내지  50%의  시티딘은  이러한  투입  혼합물  중  시티딘의  유사체이며  5  내지  50%의  우리딘은  이러한  투입  혼합물  중  우리딘의  유사체이다.    특정  실시양태에서,  5  내지  40%의  시티딘은  이러한  투입  혼합물  중  시티딘의  유사체이며  5  내지  40%의  우리딘은  이러한  투입  혼합물  중  우리딘의  유사체이다.    특정  실시양태에서,  5  내지  30%의  시티딘은  이러한  혼합물  중  시티딘의  유사체이며  5  내지  30%의  우리딘은  이러한  투입  혼합물  중  우리딘의  유사체이다.    특정  실시양태에서,  5  내지  30%의  시티딘은  이러한  혼합물  중  시티딘의  유사체이며  10  내지  30%의  우리딘은  이러한  혼합물  중  우리딘의  유사체이다.    특정  실시양태에서,  5  내지  20%의  시티딘은  이러한  투입  혼합물  중  시티딘의  유사체이며  5  내지  20%의  우리딘은  이러한  투입  혼합물  중  우리딘의  유사체이다.    특정  실시양태에서,  5  내지  10%의  시티딘은  이러한  투입  혼합물  중  시티딘의  유사체이며  5  내지  10%의  우리딘은  이러한  투입  혼합물  중  우리딘의  유사체이다.    특정  실시양태에서,  25%의  시티딘은  이러한  투입  혼합물  중  시티딘의  유사체이며  25%의  우리딘은  이러한  투입  혼합물  중  우리딘의  유사체이다.    특정  실시양태에서,  투입  혼합물은  아데노신의  유사체  및/또는  구아노신을  포함하지  않는다.    다른  실시양태에서,  임의로,  투입  혼합물은  아데노신  및/또는  구아노신의  하나  이상의  유사체  (또는  둘  중  하나  또는  둘  다  없음)를  포함한다.  
 특정  실시양태에서,  시티딘의  유사체인  투입  혼합물  중  시티딘의  백분율은  우리딘의  유사체인  투입  혼합물  중  우리딘의  백분율과  동일하지  않다.    특정  실시양태에서,  투입  혼합물  중  시티딘의  유사체의  백분율은  투입  혼합물  중  우리딘의  유사체의  백분율보다  낮다.    상기  언급된  바와  같이,  이는  투입  혼합물  중  아데노신  및  구아노신의  유사체의  존재  또는  부재하에  있을  수  있으나,  특정  실시양태에서,  투입  혼합물  중  아데노신의  유사체  및  구아노신의  유사체의  부재하에  있다.
 특정 실시양태에서, 본 발명의 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드를 생성하는 시험관내 전사  시스템을  위한  뉴클레오티드의  투입  혼합물은  시티딘의  유사체  및  우리딘의  유사체를  포함하며,  투입  혼합물의  5  내지  20%의  시티딘은  시티딘의  유사체이며  투입  혼합물의  25  내지  45%의  우리딘은  우리딘의  유사체이다.    환언하면,  투입  혼합물은  변형된  및  비변형된  시티딘  및  변형된  및  비변형된  우리딘을  포함하며,  투입  혼합물의  5  내지  20%의  시티딘은  시티딘의  유사체를  포함하며  한편  투입  혼합물의  25  내지  45%의  우리딘은  우리딘의  유사체를  포함한다.    다른  실시양태에서,  투입  혼합물은  5  내지  10%의,  시티딘의  유사체  및  30  내지  40%의,  우리딘의  유사체,  예컨대  7-9%의,  시티딘의  유사체,  예컨대  7,  7.5  또는  8%  및,  예컨대  32-38%의,  우리딘의  유사체,  예컨대  33,  34,  35,  36%를  포함한다.
 특정  실시양태에서,  본원에  개시된  우리딘의  유사체  및  시티딘의  유사체  중  어느  한  유사체는,  임의로  슈도우리딘을  제외하고,  사용될  수  있다.    특정  실시양태에서,  시티딘의  유사체는  (예를  들어,  그것은  사용된  단일  C  유사체  유형이다)  5-아이오도시티딘을  포함하거나  그로  이루어지며  우리딘의  유사체는  (예를  들어,  그것은  사용된  단일  U  유사체  유형이다)  5-아이오도우리딘을  포함하거나  그로  이루어진다.
 예시적인  유사체는  상기  표에  기재되어  있다.    원하는  폴리펩티드를  코딩하는  변형된  폴리리보뉴클레오티드  (모듈  (a))의  경우,  달리  명시되지  않는  한,  유사체  및  변형의  수준은  5'  및  3'  비번역  영역을  포함한,  원하는  폴리펩티드를  코딩하는  전체  폴리리보뉴클레오티드  (모듈  (a))에  걸쳐  고려된다는  점  (예를  들어,  변형의  수준은  유사체가  전사되는  위치에  혼입될  수  있도록  시험관내  전사  반응에서  유사체의  투입  비율을  기준으로  한다)을  이해하여야  한다.  
 더욱이, 변형된 RNA 분자/폴리리보뉴클레오티드 분자는, 예를 들어, 고상 지지체 및 표준 기술을 사용하는 자동화된 뉴클레오티드 서열 합성기 상에서 통상적인 화학적 합성에 의해 또는 각각의 DNA 서열의 화학적 합성 및 동일한 DNA 서열의 후속 시험관내 또는 생체내 전사에 의해 화학적으로 합성될 수 있다.
 분자  생물학과  유전학에서  상류  및  하류는  둘  다  RNA  분자의  상대적  위치를  지칭한다.    본  발명의  맥락에서,  상류는  RNA  분자의  5'말단을  향하며  하류는  분자의  3'  말단을  향한다.
 따라서,  한  실시양태에서,  UTR  모듈  (b)  (즉,  상기에  정의된  바와  같이  서열번호  1을  포함하는  UTR을  포함하는  RNA  분자와  동일하거나  더  높은  번역  효율을  갖는  RNA  분자를  결과하는,  서열번호  1과  비교하여  1  내지  4개의  치환을  나타내는  서열  또는  서열번호  1에  나타낸  바와  같은  서열을  포함하는  하나  이상의  UTR(들))는  모듈  (a)의  코딩  영역의  상류에  위치한다.    게다가,  한  실시양태에서,  UTR  모듈  (c)  (즉,  상기에  정의된  바와  같이  서열번호  2를  포함하는  UTR을  포함하는  RNA  분자와  동일하거나  더  높은  번역  효율을  갖는  RNA  분자를  결과하는,  서열번호  2와  비교하여  1  내지  7개의  치환을  나타내는  서열  또는  서열번호  2에  나타낸  바와  같은  서열을  포함하는  하나  이상의  UTR(들))은  모듈  (a)의  코딩  영역의  하류에  위치한다.    그러나,  바람직하게는,  폴리펩티드를  코딩하는  코딩  영역  (즉,  모듈  (a))은  UTR  모듈  (b)와  UTR  모듈  (c)  사이에  위치하며,  따라서,  RNA  분자는  바람직하게는  5'-(b)-(a)-(c)-3'의  배열을  갖는다.  
 RNA 분자가 하나의 UTR 모듈 (즉, 모듈 (b) (즉, 상기에 정의된 바와 같이 서열번호 1을 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 1과 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들) 또는 모듈 (c) (즉, 상기에 정의된 바와 같이 서열번호 2를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 2와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들) 중 어느 하나)을 단지 보유하는 경우에 RNA 분자는 바람직하게는 5'-(b)-(a)-3' 또는 5'-(a)-(c)-3'의 배열을 갖는다.
 The  RNA  분자는  모듈  (a),  (b)  및/또는  (c)의  융합  RNA  서열의  형태,  즉,  상기  모듈을  코딩하는  적어도  2개의  뉴클레오티드  서열을  조합함으로써  제조된  하이브리드  유전자의  발현에  의해  형성되는  (융합)  RNA  분자로  존재할  수  있다.    전형적으로,  이하에  추가로  더  상세히  설명되는  바와  같이,  이것은  RNA  분자의  번역을  가능하게  하는  발현  벡터  내로  cDNA를  클로닝함으로써  완수될  수  있다.    따라서,  본  발명의  RNA  분자를  코딩하는  DNA  분자는  융합  DNA  서열일  수  있으며,  즉  하나의  모듈의  각각의  말단과  또  다른  분자의  말단  사이에  포스포디에스테르  결합을  형성하는,  또  다른  뉴클레오티드  상의  3'  탄소에  결합된  하나의  뉴클레오티드로부터  포스페이트  기를  통해  2종  이상의  폴리뉴클레오티드를  연결함으로써  형성되는  키메라  분자일  수  있다.    이러한  방식으로,  상기  적어도  2개의  모듈,  바람직하게는  모든  3개의  모듈을  코딩하는  상기  DNA  분자는  본  발명의  면에서  DNA  분자의  형태로  함께  연결된다.    일단  프레임에  클로닝되면,  그  다음에  이러한  재조합  DNA  분자는  상기  단백질,  폴리펩티드  또는  효소  분자를  코딩하는  그의  상응하는  RNA  핵산  서열로  전사된다.  
 대안적으로,  적어도  2개의  모듈,  바람직하게는  모든  세개의  모듈은  화학적  접합체에  의해  또한  공유  결합될  수  있다.    따라서,  이하에  추가로  더  상세히  개요를  서술하는  바와  같이,  RNA  분자의  모듈은  개별적으로  화학적으로  합성되며  그  후에  상기에  개요를  서술한  바와  같이  포스포디에스테르  결합에  공유  결합으로  결합될  수  있다.  
 하기에서, 코딩 영역 (a)와 관련하여 본 발명의 UTR 모듈 (b) 및/또는 (c)의 바람직한 배열이 기재되며, 여기서 UTR 모듈 (b) (CYBA mRNA의 상기-정의된 5' UTR 단편에 상응)은 코딩 영역의 상류에 (즉, 코딩 영역의 5' 말단에) 위치하며/하거나 UTR 모듈 (c) (CYBA mRNA의 상기-정의된 3' UTR에 상응)는 코딩 영역의 하류에 (즉, 코딩 영역의 3' 말단에) 위치된다.
 따라서,  바람직한  실시양태에서,  그리고  전술한  바에  따르면,  본  발명은    (a)  폴리펩티드를  코딩하는  코딩  영역;  및  (b)  서열번호  1을  포함하는  UTR을  포함하는  RNA  분자와  동일하거나  더  높은  번역  효율을  갖는  RNA  분자를  결과하는,  서열번호  1과  비교하여  1  내지  4개의  치환을  나타내는  서열  또는  서열번호  1에  나타낸  바와  같은  서열을  포함하는  하나  이상의  UTR(들)을  포함하는  RNA  분자로서,  여기서  (a)에서의  폴리펩티드를  코딩하는  상기  코딩  영역이  상기  본원에  정의된  바와  같이  시토크롬  b-245  알파  폴리펩티드  (CYBA)를  코딩하는  코딩  영역이  아니며  여기서  (b)에  정의된  바와  같은  상기  UTR(들)은  (a)에  정의된  바와  같은  코딩  영역의  5'  말단에  위치하는  것인,  RNA  분자에  관한  것이다.  
 바람직한 실시양태에서, 그리고 전술한 바에 따르면, 본 발명은 (a) 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역; 및 (c) 상기 코딩 영역의 하류에 서열번호 2를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 2와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들)을 포함하는 RNA 분자로서, 여기서 (a)에서의 폴리펩티드를 코딩하는 상기 코딩 영역이 상기 본원에 정의된 바와 같이 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA)를 코딩하는 코딩 영역이 아니며 여기서 (c)에 정의된 바와 같은 상기 UTR(들)은 (a)에 정의된 바와 같은 코딩 영역의 3' 말단에 위치하는 것인, RNA 분자에 관한 것이다.
 바람직한 실시양태에서, 그리고 전술한 바에 따르면, 본 발명은 (a) 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역; 및 (b) 서열번호 1을 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 1과 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들); 및 (c) 서열번호 2를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 2와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나 이상의 UTR(들)을 포함하는 RNA 분자로서, 여기서 (a)에서의 폴리펩티드를 코딩하는 상기 코딩 영역이 상기 본원에 정의된 바와 같이 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA)를 코딩하는 코딩 영역이 아니며 여기서 (b)에 정의된 바와 같은 상기 UTR(들)은 (a)에 정의된 바와 같은 코딩 영역의 5' 말단에 위치하며 여기서 (c)에 정의된 바와 같은 상기 UTR(들)은 (a)에 정의된 바와 같은 코딩 영역의 3' 말단에 위치하는 것인, RNA 분자에 관한 것이다.
  바람직한 실시양태에서, 그리고 전술한 바에 따르면, 본 발명은 (a) 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역; 및 (b) 서열번호 1을 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 1과 비교하여 1 내지 4개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 하나의 UTR; 및 (c) 서열번호 2를 포함하는 UTR을 포함하는 RNA 분자와 동일하거나 더 높은 번역 효율을 갖는 RNA 분자를 결과하는, 서열번호 2와 비교하여 1 내지 7개의 치환을 나타내는 서열 또는 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 2개의 UTR을 포함하는 RNA 분자로서, 여기서 (a)에서의 폴리펩티드를 코딩하는 상기 코딩 영역이 상기 본원에 정의된 바와 같이 시토크롬 b-245 알파 폴리펩티드 (CYBA)를 코딩하는 코딩 영역이 아니며 여기서 상기 RNA 분자는 (a)에 정의된 바와 같은 코딩 영역의 5' 말단에 (b)에 정의된 바와 같은 하나의 UTR을 포함하며 (a)에 정의된 바와 같은 코딩 영역의 3' 말단에 (c)에 정의된 바와 같은 상기 2개의 UTR을 포함하는 것인, RNA 분자에 관한 것이다.
   바람직한  실시양태에서,  그리고  전술한  바에  따르면,  본  발명은  (a)  폴리펩티드를  코딩하는  코딩  영역;  및  (c)  서열번호  2를  포함하는  UTR을  포함하는  RNA  분자와  동일하거나  더  높은  번역  효율을  갖는  RNA  분자를  결과하는,  서열번호  2와  비교하여  1  내지  7개의  치환을  나타내는  서열  또는  서열번호  2에  나타낸  바와  같은  서열을  포함하는  2개의  UTR을  포함하는  RNA  분자로서,  여기서  (a)에서의  폴리펩티드를  코딩하는  상기  코딩  영역이  상기  본원에  정의된  바와  같이  시토크롬  b-245  알파  폴리펩티드  (CYBA)를  코딩하는  코딩  영역이  아니며  여기서  상기  RNA  분자는  (a)에  정의된  바와  같은  코딩  영역의  3'  말단에  (c)에  정의된  바와  같은  상기  2개의  UTR을  포함하는  것인,  RNA  분자에  관한  것이다.    
 상기에서  언급한  바와  같이,  본  발명의  RNA  분자는  폴리-A  테일을  또한  보유할  수  있다.    본원에  사용된  바와  같이,  폴리-A  테일은  RNA의  3'  말단에  위치한  아데닌  뉴클레오티드의  서열에  관한  것이다.    폴리-A  테일은  폴리아데닐화로  칭해지는  과정에  의해  RNA의  3'  말단에  통상적으로  첨가된다.    따라서,  본  발명은  RNA  분자가  3'  말단에서  폴리-A  테일을  포함하는  것인,  상기-기재된  RNA  중  어느  하나에  관한  것이다.  
 폴리-A  테일의  길이는  특히  제한되지는  않는다.    그러나,  바람직한  실시양태에서,  본  발명의  RNA  분자는  3'  말단에서  폴리-A  테일을  포함하며  여기서  폴리-A  테일는  적어도  50,  60,  70,  80,  90,  100  또는  110개의  뉴클레오티드의  길이를  갖는다.    더  바람직한  실시양태에서,  본  발명의  RNA  분자는  3'  말단에서  폴리-A  테일을  포함하며  여기서  폴리-A  테일은  적어도  120개의  뉴클레오티드의  길이를  갖는다.    다른  바람직한  실시양태에서,  본  발명의  RNA  분자는  3'  말단에서  폴리-A  테일을  포함하며  여기서  폴리-A  테일은  적어도  150,  200,  250,  300,  350,  400,  500,  600,  700,  800,  900  또는  1000개의  뉴클레오티드의  길이를  갖는다.  
 본 발명의 RNA 분자가 이하에 추가로 본원에 기재된 바와 같이 시험관내 전사 방법에 의해 생성되는 경우에 폴리-A 테일은 RNA 구축물의 3' 말단에 있는 UTR에 인접한 RNA의 3' 말단에 위치하며 한편 본 발명의 RNA 분자를 보유하는 플라스미드는 폴리-A 테일의 하류에 시험관내 전사 이전에 선형화되어 시험관내 전사된 RNA 분자가 상기 폴리-A 테일을 함유하는 것을 보장하도록 한다.
 본  발명에  따른  구축물은  상기  세  가지  주요  모듈  (a),  (b)  및/또는  (c)를  단지  포함하지  않을  수  있다.    더  정확히  말하면,    개별  모듈  (a)  사이에,  예를  들어,  구축물의  구축을  용이하게  할  수  있는,  링커  모이어티/모이어티  및/또는  (a)  다중  클로닝  부위(들)가  배치되는  것이  바람직할  수  있다.    적합한  링커  모이어티  및  다중  클로닝  부위는  통상의  기술자에게  공지되어  있다.  
 바람직하게는,  본  발명의  구축물은  플라스미드  pVAX1  (인비트로겐(Invitrogen))로부터  유래되는  다중  클로닝  부위를  보유한다.    실시예  부분에서  개요를  서술한  바와  같은  모든  구축물은  WO2013/182683  A1에  이전에  기재된  구축물  pVAX  A120으로부터  유래한다.  
 모듈  (a)  (즉,  코딩  영역)와  관련하여  본  발명의  RNA  분자  내에  UTR  모듈  (b)  및/또는  (c)의  위치는  특히  제한되지는  않으며,  따라서,  본  발명의  RNA  분자의  개별  모듈  사이에  주요  모듈  (a),  (b)  및/또는  (c)의  부분이  아닌  하나  이상의  뉴클레오티드  G,  A,  U  및/또는  C로  채워진  스페이싱(spacing)  또는  갭(gap)이  있을  수  있다.    
 이  맥락에서  "하나  이상의  뉴클레오티드  G,  A,  U  및/또는  C"는  본  발명의  RNA  분자의  개별  모듈  사이에  스페이싱  또는  갭이  1,  2,  3,  4,  5,  6,  7,  8,  9  또는  10개의  뉴클레오티드  G,  A,  U  및/또는  C로  채워짐을  의미한다.    다른  바람직한  실시양태에서,  본  발명의  RNA  분자의  개별  모듈  사이에  스페이싱  또는  갭은  20,  30,  40,  50,  60,  70,  80,  90,  100  또는  110개  또는  그  초과의  뉴클레오티드  G,  A,  U  및/또는  C로  채워진다.  
 그러나, 바람직한 실시양태에서, 모듈 (a) (즉, 코딩 영역)와 관련하여 본 발명의 RNA 분자 내에 UTR 모듈 (b) 또는 (c)는, 그 사이에 어떠한 스페이싱 또는 갭이 없이 모듈 (a)의 코딩 영역의 시작 코돈에 바로 인접하게, 즉, 모듈 (a)의 코딩 영역의 시작 코돈의 바로 상류에 배치된다.
 또 다른 바람직한 실시양태에서, 모듈 (a) (즉, 코딩 영역)와 관련하여 본 발명의 RNA 분자 내에 UTR 모듈 (b) 또는 (c)는, 그 사이에 어떠한 스페이싱 또는 갭이 없이 모듈 (a)의 코딩 영역의 종결 코돈 (즉, 정지 코돈)에 바로 인접하게, 즉, 모듈 (a)의 코딩 영역의 종결 코돈/정지 코돈의 바로 하류에 배치된다.
 바람직한 실시양태에서, 모듈 (a) (즉, 코딩 영역)와 관련하여 본 발명의 RNA 분자 내에 UTR 모듈 (b)는, 그 사이에 어떠한 스페이싱 또는 갭이 없이 모듈 (a)의 코딩 영역의 시작 코돈에 바로 인접하게, 즉, 모듈 (a)의 코딩 영역의 시작 코돈의 바로 상류에 배치되며 모듈 (a) (즉, 코딩 영역)와 관련하여 본 발명의 RNA 분자 내에 UTR 모듈 (c)는, 그 사이에 어떠한 스페이싱 또는 갭이 없이 모듈 (a)의 코딩 영역의 종결 코돈 (즉, 정지 코돈)에 인접하게 바로, 즉, 모듈 (a)의 코딩 영역의 종결 코돈/정지 코돈의 바로 하류에 배치된다.
 상기에서  언급한  바와  같이,  RNA  분자는  모듈  (a),  (b)  및/또는  (c)의  융합  RNA  서열의  형태,  즉,  상기  모듈을  코딩하는  적어도  2개의  뉴클레오티드  서열을  조합함으로써  제조된  하이브리드  유전자의  전사에  의해  형성되는  (융합)  RNA  분자로  존재할  수  있다.    전형적으로,  이것은  전체  RNA  분자의  전사를  가능하게  하는  발현  벡터  내로  cDNA를  클로닝함으로써  완수된다.    본  발명의  RNA  분자를  "코딩하는"  합성  이중  가닥  핵산  분자를  생성하기  위해  핵산  합성,  하이브리드화  및/또는  증폭을  포함한,  융합  구축물을  제조하기  위한  여러  가지의  방법이  공지되어  있다.    이러한  이중  가닥  핵산  분자  (즉,  DNA  분자)는  한  가닥  상에  (즉,  코딩  가닥  상에)  본  발명의  RNA  분자에  상응하는  DNA  서열을  함유하며,  따라서,  본  발명의  RNA  분자를  "코딩한다".    환언하면,  이러한  이중  가닥  핵산/DNA  분자는  전사시,  유전  정보,  즉  상기  본원에  정의된  바와  같은  본  발명의  RNA  분자를  가닥  상에  포함한다.    본  발명의  맥락에서  용어  "코딩(coding)"  또는  "코딩하는(encoding)"은  그의  통상적인  의미,  즉  단백질을  코딩하는  유전자의  DNA  (및,  따라서,  폴리펩티드  또는  단백질  아미노산  서열로  변역될  수  있는  유전  정보)와  관련되도록  단지  사용되는  것이  아니다.    더  정확히  말하면,  본  발명의  면에서,  모듈  (a),  (b)  및/또는  (c)를  코딩하는  개별  DNA  서열이  단일  (키메라)  DNA  분자에  "융합"  또는  연관되어  있는  구축물에서,  구축물은  또한  단백질로  번역되지  않는  성분  (즉,  모듈  (b)  및/또는  모듈  (c))을  포함한다.    그럼에도  불구하고,  모듈  (b)  및/또는  모듈  (c)에  상응하는  DNA  서열은  본  발명의  UTR의  구조에  대한  정보,  즉,  "코드"를  제공하며,  따라서,  본  발명에서의  용어  "코딩하는"은  또한,  예를  들어,  한  가닥  상에  본  발명의  RNA  분자를  보유하는  이중  가닥  핵산  분자에  존재할  경우,  발현,  즉,  전사될  수  있는,  UTR의  유전  정보에  관한  것이다.    따라서,  본  발명의  맥락에서  용어  "코딩하는"은,  비록  이것은  통상적으로  단백질의  코딩/발현과  관련되도록  단지  사용되긴  하지만,  핵산  분자가  단백질  또는  폴리펩티드를  코딩하는  부분  (즉,  모듈  (a))  및  UTR을  "코딩하는"  부분  (즉,  모듈  (b)  및/또는  (c))을  보유하며,  여기서  후자는  UTR이  단백질  또는  폴리펩티드로  번역되지  않기  때문에  발현시  최종  생성물을  나타내는  것인,  본  발명의  RNA  분자로  전사될  수  있는  방식으로  이해되어야  한다.    이러한  이중  가닥  핵산은  표준  분자  생물학  기술에  의한  융합  단백질  생산을  위한  발현  벡터에  삽입될  수  있다  (예를  들어  문헌  [Sambrook  et  al.,  Molecular  Cloning,  A  laboratory  manual,  2nd  Ed,  1989]  참조).    용어  "벡터"  예컨대  "발현  벡터"  또는  "클로닝  벡터"는  본  발명의  의미에서  염색체  DNA와  독립적으로  세포  내에서  복제되며  유전  물질을  세포  내로  운반하는  비히클로서  사용되는  DNA의  원형의  이중  가닥  단위로서  이해되며,  여기서  이는  복제  및/또는  발현  (즉,  RNA로  전사되며  아미노산  서열로  번역)될  수  있는  것으로  이해된다.    외래  DNA를  함유하는  벡터는  재조합  DNA로  칭해진다.    벡터  그  자체는  일반적으로,  벡터의  "백본"으로서  역할을  하는  더  큰  서열  및  삽입물  (즉,  모듈  (a)  코딩  영역  및  단백질로  번역되지  않는  모듈  (b)  및/또는  모듈  (c))로  이루어진  DNA  서열이다.    본  발명의  의미에서  플라스미드는  박테리아에서  가장  흔히  발견되며  재조합  DNA  연구에서  세포  사이에  유전자  전달에  사용되며  이와  같이  본  발명의  의미에서  사용된  바와  같이  보통  말하는,  "벡터"의  하위  집단이다.
 따라서, 또한 본 발명은 본 발명의 RNA 분자를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
 핵산은,  예를  들어,  본  발명의  RNA  분자의  세  가지  주요  모듈  중  두  가지  (즉,  모듈  (a)  및  모듈  (b)  또는  모듈  (c))를  코딩하는  DNA이다.    대안적으로,  핵산,  바람직하게는  DNA는  모든  세  가지  주요  모듈  (즉,  모듈  (a)  및  모듈  (b)  및  모듈  (c))을  코딩한다.    본  발명의  상기  핵산  분자는  바람직하게는  재조합  핵산  분자일  수  있으나  또한  자연적으로  발생하는  핵산  분자를  포함할  수  있다.    따라서,  본  발명의  핵산  분자는  천연  기원,  합성  또는  반합성일  수  있다.    그것은  DNA,  RNA,  잠김  핵산뿐만  아니라  PNA를  포함할  수  있으며,  그것은  그의  하이브리드일  수  있다.
 RNA  분자를  코딩하는  본  발명의  핵산  분자에  조절  서열이  첨가될  수  있다는  것은  관련  기술분야의  통상의  기술자에게  명백하다.    예를  들어,  본  발명의  폴리뉴클레오티드,  즉  RNA  분자의  유도  발현을  가능하게  하는  프로모터,  전사  인핸서  및/또는  서열을  사용할  수  있다.    예를  들어,  적합한  유도가능  시스템은,  예를  들어,  문헌  [Gossen  and  Bujard,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA 89 (1992), 5547-5551], 및 [Gossen, Trends Biotech. 12 (1994), 58-62]에 기재된 바와 같은 테트라시클린-조절 유전자 발현, 또는 예를 들어 문헌 [Crook, EMBO J. 8 (1989), 513-519]에 기재된 바와 같은 덱사메타손-유도가능 유전자 발현 시스템이다.
 더욱이,  상기  핵산  분자는,  예를  들어,  티오에스테르  결합  및/또는  뉴클레오티드  유사체를  함유할  수  있다.    상기  변형은  세포에서  엔도-  및/또는  엑소뉴클레아제에  대한  핵산  분자의  안정화에  유용할  수  있다.    상기  핵산  분자는  세포에서의  상기  핵산  분자의  전사를  가능하게  하는  키메라  유전자를  함유하는  적절한  벡터로부터  전사될  수  있다.    본  발명의  맥락에서  상기  핵산  분자는  또한  표지될  수  있다.    핵산의  검출  방법은  관련  기술분야에  널리  공지되어  있으며,  예를  들어,  서던(Southern)  및  노던(Northern)  블롯팅,  PCR  또는  프라이머  신장법(primer  extension)이  있다.  
 본  발명의  핵산  분자(들)는  앞서  언급한  핵산  분자  중  어느  한  분자를  단독으로  또는  조합하여  포함하는  재조합으로  생성된  키메라  핵산  분자일  수  있다.    바람직하게는,  본  발명의  핵산  분자는  벡터의  부분이다.
 따라서  또한  본  발명은  본  발명의  핵산  분자를  포함하는  벡터에  관한  것이다.    따라서,  본  발명은  본  발명의  핵산을  포함하는  벡터,  바람직하게는  발현  벡터에  관한  것이다.  
 본 발명의 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지 또는 예를 들어 유전 공학에서 통상적으로 사용되는 또 다른 벡터일 수 있으며, 적합한 숙주 세포에서 및 적합한 조건 하에 상기 벡터의 선택을 가능하게 하는 추가 유전자 예컨대 마커 유전자를 포함할 수 있다.
 더욱이,  본  발명의  벡터는,  본  발명의  RNA  분자를  코딩하는  핵산  분자의  서열  이외에도,  적합한  숙주에서  코딩  영역의  적절한  발현을  가능하게  하는,  발현  제어  요소를  포함할  수  있다.    이러한  제어  요소는  통상의  기술자에게  공지되어  있으며  프로모터,  스플라이스  카세트,  번역  시작  코돈,  번역  및  벡터에  삽입물을  도입하기  위한  삽입  부위를  포함할  수  있다.    바람직하게는,  본  발명의  핵산  분자는  진핵  세포  또는  원핵  세포에서  발현을  가능하게  하는  상기  발현  제어  서열과  작동가능하도록  연결된다.    따라서,  본  발명은  본  발명의  핵산  분자를  포함하는  벡터에  관한  것으로서,  여기서  진핵  및/또는  원핵  (숙주)  세포가  벡터로  형질감염되는  경우  핵산  분자가  숙주  세포에  의해  인식되는  제어  서열에  작동가능하도록  연결된다.  
 진핵  및  원핵  (숙주)  세포에서  발현을  보장하는  제어  요소는  관련  기술분야의  통상의  기술자에게  널리  공지되어  있다.    상기  본원에  언급된  바와  같이,  이들은  통상  전사의  개시를  보장하는  조절  서열  및  임의로  전사물의  안정화  및  전사의  종결을  보장하는  폴리-A  신호를  포함한다.  
 그러나,  본  발명에  따르면,  벡터  자체가  폴리-A  테일을  위한  서열을  보유하는  것은  중요하지  않다.    상기에서  언급한  바와  같이,  본  발명의  RNA  분자가  이하에  추가로  본원에  기재된  바와  같이  시험관내  전사  방법에  의해  생성되는  경우에  상기  폴리-A  테일은  본  발명의  구축물의  부분이며  (반드시  클로닝  벡터에  원래  위치하는  것은  아니며)  RNA  구축물의  3'  말단에  있는  UTR에  인접한  RNA의  3'  말단에  위치한다.    본  발명의  RNA  분자가  시험관내  전사  방법에  의해  생성되는  경우에  본  발명의  RNA  분자를  보유하는  플라스미드는  폴리-A  테일의  하류에  시험관내  전사  이전에  선형화되어  시험관내  전사된  RNA  분자가  상기  폴리-A  테일을  함유하는  것을  보장하도록  한다.  
 추가  조절  요소는  전사뿐만  아니라  번역  인핸서,  및/또는  자연적으로-연관된  또는  이종  프로모터  영역을  포함할  수  있다.    예를  들어  포유동물  숙주  세포에서  발현을  허용하는  가능한  조절  요소는  CMV-HSV  티미딘  키나제  프로모터,  SV40,  RSV-프로모터  (라우스  육종  바이러스(Rous  Sarcoma  Virus)),  인간  신장  인자  1α-프로모터,  글루코코르티코이드-유도가능  MMTV-프로모터  마우스  유방  종양  바이러스(Mouse  Mammary  Tumor  Virus)),  메탈로티오네인-  또는  테트라시클린-유도가능  프로모터,  또는  인핸서,  예컨대  CMV  인핸서  또는  SV40-인핸서를  포함한다.    신경  세포에서의  발현의  경우,  신경미세섬유(neurofilament)-,  PGDF-,  NSE-,  PrP-  또는  thy-1-프로모터가  사용될  수  있는  것으로  예상된다.    상기  프로모터는  관련  기술분야,  그  중에서도,  문헌  [Charron,  J.  Biol.  Chem.  270  (1995),  25739-25745]에  공지되어  있다.    원핵  세포에서의  발현의  경우,  예를  들어,  tac-lac-프로모터  또는  trp  프로모터를  포함한,  다수의  프로모터가  기재되어  있다.    전사의  개시의  원인이  되는  요소  외에도,  이러한  조절  요소는  폴리뉴클레오티드의  하류에  전사  종결  신호,  예컨대  SV40-폴리-A  부위  또는  tk-폴리-A  부위를  또한  포함할  수  있다.    이  맥락에서,  적합한  발현  벡터는  관련  기술분야  예컨대  오카야마-베르그(Okayama-Berg)  cDNA  발현  벡터  pcDV1  (파마시아(Pharmacia)),  pRc/CMV,  pcDNA1,  pcDNA3  (인비트로겐),  pSPORT1  (GIBCO  BRL),  pX  (문헌  [Pagano,  Science  255  (1992),  1144-1147]),  효모  2-하이브리드  벡터,  예컨대  pEG202  및  dpJG4-5  (문헌  [Gyuris,  Cell  75  (1995),  791-803]),  또는  원핵생물  발현  벡터,  예컨대  람다  gt11  또는  pGEX  (아머샴-파마시아(Amersham-Pharmacia))에  공지되어  있다.  
 더욱이,  본  발명의  벡터는  또한  발현  벡터일  수  있다.    본  발명의  핵산  분자  및  벡터는  세포  내로  직접  도입을  위해  또는  리포솜,  바이러스  벡터  (예를  들어  아데노바이러스,  레트로바이러스),  전기천공법,  탄도  (예를  들어  유전자  총)  또는  다른  전달  시스템을  통한  도입을  위해  설계될  수  있다.    게다가,  바큘로바이러스  시스템이  본  발명의  핵산  분자에  대한  진핵생물  발현  시스템으로서  사용될  수  있다.  
 또한  본  발명은  본  발명의  벡터를  포함하는  숙주  세포에  관한  것이다.    따라서,  본  발명은  본  발명의  벡터로  형질감염되거나  형질  전환된  숙주  또는  본  발명의  벡터를  운반하는  비인간  숙주,  즉  본  발명에  따른  핵산  분자로  또는  이러한  핵산  분자를  포함하는  벡터로  유전자  변형된  숙주  세포  또는  숙주에  관한  것이다.    용어  "유전자  변형된"은  숙주  세포  또는  숙주가  그의  자연  게놈  이외에도  세포  또는  숙주에  또는  그의  전임자/부모  중  하나에  도입된  본  발명에  따른  핵산  분자  또는  벡터를  포함함을  의미한다.    핵산  분자  또는  벡터는  게놈  밖의  독립  분자로서,  바람직하게는  복제  가능한  분자로서  유전자  변형된  숙주  세포  또는  숙주에  존재할  수  있거나,  그것은  숙주  세포  또는  숙주의  게놈에  안정적으로  통합될  수  있다.    본  발명에  따른  벡터로  숙주  세포를  형질  전환시키는  것은,  예를  들어  문헌  [Sambrook  and  Russell  (2001),  Molecular  Clonining:  A  Laboratory  Manual,  CSH  Press,  Cold  Spring  Harbor,  NY,  USA;  Methods  in  Yeast  genetics,  A  Laboratory  Course  Manual,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  1990]에  기재된  바와  같은  표준  방법에  의해  수행될  수  있다.    숙주  세포는,  특히  pH  값,  온도,  염분  농도,  통기,  항생제,  비타민,  미량  원소  등의  관점에서,  사용된  특정  숙주  세포의  요건을  충족시키는  영양  배지에서  배양된다.  
 본  발명의  숙주  세포는  임의의  원핵  또는  진핵  세포일  수  있다.    적합한  원핵  세포는  클로닝에  일반적으로  사용되는  것들  예컨대  이.  콜라이( E. coli) 또는 바실러스 서브틸리스( Bacillus subtilis)이다.    더욱이,  진핵  세포는,  예를  들어,  진균  또는  동물  세포를  포함한다.    적합한  진균  세포의  예는  효모  세포,  바람직하게는  사카로마이세스( Saccharomyces) 속의 것들, 가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애( Saccharomyces cerevisiae)의  종의  것들을  포함한다.    적합한  동물  세포는,  예를  들어,  곤충  세포,  척추동물  세포,  바람직하게는  포유동물  세포,  예컨대  예를  들어  HEK293,  NSO,  CHO,COS-7,  MDCK,  U2-OSHela,  NIH3T3,  MOLT-4,  저캇(Jurkat),  PC-12,  PC-3,  IMR,  NT2N,  Sk-n-sh,  CaSki,  C33A이다.    관련  기술분야에  공지된  추가의  적합한  세포주는  세포주  보관소,  예컨대,  예를  들어,  더  도이체  잠룽  폰  미크로오르가니스멘  운트  젤쿨투렌  게엠베하(the  Deutsche  Sammlung  von  Mikroorganismen  und  Zellkulturen  GmbH)  (DSMZ)  또는  더  아메리칸  타입  컬쳐  컬렉션(the  American  Type  Culture  Collection)  (ATCC)으로부터  입수가능하다.    본  발명에  따라서,  1차  세포/세포  배양은  숙주  세포로서  기능할  수  있다는  것이  더욱이  예상된다.    상기  세포는  특히  곤충  (예컨대  초파리(Drosophila)  또는  바퀴(Blatta)  종의  곤충)  또는  포유동물  (예컨대  인간,  돼지,  마우스  또는  쥐)에서  유래된다.    상기  숙주  세포는  신경모세포종  세포주와  같은  세포주로부터의  세포  및/또는  상기  세포주로부터  유래된  세포를  포함할  수  있다.    상기  언급한  1차  세포는  관련  기술분야에  널리  공지되어  있으며,  그  중에서도,  1차  성상교세포,  (혼합된)  척추  배양물  또는  해마  배양물을  포함한다.
 또한  본  발명은  본  발명의  개별  모듈  또는  본  발명의  전체  RNA  분자를  코딩하는  발현  벡터를  보유하는  숙주  세포를  배양  배지에서  배양하고,  숙주  세포  또는  배양  배지로부터  RNA  분자를  회수함으로써  본  발명의  RNA  분자를  생성시키는  방법에  관한  것이다.    본  발명은  또한  본  발명의  숙주  세포의  배양  및  임의로  배양물로부터  RNA  분자를  회수하는  것을  포함하는,  본  발명의  RNA  분자를  생성시키는  방법에  관한  것이다.
 본 발명의 RNA 분자를 회수하고/거나 그 후에 정제하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
 본  발명은  또한,  관련  기술분야의  통상의  기술자에  공지된  방법에  의해  본  발명의  RNA  분자를  시험관내  반응으로  생성시키는  방법에  관한  것이다.    보다  구체적으로,  본  발명의  RNA  분자는  시험관내  전사  시스템을  사용하여  시험관내에서  생성될  수  있다.    시험관내  전사  시스템은  통상적으로  공지되어  있으며  상기에  개요를  서술한  바와  같이  모듈  (b)  및/또는  모듈  (c)를  "코딩하는"  DNA  서열을  함유하는  정제된  선형  DNA  주형을  통상적으로  필요로  하며  여기서  상기  DNA  서열은  적절한  프로모터의  제어하에  있다.    게다가,  시험관내  전사  시스템은  또한  리보뉴클레오시드  트리포스페이트,  DTT  및  마그네슘  이온을  포함하는  완충제  시스템,  및  본  발명의  RNA  분자로의  시험관내  전사에  효소  활성을  제공하는  적절한  RNA  폴리머라제를  통상적으로  필요로  한다.  
 시험관내 전사를 사용하여 RNA 분자를 생성시키는 데 통상적으로 사용되는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Methods Mol. Biol. 703 (2011):29-41]에 기재되어 있다.
 상기에서  언급한  바와  같이,  본  발명의  RNA  분자가  이하에  추가로  본원에  기재된  바와  같이  시험관내  전사  방법에  의해  생성되는  경우에  상기  폴리-A  테일은  본  발명의  구축물의  부분이며  (반드시  클로닝  벡터에  원래  위치하는  것은  아니며)  RNA  구축물의  3'  말단에  있는  UTR에  인접한  RNA의  3'  말단에  위치한다.    본  발명의  RNA  분자가  시험관내  전사  방법에  의해  생성되는  경우에  본  발명의  RNA  분자를  보유하는  플라스미드는  폴리-A  테일의  하류에  시험관내  전사  이전에  선형화되어  시험관내  전사된  RNA  분자가  상기  폴리-A  테일을  함유하는  것을  보장하도록  한다.  
 대안적으로, 본 발명의 RNA 분자는, 예를 들어, 고상 지지체 및 표준 기술을 사용하는 자동화된 뉴클레오티드 서열 합성기 상에서 통상적인 화학적 합성에 의해 화학적으로 또한 합성될 수 있다.
 본 발명은 또한, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 공지된 방법에 의해 그리고 상기에 개요를 서술한 바와 같이 본 발명의 RNA 분자를 시험관내 반응으로 생성시키고 반응으로부터 RNA 분자를 회수하는 방법에 관한 것이다.
 본 발명의 RNA 분자를 회수하고/거나 그 후에 정제하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
 상기  정의된  바와  같은  RNA  분자는  의학적  환경에서  및  특정  질환의  치료,  특히  RNA-기반  요법에서  특히  유용하다.    따라서,  또한  본  발명은  본  발명의  RNA  분자,  본  발명의  핵산  분자,  본  발명의  벡터  또는  본  발명의  숙주  세포  및  임의로  제약상  허용되는  담체를  포함하는  제약  조성물에  관한  것이다.
 용어  "치료"  등은  바람직한  약리학적  및/또는  생리학적  효과를  얻는  것을  일반적으로  의미하는  것으로  본원에서  사용된다.    따라서,  본  발명의  치료는  특정  질환의  (급성)  상태의  치료에  관한  것일  수  있으나,  또한  질환  또는  그의  증상을  완전히  또는  부분적으로  예방한다는  면에서의  예방을  위한  치료에  관한  것일  수  있다.    바람직하게는,  용어  "치료"는  질환  및/또는  유해  효과  및/또는  질환에  기인  한  증상을  부분적으로  또는  완전히  치유한다는  면에서  치료적임을  이해하여야  한다.    이  점에서  "급성"은  대상체가  질환의  증상을  나타내는  것을  의미한다.    환언하면,  치료되는  대상체는  치료를  실제로  필요로  하며  본  발명의  맥락에서  용어  "급성  치료"는  질환이  발병하거나  질환이  발생한  후에  질환을  실제로  치료하기  위해  취해치는  조치에  관한  것이다.    치료는  또한,  예를  들어,  질환의  발병  및/또는  감염을  예방하기  위해,  예방을  위한  또는  예방적  치료,  즉,  질환  예방을  위해  취해지는  조치일  수  있다.  
 본  발명의  제약  조성물은  통상의  기술자에게  공지된  광범위한  부류의  투여  형태를  통해  투여될  수  있다.    투여는  연고,  로션,  겔,  발포제,  크림  및  흡입기의  사용,  주사침,  정제를  포함하나  이에  제한되지는  않는  에어로졸을  통해,  경구,  국소적,  전신적일  수  있다.  
 언급한 바와 같이, 본 발명은 유효량의 상기에 따른 본 발명의 RNA 분자 (또는 핵산 분자, 벡터 또는 숙주 세포) 및 적어도 1종의 제약상 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는, 제약 조성물에 관한 것이다.
 부형제  또는  담체는  강력한  활성  성분을  함유하는  제제를  벌크  업(bulking-up)하기  위한  목적으로,  활성  성분,  즉  상기에  따른  본  발명의  구축물과  함께  제제화되는  불활성  물질이다.    부형제는  종종  "증량제(bulking  agent)",  "충전제",  또는  "희석제"로  지칭된다.    벌크  업은  투여  형태를  제조할  때  약물  물질을  편리하고  정확하게  조제할  수  있게  한다.    그들은  또한  다양한  치료-향상  목적,  예컨대  약물  흡수  또는  용해도  촉진,  또는  다른  약물동태학적  고려  사항에  기여할  수  있다.    부형제는  또한,  시험관내  안정성  예컨대  예상  저장  기간(shelf  life)에  걸친  변성의  예방을  돕는  것  외에도,  예컨대  분말  유동성  또는  비-점착  특성을  촉진시킴으로써,  관련  활성  물질의  취급을  돕기  위해,  제조  공정에서  유용할  수  있다.    적절한  부형제의  선택은  또한  투여  경로  및  투여  형태,  뿐만  아니라  활성  성분  및  기타  인자에  따라  달라진다.  
 따라서,  상기에  따라,  유효량의  본  발명의  핵산을  포함하는  제약  조성물은  고체,  액체  또는  기체  형태일  수  있고,  그  중에서도,  (하나의)  분말(들),  (하나의)  정제(들),  (하나의)  용액(들)  또는  (하나의)  에어로졸(들)의  형태일  수  있다.    상기  제약  조성물이  제약상  허용되는  담체  및/또는  희석제를  임의로  포함하는  것이  바람직하다.  
 적합한  제약  담체,  부형제  및/또는  희석제의  예는  관련  기술분야에  널리  공지되어  있고  인산염  완충  식염수,  물,  에멀젼,  예컨대  수중유  에멀젼,  다양한  유형의  습윤제,  멸균  용액  등을  포함한다.    이러한  담체를  포함하는  조성물은  널리  공지된  통상적인  방법에  의해  제제화될  수  있다.    이들  제약  조성물은  대상체에게  적합한  양으로,  즉  관련  기술분야에  공지된  방법에  의해  통상의  기술자에  의해  쉽게  결정될  수  있는  "유효량"으로  투여될  수  있다.    투여  요법은  담당  의사와  임상적  인자에  의해  결정될  것이다.    의학  분야에서  널리  공지된  바와  같이,  임의의  한  환자에  대한  투여량은  환자  또는  대상체의  체격,  신체  표면적,  연령,  투여할  특정한  화합물,  성별,  시간  및  투여  경로,  일반적인  건강,  및  공동으로  투여되는  다른  약물을  포함한,  많은  인자에  따라  달라진다.  
 따라서,  바람직하게는,  본  발명의  구축물은  유효량을  포함된다.    용어  "유효량"은  제약  조성물이  투여될  대상체에서  검출  가능한  치료  반응을  유도하기에  충분한  양을  지칭한다.    상기에  따르면,  제약  조성물  중  본  발명의  구축물의  함량은  상기  기재된  바와  같이  치료에  유용한한  제한되지는  않으나,  바람직하게는  총  조성물당  0.0000001-10  중량%를  함유한다.    추가로,  본원에  기재된  구축물은  바람직하게는  담체  중에  사용된다.    일반적으로,  적절한  양의  제약상  허용되는  염이  담체  중에  사용되어  조성물을  등장성으로  만든다.    담체의  예는  식염수,  링거  용액  및  덱스트로스  용액을  포함하나  이제  제한되지는  않는다.    바람직하게는,  허용되는  부형제,  담체  또는  안정제는  사용된  투여량  및  농도에서  비독성이며,  예를  들어  완충제  예컨대  시트레이트,  포스페이트,  및  기타  유기산  완충액;  염-형성  반대  이온,  예를  들어  나트륨  및  칼륨;  저  분자량  (>  10  아미노산  잔기)  폴리펩티드;  단백질,  예를  들어  혈청  알부민  또는  젤라틴;  친수성  중합체,  예를  들어  폴리비닐피롤리돈;  아미노산  예컨대  히스티딘,  글루타민,  리신  아스파라긴,  아르기긴,  또는  글리신;  글루코스,  만노스,  또는  덱스트린을  포함한  탄수화물;  모노사카라이드;  디사카라이드;  기타  당류,  예를  들어  수크로스,  만니톨,  트레할로스  또는  소르비톨;  킬레이트제,  예를  들어  EDTA;  비이온성  계면활성제,  예를  들어  트윈(Tween),  플루로닉(Pluronics)  또는  폴리에틸렌  글리콜;  메티오닌,  아스코르브산  및  토코페롤을  포함한  항산화제;  및/또는  보존제,  예를  들어  옥타데실디메틸벤질  암모늄  클로라이드;  헥사메토늄  클로라이드;  벤즈알코늄  클로라이드,  벤즈에토늄  클로라이드;  페놀,  부틸  또는  벤질  알콜;  알킬  파라벤,  예를  들어  메틸  또는  프로필  파라벤;  카테콜;  레조르시놀;  시클로헥산올;  3-펜탄올  및  m-크레솔)을  포함한다.    적합한  담체  및  그의  제제는  문헌  [Remington's  Pharmaceutical  Sciences,  17th  ed.,  1985,  Mack  Publishing  Co.]에  더  상세히  기재되어  있다.
 주기적  평가에  의해  치료  진전을  모니터링할  수  있다.    본  발명의  RNA  분자  또는  제약  조성물은  멸균  수성  또는  비수성  용액,  현탁액,  및  에멀젼뿐만  아니라  크림  및  좌제로  있을  수  있다.    비수성  용매의  예는  프로필렌  글리콜,  폴리에틸렌  글리콜,  식물성  오일  예컨대  올리브  오일,  및  유기  에스테르  예컨대  에틸  올레에이트이다.    수성  담체는  물,  알콜성/수성  용액,  에멀젼  또는  에멀젼,  예를  들어  식염수  및  완충  매질을  포함한다.    보존제  및  기타  첨가제  예컨대,  예를  들어,  항균제,  항산화제,  킬레이트제,  및  불활성  기체  등이  또한  존재할  수  있다.    더욱이,  본  발명의  제약  조성물은  제약  조성물의  의도된  용도에  따라  추가의  작용제를  포함할  수  있다.    상기  작용제는,  예를  들어,  상업적  명칭  트윈으로  시판되고  있는,  폴리옥시에틸렌  소르비탄  모노라우레이트,  프로필렌  글리콜,  EDTA,  시트레이트,  수크로스뿐만  아니라  관련  기술분야의  통상의  기술자에게  널리  공지된  제약  조성물의  의도된  사용에  적합한  다른  작용제일  수  있다.  
 본 발명에 따라서, 용어 "제약 조성물"은 환자, 바람직하게는 인간 환자에게 투여하기 위한 조성물에 관한 것이다.
 본  발명의  제약  조성물은  RNA-기반  요법에서  사용하기  위한  것일  수  있다.    상기에서  언급한  바와  같이,  "폴리펩티드를  코딩하는  코딩  영역"을  포함하는  본  발명의  RNA  분자는  RNA-기반  요법에서  사용될  수  있으며  여기서  "폴리펩티드를  코딩하는  코딩  영역"은  치료  또는  예방  효과를  갖는  치료상  또는  제약상  활성인  폴리펩티드  또는  단백질을  코딩한다.    따라서,  바람직한  실시양태에서,  본  발명의  제약  조성물은  상기   표 2에  열거된  바와  같이  질환의  치료  또는  예방에서  RNA-기반  요법에서  사용하기  위한  것일  수  있다.    따라서,  본  발명에  따른  RNA-기반  요법은  상기   표 2에 열거된 바와 같이 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 것일 수 있다.
 따라서, 본 발명의 제약 조성물은 상기 표 2에  기재된  유전자  결함이  질환을  야기한  다음에  이를  본  발명의  RNA  분자를  사용한  전사물  대체  요법/효소  대체  요법에  의해  치료  또는  예방할  수  있는  경우에  RNA-기반  요법에서  사용하기  위한  것일  수  있으며,  여기서  RNA  분자는  상기  개시된  결손  유전자를  보완하는  단백질  또는  그의  기능적  단편의  무손상  버전을  코딩하는  "폴리펩티드에  대한  코딩  영역"을  포함한다.    특히  바람직한  실시양태에서,  본  발명의  제약  조성물은  리소솜  질환  예컨대  고셰병,  파브리병,  MPS  I,  MPS  II  (헌터  증후군),  MPS  VI  및  글리코겐  축적병  예컨대  예를  들어  글리코겐  축적병  제I형  (폰  기에르케병),  제II형  (폼페병),  제III형  (코리병),  유형  IV  (안데르센병(Andersen's  disease)),  제V형  (맥아들병),  제VI형  (헤르병(Hers  diease)),  제VII형  (타우리병(Tauri's  disease)),  제VII형,  제IX형,  제X형,  제XI형  (판코니-비켈  증후군(Fanconi-Bickel  syndrome)),  제XI형,  또는  제0형의  치료  또는  예방에서  RNA-기반  요법에서  사용하기  위한  것일  수  있다.    전사물  대체  요법/효소  대체  요법은  근본적인  유전적  결함에  유익하게  영향을  미치지  않으나,  환자가  결핍된  효소의  농도를  증가시킨다.    예로서,  폼페병에서,  전사물  대체  요법/효소  대체  요법은  결핍된  리소솜  효소  산  알파-글루코시다제  (GAA)를  대체한다.
 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 본 발명에 따라서 RNA-기반 요법에서 사용하기 위한 것일 수 있으며 여기서 "폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역"은 치료 또는 예방 효과를 갖는 치료상 또는 제약상 활성인 폴리펩티드, 단백질 또는 펩티드를 코딩하며, 여기서 상기 폴리펩티드, 단백질 또는 펩티드는 표 2에 개요를 상술한 바와 같이 유전자에 의해 코딩된 군으로부터 선택된다.
 다른  바람직한  실시양태에서,  본  발명에  따른  RNA-기반  요법은  암,  심혈관  질환,  바이러스  감염,  면역  기능  장애,  자가  면역  질환,  신경  장애,  유전성  대사  장애  또는  유전적  장애  또는  세포에서  생성된  단백질  또는  단백질  단편이  환자에  유익한  효과를  가질  수  있는  임의의  질환을  치료하는데  사용하기  위한  것일  수  있다.    암의  예는  두경부암,  유방암,  신장암,  방광암,  폐암,  전립선암,  골암,  뇌암,  자궁  경부암,  항문암,  결장암,  결장직장암,  맹장암,  안암,  위암,  백혈병,  림프종,  간암,  피부암,  난소암,  음경암,  췌장암,  고환암,  갑상선암,  질암,  외음부암,  자궁  내막  암,  심장  암  및  육종을  포함한다.
 심혈관 질환의 예는 죽상동맥경화증, 관상동맥성 심질환, 폐성 심질환 및 심근병증을 포함한다.
 면역 기능 장애 및 자가 면역 질환의 예는 류마티스성 질환, 다발성 경화증 및 천식을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
 바이러스 감염의 예는 인간 면역결핍 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 인간 유두종바이러스뿐만 아니라 B형 및 C형 간염 바이러스에 의한 감염을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
 신경 장애의 예는 파킨슨병, 다발성 경화증 및 치매를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
 유전성 대사 장애의 예는 고셰병 및 페닐케톤뇨증을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
 본  발명은  또한  RNA-기반  요법의  방법에  관한  것이다.    따라서,  본  발명은  질환  예컨대  암,  심혈관  질환,  바이러스  감염,  면역  장애,  자가  면역  질환,  신경  장애,  유전성  대사  장애  또는  유전적  장애의  RNA-기반  요법에  의한  치료  방법에  관한  것이다.    치료  방법의  바람직한  실시양태에  관해서는,  상기  정의된  바와  같은  RNA-기반  요법에서  사용하기  위한  RNA  분자  또는  제약  조성물의  맥락에서  상기  설명된  바와  같이  필요한  변경을  가하여  동일하게  적용된다.
 본  발명에서,  대상체는,  바람직한  실시양태에서,  포유  동물  예컨대  개,  고양이,  돼지,  소,  양,  말,  설치류,  예를  들어,  래트,  마우스,  및  기니아  피그,  또는  영장류,  예를  들어,  고릴라,  침팬지,  및  인간이다.    가장  바람직한  실시양태에서,  대상체는  인간이다.  
 또한,  본  발명은  본  발명의  RNA  분자,  본  발명의  핵산  분자,  본  발명의  벡터  또는  본  발명의  숙주  세포를  포함하는  키트에  관한  것이다.    바람직한  실시양태에  관해서,  본  발명에  따른  RNA  분자,  핵산  분자,  벡터  또는  숙주  세포의  맥락에서  상기  설명된  바와  같이,  필요한  변경을  가하여  동일하게  적용된다.    유리하게는,  본  발명의  키트는,  상기  및  하기  용도  및  방법의  수행에  필요한,  임의로  (하나의)  완충제(들),  저장  용액  및/또는  잔여  시약  또는  물질을  추가로  포함한다.    더욱이,  본  발명의  키트의  부분은  바이알  또는  병에  또는  용기  또는  다중  용기  단위로  조합하여  개별적으로  포장될  수  있다.    본  발명의  키트는,  그  중에서도,  본  발명의  방법,  본  발명의  RNA  분자의  제조를  수행하기  위해  유리하게  사용될  수  있고,  본  발명의  RNA  분자의  제조를  위해  유리하게  사용될  수  있고,  예를  들어,  상기  및  하기에  개요를  상술한  바와  같은  용도에서,  본원에  언급된  여러  가지  적용에서  사용될  수  있을  것이다.    키트에  포함될  수  있는  또  다른  구성  요소는  그의  사용에  대해  키트를  사용하는  사람에  대한  사용  설명서이다.    키트의  제조는  바람직하게는  관련  기술분야의  통상의  기술자에게  공지된  표준  절차를  따른다.
 마지막으로,  또한  본  발명은  RNA  분자의  코딩  영역을  상기에  정의되어  있는  바와  같이  상기  코딩  영역에  의해  코딩된  폴리펩티드  또는  단백질로  번역하는  효율을  증가시키기  위한,  서열번호  1을  포함하는  UTR을  포함하는  RNA  분자와  동일하거나  더  높은  번역  효율을  갖는  RNA  분자를  결과하는,  서열번호  1과  비교하여  1  내지  4개의  치환을  나타내는  서열  또는  서열번호  1에  나타낸  바와  같은  서열을  포함하는  하나  이상의  UTR(들);  및/또는  서열번호  2를  포함하는  UTR을  포함하는  RNA  분자와  동일하거나  더  높은  번역  효율을  갖는  RNA  분자를  결과하는,  서열번호  2와  비교하여  1  내지  7개의  치환을  나타내는  서열  또는  서열번호  2에  나타낸  바와  같은  서열을  포함하는  하나  이상의  UTR(들)의  용도에  관한  것이다.    용도의  바람직한  실시양태에  관해서,  본  발명의  RNA  분자의  맥락에서  상기  설명된  바와  같이,  필요한  변경을  가하여  동일하게  적용된다.
 [도면의 간단한 설명]
  도 1: A549 세포의 형광 현미경검사 및 유동 세포측정법.
 (A) 5' CAP, 5' UTR, 코딩 영역, 3' UTR 및 폴리-A 테일로 이루어진, 치료용 mRNA의 개략도.
 (B)  형질감염  24시간  후에  4x  배율  (JULYTM)로  취한  형광  현미경검사.    모든  구축물은  대조군과  비교하여  개선된  단백질  발현  수준을  나타냈다.  
 (C)  FC에  의해  결정된  바와  같은  d2EGFP  양성  세포의  백분율은  모든  구축물에  대해  유사하다.    아이오딘화프로피디움을  사용하여  죽은  세포를  검출하였다.    적용된  게이트는  죽은  세포와  비형질감염  세포의  배제를  보장하였다.  
 (D) 형질감염 48시간 후에, 지속적 단백질 발현은 대조군과 비교하여 안정화된 구축물에서 더 높았다.
  도 2: A549  세포  (A)  및  Huh7  세포  (B)에  대해  FC에  의해  결정된  바와  같은  단백질  발현의  시간  과정.    대조군에  대해  정규화된  평균  형광  강도는  로그-선형  플롯에서  시간에  대해  플롯팅된다.    형질감염  후의  시간이  증가함에  따라,  안정화  된  구축물의  상승된  단백질  발현  수준이  점점  더  분명해진다.    대조군,  5'UTR  및  3'UTR  구축물  각각  뿐만  아니라  구축물  5'+3',  5'+2x3'  및  2x3'에  상응하는  막대는  도면의  우측에  나타낸  바와  같이  상이하게  음영  처리되어  있다.
  도 3: 상이하게 안정화된 mRNA 구축물을 시험하는 평행 단세포 검정을 위한 미세구조화된 다중-채널 슬라이드.
   (A)  그  사이의  세포-반발성(cell-repellent)  PEG  영역을  가진  세포-부착성,  미세구조화된  단백질  패턴은  정렬된  세포  배열을  가능하게  한다.    형광성으로  표지된  피브로넥틴을  사용하여  미세패턴을  가시화하였다.  
 (B) 마이크로채널(microchannel) 내부에 피브로넥틴 패턴에 부착하는 형광 A549 세포 (시딩 후 3시간).
 (C) 우리의 분석 용액에 기저를 이루는 반응식 (우측에) 및 mRNA 리포펙션 (좌측에)의 개략도.
 (D)  A549  세포에서  mRNA-매개  d2EGFP  발현의  예시적인  시간  경과.    흑색  선은  이론상  번역  모델에  대한  대표적인  피트(fit)이다.  
  도 4: 발현률 K의 분포, mRNA 수명 및 d2EGFP 수명 및 상응하는 평균값과 구축물의 개략도.
 (A)  초기  mRNA  분자  수와  번역률의  곱인  발현률  K의  분포.    분포가  유사하게  형상화된다는  사실은  형질감염  동역학  및  번역률이  매우  유사하다는  것을  나타낸다.    
 (B)  mRNA  반감기의  분포는  그의  광대함에  큰  변화를  보인다.    겉으로  보기에  참고로,  점선은  대조군의  평균  반감기를  나타낸다.  
 (C)  d2EGFP  반감기의  분포.    예상대로,  상이한  구축물의  분포는  유사하게  형상화되고  평균값이  필적할  만하다.    겉으로  보기에  참고로,  모든  측정된  반감기를  기준으로  한  d2EGFP의  전체  평균  반감기를  점선으로  나타냈다.  
 (D)  적합률(fitted  rate)의  평균값  및  상응하는  표준  편차  (std).    비록  대조군  구축물이  두  세포  유형  모두에서  높은  평균  K  값을  산출하긴  하지만,  이  구축물의  짧은  mRNA  반감기는  안정화된  구축물과  비교하여  작은  AUC  값을  야기한다.    이는   도 6에서  볼  수  있다.    구축물의  개략도는  우측에서  볼  수  있다.    모든  구축물은  동일한  5'캡  및  폴리-A  테일을  갖는다.    895  단일  A549  및  1355  Huh7  세포로부터의  데이터를  분석하였다.
  도 5: 상이한  구축물의  마스터곡선(Mastercurve).    개시  시간이  0으로  이동  된  A549  (A)  및  Huh7  (B)  세포의  모집단  평균.    짙은  회색,  중간  회색  및  밝은  회색  곡선은  각각  대조군  제어/5'UTR/3'UTR  구축물에  상응한다.    곡선은  우측에  상응하게  표시된  바와  같은  구축물에  상응한다.
  도 6: 상이한 구축물의 AUC 및 mRNA 수명 연장 인자.
 (A) mRNA 번역과 단백질 및 mRNA의 분해 사이의 상호 작용을 설명하기 위한 AUC의 개략도.
 (B) 및 (C) → ∞에 대해 분석된 바와 같이 상이한 구축물의 AUC.
 십자가는 상이한 실험의 상대적 AUC를 나타내며, 막대(bar)는 모든 단세포 AUC의 평균에 상응한다.
 (D)  및  (E)  mRNA  수명  연장  인자.    모든  변형은  대조군과  비교하여  연장된  mRNA  수명을  결과한다.    유사한  경향이  A549  (D)  및  Huh7  (E)  세포에서  관찰된다.    (D)  및  (E)의  오차  막대는  표준  편차를  나타낸다.  
  도 7: Huh7 세포의 형광 현미경검사 및 유동 세포측정법 데이터.
 (A)  형질감염  24시간  후에  4x  배율  (JULYTM)로  찍은  형광  현미경검사.    모든  구축물은  대조군과  비교하여  개선된  단백질  발현  수준을  나타냈다.  
 (B)  FC에  의해  결정된  바와  같은  d2EGFP  양성  세포의  백분율은  모든  구축물에  대해  유사하다.    아이오딘화프로피디움을  사용하여  죽은  세포를  검출하였다.    적용된  게이트는  죽은  세포와  비형질감염  세포의  배제를  보장하였다.  
 (C) 형질감염 48시간 후에, 지속적 단백질 발현은 대조군과 비교하여 안정화된 구축물에서 더 높았다.
  도 8: A549 및 Huh7 세포에서 qRT-PCR에 의한 mRNA 반감기의 결정
 물질  및  방법  부분에  기재된  바와  같은  프로토콜에  따라  세포를  형질감염시켰다.    모든  mRNA  구축물에  대한  4,  8,  24,  36,  48,  60,  72시간의  절대  mRNA  정량은  A549  (도  8A  참조)  및  Huh7  (도  8B  참조)에서  결정되었다.    이  데이터로부터  mRNA  반감기를  계산하였다.    물리적  반감기는  대조군으로  정규화하였다.
  도 9: 미세구조화된 기질에 대한 형질감염 효율.
 리포펙타민(Lipofectamine)TM2000  또는  DOGTOR를  활용하여  SNIM  RNA로  형질감염된  A549  세포  및  Huh7  세포에  대한  형질감염된  세포의  백분율  및  상응하는  표준  편차.    리포펙타민TM2000으로  형질감염된  세포에서  더  높은  형질감염  효율이  밝혀졌다.
  도 10: 직접 측정 된 d2EGFP 반감기의 분포
 (A)  Huh7  세포에서  시클로헥스이미드-유도  d2EGFP  분해의  예시적인  시간  과정.    흑색  선은  단백질  분해에  대한  단순  지수  피트(simple  exponential  fit)이다.
 (B)  2.46 h  (std  0.71 h)의  평균  반감기를  산출하는,  A549  세포에서  측정된  d2EGFP  반감기의  분포.    (C)  4.04 h  (std  1.82 h)의  평균  반감기를  산출하는,  Huh7  세포에서  측정된  d2EGFP  반감기의  분포.
  도 11: 단세포  AUC의  분포.    AUC는  하기  수학식  3에  따라  계산되었다.    A549  데이터는  좌측  열에  나타냈고,  Huh7  데이터는  우측  열에  나타냈다.
  도 12: 표 5에 명시된 바와 같이 상이한 유전자의 UTR을 갖는 구축물 #2 내지 #5와 CYBA-UTR #1 구축물의 비교.
 본  발명의  다른  측면  및  이점은  하기  실시예에  기재될  것이며,  이는  예시적인  목적으로  제시되는  것이며  제한하기  위한  것은  아니다.    본  출원에  인용된  각각의  간행물,  특허,  특허  출원  또는  기타  문헌은  그  전문이  본원에  참조로  포함된다.
  실시예
  I. 물질 및 방법
  플라스미드 벡터
 불안정화된  증강된  녹색  형광  단백질  (d2EGFP)을  pd2EGFP-N1  (클론테크(Clonetech))로부터  절제하고  pVAXA120  (3)에서  클로닝하여  pVAXA120-d2EGFP를  생성시켰다.    mRNA  안정성에  관하여  이전에  공개된  데이터에  기초하여,  CYBA  유전자의  미리  선택된  5'  및  3'  UTR  서열을  유로핀즈(Eurofins)  MWG  (독일)에  의해  합성하였으며  pVAXA120-d2EGFP에서  d2EGFP의  상류에서  (5'UTR)  및/또는  하류에서  (3'UTR  또는  2x3'UTR)  클로닝함으로써여,  각각의  UTR  조합을  가진  구축물을  생성시켰다.  
  mRNA 제조
 시험관내  전사된  mRNA  (IVT  mRNA)를  생성시키기  위해,  플라스미드를  NotI  소화(digestion)에  의해  폴리-A  테일의  하류에서  선형화시키고,  클로로포름  추출  및  에탄올  침전에  의해  정제하였다.    정제된  선형  플라스미드를  리보맥스(RiboMax)  대규모  RNA  제조  시스템(Large  Scale  RNA  Procution  System)-T7  (프로메가(Promega),  독일)을  사용하여  시험관내  전사용  주형으로서  사용하였다.    항-역전  캡  유사체(Anti-Reverse  Cap  Analog)  (ARCA)를  반응  믹스에  첨가하여  5'  캡핑된  mRNA를  생성시켰다.    또한  SNIM  mRNA의  생산을  위해,  화학적으로  변형된  뉴클레오티드,  즉  메틸-CTP  및  티오-UTP  (예나  바이오사이언스(Jena  Bioscience),  독일)를  ATP:CTP:UTP:메틸-CTP:티오-UTP:GTP의  7.57  mM:5.68  mM:5.68  mM:1.89  mM:1.89  mM:1.21  mM의  최종  농도에  첨가하였다.    완전  IVT  믹스를  37℃에서  2시간  동안  배양한  후  DNaseI로  37℃에서  20분  동안  DNA를  소화시켰다.    RNA를  암모늄  아세테이트  (최종  농도  2.5M)으로  침전시키고  70%  EtOH로  세척하였다.    세척  단계를  2회  수행하였다.    마지막으로,  RNA  펠렛을  RNAse-비함유  물에  재현탁시켰다.    모든  mRNA가  1%  아가로스  겔에서  확인되었다.    예시적인  mRNA  구축물의  개략도를   1A에서  볼  수  있다.    UTR의  정확한  서열은  상기   표 1 아래 본문에 제시하였다.
 
 < 표 3> 이차 구조 ( mfold )
  표 3에,  양  말단  및  UTR  내에서  발견되는  mRNA  구축물  예컨대  자유  최소  에너지  (G)  및  이차  구조의  특징을  열거하였다.    폴딩  플랫폼  mfold를  사용하여  mRNA이차  구조를  예측하였다  (40).    각각의  구축물에  대해,  우리는  최고  자유  에너지를  갖는  8개  이차  구조를  비교하였다.    최고  자유  에너지  값은  2x3  'UTR  및  3'UTR  구축물에  대해  예측된다.    각각의  mRNA  구축물의  5'  말단은  3'UTR  또는  5'UTR과  부분적으로  결합하나,  대조군  구축물은  코딩  서열  (cds)에  결합한다.    흥미롭게도,  2x3'  mRNA  구축물의  5'  말단은  그  자체로  안정적인  헤어핀을  형성한다.    그러나,  5'  말단  근처의  헤어핀  루프는  단백질  번역을  또한  방해할  수  있다  (41).    또  다른  특징은  3  'UTR  및  5'+3'  UTR  mRNA  구축물의  3'  말단에서  발견되었다:  따라서,  3'  말단은  5'  말단과  결합하여,  서로로부터의  거리를  최소화하여  더  빠른  번역  개시를  가능하게  한다.    5'UTR과는  달리,  각각의  mRNA  구축물의  3'UTR은  적어도  하나의  헤어핀을  그  자체로  형성한다.
  유동 세포측정법 ( FC )
 실험  설정은  다음과  같다:  150  μl  배지  중  20.000개  세포를  96-웰  플레이트에서  웰당  시딩하고  시딩  후  24시간  형질감염시켰다.    세포를  시판  형질감염  시약  리포펙타민 TM2000을  사용하여  5  pg  mRNA/세포의  용량으로  형질감염시켰다.    복합체를  1  μg  mRNA당  2.5  μl  리포펙타민 TM2000의  비로  제조하였다.    리포플렉스(lipoplex)의  형성을  위해,  리포펙타민 TM2000  및  mRNA를  각각  50  μl의  전체  부피로  옵티MEM(OptiMEM)  형질감염  배지에서  개별적으로  희석하였다.    이들  혼합물을  5분  동안  실온에서  인큐베이션하였다.    그  다음에  mRNA  용액을  리포펙타민 TM2000  용액과  혼합한  후,  실온에서  또  다른  20분  인큐베이션하였다.    인큐베이션  후에,  900  μl의  옵티MEM를  리포플렉스  용액에  첨가하였다.    마지막으로,  50  μl의  복합체  용액을  세포에  첨가하고  1시간  동안  인큐베이션하였다.    모든  mRNA  구축물에  대해,  생물학적  삼중물을  제조하였다.    인큐베이션  후,  리포플렉스-용액을  버리고  새로운  150  μl  배지를  각각의  웰에  첨가하였다.    d2EGFP  발현은  FC를  이용하여  8,  24,  36,  48,  60  및  72시간  후에  측정하였다.    이들  시점  각각에서  형광  현미경검사  영상을  취하였다.    FC  측정을  위해,  세포  배양  배지를  버리고  세포를  1xDPBS  (깁코  라이프  테크놀로지(Gibco  Life  Technology))로  세척하였다.    그  후에,  20  μl의  TrypLE  익스프레스(Express)  (깁코  라이프  테크놀로지)를  웰  당  첨가하고  37℃에서  5분  동안  인큐베이션하였다.    2%  FBS가  보충된  80  μl  1xPBS를  첨가함으로써  반응을  중화시켰다.    세포를  피펫팅(pipetting)함으로써  혼합하고  유동  세포  측정에  적절한  96  웰  플레이트로  옮겼다.    마지막으로,  5  μl의  아이오딘화프로피디움  (최종  농도  1  μg/ml)을  웰당  첨가하고  어툰  오토  샘플러(Attune  Auto  Sampler)  (어플라이드  바이오시스템즈(Applied  Biosystems))로  측정하였다.    줄라이(JULY) TM 현미경을 사용하여 FC 분석 전에 형광 영상을 취하였다.
  정량적 실시간 PCR
 qRT-PCR  분석을  사용하여  A549  및  Huh7  세포에서  4,  8,  24,  36,  48,  60  및  72시간의  시간  간격으로  d2EGFP  mRNA  양을  결정하였다.    게다가,  mRNA  발현  동역학  그  자체는  각각의  UTR의  mRNA  반감기를  계산하는데  사용되었다.    여기에서,  상기  세포는  상기  기재된  프로토콜과  유사하게  형질감염시켰다  (FC  참조).    200.000개  세포/웰의  세포  밀도가  RNA  단리에  충분한  것으로  밝혀졌다.    RNA  단리는  뉴클레오스핀(NucleoSpin)  RNA  (마쉐레이  마겔(Macherey  Nagel))를  사용하여  제조자의  프로토콜에  따라  수행하였다.    단리된  전체  RNA는  분광  광도  측정  및  겔  분석에  의해  RNA  농도  및  품질에서  검사되었다.    추가로,  각각의  UTR  구축물  및  대조군의  0,5  μg의  전체  RNA를  퍼스트  스트랜드(First  Strand)  cDNA  합성  키트(Synthesis  Kit)  (써모  사이언티픽(Thermo  Scientific))로부터  올리고(dT)를  사용하여  cDNA  합성에  사용하였다.    동등한  양의  cDNA  (1:50로  희석)를  에스소어드벤스트(SsoAdvanced)™  유니버셜(Universal)  SYBR?  그린  슈퍼믹스(Green  Supermix)  (바이오라드(BioRad))를  사용하여  125  nM의  각각의  d2EGFP-프라이머  (정방향  프라이머:  5'-CAA  CCA  CTA  CCT  GAG  CAC  CC-3'  (서열번호   3); 역방향 프라이머: 5'-GTC CAT GCC GAG AGT GAT CC-3' (서열번호 4))로  시험하였다.    절대  정량의  표준으로서,  IVT에  의해  생성된  순수한  d2EGFP  mRNA를  cDNA  합성에  사용하였다.    절대  mRNA  정량화는  라이트사이클러(Lightcycler)  96  장치  (로슈(Roche))  상에서  수행하였다.
  표면 패턴화 및 샘플 준비
 미세구조화된  표면은  선택적인  산소  플라즈마  처리  (펨토  디에너(Femto  Diener),  3분  동안  40  W)에  의해  기재  (이비디  게엠베하(ibidi  GmbH))로서의  최상부에서  후속  부동태화와  함께  제조되었다.    선택성은  폴리디메틸실록산  (PDMS)  스탬프  (포토리소그래피에  의해  제조된  마스터(master)로부터  주조)를  마스크로서  사용하여  달성되었다.    플라즈마에  노출된  부분을  수성  완충제  (10 mM  HEPES  pH 7.4  및  150 mM  NaCl)에서  1  mg/ml의  농도로  PLL(20k)-g(3.5)-PEG(2k)로  30분  동안  인큐베이션에  의해  부동태화하였다.    그  후,  샘플을  PBS로  세정하고  PDMS  스탬프를  제거하였다.    그  다음에  호일을  부착성  6-채널  슬라이드  (점성의  μ-  슬라이드  VI)에  고정시켰다.    각각의  채널을  1시간  동안  PBS  중의  50 μg/ml  피브로넥틴의  용액으로  채워  나머지  구역을  세포-부착성이  되도록  하였다.    프로브를  PBS로  3회  철저히  세정하였다.    샘플은  세포  시딩  전에  세포  배지에  실온에서  보관하였다.    이  연구에  대해,  30  μm  x  30  μm의  정사각형  부착  부위가  사용되었는데,  그  이유는  이  크기가  A549뿐만  아니라  Huh7  세포의  단세포  부착에  대해  합리적으로  판명되었기  때문이다.    세포를  채널당  10,000개  세포의  밀도로  시딩하여  대략  하나의  세포가  각각의  세포-부착  섬(island)에  부착할  수  있도록  하였다.     3A에 나타낸 바와 같은 형광 미세패턴을 수득하기 위해, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488과 접합된 30 μg/ml 피브리노겐과 20 μg/ml 피브로넥틴의 혼합물을 사용하였다.
  물질
 FBS, 레이보비츠(Leibovitz)의 L-15 배지 (깁코), 리포펙타민 TM2000,  및  옵티MEM  (깁코)을  인비트로겐  (독일)으로부터  구매하였다.    멸균  PBS를  자체에서(in-house)  준비하였다.    햄(Ham)의  F-12K,  DMEM,  및  트립신-EDTA를  체.체.프로  게엠베하(c.c.pro  GmbH)  (독일)로부터  구매하였다.    채널  슬라이드를  이비디  (독일)로부터  구매하였다.    피브로넥틴을  요  프로테인즈(Yo  Proteins)  (스웨덴)로부터  구매하였다.    PLL-g-PEG를  수소에스  아게(SuSoS  AG)  (스위스)로부터  구매하였다.    알렉사  플루오르  488을  라이프  테크롤로지즈(Life  Technologies)  (독일)로부터  구매하였다.    플라스미드  pd2EGFP-N1을  BD  바이오사이언시즈  클론테크(BD  Biosciences  Clontech)  (독일)로부터  구매하였다.
  세포 배양
 인간  폐포  선암  세포주  (A549,  ATCC  CCL-185)를  10%  FBS가  보충된  햄의  F12K  배지에서  성장시켰다.    인간  간암  상피  세포주  (Huh7,  JCRB0403,  JCRB  세포  은행(Cell  Bank),  일본)를  10%  태아  소  혈청이  보충된  DMEM  배지에서  배양하였다.    모든  세포주를  5%  CO 2 수준의 가습 분위기에서 성장시켰다.
  시험관내 형질감염
 형질감염  3시간  전에,  채널당  10.000개  세포를  6-채널  슬라이드에  시딩하였다.    세포를  시판  형질감염  시약  리포펙타민 TM2000을 사용하여 1 μg mRNA 당 2.5 μl 리포펙타민 TM2000의  비로  5  pg  mRNA/세포의  용량으로  형질감염시켰다.    복합체  형성은  다음과  같이  준비하였다:  리포펙타민 TM2000  및  mRNA를  각각  45  μl의  전체  부피로  옵티MEM  형질감염  배지에서  개별적으로  희석하였다.    이들  혼합물을  5분  동안  실온에서  인큐베이션하였다.    그  다음에  리포펙타민 TM2000  용액을  mRNA  용액과  혼합한  후,  실온에서  또  다른  20분  인큐베이션하였다.    모든  후속  세정  단계  동안에  마이크로채널은  결코  비어  있지  않았음에  주목한다:  형질감염  직전에,  세포를  PBS로  세척하였다.    마지막으로,  상이한  mRNAs  구축물을  함유하는  리포플렉스  용액을  6개  채널에  채웠다.    따라서  모든  5개의  상이한  mRNA  구축물에  더하여  참조  구축물은  동일한  실험  조건하에서  측정될  수  있었다.    세포를  1시간  동안  37℃  (5%  CO 2  수준)에서  90  μl의  전체  형질감염  부피로  인큐베이션하였다.    그  후에  형질감염  배지를  제거하고  세포를  PBS로  세척하였다.    그  후에,  세포는  10%  FBS를  함유하는  레이보비츠의  L-15  배지로  다시  인큐베이션하였다.    d2EGFP  발현을  현미경으로  모니터링하기  전에  각각의  배지  저장고의  최상부에  항-증발  오일  (이비디  게엠베하,  독일)을  첨가하였다.
  데이터 수집 및 정량적 영상 분석
 생  세포  영상화(Live-cell  imaging)는  현미경  단계용  온도  제어  장착  프레임과  대물  렌즈  (CFI  플랜플루오르(PlanFluor)  DL-10×,  상1,  NA  0.30,  니콘(Nikon))가  장착된  전동  도립  현미경  (니콘,  이클립스(Eclipse)  Ti-E)  상에서  수행하였다.    우리는  측정  전반에  걸쳐  37℃  (±  2℃)에서  샘플의  온도를  안정화시키기  위해  온도  제어기를  갖춘  이비디  가열  시스템  (이비디  게엠베하,  독일)을  사용하였다.    세포  영상을  획득하기  위해,  우리는  냉각된  CCD  카메라  (CLARA-E,  안도르(Andor))를  사용하였다.    수은  광원  (C-HGFIE  인텐시라이트(Intensilight),  니콘)을  조명에  사용하고  필터  세트  41024  (크로마  테크놀로지  코포레이션(Chroma  Technology  Corp.),  BP450-490,  FT510,  LP510-565)를  갖춘  필터  큐브를  d2EGFP  검출에  사용하였다.    조명  셔터  제어(illumination  shutter  control)를  사용하여  표백을  방지하였다.    형질감염  후  적어도  25시간  동안  10분  간격으로  600  ms의  일정한  노출  시간으로  10배  배율로  영상을  취하였다.    형광  영상을  단일  영상  시퀀스  파일로  통합하였다.    단세포  발현  동역학의  특징적인  매개  변수의  정량  분석은  발현  효율  및  안정성의  면에서  다양한  벡터  성능의  비교를  가능하게  한다.    영상  분석은  여러  단계로  이루어져  있으며  ImageJ를  기반으로  하는  자체  개발  소프트웨어를  사용하여  수행되었다.    먼저,  직사각형  격자에  원본  타임  랩스  무비가  겹쳐지고  근본적인  세포-패턴의  크기  및  방향으로  조정되었다.    그  다음에,  소프트웨어는  모든  스퀘어의  형광  강도를  판독함으로써  d2EGFP-발현  세포를  자동으로  검출하였다.    비어  있는  스퀘어는  배경  수정에  사용되었다.    소프트웨어는  전체  서열에  대해  세포의  형광을  계산하고  상응하는  강도를  세포당  형광의  시간  과정에  연결한다.    마지막으로,  스퀘어당  단세포  형광  강도를  추출하였다.  
 그 다음에, 데이터는 mRNA와 d2EGFP에 대한 미분 방정식에 대한 솔루션인, IgorPro 소프트웨어를 사용하여 mRNA-유도 단백질 발현에 대한 분석 용액으로 각각의 시간 과정을 피팅함으로써 최근에 기재된 바와 같이 분석되었다 ( 수학식 1 참조),
  ( 수학식 4)
  (수학식 5)
 mRNA-유도 단백질 발현에 대해 근본적인 단순화한 모델의 개략도를 도 3C에 도시하였다.
  II. 실시예 1 : 형광 현미경검사 및 유동 세포측정법 ( FC )을 통한 분석
 트랜스진  발현  동역학에  대한  상이한  UTR  조합의  영향을  평가하기  위해,  5'  UTR  단독,  3'  UTR,  5'+3'  UTR,  두  개의  카피의  3'UTR  및  5'+2x3'  UTR을  함유하는  상이한  d2EGFP  mRNA  구축물을  가진  리포펙타민TM2000을  사용하여  2개의  상이한  세포주를  형질감염시켰다.    모든  구축물의  빌딩  블록의  개략도를  도 1A에서 볼 수 있다.
 형질감염  후  3일까지의  상이한  시점에서,  d2EGFP  발현은  FC를  사용하여  정량화되었다.    살아있는  A549  세포의  d2EGFP  발현  수준을  도시하는  t=24h에  대한  예시적인  도트  플롯을   도 1C에 나타냈다 (상응하는 Huh7 데이터에 대해서는 도 7B  참조).    게다가,  우리는  형광  현미경검사를  사용하여  세포를  영상화하였다  ( 도 1B 및 D 도 7A 및 C).    모든  mRNA  구축물에  대한  필적하는  형질감염  효율을  형질감염  후  24시간  확인하였다  ( 도 1B 8A).    그렇게  함으로써,  발현  동역학에서의  관찰된  차이에  대한  원인  인자가  되는  감별  전달  효율(differential  transfer  efficiency)을  배제할  수  있다.    형광  현미경검사  영상을  기초로  하여,  형질감염  48시간  후  모든  구축물에  대한  d2EGFP  발현의  급격한  감소가  검출되었다  ( 도 1B 및 D, 도 7A 및 C).    그러나,  모든  UTR-안정화된  mRNA에  대해  대조군과  비교하여  더  높은  EGFP  발현  수준이  밝혀졌다.    보다  구체적으로,  3  'UTR를  함유하는  mRNA  구축물은  3'  UTR이  없는  구축물보다  발현을  증강시키는  것으로  보였다.    이것은  A549  및  Huh7  세포에서  관찰되었다  ( 도 1도 7  각각  참조).    48시간  이후의  시점에서,  이  효과는  훨씬  더  두드러졌다  (데이터는  표시되지  않음).     2 A 및 B에서, FC에 의해 결정된 바와 같은 평균 형광 강도 (MFI)의 시간 경과는 두 세포 유형 모두에서 모든 구축물에 대해 나타냈다.
 또한  여기에서,  모든  UTR-함유  mRNA  구축물은  모든  시점에서  세포  주  둘  다에서  대조군  구축물보다  더  높은  MFI  값을  나타냈다.    종합하면,  형광  현미경검사  및  FC  데이터는  CYBA  UTR이  제공된  mRNA  분자는  24시간이  넘는  동안  지속  d2EGFP  발현을  나타낸다는  점을  시사한다.
  III. 실시예 2 : 정량적 실시간 PCR
 추가  접근법으로서의  qRT-PCR  측정을  수행하여  상이한  구축물의  "물리적"  mRNA  반감기를  결정하였다.    우리가  선택한  프라이머의  d2EGFP에  대한  결합은  시작  코돈의  600nt  하류에서  일어났다.    그러므로,  물리적  mRNA  반감기의  측정은  무손상  mRNA와  탈캡핑되었으나  아직  분해되지  않은  것들  또는  탈캡핑되고  또한  염기  599까지  분해된  것들  둘  다를  손상시킨다.    이는  번역  풀에서  제거되어  P-바디(body)에  저장되어  있는  mRNA를  또한  포함한다  (29-32).    비록  무손상  mRNA가  d2EGFP  발현의  한  원인이  되긴  하지만,  탈캡핑된  및/또는  부분적으로  분해된  전사물의  후자의  군,  및  P-바디에서의  것들은  어떠한  발현도  야기하지  않는다.    물리적  mRNA  반감기의  결정은  A549  및  Huh7  세포에서  대조군과  비교하여  UTR의  어떠한  유의한  수명  연장도  나타내지  않았다  ( 도 8A 및 B  각각  참조).    흥미롭게도,  대신  5',  3',  5'+2x3'  및  2x3'  UTR  구축물에  대한  mRNA  물리적  반감기의  감소가  세포주  둘  다에서  관찰되었다.
  A549 및 Huh7 세포에서 qRT - PCR에 의한 mRNA 반감기의 결정
 추가적인 실험에서, qRT-PCR을 사용하여 상이한 mRNA 구축물의 mRNA 반감기를 조사하였고, 이는 통상적인 접근법이다 ( 도 8A 및 B 참조).    따라서,  mRNA  구축물은  본원에  기재된  바와  같이  형질감염되었다.    결국,  각각의  특정  시점에서의  절대  mRNA  양을  얻어  UTR이  공급된  각각의  mRNA에  대한  mRNA  반감기를  계산하였다.    대조군과  비교하여  선택된  mRNA  구축물  중  어느  한  구축물에  대해서도  어떠한  유의한  mRNA  안정화  효과도  관찰되지  않았다.
  IV. 실시예 3 : 단세포 발현 어레이
  도 3A 및 B에 나타낸 바와 같은 미세구조화된, 세포-부착성 기질이 단세포 타임 랩스 현미경검사에 대한 플랫폼으로서 제작되었다.
 직사각형  스퀘어는  세포외  기질  단백질  피브로넥틴으로  기능화되어  있으며,  한편  주변  어두운  영역은  세포  반발성  PLL-g-PEG로  부동태화되어  있다.    세포를  적절하게  묽은  세포  밀도로  시딩하여,  약  3시간  후에  세포가  직사각형  스퀘어에  부착되었다.    이러한  세포  자기  조직화(cellular  self-organization)  과정은  이전에  상세히  연구되었다  (27).    스퀘어의  크기는  단세포로의  최적의  충전을  위해  30  μm이었다.    스퀘어  사이의  거리는  동시에  1개  초과의  스퀘어에  부착되어  있는  세포의  브릿징(bridging)  효과를  최소화하기에  충분할  정도로만  컸다  (60  μm).    스퀘어당  형광  신호의  자동  영상  분석  및  타임  랩스  형광  현미경검사는  수백  가지  개별  시간  과정을  산출한다.    배경  수정된  원시  데이터의  전형적인  세트를   3D에  나타냈다.    흑색  선은  mRNA  발현에  대한  수학적  발현에  대한  예시적인  피트를  나타낸다  (물질  및  방법  섹션  또한  참조).    데이터를  IgorPro  소프트웨어를  사용하여  mRNA-유도  단백질  발현에  대한  분석  용액으로  각각의  시간  과정을  피팅함으로써  최근에  (26)  기재된  바와  같이  분석되었다.
  (수학식 1)
 여기에서,  G는  단백질  양을  의미하며,  K는  발현률이며,  δ는  mRNA  분해율(degradation  rate)이며,  β는  리포터  단백질  d2EGFP의  분해율이다.    발현률   은  세포  내  mRNA  분자의  초기  양  (m0)과  번역률  kTL이  곱이다.    수학식  1에  의해  기재되는  시간  과정은  이하의  섹션  "단백질  발현의  마스터곡선"에서  상세히  논의될  것이다.
  V. 실시예 4 : 세포 어레이에 대한 시험관내 형질감염
 전형적인  실험에서,  세포를  형질감염  3시간  전에  마이크로패턴에  부착시켰다.    6개의  마이크로채널  각각을  관심  구축물  중  하나를  함유하고  있는,  리포플렉스  용액으로  채웠다다.    초기  실험에서,  우리는  두개의  상이한,  시판되는  형질감염  시약  (즉  리포펙타민TM  2000  및  DOGTOR)을  비교하였다.    DOGTOR의  경우보다  더  높은  형질감염  효율이  리포펙타민TM  2000의  경우  발견되었다  ( 도 9  참조).    추가로  얻은  80%  초과의  높은  세포  생존률을  리포펙타민TM2000으로  얻었기  때문에  (데이터는  표시되지  않음),  모든  추가  형질감염  실험은  리포펙타민  TM2000을  사용하여  수행되었다.    형질감염  직후  mRNA-매개  단백질  발현이  시작됨에  따라,  인큐베이션  시간은  최소로  유지되었다.    따라서,  mRNA  투여량과  인큐베이션  시간  사이의  비율을  조정하여  높은  형질감염  효율  ( 도 9를  또한  참조)  및  리포터  단백질의  과발현에  의해  유발되는  무시할  수  있는  독성  효과를  달성하였다.    5  pg/세포의  mRNA  용량에서,  1시간의  인큐베이션  시간이  최적인  것으로  밝혀졌다.
  미세구조화된 기질에 대한 형질감염 효율
 성공적으로 형질감염된 세포의 백분율을 평가하여 두 가지 상이한 형질감염제를 비교하고 형질감염 효율이 미세구조화된 세포 성장에 의해 방해받지 않는 것을 보장하였다 ( 도 9 참조).    여기에서,  모든  세포는  미세구조화된  단백질  어레이  상에서  성장하였다.    우리는  DOGTOR와  비교하여  리포펙타민 TM2000의  경우  더  높은  형질감염  효율을  얻었다.    시판  살아있는/죽은  세포  생존률  검정(Live/Dead  cell  viability  assay)  (몰레큘라  프로브즈(Molecular  Probes),  독일)을  사용하여,  80%  초과의  높은  세포  생존률을  밝혀냈다  (데이터는  표시되지  않음).
  VI. 실시예 5 : 발현률
 두  세포  유형에  대한  모든  결과는  동일한  실험  조건하에  4가지  독립적인  측정에  기초하였다.    약  1000개의  A549  세포와  1000개의  Huh7  세포의  타임  랩  데이터를  분석하였다.    얻어진  발현률  K의  분포를   도 4A에 나타냈고, 상응하는 평균값은 도 4D에서 볼 수 있다.
 평균 발현률 및 그의 분포의 형상 둘 다가 상이한 구축물에 대해 꽤 유사한 것으로 밝혀졌다.
  VII. 실시예 6 : mRNA 반감기
 우리는 수학식 2에 따라 피팅된 mRNA-분해율 δ를 mRNA 반감기로 전환시켰다
  (수학식 2)
  4B는  A549  및  Huh7  세포  각각에서  상이하게  안정화된  mRNA  구축물의  반감기  분포를  나타낸다.    여기에서,  안정화된  구축물에  대하여,  평균  반감기  및  근본적인  분포의  광대함이  참조  구축물과  비교하여  증가한다는  것이  명백해졌다.
 모든 결정된 반감기의 개요는 4D에  제시하였다.    A549  및  Huh7  세포  둘  다에  대해,  우리는  어떠한  안정화  UTR도  함유하지  않는  대조군  구축물과  비교하여  UTR  요소에  의해  안정화된  mRNA에  대해  더  긴  반감기를  밝혀냈다  (A549  세포의  경우  5.8시간  및  Huh7  세포의  경우  7.8시간).    수명  연장  효과는  A549  세포에서  더  두드러졌다.
  VIII. 실시예 7 : 단백질 반감기
 단백질 (d2EGFP) 분해 수명의 분포는 4C에  제시하였다.    예상대로,  발현된  단백질의  반감기는  상이한  mRNA  구축물에  따라  다르지  않다.    결정된  평균  수명은   도 4D에  나타낸  바와  같이  A549  세포에  대해서는  4.2  내지  4.9  시간이고,  Huh7  세포에  대해서는  5.6  내지  8.5  시간이다.    변이  계수는  약  0.29  (A549)  및  0.45  (Huh7)이므로,  mRNA  수명에  대한  분포에서  우리가  밝혀낸  0.6까지의  변이  계수보다  상당히  작다.    대조군으로서,  형질감염  후,  주어진  시점,  t0에서  시클로헥스이미드를  첨가함으로써  번역이  억제되는  대안적  접근법으로  반감기가  또한  측정되었다  ( 도 10  참조).    이  경우에,  단백질  발현이  잠시  동안  유도된  다음에  정지된다.    억제  후  형광에서  지수적  붕괴로  단백질  수명을  산출한다.    이들  반감기는  억제가  없는  상기  실험과  비교하여,  약  2배로  더  작은  것으로  밝혀졌다.    그러나,  두  실험에서,  A549  세포에서와  비교하여  Huh7  세포에서의  단백질  수명의  상대적인  비율은  동일하다.
  리포터 단백질의 분해율
 피팅된  d2EGFP  분해율을  점검하기  위해,  A549  및  Huh7  세포  내의  d2EGFP의  분해율을  미세구조화된  6-채널  슬라이드에서  독립적으로  측정하였다.    단백질  합성을  펩티딜  트랜스퍼라제  활성에  지장을  주는  항생제  시클로헥스이미드에  의해  차단하였다  (42).    단세포  형광  강도  시간  과정은  대략  20시간  동안  모니터되었다  ( 도 10 참조).    제어  실험은  형광  강도의  감소가  발색단의  광퇴색으로  인한  것이  아니라는  것을  보장하였다.    단세포  시간  과정은  단일  지수적  피트에  의해  피팅되어,  단백질  분해율의  분포를  산출하였다.    평균  분해율은  2.46 h  및  4.04 h  각각의  단백질  수명에  상응하는,  A549  세포에서  0.28/h  (std  0.08/h)  및  Huh7  세포에서  0.17/h  (std  0.08/h)인  것으로  밝혀졌다.    이들  수명은  mRNA  매개  단백질  발현의  단세포  시간  과정  분석에  의해  결정된  바와  같은  수명보다  상당히  짧긴  하지만,  Huh7  및  A549  세포  내의  d2EGFP의  평균  수명  사이의  비는  동일하다  (mRNA  발현을  위한  분석  용액을  피팅함으로써  결정된  바와  같은  7.4 h/4.5 h=1.64와  비교하여  번역  차단에  의해  측정된  바와  같은  4.04 h/2.46 h=1.64).
  IX. 실시예 8 : 단백질 발현의 마스터곡선
 mRNA 유도 단백질 발현의 특징은 도 5A (A549) 및 B (Huh7)에 도시된 바와 같이 단백질 발현의 소위 마스터곡선에서 명백해졌다.
 마스터곡선은  발병  시간을  보정한  단세포  추적(trace)의  모집단  평균이며,  즉  모든  발병  시간을  시점  0으로  이동시켰다.    형광  강도를  참고문헌  (26)에서  이전에  기재된  바와  같이  d2EGFP의  실제  수로  변환시켰다.    3'  및  5'+3'-안정화된  mRNA  구축물의  우수한  특성은  마스터곡선  플롯에  도시되어  있다.    이들  구축물은  시간이  지남에  따라  단백질  발현의  가장  피상적인  감소  및  그러므로  가장  긴  반감기와  더불어,  다른  구축물과  비교하여  더  높은  단백질  발현  값을  나타냈다.  
  X. 실시예 9 : 곡선하 면적 ( AUC )
 약물동태학에서,  약물의  총  노출은  "곡선하  면적"으로  공지되어  있다.    유전자  요법에서의  유사  발현은  인위적으로  발현된  단백질의  양을  시간의  경과에  따라  적분한  값,  즉  (발현-대-시간)  곡선하  면적  (AUC)이다.    AUC는  번역상  효율과  mRNA  구축물의  안정성을  동시에  정량화하는  수단이다.    이것은  mRNA  상에  코딩되는  단백질의  누적  시간-용량으로  해석될  수  있으므로,  선택된  mRNA  구축물의  효능을  기재한다.    생화학적  속도(biochemical  rate)  모델  ( 도 3A 참조)을 고려해 볼 때, AUC는 명시적으로 계산될 수 있다:
  (수학식 3)
 그러므로 최적의 치료용 mRNA 구축물은 바람직하게는 긴 mRNA, τmRNA 뿐만 아니라, 단백질 반감기, τd2EGFP  및  높은  번역상  효율,  kTL을  가져야  한다.    게다가,  치료용  mRNA의  초기  양,  m0을  결정하는  전달  효율(transfer  efficiency)은  AUC에  직접적으로  비례한다.    단백질  발현의  이론적  시간  과정  및  계산된  AUC에  대한  실례가  되는  설명은   도 6A에서 볼 수 있다.
 단백질  분해가  없다면  (β  =  0),  세포  내  단백질의  양은  mRNA  번역  및  mRNA  분해의  균형  잡힌  플럭스(flux)의  결과로서  정상  상태(steady  state)  수준에  이를  것이다.    이  경우에,  발현  역학은   에  따른다.    δ가  0과  같은  경우에  대해서도  유사한  방식으로  마찬가지일  것이다.    이것을  d2EGFP  단백질의  영구적이고  지수적  붕괴  ( 에 따름)로 중첩하면 도 6A에  나타낸  바와  같이  AUC의  특징적인  형상을  결과한다.     6B 및 C는  전체  평균  상대  AUC뿐만  아니라  대조군의  평균  AUC로  정규화된  "실험당"  상대  AUC를  나타내며,  후자는  대조군  구축물로  형질감염  후  단백질  발현의  AUC이다.    두  세포  유형  모두에서,  가장  높은  상대  AUC가  3'UTR-  및  5'+3'UTR-안정화된  구축물에서  밝혀졌다.    이것은  이들  구축물에  대해  관찰된  긴  반감기와  일치하는데,  그  이유는  이들이  수학식  3에서  보이는  바와  같이  AUC에  기여하기  때문이다.    세부적인  단세포  AUC  분포는   11에서 찾을 수 있다.
 보다 구체적으로, 도 3C에 따른 번역 및 분해에 대한 생화학적 속도의 수학식 (4) 및 (5)를 가정하면, mRNA 형질감염후의 발현된 단백질의 양은 수학식 1에 의해 주어진다.
  (수학식 1)
 곡선하 면적 (AUC)은 발현이 장시간 (t → ∞)으로 설정될 때 발현 수준 G d2EGFP(t)을 t0으로부터 적분하여 계산된다:
 
 여기서 이다.
  을 사용하여, 수학식 3을 얻는다:
 
 G d2EGFP(t) 및 AUC의 시간 과정은 도 6A에 개략적으로 도시하였다.
 실험적 단세포 AUC 분포는 도 11에서  볼  수  있다.    AUC가  mRNA  및  단백질  수명으로부터  선형적으로  의존하기  때문에,  단세포  AUC  분포는  본문의   4B4C에 나타낸 mRNA 및 단백질 반감기 분포와 밀접하게 관련되어 있다.
  XI. 실시예 10 : 수명-연장 인자
 A549 및 Huh7 세포에 대한 수명-연장 인자는 도 6D 및 E에  각각  나타냈다.    예상대로,  모든  안정화된  구축물은  하나보다  높은  수명-연장  인자를  산출하는데,  이는  양쪽  말단에  UTR의  삽입이  mRNA  안정화를  유발한다는  것을  의미한다.    그러나,  3'UTR  mRNA  구축물은  2x3'UTR  구축물보다  더  긴  mRNA  수명을  나타낸다.    유사하게,  5'+3'UTR  구축물은  5'+  2x3'  구축물보다  더  안정적이다.    이들  결과는  두  세포  유형  모두에  유효하다.    흥미롭게도,  안정화  효과는  모든  경우에  Huh7  세포에서보다  A549  세포에서  상당히  더  두드러진다.
  XI. 실시예 11 : CYBA - UTR 구축물과 비교하여 상이한 유전자의 UTR을 갖는 구축물의 비교
 하기 표 4에  명시된  바와  같이  상이한  유전자의  UTR을  갖는  구축물  #2  내지  #5를  안정성  및  생산성  면에서  mRNA  구축물을  최적화하기  위하여  CYBA-UTR  구축물  #1과  비교하였다.    유전자의  5가지  상이한  세포  UTR은  긴  mRNA  반감기를  특징으로하는  출판물  데이터  (Hoen  et  al.,  2010)에  기초하여  선택되었다.    이들  세포  UTR은  CYBA,  DECR1,  GMFG,  MAPBPIP  및  MYL6B이다.    각각의  세포  유전자의  5'  및  3'  비번역  영역의  서열은  UTR  데이터베이스  (http://utrdb.ba.itb.cnr.it/search)로부터  얻었으며,  이는  5'UTR  단독,  3'UTR  단독,  5'+3'UTR,  5'+2x3'UTR  및  2x3'UTR인,  5가지  상이한  조합으로  클로닝되었다.
 첫째로,  비번역  영역  서열이  백본  pVAX1-A120에  클로닝되었다.    5'UTR의  경우에,  5'말단  상의  HindIII  제한  부위와  3'말단  상의  BamHI  제한  부위를  통해  클로닝이  일어났으며,  메트리디아  루시퍼라제(Metridia  luciferase)를  코딩하는  리포터  유전자의  상류에  삽입되었다.    3'UTR에  대한  제한  부위는  EcoRI  (5'말단)  및  PstI  (3'말단)이고  MetLuc의  하류에서  클로닝되었다.    각각의  세포  UTR에  대해  5'  UTR  단독  및  5'+3'UTR을  함유하는  플라스미드를  유로핀즈  MWG  오페론(Operon)에  의해  제조하였다.    이들  플라스미드는  전기  천공법을  통해  이.  콜라이( E. coli)  박테리아  (DH10B)로  형질전환되었다.    3'UTR  단독,  5'+2x3'UTR  및  2x3'  UTR을  함유하는  다른  조합이  자체에서  클로닝되었다.    3'UTR을  가진  플라스미드의  클로닝은  단순히  HindIII  (블런트(blunt))  및  BamHI  (블런트)  소화를  통해  백본의  5'UTR을  커팅해  냄으로써  수행되었다.    5'UTR+2x3'UTR을  함유하는  구축물은  5'+3'UTR을  포함하는  pVAX1-A120  MetLuc의  백본에  3'UTR  (BamHI/PstI  블런트)을  함유하는  MetLuc를  삽입함으로써,  MetLuc를  대체하고  백본의  각각의  3'UTR  앞에  제2의  3'UTR을  삽입함으로써  클로닝되었다.    마지막으로,  2x3'UTR을  함유하는  구축물은  5'+2x3'UTR을  함유하는  플라스미드로부터  5'UTR  (HindIII  및  BamHI,  둘  다  블런트)을  제거함으로써  생성되었다.    클로닝  후,  모든  플라스미드는  전기  천공법  후에  이.  콜라이  박테리아  (DH10B)에서  증폭되었다.
 두  번째로,  화학적으로  변형된  mRNA를  시험관내  전사에  의해  생성시켰다.    그  목적을  위해,  플라스미드를  XbaI  소화로  선형화시키고  클로로포름/에탄올  침전에  의해  정제하였다.    시험관내  전사  키트  (프로메가)는  필요한  T7  폴리머라제  효소  믹스뿐만  아니라  적합한  완충제를  포함하였다.    전사는  또한  비변형된  뉴클레오티드  아데노신-트리포스페이트  (ATP),  구아노신-트리포스페이트  (GTP),  우리딘-트리포스페이트  (UTP)  및  시토신-트리포스페이트  (CTP)뿐만  아니라  화학적으로  변형된  뉴클레오티드  메틸-CTP  및  티오-UTP  (예나  바이오사이언스,  게엠베하,  예나,  독일)를  7.13  mM:1.14  mM:5.36  mM:5.36  mM:0.536  mM:0.536  mM의  ATP:GTP:UTP:CTP:메틸-CTP:티오-UTP의  최종  농도로  함유하였다.    게다가,  캡  구조  유사체  ARCA  (항-역전  캡  유사체)를  믹스에  첨가하여  오른  방향으로  5'-캡의  혼입을  보장하였다.    마지막으로,  선형화된  DNA를  반응  믹스에  첨가하였다.    IVT  믹스를  37℃에서  2시간  동안  인큐베이션하였다.    나머지  DNA의  소화는  DNase  I의  첨가  및  37℃에서  또  다른  20분  동안의  추가  인큐베이션에  의해  가능해졌다.    최종  농도  2.5  M으로  미리  냉각된  암모늄-아세테이트를  첨가함으로써  RNA  침전을  수행하였다.    RNA  펠렛을  70%  에탄올로  세척하였다.    세척  단계를  2회  수행하였다.    마지막으로,  상기  RNA를  RNAse-비함유  물에  재현탁시켰다.    분광  광도계로  RNA  농도를  결정하고  순도를  아가로스  겔에서  시험하였다.  
 IVT  후,  상이한  mRNA는  두가지  상이한  세포주,  즉,  NIH3T3  및  A549에서  시험하였다.    스크리닝  실험을  위해,  리포펙션과  같은  비-바이러스성  핵산  전달  시스템이  사용되었다.    첫  번째  형질감염  실험에서,  상이한  형질감염제를  시험하여  단백질  발현  및  세포  생존률을  비교하였다  (데이터는  나타내지  않음).    다음으로,  용량  적정을  포함한  스크리닝  실험을  수행하여  용량  의존  효과를  평가하였다.    실험  설정은  다음과  같다:  150  μl  DMEM  완전  배지  중  5000개  세포  (NIH3T3)를  96-웰  플레이트에  웰당  시딩하고  시딩  후  24시간  형질감염시켰다.    시판  형질감염  시약  드림펙트  골드(Dreamfect  Gold)  (DFG)를  사용하여  500  ng/웰  (100  pg  mRNA/세포)의  출발  용량으로  세포를  형질감염시켰다.    복합체를  1  μg  mRNA  당  4  μl  드림펙트  골드의  비로  제조하였다.    리포플렉스의  형성을  위해,  mRNA  (3.6  μg)를  각각의  mRNA에  대해  340  μl의  전체  부피로  보충물  없이  DMEM에서  개별적으로  희석하였다.    96  웰  플레이트에서  각각의  mRNA  희석을  위해  준비된  하나의  웰에서  14.4  μl  DFG를  5.6  μl  물과  혼합하였다.    복합체  형성은  mRNA  희석액을  DFG에  첨가하고  위  아래로  피펫팅에  의해  혼합했을  때  일어났다.    혼합물을  20분  동안  실온에서  인큐베이션하였다.    한편,  희석  시리즈가  준비되었다.    복합체  믹스  아래에  있는  나머지  7개의  웰에서,  웰당  보충물이  없는  180  μl  DMEM을  첨가하였다.    인큐베이션  시간  후에  180  μl의  복합체  용액을  제거하고  희석  시리즈의  첫  번째  웰에  첨가하였다.    이  절차는  마지막  희석  단계까지  수행되었다.    마지막으로,  50  μl의  복합체  용액을  세포에  첨가하고  4시간  동안  인큐베이션하였다.    모든  mRNA  구축물에  대해,  생물학적  삼중물을  제조하였다.    4시간  후,  완전  상청액을  측정용  세포  배양  플레이트로부터  제거하고  새로운  150  μl  배지를  각각의  웰에  첨가하였다.    다중라벨  플레이트  판독기를  사용하여  4,  24,  48,  72,  96,  120  및  144  시간  후에  생체  발광을  측정하였다.    여기에  50  μl의  상청액을  20  μl의  코엘렌테라진과  혼합하여  생성된  빛을  측정하였다.    마지막으로  시간  경과에  따른  단백질  양이  관찰되었고  곡선하  면적  (AUC)으로  도시하였다.
 결과는 도 12에 나타냈다.
 
  <표 4>
 구축물 #1 내지 #5의 요약.
  XIII. 논고
 mRNA  안정성  및  그의  발현의  결정은  새로운  mRNA  요법  개발에  관해  고려해야  할  두  가지  중요한  인자이다.    여기에서,  상이한  조합의  UTR,  5'  UTR,  3'UTR,  5'+3'  UTR,  5'+2x3'  UTR,  및  두  개의  카피의  3'  UTR을  사용하여  안정성  및  그의  발현의  면에서  mRNA를  개선하였다.    d2EGFP  시간  과정의  AUC는  총  단백질  발현이  지속  치료  효과와  관련되기  때문에  또한  평가된다.    단세포  수준에서  상세한  시간-분해된(time-resolved)  데이터를  얻고  단백질  발현  역학을  모니터링하기  위해,  mRNA  안정성  및  번역상  효율의  평행,  정량  측정을  위한  미세구조화된  단세포  어레이를  사용하였다.    세포의  규칙적인  배열은  재현가능한  미세  환경을  보장하였으며  비교가  가능한  대량신속처리(high-throughput)의  단세포  연구의  전제  조건인  신속하고  자동화된  영상-분석을  가능하게  하였다.    이  접근법은  (i)  단백질  반감기,  (ii)  발현률,  및  (iii)  기능적  mRNA  반감기에  대한  분포  함수의  결정을  가능하게  한다.
 A549  및  Huh7  세포  둘  다에서,  d2EGFP의  평균  단백질  반감기는  UTR  서열과    독립적으로  좁게  분포되어  있었다.    A549  세포의  경우  4.5시간  및  Huh7  세포의  경우  7.4시간의  계산된  반감기  값은  비교된  세포주  사이의  세포  유형  특이적  차이에  기인할  수  있을  것이다.    d2EGFP  반감기의  이러한  세포  특이적  차이는  이전에  발표되어  있다.    유사한  영상화  세포측정  접근법을  사용한  NIH3T3  세포에서의  연구는,  12시간의  측정  기간(measurement  window)  이내에  2.8시간의  반감기를  기록하였다  (33).    CHO  세포에  대해  2시간  미만의  훨씬  더  짧은  반감기가  리(Li)  등에  의해  보고되었다  (34).    여기에서,  단백질  분해는  단지  3시간  동안의  유동  세포측정법  및  웨스턴  블롯팅에  의해  측정하였다.  
 단세포 데이터 분석으로부터의 우리의 조사 결과를 검증하기 위해, 시클로헥스이미드를 사용하여 직접 측정한 d2EGFP 수명을 추가로 결정하였다 ( 도 10 참조).    단세포  데이터  분석으로부터  관찰된  값과  비교하여  더  짧은  수명이  밝혀졌다.    이는  단세포  데이터  분석에서  일정한  초기  수의  mRNA  분자가,  조합된  발현률   의 부분으로서 가정되었다는 사실로 인한 것일 수 있다 ( 수학식 1 참조).    그러나,  1시간    인큐베이션  시간  후에  세포를  세척하였음에도  불구하고,  mRNA  분자의  수는  관찰의  시작부터  일정하지  않을  가능성이  여전히  있다.    결과적으로,  단백질  발현을  야기하는,  번역을  위해  나중에  이용가능한  mRNA  분자는  단세포  발현의  시간  과정  피팅으로부터  더  긴  반감기  값을  결과할  수  있다.    Huh7  세포에  대해  결정된  평균  반감기가  A549  세포에  대해  결정된  평균  반감기와  비교될  때,  두  측정  방법의  경우  대략  1.64의  동일한  비가  밝혀졌다.    또한,  mRNA와  단백질  반감기에  대한  가능한  체계적인  과대  평가조차도  mRNA  성능의  질적인  순서를  변화시키지  않는다.
 발현률은  mRNA  분자의  초기  수,  m0,  뿐만  아니라  번역률  KTL에  따라  달라진다.    성공적으로  전달된  mRNA  분자의  수는  전달  과정의  본질적인  확률  성  (stochasticity)으로  인해  다양하다는  점을  주목해야  한다.    그러나,  mRNA  분자의  평균  수는  형질감염  프로토콜이  모든  실험에서  용의주도하게  유지되어  왔기  때문에  동일할  것으로  예상된다.    그에  반해서,  다양한  UTR  구축물의  번역  활성  (KTL)은  다양할  수  있다.    그럼에도  불구하고,  발현률  K의  분포뿐만  아니라  평균값이  모든  구축물에  대해  다소  유사하다는  사실  ( 도 3A 및 도 3D 참조)은 번역률이 삽입된 UTR에 의해 단지 영향을 받는다는 것을 나타낸다.
 최고  관심  매개  변수는  mRNA  반감기이다.    여기에서  기능적  mRNA  반감기가  물리적  mRNA  반감기와  비교되었다.    단세포  형질감염  연구의  결과는  5'  또는  3'  UTR의  mRNA  서열에의  임의의  삽입은  그의  기능적  mRNA  반감기를  증가시킨다는  것을  시사한다.    이  연구에서  시험된  모든  변형은  연장된  mRNA  반감기를  야기하여  ( 2 및 도 3 참조), 형광 현미경 영상화 및 FC ( 도 1  참조)에  의해  측정된  바와  같이  발현을  연장시켰다.    기능적  mRNA  반감기와  대조적으로,  qRT-PCR에  의해  결정된  물리적  mRNA  반감기는  두  세포주  모두에서  5',  3',  5'+2x3'  및  2x3'  UTR에  대한  mRNA  안정성에서  감소를  나타냈다  ( 도 8A 및 B  참조).    하나의  주요  차이는  두  방법  모두에서  모든  측정된  mRNA에  대한  번역  능력이다.    기능적  mRNA  반감기를  측정하는  경우에,  mRNA는  적극적인  번역에  관여하며,  한편  물리적  mRNA  반감기는  검출된  mRNA의  번역  상태에  관계없이  모니터링된다.    유사한  조사  결과들이  갈리(Gallie)  등  (35)에  의해  보고되었다.    물리적  mRNA  반감기는  mRNA의  번역  능력의  적절한  지표가  아니라고  여겨진다.    mRNA에  대한  번역  능력은  그의  기능적  반감기  (발현의  수명)와  생성된  총  단백질의  양  (곡선하  면적)으로부터  판단될  수  있다.    치료용  mRNA의  경우,  분자가  가능한  한  오랫동안  기능적이며  최대의  가능한  단백질을  생성시키는  것이  필수적이다.    이것은  기능적  mRNA  반감기  및  생성된  단백질의  총량  둘  다가  mRNA  치료제를  확인하고,  비교하고,  시험하는  더  양호한  척도라는  결론을  이끌어낸다.    더욱이,  반감기의  불균일  분포는  앙상블  측정에서,  이들  영향이  불분명하기  때문에  단세포  측정  기술의  중요성을  지적한다  ( 도 2, 4, 및 8A 및 B).
 흥미롭게도,  비록  지금까지  CYB5  'UTR에서의  어떠한  공지된  모티프도  발견되지  않았지만,  5'  UTR  단독에  대해  단백질  발현에  대한  긍정적인  효과가  관찰되었다.    처음으로,  양쪽  말단에서  CYBA  UTR이  두  세포주  모두에서  단백질  발현의  피크  및  지속성  둘  다를  증가시키는  데  충분한  것으로  나타났다.    이들  조사  결과들은  5'  UTR  및  3'  UTR의  개별적  또는  상승작용적  거동을  주장하는  출판물과  일치한다  (14).    홀트캠프(Holtkamp)  등  (16)과  대조적으로,  하나의  단일  3'  UTR과  비교하여  두  개의  순차적  카피의  3'UTR로  단백질  발현  또는  mRNA  안정성의  어떠한  추가적  증가도  관찰될  수  없었다  ( 도 4 참조).    반대로,  이는  심지어  5'+3'  대  5'+2x3'  UTR  삽입  및  3'  대  2x3'  UTR  삽입  둘  다에  대한  더  짧은  수명을  결과하였다.    이것은  홀트캠프  등  (16)에  의한  연구에서  상이한  유형의  세포  (즉,  수지상  세포)가  사용되었다는  사실로  인한  것일  수  있다.    유사한  세포  유형  특이적  효과가  간세포에서도  보고되었다  (39).    mRNA  안정성과  그의  번역  효율  둘  다에  영향을  미치는  또  다른  기여  인자는  상이한  mRNA의  이차  구조일  수  있다.    유전자  발현  조절에  있어서  mRNA  이차  구조의  이러한  효과는  이전에  보고된  바  있다  (36,37).
 현재 연구에서 사용된 mRNA 구축물에 대한 그의 최소 자유 에너지와 함께 중요한 구조적 특성을 표 3에 요약하였다.
   5'  +  3'UTR  안정화된  구축물의  지속적인  단백질  발현은  mRNA의  원형화(circularization)를  촉진하는  5'의  3'  말단으로의  결합으로  인한  것일  수  있다  (19).    5  'UTR  내에  어떠한  안정적인  이차  구조가  발견될  수  없기  때문에,  이  특징은  조기  발현  발생을  가능하게  하는  것으로  추정된다  (38).    그에  반해서,  3'  UTR  내에  이차  구조가  확인되었다.    이들은  3'-5'  분해  경로로부터  mRNA를  보호할  수  있다.    2개의  3'  UTR은  최상의  최소  자유  에너지를  지닌  훨씬  더  많은  이차  구조  (2개의  헤어핀)를  나타냈고,  이는  더  지속적인  발현을  나타내는  것이다.    종합하면,  이들  조사  결과들은  3'  UTR을  함유하는  mRNA  구축물의  추후  시점에서의  지속적인  발현  및  5'UTR과  비교하여  2x3  'UTR의  더  열등한  발현  발생에  대한  설명이  될  수  있다.
 단백질  반감기에  따라,  UTR로  안정화된  mRNA에  대해  더  긴  반감기  값이  얻어졌다.    이것은  절대  값에  영향을  미칠  가능성이  가장  높은  세포  특이적  차이가  있는  세포주  둘  다에서  관찰되었다.    A549  세포에서,  UTR을  가진  구축물의  mRNA  반감기는  대조군의  5.8시간과  비교하여  13.0시간  내지  23.0시간의  범위였다.    Huh7  세포에서는,  대조군  mRNA에  대한  7.8시간의  반감기와  대조적으로,  9.9시간  내지  13.6시간의  반감기가  UTR-함유  구축물에  대해  측정되었다.    A549  세포에서  3'UTR-안정화된  mRNA의  반감기는  이전에  보고된  유사하게  안정화된  mRNA의  mRNA  수명과  잘  일치한다  (16,26).    단백질  및  mRNA의  붕괴  동역학  및  안정성이  상이한  세포  유형에  있어서  상이하다는  사실은  세포  유형  의존성일  가능성이  높은  단백질과  mRNA  사이의  상호  작용의  복잡한  네트워크에서의  차이로  인한  것일  가능성이  가장  높다.  
 종합하면,  분석법  (FC  또는  단세포  분석)과  관계없이  A549  및  Huh7  세포  둘  다에서의  우리의  결과는  CYBA  UTR  안정화된  mRNA에  의해  지속적이고  높은  수준의  단백질  발현이  유도될  수  있음을  시사한다.    UTR  조합의  선택은  적용의  실험의  필요에    따라  달라진다.    감소된  mRNA  붕괴를  가진  지속적인  단백질  발현이  요구되는  경우,  3'  UTR  단독으로  안정화된  mRNA가  목적을  충족시킬  수  있다.    그러나,  5'+3'  UTR의  조합은  조기  발병,  높은  피크  및  누적  단백질  발현의  추가적인  바람직한  특징을  결과한다.  
 여기에서  mRNA-유도  단백질  발현의  단세포  분석은  mRNA  구축물의  약물동태학적  특성을  특성화하고  개선시키는  수단임이  입증된다.    이  접근법을  사용하여,  상이한  mRNA  구축물의  세포내  생체이용률을  체계적으로  평가하여  지속적인  단백질  발현을  초래하는  서열을  확인하는  것이  가능하다.    두  가지  세포  유형에서  FC  분석  및  단세포  모델을  사용하는  UTR  삽입에  의해  안정화된  구축물에  대해  단백질  발현의  지속성이  연장된  것으로  밝혀졌다.    이  조사  결과는  mRNA  치료제  개발의  경우에  바람직하다.    일정  기간  (AUC)에  걸쳐  지속적인  단백질  발현을  가진  전령  RNA  구축물이  바람직하며,  최종  치료  결과와  함께  환자에게  적절한  감소된  투여를  가능하게  한다.
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