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1. KR1019930701481 - 리포폴리사카라이드에 대해 친화성을 갖는 신규 폴리펩티드 및 그의 용도

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[ KO ]
명 세 서
[발명의 명칭]
리포폴리사카라이드에 대해 친화성을 갖는 신규 폴리펩티드 및 그의 용도
[발명의 분야]
본 발명은 리포폴리사카라이드, 특히 엔도톡신에 대해 강한 친화성을 나타내는 신규 폴리펩티드(들) 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염에 관한 것이다. 이 폴리펩티드는 제약학적 조생물내의 항-균 또는 항-비루스제(예를들면, HIV제)로서 사용될 수있다.
[발명의 배경]
두개 과(family)의 항균 폴리펩티드가 참게로부터 분리되었다(예를들면, Shigenaga, 1990. J. Biol. Chem. 265 : 21350∼21354; Kawano 등, 1990, J. Biol. Chem. 265 : 15365∼15367; Muta 등, 1990, J. Biochem. 108 : 261∼266; 일본국 특개평 제167230/1990호; 일본국 특개편 제152987/1990호; 일본국 특개평 제53799/1990호; Published searched Application 500194/1990호; Miyata 등, 1989, J. Biochem. 106 : 663∼668; Akaji 등, 1989, Chem. Pharm. Bull. 37 : 2661∼2664; Tai놈 (Metabolism) 26 : 301∼311 (1989); Shieh 등, 1989, FEBS Lett. 252 : 121∼124; 및 Nakamura 등, 1988, J. Biol. Chem. 263 : 16709∼16713 참조). 그중 한 개 과인 태치플레신(tachyplesin)계는 일본 참게, 태치플레우스(Tachpleus)로부터 분리되었다.
세 개의 태치플레신, I, II 및 III이 확인되었으며; 그들의 아미노산 배열을 제1도에 나타낸다. 또한, 글리신-리신으로 카르복실 말단이 연장된 태치플레신 펩티드 유도체가 동남아시아 참게 종, 칼시노스코르피우스 로툰디카우다(Carcinoscorpius rotundicauda)에서 발견되었다(Muta 등, 1990, J. Biochem. 108: 261∼266). 두 번째 과인, 폴리페뮤신과가 미국 참게, 리물러스 폴리페뮤스(Limulus polyphemus)의 혈구로부터 분리되었다. 두 개의 폴리페뮤신, I 및 II가 확인되었으며; 그들의 아미노산 배열을 제1도에 나타낸다. 두 개 과 모두의 폴리펩티드는 17 또는 18개의 아미노산 잔기로 구성되고 통상적으로 4개의 보존 영역과 두 개의 디술피드 다리를 갖는다(제1도 참조). 태치플레신과 폴리페뮤신 모두는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)와 같은 진균뿐만이 아니라 저 농도에서 그램-음성 및-양성 세균의 성장을 저해하며 세균성 리포폴리사카라이드와 복합체를 형성하는 것으로 발견되었다(Shigenaga 등, 1990, J. Biol. Chem. 265 : 21350∼21354 및 Muta 등, 1990, J. Biochem. 108 : 261∼266).
또한, 태치플레신과의 폴리펩티드는 인플루엔자 바이러스, 수포성 구내염 바이러스(Murakami 등, 1991, Chemotherapy, 37, 327∼334) 또는 인간 면역 결핍 바이러스(Moritomo 등, 1991, Chemotherapy, 37, 206∼211)과 같은 바이러스에 대하여 약간의 저해활성을 나타내는 것으로 발견되었다.
[발명의 개요]
본 발명은 참게의 엔도톡신 고친화성 폴리펩티드, 특히, 태치플레신 및 폴리페뮤신으로부터 유도되고 이들과 어느 정도의 유사성을 가지나, 현저한 차이점을 갖는 신규 폴리펩티드(들)에 관한 것이다. 참게 폴리펩티드에 있어서, 태치플레신의 6-위치의 아미노산 또는 폴리페뮤신의 7-위치의 아미노산은 발린(Val), 즉 중성 지방족 아미노산이다. 본 발명의 폴리펩티드(들)에서, 6-위치의 아미노산 잔기는 리신(Lys) 또는 아르기닌(Arg) 잔기이고; 이들은 발린 잔기와는 실질적으로 다른 특성을 갖는 염기성 아미노산 잔기이다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드내 11-위치의 아미노산 잔기는 티로신(Tyr), 페닐 알리닌(Phe) 또는 트립토판(Trp)인데, 즉 태치플레신의 11-위치의 이소로이신(Ile)와는 다른 특성을 갖는 방향족 아미노산 잔기이다.
본 발명의 신규 폴리펩티드는 항-HIV제로서 사용될 수 있다. 하기 섹션 6에서 상세히 설명되는 바와같이 본 발명의 폴리펩티드(들)는 참게의 공지된 엔도톡신 고친화성 폴리펩티드에 비하여 현저하게 높은 항-HIV 활성치를 갖는다.
[정의]
여기에서 정의되는 펩티드 배열은 하기와 같은 아미노산 잔기에 대한 세글자 약자로 표시된다 :
Ala(알라닌); Arg(아르기닌); Cys(시스테인); Gly(글리신); Ile(이소로이신); Leu(로이신); Lys(리신); Phe(페닐알라닌); Trp(트립토판); Tyr(티로신); 및 Val(발린).
여기에서 사용되는 하기 용어는 지시된 바와 같은 의미를 나타낼 것이다.
HIV = 인간 면역결핍 바이러스 (모두 변이체)
MOI = 감염의 다중도
SI = 선택성 지수 (EC 50에 대한 CC 50의 비율)
[도면의 간단한 설명]
제1도는 태치플레신 I, 태치플레신 II, 태치플레신 III, 폴리페뮤신 I, 및 폴리페뮤신 II의 아미노산 배열을 나타낸다. 보존 아미노산은 박스안에 있는 것이다. Cys-3 또는 -4와 Cys-16 또는 -17사이의 그리고 Cys-7 또는 -8과 -12사이의 디술피드 결합을 솔리드 라인으로 나타낸다.
제2도는 본 발명의 폴리펩티드(1)를 합성하기 위한 합성도를 나타낸다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 하기 구조식(I)의 신규 폴리펩티드 또는 그의 염에 관한 것이다.
서열 1
[상기 식에서, A 1은 수소 또는 리신 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의, 그리고 2개 이하의 아미노산이고, A 2는 티로신, 페닐알라닌 또는 트립토판 잔기이고, A 3는 아르기닌 또는 리신 잔기이고, A 4는 리신 및 아르기닌을 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의, 그리고 2개 이하의 아미노산이고, A 5는 -OH (카르복실기로부터 유도된) 또는 -NH 2 (산 아미드기로부터 유도된)이고, Cys는 시스테인 잔기이고, Gly는 글리신 잔기이다.]
특정 구현예어서, 3- 및 16-위치의 시스테인 잔기 및/ 또는 7- 및 12-위치의 시스테인 잔기는 디술피드 결합(-S-S)을 통하여 결합될 수 있다.
구조식(I)로 표시되는 본 발명의 폴리펩티드의 특정예를 표 1에 나타내고 (1) 내지 (33)으로 번호를 매긴다. 각각의 부호는 국제적으로 공인된 세글자 표현에 의해 상응하는 아미노산 잔기를 나타낸다.(상기 섹션 3.1. 참조).
표 1
표 1a
당 분야에 공지된 참게로부터 분리된 엔도톡신 고친화성 폴리펩티드와 유사하게, 본 발명의 폴리펩티드는 분자간 수소결합 및 3-, 7-, 12- 및 16-위치의 4개의 시스테인 잔기의 존재로 인하여 비평행 베타-쉬트 구조(antiparallel beta-sheet structure)를 갖는다. 아마도 베타-턴(beta-trun)구조의 터닝 위치(turning position)는 9- 및 10-위치에 존재한다. 3-위치 내지 8-위치의 펩티드 부분과 11-위치 내지 16-위치의 펩티드 부분은 서로 대면한다.
그러나, 참게로부터 분리된 공지 폴리펩티드와는 대조적으로, 본 발명의 폴리펩티드(들)는 보다 염기성이다. 특히, 6-위치의 아미노산 잔기는 아르기닌(Arg) 또는 리신(Lys) 잔기이다. 참게로부터 분리된 폴리펩티드내 6-위치의 아미노산 잔기는 발린 잔기이다.
염기성인 특성으로 인하여, 본 발명의 폴리펩티드(들)는 산 첨가에 의해 염을 형성할 수 있다. 예를들면, 폴리펩티드는 무기산 (염산, 브롬화수소산, 인산, 질산, 황산 등), 또는 유기 카르복실산 (아세트산, 트리플루오로아세트산과 같은 할로 아세트산, 프로피온산, 말레산, 숙신산, 말산, 시트르산, 타르타르산, 살리실산 및 글루쿠론산 또는 히알루론산과 같은 우론산 등) 또는 콘드로이틴 술페이트와 같은 술폰산을 포함하는 유기 술폰산(메탄술폰산, p-톨루엔술폰산 등)과 염을 형성할 수 있다.
[폴리펩티드의 제조]
본 발명의 신규 폴리펩티드는 당분야 공지 방법, 예를들면 Solid-Phase Peptide Synthesis, Stewart Young, Pierce Chemical company, Rockford, Illinois(1984)에 기재된 고체상 합성에 의해 제조될 수 있다. 즉, 상기 구조식(I)의 본 발명의 직쇄 폴리펩티드는 17-위치의 N-보호 아르기닌의 카르복실기를 직접 부착되거나 교대로 부착된 아미노기를 갖는 불용성 수지에 카르복실기에 결합될 수 있는 작용기를 갖는 스페이서(spacer)(예를들면, 아르기닌의 카르복실기를 p-카르복시벤질에스테르로 전환시킬 수 있는 것)를 통해 결합시킴으로써 수득될 수 있다. -아미노(Na)-보호기를 탈보호한 후에 17-위치에서 아르기닝(Arg) 잔기를 갖는 불용성 수지의 아미노기는 고체상 방법에 따라서 하기 구조식(I)의 아미노산 배열의 16-위치 내지 1-위치의 각각의 보호 아미노산과 연속적으로 연결될 수 있으며, 그후에 불용성 수지와 아미노산의 보호기를 제거한다.
[서열 1]
[상기 식에서, A 1, A 2, A 3, A 4, A 5, Cys 및 Gly는 상기 구조식(I)에서 정의한 바와 같다.]
이 경우에 있어서, 17-위치의 아미노산 잔기의 카르복실 말단은 유리 상태(A 5는 -OH에 상응한다)이거나 산 아미드 형태(A 5는 -NH 2에 상응한다)로 전환될 수 있다. 3- 및 16-위치와 7- 및 12-위치에서의 두 개의 시스테인은 공기산화에 의해 머캅토기를 통해 디술피드 결합(-S-S)을 형성할 수 있거나, 디술피드 결합은 Atherton, E. 등; J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1985, 2065의 방법에 따라서, 즉 3- 및 16-위치와 7- 및 12-위치의 시스테인기 쌍중 하나의 머캅토기를 보호기, t-Bus(t-부틸티오)로 선택적으로 보호하고, 나머지 시스테인쌍의 머캅토기를 보호기, Acm(아세트아미도메틸)로 보호한 다음; t-Bus를 제거하고, 부분적으로 머캅토기를 산화하고; Acm 보호기를 제거하는 단계를 당 분야 공지된 절차를 사용하여실행하는 단계를 통하여 형성될 수 있다.
아미노기를 갖는 불용성 수지는 그의 아미노기를 통해 C-말단의 N-보호 아르기닌 또는 리신의 카르복실기에 또는 특정 경우에는 그에 결합된 스페이서의 카르복실기에 연결된 다음에 제거될 수 있는 한 임의의 아미노기를 갖는 불용성 수지가 본 발명의 신규 폴리펩티드를 합성하는데 사용될 수 있다. 그러한 불용성 수지의 예는 아미노-메틸 수지(아미노메틸화 스티렌-디비닐벤젠 공중합체), 벤즈히드릴아민 수지, 메틸벤즈히드릴아민 수지 및 아미노메틸페녹시메틸 수지와 그의 유도체를 포함하나 이것으로 한정되는 것은 아니다. 벤즈히드릴아민 수지, 메틸벤즈히드릴아민 수지, 디메톡시벤즈히드릴아민(DMBHA) 수지 또는 아미노메틸페녹시메틸 수지가 사용될 때, 아미드가 분해에 의해 직접 수득되나, 아미노-메틸 수지가 수율면에서 바람직하다.
고체상 합성 방법에 사용될 수 있는 각각의 아미노산은 L형 또는 D-형일 수 있다. 보호 아미노산은 그의 작용기가 당분야에 공지된 방법을 사용하여 보호기를 보호될 수 있는 아미노산이거나, 상업적으로 구입가능한 다양한 보호 아미노산일 수 있다. 당분야 숙련인이라면 폴리펩티드 합성방법이 합성방법 도중에 아미노산의 측쇄가 화학적으로 변형되는 것을 막기 위해서 아미노산의 불안정화 측쇄를 안정화시키기 위한 보호기의 사용을 필요로 한다는 것을 인식할 것이다. 아미노산의 -아미노기에 대한 보호기는 Boc(t-부틸옥시카르보닐) 또는 Fmoc(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐)로부터 선택되는 기를 포함하나 이로 한정되는 것은 아니다. 아르기닌(Arg)의 구아니디노기에 대한 보호기는 Tos(토실), NO 2(니트로), Mtr(4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠-술포닐) 또는 Pmc(2,2,5,7,8-펜타메틸-크로판-6-술포닐)로부터 선택되는 기를 포함하나 이로 한정되는 것은 아니다. 시스테인(Cys)의 머캅토기에 대한 보호기는 Bz1(벤질), MBz1(4-메톡시벤질), 4-MeBzl(메틸벤질), Acm(아세트아미도메틸), Trt(트리틸), Npys(3-니트로-2-피리딘술페닐), t-Bu(t-부틸) 또는 t-Bus(t-부틸티오) 및 Mbzl로부터 선택되는 기를 포함하나 이로 한정되는 것은 아니며, 4-MeBzl, Trt, Acm 및 Npys가 바람직하다. 티로신(Tyr)의 히드록실기에 대한 보호기는 Bzl, Cl 2Bzl(2,6-디클로로벤질) 또는 t-Bu로부터 선택되는 기를 포함하나 이로 한정되는 것은 아니다. 리신(Lys)의 -아미노기에 대한 보호기는 Z(벤질옥시카르보닐), C1Z(2-클로로-벤질옥시카르보닐), Boc 또는 Npys로부터 선택되는 기이나, 이로 한정되는 것은 아니다.
보호 아미노산의 커플링은 당분야에 공지된 축합방법, 예를들면, DCC (디시클로헥실카르보디이미드) 방법, DIPCDI(디이소프로필카르보디이미드) 방법 [Tartar, A. 등, 1979, J. Org, Chem. 44 : 5000], 활성 에스테르 방법, 혼합 또는 대칭산 무수물 방법, 카르보닐디이미다졸 방법, DCC-HOBt (1-히드록시벤조트리아졸)방법 [Konig W. 등, 1970, Chem. Ber., 103 : 788, 2024, 2034] 또는 디페닐포스포릴 아지드 방법에 따라서 실행될 수 있으나, 바람직하게는 DCC 방법, DCC-HOBt 방법, DIPCDI-HOBt 방법 또는 대칭산 무수물 방법이 사용된다. 축합방법은 유기 용매, 예컨대 디클로로메탄 또는 디메틸포름아미드, 또는 그의 혼합 용매내에서 실행될 수 있다. 탈보호제, 예컨대 트리플루오로아세트산/디클로로메탄, HIC/디옥산, 피페리딘/디메틸포름아미드(DMF)가 -아미노기에 대한 보호기를 탈보호하기 위해 사용된다. 합성의 각 단계에서 축합반응의 진전 정도는 E.Kaiser 등의 방법 [Anal. Biochem., 34, 595(1970)](닌히드린 반응방법)에 의해 측정된다.
아미노메틸 수지 유도체가 불용성 수지로서 사용될 때, 보호 폴리펩티드는 수지로부터, 보호 펩티드 수지를 적절한 용매내에서 암모니아로 처리함으로써 제거될 수 있다. 생성 보호 펩티드를 불화 수소로 처리하여 상기 구조식으로 표시되고 보호기가 없는 폴리펩티드 아미드를 수득한다. 벤즈히드릴아민 수지, 메틸벤즈히드릴아민 수지, 아미노메틸페녹시메틸 수지 또는 DMBHA 수지 [Funakoshi, S. 등; J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1988, 382]가 불용성 수지로서 사용될 때, 폴리펩티드는 수지로부터 제거될 수 있고 보호기는 보호 펩티드 수지를 불화 수소, TFMSA(트리플루오로메탄술폰산) [Academic Press 출판, E. Gross 편집; Yajima, H 등; "The Peptides" vol. 5, Page 65(1983)], TMSOTf(트리메틸실릴 트리플레이트) [트리메틸실릴 브로마이드) [Fujii, N, 등; Chem. Pharm. Bull., 35, 3880 (1987)] 등으로 처리함으로써 폴리펩티드 수지로부터 제거될 수 있다.
비람직한 구현예에서는, 생성 폴리펩티드를 2-머캅토에탄올, DTT(디티오트레이톨) 등으로 환원시켜서 시스테인의 머캅토기가 환원된 형태이도록 한다. 이어서 머캅토기는 산화될 수 있어서 환상 폴리펩티드를 수득한다. 산화 처리는 공지방법에 의해 실행될 수 있다. 통상적으로 공기 또는 페리시아네이트(예를들면, 포타슘 페리시아나이드)와 같은 산화제가 사용된다.
대안적으로, 본 발명의 폴리펩티드(들)은 재조합 NDA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드(들)용 뉴클레오티드 코딩서열은 당분야 공지된 기술을 사용하여 클리닝되고 발현될 수 있다. 예를들면, Maniatis 등의 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1991을 참조한다.
본 발명의 폴리펩티드는 폴리펩티드에 관한 당분야 공지기술, 예를들면, 추출, 재결정화, 다양한 크로마토그래피(겔 여과, 이온 교환, 분배, 흡착, 역상), 전기영동, 향류 분배 등에 의해 분리 및 정제될 수 있으며, 역상 고성능 액체 크로마토그래피가 가장 효과적이다.
[폴리펩티드의 용도]
구조식(I)로 표시되는 본 발명의 폴리펩티드(들)는 엔도톡신에 결합하는 능력, 항균 활성 및 엔도톡신-감작 혈구를 용혈시키는 활성을 갖는다. 추가적으로, 본 발명의 폴리펩티드(들)는 항비루스 활성을 갖는다. 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드(들)는 항-HIV 활성을 갖는다. 하기 섹션 6에서 상세히 설명되는 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드는 공지된 엔도톡신 고친화성 폴리펩티드 (예를들면, 태치플레신 I, II 또는 III 또는 폴리페뮤신 I 또는 II)보다 현저하게 높은 항-HIV 활성을 나타낸다.
그러므로, 본 발명의 폴리펩티드(들)는 본 발명의 폴리펩티드(들) 또는 그의 염과 제약학적 조성물의 투여방법 및 투여형태에 따라서 선택된 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제약학적 조성물에 사용될 수 있다. 제약학적 담체는 Hank's 또는 Ringer's 용액, 생리식염수, 식염수 및 글루코오즈로 구성된 혼합물 및 헤파린화 소듐-시트레이트-시트르산-텍스트로즈 용액과 같은 생리학적으로 혼화성인 담체일 수 있다. 제약학적 조성물은 치료대상에 따라서 경구로 또는 비경구로 투여되며, 투여방법에 따라서 적절한 제약학적 담체를 사용하여 분말, 과립, 주사액 또는 경구투여제, 정제, 좌약, 페사리, 연고, 크림 또는 연무질로서 제조될 수 있다.
제약학적 조성물이 환자에게 주사에 의해 직접 투여될 때, 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 염은 1일당 10 내지 5.000mg/인체의 체중 kg 의 양으로 생리학적 식염수내 용액으로서 정맥내 적주법에 의해 연속적으로 또는 간헐적으로 투여될 수 있다.
[실시예]
본 실시예에서는, 폴리펩티드(1)의 합성을 기술한다. 추가로, 본 발명의 폴리펩티드와 공지 엔도톡신 고친화성 폴리펩티드의 항-HIV 활성 분석 결과가 공개된다. 본 발명의 폴리펩티드는 공지 엔도톡신 고친화성 폴리펩티드에 비하여 현저하게 높은 항-HIV 활성을 갖는다.
실시예에서는 하기하는 바와같은 기구 및 시약이 사용된다 :
HPLC 기구 : Waters co. (USA) Model 600
기구의 컬럼 : Asahipak ODP-90 (Asahi Chemical Industry Co., Ltd.)
Fmoc 아미노산 : Kokusan Kagaku co., Ltd. 제조
아미노 수지 및 축합제 : Peptide Kenkyusho Co., Ltd. 제조
FAB-MS(FAB-질량 분석 사진기) : VC Co. (USA), Model ZAB-SE
[실시예 1 : 폴리펩티드(1)의 합성]
하기 구조식을 갖는 폴리펩티드(1)의 합성을 하기 섹션 6.1.1∼6.1.7에 기술한다. 폴리펩티드(2-33)(구조에 대해서 표1 참조)를 유사한 방법을 사용하여 합성한다.
서열 2
3- 및 16-위치와 7- 및 12-위치의 시스테인 잔기는 각각 디술피드 결합을 통해 결합된다.
[Fmoc-DMBHA-CH 2CH 2COOH [(3-( -Fmoc-아미노-4- 메톡시벤질)-4-메톡시페닐) 프로피온산]의 아미노메틸 수지로의 도입]
270mg(0.2mmole)의 아미노메틸 수지(0.74meq/g) 및 268.5mg(0.5mmole, 2.5eq)의 Fmoc-DMBHA-CH 2CH 2-COOH (MW 537)를 고체상 합성 컬럼에 넣고 축합반응을 Guo, L. 등 [(Chem. Pharm. Bull., 36, 4989 (1988)]의 방법에 따라 DMF내의 DIPCDI-HOBt의 방법에 의해 2시간동안 실행한다.
축합반응의 완결후에, 커플링을 유리 아미노기의 보호를 위해 아세트산 무수물(DMBHA 수지)을 사용하여 실행한다.
[17-위치 아르기닌의 DMBHA 수지로의 도입]
상기 섹션 6.1.1에서 제조된 DMBHA로부터 Fmoc기를 20 피페리딘/DMF로 제거한 후에, DMBHA 수지를 기준으로 하여, 2.5 당량(eq)의 Fmoc Arg(Mtr)-OH를 첨가하고, 축합반응을 DIPCDI-HOBt 방법에 따라서 DMF내에서 실행한다.
축합반응의 진전 정도를 Kaiser, E. 등 [Anal. Biochem., 34, 595 (1970)]의 닌히드린 시험에 따라서 측정한다.
[16-위치 시스테인의 도입]
DMBHA 수지로부터 Fmoc 기를 20 피페리딘 / DMF로 제거한 후에, DMBHA 수지를 기준으로 하여 2.5eq의 Fmoc-Cys (MBzl)-OH를 첨가하고, 축합반응을 DIPCDI-HOBt 방법에 의해 DMF내에서 실행한다. 축합반응의 진전정도를 상기 6.1.2 와 유사하게 닌히드린 시험에 따라서 측정한다.
[6.1.4 15-위치로부터 1-위치까지의 아미노산의 도입]
상기한 바와 유사하게, Lys(Boc), Arg(Mtr), Tyr(t-Bu), Cys(MBzl), Tyr(t-Bu), Gly, Lys(Boc), Tyr(t-Bu), Cys(MBzl), Lys(Boc), Arg(Mtr), Tyr(t-Bu), Cys(MBzl), Trp, Arg(Mtr) 및 Arg(Mtr)을 연속적으로 DMBHA 수지내로 도입하여 보호기로 보호된 펩티드(1) 수지를 수득한다.
고체상 합성에서의 각각의 아미노산 축합 반응을 표 2의 조작 조건에 따라서 실행한다.
표 2
[6.1.5 보호기의 제거, 수지로부터의 폴리펩티드(1)의 제거 및 부분 정제에 의한 폴레펩티드(1)의 제조]
보호 폴리펩티드(1)수지를 20 피페리딘/DMF 처리하여 Fmoc 기를 제거한 다음 수지 100mg 당 1M TMSOTf-티오아니솔/ TFA (트리플루오로아세트산)계 (m-크레졸 (100eq) 및 에탄디티올(300eq) 존재하의 10ml의 트리플루오로아세트산)내에서 25 에서 2시간 반응시킨다. 수지를 반응 혼합물로부터 여과하고 1ml의 트리플루오로아세트산으로 2회 세척한다. 100ml의 빙냉 건조 에테르를 여액 및 세척액의 혼합물에 연속적으로 첨가한다. 형성된 침전물을 원심분리하고, 잔류물을 경사분리에 의해 상청액으로부터 분리한다. 생성 잔류물을 차가운 에테르로 세척하고, 10ml의 4N AcOH에 용해시키고, 830mg, 80eq의 디티오트레이톨을 첨가하고 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반한다.
반응 용액을 원심분리하고, 상청액을 Sephadex G-10 (3.7 × 5cm)로 처리하고, 4N 아세트산(AcOH)으로 겔 여과하고 주요 용출 부분으로서 플로우-쓰루(flow-through)를 수집하고 동결건조하여 분말로서 부분적으로 정제된 비-고리형 폴리펩티드(1)을 수득한다.
[6.1.6 공기 산화에 의한 폴리펩티드(1)의 제조]
1/2 양의 플로우-쓰루 분획의 pH를 진한 수성 암모니아로 7.5로 조정하고 에어레이션(aeration)에 의해 공기 산화시켜서 고리화 반응을 실행한다. 공기 산화를 완결한 후에, 고리화된 폴리펩티드(1)을 10g의 Diaion HP-20 수지에 흡착시키고, 이어서 60 CH 3추(1N AcOH 내)로 용출한다. 용출물을 감압하 실온에서 농축시켜서 CH 3CN을 제거한 다음 동결건조하여 분말을 수득한다. 분말을 소량의 물에 용해시키고, 용액을 Asahipak에 붓고 CH 3CN으로 구배용출하면서 고성능 액체 크로마토그래피(Waters Co. 제 HPLC-모델 600)에 의해 정제하여 수율 27 (보호기- 보호 폴리펩티드(1)수지를 기준으로 하여 계산한 값)로 단일 피크의 폴리펩티드(1)를 수득한다.
[6.1.7 폴리펩티드의 분석]
아미노산 조성치를 상기 섹션 6.1.6에서 정제된 폴리펩티드의 류신 아미노펩티다제 소화에 의해 측정했을 때 구조식(1)의 아미노산 서열을 기준으로 한 조성 계산치 범위내인 것을 알 수 있다.
수득된 폴리펩티드의 고유 광회전도 는 +8.4°이다)C=0.1, 1N 아세트산).
[6.2 실시예 2 : 인간 면역 결핍 비루스(HIV)에 대한 항비루스 활성]
실시예 1에서 합성된 폴리펩티드(1)뿐만 아니라 폴리펩티드(2), (3), (4), (7), (12), (13), (14), (20), (21) 및 (26)의 HIV에 대한 항비루스 활성을 하기 방법에 따라 시험하고 평가한다.
HIV- 감염 MT-4 세포 (2.5×10 4 세포/웰, 감염 다중도 (MOI) : 0.001)을 감염후 즉시 다양한 농도의 시험물질과 함게 96-웰 마이크로티터 (microtitre) 플레이트에 첨가한다. 37 에서 5일간 CO 2 인큐베이터에 배양한 후에, 생존 세포의 수를 MTT 방법 [Pauwels 등 ; J. Virol. Methods, 20, 309∼321 (1988)]에 의해 측정한다. 항비루스 활성을 HIV 감염으로 인한 셀의 죽음이 50 저해되는 농도(EC 50 : 50 유효 농도)로서 나타낸다. 한편, 시험물질의 MT-4 세포에 대한 세포독성을 알기 위하여, 비루스-비-감염세포를 상기한 바와같이 다양한 농도의 시험 화합물과 함께 배양한다. 세포독성을 시험물질로 인한 50 세포독성 농도(EC 50)로 나타낸다. 또한 CC 50 대 EC 50의 러브(rough) 비율 (CC 50/EC 50)을 유효 비율 (SI=선택성 지수)로서 나타낸다.
표 3은 폴리펩티드 (1), (2), (3), (4), (7), (12), (13), (14), (20), (21) 및 (26)과 엔도톡신 고친화성을 갖는 공지 폴리펩티드, 특히, 태치플레신 I 및 II 및 폴리페뮤신 I 및 II와 공지 항- HIV 제 AZT의 EC 50, CC 50 및 SI치를 나타낸다.
표 4는 폴리펩티드(1), (3), (13), (20) 및 (21)의 물리적 특성치를 나타낸다.
표 3
표 4
표 3에 나타낸 결과는 실시예 I에서 합성된 폴리펩티드가 유효 농도로 측정시 현저하게 높은 항-HIV활성을 갖는다는 것을 나타낸다. 화합물 (1), (3), (12), (13), (14) 및 (26)이 HIV 감염 세포를 죽이는데 특히 선택적이다. 화합물 (1), (3), (12), (13), (14) 및 (26)의 선택성 지수는 임의의 공지된 엔도톡신 고친화성 화합물보다 적어도 7배 높다.
여기에 공개된 구현에는 본 발명의 몇몇 영역을 기술하기 위한 것이기 때문에, 여기에 기술되고 청구되는 본 발명은 이들 특정 구현예에 의해 제한되는 것은 아니다. 임의의 동등한 구현예는 본 발명의 영역내이다. 여기에 기술된 것에 첨가하여 본 발명의 다양한 변형이 당분야 숙련인에게 전술한 기술내용으로부터 명백히질 것이다. 그러한 변형은 또한 첨부된 특허청구의 범위의 영역내일 것이다.
기술 내용이 전체적으로 참고내용으로 통합된 다양한 참고문헌이 본 명세서에 인용된다.