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1. DE102017127984 - Verfahren für die Vermehrung und Aktivierung von γδ-T-Zellen

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[ DE ]
Beschreibung  

HINTERGRUND  Gebiet der Erfindung 

[0001]  Die vorliegende Offenbarung bezieht sich auf die Vermehrung und Aktivierung von T-Zellen. In einem Aspekt bezieht sich die vorliegende Offenbarung auf die Vermehrung und Aktivierung von γδ-T-Zellen, die für die Transgenexpression verwendet werden können. In einem anderen Aspekt bezieht sich die Offenbarung auf die Vermehrung und Aktivierung von γδ-T-Zellen, während α- und/oder β-TCR positive Zellen depletiert werden. Die Offenbarung stellt weiterhin Verfahren zur Verwendung der offenbarten T-Zell-Populationen bereit.

Stand der Technik 

[0002]  γδ-T-Zellen stellen eine kleine Untergruppe von T-Zellen dar, die den γδ-TCR anstelle des αβ-TCR exprimieren. γδ-T-Zellen können in zwei primäre Untergruppen unterteilt werden: die gewebsgebundenen Vδ2-negativen Zellen und die peripher zirkulierenden Vδ2-positiven Zellen, insbesondere Vγ9δ2-Zellen. Es wurde gezeigt, dass beide Untergruppen Anti-Virus- und AntiTumor-Aktivitäten zeigen. Anders als die konventionellen αβ-TCR-exprimierenden Zellen erkennen γδ-TCR-exprimierende Zellen ihre Ziele unabhängig von dem klassischen MHC I und II. Ähnlich wie natürliche Killer (NK)-T-Zellen, exprimieren γδ-T-Zellen NKG2D, der an nicht-klassische MHC-Moleküle bindet, d. h. die Sequenz A (MICA), die mit MHC-Klasse-I-Polypeptiden verwandt ist, und die Sequenz B (MICB), die mit MHC-Klasse-I-Polypeptiden verwandt ist, wobei diese Sequenzen auf unter Stress gesetzten Zellen und/oder Tumorzellen vorhanden sind. γδ-TCR erkennt viele verschiedene Liganden, z. B. mit Stress und/oder Tumoren zusammenhängende Phosphatantigene. γδ-T-Zellen vermitteln die direkte Zytolyse ihrer Zielzellen über zahlreiche Mechanismen, d. h. die TRAIL, FasL, Perforin- und Granzym-Sekretion. Darüber hinaus verstärken die CD16-exprimierenden γδ-T-Zellen antikörperabhängige, Zell-vermittelte Zytotoxizität (ADCC).

[0003]  Ein Problem der γδ-T-Zellen, die allgemein in einer Menge von nur 1 bis 5% im peripheren Blut vorhanden sein können, besteht darin, dass die Reinheit und Anzahl der γδ-T-Zellen, die für eine medizinische Behandlung ausreichen, nicht erreicht werden können, selbst wenn eine kleine Menge Blut gesammelt wird und anschließend die daraus erhaltenen Zellen aktiviert und/oder proliferiert werden. Die Erhöhung der Menge des einem Patienten entnommenen Blutes, um die Reinheit und Anzahl der γδ-T-Zellen zu erreichen, die für eine medizinische Behandlung ausreicht, stellt ebenfalls ein Problem dar, weil dies für den Patienten eine erhebliche Belastung darstellt.

[0004]  Heute verwenden klinische Studien mit autologen Vγ9δ2-T-Zellen ein klassisches Vy9ö2-T-Zell-Vermehrungsprotokoll, bei dem es sich um eine 14 Tage dauernde Behandlung von PBMC mit Bisphosphonat, d. h. Zoledronat und Pamidronat und 100 E/ml IL-2 handelt. Im besten Fall kann dieses Verfahren zu einem 100-fachen Anstieg der Gesamtzahl an Vγ9δ2-T-Zellen innerhalb von 14 Tagen führen, danach sinkt die Vermehrungsrate und gleichzeitig steigt die Anzahl der Zelltode. Das konventionelle Vγ9δ2-Vermehrungsprotokoll als solches kann keine ausreichende Anzahl von Zellen liefern, um als kommerziell verwertbares allogenes Produkt eingestuft zu werden.

[0005]  Das US-Patent Nr. 7,749,760 beschreibt einen Wirkstoff zur Vγ9Vδ2-T-Zell-Proliferation, der mindestens ein Bisphosphonat, Interleukin 2 (IL-2) und Interleukin 18 (IL-18) enthält. Da IL-18 Eigenschaften aufweist, welche die Lebensfähigkeit der Zellen verbessern, indem sie den Zelltod verhindern, ist es vermutlich in der Lage, als ein Cofaktor für das Bisphosphonat zu wirken, so dass es die Wirkung des Vγ9Vδ2-T-Zell-Wachstums durch das Bisphosphonat und IL-2 wesentlich verstärkt. Dadurch wird es ermöglicht, einen Wirkstoff zur Vγ9Vδ2-T-Zell-Proliferation bereitzustellen, der in der Lage ist, Vγ9Vδ2-T-Zellen mit einer im Vergleich zu konventionellen Verfahren sehr hohen Proliferationswirkung zu züchten, so dass die vermehrten Vγ9Vδ2-T-Zellen eine hohe Antitumor-Aktivität und hohe Zytokin-Produktivität aufweisen.

[0006]  Das US-Patent Nr. 8,962,313 beschreibt ein Verfahren für die gleichzeitige Proliferation von Krankheitserreger-Antigen-spezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs) und γδ-T-Zellen, indem ein Krankheitserreger-Antigen und ein Amino-Bisphosphonat, z. B. Zoledronsäure, zu isoliertem peripherem Blut hinzugefügt wird und die daraus resultierende Kombination in einem IL-2-enthaltendem Kulturmedium kultiviert wird.

[0007]  Die Anmeldung WO 2014/072446 beschreibt ein Verfahren für das Induzieren von IL-2-freier Proliferation von γδ-T-Zellen unter Verwendung einer Kombination aus einem γδ-T-Zell-Aktivator und IL-33 für die Verwendung bei der Therapie von Infektionen, Krebs, Autoimmunerkrankungen sowie anderen Erkrankungen.

[0008]  Die Anmeldung WO 2016/166544 beschreibt γδ-T-Zellen, bei denen es sich um Phosphoantigen Isopentenylpyrophosphat (IPP) vermehrte humane Vγ9Vδ2-T-Zellen und - Faktoren handelt, wie beispielsweise IL-2, IL-15 oder IL-18, die bei dem Kultivierungsschritt bereitgestellt werden können, um die Proliferation von γδ-T-Zellen und die Aufrechterhaltung des zellulären Phänotyps der mononuklearen Zellen des peripheren Blutes zu fördern.

[0009]  Die Anmeldung U.S. 2011/0158954 beschreibt ein Verfahren für die Herstellung einer γδ-T-Zellpopulation, bei welcher das Verfahren den Schritt der Kultivierung einer Zellpopulation, die γδ-T-Zellen umfasst, einschließt, in der Anwesenheit von (a) Fibronektin, einem Fibronektinfragment oder einer Mischung davon und (b) einem Aktivierungsfaktor von γδ-T-Zellen.

[0010]  Die Anmeldung U.S. 2016/0175358 beschreibt die positive und/oder negative Selektion von Zelloberflächenmarkern, die auf den gesammelten γδ-T-Zellen exprimiert werden, die verwendet werden können, um γδ-T-Zellen direkt von verschiedenen Quellen zu isolieren, z. B. einer peripheren Blutprobe, einer Nabelschnur-Blutprobe, einem Tumor, einer Tumorbiopsie, einem Gewebe, einem Lymphknoten oder von der Epithelprobe eines Subjekts. γδ-T-Zellen können aus einer komplexen Probe isoliert werden, die auf der positiven oder negativen Expression von CD4, CD8, TCRα, TCRβ, TCRδ und anderen geeigneten Zelloberflächenmarkern basiert. Verbindungen wie beispielsweise Glutamin/Glutamax, Zoledronsäure, Isopentenylpyrophosphat (IPP), IL-2 und IL-15 können verwendet werden, um γδ-T-Zellen in vitro zu stimulieren und/oder vermehren. Im Unterschied werden in der vorliegenden Erfindung die störenden α/β-T-Zellen entfernt, damit die Cytokine effektiv an die Rezeptoren binden können.

[0011]  Es bleibt der Bedarf an Verfahren, mit denen eine ausreichende Anzahl an γδ-T-Zellen als ein kommerziell verwertbares therapeutisches Produkt hergestellt werden kann. Eine Lösung für dieses technische Problem wird von den Ausführungsformen bereitgestellt, die in den Ansprüchen charakterisiert werden.

KURZE ZUSAMMENFASSUNG 

[0012]  In einem Aspekt bezieht sich die vorliegende Anmeldung auf in vitro Verfahren für das Vermehren und Aktivieren von γδ-T-Zellen, umfassend ein Isolieren der γδ-T-Zellen von mononuklearen Zellen des peripheren Bluts (PBMC) eines humanen Subjekts, bei dem das Isolieren das Inkontaktbringen der PBMC mit Anti-α- und Anti-β-T-Zell-Rezeptor (TCT)-Antikörpern einschließt, das Entfernen von α- und/oder β-TCR-positiven Zellen von den PBMC, das Aktivieren der isolierten γδ-T-Zellen in der Anwesenheit von mindestens einer Verbindung, die Aminobisphosphonat und/oder Isopentenylpyrophosphat (IPP) und mindestens ein Zytokin umfassend humanes rekombinantes Interleukin 2 (IL-2) und/oder humanes rekombinantes Interleukin 15 (IL-15) einschließt, und das Vermehren der aktivierten γδ-T-Zellen in der Abwesenheit von der mindestens einen Verbindung und in der Anwesenheit des mindestens einen Zytokins.

[0013]  In einem anderen Aspekt umfassen α- und/oder β-TCR-positive Zellen αβ-T-Zellen und natürliche Killer-T-(NKT)-Zellen.

[0014]  In noch einem anderen Aspekt liegt das Aminobisphoshonat als Pamidronsäure, Alendronsäure, Zoledronsäure, Risedronsäure, Ibandronsäure, Incadronsäure, ein Salz davon und/oder ein Hydrat davon vor.

[0015]  Das von der Offenbarung ferner bereitgestellte Aktivieren erfolgt in der Anwesenheit von Aminobisphosphonat, IL-2 und IL-15.

[0016]  In einem Aspekt erfolgt das Aktivieren in der Anwesenheit von IPP, IL-2 und IL-15.

[0017]  In einem anderen Aspekt handelt es sich bei dem Aminobisphosphonat um Zoledronsäure.

[0018]  In noch einem anderen Aspekt beträgt die Dichte der isolierten γδ-T-Zellen mindestens ungefähr 1 × 105 Zellen/ml, mindestens ungefähr 1 × 106 Zellen/ml, mindestens ungefähr 1 × 107 Zellen/ml, mindestens ungefähr 1 × 108 Zellen/ml oder mindestens ungefähr 1 × 109 Zellen/ml.

[0019]  In einem Aspekt liegt die Konzentration von IL-2 im Bereich von ungefähr 10 E/ml bis ungefähr 1000 E/ml, ungefähr 10 E/ml bis ungefähr 500 E/ml, ungefähr 100 E/ml bis ungefähr 500 E/ml oder ungefähr 10 E/ml bis ungefähr 100 E/ml.

[0020]  In einem anderen Aspekt liegt die Konzentration von IL-15 im Bereich von ungefähr 10 ng/ml bis ungefähr 1 µg/ml, ungefähr 50 ng/ml bis ungefähr 500 ng/ml oder ungefähr 100 ng/ml bis ungefähr 1 µg/ml.

[0021]  In noch einem anderen Aspekt schließt mindestens eine Verbindung ferner einen Toll-ähnlichen Rezeptor 2 (TLR2)-Liganden ein.

[0022]  In einem Aspekt wird der TLR2-Ligand aus der Gruppe ausgewählt, die aus Amphotericin B, L-Theanin, Tannin und Polyphenolen besteht.

[0023]  In einem anderen Aspekt handelt es sich bei dem TLR2-Liganden um Amphotericin B.

[0024]  In noch einem anderen Aspekt schließt mindestens eine Verbindung des Weiteren N-Acetyl-Cystein (NAC) und/oder Glutamin/Glutamax ein.

[0025]  In einem Aspekt liegt die Konzentration von NAC im Bereich von ungefähr 1 mM bis ungefähr 10 mM, ungefähr 2 mM bis ungefähr 8 mM, ungefähr 0,5 mM bis ungefähr 5 mM oder ungefähr 0,5 mM bis ungefähr 2,5 mM.

[0026]  In noch einem anderen Aspekt schließt die mindestens eine Verbindung ferner einen COX-2-Inhibitor ein.

[0027]  In noch einem anderen Aspekt handelt es sich bei dem COX-2-Inhibitor um Ibuprofen.

[0028]  In einem Aspekt erfolgt das Vermehren ferner in Anwesenheit von N-Acetyl-Cystein (NAC) und/oder Glutamin/Glutamax.

[0029]  In einem Aspekt liegt die Konzentration von NAC im Bereich von ungefähr 1 mM bis ungefähr 10 mM.

[0030]  In einem Aspekt beträgt die Dauer des Aktivierens nicht mehr als 14 Tage.

[0031]  In einem Aspekt beträgt die Dauer des Vermehrens mehr als 14 Tage.

[0032]  Beschrieben wird eine Population von vermehrten und aktivierten γδ-T-Zellen, die durch das Verfahren von einem der hier beschriebenen Aspekte hergestellt wurden.

[0033]  In einem anderen Aspekt bezieht sich die vorliegende Anmeldung auf Verfahren zur Verstärkung der Effizienz der viralen Transduktion in γδ-T-Zellen, einschließlich der Transduktion der vermehrten und aktivierten γδ-T-Zellen, die durch das Verfahren eines des ersten bis zum sechzehnten Aspekt mit einem rekombinanten viralen Vektor hergestellt wurden.

[0034]  In einem anderen Aspekt handelt es sich bei dem viralen Vektor um einen retroviralen Vektor.

[0035]  In noch einem anderen Aspekt exprimiert der virale Vektor CD8 und ein αβ-TCR.

[0036]  Beschrieben werden konstruierte γδ-T-Zellen, die durch das Verfahren der vorliegenden Offenbarung hergestellt wurden.

[0037]  Beschrieben wird eine Population von vermehrten γδ-T-Zellen, die durch das Verfahren der vorliegenden Offenbarung hergestellt wurden, bei denen die Dichte der vermehrten γδ-T-Zellen mindestens ungefähr 1 × 105 Zellen/ml, mindestens ungefähr 1 × 106 Zellen/ml, mindestens ungefähr 1 × 107 Zellen/ml, mindestens ungefähr 1 × 108 Zellen/ml oder mindestens ungefähr 1 × 109 Zellen/ml beträgt.

[0038]  Beschrieben wird ein Verfahren zur Behandlung von Krebs, das die Verabreichung einer wirksamen Menge von konstruierten γδ-T-Zellen, die durch das Verfahren der vorliegenden Offenbarung hergestellt wurden, umfasst, an einen Patienten, der diese Verabreichung benötigt.

[0039]  In einem Aspekt ist der Krebs ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lungenkrebs, kleinzelligem Lungenkrebs, Melanom, Leberkrebs, Brustkrebs, Gebärmutterkrebs, Merkelzellkarzinom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Gallenblasenkrebs, Gallengangkrebs, kolorektalem Krebs, Harnblasenkrebs, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Nierenkrebs, Leukämie, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Hirnkrebs, Magenkrebs und Prostatakrebs.

[0040]  In einem Aspekt handelt es sich bei dem Krebs um Melanom.

Figurenliste 

Fig. 1A zeigt die Depletion von αβ-T-Zellen von PBMC gemäß einer Ausführungsform der Offenbarung.

Fig. 1B zeigt die minimalen restlichen αβ-T-Zellen im Vγ9δ2-T-Zell-Produkt wie beschrieben.

Fig. 1C zeigt die minimalen restlichen αβ-T-Zellen im Vγ9δ2-T-Zell-Produkt wie beschrieben.

Fig. 1D zeigt die Zytokin-Profilierung von Vγ9δ2-T-Zellen wie beschrieben.

Fig. 2 zeigt Wirkungen von Molekülen auf die Aktivierung von Vγ9δ2-T-Zellen wie beschrieben.

Fig. 3 zeigt Wirkungen von Molekülen auf das Vermehren von Vγ9δ2-T-Zellen gemäß einer Ausführungsform der Offenbarung.

Fig. 4A zeigt Wirkungen der Zelldichte auf T-Zell-Marker gemäß einer Ausführungsform der Offenbarung.

Fig. 4B zeigt Wirkungen der Zelldichte auf den Zelltod gemäß einer Ausführungsform der Offenbarung.

Fig. 5 zeigt Wirkungen von Amphotericin B auf Vδ2-T-Zellen, die IL-2Rα exprimieren, gemäß einer Ausführungsform der Offenbarung.

Fig. 6 zeigt Wirkungen von Zoledronat (Zometa) auf die Zellvermehrung gemäß einer Ausführungsform der Offenbarung.

Fig. 7 zeigt einen Zeitplan für die virale Transduktion in Vγ9δ2-T-Zellen gemäß einer Ausführungsform der Offenbarung.

Fig. 8 zeigt die Virus-Transgenexpression in Vγ9δ2-T-Zellen gemäß einer Ausführungsform der Offenbarung.

Fig. 9 zeigt die Transduktionseffizienz von Vγ9δ2-T-Zellen mit konstruierten Viren gemäß einer Ausführungsform der Offenbarung.

Fig. 10 zeigt die Größenordnung der Vermehrung von Vγ9δ2-T-Zellen, die mit konstruierten Viren gemäß einer Ausführungsform der Offenbarung transduziert wurden.

Fig. 11A zeigt konstruierte Vγ9δ2-T-Zellen wie beschrieben.

Fig. 11B zeigt funktionelle Bewertungen von konstruierten Vγ9δ2-T-Zellen wie beschrieben.

Fig. 11C zeigt funktionelle Bewertungen von konstruierten Vg9d2-T-Zellen wie beschrieben.

Fig. 11D zeigt die zytolytische Aktivität von konstruierten Vg9d2-T-Zellen wie beschrieben.

Fig. 12A zeigt ein Schema von einem konstruierten Virus gemäß einer Ausführungsform der Offenbarung.

Fig. 12B zeigt ein Schema von einem konstruierten Virus wie beschrieben.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG 

[0041]  In einem Aspekt bezieht sich die vorliegende Offenbarung auf die Vermehrung und Aktivierung von T-Zellen. In einem anderen Aspekt bezieht sich die vorliegende Offenbarung auf die Vermehrung und Aktivierung von γδ-T-Zellen, die für die Transgenexpression verwendet werden können.

[0042]  Die Offenbarung bezieht sich ferner auf die Vermehrung und Aktivierung von γδ-T-Zellen, während α- und/oder β-TCR positive Zellen depletiert werden. Die Offenbarung stellt weiterhin Verfahren zur Verwendung der offenbarten T-Zell-Populationen bereit.

[0043]  In einem Aspekt werden hier Verfahren für die Herstellung von TCR konstruierten Vγ9δ2-T-Zellen in GMP-Qualität in großem Maßstab bereitgestellt.

[0044]  In der Abwesenheit von Feeder-Zellen verstärkt die Zugabe von IL-18 zu gereinigten γδ-T-Zellen die Vermehrung von γδ-T-Zellen mit einem merkbaren Anstieg der Menge von Oberflächenrezeptoren mit hoher Affinität für IL-2 (CD25 oder IL-2Ra). Ferner kann Amphotericin B, ein Toll-ähnlicher Rezeptor 2 (TLR2) Ligand, γδ -T-Zellen, CD8+-T-Zellen und NK-Zellen aktivieren und die Erkennung der Oberflächenexpression von CD25, der IL-2Rα mit hoher Affinität verstärken. Insgesamt heben diese Beobachtungen eine kritische Rolle der IL-2-Signalisierung bei der Zoledronat-vermittelten Aktivierung und Vermehrung von Vγ9δ2-T-Zellen hervor. Um daher die Verfügbarkeit von IL-2 für die γδ-T-Zell-Proliferation über die IL-2-Signalisierung zu maximieren (oder die Sequestrierung von IL-2 durch eine hohe Anzahl an αβ-T-Zellen zu minimieren), können Verfahren der vorliegenden Offenbarung die Depletion von αβ-T-Zellen von normalem PBMC einschließen, wobei Anti-αβ-TCR kommerziell verfügbare GMP Reagenzien verwendet werden. Da rekombinantes IL-18 als kommerzielles GMP-Reagenz zurzeit nicht verfügbar ist, können die Verfahren der vorliegenden Offenbarung die Kultur mit Amphotericin B in niedriger Dosierung ergänzen, um die CD25-Oberflächenexpression zu erhöhen, um die IL-2-Bindung und Signalisierung zu verstärken, die wiederum das Ansprechen auf IL-2 während der Aktivierung/Vermehrung verstärken kann. Darüber hinaus kann IL-15 zugefügt werden, weil gezeigt wurde, dass IL-15 die Proliferation und das Überleben von mit IPP behandelten Vγ9δ2-T-Zellen erhöht.

[0045]  Um kommerziell vermarktbare allogene T-Zellprodukte zu entwickeln, die beispielsweise so konstruiert werden können, dass sie Tumorantigen-spezifischen TCR exprimieren, wie beispielsweise chimäres CD8a-CD4tm/intrazelluläres Protein (Fig. 11 A und Fig. 11B), können Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung Verfahren umfassen, welche die Ausbeute an γδ-T-Zellen maximieren können, während sie das Vorhandensein von restlichen αβ-T-Zellen in dem allogenen Endprodukt minimieren. Beispielsweise können Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung Verfahren für das Vermehren und Aktivieren von γδ-T-Zellen einschließen, in denen αβ-T-Zellen depletiert werden, und die Wachstumskultur mit Molekülen, wie beispielsweise Amphotericin B, N-Acetyl-Cystein (NAS) (oder hoch dosiertes Glutamin/Glutamax), IL-2 und/oder IL-15 angereichert wird.

Depletion von αβ-T-Zellen 

[0046]  αβ-T-Zellen machen mehr als 90% der gesamten T-Zellen im Blut aus. aβ-T-Zellen weisen gemeinsam mit γδ-T-Zellen viele der homöostatischen Zytokin-Rezeptoren auf, beispielsweise IL-2- und IL-15-Rezeptoren. Beispielsweise kann IL-2 (100 E/ml) Vγ9δ2-T-Zellen während einer 14-tägigen Behandlung mit Zoledronat bis zu 100-fach vermehren und IL-2 bei 1.000 E/ml kann das Wachstum von Vγ9δ2-T-Zellen immer noch stark erhöhen; dadurch wird nahegelegt, dass die Verfügbarkeit von IL-2 ein limitierender Faktor sein kann. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass γδ-T-Zellen und CD8+-T-Zellen unter lymphogenen Bedingungen um IL-15 konkurrieren. Daher würde die Depletion von αβ-T-Zellen, die CD8+- und CD4+-T-Zellen sowie NK-T-Zellen umfassen, in dem Starter-PBMC die Sequestrierung von Zytokin durch αβ-T-Zellen eliminieren und dadurch die Verfügbarkeit von homöostatischen Zytokinen wie beispielsweise IL-2 und IL-15 für die γδ-T-Zell-spezifische Vermehrung erhöhen. In anderen Worten würde die Depletion von αβ-T-Zellen die Verfügbarkeit von diesen homöostatischen Zytokinen wie beispielsweise IL-2 und IL-15 erhöhen, um die jeweiligen Rezeptoren an γδ-T-Zellen zu binden.

[0047]  Fig. 1A zeigt die Depletion von αβ-T-Zellen von PBMC. Nachdem PMBCs mit Ficoll versetzt wurden, wurden sie gemäß dem Herstellerprotokoll mit Biotin-konjugierten αβ-TCR-Antikörpern, gefolgt durch Streptavidin-Mikroperlen inkubiert. Proben werden anschließend durch eine LS-Säule geschickt, um mit aβ-TCR-exprimierenden Zellen angereichert zu werden. Der Säulen-Durchfluss besteht aus den aβ-TCR-freien Fraktionen. Nach der Übernacht-Kultivierung wurden Zellen mit Fluorochrom-konjugierten aβ-TCR-Antikörpern gegenüber Vγ9-Antikörpern eingefärbt. Die Daten zeigen, dass während die aβ-TCR-angereicherten Fraktionen fast keine (0%) Vγ9δ2-Zellen enthalten, fast alle Vγ9δ2-Zellen (45%) in den aβ-TCR-freien Fraktionen angereichert werden.

[0048]  Fig. 1B und Fig. 1C zeigen minimale restliche αβ-T-Zellen im Vγ9δ2-T-Zell-Produkt. aβ-T-Zellen wurden aus dem PBMC von normalen Spendern (Spender A, Spender B, Spender C, Spender 12 und Spender 13) depletiert, wobei kommerziell verfügbare biotinylierte Anti-αβ-TCR-Antikörper/Streptavidin-Mikroperlen verwendet wurden. aβ-T-Zell-freie PBMC wurden mit Zoledronat/IL-2/IL-15 für 14 Tage kultiviert, gefolgt von einem Einfärben der Zelloberfläche mit den jeweiligen Fluorochrom-konjugierten Antikörpern, beispielsweise Anti-αβ-TCR-Antikörpern und Anti-γδ-TCR-Antikörpern, um auf restliche αβ-T-Zellen und angereicherte γδ-T-Zellen durch Sub-Gating von CD3 zu untersuchen. Diese Ergebnisse zeigen, dass αβ-T-Zell-freie γδ-T-Zellen angereichert wurden, d. h. 90,1% (Spender A), 78,6% (Spender B), 28,9% (Spender C), 89% (Spender 12) und 74% (Spender 13). Darüber hinaus zeigen αβ-T-Zell-freie γδ-T-Zellen minimale Reste von αβ-T-Zellen, d. h. 0,02% (Spender A), 0,05% (Spender B), 0,2% (Spender C), 0,4% (Spender 12) und 1 % (Spender 13). Minimale restliche αβ-T-Zellen sind wichtig, weil beispielsweise bei der haploidentischen hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT), restliche αβ-T-Zellen im Bereich von 0,2-0,6% nicht zu einer chronischen Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung (GvHD - Graft versus Host Disease) führten und daher diese αβ-T-Zell-freien γδ-T-Zellen zu sicheren allogenen Produkten machten.

[0049]  Fig. 1D zeigt die Zytokin-Profilierung von Vγ9δ2-T-Zellen. Die Zellen wurden für 6 Stunden vor der Zell-Ernte mit Golgi Stop/Plug behandelt (d. h. Proteintransport-Inhibitoren). Die Zellen wurden für die Oberflächen-Vδ2 eingefärbt, danach folgte die Fixierung und Permeabilisierung. Intrazelluläre Färbung mit Fluorochrom-konjugierten Antikörpern gegen TNF-α, IL-17a, und IFN-γ wurden durchgeführt. Diese Ergebnisse zeigen, dass TNF-α, IL-17a, und IFN-γ jeweils in 12%, 0,2% und 4% der Vγ9δ2-Zellen exprimiert wurden.

Aktivierung und Vermehrung von αβ-T-Zell-freiem PBMC 

[0050]  Maximale T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Überleben ohne Verpflichtung zu Anergie können drei Signale erfordern: Signal 1, hervorgerufen durch TCR, Signal 2, hervorgerufen durch co-stimulierende Moleküle und Signal 3, hervorgerufen durch Wachstumsfaktorsignalisierung.

[0051]  Ergänzen von Vγ9δ2-Kulturen mit co-stimulierenden Molekülen wie beispielsweise CD86 und 41BBL förderten ihre Proliferation. Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung können die Verwendung von αβ-T-Zell-freien PBMCs einschließen, bei denen myeloide Zellen die vorherrschende Zellpopulation sein können. Myeloide Zellen nehmen Zoledronat auf, welches den Mevalonat-Signalweg inhibiert und zur Akkumulation von IPP führt, das auf γδ-T-Zellen exprimiert werden, von diesen sezerniert werden oder als membrangebundene Form präsentiert werden kann. Myeloide Zellen sind auch ausgezeichnete Antigen-präsentierende Zellen, die verschiedene co-stimulierende Moleküle in verschiedenen Differenzierungsstadien exprimieren.

[0052]  Darüber hinaus können γδ-T-Zellen selbst auch verschiedene co-stimulierende Moleküle exprimieren. Als solche können αβ-T-Zell-freie PBMCs bei hoher Zelldichte während der Zoledronat-Behandlung kultiviert werden, um das Eingreifen von co-stimulierenden, auf myeloiden Zellen vorhandenen Molekülen sowie die Vermehrung von γδ-T-Zellen zu erleichtern und dadurch die Aktivierung, die Proliferation und das Überleben von Vγ9δ2-T-Zellen zu verstärken. Beispielsweise können exogene IL-2 (10-1000 E/ml, bevorzugt 20-500 E/ml, noch bevorzugter 50-100 E/ml) zu αβ-freien PBMCs hinzugefügt werden, bei denen CD4 Helfer-T-Zellen (dafür bekannt, dass sie IL-2 sezernieren) unter den αβ-T-Zell-freien Zellen sind, um das Überleben und die Proliferation während der Aktivierung und der Vermehrung aufrecht zu erhalten. Exogene IL-15 (10-1000 ng/ml, bevorzugt 20-500 ng/ml, noch bevorzugter 50-100 ng/ml) können in Zellkulturen mit hoher Dichte verwendet werden, um die Vγ9δ2-Aktivierung durch Inhibierung der Entwicklung von IL-17-produzierenden Vγ9δ2-T-Zellen zu maximieren, die γδ-Zell-Proliferation zu steigern und die Differenzierung von naiven Vγ9δ2-T-Zellen in Effektorzellen zu fördern. Zellkulturen mit hoher Dichte nutzen daher die reziproke co-stimulierende Wirkung zwischen γδ-γδ-Zellen, die CD28, CD86, CD83, CD80 auf γδ-T-Zellen exprimieren. Beispielsweise können CD28 co-stimulierende Moleküle, die mit CD86 und/oder CD80 interagieren, das Überleben und die Proliferation von γδ-T-Zellen verstärken.

[0053]  Um nach der Aktivierung in der Anwesenheit von Zoledronat IL-2 und IL-15 für 14 Tage die Wirkungen der Zelldichte auf T-Zell-Phänotypen und Zelltod zu bestimmen, wurden Vγ9δ2-T-Zellen analysiert, die durch hämostatische Zytokine, z. B. IL-2 und IL-15 in der Abwesenheit von Zoledronat bei hoher Dichte (z. B. 2 × 106 Zellen/ml) und bei niedriger Dichte (z. B. 0,5 × 106 Zellen/ml) vermehrt wurden. Fig. 4A zeigt, dass immunphänotypisierte Marker, z. B. CD122, CD80, CD83, CD86, CD95 und CD95L in Vγ9δ2-T-Zellen nicht bezüglich der Zelldichte betroffen waren, da es keinen bedeutenden Unterschied zwischen den Marker-Expressionen in Vγ9δ2-T-Zellen gibt, welche bei hoher Dichte und bei niedriger Dichte kultiviert wurden. Jedoch zeigt Fig. 4B einen signifikanten Rückgang beim Zelltod (20%) während der Vermehrung bei hoher Dichte im Vergleich zum Zelltod (51%) bei niedriger Dichte. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Kultivierung von Vγ9δ2-T-Zellen bei hoher Dichte, z. B. mindestens 1 × 106 Zellen/ml, das Überleben von Zellen durch Reduktion des Zelltodes fördern können.

[0054]  Fig. 2 und Fig. 3 zeigen jeweils einen Aktivierungsschritt und einen Vermehrungsschritt gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung. Bei dem Aktivierungsschritt und dem Vermehrungsschritt kann es sich um zwei aufeinanderfolgende Schritte handeln. Beispielsweise kann während dem Aktivierungsschritt Aminobisphosphonat, z. B. Zoledronat (ZA) oder IPP und Zytokine, beispielsweise IL-2 und IL-15 vorhanden sein. Während dem Vermehrungsschritt können Zytokine weiterhin ohne Aminobisphosphonat oder IPP vorhanden sein. Der Aktivierungsschritt kann während der ersten 14 Tage stattfinden, wenn Aminobisphosphonat oder IPP hinzugefügt und nicht ausgewaschen wird. Der Vermehrungsschritt kann von Tag 15 an stattfinden, weil am Ende von Tag 14 aktivierte Zellen gesammelt werden können, indem das gesamte Medium, das Aminobisphosphonat oder IPP enthält, entfernt wird und mit Medium ersetzt wird, das Zytokine in der Abwesenheit von Aminobisphosphonat oder IPP enthält. Im Gegensatz dazu bezeichnet das konventionelle Protokoll für die Vγ9δ2 Zoledronatvermittelte Produktion Tag 1-14 oft als eine Aktivierung/Vermehrung, weil unter diesen Bedingungen Zellen nicht über den Tag 14 hinaus am Leben erhalten werden können. In der vorliegenden Offenbarung wird Tag 1-14 als Aktivierungs-Schritt bezeichnet, weil Aminobisphosphonat, z. B. Zoledronat oder IPP vorhanden ist und der Schritt ab Tag 15 als Vermehrungsschritt bezeichnet wird, weil Zellen über den konventionellen 14-tägigen Vorgang hinaus am Leben erhalten und vermehrt werden können.

[0055]  Fig. 2 zeigt Signal 1, das unter Verwendung von Aminobisphosphonat durch TCR hervorgerufen wurde, das Pamidronsäure, Alendronsäure, Zoledronsäure, Risedronsäure, Ibandronsäure, Incadronsäure, ein Salz davon und/oder ein Hydrat davon oder Phosphoantigene, z. B. Isopentenylpyrophosphat (IPP) umfassen kann, um Vγ9δ2-T-Zellen für die Proliferation zu aktivieren. Beispielsweise inhibiert Zoledronat (Zoledronsäure (ZA) oder Zometa) den Mevalonat-Signalweg in Monozyten, was zur Ansammlung von Phosphoantigenen wie beispielsweise IPP führt, das auf Monozyten (ZA-Mo) präsentiert wird, um γ9δ2 TCR/CD3 zu aktivieren und Proliferation über PKC-Signalisierung zu induzieren und dadurch als Signal 1 zu dienen. IPP an sich kann auch direkt auf γδ-T-Zellen wirken und dabei die Notwendigkeit für Monozyten überflüssig machen.

[0056]  Fig. 2 zeigt Signal 2, das durch co-stimulierende Moleküle wie beispielsweise Amphotericin B (durch die FDA zugelassenes Ambisom) hervorgerufen wird, d. h. ein TLR2-Ligand. Beispielsweise kann Amphotericin B γδ-T-Zellen über zwei potentielle Mechanismen stimulieren. Zuerst kann Amphotericin B, das als Signal 2 dient, als ein co-stimulierendes Molekül auf γδ-T-Zellen wirken, um γδ-T-Zell-Aktivierung, Proliferation und IFN-γ-Produktion zu co-stimulieren und die immunsuppresive Aktivität von Vδ2-T-Zellen auf αβ-T-Zellen zu reduzieren. Amphotericin B kann auch als Verstärker von CD25, dem hoch affinen Rezeptor für IL-2 (IL-2Rα), wirken und dabei die Ansprechempfindlichkeit für IL-2 erhöhen, um Proliferation über Signal 3 zu stimulieren. Zweitens kann Amphotericin B, das als Signal 3 dient, auf Monozyten (ZA-Mo) wirken, um die Sekretion von IL-18 zu fördern, wodurch die CD25 Expression erhöht, und die zentralen Gedächtnis-T-Zellen bevorzugt werden und die Sekretion von IL-15 gefördert wird, wodurch die Herstellung von Effektor-Vγ9δ2-T-Zellen und das Blockieren von IL-17-festgelegten Zellen verstärkt werden kann. Geeigneter Ersatz für Amphotericin B kann natürliche Extrakte, wie beispielsweise L-Theanin von Tee, Tannin vom Apfel und Polyphenole von Preiselbeeren und Shitake Pilzen einschließen.

[0057]  Fig. 5 zeigt, dass das Einschließen von Amphotericin B den prozentualen Anteil von Vδ2 erhöht (d. h. Vγ9δ2)-T-Zellen, die IL-2Rα exprimieren. Kurz gesagt, wurden αβ-freie PBMCs in einem Aktivierungsmedium kultiviert, das am Tag 0 mit Zoledronat, IL-2 und IL-15 angereichert worden war. Nach 48 Stunden wurde Amphotericin B hinzugefügt und 48 Stunden später wurden Zellen für die Durchflusszytometrie auf Grundlage der Analyse von CD25-(oder IL-2Rα) Oberflächenexpression auf CD3+/Vδ2-T-Zellen geerntet. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung mit Zoledronat, IL-2 und IL-15 den prozentualen Anteil von Vδ2-T-Zellen im Vergleich zu dem prozentualen Anteil von unbehandelten αβ-freien PBMCs (0,55%) auf 16% erhöht. Jedoch erhöht die Zugabe von Amphotericin B zu Zoledronat, IL-2 und IL-15 den prozentualen Anteil von Vδ2-T-Zellen von 16% (ohne Amphotericin B) auf 29% (mit Amphotericin B). Diese Ergebnisse zeigen, dass Amphotericin B Vδ2-T-Zellen, die durch Zoledronat, IL-2 und IL-15 über die Signale 2 und 3 vermehrt und aktiviert wurden, weiter vermehren kann.

[0058]  Fig. 6 zeigt die γδ-T-Zell-Vermehrung unter Verwendung von Zoledronat (Zometa) in einem definierten Medium, das IL-2, IL-15 und Amphotericin B umfasst. Die Größenordnung des Anstieges der absoluten Anzahl von γδ-T-Zellen ist 3.350-fach, 11.060-fach und 31.666-fach für den Spender 20 jeweils von Tag 0 bis Tag 17, von Tag 0 bis Tag 22 und von Tag 0 bis Tag 29. Gleichermaßen ist die Größenordnung des Anstieges der absoluten Anzahl von γδ-T-Zellen 4.633-fach, 12.320-fach und 32.833-fach für den Spender 21 jeweils von Tag 0 bis Tag 17, von Tag 0 bis Tag 22 und von Tag 0 bis Tag 29. Wie oben festgestellt, kann im Gegensatz dazu das klassische Vγ9δ2-T-Zell-Vermehrungsprotokoll im besten Fall nur zu einem 100-fachen Anstieg der Gesamtzahl an Vγ9δ2-T-Zellen innerhalb von 14 Tagen führen, danach sinkt die Vermehrungsrate, was möglicherweise eine Folge des Anstiegs der Zelltode sein könnte.

[0059]  Neutrophile (die am häufigsten im Blut vorkommenden Leukozyten) könnten das Wachstum und das Überleben der γδ-T-Zellen abschwächen. Daher kann das Entfernen oder das Inaktivieren von Neutrophilen das Wachstum und das Überleben der γδ-T-Zellen fördern. Um dies zu Erreichen, können die neutrophilen Proteasen, wie beispielsweise die Proteinase 3, die Elastase und Cathepsin G für das Inhibieren (1) der Proliferation von Neutrophilen, (2) die Zytokinenproduktion und (3) die Zytotoxizität von γδ-T-Zellen über das proteolytische Spalten von IL-2 und der Modulierung von Butyrophilin 3A1 (CD277) verwendet werden. Darüber hinaus, wie bei polymikrobiellen septischen Mäusen beobachtet wurde, reduziert die Verabreichung von Glutamin und/oder N-Acetyl-Cystein (NAC) die Anzahl von Neutrophilen und erhöht den prozentualen Anteil von γδ-T-Zellen. Darüber hinaus, wie bei Ratten mit LPS-induzierter akuter Lungenverletzung beobachtet wurde, reduziert die Supplementierung mit Glutamin die Apoptoserate in γδ-T-Zellen teilweise durch Verstärkung der Synthese von Glutathion (GSH), einem Antioxidans, und verringert damit die schädigende Einwirkung von freien Radikalen, d. h. die Erosion von Telomeren. Auf Grundlage dieser Beobachtungen, wie in Fig. 2 und Fig. 3 gezeigt, können Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung auch die Supplementierung der Kultur mit hoch dosiertem Glutamin/Glutamax (oder niedrig dosiertem N-Acetyl-Cystein (NAC), d. h. 1-10 mM, bevorzugt 2,5-7 mM) einschließen, um dem durch freie Radikale vermittelten Schaden entgegenzuwirken und das replikative Potential von γδ-T-Zellen aufrecht zu erhalten und dadurch das Vermehren der Kultur zu maximieren. NAC oder hoch dosiertes Glutamin/Glutamax kann hohe intrazelluläre Konzentrationen von GSH aufrechterhalten und eine große Produktion von freien Radikalen (reaktive Oxygen-Spezies (ROS)) aus Monozyten und Neutrophilen in der Kultur ausgleichen. Darüber hinaus, wie in Fig. 2 gezeigt, kann Ibuprofen (ein Cyclo-Oxygenase-2 (COX-2) Inhibitor) die Amphotericin B-vermittelte Aktivierung von COX-2 in Monozyten (ZA-Mo) ausgleichen und dadurch die Ansammlung von Prostaglandin E2 (PGE2) während der gleichzeitigen Kultivierung mit Monozyten begrenzen. Andere COX-2 Inhibitoren, wie beispielsweise Valdecoxib, Rofecoxib, Celecoxib können auch verwendet werden.

Die TCR-Konstruktion von Vγ9δ2-T-Zellen mit RD114-pseudotypisierten γ-Retroviren 

[0060]  Um zu bestimmen, ob Vγ9δ2-T-Zellen, die durch die Verfahren der vorliegenden Offenbarung hergestellt wurden, für die virale Transfektion geeignet sind, wurden der das grüne fluoreszierende Protein (GFP)-exprimierende γ-Retrovirus (z. B. der Gibbonaffen Leukämie Virus (GALV) und RD114 Pseudotyp) und GFP-exprimierende Lentivirus (z. B. VSV-G Pseudotyp) auf ihre Transduktionseffizienz in diesen Zellen getestet.

[0061]  Fig. 7 zeigt einen Zeitplan für die virale Transduktion in Vγ9δ2-T-Zellen. Beispielsweise wurde frisches PBMC am Tag 1 von αβ-T-Zellen befreit und in Anwesenheit von IL-2 und IL-15 mit Zoledronat aktiviert; 24 Stunden später (am Tag 2) wurden Zellen unter Verwendung des jeweiligen Virus-Überstands bei einer MOI (Multiplicity of Infection = Multiplizität der Infektion) von 1,5 transduziert; die GFP Transgen-expression wurde am Tag 7 (d. h. am Tag 5 nach der Transduktion) mittels Durchflusszytometrie auf Transduktions-Effizienz untersucht und am Tag 12 (d. h. am Tag 10 nach der Transduktion) auf eine persistierende Transgenexpression untersucht.

[0062]  Fig. 8 zeigt, dass am Tag 5 nach der Transduktion die GFP-Expression für GALV 12%, für RD114 34% und für VSV-G 46% beträgt. Jedoch hält RD114 am Tag 10 nach der Transduktion eine GFP-Expression bei 40% aufrecht, während die GFP-Expression von GALV und VSV-G jeweils auf 7% und 3,6% sank. Diese Ergebnisse legen nahe, dass RD114-pseudotypisierte γ-Retroviren das optimale Vehikel für die Übertragung von Genen für die stabile Genexpression in Zoledronat, IL-2 und IL-15-vermehrten Vγ9δ2-T-Zellen ist.

[0063]  Konstruktion von γδ-T-Zellen mit αβ-TCR gegen tumorassoziierte Antigene (TAA) und CD8aß.

[0064]  Um γδ-T-Zellen zu konstruieren, die αβ-TCR exprimieren, die spezifisch an einen TAA/MHC-Komplex binden, wurde ein αβ-TCR-exprimierender γ-Retrovirus (αβ-TCR-Virus) erzeugt. Weil γδ-T-Zellen CD8 nicht exprimieren können, können γδ-T-Zellen möglicherweise CD8 zusätzlich zu αβ-TCR benötigen, um TAA/MHC-I-Komplexe auf der Zellmembran von Zielzellen, z. B. Krebszellen, zu erkennen. Zu diesem Zweck wurde ein CD8-exprimierender γ-Retrovirus (CD8-Virus) erzeugt.

[0065]  Um die Transduktionseffizienz von Vγ9δ2-T-Zellen mit gentechnisch veränderten γ-Retroviren zu bestimmen, wurden Zoledronat-aktivierte Vγ9δ2-T-Zellen mit αβ-TCR-Viren und/oder CD8-Viren bei einer MOI von 3 in einem definierten Medium, das mit IL-2 und IL-15 angereichert war, transduziert. Die Transduktionseffizienz wurde 96 Stunden nach der Transduktion durch Einfärben mit TAA/MHC-PE Dextrameren (oder NYESO-PE Dextrameren für eine negative Kontrolle) gemessen, gefolgt durch CD3-, CD8α- und Vδ2-Einfärben. Auf die Aufzeichnung auf MacsQuant folgte die Eingrenzung der Untersuchung an der CD3-Population.

[0066]  Fig. 9 zeigt 71% von Vγ9δ2-T-Zellen, die nur mit αβ-TCR-Viren allein transduziert wurden und 49% der Vγ9δ2-T-Zellen, die sowohl mit αβ-TCR-Viren als auch mit CD8-Viren transduziert wurden, die durch TAA/MHC-PE Dextramer-Färbung im Vergleich zur Färbung mit NYESO-PE Dextrameren für eine negative Kontrolle identifiziert wurden, d. h. die nur mit αβ-TCR-Viren (1,6%) und sowohl αβ-TCR-Viren als auch CD8-Viren (2%) transduziert wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass αβ-TCR, der spezifisch einen TAA/MHC-Komplex bindet, ohne weiteres in Vγ9δ2-T-Zellen exprimiert wurde, die mit αβ-TCR-Viren transduziert wurden. Darüber hinaus wurden 7,6% der Vγ9δ2-T-Zellen, die nur mit dem CD8-Virus und 6,8% der Vγ9δ2-T-Zellen, die sowohl mit αβ-TCR-Viren als auch CD8-Viren transduziert wurden, durch Färben mit CD8a identifiziert, verglichen mit einer negativen Blindprobe (kein Virus) (4%) und einer Transduktion nur mit αβ-TCR-Viren (4,4%). Diese Daten zeigen, dass Vγ9δ2-T-Zellen, die durch Zoledronat, IL-2 und IL-15-vermittelte Aktivierung und Vermehrung hergestellt wurden, für die Expression von TAAspezifischen TCRs durch virale Transduktion verwendet werden können.

[0067]  Um die Größenordnung der Vermehrung von Vγ9δ2-T-Zellen nach der viralen Transduktion zu bestimmen, wurden Vγ9δ2-T-Zellen (GD) oder αβ-T-Zellen (AB) mit αβ-TCR-Viren (TCR) und/oder CD8-Viren (CD8) transduziert, gefolgt von Messungen der Größenordnung der Vermehrung von Tag 7 bis Tag 21 nach der Transduktion. Fig. 10 zeigt, dass ohne Transduktion Vγ9δ2-T-Zellen (GD negative Blindprobe) (1.040-fach) im allgemeinen eine Vermehrung mit einem höheren Vielfachen aufweisen, als αβ-T-Zellen (AB Blindprobe) (289-fach). Nach der Transduktion nur mit αβ-TCR zeigen Vγ9δ2-T-Zellen (GD + TCR) eine 517-fache Vermehrung, die höher ist, als die Vermehrung von αβ-T-Zellen (AB + TCR) (211-fach). Nach der Transduktion nur mit CD8 (GD + CD8) oder CD8 + αβ-TCR (GD + CD8 + TCR) zeigen Vγ9δ2-T-Zellen jeweils eine 620-fache und 540-fache Vermehrung. Diese Ergebnisse zeigen, dass Vγ9δ2-T-Zellen eine höhere Kapazität für die Zell-Vermehrung als αβ-T-Zellen im Allgemeinen und für die virale Transduktion aufweisen.

[0068]  αβ-TCR-exprimierende Vγ9δ2-T-Zellen, bei denen αβ-TCR spezifisch an einen TAA/MHC-Komplex bindet, wurden erzeugt, indem Vγ9δ2-T-Zellen mit αβ-TCR-Retroviren und CD8αβ-Retroviren transduziert wurden. Fig. 11A zeigt, dass im Vergleich mit Vγ9δ2-T-Zellen ohne virale Transduktion (Blindprobe), 34,9% der Vγ9δ2-T-Zellen, die mit αβ-TCR-Retroviren und CD8αβ-Retroviren (αβ-TCR + CD8) transduziert werden, durch TAA/MHC-Dextramere (TAA/MHC-Dex) und Anti-CD8-Antikörper (CD8) positiv eingefärbt wurden, wodurch die Erzeugung von Vγ9δ2-T-Zellen gezeigt wurde, die sowohl αβ-TCR als auch CD8aß auf der Zelloberfläche exprimieren (αβ-TCR + CD8αβ-gentechnisch konstruierte Vg9d2-T-Zellen).

[0069]  Um die zytolytische Aktivität von konstruierten Vγ9δ2-T-Zellen zu bestimmen, wurden mit αβ-TCR +CD8αβ konstruierte Vg9d2-T-Zellen Zielzellen ausgesetzt, beispielsweise der A375-Zelllinie, bei der es sich um eine Zelllinie des humanen malignen Melanoms handelt, auf deren Zelloberfläche ein TAA/MHC-Komplex präsentiert ist. Drei funktionale Tests: (1) CD107a Degranulation, (2) IFN-γ-Freisetzung und (3) Apoptose fanden anschließend 6 Stunden nach dem Kontakt mit A375-Zellen statt.

[0070]  Das Prinzip des CD107a-Degranulationstests basiert auf dem Abtöten von Zielzellen über einen Granula-abhängigen Signalweg, der vorgeformte lytische Granuli verwendet, die sich im Zytoplasma von zytotoxischen Zellen befinden. Die Lipid-Doppelschicht, welche diese Granuli umgibt, enthält Lysosomen-assoziierte Membran-Glykoproteine (LAMPs), einschließlich CD107a (LAMP-1). Bei Erkennung von Zielzellen über den T-Zell-Rezeptorkomplex werden schnell Apoptose-induzierende Proteine wie beispielsweise Granzyme und Perforin in die immunologische Synapse freigesetzt, ein Vorgang, der als Degranulation beschrieben wird. Dadurch kommt das Transmembranprotein CD107a mit der Zelloberfläche in Kontakt und kann durch spezifische monoklonale Antikörper gefärbt werden. Fig. 11B zeigt, dass im Vergleich mit Vγ9δ2-T-Zellen ohne virale Transduktion (Blindprobe), 23,1% der Vγ9δ2-T-Zellen, die mit αβ-TCR-Retroviren und CD8αβ-Retroviren (αβ-TCR + CD8) transduziert wurden, durch Anti-CD107a-Antikörper positiv eingefärbt wurden, wodurch gezeigt wurde, dass die mittels αβ-TCR und CD8αβ konstruierten Vg9d2-T-Zellen zytolytisch sind, indem sie Degranulation durchführen, wenn sie in Kontakt mit A375-Zellen kommen.

[0071]  IFN-γ-Freisetzungstests messen durch die Konzentrationen von freigesetztem IFN-γ die Zell-vermittelte Antwort auf Antigen-präsentierende Zellen, beispielsweise A375-Zellen, wenn TCR von T-Zellen spezifisch an den Peptid/MHC-Komplex von Antigen-präsentierenden Zellen auf der Zelloberfläche bindet. Fig. 11C zeigt, dass im Vergleich mit Vγ9δ2-T-Zellen ohne virale Transduktion (Blindprobe), 19,7% der Vγ9δ2-T-Zellen, die mit αβ-TCR-Retroviren und CD8αβ-Retroviren (αβ-TCR + CD8) transduziert wurden, durch Anti-IFN-γ-Antikörper positiv eingefärbt wurden, wodurch gezeigt wurde, dass die mittels αβ-TCR und CD8αβ konstruierten Vg9d2-T-Zellen zytolytisch sind, indem sie IFN-γ freisetzen, wenn sie in Kontakt mit A375-Zellen kommen.

[0072]  Die zytolytische Aktivität wurde 24 Stunden nach dem Inkontaktbringen mit A375-Zellen durch Eingrenzen auf die Apoptose von nicht-CD3-T-Zellen, d. h. A375-Zellen untersucht. Die Apoptose wurde durch Einfärben der geernteten Kultur mit lebender/toter Farbe untersucht. Fig. 11D zeigt, dass im Vergleich mit Vγ9δ2-T-Zellen ohne virale Transduktion (Blindprobe) Vg9d2-T-Zellen, die mit αβ-TCR und CD8αβ (αβ-TCR + CD8) konstruiert wurden, Apoptose bei 70% der A375-Zellen hervorriefen, wodurch gezeigt wird, dass Vg9d2-T-Zellen, die mit αβ-TCR und CD8αβ konstruiert wurden, zytolytisch sind, weil sie A375-Zellen töten.

[0073]  Diese Daten zeigen, dass gentechnisch konstruierte Vg9d2-T-Zellen, die durch die Verfahren der vorliegenden Offenbarung hergestellt werden, funktionsfähig sind und auf eine TAApeptidspezifische Art und Weise für das Töten von Zielzellen, z. B. Krebszellen, geeignet sind.

[0074]  Unter einem Gesichtspunkt umfassen TAA-Peptide, die vorliegend beschrieben werden, die in der Lage sind, mit den vorliegend beschriebenen Verfahren und Ausführungsformen verwendet zu werden, beispielsweise die in U.S. Veröffentlichung 20160187351, U.S. Veröffentlichung 20170165335, U.S. Veröffentlichung 20170035807, U.S. Veröffentlichung 20160280759, U.S. Veröffentlichung 20160287687, U.S. Veröffentlichung 20160346371, U.S. Veröffentlichung 20160368965, U.S. Veröffentlichung 20170022251, U.S. Veröffentlichung 20170002055, U.S. Veröffentlichung 20170029486, U.S. Veröffentlichung 20170037089, U.S. Veröffentlichung 20170136108, U.S. Veröffentlichung 20170101473, U.S. Veröffentlichung 20170096461, U.S. Veröffentlichung 20170165337, U.S. Veröffentlichung 20170189505, U.S. Veröffentlichung 20170173132, U.S. Veröffentlichung 20170296640, U.S. Veröffentlichung 20170253633 und U.S. Veröffentlichung 20170260249 beschriebenen TAA-Peptide.

[0075]  Andere gentechnisch konstruierte Viren, die verwendet werden können, um γδ-T-Zellen zu transduzieren, können zwei Viren umfassen, um αβ-TCR und chimäre CD8/CD4 getrennt zu exprimieren. Alternativ können sowohl TAA-spezifische αβ-TCR als auch chimäre CD8/CD4 (mit verkürztem koloniestimulierendem Faktor 1 Rezeptor (CSF1R)) in einem einzelnen Virus eingeschlossen werden.

[0076]  Fig. 12A zeigt beispielsweise CD8/CD4 chimäre Rezeptor-T2A-verkürzte CSF1R, bei denen die CD8a extrazelluläre Domäne mit der transmembranen und intrazellulären Domäne von CD4 verbunden sein kann. CD8a wird für die Bindung an die a3-Domäne des MHC I Moleküls benötigt, bei welchem CD8β für die Palmitoylation wichtig ist, und daher die richtige Rekrutierung von CD8 zu Lipidflößen für die Interaktion mit dem TCR-Komplex bereitstellt. Auf der anderen Seite funktioniert CD4 als ein Monomer und kann auf Lipidflößen vorliegen und ähnlich zu der CD8 intrazellulären Domäne kann die CD4 intrazelluläre Domäne Lymphozyten-spezifische Protein-Tyrosin-Kinase (Lck) rekrutieren, die jeweils mit den zytoplasmatischen Schwänzen der CD4 und CD8 Co-Rezeptoren auf T-Helferzellen und zytotoxischen T-Zellen interagieren kann, um die Signalisierung von dem TCR-Komplex zu unterstützen. Anstatt daher sowohl CD8a als auch CD8β zu exprimieren, kann ein chimäres CD8/CD4-Protein erzeugt werden, dass an das MHC-I-Molekül binden und auf Lipidflößen vorliegen kann. Eine verkürzte intrazelluläre katalytische Domäne des CSF1-Rezeptors (CSF1R) kann stromabwärts von dem chimären CD8/CD4-Protein, das als Tötungsschalter verwendet wird, verbunden sein, wenn die Funktion eines chimären CD8/CD4-Proteins nicht länger benötigt wird. CSF1R wird nicht auf T-Zellen exprimiert und kommt in myeloiden Zellen am häufigsten vor. Daher hätte das Abschalten der CSF1R intrazellulären katalytischen Domänen-vermittelten Signalisierung eine minimale Wirkung auf T-Zellen, wie beispielsweise γδ-T-Zellen. Um die CSF1R-Signalisierung auszuschalten, kann eine Anzahl an Tyrosin-Kinase-Inhibitoren, wie beispielsweise R7155, CYC11645, Ki20227, GW2580, BLZ945, PLX5622 und PLX3397 verwendet werden. Andere Rezeptoren können als Tötungsschalter verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Signalisierung verkürzter TNFR2, verkürzter ESR1 und/oder ESR1/Fas, die Östrogen-Rezeptoren aktivieren können, um den Fasvermittelten Tod von T-Zellen zu induzieren.

[0077]  CSF1 kann die M1 (klassisch aktivierte Makrophagen) zu einer M2 (alternativ aktivierte Makrophagen)-Polarisierung aufwerten. In einer Tumor-Mikroumgebung kann CSF1 Tumorverbundene Makrophagen (TAM) vom M1- zum M2-Typ polarisieren. Dies kann eventuell nicht wünschenswert sein, weil der M1-Typ von TAM eine größere Tumor-tötende Aktivität als der M2-Typ von TAM aufweist. Um die Anwesenheit von CSF1 in einer Tumor-Mikroumgebung zu nutzen und die T-Zell-Funktion/Persistenz anzutreiben und die Verfügbarkeit von CSF1 zu reduzieren, um TAM zu polarisieren kann die CSF1R extrazelluläre Domäne, welche CSF1 bindet, in chimärem CD8/CD4-Protein eingeschlossen sein.

[0078]  Fig. 12B zeigt beispielsweise den CD8/CD4 chimären Rezeptor-T2A-CSF1R/41BB chimären Rezeptor, in dem die CSF1R extrazelluläre Domäne stromabwärts von dem chimären CD8/CD4-Protein verbunden ist, so dass die CSF1R extrazelluläre Domäne CSF1 binden und von den Makrophagen weg sequestrieren kann und damit die M1- zur M2-Polarisierung reduziert. Indem sie ein co-stimulierendes Molekül wie beispielsweise 41BB bereitstellt, kann dieses Fusionsprotein das Überleben und die Vermehrung von T-Zellen wie beispielsweise γδ-T-Zellen fördern.

[0079]  Vorteile der vorliegenden Offenbarung können umfassen (1) die Verwendung von γδ-T-Zellen, um die Zytotoxizität gegen Mevalonat-abhängige Tumoren hervorzurufen; (2) die Verwendung von γδ-T-Zellen als eine allogene Zelle, die so gentechnisch konstruiert wurde, dass sie einen Tumor-Antigen-spezifischen chimären Antigen-Rezeptor (CAR) oder γδ-TCR mit oder ohne Deletion von endogenem γδ-TCR exprimiert; (3) Verwendung von γδ-T-Zellen als allogene Immunzellen durch die Co-Verabreichung mit verschiedenen Formen von Antikörpern oder aufnehmenden Mitteln für T-Zellen, um Krebspatienten mit beeinträchtigtem Immunsystem zu behandeln; (4) Verwendung von γδ-T-Zellen, um die Reifung von dendritischen Zellen für Krebsimpfstoffe zu fördern; und (5) Verwendung von γδ-T-Zellen als Antigen-präsentierende Zellen zur Erhöhung der Aktivierung von zytotoxischen CD8-T-Zellen.

[0080]  Es entspricht dem Verständnis, dass jedes der oben beschriebenen Elemente oder zwei oder mehr Elemente zusammen auch eine nützliche Anwendung in anderen Typen von Verfahren finden, die sich vom oben beschriebenen Typ unterscheiden. Die vorstehenden Ausführungsformen werden nur im Wege von Beispielen dargestellt; der Umfang der vorliegenden Offenbarung darf nur durch die folgenden Ansprüche eingegrenzt werden.