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1. CN101932933 - Formation of layers of amphiphilic molecules

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两性分子层的形成


技术领域
一方面,本发明涉及诸如脂双层等两性分子层的形成。本发明特别 涉及的是适合于要求高度灵敏性地测量电信号的应用(例如单通道记录和 用于生物传感器的随机传感或药物筛选应用)的高品质层的形成。在一个 具体方面,本发明涉及的是采用两性分子层(例如脂双层)的阵列的应用。 在另一个方面,本发明涉及设置在凹槽中的电极(例如用于执行电生理学 测量的电极)的性能。
背景技术
将细胞蛋白质用于生物传感和药物发现应用的潜力早就受到重视。 然而,在研发该技术以充分实现该可能性时有很多挑战需要克服。关于 利用荧光和光学途径的文献有很多,但是该文档关注于电信号的测量以 识别生物传感中的分析物。
在一类技术中,可以将两性分子层用作分隔两个体积(volume)的水溶 液的层。所述层阻止电流在两个体积之间的流动。膜蛋白被插入到所述 层中以选择性地允许离子跨越所述层通过,并将其记录为通过所述两个 体积的水溶液中的电极所检测到的电信号。目标分析物的存在调节了离 子的流动,并通过观测所导致的电信号变化进行检测。因此该技术允许 所述层用作生物传感器以检测分析物。所述层是所存在的单分子生物传 感器的必要组件,其目的是双重的。第一,所述层为用作传感元件的蛋 白提供了平台。第二,所述层将所述体积之间的离子流分开,所述层的 电阻确保系统中离子流的优势部分通过目的膜蛋白,通过所述双层的离 子流可以忽略不计,因此允许进行单蛋白通道检测。
一种具体应用是随机传感,其中膜蛋白的数量保持很小(通常为1至 100),使得可以监测单蛋白分子的行为。该方法提供了与各个特异性分子 相互作用有关的信息,因此得到了比大量测量(bulk measurement)更加丰富 的信息。然而,由于涉及到小的电流(通常为若干pA),该方法的必备条件 是极高的阻封(通常为至少1GΩ,并且对于某些应用还要高一或两个量级) 和足够的电敏感性以测量电流。虽然在实验室中已经满足了随机传感的要 求,但是所需的条件和专门知识限制了其应用。另外,实验室方法费力耗 时,并且不容易扩大至高密度阵列,高密度阵列是所有商业生物传感器 都需求的。而且,单独的双层膜的脆性意味着在实验室常使用抗震台。
将利用背景回顾用于形成诸如脂双层等两性分子层的现有技术。
在本领域中,已知有数种用于形成平面人造脂双层的方法,最著名 的包括折叠双层形成法(例如,Montal&Mueller的方法)、浸尖法、涂布 法、膜片钳法和油包水微滴界面法。
目前在研究实验室,大量的常规单离子通道表征使用折叠双层法、 涂布双层法或浸尖法进行。使用这些方法的原因是容易形成双层或能够 形成高阻封(例如10GΩ至100GΩ)。浸尖双层和来自大单室脂质体的膜 片钳法的双层也得到研究,因为它们能够以无溶剂的方式形成,据认为 这对于一些蛋白通道的活性是重要的。
Montal&Mueller(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1972),69,3561-3566) 的方法流行的原因在于其是一种形成适用于蛋白孔插入(protein pore insertion)的良好品质的折叠脂双层的具有成本效率且相对简单的方法,其 中脂单层携带于水/空气界面而通过膜内开孔的任意一侧,所述开孔垂直于 该界面。通常,通过首先将脂质溶解于有机溶剂中而将脂质添加到电解质 水溶液的表面,然后让其中一滴于开孔的任意一侧的水溶液的表面上蒸 发。有机溶剂蒸发后,所述溶液/空气界面以物理方式上下运动而通过开孔 的任意一侧,直到形成双层。该技术要求存在作为预处理涂料施加到开孔 表面的疏水性油。疏水性油的主要功能是在双层和开孔膜之间形成环形 区,其中脂单层必须在一定距离(通常为1μm至25μm)上聚集在一起。
浸尖法双层形成必须使开孔表面(例如移液器尖端)与携带脂质单层 的测试溶液的表面接触。同样,首先通过使施加到溶液表面的溶解在有 机溶剂中的脂质滴蒸发,在溶液/空气界面产生脂单层。然后通过机械活 动以使所述开孔出入所述溶液表面而运动,从而形成脂双层。
对于涂布双层,将溶解在有机溶剂中的脂质滴直接施加在所述开孔 上,所述开孔浸没在测试水溶液中。使用漆刷或等效物将脂质溶液很薄 地铺展在开孔上。脂质的薄化导致脂双层的形成,但是难以完全从双层 中去除溶剂,结果导致所形成的双层的稳定性较低,在测量过程中容易 有更多的噪音。
膜片钳常用于生物细胞膜的研究中,利用膜片钳通过抽吸将细胞膜 夹到移液器的末端,一片膜附接在开孔上。该方法已经应用于人造双层 研究中,其中通过夹持脂质体然后脂质体破裂而剩下密封在移液器的开 孔上的脂双层。该方法需要稳定而巨大的单室脂质体并且在玻璃表面材 料中制造出小的开孔。
油包水微滴界面是一件最近的发明,其中两份水性样品浸没在含有 脂质的烃油库中。所述脂质在油/水界面处的单层中累积,使得当两份样 品接触时在它们之间的界面处形成双层。
在这些技术的任何一种技术中,一旦形成脂双层,然后将蛋白通过 下述方式导入到双层中:通过来自于水性溶液的随机碰撞、通过含有蛋 白的囊泡的融合、或通过将其以机械方式运输到双层,例如在探测器件(例 如琼脂尖棒(agar tipped rod)的末端。
最近为了提高使用微制造形成双层的容易性而作了很大的努力。一 些技术主要尝试将用于折叠脂双层的标准系统小型化。其他技术包括通 过共价结合或物理吸附,在固体基底上形成双层,或直接在电极表面形 成双层。
大部分能够进行随机传感的器件通过使用折叠脂双层技术或涂布双 层技术的变体形成双层。迄今为止,绝大部分集中于开孔形成的新型方 法或集中于在微制造中使用浸没技术使器件小型化或建立多个可寻址传 感器。
一个实例是Suzuki等的″Planar lipid bilayer reconstitution with a micro-fluidic system″,Lab Chip,(4),502-505,2004。在此,开孔阵列通过 以下方法来形成:对硅基底进行蚀刻,然后进行表面处理以促进双层形 成过程,不过所公开的双层形成的成功率非常低(十分之二)。
更近的一个实例公开在Sandison等的″Air exposure technique for the formation of artificial lipid bilayers in microsystems″,Langmuir,(23), 8277-8284,2007中。其中由聚(甲基丙烯酸甲酯)制得的器件含有两个不同 的含水腔室。双层形成的再现性问题归因于从开孔中除去多余疏水性材 料的难度上,并且需要应对通过使用一时段的空气暴露以帮助双层形成 工艺而薄化前处理。
Sandison等和Suzuki等的器件都是标准涂布双层技术的小型版,两 个不同流体腔室被含有开孔的隔膜隔开,双层跨越所述开孔形成,一个 腔室先于另一个腔室被填充。这对于按比例将系统放大到大量的单独可 寻址双层而言有很多的困难,因为含水腔室中的至少一个必须是一个与 其他任何腔室没有电连接或没有离子连接关系的独特腔室。Sandison等 建造了一个带有3个流体腔室的器件,各个腔室具有独立的流体学,这 是一个难以放大至大量双层的方法。Suzuki等试图通过使用疏水性光刻 胶层在含有开孔的基底的顶部上形成小的含水腔室来解决这一问题。在 这种情况中,难以控制溶液跨越含有开孔的界面的流动,并且使用暴露 于空气的小体积使得装置容易受蒸发效应影响。在两个所引用的实例中, 对每个双层都需要使用单独的含水腔室意味着必须使用大样品体积来填 充所有的腔室。
使用支持式脂双层的生物传感器器件的一个实例公开在 US-5,234,566中。该器件是电容性的。门控离子通道响应分析物,该分析 物的结合导致离子通道门控行为的改变,并且这通过膜电容的电响应进 行测量。为了支持脂双层,在金电极上使用烷硫醇分子单层,这为脂质 单层在上面自组装提供了支架。该单层能够引入能够用作器件的传感元 件的离子通道,如短杆菌肽。已经利用对该方法的改变来在电极表面上 形成锚定脂双层从而引入其它膜蛋白。然而,该方法具有很多的缺点, 首先是在脂双层(通常为1nm至10nm厚度的量级)下方所存在的少量含 水体积不含有足够的离子来在任何有用时段进行直流测量。这是几乎所 有在固体支持体上的锚定脂双层系统所共有的效应。对于任何有意义阶 段的记录,必须使用交流测量来克服电极处的离子消耗,但这限制了器 件的敏感性。
使用支持式脂双层的生物传感器的实例公开在Urisu等的″Formation of high-resistance supported lipid bilayer on the surface of a silicon substrate with microelectrodes″,Nanomedicine,2005,(1),317-322中。该器件采用在 磷脂分子和SiO 2 表面之间的强表面附着以形成支持式双层。使用在硅芯 片制造中常见的蚀刻技术对二氧化硅表面进行改性,以将小通道暴露于 电极表面。然后在二氧化硅表面形成双层,得到数MΩ的电阻。在该系 统中,通过这种工艺形成的阱(well)不能单独寻址。
在两个使用支持式脂双层的引用实例中,使用这些方法非常难以形 成高阻封。虽然阻抗可足以观测到由大量离子通道产生的变化,但是使用 这种方法,固有更高敏感性的单通道或随机测量具有难以估量的挑战性。
在这些文档中的支持式双层方法存在很多问题,总而言之,这些问 题使得这种系统不适用。第一个问题在于双层膜的通常为约100MΩ的 阻抗。虽然这对于在高蛋白浓度时检测蛋白行为是适用的,但是对基于 单分子传感的高保真试验(通常要求至少1GΩ的阻抗)和一些高出一或两 个量级的应用而言是不够的。第二个问题是陷于双层和固体支持体之间 的短距离(通常为1nm量级)的小体积溶液。这样的小体积不会含有较多 的离子,影响跨越双层的电位稳定性并限制了记录的持续时间。
已经提出很多方法来克服固体支持式双层所存在的问题。一种选择 是在双层和表面之间引入化学连接,或引入小的聚乙二醇层(聚合物衬垫 双层),或对脂质进行化学改性以包含小的亲水性连接并与表面发生反应 以为囊泡沉积提供支架(锚定双层)。虽然这些方法增加了脂双层下方的离 子库,但是它们不便实施并且几乎不能减少跨越双层的电流渗漏。
在硅芯片行业使用的技术提供了可产生能够用于生物传感器应用的 大量电极的诱人技术。这种方法公开在有关的申请US-7,144,486和 US-7,169,272中。US-7,144,486公开了含有蚀刻到绝缘体材料层中的微腔 的微电极器件的制造方法。据说该器件的电化学应用广泛,其中空腔中 的电极可测量电信号。薄膜据称可以跨越空腔悬置。提到了若干种类型的 膜(包括作为脂双层的膜)。然而,这仅仅是一种提议,并且没有用于形成 脂双层的任何技术的公开内容,也没有这种膜的实验报道。实际上,确实 报道了在相同类型器件中实验形成脂双层的相关申请US-7,169,272,公开 了支持式脂双层直接以化学方式附接在电极上。这使用了与在上述Osman 等给出的那些技术类似的技术,并存在与下述相关的相同缺陷:缺少用于 随机测量的足够高的阻封和缺少用于记录跨越双层系统离子流的离子库。
总而言之,以上总结的已知技术要么给出了不能再现地实现高阻抗 的双层形成方法,要么是受限于低离子库并且不能实现长时间的直流电 测量,或者需要用于各个阵列元件的隔开的流体腔室,从而限制了将该 器件按比例扩大至高密度阵列。减少这些问题是令人期望的。
发明内容
根据本发明的第一方面,提供了一种形成分隔两个体积的水溶液的 层的方法,所述方法包括:
(a)提供包含限定腔室的元件的装置,所述元件包括其中形成有至少 一个通向所述腔室的凹槽的非导电性材料的主体,所述凹槽包含电极;
(b)跨越所述凹槽对所述主体涂布疏水性流体预处理涂料;
(c)使其中添加有两性分子的水溶液流过所述主体而覆盖所述凹槽, 从而将水溶液由所述腔室导入所述凹槽,并且使得两性分子层跨越所述 凹槽形成,从而将导入到所述凹槽中的水溶液的体积与水溶液的其余体 积隔开。
所述方法允许形成两性分子层,所述两性分子层具有对于敏感技术 如随机传感而言足够高的品质,同时使用易于实施的装置和技术。
所用装置相对简单,最重要的是涉及其中形成有至少一个凹槽的离 子性非导电材料的主体。令人惊讶的是,已经证明可以简单地通过使水 溶液跨越所述主体流动以覆盖所述凹槽,从而形成跨越所述凹槽的两性 分子层。为了实现这个目标,将疏水性流体预处理涂料涂布在跨越所述 凹槽的主体上。所述预处理涂料有助于层的形成。层的形成无需任何涉 及被隔膜分隔的两个腔室的复杂装置,并且不需要复杂的流体学排布以 实现隔离填充。这是因为所述方法不需要在将水溶液导入到以上腔室中 之前预先填充凹槽。相反,水溶液从所述腔室导入到所述凹槽中。尽管 如此,仍可以通过仅仅控制流入所述腔室中的水溶液而形成层。这样的 流动控制是一种简单实用技术。
重要的是,所述方法允许形成适合高灵敏度生物传感器应用(如随机 传感和单通道记录)的两性分子层。已经证明的是,可以形成提供高阻电 封接的高阻抗层(具有1GΩ以上,通常为至少100GΩ的电阻的高阻抗 层)。所述高阻抗层例如能够实现来自单蛋白孔的高保真随机记录。这在 实现的同时还将一定体积的水溶液陷于所述层和电极之间的凹槽中。这 保持电解质的有效供应。例如,该水溶液体积足以允许通过插入到所述 层中的膜蛋白进行稳定持续的dc电流测量。这与上述使用支持式脂双层 的已知技术显著不同。
另外,该装置的简单构造允许形成具有多凹槽阵列并允许跨越各凹 槽的层是电分离的并使用其自身的电极单独寻址的小型化装置,这样小 型化阵列等效于许多平行测量检验样品的单独传感器。所述凹槽可以相 对紧密地包装,从而允许针对给定体积的检测样品使用大量的层。可以 通过对各个电极提供单独接触器来实现单独寻址,对此使用现代的微制 造技术例如光刻(lithography)是简单的。
另外,所述方法可使用非常简单的技术在跨域阵列中的多个凹槽的 单装置内形成多层两性分子层。
在绝大多数应用中,随后将一种或多种膜蛋白插入到所述层中。能 够用于本发明的某些膜蛋白将在下文进行更加详细的讨论。
根据本发明的另一方面,提供了适合于执行形成两性分子层的所述 方法的装置。
现在将说明本发明的更加详细和优选的特征。
两性分子通常是脂质。在这种情况中,所述层是由两个相对的脂质 单层形成的双层。所述脂质可以包含一种或多种脂质。所述脂双层还可 以包含影响所述双层的性能的添加剂。下文将更加详细地说明可以用于 本发明的某些脂质和其他两性分子和添加剂。
可以使用各种技术将两性分子添加到所述水溶液中。
第一种技术在将水溶液导入到所述腔室之前在所述装置外简单地将 两性分子添加到水溶液中。
具有特定优点的第二种技术是在将所述水溶液导入到所述腔室之 前,将两性分子沉积在所述腔室的内表面上,或沉积在所述水溶液的流 路内,例如沉积在与入口连接的流体入口管道内。在这种情况下,所述 水溶液在步骤(c)的过程中覆盖在所述内表面,由此将所述两性分子添加 到水溶液中。通过这种方式,使用水溶液来从所述内表面收集所述两性 分子。所述两性分子的这种沉积具有若干优点。其允许在没有大量的有 机溶剂的情况下形成两性分子层,而如果将所述两性分子直接添加到所 述水溶液中,则通常就会存在大量有机溶剂。这意味着不需要在所述层 可以形成之前等待有机溶剂的蒸发。另外,这意味着所述装置不需要由 对有机溶剂不敏感的材料制得。例如,可以使用有机类粘合剂,并且可 以使用丝网印刷导电银/氯化银浆料来构造电极。
有利的是,可以干燥所沉积的两性分子。在这种情况下,使用水溶 液来使所述两性分子再水合。这允许所述两性分子在使用前稳定地储存 在所述装置中。还避免需要对两性分子进行湿式储存。两性分子的这种 干式储存延长了所述装置的保存寿命。
若干种技术可以用于将膜蛋白插入到所述两性分子层中。
第一种技术是简单地将膜蛋白添加到所述水溶液中,由此使膜蛋白 自发地插入到两性分子层中。可以在将所述水溶液导入到所述腔室中前, 将膜蛋白在装置外添加到水溶液中。作为另一种选择,可以在将水溶液 导入所述腔室之前,将膜蛋白沉积到所述腔室的内表面上。在这种情况 中,所述水溶液在步骤(c)的过程中覆盖所述内表面,由此将膜蛋白添加 到所述水溶液中。
第二种技术是使所述水溶液具有包含添加到其中的膜蛋白的囊泡, 由此在囊泡与两性分子层融合时插入膜蛋白。
第三种技术是通过将膜蛋白携带到所述探针上的层(例如琼脂尖棒) 上来插入膜蛋白。
为了形成两性分子层,使所述水溶液流过所述主体以覆盖所述凹槽。 如果采用其中在最后一次覆盖所述凹槽之前使水溶液覆盖和露出所述凹 槽至少一次的多通过技术(multi-pass technique),则形成得到改善。据认 为,这是因为在所述凹槽中至少留下一些所述水溶液,这在随后的通过 中有助于层的形成。
预处理涂料是可通过增加两性分子与所述主体在所述凹槽周围的表 面的亲合力而有助于层的形成的疏水性流体。一般而言,可以使用对围 绕所述开孔的表面进行表面改性以增加其与脂质的亲合力的任何预处 理。能用于本发明的用于预处理涂料的某些材料将在下文中详细讨论。
为了有助于预处理涂料的铺展,可以是疏水性的表面包括以下任一 或优选二者:(a)所述主体在所述凹槽周围的最外表面,和(b)延伸自所述 凹槽的边缘的所述凹槽的内表面的至少外面部分。这可以通过制得带有 由疏水性材料形成的最外层的所述主体来实现。
实现该目的的另一种方法是在制造所述装置的过程中利用氟物质 (如氟自由基)例如通过氟等离子体处理等处理所述表面。
预处理涂料的应用可以留下多余的覆盖包含在所述凹槽中的所述电 极的疏水性流体。这可能通过降低离子流使电极绝缘,从而降低所述装 置在测量电信号时的敏感性。然而,可以使用各种技术使该问题最小化。
第一种技术是跨域所述凹槽中的电极和所述腔室中的所述另外的电 极施加电压,该电压足以降低覆盖包含在所述凹槽中的所述电极的多余 疏水性流体的量。如此产生与电润湿类似的效果。使水溶液跨越所述主 体流过以覆盖所述凹槽从而使得水溶液流进所述凹槽,之后施加电压。 由于电压会破坏任何跨越所述凹槽形成的层,因此随后所述水溶液流动 而露出所述凹槽,然后其中添加有两性分子的水溶液跨越所述主体流动 而重新覆盖所述凹槽,从而使得两性分子层跨越所述凹槽形成。
第二种技术是使所述凹槽的内表面的里面部分具有亲水性。通常, 这将与如下方法结合使用:使凹槽的内表面的外面部分具有疏水性。这 可以通过制备带有由亲水性材料形成的内层和由疏水性材料形成的最外 层的主体来实现。
第三种技术是在电极表面上设置亲水性表面(例如设置保护材料),该 亲水性表面在允许从水溶液到电极的离子传导的同时排斥步骤(c)中施加 的疏水性流体。保护材料可以是导电性聚合物,例如聚吡咯/聚苯乙烯磺酸 酯。作为另一种选择,保护材料可以是共价连接的亲水性物质如硫醇-PEG。
一般而言,在所述装置中可以采用很多结构性特征以形成非导电性 材料的主体、其中形成的所述至少一个凹槽和限定所述腔室的其它元件。 实例将在下文作更详细的说明。
根据本发明的第二方面,提供了一种改善凹槽中的电极在执行电生 理学测量中的性能的方法,所述方法包括将导电性聚合物沉积在所述电 极上。
进一步根据本发明的第二方面,提供了一种用于执行电生理学测量 的装置,所述装置包括具有凹槽的主体,所述凹槽中设置有电极,其中, 在所述电极上设置导电性聚合物。
已经发现,在凹槽中的电极上设置导电性聚合物可以改善电极在执 行电生理学测量中的性能。一个优点是改善电极作为用于执行电生理学 测量的稳定电极的性能。另一个优点是增加凹槽内的电极可以获得的电 荷库而无需增加包含在凹槽中的水溶液的体积。
附图说明
为了更好地理解,现在将通过非限定性实施例并参考附图说明本发 明的实施方式,其中:
图1是装置的透视图;
图2是图1的装置沿图1的II-II线截取的截面图,并示出水溶液的 导入;
图3是类似于图2的装置截面图,但是示出充满水溶液的装置;
图4是在电化学电极改性过程中装置中的凹槽的系列局部截面图;
图5是用CO 2 激光打孔形成的凹槽的SEM图;
图6是使用光刻法形成的凹槽的OM图;
图7a和7b分别是使用光刻法形成的凹槽的3D和2D LP图;
图8a和8b分别是在电镀后使用光刻法形成的凹槽的3D和2D LP图;
图9是涂布有预处理涂料的装置的凹槽的局部截面图;
图10a至10e是在除去多余预处理涂料的方法过程中,装置中的凹 槽的系列局部截面图;
图11是在主体具有多个另外的层的装置中的凹槽的局部截面图;
图12是电路图;
图13是装置和安装在印刷电路板上的电路的立体图;
图14是平行获取多个信号的电路图;
图15是对干式装置的施加电位和电流响应的图;
图16是对湿式装置的施加电位和电流响应的图;
图17是对装置电润湿时的施加电位和电流响应的图;
图18是形成两性分子层时的施加电位和电流响应的图;
图19至22是各种不同装置的施加电位和电流响应的图;
图23至25是具有多个凹槽的改进型装置中的另外的层的平面图;
图26至28是具有多个凹槽的改进型装置的基底的平面图;
图29和30是具有多个凹槽的两个不同装置的电流响应的图;
图31是改进型装置的一部分的截面图;
图32是另一个改进型装置的截面图;
图33是装置制造方法的流程图;
图34a和34b是具有经聚吡咯电聚合改性的电极的凹槽的通过轮廓 测定法得到的3D和2D表面图;
图35是在具有经聚吡咯电聚合改性的电极的凹槽阵列上记录的电 流图。
具体实施方式
可以用于形成两性分子层的装置1显示在图1中。
装置1包括具有如图2和3所示的分层结构的主体2,包括非导电 性材料的基底3,所述基底3支持也是非导电性材料的另外的层4。在一 般情况下,如下文进一步描述的,可以有多个另外的层4。
凹槽5形成于另外的层4中,尤其是作为延伸通过另外的层4到达 基底3的开孔。在一般情况下,如下文进一步描述的,可以有多个凹槽5。
装置1进一步包括在主体2上方延伸的封套6。封套6是中空的并 限定腔室7,除了各自由穿过封套6的开口形成的入口8和出口9之外, 腔室7都是封闭的。腔室7的最底壁由图2中另外的层4形成,但是作 为另一种选择,可以将另外的层4形成为提供侧壁。
如下文进一步描述的,使用时,水溶液10被导入到腔室7中,两性 分子层11跨越凹槽5形成,将凹槽5中的水溶液10与腔室7中的其余 体积的水溶液隔开。装置包括下述电极排布以允许测量跨越两性分子层 11的电信号。
使用封闭的腔室7使得非常容易使水溶液10流入和流出腔室7。这 可以简单通过如下方法进行:如图2所示使水溶液10通过入口8流入直 至如图3所示腔室7充满。在这个过程中,腔室7中的气体(通常为空气) 被水溶液10所置换,并通过出口9排出。例如,可以使用附接到入口8 的单流体系统。这可以像活塞那么简单,不过可以使用更为复杂的系统 来改善控制。然而,腔室7无需封闭,而是可以打开,例如通过将主体2 形成为杯状物。
基底3具有沉积在基底3上表面上并在另外的层4下方延伸至凹槽 5的第一导电层20。第一导电层20在凹槽5下方的部分构成电极21,该 部分还形成凹槽5的最底面。第一导电层20延伸到另外的层4的外部, 使得第一导电层20的一部分暴露并构成接触器22。
另外的层4的上面沉积有在封套6下方延伸进入腔室7的第二导电 层23,第二导电层23在腔室7内的部分构成电极24。第二导电层23延 伸到封套6外部,使得第二导电层23的一部分暴露并构成接触器25。
电极21和24与凹槽5和腔室7中的水溶液电连接。这允许通过将 电路26与接触器22和25连接来测量跨越两性分子层11的电信号。电 路26可以具有基本上与常规用于执行跨越形成于常规小室中的脂双层 (使用Montal和Mueller的方法)的随机传感的常规电路相同的结构。
电路26的设计实例如图12所示。电路26的主要功能是测量电极 21和24之间形成的电流信号以对使用者提供有意义的输出信息。这可以 简单地是测量信号的输出信息,但是原则上还可以包括信号的进一步分 析。电路26要求充分灵敏以检测并分析通常非常低的电流。举例说明, 一个开放膜蛋白在1M盐溶液的情况中一般可能通过100pA至200pA的 电流。
在本实施中,腔室7中的电极24用作参比电极,而凹槽5中的电极 21用作工作电极。因此,相对于其本身是虚拟地电位(virtual ground potential)并将电流信号供应到电路26的电极21,电路26为电极24提供 了偏压电位。
电路26具有偏压电路40,该偏压电路40与腔室7中的电极24连 接并被排布以施加有效显示跨越两个电极21和24的偏压。
电路26还具有放大电路41,该放大电路41与凹槽5中的电极21 连接,用于放大显示跨越两个电极21和24的电流信号。通常,放大电 路41由两个放大级42和43组成。
输入放大级42与电极21连接,将电流信号转换成电压信号。
输入放大级42可以包含跨阻抗放大器,如构造成带有高阻抗反馈电 阻器(例如具有500MΩ)的反相放大器的静电计运算放大器,以提供放大 通常具有约数十至数百皮安量级的电流信号所需的增益。
作为另一种选择,输入放大级42可以包含开关积分放大器(switched integrator amplifier)。这对于非常小的信号是优选的,因为反馈元件是电 容器并且基本没有噪音。另外,开关积分放大器具有更大的带宽容量。 然而,由于在输出饱和发生之前需要重置积分器,因而积分器具有死时 间。这样的死时间可以降低至约一个微秒,因此如果所要求的取样速度 非常高的话,这不具有重要性。如果所要求的带宽较小的话,跨阻抗放 大器更为简单。一般而言,开关积分放大器输出信息是在每个取样周期 期末采样,然后重置脉冲。可以使用其他技术来对积分起点进行取样, 从而消除系统中的小误差。
第二放大级43放大并过滤经第一放大级42输出的电压信号。第二 放大级43提供足够的增益以提升信号至足够的级别以便在数据采集单元 44中进行处理。以在第一放大级42中的500MΩ反馈阻抗为例,第二放 大级43的输入电压(假如为典型的100pA级别的电流信号)将是50mV 级别,并且在这种情况中,第二放大级43必须提供50的增益以将50mV 信号范围提高到2.5V。
电路26包括数据采集单元44,该数据采集单元44可以是运行适当 程序的微处理器,或者可以包括专用硬件。数据采集单元44可以是待插 入到计算机45(如台式计算机或便携式计算机)中的插卡。在这种情况中, 偏压电路40通过从数字模拟转换器46提供有信号的反相放大器简单形 成,所述数字模拟转换器46可以是专用器件或者是数据采集单元44的 一部分,其根据从软件装载到数据采集单元44中的编码提供电压输出信 号。类似的,来自放大电路41的信号通过数字模拟转换器47提供到数 据采集卡40。
电路26的各种不同组件可以通过独立组件形成,或者可以将任何组 件集成到常见半导体芯片中。电路26的组件可以通过排布在印刷电路板 上的组件来形成。这种情况的实例如图13所示,其中,装置1结合到印 刷电路板50上,铝线51从接触器22和25连接到印刷电路板上的轨道 52。整合电路26的芯片53也结合到印刷电路板50上。作为另一种选择, 装置1和电路板26可以安装在分开的印刷电路板上。
在装置1含有多个凹槽5的情况中,每个凹槽5具有各自的电极21, 然后通过复制用于各个电极21的放大器电路41和A/D转换器47而对电 路26进行必要的改进,以允许从各个凹槽5平行采集信号。在输入放大 级42包含开关积分器的情况下,则这些开关积分器需要数字控制系统处 理取样保持信号并重置积分器信号。最常见的是,数字控制系统构造在 现场可编程门阵列器件(FPGA)上。另外,FPGA可以集成与标准通信协 议(即USB和以太网)接口所需的拟处理器函数和逻辑。
图14示出电路26的可能结构并排布如下。装置1的各电极21通过 互连器(interconnection)55与电路26连接(例如图13的配置中的铝线51 和印刷电路板)。在电路26中,放大电路41可以形成于具有多通道的一 个或多个放大器芯片56中。来自不同电极21的信号可以在不同通道上, 也可以在同一通道上多路混合在一起。所述一个或多个放大器芯片56的 输出信号通过A/D转化器47输送至可编程逻辑器件57,以接收各个通 道上的信号。例如,为了处理来自具有1024个凹槽的装置的信号,可编 程逻辑器件57可以以10兆比特/秒的级别的速度运行。可编程逻辑器件 57通过接口58(例如USB接口)连接到计算机59上,以将信号输送至计 算机59中进行贮存、显示和进一步分析。
在使用过程中,装置1可以封闭在法拉第笼(Faraday cage)中以减少 干扰。
现在将讨论装置1的组件的材料。装置1的各组件的材料由能够在 操作过程中正确运行所需的性能来决定,但是还考虑成本和制造输出量。 所有材料应该被选择来提供足够的机械强度从而允许健壮处理(robust handling),并且表面适于与随后的层结合。
选择基底3的材料来为装置1的其他部分提供刚性支持。在有多个 凹槽5时,还选择材料来提供相邻电极21之间的高电阻和低电容电绝缘。 可能的材料包括但不限于:聚酯(例如Mylar)、或另外的聚合物;或硅、 氮化硅、或二氧化硅。例如,基底可以包含带有热生长氧化物表面层的 硅晶片。
另外的层4(或者,一般情况下是多个层)的材料应该选择提供电极21 与24之间的高电阻和低电容电绝缘,并且当有多个凹槽5时,还提供相 邻凹槽5的电极21和24之间的高电阻和低电容电绝缘。此外,另外的 层4的表面对在操作前(如下讨论)前所涂布的预处理涂料和对水溶液10 应当具有化学稳定性。最后,另外的层4应当具有机械稳固性,以保持 其结构完整性和对第一导电层20的覆盖度,并且应该适合于封套6随后 的附接。
下文列出用于另外的层4的可能材料,以及已经在实验中得到成功 使用的厚度,但是不限于这些厚度:各种不同厚度的光刻胶(如SU8光刻 胶或Cyclotene);聚碳酸酯,6μm厚的膜;聚氯乙烯,7μm厚的膜;聚 酯,50μm厚的膜;涂有粘合剂的聚酯,25μm和50μm厚的膜;热层压 膜,例如厚度为15μm的Magicard和厚度为35μm的Murodigital;或丝 网印刷电介墨(dielectric ink)。
有利的是,包括下述(a)和(b)在内的表面是疏水性的:(a)主体2围绕 凹槽的最外表面,(b)凹槽5从凹槽5的边缘延伸的内表面的外面部分。 这有助于预处理涂料的铺展,因而也有助于形成脂双层。实现这一目的 的一种具体方法是利用氟物质改性这些表面。这类氟物质是任何能够改 性所述表面以提供含氟层的物质。氟物质优选为含有氟自由基的氟物质。 例如,可以在制造过程中通过用氟等离子体(例如CF 4 )处理主体2来实现 改性。
现在将进一步讨论导电层20和23。
电极21和24的材料应该提供与水溶液10接触的电化学电极,从而 能够测量低电流,并且应当对预处理涂料和水溶液10具有稳定性。导电 层20和23的其他部分的材料(通常不需要与电极21和24的相同)还提供 从电极到接触器22和25的电导。第一导电层20还能够承受与另外的层 4的结合。可以通过多个重叠层和/或适当的表面处理来构造导电层20和 23。一种可能的材料是铂,在暴露于检测溶液的区域涂有银,然后在银 的上面形成氯化银。用于第一导电层20的可能材料包括但不限于:银/ 氯化银电极墨;带有或不带有表面层的银,所述表面层例如为通过氯化 形成的氯化银或通过氟化形成的氟化银;在溶液中具有或不具有氧化还 原对的金;在溶液中具有或不具有氧化还原对的铂;在溶液中具有和不 具有氧化还原对的ITO;电化学涂布有导电性聚合物电解质的金;或电 化学涂布有导电性聚合物电解质的铂。用于第二导电层23的可能材料包 括但不限于:银/氯化银电极墨;银线;或氯化银线。
一些具体的实例包括:基底3为硅,并且导电层20为隐埋在二氧化 硅绝缘层(例如使用典型的半导体制造工艺)中的金属导体(漫射或多晶硅 线是不好的方法);基底3为玻璃,并且导电层20为金属导体(例如使用 典型的LCD显示技术);或基底3为聚合性基底,并且导电层20为消蚀 金属或印刷导体(例如使用典型的葡萄糖生物传感器技术)。
对封套6的材料要求是容易附接以形成用于腔室7的密封件,同时 与预处理涂料和水溶液10具有相容性。以下是可能的材料以及已经在实 验中成功使用的厚度,但是这些厚度不限于此:硅橡胶,0.5mm、1.0mm、 2.0mm厚度;聚酯,0.5mm厚度;或PMMA(丙烯酸类),0.5mm至2mm 厚度。
现在将讨论制造装置1的各种方法。一般而言,装置1的分层结构 是简单的,并且容易通过各种方法形成。已经实际使用的三种不同制造 技术为:聚合物膜层压法、采用高解析焊接掩模成型的印刷电路板制造 法和使用硅晶片或玻璃的光刻法。
层压法的实例如下。
基底3为250μm厚度的聚酯片材(Mylar),并且第一导电层20通过 以下任何方法沉积:丝网印刷银/氯化银电极墨;金属箔的粘附;或气相 沉积法(溅射法或蒸发法)。然后通过以下任意方法将另外的层4层压在基 底3上:压敏粘合剂;热活化粘合剂;或使用湿式银/氯化银墨作为在层 压前直接涂在电介质(dielectric)上的粘合剂(称为“涂布电极”)。在层压 到基底3之前或之后,另外的层4中形成凹槽5的开孔(5μm至100μm 直径)采用如下任意方法形成:电学放电法(瞬态放电法);或激光钻孔法(例 如利用受激准分子激光器、固态激光器或CO 2 激光器)。通过层压聚合物 膜形成的装置有时需要另外的瞬态放电步骤以在使用前活化电极。第二 导电层23通过丝网印刷形成于另外的层4的顶部上。使用压敏粘合剂将 封套6层压在顶部上。
使用硅晶片的利用光刻法的工艺的实例如下。
基底3是具有氧化表面层的硅晶片。通过沉积在基底3上的金、银、 氯化银、铂或ITO而形成第一导电层20。然后将光刻胶(例如SU8)旋涂 在基底3上以形成另外的层4。通过使用限定凹槽5形状的掩模进行UV 照射,然后去除光刻胶,从而形成具有5μm至100μm的直径的凹槽5。 例如通过丝网印刷将第二导电层23形成在另外的层4的顶部。使用压敏 粘合剂将封套6层压在顶部上。
由于允许使用标准硅晶片加工技术和材料将装置形成在硅芯片上, 因此使用这种类型的工艺的能力具有显著意义。
现在将进一步讨论电极21和24。
为了使操作稳定而可靠,电极21和24应该在所要求的低电流水平 和低的过电位下运行,并在整个测量过程中保持它们的电极电位值。另 外,电极21和24应当向电流信号中引入最少量的噪音。用于电极21和 24的可能材料包括但不限于:银/氯化银电极墨;带有或不带有表面层的 银,所述表面层例如为通过氯化形成氯化银或通过氟化形成氟化银;在 溶液中具有或不具有氧化还原对的金;在溶液中具有或不具有氧化还原 对的铂;在溶液中具有和不具有氧化还原对的ITO;电化学涂布有导电 性聚合物电解质的一氢化二钯、金;或电化学涂布有导电性聚合物电解 质的铂。
对于电极21和24的材料,银是良好的选择,但是由于其在曝光、 暴露于空气和高温时倾向于发生氧化,因此难以引入到硅晶片制造工艺 中。为了避免这个问题,可以制造凹槽中带有惰性导电材料(例如Pt或 Au)的装置,然后使用包括但不限于如下方法改变惰性导电材料的表面类 型或性质:电镀法、电聚合法、无电镀、等离子体改性、化学反应和其 他本领域已知的涂布方法。
例如使用Polk等的″Ag/AgCl microelectrodes with improved stability for microfluidics″(Sensors and Actuators B 114(2006)239-247)中方法的改 进型方法可以实现银的电镀。通过将0.41g的硝酸银添加到20ml 1M氢 氧化铵溶液中制备镀液。对其快速摇动以避免不可溶的氧化银沉淀,以 促进二胺银络合物的形成。溶液总是新配的以避免降低镀覆效率。使用 常规的设备进行镀覆,其中将电极21作为阴极连接,并且使用铂电极作 为阳极。例如,在对Pt电极镀覆的情况中,向阴极施加-0.58V电位,阳 极保持在地电位,但是在对Au电极镀覆的情况中,电位保持为-0.48V(相 对于地电位)。实验发现,对于100μm直径电极,5.1x103C/m2的目标电 荷会导致1μm至2μm的银沉积,这通常需要约60秒。
在进行这样的镀覆时,理想的是水性镀液对凹槽5的底部实现均匀 的渗透。在层4由天然疏水性材料(例如SU8光刻胶)形成的情况中,为 了确保凹槽的均匀润湿,理想的是提高亲水性的程度。实现该目的的三 种方法如下。第一种方法将脂质涂布于层4的表面,使得脂质发挥表面 活性剂的作用,从而有利于镀液的进入。第二种方法使层4暴露至氧等 离子体,所述氧等离子体活化所述层的材料并产生亲水性官能团。这将 会形成限定良好的亲水性清洁表面。第三种方法是向镀液中添加乙醇。
在电极21由银(或者实际为其它金属)制得的情况下,理想的是将电 极的外表面转化为卤化物,以使电极21有效地发挥作为稳定参比电位的 提供者的作用。在一般使用中,所用的卤化物是氯化物,因为由银向氯 化银的转化例如通过在盐酸溶液中电解可相对容易实现。避免使用可能 具有腐蚀性的酸(可能影响层4的表面状况)的替代性化学方法包括:a)在 3M氯化钠溶液中进行的扫描伏安法(sweeping voltammetry)和b)通过将电 极21浸入50mM氯化铁溶液中进行的化学蚀刻。
用于卤化的替代性卤素是氟。选择氟具有如下显著优点:氟化银层 可以在与改性主体2的表面(a)和(b)以使它们具有疏水性(如上所述)相同 的步骤中进行。例如,这可以在制造装置1的过程中通过利用氟等离子 体(例如CF 4 等离子体)处理主体2来实现。这对改性主体2的表面,尤其 是在层4是诸如SU8等光刻胶以实现足够的疏水性程度从而支持稳定脂 双层的形成时是有效的。同时,氟等离子体照射将电极21的金属转化成 金属氟化物的外层。
现在将讨论凹槽5中电极21的一些可能改动,以作为如上所述的使 用氟等离子体的替代方案。
可以对电极21进行电化学改性以改变表面类型。这允许使用具有良 好整体性质但是表面性能欠佳的另外的材料,例如金。可能的电化学表 面改性包括但不限于:银电镀、银的电化学氯化、聚合物/聚电解质的电 聚合。
进一步举例说明,一种可能的改性顺序显示在图4中,其中在由金 或铂形成的电极21上通过电化学沉积形成银的涂层37。通常可以通过使 用标准的单液体接界Ag/AgCl参比电极和铂对电极,在-0.48V在0.2M AgNO 2 、2M KI、0.5mM Na 2 S 2 O 3 中进行电镀。涂层37的典型厚度据估 计为750nm,沉积时间为约50s(秒),并且有约50μC电荷通过。然后利 用氯化法形成氯化层38,一般在+150mV在0.1M HCl中30s。
另一种可能的表面改性是涂布导电性聚合物。导电性聚合物可以是 任何具有导电性的聚合物。适当的导电性聚合物应该具有移动性电荷载 流子。通常,这种导电性聚合物会具有主链,该主链具有能够起作电荷 载流子的离域电子,从而允许聚合物导电。可以例如通过氧化还原法或 通过电化学掺杂法对导电性聚合物进行掺杂以提高其导电性。适当的导 电性聚合物包括但不限于:聚吡咯、聚乙炔、聚噻吩、聚苯撑、聚苯胺、 聚芴、聚(3-烷基噻吩)、聚四硫富瓦烯、聚萘、聚(对苯硫醚)、聚吲哚、 聚硫堇、聚乙烯二氧噻吩和聚(对苯乙炔)。
一种可能的导电性聚合物是聚吡咯,其可以例如用聚苯乙烯磺酸酯 掺杂。例如,这可以通过在与Ag/AgCl参比电极相比的+0.80V下电氧化 在0.1M KCl中的0.1M吡咯+90mM聚苯乙烯磺酸酯,从而在金电极21 上沉积。根据40mC/cm2电荷产生厚度约0.1μm的膜的假设,在30μC时 所沉积的聚合物的估计厚度为1μm。聚合过程可以表示如下,其中PE 表示聚苯乙烯磺酸酯:
使用沉积在惰性电极上的导电性聚合物例如电聚合在金或铂上的掺 杂有聚苯乙烯的聚吡咯的优点在于改善作为用于执行电生理学测量的稳 定电极的电极性能。另外的优点在于在没有增加包含在凹槽中的水溶液 的体积的情况下增加了凹槽中的电极可以利用的电荷库。这些优点在使 用凹槽中的电极(例如装置1中的电极21)执行电生理学测量时通常是可 适用的。
在装置1的凹槽5中的电极21上使用导电性聚合物的其他优点包括 但不限于:控制电极表面的亲水性质,从而帮助缓冲水溶液对电极表面 的润湿,以及相似地以在双层形成之前防止通过化学预处理将电极闭塞。
图34a和34b是通过聚吡咯的电聚合进行改性的示例性电极的通过 轮廓测定法得到的3D和2D表面图。在该实例中,电化学沉积聚合物膜 的厚度为约2μm。图35示出了通过聚吡咯的电聚合进行改性的凹槽阵列 上记录的电流,显示稳定的脂双层和来自于插入蛋白孔(protein pore)的环 糊精的单分子检测。
在所有实施方式中,第二导电层23的替代性方案是通过经过导电部 件的封套6插入而简单地形成腔室7中的电极(例如氯化银线)。
为了表征电极21,使用光学显微镜(OM)、扫描电子显微镜(SEM)和 激光轮廓测量法(LP)进行主体2中形成的凹槽5的可视化。
图5显示凹槽5的SEM图,所述凹槽5通过CO 2 激光在层压聚合物 层形成的装置1中开孔、然后施加电学放电以活化电极21从而形成。该 图表明,使用这种形成方法不能良好限定凹槽5的几何形状,周围具有 明显的表面损伤和直径的多变性,但是希望这可以通过优化激光特性得 到改善。
图6显示对光刻胶SU8的另外的层4的使用光刻法形成的凹槽5的 OM图,所述光刻胶SU8的另外的层4在硅基底3上的气相沉积金的电 极21上。类似的,图7a和7b是以类似方法制造的凹槽5的3D和2D LP 图。图8a和8b是在电镀形成银涂层38后同一凹槽5的3D和2D LP图。 这些图表明光刻法提供了对凹槽的几何形状和尺寸的高度控制。
受激准分子激光法也可产生与光刻法类似的受控几何形状。
现在将说明装置1的制造方法的实例,如图33所示。该方法的理论 基础是提供高通量的制造。这是通过加工硅晶片来实现,所述硅晶片形 成多个装置1的基底3,然后进行切割(dice)。晶片制备有绝缘层,如热 生长二氧化硅。
首先制备晶片。在步骤S1中,清洁晶片。在步骤S2中,对晶片进 行HF浸渍以改善对金属和抗蚀剂的粘合。一般条件是浸在10∶1经缓冲 的氧化物腐蚀剂中3分钟。在S3中,对晶片进行烘焙作为脱水步骤。一 般条件是在烘炉中在200℃烘焙1小时。
接着,使晶片金属化以提供各个装置1的第一导电层20。在步骤S4 中,将光刻胶旋涂在晶片上,然后对晶片进行UV光照射以形成所需的 图案。在步骤S5中,沉积导电层20,该导电层20例如由相继的Cr和 Au层组成。各自厚度通常为50nm和300nm。在步骤S6中,例如通过 浸泡在丙酮中除去抗蚀剂。
接着,形成层4和凹槽5。在步骤S7中,通过施加O 2 等离子体并 在例如烘炉中进行脱水烘焙来改善光刻胶粘合作用。在步骤S8中,晶片 上已经涂布有光刻胶,然后对其进行UV照射以形成层4和凹槽,例如, 厚度为20m的SU8-10。在步骤S9中,对凹槽进行检查和测量。
接着,镀覆电极21。在步骤S10中,通过进行O 2 等离子体除渣来 准备可用于镀覆的表面。在步骤S11中,如上所述,对电极进行银镀, 以例如形成厚度为1.5μm的镀层。
在步骤S12中,将晶片切割形成独立的装置1的主体2。
最后,用CF 4 等离子体处理主体2,如上所述,所述CF 4 等离子体改 性主体2和电极21的表面。典型照射是12分钟,70W和160毫托。
使用该方法实际制造装置1时,双层形成和孔电流稳定性的结果已 经相当于采用湿式化学手段镀覆和氯化的主体所获得的那些结果。
现在将说明采用装置1形成两性分子层11的方法。首先应当考虑可 以使用的两性分子的性质。
两性分子通常是脂质。在这种情况中,所述层是由两个相对的脂质 单层形成的双层。两个脂质单层经排布而使它们的疏水性尾部基团相互 面对以形成疏水性内部。脂质的亲水性头部基团朝外面向在双层的每一 侧的水性环境。双层可以以很多脂质相存在,包括但不限于脂质无序相(流 体层)、脂质有序相、固体有序相(层状凝胶相、相互交叉凝胶相)和平面 双层晶体(层状亚凝胶相、层状结晶相)。
可以使用形成脂双层的任意脂质。选择所述脂质使得形成具有所需 性质(如表面电荷、支持膜蛋白的能力、装填密度或机械性质)的脂双层。 所述脂质可包括一种或多种不同脂质。例如,脂质能够包含至多100种 脂质。所述脂质优选含有1种至10种脂质。脂质可以包含天然存在的脂 质和/或人造脂质。
脂质一般包含头部基团、界面部分和两个可以相同或不同的疏水性 尾部基团。适当的头部基团包括但不限于中性头部基团如二酰甘油(DG)、 神经酰胺(CM);兼性离子头部基团如磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE) 和鞘磷脂(SM);带负电荷的头部基团如磷脂酰甘油(PG);磷脂酰丝氨酸 (PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷酸(PA)和心磷脂(CA)和带正电荷的头部基团如 丙烷三甲基铵(TAP)。合适的界面部分包括但不限于天然存在的界面部 分,如甘油类部分或神经酰胺类部分。合适的疏水尾部基团包括但不限 于饱和烃链,如月桂酸(正十二烷酸)、肉豆蔻酸(正十四烷酸)、棕榈酸(正 十六烷酸)、硬脂酸(正十八烷酸)和花生酸(正二十烷酸);不饱和烃链,如 油酸(顺-9-十八碳酸)和支化烃链,如植烷酰。在不饱和烃链中,链的长度 与双键的数目和位置可以有变化。在支化烃链中,链的长度与支链如甲 基的位置和数目可以有变化。疏水尾部基团可以作为醚或酯被连接到界 面基团上。
这些脂质也可进行化学改性。可以对脂质的头部基团或尾部基团进 行化学改性。头部基团经过化学改性的合适的脂质包括但不限于PEG改 性脂质,如1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二 醇)-2000];官能化PEG脂质,如1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3磷酸乙醇胺-N-[生 物素酰(聚乙二醇)2000];和共轭改性的脂质,如1,2-二油酰基-sn-甘油-3- 磷酸乙醇胺-N-(琥珀酰)和1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(生物素 酰)。尾部基团经过化学改性的合适脂质包括但不限于,聚合性脂质,如 1,2-双(10,12-二十三联炔酸酰)-sn-甘油-3磷酸胆碱;氟化脂质,如1-棕榈 酰-2-(16-氟化棕榈酰)-sn-甘油-3-磷酸胆碱;氘化脂质,如1,2-二棕榈酰 -D62-sn-甘油-3-磷酸胆碱;和醚连接脂质,如1,2二-O-植烷酰-sn-甘油-3- 磷酸胆碱。
脂质一般包含一种或多种影响脂双层的性质的添加剂。适当的添加 剂包括但不限于脂肪酸,如棕榈酸、肉豆蔻酸和油酸;脂肪醇,如棕榈 醇、肉豆蔻醇和油醇;固醇,如胆固醇、麦角固醇、羊毛固醇、谷甾醇 和豆固醇;溶血磷脂,如1-酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱;和神经酰 胺。当要将膜蛋白插入到脂双层时,脂质优选包含胆固醇和/或麦角固醇。
然而,虽然一般用脂质来形成双层,但是预期该方法通常适用于可 以形成层的任意两性分子。
对于水溶液10,一般可以使用很多与两性分子层11的形成相容的水 溶液10。水溶液10通常是生理学上可接受的溶液。生理学上可接受的溶 液通常缓冲至pH 3至11。水溶液10的pH取决于所用的两性分子和层 11最终的应用。适当的缓冲剂包括但不限于磷酸缓冲盐水(PBS);N-2-羟 乙基哌嗪-N′-乙烷磺酸(HEPES)缓冲盐水;哌嗪-1,4-双-2-乙烷磺酸(PIPES) 缓冲盐水;3-(n-吗啉)丙烷磺酸(MOPS)缓冲盐水;和三(羟甲基)氨基甲烷 (TRIS)缓冲盐水。举例说明,在一个实施方式中,水溶液10可以是含有 1.0氯化钠(NaCl)并且pH为6.9的10mM PBS。
装置1的使用方法如下。
首先,预处理涂料30涂布在跨越凹槽5的主体2上,如图9所示。 预处理涂料30是可改性主体2围绕凹槽5的表面以提高其与两性分子的 亲合力的疏水性流体。
预处理涂料30一般是在有机溶剂中的通常具有长链分子的有机物 质。适当的有机物质包括但不限于:正癸烷、十六烷、异二十烷、鲨烯、 氟化油(适合与氟化脂质一起使用)、烷基硅烷(适合与玻璃膜一起使用)和 烷基硫醇(适合与金属膜一起使用)。合适的溶剂包括但不限于:戊烷、己 烷、庚烷、辛烷、癸烷和甲苯。该材料通常可以为1.0μl至10μl在戊烷 或其他溶剂中的0.1体积%至50体积%十六烷,例如2μl在戊烷或其他 溶剂中的1体积%的十六烷,在该情况中,可以以0.6mg/ml的浓度包含 诸如二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPhPC)等脂质。
预处理涂料30所用的一些具体材料通过举例方式(而非限定方式)列 在表1中。
表1:
预处理涂料30可以以任何适当的方式涂布,例如通过毛细吸管简单 地进行涂布。预处理涂料30可以在封套6附接到装置1上之前或之后进 行涂布。
所需的预处理涂料30的材料的精确体积取决于凹槽5的尺寸、材料 的配制和其在开孔周围干燥的时的量和分布。一般而言,增加量(体积和/ 或浓度)会改善效力,不过过多的材料可能覆盖电极21(如下所讨论的)。 随着凹槽5的直径的减小,所需的预处理涂料30的材料的量也会变化。 预处理涂料30的分布也能够影响效力,这取决于沉积方法和膜表面化学 的相容性。虽然预处理涂料30与层形成的容易性和稳定性之间的关系是 复杂的,但是容易通过常规的试错法优化用量。在另一种方法中,腔室7 可以被在溶剂中的预处理物所完全填充,然后除去多余的溶剂,并用气 流干燥。
预处理涂料30跨越凹槽5涂布。结果如图9所示,预处理涂料30 覆盖在主体2跨越凹槽5的表面上。预处理涂料30还延伸到凹槽5的边 缘,并且有利的是,至少覆盖凹槽5的侧壁的最外部分。这有助于跨越 凹槽5形成两性分子层11。
然而,预处理涂料30在涂布过程中还具有覆盖电极21的自然趋势。 这是不利的,因为预处理涂料30降低了电流向电极21的流动,因此减 少了电信号测量的灵敏性,在最坏的情况下,完全阻止了所有的测量。 可以采用很多不同的技术来减轻或避免这个问题,在说明两性分子层11 的形成之后将讨论这些技术。
在涂布预处理涂料30后,使水溶液10流过主体2以覆盖凹槽5(如 图3所示)。这一步骤采用添加到水溶液10的两性分子进行。已经证实, 采用适当的预处理涂料30,这可以跨越凹槽5形成两性分子层11。如果 采用多通过技术,则形成可以得到改善,在所述多通过技术中水溶液10 在最后一次覆盖凹槽5之前至少覆盖和露出凹槽5一次。据认为这是因 为至少一些水溶液留在凹槽5中,这样有助于在随后通过中形成层11。 尽管如此,应当注意的是,层11的形成是可靠而可再现的。纵然是这样 的,事实是使水溶液10通过腔室7流过主体2的实际技术是非常容易实 施的。如下所述,通过监测跨越电极21和24的所得电信号可以观察到 层11的形成。即便层11不能形成,进行水溶液10的再一次通过也是一 件简单的事情。这种使用简单的方法和相对简单的装置1使两性分子层 11可靠地形成是本发明特别有利之处。
另外,已经证实,两性分子层11具有高品质,尤其适合于高灵敏度 生物传感器应用,如随机传感和单通道记录。层11具有高阻抗,从而提 供高电阻电封接,具有1GΩ以上的电阻,一般至少100GΩ,这例如能 够实现来自单蛋白孔的高保真随机记录。
实现本目的的同时,使一定体积的水溶液10陷于层11和电极21之 间的凹槽5中。这保持电解质的大量供应。例如,所述体积的水溶液10 足以允许通过插入到所述层中的膜蛋白进行稳定持续的直流电测量。
证明这些优点的实验结果在后文给出。
如下,存在将两性分子添加到水溶液10中的各种不同技术。
第一种技术是在将水溶液10导入到腔室7之前,将两性分子简单地 添加到装置1外的水溶液10中。
具有特别优点的第二种技术是在将水溶液10导入到腔室7之前,将 两性分子沉积在腔室7的内表面上,或者沉积在水溶液10到腔室7中的 流路内的内表面上,例如沉积在与入口连接的流体入口管内。两性分子 可以沉积在腔室7的内表面中的任何一个或多个表面上,包括另外的层4 或封套6的表面上。水溶液10在其导入的过程中覆盖所述内表面,从而 将两性分子添加到水溶液10中。采用这种方法,使用水溶液10从内表 面收集两性分子。水溶液10可以以任何顺序覆盖两性分子和凹槽5,但 是优选先覆盖两性分子。如果两性分子先被覆盖,则两性分子沿着入口8 和凹槽5之间的流路沉积。
可以使用任何方法来将脂质沉积在腔室7的内表面上。适当的方法 包括但不限于载体溶剂的蒸发或升华,脂质体或囊泡从溶液中的自发沉 积以及干燥脂质从另外表面的直接转移。可以使用以下方法制造在内表 面上沉积有脂质的装置1,这些方法包括但不限于:滴涂法、各种印刷技 术、旋涂法、漆涂法、浸涂法和气溶胶涂布法。
优选干燥所沉积的两性分子。在这种情况下,使用水溶液10使两性 分子再水合。这使两性分子在使用前稳定贮藏在装置1中。还可以避免 两性分子进行湿式贮藏的必要。两性分子的这种干式贮藏提高了装置的 保存期限。即使在干燥至固态时,两性分子一般也将含有痕量的残留溶 剂。干燥的脂质优选为所包含的溶剂小于50重量%(例如小于40重量%、 小于30重量%、小于20重量%、小于15重量%、小于10重量%或小于 5重量%)的脂质。
在绝大多数实际应用中,膜蛋白插入到两性分子层11中。有若干种 方法可以实现本目的。
第一种技术是简单地在水溶液10中添加膜蛋白,由此在一段时间后 膜蛋白自发插入到两性分子层11中。可以在将水溶液10导入腔室7之 前,将膜蛋白添加到装置1外部的水溶液10中。作为另一种选择,可以 在层11形成之后添加膜蛋白。
将膜蛋白添加到水溶液10中的另一种方法是将其沉积在腔室7的内 表面上,然后将水溶液10导入到腔室7中。在这种情况下,水溶液10 在其导入的过程中覆盖所述内表面,由此使膜蛋白添加到水溶液10中, 然后将自发插入到层11中。可以将膜蛋白沉积在腔室7的内表面中的任 何一个或多个表面上,包括另外的层4或封套6的表面上。膜蛋白可以 沉积在与两性分子(如果也沉积的话)相同或不同的内表面上。两性分子和 膜蛋白可以混合在一起。
可以使用任何方法将膜蛋白沉积在腔室7的内表面上。适当的方法 包括但不限于:滴涂法、各种印刷技术、旋涂法、漆涂法、浸涂法和气 溶胶涂布法。
优选干燥膜蛋白。在这种情况下,使用水溶液10使膜蛋白再水合。 即使在干燥至固态时,膜蛋白一般也将含有痕量的残留溶剂。干燥的膜 蛋白优选为所包含的溶剂低于20重量%(例如小于15重量%、小于10重 量%或小于5重量%)的膜蛋白。
第二种技术是使水溶液10具有其中添加有膜蛋白的囊泡,由此使膜 蛋白在囊泡与两性分子层11融合时插入。
第三种技术是使用WO 2006/100484中所披露的技术,通过将膜蛋白 携带在探针(例如琼脂尖棒)上的层11来插入膜蛋白。在装置具有凹槽阵 列的情况下,探针的使用可以有助于将不同的膜蛋白选择性地插入到不 同的层11中。然而,这需要对装置1进行改进以容纳探针。
可以沉积任何可插入到脂双层中的膜蛋白。膜蛋白可是是天然存在 的蛋白和/或人造蛋白。适当的膜蛋白包括但不限于:β-桶形膜蛋白,如 毒素、孔蛋白和相关蛋白以及自动转运体;膜通道蛋白,如离子通道蛋 白和水通道蛋白;细菌性视紫红质;G-蛋白偶联受体;和抗体。非组成 型毒素的实例包括溶血素和杀白细胞素,如葡萄球菌杀白细胞素。孔蛋 白的实例包括炭疽保护性抗原、麦芽糖孔蛋白、OmpG、OmpA和OmpF。 自动转运体的实例包括NalP和Hia转运体。离子通道蛋白的实例包括 NMDA受体和来自浅青紫链霉菌(Streptomyces lividan)的钾通道蛋白 (KcsA)、具有大电导率的细菌性机械敏感型膜通道蛋白(MscL)、具有小 的电导率的细菌性机械敏感型膜通道蛋白(MscS)和短杆菌肽。G蛋白偶 联受体的实例包括:代谢型谷氨酸受体。所述膜蛋白还可以是炭疽保护 性抗原。
膜蛋白优选包括α-溶血素或其变体。α-溶血素孔由7个相同的亚基 形成(七聚体)。编码α-溶血素的1个亚基的多核苷酸序列显示在SEQ ID NO:1中。α-溶血素的1个亚基的全长氨基酸序列显示在SEQ ID NO:2中。 SEQ ID NO:2的前26个氨基酸对应于信号肽。不带信号肽的α-溶血素的 1个成熟亚基的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:3中。SEQ ID NO:3在位置 1具有甲硫氨酸残基,而不是在SEQ ID NO:2中所出现的26个氨基酸的 信号肽。
变体是这样的七聚体孔:其中7个亚基中的一个或多个具有不同于 SEQ ID NO:2或3且保持孔活性的氨基酸序列。α-溶血素变体中的1、2、 3、4、5、6或7个亚基可以具有不同于SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列。 变体孔内的7个亚基通常是相同的,但是也可以不同。
变体可以是由生物体例如葡萄球菌表达的天然存在的变体。变体还 可以包括由重组技术产生的非天然存在的变体。在SEQ ID NO:2或3的 氨基酸序列的整个长度上,基于氨基酸同一性,变体优选与该序列具有 至少50%的同源性。更优选的是,基于氨基酸同一性,亚基多肽与SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列在整个长度上具有至少80%、至少90%、至少 95%、至少98%、至少99%的同源性。
可以对SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列进行氨基酸取代,例如可以 进行单氨基酸取代或者两个或更多个取代。也可以进行保守取代,例如 根据下表进行保守取代。在第2列同一框内的氨基酸(优选在第3列的同 一行中的氨基酸)可以相互取代。
也可以在SEQ ID NO:2或3内的一个或多个位置进行非保守取代, 其中被取代的残基被化学性质和/或物理尺寸明显不同的氨基酸所替换。 可以进行的非保守取代中的一个实例是SEQ ID NO:2中第34位和SEQ ID NO:3中第9位赖氨酸由半胱氨酸替换(即K34C或K9C)。可以进行的 非保守取代中的另一个实例是SEQ ID NO:2的第43位和SEQ ID NO:3 的第18位的天冬酰胺残基由半胱氨酸替换(即N43C或N17C)。在SEQ ID NO:2或3内包含这些半胱氨酸在相关位置提供了巯基连接点。在相同亚 基上的所有其他位置以及多个位置都可以进行类似的改变。
可以选择或另外地缺失SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列的一个或多 个氨基酸残基。至多50%的残基可以作为分布在氨基酸链的整个长度上 的连续区域或多个小区域发生缺失。
变体可以包括由SEQ ID NO:2或3的片段制得的亚基。所述片段保 留它们插入到脂双层中的能力。片段在长度上可以是至少100(例如150、 200或250)个氨基酸。所述片段可以用来形成嵌合孔。片段优选包含SEQ ID NO:2或3的β-桶域。
变体包括包含SEQ ID NO:2或3的片段或部分的嵌合蛋白。嵌合蛋 白由各自包含SEQ ID NO:2或3的片段或部分的亚基形成。嵌合蛋白的 β-桶部分一般由SEQ ID NO:2或3的片段或部分形成。
作为另外一种选择或附加性地,可以将一个或多个氨基酸残基插入 到SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列中,或插入在SEQ ID NO:2或3的氨 基酸序列的任意一端或两端。将一个、两个或更多个另外的氨基酸插入 到肽序列的C末端较不太可能影响到蛋白的结构和/或功能,这些添加可 以是大量的,但是优选可以使用至多10、20、50、100或500或更多个 氨基酸的肽序列。在单体N末端的添加也可以是大量的,增加1个、2 个或更多个另外的残基,但是更优选添加10、20、50、500或更多个残 基。还可以将额外的序列添加到蛋白的SEQ ID NO:3的残基119至139 之间的跨膜区域中。更精确而言,可以在除去残基128和129之后,将 额外的序列添加到SEQ ID NO:3的残基127至130之间。添加可以在SEQ ID NO:2的等效位置进行。可以将载体蛋白与本发明的氨基酸序列融合。
可以采用本领域的标准方法来测定同源性。例如,UWGCG包提供 了能够用来计算同源性的BESTFIT程序,例如按照其默认设置使用 ((Devereux等(1984)Nucleic Acids Research 12,387页-395页)。可以使用 PILEUP和BLAST算法来计算同源性或排列序列(例如(一般根据它们的 默认设置)鉴定等效残基或相应的序列),如Altschul S.F.(1993)J MoI Evol 36:290-300;Altschul,S.F等(1990)J MoI Biol 215:403-10所述。用于执行 BLAST分析的软件可以从National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。
可以使用显示标记(revealing label)来标记膜蛋白。显示标记可以是任 何使蛋白能够被检测到的适当标记。适当的标记包括但不限于荧光分子、 放射性同位素(如125I、35S)、酶、抗体、多核苷酸和接头如生物素。
膜蛋白可以从生物体例如金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)中 分离,或者通过合成制得,或通过重组手段制得。例如,可以通过体外 转录翻译合成蛋白。可以修饰蛋白的氨基酸序列以包含非天然存在的氨 基酸或以增加蛋白的稳定性。当蛋白是通过合成手段制得时,这样的氨 基酸可以在制备过程中引入。蛋白还可以在合成或重组制备后进行修饰。
还可以使用D-氨基酸制备蛋白。在这种情况下,氨基酸将以C到N 方向连接到反向序列中。这在制备所述蛋白的领域中是常见的。
很多侧链修饰在本领域中是已知的,并且可以实施于膜蛋白的侧链。 这些修饰包括例如通过以下方式进行的氨基酸修饰:与醛反应、随后用 NaBH4还原从而进行的还原性烷基化,用甲基乙酰亚胺酯进行的脒基化 或用醋酸酐进行的酰化。
可以使用本领域已知的标准方法来制备重组膜蛋白。可以使用本领 域的标准方法分离并复制编码蛋白的核酸序列。可以使用本领域的标准 技术将编码蛋白的核酸序列于细菌宿主细胞中表达。可以通过来自重组 表达载体的多肽的原位表达来将蛋白导入到细胞中。表达载体可选地携 带有诱导型启动子以控制多肽的表达。
因此,装置1可以用于很多的应用。膜蛋白通常插入到层11中。使 用电路26监测凹槽5中的电极21和腔室7中的另一电极24之间形成的 电信号(通常为电流信号)。还常在电极21和24之间施加电压,同时监测 电信号。电信号的形式尤其是其中的变化提供了与层11以及其中所插入 的任何膜蛋白有关的信息。
现在描述应用的某些非限定性实例。一种应用是通过单通道记录进 行膜蛋白体外研究。一种重要的商业应用是作为生物传感器以检测一系 列物质的存在。使用随机传感,通过检测可指示分析物分子或其他刺激 物的存在的电流变化,可以将装置1用于检测与所插入的膜蛋白结合的 分析物分子或其他刺激物。类似的,通过检测膜孔或通道插入时电流的 变化,可以将装置1用于检测样品中膜孔或通道的有无。脂双层可以用 于一系列的其他用途,例如研究已知存在的分子的性质(例如DNA测序 或药物筛选)或分离反应中的组分。
现在将讨论减少或避免预处理涂料30覆盖电极21的问题的一些技 术。
第一种技术是在涂布预处理涂料30后,跨越凹槽5中的电极21和 腔室7中的另一个电极24施加足以减少覆盖凹槽5中的电极21的多余 疏水性流体的量的电压。这会产生类似于电润湿的效果。
该技术展示在图10a至10e中。首先,如图10a所示,预处理涂料 30按照图10a所示涂布,其中预处理涂料30覆盖电极21。接着,如图 10b所示,使水溶液10流过主体2以覆盖凹槽5,使得水溶液10流入凹 槽5。然后,如图10c所示,施加电压,除去覆盖电极21的预处理涂料 30。所述电压将破坏跨越凹槽5形成的任何两性分子层。因此,接着, 如图10d所示,水溶液10流出腔室7而露出凹槽5。通常,一定量的水 溶液10将保留在凹槽5中。最后,如图10e所示,其中添加有两性分子 的水溶液10流过主体2而重新覆盖凹槽5,从而形成两性分子层11。
这可以极其简单地通过将相同的水溶液10流入并流出腔室7来进 行。然而,原则上流入腔室7而重新覆盖凹槽5(图10e中)的水溶液10 可以不同于流入腔室7而首次覆盖凹槽5(图10b中)的水溶液10。类似的, 在施加电压前流入到腔室7而首先覆盖凹槽5(图10b中)的水溶液10可 以未添加有两性分子。
第二种技术是使凹槽5的内表面的里面部分具有疏水性。这可以通 过制备带有两个(或者,一般会更多)另外的层4a和4b的主体2来实现(如 图11所示),其中最里面的另外的层4a(或者多层)由亲水性材料例如SiO 2 形成。一般(但是没有限制)最里面的另外的层4a可以具有2μm的厚度。
最外面的另外的层4b(或者多层)由疏水性材料形成,结果(a)主体2 在凹槽周围的最外表面和(b)凹槽5的从凹槽5的边缘延伸的内表面的外 面部分均具有疏水性。这有助于预处理涂料的铺展。实际上,即便没有 由亲水性材料形成的内部的另外的层4a,主体2的这些表面的这种性能 也是理想的。通常(但不是限定性的),最外面的另外的层4b可以具有 约1μm、3μm、5μm、10μm、20μm或30μm的厚度。
第三种技术是在电极21上提供这样的亲水性表面:可排斥所涂布的 预处理涂料30同时允许从水溶液10到电极2的离子传导。这可以通过 在电极21上沉积保护材料来实现。有一系列的保护材料可以使用。一种 可能性是导电性聚合物,例如如上所讨论的聚吡咯/聚苯乙烯磺酸酯。另 一种可能是共价连接的亲水性物质如硫醇-PEG。
上述装置1已经在实验中制得并使用从而证明层11尤其是脂双层的 形成、膜蛋白尤其是α-溶血素的插入。制得装置1后按照如下程序进行:
1)将预处理涂料30涂布在主体2上;
2)将水溶液10导入腔室7以覆盖凹槽5;
3)对电极21进行电润湿;
4)除去水溶液10以露出凹槽5并将水溶液10重新导入腔室7以 覆盖凹槽5并形成层11;
5)将游离的α-溶血素添加到水溶液10并监测在层11中的插入。
在步骤1)中,预处理涂料30是溶解在戊烷中的十六烷。对于每次检 测可以改变预处理涂料30的量和体积,以获得对于层11的形成而言最 优的条件。不足的预处理涂料30会妨碍层11的形成,而过量的预处理 涂料30会导致凹槽的阻塞。然而,所述量的常规变化可以进行优化。
两性分子是脂质,尤其是1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱。将脂质 溶解在戊烷中,然后在限定腔室7的内部表面的封套6的表面上干燥, 再将封套6附接在主体2的顶部上。在步骤2)中,水溶液10收集所述脂 质。
步骤3)通过跨越电极21和24施加大电位来进行。这从电极21除去 过量的预处理涂料30。虽然不是每种情况中都需要,但是该阶段在进行 的情况下有助于为层11的形成而调整凹槽5,并有助于电信号的随后测 量。
通过监测在电极21和24之间形成的电信号,在步骤4)和5)中,观 察层11的形成和膜蛋白的插入。
所述程序已经成功地执行以用于通过层压在聚合物基底3上形成的 上述类型的装置1。使用所有可以根据以上所述改变的制造方法,观察到 层11的形成和膜蛋白的插入,尽管重复性和信号质量有不同程度的变化。
现在将就典型的装置1描述一个实例,其中利用热压到基底3上的银 箔带(25μm厚,来自Goodfellow)形成第一导电层20,使用15μm厚度层 压膜(Magicard)形成另外的层4。使用受激准分子激光照射直径为100μm 的圆形银电极21,从而在另外的层4形成直径为100μm的圆形凹槽5。 受照射的银如前所述被电化学氯化。第二导电层23是印刷在主体2的顶 侧的丝网印刷银/氯化银墨。
然后,将包含0.5μl在戊烷中的1%十六烷+0.6mg/ml DPhPC的预处 理涂料30涂布在主体2上并在室温干燥。
封套6包含1mm厚的硅橡胶体,并带有250μm厚的Mylar顶盖(lid)。 将脂质(4μl在戊烷中的10mg/ml DPhPC)涂布到封套6的内部,并在室温 进行干燥,然后以自动粘合剂附接到主体2上。
典型的成功检测如下。
将干燥的接触器22和25附接到封闭在法拉第笼中的电路26并施加 20mV 50Hz三角电位波形。图15示出了所施加的波形和指示所预期的 电容响应的所得电流信号。
添加水溶液10在电极之间形成“开放电路”连接,因而对所施加的 电位波形的电流响应大,通常使电流放大器饱和。典型轨迹如图16所示, 包括对20mV电位的大于20000pA的电流响应。这对应于小于1MΩ的 阻抗,这对于与双层形成和孔电流测量有关的应用是足够小的。
如果电极21初始时没有与水溶液10形成适当的电连接,则施加-1V DC电位可以用来增加可以获得的活化电极区。这如图17所示,其中电 极开始部分活化,然后在施加电位约4s后完全活化。
在水溶液10和电极21之间开放电路连接后,从腔室7除去水溶液 10并再导入。在重新导入时,从腔室7的内表面收集的脂质跨越凹槽5 形成层11。根据对刚好低于500pA的电容方形波电流响应的增加(例如 如图18所示)可观察这种形成。该值与针对直径约100μm的圆形脂双层 所预期的电容一致,并且按预期针对不同的几何形状发生变化。
然后将α-溶血素添加到水溶液10中,在所施加的100mV电位下形 成典型孔插入的电流响应。举例说明,图19是存在于水溶液10的环糊 精的一个典型实例,显示所预期的电流响应,结合事件证实电流通过所 述孔。
虽然以上实例显示热层压装置1的数据,但是所研究的其他系统也 成功实现层11的形成和孔插入。例如,这对于采用压敏粘合剂粘合另外 的层4且通过层压形成的装置1也成功地得到证明。然而,发现粘合剂 层在所得纵横比和跨越电极21的粘合剂的铺展方面使凹槽5的形成复杂 化。通过电学瞬态放电法来“激活”电极21可克服这个问题。
通过比较采用CO 2 激光和受激准分子激光(分别如图20和21所示) 形成的凹槽所得到的结果,对凹槽5品质的影响是明显的。在两种情况 中,层11的形成和孔插入都是成功的并且响应是明显的,但是使用受激 准分子激光生产了更具有可再生性的开孔。通过CO 2 激光形成的凹槽5 倾向于形成较易渗漏的层11,产生噪音较大的孔信号,并且还容易阻塞。 通过受激准分子激光形成的凹槽5产生密封良好的层11,产生良好的孔 信号。
使用高清晰度印刷电路板制造方法如上所述形成的装置1,对层11 的形成和孔插入进行类似的观察。在这种情况中,为了形成装置1,通过 在通常用于印刷电路板制造的FR4基底上蚀刻铜箔形成第一导电层20。 然后用Ronascreen SPSRTM光成像焊接掩模将电路板丝网印刷成25μm的 深度,在Orbotech Paragon 9000激光直接成像仪上照射UV光,并用 KaCO 3 溶液显影,在电极21上形成100μm圆形开孔。
使用光刻法如上所述形成的装置1,对层11的形成和孔插入进行类 似的观察。在这种情况中,为了形成装置1,通过使用洁净室设施使金蒸 汽沉积在基底3上形成第一导电层20,并在顶部旋涂厚度为12.5μm的 SU8光刻胶的另外的层4。利用掩模通过UV照射固化光刻胶然后除去未 固化的光刻胶,从而形成凹槽5。凹槽5的直径为100μm,暴露出直径 为100μm的电极21。在烘焙固定光刻胶后,将晶片切割以形成独立的基 底,每个基底具有单个凹槽5。用银对电极21进行电镀,然后如前所述 采用电化学法对电极21进行氯化。第二电极24是印刷在主体2的顶侧 的丝网印刷银/氯化银墨。
然后将包含0.5μl在戊烷中的0.75%十六烷的预处理涂料30涂布在 主体2上并在室温干燥。
封套6包含1mm厚的硅橡胶体,带有250μm厚的Mylar顶盖。将 脂质(4μl在戊烷中的10mg/ml DPhPC)涂布在封套6的内部,然后在室温 干燥,再用自动粘合剂附接到主体2上。
按照如上所述的方法进行检测,观察到成功的层11形成和孔插入。 例如,图22示出显示环糊精与野生型α-溶血素孔的结合事件的典型电流 轨迹。
这些结果一般表明可以执行层11形成的方法的容易性。尤其是,采 用很多装置1的材料、凹槽5的尺寸(宽度和深度)以及制造方法来实现层 11的形成。成功率上的一些变化是明显的,但是一般这可以通过对不同 装置1进行常规检测来优化。尤其是层11的形成不过度取决于凹槽5的 宽度。在5μm至100μm宽度上的形成已经得到证实,从形成的容易性 角度来看,预计形成在高达200μm、500μm以上的较大宽度上是可能的。 同样从层11形成的容易性角度来看,预期也能够适应凹槽5的形状上的 变化。
现在将讨论对装置1进行改进以包括多个凹槽5(一般称为“凹槽5 阵列)。容易地在单件装置1中形成跨越凹槽5阵列的层11阵列的能力是 本发明的特别有利之处。与形成脂双层的传统方法不同的是,装置1具 有单个腔室7,但是在检测的过程中原位形成层11,并在层11下方的凹 槽5中留存电解质库,这允许对通过插入到层11中的蛋白孔的电流进行 连续稳定的测量。另外,所形成的层11具有高品质,位于凹槽5的区域, 这对于使用膜蛋白孔进行高保真电流测量是理想的。这些有利之处在形 成层11阵列的装置1中得到放大,因为这允许跨越所有层11进行平行 测量,或者与电流信号组合以增加灵敏度,或者分别监测电流信号以进 行跨越各个层11的独立测量。
已经对具有凹槽5阵列的装置进行测试并证实了层11阵列的成功形 成,表明可以形成紧密包装的单独寻址层的小型化阵列,从而可以从受 检样品平行记录电流信号。
重要的是,使用上述制造技术(不过形成多个凹槽5),可以简单地形 成具有凹槽5阵列的装置1。在这种情况中,对于各个凹槽5,第一导电 层20分开形成独立的电极21,接触器22和中间导电轨道27。装置1具 有单个腔室7,单个电极24为所有凹槽5所共有。
图23至25显示第1至第3设计,其中通过在另外的层4中分别提 供4、9和128个凹槽5来进行改进装置1。在第1至3设计的每一种设 计中,分别如图26至28(为基底3的平面图)所示,第一导电层20被分 开。第一导电层20对每一个凹槽5提供:在凹槽5下方的电极21;暴露 以连接外部电路26的接触器22和在电极21与接触器22之间的轨道27。 于是,各个电极21(以及与其有关联的轨道27和接触器22)相互电绝缘, 从而可单独测量来自各个凹槽5的电流信号。
可以使用上述技术采用层压聚合物膜或使用硅晶片的光刻法来进行 装置1的制造。
具有多个凹槽5的装置1已经在实验室制得并使用,从而证实了层 11尤其是脂双层的形成和膜蛋白尤其是α-溶血素的插入。实验程序如上 文对于具有单个凹槽5的装置1所述,不同之处在于在多个凹槽5中观 察层5的形成和膜蛋白的插入。一些实例如下所述。
通过上述在聚合物基底3上层压的技术制造第一设计的具有4个凹 槽5的装置。第一导电层20是气相沉积在聚酯片基底3上的银。另外的 层4是热层压在顶部的15μm厚的层压膜。4个直径为100μm的凹槽5 通过受激准分子激光以300μm的间距形成。
为了从各凹槽5同时平行记录,平行运行多个Axon电流放大器器件, 在腔室7中的银/氯化银电极24作为为所有通道所共有的地电极。在多个 凹槽5处的层11的形成和膜蛋白的插入可以成功地进行平行记录。这常 常在各个凹槽5处发生,但是有时层11在一个或多个凹槽5处没有形成。 例如,典型的电流轨迹显示在图29中,证明4个层11的同时形成,每 个层插入有一个或两个α-溶血素孔,并出现环糊精结合事件。值得注意 的是,在信号之间没有串扰。这证实了层11是独立运行的,能够实现有 意义的平行测量,同时单独寻址并使用共同的第二电极24。
通过使用硅晶片基底2的光刻法的上述技术制造第二设计的具有9 个凹槽5的装置。另外的层4是5μm厚的SU8光刻胶。9个圆形凹槽5 通过光刻法以300μm的间距形成。在这种情况中,9个凹槽具有不同的 直径,具体为5μm、10μm、15μm、20μm、20μm、30μm、40μm、50μm 和100μm。将基底3结合到带有与各个接触器22和25连接的独立轨道 的印刷电路板上。跨越接触器22和25添加环氧树脂进行保护。
为了控制所施加的电位并平行记录电流响应,采用相应的软件形成 多通道电路26。使用注射泵进行计算机自动检测,以提供重复施加的流 体控制和水溶液10的除去。
成功地平行记录了在多个凹槽5处的层11的形成和膜蛋白的插入。 通常这在各个凹槽5处发生,但是有时层11在一个或多个凹槽5处没有 形成。例如,构造有金电极并在溶液中没有氧化还原对的情况下运行的 凹槽5的典型电流轨迹显示在图30中,证明8个层11的同时形成,每 个层插入有一个或两个α-溶血素孔,并出现环糊精结合事件。同样,没 有串扰,这证实了层11是独立运行的,并且能够实现有意义的平行测量。
另外,装置1证明了层11跨越直径各自为5μm至100μm范围内的 凹槽5的成功形成。因此,通过实验检测采用3种不同浓度(即在戊烷中 的0.5%、1.0%和2.0%的十六烷)的预处理涂料30形成层5的成功百分比, 使用装置1研究了凹槽5的直径以及所涂布的预处理涂料的品质的作用。 结果表明,在预处理涂料30过少的情况下,不能形成跨越所述直径范围 的凹槽5的层11。另外,在预处理涂料30过多的情况下,不能润湿电极 21,并且没有观察到层11的形成。在该具体构造中,对于15μm至100μm 的直径范围,形成层11的产率大于60%。影响层形成的因素(其中一些因 素在该实验中进行了研究)包括但不限于预处理涂料30、凹槽5的直径、 凹槽5的深度、凹槽5的纵横比、凹槽5的表面性质、凹槽周围表面的 表面性质、腔室7内的流体流动、在层形成中所用的两性分子以及凹槽5 内的电极21的物理和电学性质。随后的实验证实,使用图28的器件的 128凹槽(直径各自为100μm)来形成层11的产率,采用所插入的膜通道 蛋白的随机结合信号来证实大于70%。
在上述装置1中,从电极21到接触器22的导轨27形成在位于另外 的层下方的基底3的表面上。这可以称为导轨27的平面转义路线(planar escape route)。如前文所述,独立的导轨27允许各电极21与电路26中的 专用低噪音高输入阻抗皮安培计单独连接,同时最小化因噪音和带宽减 少带来的信号损坏。对于具有少数凹槽5和在轨道27与水溶液10之间 的厚层的装置1而言,这种平面导轨27是理想的。
然而,对要求高灵敏度的应用而言,有利的是电极21和放大电路之 间的电连接具有低的寄生电容和对周围的低渗漏。寄生电容造成噪音, 因此信号损伤和带宽减小。渗漏也会增加噪音,同时引入补偿电流。在 装置1中,在导轨27之间以及轨道与水溶液10之间,导轨27存在某些 程度的寄生电容和渗漏。随着阵列中凹槽数量的增加,用以转义的电连 接的数目也增加,并且通过平面转义路线,在导轨27的密度在轨道间产 生过多的寄生电容和/或渗漏时,达到实际的限度。另外,随着层4的厚 度的下降,轨道27和水溶液10之间的电容和/或渗漏会增加。
举例说明,通过将脂双层作为电容元件的模型,可以获得典型的图, 所述脂双层每单位面积具有典型值为0.8μF/cm2的电容。轨道27和水溶 液10之间的寄生电容可以粗略地模拟为具有通过该层接触水溶液的轨道 27的区域的电容元件。轨道27的典型的值为50μm宽,2mm暴露并且 该层相对电容率(介电常数)约为3。对于100μm直径的双层和20μm深 的凹槽,电容为63pF,轨道-溶液寄生电容为0.13pF。然而,按比例缩 小至较小的双层(5μm直径和1μm深度)电容为0.16pf,寄生电容为0.53 pF。对于较小的双层和较薄的层,寄生电容是显著的。
为了减轻该问题,图31所示的改进是,用从电极21延伸通过主体 2到达主体2的相对侧上的接触器29的导路28代替导轨27。具体地说, 导路28延伸通过基底3。由于该基底3在导路28之间提供了比平面导路 27之间可能的电介质厚度更厚的电介质,实现了显著较低的寄生电容。 另外,由于基底3的厚度和电介质性质,渗漏也是较低的。结果,在寄 生电容和/或渗漏所施加的实际限度达到之前,导路28的使用有效地增加 了可以容纳在主体2内的凹槽5的数量。这种形式的互连器可以连接到 低电容多层基底61上,这可以借助于层的数量和材料的低介电常数实现 显著较多的电转义路线数量。另外,使用焊料凸点技术(也称为“倒装芯 片”技术)和适当的连接件可以允许将图31所示的装置1(除了基底61之 外)制成低成本的一次性部件。
可以使用已知的晶片通孔互连技术形成导路28。可以用于形成导路 的晶片通孔互连器的类型包括但不限于:
在硅基底3上,产生通过硅晶片的通道(via)、分离通道的内表面并 用导电材料填充该通道而形成的晶片通孔互连,或者作为另一种选择, 通过以通过硅基底的圆筒形通道的形式产生半导体PN结来形成导路28;
在玻璃基底3上,通过包括激光钻孔、湿式蚀刻和用金属或掺杂半 导体材料填充通道在内的方法而形成的晶片通孔互连;和
在聚合物制得的基底3上,通过包括激光钻孔、激光烧蚀、丝网印 刷导体和已知的印刷电路板技术在内的方法而形成的晶片通孔互连。
由于主体2远离电极21的相对侧是干燥的,因此电气点接触阵列可 以用来连接电路26。举例说明,图31示出了焊料凸点连接的使用。具体 地说,在各个接触器29上沉积相应的焊料凸点60,将电路元件61安装 在上面,从而焊料凸点60与电路元件61上的轨道62形成电接触。
电路元件61可以是例如图13所示的印刷电路板。
作为另一种选择,电路元件61可以是集成电路芯片或层压件,例如 低温固化陶瓷封装。这种集成电路芯片或层压件可以用作铺开连接的方 法,从而以更大间距连接集成电路芯片或层压件相对侧上的其他焊料凸 点阵列。其实例显示在图32中,其中电路元件61是集成电路芯片或层 压件,其提供从沉积在主体2上的焊料凸点60到另外的焊料凸点63的 连接,所述另外的焊料凸点63以更大间距排列并用以连接另外的电路元 件64,例如印刷电路板。作为集成电路芯片或层压件的电路元件61也可 以用来以多层形式转义连接旁路。
在如硅等半导体材料的基底3的情况中,可以用来制作导路28的两 种类型晶片通孔互连是金属-绝缘体-半导体(MIS)和PN结型。在MIS中, 通过深反应离子刻蚀(DRIE)工艺对硅芯片钻孔,并用绝缘体涂布该孔, 然后用金属填充以形成导路28。晶片通孔互连的PN结型是形成在通过 硅芯片的圆筒形通道中的半导体结。每种类型的晶片通孔互连都形成在 薄化至低于0.3mm以在制作该孔时节省DRIE加工时间的硅晶片上。PN 结型晶片通孔互连的重要特征是通过具有大的耗尽区来提供的低电容(相 对于MIS型互连)。这部分得益于增加所述结的反向偏压。