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1. CN101405028 - Methods for preparing complex multivalent immunogenic conjugates

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[ ZH ]

权利要求书

1.用于制造复合的多价免疫原性结合物的方法,包括:
将多种免疫原性不同的多糖与氧化剂进行反应,产生多种醛活化的免疫原性不同的多糖的混合物;
将至少一种蛋白与肼、碳酰肼、盐酸肼、二酰肼或其混合物在足以产生至少一种酰肼活化的蛋白的溶液条件下进行反应;
将多种醛活化的免疫原性不同的多糖的混合物与至少一种酰肼活化的蛋白在pH5到8下相接触,使得多种醛活化的免疫原性不同的多糖同时与至少一种酰肼活化的蛋白发生反应,产生复合的多价结合物,该结合物含有在每种结合的免疫原性不同的多糖和蛋白之间形成的至少一个C=N双键;以及
将复合的多价结合物的C=N双键还原成C-N键,产生复合的多价免疫原性结合产物。

2.权利要求1中的方法,其中至少一种酰肼活化的蛋白在中性pH下可溶。

3.权利要求1中的方法,其中在含有多种醛活化的免疫原性不同的多糖的混合物和至少一种酰肼活化蛋白的组合物中,实现了所述多种醛活化的免疫原性不同的多糖与至少一种酰肼活化蛋白的同时反应。

4.权利要求1中的方法,其中多种醛活化的免疫原性不同的多糖的混合物与至少一种酰肼活化蛋白的接触和C=N双键的还原包括在硼氢化钠的存在下提供多种由醛活化的免疫原性不同的多糖的混合物与至少一种酰肼活化蛋白形成的组合物。

5.权利要求2中的方法,其中至少一种蛋白与肼、碳酰肼、盐酸肼、二酰肼或其混合物在(i)碳二亚胺以及(ii)至少一种氨基酸、至少 一种肽、或至少一种氨基酸与至少一种肽的混合物存在下进行反应。

6.权利要求5中的方法,其中氨基酸选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸或半胱氨酸的至少一种。

7.权利要求1中的方法,其中至少一种蛋白与肼、碳酰肼、琥珀酰二酰肼、己二酸二酰肼或其混合物在碳二亚胺盐酸盐存在下在pH6到7下反应以获得酰肼活化的蛋白的溶液,并且还包括对酰肼活化蛋白的溶液进行缓冲液交换,使pH达到10.0到11.0。

8.权利要求1中的方法,其中至少一种蛋白与肼、碳酰肼、琥珀酰二酰肼、己二酸二酰肼或其混合物在碳二亚胺盐酸盐存在下在pH5.5到6.5下反应以获得酰肼活化的蛋白的溶液,并且还包括对酰肼活化的蛋白的溶液进行缓冲液交换,使pH达到10.0到11.0。

9.权利要求1中的方法,其中2-28种醛活化的免疫原性不同的多糖同时与至少一种酰肼活化的蛋白反应。

10.权利要求9中的方法,其中免疫原性不同的多糖选自脑膜炎球菌(Meningococcal)多糖、肺炎球菌(Pneumococcal)多糖、b型流感嗜血杆菌(Hemophilus influenzae type b)多糖、伤寒沙门氏菌(Salmonnella typhi)Vi多糖和B类链球菌(group B Streptococcus)多糖。

11.权利要求1中的方法,其中免疫原性不同的多糖选自A群脑膜炎球菌、C群脑膜炎球菌、W135群脑膜炎球菌和Y群脑膜炎球菌。

12.权利要求1中的方法,其中醛活化的免疫原性不同的多糖与单个的酰肼活化的蛋白反应。

13.权利要求1中的方法,其中醛活化的免疫原性不同的多糖与 多种不同的酰肼活化的蛋白反应。

14.权利要求7中的方法,其中碳二亚胺盐酸盐是l-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。

15.权利要求1中的方法,其中多种免疫原性不同的多糖是免疫原性不同的多糖的混合物。

16.权利要求1中的方法,其中每种免疫原性不同的多糖最初与氧化剂反应,然后将获得的个体醛活化的免疫原性不同的多糖混合在一起,形成醛活化的免疫原性不同的多糖的混合物。

17.制造复合的多价免疫原性结合物的方法,包括:
将多种免疫原性不同的多糖与氰基化试剂进行反应,产生多种氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖的混合物;
将至少一种蛋白与肼、碳酰肼、盐酸肼、二酰肼或其混合物在足以产生至少一种肼活化的蛋白的溶液条件下进行反应;以及
将多种氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖的混合物与至少一种酰肼活化的蛋白在pH6到8下相接触,使得多种氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖同时与至少一种酰肼活化的蛋白发生反应,产生复合的多价免疫原性结合物,该结合物含有在每种结合的免疫原性不同的多糖和蛋白之间形成的至少一个C-N键。

18.权利要求17中的方法,其中氰基化试剂选自1-氰基-4-二甲基铵吡啶四氟硼酸盐、溴化氰或N-氰基-N,N,N-三乙基铵四氟硼酸盐。

19.权利要求17中的方法,其中在含有多种氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖的混合物和至少一种酰肼活化的蛋白的组合物中,实现了多种氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖与至少一种酰肼活化的蛋白同时反应。

20.权利要求17中的方法,其中多种氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖的混合物与至少一种酰肼活化的蛋白的接触包括制备含有多种氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖的混合物与至少一种酰肼活化的蛋白的反应组合物。

21.权利要求17中的方法,还包括将第二多种第二种免疫原性不同的多糖与氰基化试剂进行反应,产生多种第二种氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖的第二混合物;以及
将多种氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖的第二混合物与复合的多价免疫原性结合物相接触,从而在每种第二种氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖和蛋白之间形成至少一个C-N键。

22.权利要求21中的方法,其中第二种免疫原性不同的多糖与氰基化试剂的反应性比权利要求17中的免疫原性不同的多糖与氰基化试剂的反应性高。

23.权利要求22中的方法,其中权利要求17中的免疫原性不同的多糖选自A群脑膜炎球菌或C群脑膜炎球菌的至少一种。

24.权利要求22中的方法,其中第二种免疫原性不同的多糖选自W135群脑膜炎球菌或Y群脑膜炎球菌的至少一种。

25.制造复合的多价免疫原性结合物的方法,包括:
将蛋白与l-氨基-2,3-丙二醇(ADPO)在l-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐存在下在pH5.5到7下进行反应,产生ADPO修饰的蛋白的溶液;
将ADPO修饰的蛋白与氧化剂进行反应,产生醛活化的蛋白的溶液;
将多种酰肼活化的免疫原性不同的多糖的混合物与醛活化的蛋白 在pH5到8下相接触,使得多种酰肼活化的免疫原性不同的多糖同时与至少一种醛活化的蛋白发生反应,产生复合的多价结合物,该结合物含有在每种结合的免疫原性不同的多糖和蛋白之间形成的至少一个C=N双键;以及
将复合的多价结合物中的C=N双键还原成C-N键,产生复合的多价免疫原性结合产物。

26.权利要求25中的方法,其中蛋白与ADPO在pH5.5到6.5下反应。

27.权利要求25中的方法,其中蛋白与ADPO在pH6到7下反应。

28.制备酰肼活化的蛋白的方法,包括:
将蛋白与肼、碳酰肼、盐酸肼、二酰肼或其混合物在存在下述物质下进行反应:(i)碳二亚胺以及(ii)至少一种氨基酸、至少一种肽、或至少一种氨基酸和至少一种肽的混合物。

29.权利要求28中的方法,其中氨基酸选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸或半胱氨酸的至少一种。

30.权利要求28中的方法,其中至少一种酰肼活化的蛋白在中性pH下可溶。

31.制造复合的多价免疫原性结合物的方法,包括:
(a)将至少一种第一种醛活化的免疫原性不同的多糖与至少一种酰肼活化的蛋白在足以形成第一种结合物中间体的条件下相接触,使得第一种免疫原性不同的多糖与蛋白之间形成至少一个C=N双键;
(b)将至少一种第二种醛活化的免疫原性不同的多糖与第一种结合物中间体相接触,使得第二种免疫原性不同的多糖与蛋白之间形成至少一个C=N双键;以及
(c)将C=N双键还原成C-N键,产生复合的多价免疫原性结合产物;
其中第一种醛活化的免疫原性不同的多糖与酰肼活化的蛋白的反应性比第二种醛活化的免疫原性不同的多糖与酰肼活化的蛋白的反应性低。

32.权利要求31中的方法,其中第一种醛活化的免疫原性不同的多糖选自A群脑膜炎球菌或C群脑膜炎球菌的至少一种。

33.权利要求31中的方法,其中第二种醛活化的免疫原性不同的多糖选自W135群脑膜炎球菌或Y群脑膜炎球菌的至少一种。

34.权利要求32中的方法,其中第二种醛活化的免疫原性不同的多糖选自W135群脑膜炎球菌或Y群脑膜炎球菌的至少一种。

35.按照权利要求1的方法制备的复合的多价免疫原性结合物。

36.按照权利要求17的方法制备的复合的多价免疫原性结合物。

37.按照权利要求25的方法制备的复合的多价免疫原性结合物。

38.按照权利要求31的方法制备的复合的多价免疫原性结合物。

39.药物组合物,包含权利要求35的复合的多价免疫原性结合物和至少一种可药用的载体。

40.药物组合物,包含权利要求36的复合的多价免疫原性结合物和至少一种可药用的载体。

41.药物组合物,包含权利要求37的复合的多价免疫原性结合物 和至少一种可药用的载体。

42.药物组合物,包含权利要求38的复合的多价免疫原性结合物和至少一种可药用的载体。

43.权利要求1中的方法,其中多种免疫原性不同的多糖包括b型流感嗜血杆菌、19F型肺炎链球菌和A类脑膜炎奈瑟菌的多糖。

44.权利要求17中的方法,其中多种免疫原性不同的多糖包括b型流感嗜血杆菌、19F型肺炎链球菌和A类脑膜炎奈瑟菌的多糖。

45.权利要求1,17,25或31中任一项的方法,其中复合的多价免疫原性结合物包括分子,所述分子中多种免疫原性不同的多糖与单个蛋白构建物结合。

46.权利要求1,17,25或31中任一项的方法,其中复合的多价免疫原性结合物由下式的结构所示:
其中P1是载体蛋白;PS1、PS2和PS3各是共价连接到P1上的免疫原性不同的多糖。