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1. CN106399242 - Method for jointly preparing CAR-VGamma9VDelta2T cells and CAR-NKT cells

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[ ZH ]

权利要求书

1.一种联合制备CAR-Vγ9Vδ2T细胞和CAR-NKT细胞的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)从患者的自体外周血、健康供者的外周血或婴儿脐带血中分离得到外周血单个核细胞;将所得外周血单个核细胞加入可用于淋巴细胞、树突状细胞或DC细胞的无血清细胞培养基中,再加入抗γδTCR单克隆抗体、含氮二膦酸盐类药物或帕米磷酸盐类药物预活化PBMC中的Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞,之后再加入rhIL-2或rhIL-15进行Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞的选择性体外活化扩增;
2)用携带有嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体转导步骤1)所得包含Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞的混合细胞,即得包含CAR-Vγ9Vδ2T细胞和CAR-NKT细胞的混合细胞,其中嵌合抗原受体与靶向表面抗原可特异性结合;
其中,步骤1)中,使用的抗γδTCR单克隆抗体、含氮二膦酸盐类药物或帕米磷酸盐类药物加入细胞培养基后的浓度为1-10μM;所述含氮二膦酸盐类药物为帕米膦酸二钠;
所述预活化、选择性体外活化扩增的条件均为在37℃、5%二氧化碳的培养箱中进行;在预活化12-36h后加入rhIL-2或rhIL-15,选择性体外活化扩增Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞7天以上;
步骤2)中,携带有嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体转导步骤1)所得包含Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞的混合细胞的具体步骤为:收集包含Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞的混合细胞,调整包含Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞的混合细胞的浓度至5×106个/ml,携带有嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体和混合细胞以1:4的体积比混合静置6-12h;收集细胞并用PBS缓冲液清洗,换可用于淋巴细胞、树突状细胞或DC细胞的新鲜无血清细胞培养基保持72小时。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述无血清细胞培养基选自德国Cellgenix公司的cellgrowSCGM,日本TAKARA公司的GT-T551H3,日本KOHJIN公司的KBM581,美国GIBCO公司的AIM-V、瑞士LONZA公司的X-Vivo15中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,将所得外周血单个核细胞加入可用于淋巴细胞、树突状细胞或DC细胞的无血清细胞培养基中,使外周血单个核细胞在无血清细胞培养基中的浓度为(1-9)×106个/ml。

4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,预活化前所述无血清细胞培养基中还加入血浆,使血浆在无血清细胞培养基中的浓度为2-10%,且所述血浆与外周血单个核细胞来自于同一血液供体。

5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,加入rhIL-2使其在细胞培养基中的浓度为300-1000U/ml或加入rhIL-15使其在细胞培养基中的浓度为5-50ng/ml。

6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述靶向表面抗原为CD19。

7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,可与CD19特异性结合的嵌合抗原受体的基因序列如SEQ ID:1所示。

8.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,可与CD19特异性结合的嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID:2所示。