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1. (WO2018122763) SYNTHESIS OF FUNCTIONALISED GOLD NANOPARTICLES AND NANOCOMPOUNDS CONTAINING SAME FOR MEASURING SUCROSE OR STARCH IN CELLS
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SÍNTESIS DE NANOPARTÍCULAS DE ORO FUNCIONALIZADAS Y NANOCOM PUESTO QUE LAS CONTIENE PARA LA MEDICIÓN DE SACAROSA O ALMIDÓN EN CELULAS

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se encuentra relacionada con el campo de los procesos de medición de azúcares y almidón en células.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN.

La investigación relacionada con biosensores ha experimentado un crecimiento explosivo en las últimas décadas. Un biosensor se define generalmente como un dispositivo analítico que convierte una respuesta biológica en una señal procesable y cuantificable (Lowe, C. R. Biosensors. Trends in Biotechnology 1984, 2(3), 59-65).

En este contexto, las nanopartículas metálicas han sido empleadas como bloques de construcción en la fabricación de biosensores, debido a su capacidad para absorber radiación en un espectro de frecuencia particular y la frecuencia de resonancia de sus plasmones de superficie.

Los polímeros conductores y los nanotubos de carbono (CNT), entre otros nanomateriales basados en carbono, son también ampliamente utilizados en la construcción de biosensores debido a su compatibilidad dimensional y química con biomoléculas (G.A. Rivas, et al, 2007).

Las propiedades de las nanopartículas varían de acuerdo con su tamaño y composición, lo que facilita diversas aplicaciones. La producción de nanopartículas puede lograrse mediante la aplicación de métodos químicos, físicos o biológicos. Entre ellos, se ha prestado considerable atención a los

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métodos biológicos para la síntesis de Nanopartículas metálicas, debido a la gran variedad de recursos disponibles en la naturaleza (Kalishwaralal K, et al; Thakkar NK, et al, 2010).

La glucosa, como principal fuente de energía en el metabolismo celular, juega un papel importante en el crecimiento natural de las células. Su falta o exceso puede producir una influencia perjudicial en diversas funciones. La sacarosa y el almidón, son productos de la glucosa empleados naturalmente para el transporte y el almacenamiento de energía, respectivamente.

En el estado de la técnica se encuentran reportados diversos métodos para la medición de concentración de glucosa en solución, tales como la detección de plasmones de superficie (SPR) por espectroscopia, la detección de señales de fluorescencia, y la transduccion de señales electroquímicas, entre otros. (Tang et al 2008).

Tang et al 2008, describen un nanobiosensor para determinar glucosa en suero basado en un sistema mixto de puntos cuánticos (QDs) conjugados con concanavalina A (ConA) y con nanopartículas de oro (AuNPs) funcionalizadas con b-ciclodesctrina tiolizada. El mecanismo de sensado se basa en la transferencia de energía resonante por fluorescencia (FRET) entre los puntos cuánticos de CdTe (Teluro de Cadmio) como donantes a las AuNPs como receptoras de energía. En presencia de glucosa, las AuNPs son desplazadas por la glucose que compite por los sitios de enlace de la ConA, resultando en recuperación de fluorescencia atenuada normalmente por los puntos cuánticos. El incremento en intensidad de fluorescencia es proporcional a la concentración de gluocsa en un rango entre 0.10-50 mm. (A New Nanobiosensor for Glucose with High Sensitivity and Selectivity in Serum Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) between CdTe Quantum Dots and Au Nanoparticles Bo Tang,* Lihua Cao, Kehua Xu, Linhai Zhuo, Jiechao Ge, Qingling L¡, and Lijuan Yu[a] Chem. Eur. J. 2008, 14, 3637 - 3644).

Respecto a medición de sacarosa, Bagal-Kestwal et al, presentan un sistema de nanopartículas de oro mediadas por invertasa sobre una membrana de

cebolla, y su aplicación al sensado de sacarosa. Empleando espectrometría en ultravioleta visible demostraron el pico característico de las nanopartículas decoradas por invertasa en una membrana de cebolla de alrededor de 301 nm. Al ser excitada a 320 nm en presencia de sacarosa, la membrane exhibe un pico de fotoemisión a 348 nm. El tiempo de vida de la fluorescencia de la membrana modificada con nanopartículas de oro fue de 6.20 ns, comparado con 2.47 ns para la membrana mediada por invertasa sin nanopartículas de oro. (Invertase-nanogold clusters decorated plant membranes for fluorescence-based sucrose sensor Dipali Bagal-Kestwal, Rakesh Mohán Kestwal and Been-Huang Chiang Bagal-Kestwal et al. Journal of Nanobiotechnology (2015) 13:30 DOI 10.1 186/sl 2951 -015-0089-1 ).

En el campo de las patentes, se observa en el estado de la técnica cercano a la invención la solicitud US20130065777, la cual, describe un biosensor de nanoestructura plasmónica que comprende un sustrato y una película metálica dispuesta sobre el sustrato, en el que dicha película metálica comprende una o más superficies que comprenden una pluralidad de nanoelementos dispuestos en un patrón predefinido.

El sustrato comprende silicio, dióxido de silicio, nitruro de silicio, diamante, cuarzo, fluoruro de magnesio (MgF.sub.2), fluoruro de calcio (CaF2), ZnSe, germanio, o un polímero. El biosensor objeto de análisis emplea un metal noble, un metal de transición, o un metal alcalino.

La solicitud WO2016018798 divulga una nanopartícula que comprende metales elementales y sales de metales, dichas sales se seleccionan del grupo óxidos, sulfuros, seleniuros y telururos. Dicha nanopartícula es una nanopartícula que comprende un núcleo de metal o de aleación metálica y una carcasa metálica, el núcleo se selecciona del grupo que consiste en Au, Ag, Cu, Co, Fe, y Pt; la cubierta se selecciona del grupo que consiste en Au, Ag, Cu, Co, Fe, Pt, óxidos metálicos de los mismos, y combinaciones de los mismos; la corteza se selecciona del grupo que consiste en Fe / Au, Fe / Fe304, y Au / Fe203. El punto cuántico compuesto por CdSe/ZnC - Seleniuro de cadmio (CdSe)/Sulfuro de cinc (ZnS).

La solicitud US2009020048 enseña un sensor que comprende uno o más puntos cuánticos capaces de generar una transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) que puede ser atenuada mediante la donación de energía a una o más nanopartículas metálicas. La nanopartícula metálica se selecciona de entre uno o más grupos de Au, Ag, Pt. El sensor en el que el metal pesado específico es uno o más de Hg.sup.2 +, Cu2 +, y Pb.sup.2 +, la cubierta es un núcleo-corteza CdSe / ZnS.

La solicitud KR201 10122320 expone un método para detectar ácido nucléico que comprende: Una etapa de preparación de puntos cuánticos; una etapa de conexión de una sonda que contiene oligonuelcotides de secuencias complementarias para un ácido nucleico sobre la superficie del punto cuántico para formar un punto-sonda cuántica bioconjugadas; el método comprende además una etapa de detección de señal de fluorescencia por FRET. El punto cuántico tiene una estructura CdSe/ ZnS. La superficie del punto cuántico es encapsulada o modificado con el grupo hidroxi (-OH), un grupo carboxilo (-COOH), grupo amino (-NS_2), o grupo tiol (-SH).

La solicitud DE102014203254 divulga la arquitectura de una nanoparticula donde el donante y el aceptor es un luminóforo. El punto cuántico puede ser de tipo CdSe (seleniuro de cadmio) y tiene una cubierta orgánica (fluoróforo).

OBJETOS DE LA INVENCIÓN

En un primer objeto, la presente invención relata el proceso de funcionalización de nanopartículas de oro sintetizadas funcionalizadas con ligandos poliméricos para la medición selectiva de sacarosa o almidón en fluido intracelular.

En un objeto adicional, la invención divulga un nanocompuesto para la medición de concentración de sacarosa o almidón en fluido intracelular.

Los objetos anteriormente descritos, al igual que los objetos adicionales a que hubiere lugar, serán expuestos al detalle y con la suficiencia necesaria en el capítulo descriptivo que se divulga a continuación, el cual constituirá el fundamento del capítulo reivindicatorío.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS.

Figura 1 : Muestra un esquema de los fenómenos de transferencia de energía fluorescente resonante (FRET) y de transferencia de energía resonante de superficie (SET)

Figura 2: Muestra el esquema (izquierda) UDP-glucosa y (derecha) ADP-glucosa.

Figura 3: Fluoróforo Fluoresceina

Figura 4: Muestra el esquema del nano-material para sensado de UDP-glucosa y ADP-glucosa (AuN Ps funcionalizadas con ligandos SH(CH2)i2COOH) en dos estados extremos: a) Estado de referencia Ri : 11 , refleja m ínima distancia entre fluoresceina y AUNPS dando como resultado una máxima atenuación de fluorescencia por AUNPS y m ínima emisión;

b) estado R2 2, con el máximo número de analitos objetivos (U DP o ADP glucosa) enlazados al extremo del ácido carboxilico de los ligandos para una cobertura total de sitios de sensado, y con fluoresceina introducida a posteriori, resulta en una m ínima atenuación de fluorescencia por AUNPS y en una máxima em isión;

c) Muestra la eficiencia en transferencia de energía excitada (para los diferentes mecanismos en el SET) versus separación entre fluoresceina y AuNPs. La línea punteada es la eficiencia teórica del FRET, m ientras la sólida es la del SET - Validadas sobre datos experimentales. [14]. F=fluoresceina; T=udp-glucosa o adp-glucosa, X=F o T. La zona sombreada corresponde al cambio en eficiencia de transm isión de energía excitada de la fluoresceina como producto de un cambio Δ en la distancia entre el fluoróforo y la 'superficie de la AuNP.

Figura 5: Muestra la eficiencia SET obtenida en el proceso de 65% para 4 UDP/ADP-glucosas en la superficie de la AuNP funcionalizada.

Figura 6: Muestra la dispersión de AuNPs en solución con citratos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

De manera previa a la exposición de la descripción detallada de la invención, se describen las definiciones de algunos términos, con el objeto de identificar de manera clara y concisa el alcvance de los mismos.

El término "ligando" debe entenderse como una molécula enlazada por un extremo y de manera covalente a un átomo metálico de la AuNP y por el otro a UDP-glucosa, ADP-glucosa o fluoresceina.

El mecanismo fundamental de la técnica FRET[1 ] (por sus siglas en inglés, Foster o Fluorescent Resonant Energy Transfer) involucra una molécula fluoróforo donante capaz de transferir energía de estados electrónicos excitados a otra molécula fluoróforo receptora (el par donante y receptor se denomina par FRET), (Ver Figura 1 superior).

Para ello, el espectro de absorción (o excitación) de la molécula receptora debe solaparse con el espectro de emisión de la molécula donante. La transferencia de energía no se da por medios radiativos, sino mediante acoplamiento de cargas opuestas entre las dos moléculas (interacciones dipolo-dipolo), en un rango de distancia aproximado de 10 a 100 A. Esto ocurre porque la radio entre el par FRET es menor a la longitud de onda de la energía liberada por el donante, resultando en una comunicación de campo-cercano.

La eficiencia en la transferencia de energía del FRET es inversamente proporcional a la distancia entre el donante y el receptor elevada a la sexta potencia, lo cual permite medir con alta precisión la distancia entre el par FRET. Con una excitación apropiada, los electrones de la molécula donante saltan de su estado de base (denominado SO, o de mínima energía) a un nivel vibracional más alto. En cuestión de picosegundos, estos electrones decaen al nivel vibracional más bajo (denominado S1 ) y eventualmente (en nanosegundos) vuelven a su estado de base (SO); al hacerlo, emiten un fotón de luz. Estas emisiones sirven para determinar la cantidad de interacciones FRET o para determinar la distancia entre moléculas donantes y receptoras FRET.

Empleando un formalismo similar al de FRET Chance, Prock, y Silbey[2] describen la tasa de transferencia de energía desde un dipolo a una transición entre bandas electrónicas en la superficie de un metal[2-5], que luego Persson y Lang[5] extienden a los electrones de la banda de conducción del metal ( Ver Figura 1 inferior). Este tipo de transferencia se denomina como una transferencia de energía de superficie (SET, por sus siglas en inglés, surface energy transfer).

En estas condiciones, el nanomaterial objeto de la presente invención hace uso del fenómeno SET entre fluoróforos de bajo peso molecular y nanopartículas (NPs) metálicas funcionalizadas para permitir la medición selectiva de UDP-glucosa (C15H24N2O17P2) o ADP-glucosa (C16H25N5O15P2) en solución. La presencia de un fluoróforo y una NP metálica con espectros de emisión y recepción solapados, permite el uso de la relación de intensidades para detectar de manera cuantitativa el nivel o la concentración de analitos presentes en solución.

En la modalidad preferida de la invención, las NPs empleadas en el compuesto nano sensor son de oro (Au), (en adelante AuNPs). Las AuNPs tiene propiedades colorimétricas, conductivas, y ópticas únicas que pueden ser sintonizadas en función de su tamaño, forma y ambiente químico circundante. Por lo anterior, si bien en la modalidad preferida de la invención se relacionan AuNPs, el procedimiento es susceptible de aplicación de cualquier tipo de nanopartículas de metales de transición dúctiles que son susceptibles a la absorción de fluorescencia y resonancia plasmónica.

En su superficie, puede además ser funcionalizada con ligandos orgánicos para enlazar y detectar de manera selectiva diferentes objetivos moleculares. Por último, la limitación de distancia entre el par FRET convencional (<10nm) puede reducirse mediante el acoplamiento de plasmones de superficie en NPs metálicas[6] lo cual permite extender la transferencia de energía electrónica excitada entre el par FRET a distancias cercanas a 100nm (10 veces mayor que en un par FRET convencional) y a su vez permite atenuar diferentes frecuencias de emisión, [7, 8] gracias a sus altos coeficientes de extinción molar y amplio ancho de banda energético, [9, 10] en el rango de visibles a cercano a infrarrojo (i.e. hace las veces de fluoróforo receptor).

Esto convierte a las AuNPs en escafoides ideales para la fabricación de sensores químicos y biológicos, como lo demuestra el incremento en publicaciones científicas asociadas con la detección de iones, moléculas pequeñas y hasta procesos celulares. [1 1 ]

El método de obtención del compuesto nano sensor objeto de la presente invención consiste de AuNPs entre 20±5nm de diámetro como una plataforma químicamente inerte, funcionalizada con elementos moleculares para la detección selectiva de UDP-glucosa y ADP-glucosa.

El mecanismo de detección implica la permeación de los analitos en el sovente con AuNPs y su interacción selectiva con los componentes de detección provoca cambios en la intensidad de emisión fluorescente detectable.

La UDP-glucosa y la ADP-glucosa (ver Figura 2), juegan un papel importante como intermediarios en el metabolismo de la sacarosa y del almidón, respectivamente.

A nivel biológico, existen un conjunto de reacciones bioquímicas tanto de síntesis como de degradación de biomoléculas que permiten el mantenimiento y la regulación de la estructura y de la función celular.

En las plantas, la producción de sacarosa y la síntesis de almidón son dos mecanismos principales para el transporte y la reserva de carbono, respectivamente. La sacarosa es la forma de transporte principal del carbón foto asimilado (a partir del consumo de dióxido de carbono durante el proceso de fotosíntesis), al igual que una fuente de carbón esqueletal y de energía para los órganos que no realizan fotosíntesis. De otro lado, las plantas forman almidón como polímero, a partir del producto de la fotosíntesis (glucosa), y lo emplean para almacenar energía; indispensable para su crecimiento.

La sacarosa se produce en el citosol y el almidón en los cloroplastos celulares. Sus procesos de síntesis comparten mecanismos similares, excepto que en la biosíntesis de sacarosa se da como intermediario metabólico la UDP-glucosa y en el caso de la biosíntesis del almidón es la ADP-glucosa.[12, 13]

Método para la detección de UDP-glucosa y ADP-glucosa (selectividad y sensibilidad).

En su modalidad preferida, la invención emplea el fenómeno SET entre la fluoresceína (Figura 3) como fluoróforo donante de energía electrónica excitada, y AuNPs, como receptoras atenuadoras/extintoras de la fluorescencia de la fluoresceína, para determinar indirectamente la concentración de sacarosa/almidón en solución. El mecanismo de medición se describe gráficamente en la Figura 4.

Empleando la Regla de Oro de Fermi, se relaciona la tasa de transferencia de energía entre un par FRET (/ En-r) al producto entre los elementos interactuantes del donante (FD) y el receptor (FR), / ENT s FDFR. Estos elementos de interacción pueden ser simplificados de tal manera que las dependencias de distancia entre ellos (cf) sean función geométrica de su arreglo en el espacio.

Para dipolos sencillos, F ~ 1/cf3, para arreglos dipolos en 2D, F ~ 1/cf, y para arreglos dipolos en 3D, F = constante tal que la potencia del factor de distancia decrece a medida que la dimensión crece. [5] El FRET convencional, consiste de dos dipolos sencillos, de tal manera que / FRET S FDFR s (l/c xi/cf3) ~ 1/d6. De hecho, la tasa de eficiencia del FRET se escribe comúnmente como:

El radio de Forster (R0) es una función de la fuerza del oscilador de la molécula donante y la molécula receptora, su energía resonante mutua, y el vector de adición de dipolos. Típicamente, cf<100 A.

La tasa de transferencia para el SET se estima como / SET S FDFR s (1/cf3)(1 /cf) « 1 /cf . La forma de energía de transferencia dipolo-superficie es entonces:


Donde la dimensión de distancia característica está dada por:


y es función de la eficiencia cuántica del donante (Φ0), la frecuencia de la transición electrónica en el donante (ω), la frecuencia de Fermi (aif) y el vector de onda de Fermi (/ f) del metal. [2] Como consecuencia, la interacción del fluoroforo con la superficie del metal cambia dependiendo del régimen de distancia. A distancias cortas (<10 A), la tasa de acople radiativo domina;[15] a distancias intermedias (20-300 A), la energía de transferencia domina; [5] y a largas distancias (>500 A), las oscilaciones fluorescentes del dipolo-espejo toman precedencia. [2]

De una forma general, la eficiencia cuántica en la transferencia de energía puede escribirse como,


Donde, para el caso de transferencia de energía dipolo-dipolo, n=6 y r0=Ro, mientras que para el caso de transferencia de energía dipolo-superficie, como el presentado aquí, n= 4 and r0=do. Esto permite la identificación de la naturaleza del mecanismo de transferencia de energía mediante la

interrogación de la pendiente de la curva de eficiencia en transferencia de energía versus distancia de separación entre el donante y el receptor.

El mecanismo para la detección y medición de la concentración del analito en solución se deriva entonces de relacionar la distancia entre la fluoresceína y la AuNP con la eficiencia de la emisión de fluorescencia, como se muestra en la Figura 4 c). A modo de ejemplo, supongamos que tenemos una AuNP en solvente, con 8 sitios activos y 4 moléculas de UDP-glucosa enlazadas a los grupos funcionales carboxilico de la AuNP (Figura 5A).

Al introducir 8 fluoresceínas en el solvente con la AuNP y las 4 moléculas de UDP-glucosa, la atenuación SET de cada fluorescencia se reduce a E(R2)=0.5 por cada UDP-glucosa acoplada a la AuNP, para una atenuación neta de (4*0.5+4*0.8)/8=0.65, equivalente a 65% (Figura 5 b) .

Si los 8 sitios carboxilico estuviesen enlazados cada uno a una fluoresceína, la atenuación de fluorescencia para el sistema de AuNPs sería el máximo por la transferencia SET, es decir (8*0.8)/8=0.8, que equivaldría al 80% (Figura 4C).

Cada molécula de UDP-glucosa acoplada a la AuNP mediante el ligando carboxilico reduce la eficiencia SET por 3.75%, en otras palabras, aumenta la fluorescencia neta del sistema en la misma proporción (i.e. asumiendo, como en este caso, que el número de moléculas a sensar y el número de fluoresceínas sea el mismo).

Si consideramos que esta distancia de separación debe incluir el tamaño físico de una molécula de UDP/ADP-glucosa y las repulsiones esféricas a temperatura finita (300K), Δ podría superar los 2nm (un Δ mayor, incrementa aún más la fluorescencia neta del sistema).

El efecto porcentual se reduce en proporción al número total de sitios activos funcionales disponibles en solución, asumiendo el mismo número o más de fluoresceínas. Es decir, si el número de sitios funcionales activos se incrementa a 16, la intensidad total se reparte ahora entre 16 fotones (en lugar de los 8 del ejemplo anterior) y la contribución por sitio será de 1 .875%, y así sucesivamente. Estados de cobertura parcial se miden con una resolución dentro el rango de eficiencia establecido por los dos estados extremos, puntos A y B en la Figura 4C.

La eficiencia de la transferencia de energía (E), E = 1 - ID/I, se monitorea por medio de espectroscopia de fotoluminiscencia de onda continua (cw-PL) de la cantidad de fluoresceína.

En uno de sus objetos, la presente invención divulga un método de funcionalización de nanopartículas de oro sintetizadas con ácido cítrico en solución para garantizar su dispersión, y funcionalizadas con ligandos poliméricos para la medición selectiva de sacarosa o almidón en células.

En su modalidad preferida, el procedimiento comprende las siguientes etapas:

a) Sintetizar nanopartículas de oro en solución con ácido cítrico;

b) Funcionalizar las nanopartículas de oro sintetizadas (a) con los ligandos poliméricos SH(CH2)i2COOH; los ligandos desplazan los grupos citratos en solución y garantizan dispersión de las AuNPs por repulsión esférica.

c) Agregar media porción de la solución de nanopartículas AuNPs funcionalizadas obtenida en la etapa b) a una solución de citosol; revolver.

d) Reposar hasta lograr equilibrio térmico de la solución obtenida en c), es decir, hasta que todas las moléculas de UDP- o ADP-glucosa estén enlazadas en terminales carboxílicos activos de las AuNPs;

e) Agregar fluoresceína gradualmente a la media porción restante de solución de AuNPs funcionalizadas obtenida en c). Revolver y equilibrar hasta minimizar la emisión fluorescente resultante - corresponde a ocupar todos los sitios carboxílicos reactivos disponibles en la solución de AuNPs funcionalizadas con fluoresceínas y resulta en la concentración de fluoresceína requerida para una máxima atenuación de la fluorescencia por parte de las AuNPs.

f) Agregar la misma concentración de fluoresceína obtenida en el paso e) a la media porción de solución de AuNPs funcionalizadas en citosol, obtenida en el paso d). - corresponde ocupar los sitios activos remanentes en la solución c) con fluoresceína (atenuación parcial de fluorescencia) y a un exceso de fluoresceína no enlazada (fluorescencia no atenuada);

g) Calcular la diferencia de la medida de intensidad en fluorescencia entre la solución de AuNPs funcionalizadas en e) y la solución de fluoresceína en f). La concentración de UDP- o ADP-glucosa (sacarosa o almidón, respectivamente) será proporcional a dicho cálculo diferencial en la intensidad fluorescente.

Los ejemplos que se describen a continuación son presentados con el objetivo de describir los aspectos preferidos de la invención pero no constituyen una limitación al alcance de la misma.

EJEMPLO 1.

Para un volumen (v-i ) definido de solvente con pH medio de 7.2 (en el rango para citosol de 7.0-7.4 y de 8.0 para la stroma del cloroplasto) y sin grupos sensibles a ataque electrofílicos:

a) se introduce una concentración definida (c-i ) de fluoresceína y registrar la intensidad ( ) de sus emisiones (a ~521 nm) ante excitación radiativa en una longitud de onda de 494nm. Esta sería la muestra de control.

b) En otra muestra del mismo solvente y con el mismo volumen v-i , se introduce una concentración específica de AuNPs funcionalizadas con el ligando (c2; estimada como se describe a continuación) y gradualmente mezclar fluoresceína hasta una concentración máxima de c-i , excitando el sistema a 494nm de longitud de onda en cada adición y dando tiempo para equilibrar la emisión a la mínima (i.e. dar tiempo para que se acople la fluoresceína a los sitios carboxilico activo funcionales de las AuNPs) intensidad captada en la máxima longitud de onda (~521 nm). Registrar la concentración de fluoresceína (c3) ante un cambio ¡ncremental en la intensidad de la emisión (l2), i.e. al momento de saturación con fluoresceínas de los sitios carboxilico funcionales activos. Se debe verificar que los tiempos de vida del sistema conjugado AuNP-fluoresceina para las diferentes concentraciones sea similar y dializar (purificar) las mezclas para remover fluoresceína no reaccionada. Correspondería al estado mostrado en la Figura 4 a).

c) Introducir una concentración (c2) de las AuNPs funcionalizadas con el ligando en una muestra de citosol/stroma; mezclar y dejar en reposo por 15 minutos.

d) Introducir a la mezcla una concentración (c3) de fluoresceína, mezclar y dejar en reposo hasta maximizar la fluorescencia (l3) del sistema. e) Calcular la concentración de UDP/ADP-glucosa en función de intensidad neta de la emisión fluorescente (i.e. respecto de la muestra de control), como se explicó anteriormente.

La concentración c2 se estimaría en función del número de sitios carboxilico funcionales activos, y directamente proporcional al número de AuNPs/L, la distribución de tamaño de su tamaño, la cobertura de superficie de los ligandos sobre las AuNPs y la cobertura de superficie funcionalizada y con analitos enlazados por el grupo carboxilico que resulte en energía mínima.

La medición de estos azúcares nucleótidos mediante el sistema de nano sensado propuesto permite derivar la concentración de sacarosa en el citosol (o la concentración de almidón en el cloroplasto) en las plantas en un límite inferior de nano-moles (10"9), versus el límite inferior mediante las técnicas en el estado del arte de micro-moles (10"6)[16] o las técnicas experimentales tradicionales como la cromatografía y la espectrometría de masas, que proveen una resolución en la medición de la concentración de carbohidratos en la escala de los mili-moles (10"3).

EJEMPLO 2.

Síntesis y funcionalización de AuNPs.

Las AuNPs se producen en un solvente mediante la reducción química de ácido cloroaurico (H[AuCI4]),[17] aunque hay métodos más precisos y avanzados a la fecha. [18-20] Después de disolver H[AuCI4], la solución se mezcla rápidamente en presencia de un agente reductor. Este reduce los iones de Au3+ a átomos neutrales de oro. A medida que se forman más y más átomos de oro, la solución se súper-satura, y el oro comienza a precipitarse gradualmente en forma de partículas sub -nanométricas. El resto de los átomos de oro se adhieren a las partículas existentes, y para lograr nano-partículas de tamaño uniforme se revuelve vigorosamente la solución.

Para prevenir la agregación de las AuNPs, se introduce un agente estabilizante que se absorbe físicamente (i.e. interacción de baja energía, no covalente) a la superficie de las AuNPs. En este caso, empleamos grupos citratos que introducen una carga neta negativa en la superficie de las AuNPs (es decir, un potencial Z alto). La repulsión electrostática entre superficie conlleva a mantener las AuNPs dispersas en solución, según se muestra en la Figura 6.

Funcionalizacion de las AuNPs con ácido 12-tiol-dodecanoíco.

Intercambiamos los citratos por ácido 12-tiol-dodecanoíco, SH(CH2)i2COOH. Los grupos sulfatados desplazan las moléculas de citrato sobre la superficie de las AuNPs como consecuencia de la fuerte afinidad entre la superficie del oro y el sulfuro. Los grupos carboxilicos polares del ligando garantizan hydrofilicidad. El intercambio evita la agregación de las AuNPs por repulsión esférica y se permiten una funcionalizan por auto-ensamble.

Absorción química de UDP/ADP-glucosa sobre ácido 12-tiol-dodecanoíco

La reactividad química del anillo uracilo de la UDP-glucosa se explica por la presencia de los dos átomos de Carbono, C-5 y C-6, que presentan una reactividad diferencial ante reactivos electrofílicos y nucleofílicos.

En otras palabras, el anillo uracilo se caracteriza por presentar un Carbono (C-5) susceptible a un ataque electrofílico, pues presenta dos grupos carbonilos que activan al C-5 otorgándole una carga ligeramente más negativa que la que presentaría en ausencia de dichos grupos activadores y un Carbono susceptible a sufrir un ataque nucleofílico, (C-6), que es el carbono β de un sistema carbonílico α,β-insaturado. Las cargas positivas o negativas que se forman sobre el anillo uracilo durante la reacción son estabilizadas por resonancia dentro del anillo, aumentando la reactividad de dicho sistema.

La cadena funcional SH(CH2)i2COOH ligada por su extremo sulfhidrilo a la superficie de una AuNP interactúa con el C-5 del anillo uracilo, a través del carbono carbonílico de su extremo carboxilico. Como se mencionó previamente el C-5 del anillo uracilo de la UDP-glucosa, al presentar una carga ligéramente negativa atacará nucleofílicamente al C del grupo carbonilo, C=0 que presenta una carga ligeramente positiva, del ligando a través de una reacción de sustitución nucleofífila, eliminándose una molécula de agua.



Absorción química de la fluoresceína sobre ácido 12-tiol-dodecanoíco

De igual forma al proceso descrito en el numeral anterior, el oxígeno con carga negativa de la flureceina dianión a pH igual o mayor a 6,4 (ver Figura 1 ), así como el C en posición para al grupo carboxílico del anillo benzoico de la fluoresceína puede atacar nucleofílicamente al C=O del ligando de forma competitiva a la UDP-glucosa; esto permite formar un enlace covalente que integra el complejo AuNP-ligando-UDP-glucosa. De manera similar el anillo de adenina permite el enlace del ligando ácido 12-tiol-dodecanoíco por el grupo carboxilico funcional reactivo.

En ausencia de fluoresceína el ligando se unirá preferiblemente al C-5 del anillo uracilo de la UDP-Glucosa y en ausencia o deficiencia de UDP-Glucosa el exceso de ligando unidos a la nanopartícula de oro se adicionarán al C del C=O o al C-para del anillo benzoico de la fluoresceína.

La siguiente secuencia de reacciones describe gráficamente lo esbozado en los dos numerales anteriores:

Reacción de la UDP-glucosa con el ligando unido a la NPAu



Reacción de la Fluoresceína dianión, por el extremo fenolato con el ligando unido a la AuNP


Reacción de la Fluoresceína dianión, por el carbono en posición para del anillo benzoico con el ligando unido a la AuNP


Las fluoresceínas funcionalizadas con la extensión polimérica (c) tienen afinidad covalente por el grupo residual (R) con los azúcares nucleótidos del tipo UDP-glucosa y ADP-glucosa.

La adsorción física de la fluoresceína en la superficie de una AuNP da como resultado que mediante el efecto SET la AuNP disminuya la fotoluminiscencia de la fluoresceína (quenching o atenuación).

En estas condiciones, la composición del Nanocompuesto (nanosensor) objeto de la presente invención incorpora Fluoresceína en solución y Nanopartículas de oro sintetizadas con ácido cítrico en solución funcionalizada con los ligandos poliméricos SH(CH2)i2 COOH, donde el ligando SH(CH2)i2 COOH presenta una longitud ente 2 a 5 nm.

El uso del Nanocompuesto (nanosensor) objeto de la presente invención se materializa en procedimientos que involucren la medición de sacarosa o almidón en células.

Aunque la presente invención ha quedado descrita con las realizaciones preferentes mostradas, queda entendido que las modificaciones y variaciones que conserven el espíritu y el alcance de esta invención se entienden dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Referencias.

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