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1. (WO2018164536) METHOD FOR DIAGNOSING PSYCHIATRIC DISORDERS
Document

명세서

발명의 명칭

기술분야

1   2  

배경기술

3   4   5   6  

발명의 상세한 설명

기술적 과제

7  

과제 해결 수단

8   9  

발명의 효과

10   11  

도면의 간단한 설명

12   13   14   15   16   17   18   19   20   21  

발명의 실시를 위한 최선의 형태

22   23   24   25   26   27   28   29   30   31   32   33   34   35   36   37   38   39   40   41   42   43   44   45   46   47   48   49   50   51   52   53   54   55   56   57   58   59   60   61   62   63   64   65   66   67   68   69   70   71   72   73   74   75   76   77   78   79   80   81   82   83   84   85   86   87   88   89  

산업상 이용가능성

90   91   92  

청구범위

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15  

도면

1   2   3   4   5   6   7   8   9  

명세서

발명의 명칭 : 정신장애의 진단 방법

기술분야

[1]
본 발명은 대상체로부터 채취한 시료를 분석하여 대상체의 정신 장애를 예측하거나 진단하는 방법에 관한 기술이다.
[2]

배경기술

[3]
정신 장애는 외적인 외상에 의해서 발생할 수도 있으나, 영아기에서 유아기에 적절한 주위 환경에 의한 자극이 가해지지 않아 발생할 수도 있으며, 유전적으로 내재되어 있는 경우도 있다. 예를 들어, 자폐증과 같은 발달장애는 그 원인이 명확하게 밝혀진 바 없으나 유전적 요인과 환경적 요인이 복합적으로 작용하여 발생할 수 있다고 알려져 있다.
[4]
유전적이거나 환경적인 영향이 크게 작용하는 정신 장애의 경우, 정신 장애별 특유의 행동양식이 명확히 나타나는데 시간이 걸리고 특히 유아기까지는 정신 장애 여부를 판별할 수 있는 수단이 많지 않다. 자폐증과 같은 발달장애의 경우 환자로 의심되는 사람의 행동 양식을 관찰하고 이를 분석하여 발병 여부를 예측 또는 진단하고 있다. 그러나, 객관적으로 발병을 예측 또는 진단할 수 있는 생체지표(biomarker)는 알려진 바가 많지 않고, 정확성도 높지 않은 경우가 많다.
[5]
유전적이거나 환경적인 영향이 크게 작용하는 정신 장애의 경우 발병 여부를 일찍 발견할수록 통합적인 치료를 통해 증상을 현저히 완화시킬 수 있는 등 치료 효과를 높힐 수 있다. 그러나, 시기를 놓치게 되면 치료가 매우 힘들고 행동 양식의 분석 정도로는 발병 여부의 판별도 쉽지 않기 때문에, 객관적인 기준이 될 수 있는 생체 지표가 필요하다. 생체 지표의 예로 한국 등록특허 제10-1096487호는 특정 분자량을 가지는 아미노산 서열을 이용한 자폐증 진단 방법을 개시하고 있다.
[6]

발명의 상세한 설명

기술적 과제

[7]
본 발명은 객관적인 생체지표를 기준으로 정신 장애의 예측 또는 진단하기 위한 방법을 제공하고자 한다.

과제 해결 수단

[8]
본 발명은 대상체의 피부 조직을 채취하여 시료를 준비하고 대상체 피부 조직 시료의 분석 결과와 대조군 피부 조직 시료의 분석결과를 비교하는 정신 장애의 예측 또는 진단 방법을 제공한다.
[9]
본 발명은 대상체 피부의 경피수분손실(trans epidermal water loss, TEWL)의 측정 결과와 대조군 피부의 경피수분손실 측정 결과를 비교하여 정신 장애를 판단하는 정신 장애의 예측 또는 진단 방법을 제공한다.

발명의 효과

[10]
본 발명은 고통이 수반되지 않는 비침습적인 방법을 통해 대상의 정신 장애 여부를 판단할 수 있고, 정신 장애의 발병 예측이나 진단이 가능하다. 그리고, 정신 장애를 예측 또는 진단하는데 객관적인 생물 지표를 제공할 수 있다. 또한, 유아기 이전의 대상이 정신 장애를 가지는지 여부를 알 수 있어 초기 발병 및 진단을 통한 효과적인 정신 장애 치료가 가능할 수 있다.
[11]

도면의 간단한 설명

[12]
도 1은 자폐증 유발 마우스(k/o mouse)와 정상 마우스(normal)의 피부 각질층 시료의 분석결과 중 세라마이드(C24:1/C16:1)의 몰비를 보여준다.
[13]
도 2는 자폐증 유발 마우스(k/o mouse)와 정상 마우스(normal)의 피부 각질층 시료의 분석결과 중 세라마이드(C24:1/C16:0)의 몰비를 보여준다.
[14]
도 3은 자폐증 유발 마우스(k/o mouse)와 정상 마우스(normal)의 피부 각질층 시료의 분석결과 중 스핑고미엘린(C24/C18)의 몰비를 보여준다.
[15]
도 4는 자폐증 유발 마우스(k/o mouse)와 정상 마우스(normal)의 피부 각질층 시료의 분석결과 중 스핑고미엘린(C24/C20)의 몰비를 보여준다.
[16]
도 5는 자폐증 유발 마우스와 정상 마우스의 피부 각질층 시료의 분석결과 중 스핑고신(sphingosine, So)과 스핑가닌(sphinganin, Sa)의 몰비인 So/Sa, 스핑고신과 스핑고신-1-포스페이트(sphingosine-1-phosphate, S1P)의 몰비인 So/S1P 및 스핑가닌과 스핑가닌-1-포스페이트(sphinganine-1-phosphate, Sa1P)의 몰비인 Sa/Sa1P를 보여준다.
[17]
도 6은 출생 후 1일 째 정상 새끼 마우스와 자폐증 새끼 마우스의 뇌((A)) 및 피부((B))에서 세라마이드(ceramide)의 분석 결과를 보여준다(Control; 정상 새끼 마우스, VPA; 발프론산으로 유도된 자폐증 새끼 마우스).
[18]
도 7은 출생 후 1일 째 정상 새끼 마우스와 자폐증 새끼 마우스의 뇌((A)) 및 피부((B))에서 스핑고미엘린의 분석 결과를 보여준다(SM: sphingomyelin, Control; 정상 새끼 마우스, VPA; 발프론산으로 유도된 자폐증 새끼 마우스).
[19]
도 8은 출생 후 1일 및 30일 째 정상 새끼 마우스와 자폐증 새끼 마우스의 피부 상태 변화 양상을 보여준다((A); 정상 새끼 마우스의 1일 및 30일 째 피부 변화, (B) 및 (C); 자폐증 새끼 마우스에서 1일 째 피부 상태, (D); 자폐증 새끼 마우스에서 30일 째 피부 상태, scale bar = 10㎛)
[20]
도 9는 자폐증 환자와 정상인의 경피수분손실(trans-epidermal water loss, TEWL)((A))과 피부 보습 정도((B))의 차이를 보여준다(No symptoms; 정상인, w/symptoms; 자폐증 환자).
[21]

발명의 실시를 위한 최선의 형태

[22]
이하에서 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 따로 정의하지 않는 경우 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 내용으로 해석되어야 할 것이다. 본 명세서의 도면 및 실시예는 통상의 기술자가 본 발명을 쉽게 이해하고 실시하기 위한 것으로 도면 및 실시예에서 발명의 요지를 흐릴 수 있는 내용은 생략될 수 있으며, 본 발명이 도면 및 실시예로 한정되는 것은 아니다.
[23]
본 발명은 정신 장애의 예측 또는 진단 방법에 관한 발명으로, 정신 장애를 판단하기 위한 객관적인 생체지표 및 이를 이용한 정보를 제공할 수 있다.
[24]
본 발명에 따르면, 대상체의 피부 조직을 채취하여 시료를 준비하고 대상체 피부 조직 시료를 분석한 후, 대상체 피부 조직 시료의 분석 결과와 대조군 피부 조직 시료의 분석 결과를 비교하여 정신 장애를 예측하거나 진단할 수 있다.
[25]
대상체(subject)는 정신 장애 여부를 판단하기 위한 생물, 개인 또는 집단이다. 대상체로 자폐증과 같은 정신 장애에 대한 가족력이 있어 자폐증이 의심되거나 우려되는 인간 또는 정신 장애를 가진 인간이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 대상체의 피부 조직 채취는 비침습적(noninvasive) 또는 최소 침습적(minimal-invasive) 방법으로 가능하므로 대상체의 나이, 성별, 상태에 구애받지 않는다. 비침습적 방법의 예로, 테이프 스트리핑(tape stripping)이 있으나 이에 제한되지 않는다.
[26]
대조군(control, control group)은 예측 또는 진단하고자 하는 정신 장애를 겪고 있지 않는 생물, 개인 또는 집단이다. 대조군에서 피부 조직을 채취하여 시료를 제작하고, 대조군 시료의 분석 결과를 기준으로 대상체의 시료 분석 결과를 비교할 수 있다. 대조군으로 자폐증과 같은 정신 장애가 없는 정상 인간이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 대조군의 시료 분석 결과는 정신 장애가 없는 정상인으로부터 채취한 뇌 또는 피부 조직의 데이터를 수집한 후 데이터화 시킨 것으로 대체 가능할 수 있다.
[27]
피부 조직 중 각질층의 분석만으로도 본 발명에 따른 정신 장애의 예측 또는 진단이 가능하여, 간단하고 신속하며 대상체의 부담도 없다.
[28]
일반적으로 동물(인간, 인간을 제외한 포유류 등)이 자폐증과 같은 정신 장애를 가지는지 여부는 외부로 언어 표현이나 행동 이상 현상을 보이기 전까지 쉽게 알 수 없다. 인간의 경우 정신 장애를 가지는 아이는 생후 6~12개월부터 행동 이상 증상이 나타날 수 있으나, 눈맞춤(Eye tracking)을 이용한 정신 장애의 진단 방법과 같이 비교적 정확한 진단은 생후 18~24개월이 지나야 가능한 것으로 알려져 있다. 보다 조기에 정신 장애를 진단하는 방법으로 fMRI에 의한 뇌 스캔(brain scan)방법도 있으나 어린 아이를 강제적인 수면 상태로 유도하여야 하고 MRI에 의한 위험성, 과다한 비용 등의 문제가 있다. 가장 정확한 방법은 뇌척수액 등을 채취하여 뇌의 성분 이상을 직접적으로 분석하는 것이나, 이러한 침습적인 방법은 고통을 유발하고 신생아기나 영아기의 아이에게 적절하지 않다.
[29]
본 발명은 정신 장애에서 나타나는 뇌의 지질 성분 변화와 피부의 지질 성분 변화가 매우 밀접한 관계가 있음을 실험을 통해 확인하여 발명한 것으로, 피부 지질 성분 분석을 통해서 정신 장애를 진단할 수 있다.
[30]
피부 조직 시료의 분석 결과에서, 정신 장애 여부를 판단할 수 있는 주요 생체지표(biomarker)는 스핑고지질(sphingolipid), 스핑고지질 대사물질(metabolite) 및/또는 스핑고지질 대사효소(metabolic enzyme)가 있다. 스핑고지질, 스핑고지질 대사물질 및 스핑고지질 대사효소 외에도 분석 결과의 비교를 통해 시료에 포함된 여러 물질을 생체지표로 활용할 수 있다. 그리고, 스핑고지질, 스핑고지질 대사물질 및 스핑고지질 대사효소의 분석 결과 중 어느 하나만을 생체지표로 이용할 수 있고, 이들의 분석 결과 중 둘 이상의 조합을 생체지표로 이용할 수도 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 발프론산(valproic acid)로 자폐증과 같은 정신 장애가 유발된 새끼 마우스 피부의 지질 분석을 통해 생후 28일 미만의 신생아기의 영아, 생후 6~12개월 이전의 어린 아이의 피부 지질 분석으로 자폐증과 같은 정신 장애 여부를 진달할 수 있다. 본 발명의 진단 방법은 18~24개월이 지난 아이에게서 가능한 행동관찰(behavior evalution)에 의한 발달 장애 여부 진단 방법보다 더 조기에 정신 장애를 진단할 수 있고, 조기 진단에 따라 자폐와 같은 정신 장애의 개선 효과를 현저히 향상시킬 수 있다.
[31]
스핑고지질 또는 스핑고지질 대사물질 중 세라마이드(ceramide), 세라마이드-1-인산(ceramide-1-phosphate), 스핑고신(sphingosine), 스핑고신-1-인산(sphingsine-1-phosphate), 스핑고미엘린(sphingomyelin), 글루코실세라마이드(glucosylceramide), 갈락토실세라아미드(galactosylceramide), 피토스핑고신(phytosphingosine), 피토스핑고신-1-인산(phytosphingosine-1-phosphate), 세레브로사이드(cerebroside), 강글리오사이드(ganglioside), 다이하이드로스핑고신(dihydrosphingosine), 술파타이드(sulfatide), 글로보사이드(globoside) 및 아실글리코실세라마이드(acylglucosylceramide)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상을 생체지표로 활용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[32]
시료내 스핑고지질 또는 스핑고지질 대사물질의 분석방법은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, GS-MS(Gas chromatography-mass spectrometry), LS-MS(Liquid chromatography-mass spectrometry), MALDI-TOF MS(Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flightmass spectrometry) 및 TOF-SIMS(Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 분석방법을 이용할 수 있다.
[33]
분석방법에 따라 분석 결과로 얻을 수 있는 지표가 상이할 수 있고, 상이한 지표들을 활용하여 정신 장애를 판단하는데 활용할 수 있다.
[34]
일 예로, 시료를 TOF-SIMS로 분석하여 얻을 수 있는 이차이온질량(m/z)과 이차이온질량(m/z)에서의 강도로 구성된 분광패턴을 이용하여 대조군의 분광패턴과 대상체의 분광패턴을 비교하여 정신 장애를 예측 또는 진단할 수 있다. 다른 일 예로, GS-MS나 LS-MS로 시료내 성분 분석 및 함량을 측정하고, 대조군 시료 속 특정 성분의 함량 및 대상체 시료 속 특정 성분의 함량을 비교하여 정신 장애를 예측 또는 진단할 수 있다. 또는 시료 내 특정 성분간의 몰비도 활용할 수 있다.
[35]
본 발명에 따르면, 대사체 및 대조군의 피부 시료 속 스핑고지질 대사물의 분석 결과 비교를 통해 정신 장애를 진단할 수 있으므로 다양한 시료 측정방법 및 이로부터 얻은 분석결과를 활용하는데 특별한 제한은 없다.
[36]
일반적으로 동일한 스핑고지질 또는 스핑고지질 대사물질로 분류되는 물질 중에서도 탄소 수, 결합상태 등에 따라 정신 장애를 진단하는 기준이 달라질 수 있다. 예를 들어, C14 세라마이드, C16 세라마이드, C16:1 세라마이드, C18 세라마이드, C18:1 세라마이드, C20 세라마이드, C20:1 세라마이드, C22 세라마이드, C22:1 세라마이드, C24 세라마이드, C24:1 세라마이드, C26 세라마이드, C26:1 세라마이드, C14 스핑고미엘린, C16 스핑고미엘린, C16:1 스핑고미엘린, C18 스핑고미엘린, C18:1 스핑고미엘린, C20 스핑고미엘린, C20:1 스핑고미엘린, C22 스핑고미엘린, C22:1 스핑고미엘린, C24 스핑고미엘린, C24:1 스핑고미엘린, C26 스핑고미엘린, C26:1 스핑고미엘린,등 이들은 동일하게 세라마이드나 스핑고미엘린으로 분류되나 탄소 수나 이중결합의 개수에 따라 서로 다른 세라마이드나 스핑고미엘린으로써 이용될 수 있다. 일 예로, 대사체 시료의 C16:1 세라마이드 대 C24:1 세라마이드의 몰비가 대조군 시료보다 더 낮은 경우나, 대사체 시료의 C16:0 세라마이드 대 C24:1 세라마이드의 몰비가 대조군 시료보다 더 낮은 경우 정신 장애로 진단할 수 있다. 또 다른 일 예로, 대사체 시료의 C18 스핑고미엘린 대 C24 스핑고미엘린의 몰비가 대조군 시료보다 더 낮은 경우나, 대사체 시료의 C20 스핑고미엘린 대 C24 스핑고미엘린의 몰비가 대조군 시료보다 더 낮은 경우 정신 장애로 진단할 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명의 일 실시예에 따르면, 대상체로부터 채취한 피부 조직 시료에서 C24 세라마이드 및 C24:1 세라마이드의 함량이 대조군으로부터 채취한 피부 조직 시료보다 낮으면 정신 장애로 진단할 수 있다. 본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 대상체로부터 채취한 피부 조직 시료에서 C24 스핑고미엘린 및 C24:1 스핑고미엘린의 함량이 대조군으로부터 채취한 피부 조직 시료보다 낮으면 정신 장애로 진단할 수 있다. 특히, 대상체로부터 얻은 피부 조직 시료에 포함된C24 세라마이드, C24:1 세라마이드, C24 스핑고미엘린 및 C24:1로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 스핑고지질 또는 스핑고지질 대사물질은 대조군으로부터 얻은 피부 조직에 포함된 것보다 현저히 그 함량이 적어 정신 장애의 진단의 주요 생체 지표로 선택할 수 있다.
[37]
스핑고지질 또는 스핑고지질 대사물질을 생체지표로 활용할 때, 어느 하나 이상의 함량을 측정하고 대조군 시료에 포함된 함량을 기준으로 하여 비교할 수 있다. 이러한 스핑고지질 또는 스핑고지질 대사물질의 함량 비교외에도 둘 이상의 스핑고지질 또는 스핑고지질 대사물질간 몰비를 비교할 수도 있으며, 시료 내 스핑고지질 또는 스핑고지질 대사물질의 분석 결과를 다양하게 활용할 수 있다. 일 예로, 대사체 시료의 스핑가닌(sphinganine)대 스핑고신(sphingosine)의 몰비와 스핑고신-1-포스페이트(sphingosine-1-phosphate)대 스핑고신의 몰비가 대조군 시료보다 더 높은 경우 정신 장애로 진단할 수 있다. 반면, 대사체 시표의 스핑가닌-1-포스페이트(sphinganine-1-phosphate)대 스핑가닌의 몰비가 대조군 시료보다 더 낮은 경우 정신 장애로 진단할 수 있다.
[38]
스핑고지질 대사효소도 정신 장애의 예측 또는 진단에 이용할 수 있는 주요 생체지표이다.
[39]
시료 내 스핑고지질 대사효소의 기질은 스핑고지질 및 스핑고지질 대사물질 중 어느 하나가 되므로, 대조군과 대사체의 스핑고지질 대사효소의 활성 정도가 서로 상이할 수 있다. 스핑고지질 대사효소의 활성 정도를 분석하여 정신 장애의 예측 및 진단이 가능하며, 스핑고지질 대사물질 분석 결과와 함께 활용하여 보다 정확한 정신 장애의 판단도 가능하다.
[40]
스핑고지질 대사효소로 세린 팔미토일트랜스퍼레이즈(serine palmitoyltransferase), 세라마이드 신테이즈(ceramide synthase 1~6), ELOVL (elongation of very long chain fatty acid), 스핑고신 키나아제(sphingosine kinase), 세라마이드 카이네이즈(ceramide kinase), 스핑고미엘리나아제(sphingomyelinase), 베타-글루코세레브로시다아제(beta-glucocerebrosidase), 갈락토세레브로시다아제(galactocerebrosidase) 및 이들의 아형(subtype)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 생체지표로 활용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[41]
스핑고지질의 대사효소의 활성 정도를 측정하여 정신 장애의 예측 또는 진단이 가능하다. 특정 스핑고지질 대사효소는 하나의 효소 활성 정도를 측정하여 정신 장애를 판단할 수 있다. 그리고, 둘 이상의 스핑고지질 대사효소의 활성 정도를 측정한 값을 비교하여 보다 정확한 정신 장애를 판단할 수도 있다. 또한, 스핑고지질 대사물질들의 함량과 스핑고지질 대사효소의 활성 정도를 측정한 값을 복합적으로 활용하여 보다 정확한 정신 장애를 예측 또는 진단할 수 있다.
[42]
대사체 및 대조군의 동일한 부위에서 피부를 채취한다면 피부의 채취 부위는 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는 손등, 발등, 다리 또는 팔이나 이에 제한되지 않는다. 비침습적 채취가 가능하므로 외부로 쉽게 노출될 수 있는 부위 어디에서도 피부 시료를 채취할 수 있다.
[43]
피부 조직 중 각질층을 채취하여 시료로 사용하여도 정신 장애의 판별을 위한 분석이 가능하기 때문에, 테이프 스트리핑(tape stripping)과 같은 비침습적 방법으로 간단하게 피부 조직 시료를 얻을 수 있다.
[44]
본 발명에 따르면 피부 조직을 채취하지 않아도 정신 장애를 예측 또는 진단할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.
[45]
피부 조직의 채취 없이, 대상체 피부의 경피수분손실(trans epidermal water loss, TEWL)의 측정 결과와 대조군 피부의 경피수분손실 측정 결과를 비교하여 정신 장애를 예측 또는 진단할 수 있다.
[46]
각질층의 각질세포간 지질의 기능인 표피투과장벽 기능(epidermal permeability barrier function)은 세라마이드와 같은 스핑고지질 성분에 의해 나타난다. 그러므로, 피부내 스핑고지질 성분들의 비정상적인 변화는 피부의 표피투과장벽기능의 변화를 유발할 수 있고, 경피수분손실의 측정을 통해 표피투과장벽기능의 변화를 평가할 수 있다.
[47]
경피수분손실은 피부 표면에서 일정 시간 동안 소실되는 수분 증가의 양을 비침습적으로 측정한 결과로 여러가지 측정 장비, 방법 등을 통해 객관적인 측정이 가능한 지표 중 하나이다.
[48]
경피수분손실의 측정과 정신 장애의 관계의 일 예로, 대상체 피부의 경피수분손실이 대조군에 비하여 더 높은 경우 정신 장애로 진단할 수 있다. 특히 본 발명의 일 실시예에 따르면, 자폐증을 예측 또는 진단하는데 경피수분손실의 측정 결과를 객관적인 생체지표로 활용할 수 있고, 자폐증 환자들의 경피수분손실은 정상인보다 상당히 높게 나타난다.
[49]
본 발명에 따라 예측 또는 진단할 수 있는 정신 장애로 태아기, 신생아기, 영아기 또는 유아기 이전에 발병할 수 있고, 장애 여부의 판별이 어려운 발달장애가 바람직하다. 자폐증, 발달 장애, 행동 장애, 주의력결핍 과잉행동(ADHD), 주의력결핍질환(ADD), 우울증, 기분 장애, 망상 장애, 강박 장애, 기억 장애, 인지 장애, 공황 발작 및 주의력 장애로부터 선택되는 정신 장애가 대표적이나 이에 제한되지 않는다.
[50]
본 발명의 정신 장애 진단 방법은 자폐증과 같은 정신 장애를 치료하기 위한 치료제 개발에 있어, 효과적인 치료제의 스크리닝 방법에도 활용할 수 있다.
[51]
[52]
이하에서 본 발명을 실시하기 위한 실시예에 대하여 설명한다. 실시예는 본 발명을 실시하기 위한 하나의 예시에 해당하는 것으로서 본 발명이 실시예에 의해 한정 해석되어서는 안된다.
[53]
[54]
[ 실시예 1]
[55]
GABA knock- out 마우스 모델에서 스핑고지질 분석을 통한 정신 장애의 예측 또는 진단
[56]
실시예 1-1. 자폐증 유발 쥐의 스핑고지질 분석
[57]
Gamma-amino butyric acid (GABA) 수용체 넉아웃 마우스(The Jackson Laboratory) 뇌를 1 X PBS로 세척하고 약 10 mg 뇌를 준비하였다. 10mg 뇌에 800㎕의 클로로포름과 400㎕의 메탄올 그리고 1M HCl 300㎕ 및 내부 표준물질로 C17-세라마이드(d17:1/C18:0), C17 스핑고신 일인산 및 C17 스핑고신을 넣고 30분간 지질 성분을 추출하였다. 이 후, 10,000Xg 원심분리를 수행하고 클로로포름 층을 새로운 튜브로 옮겼다. 이어서 진공농축기를 이용하여 농축 후 1000㎕의 메탄올에 재용해하여 시료를 준비하고 시료 10㎕를 LC-MS/MS에 주입하여 스핑고지질을 분석하였다. 질량분석기의 분석은 MRM (multiple reaction mode)를 사용하여 분석을 시행하였다.
[58]
분석결과는 뇌의 무게 wet weight g당 측정된 스핑고지질을 nmol로 정량 하였다.
[59]
실시예 1-2. 자폐증 마우스의 스핑고지질 분석결과와 정상 마우스의 스핑고지질 대사물질 분석결과의 비교
[60]
실시예 1-1.의 자폐증 유발 마우스의 스핑고지질 분석결과와 정상 마우스의 스핑고지질 분석결과를 비교하였다.
[61]
세라마이드(C24:1/C16:1)의 몰비는 자폐증 마우스에서 1.0 미만(약 0.9)이었고, 정상 마우스에서 2.5를 초과(약 2.6)하였다(도 1). 세라마이드(C24:1/C16:0)의 몰비는 자폐증 마우스에서 1.0 미만(약 0.9)이었고 정상 마우스에서 약 2.0이었다(도 2). 세라마이드의 경우 자폐증 마우스에서 그 함량이 급격히 감소한 것을 확인하였고, 특정 세라마이드들의 몰비 역시 정상 마우스보다 감소함을 알 수 있었다.
[62]
스핑고미엘린(C24/C18)의 몰비는 자폐증 마우스에서 1.0 미만(약 0.8)이었고, 정상 마우스에서 1.0을 초과(약 1.1)하였다(도 3). 스핑고미엘린(C24/C20)의 몰비는 자폐증 마우스에서 1.5 미만(약 1.3)이었고, 정상 마우스에서 1.5를 초과(약 1.55)를 초과하였다(도 4). 스핑고미엘린의 경우 자폐증 마우스에서 그 함량이 감소한 것을 확인하였고, 특정 스핑고미엘린들의 몰비 역시 정상 마우스보다 감소함을 알 수 있었다.
[63]
스핑고지질 중 스핑고신(sphingosine, So)과 스핑가닌(sphinganin, Sa)의 몰비인 So/Sa는 자폐증 마우스 약 3이고 정상 마우스에서 약 2로 자폐증 마우스에서 더 높게 나타났다. 스핑고신과 스핑고신-1-포스페이트(sphingosine-1-phosphate, S1P)의 몰비인 So/S1P는 자폐증 마우스에서 15를 초과(약 18)하였고 정상 마우스에서 15 미만(약 14)으로 자폐증 마우스에서 더 높게 나타났다. 스핑가닌과 스핑가닌-1-포스페이트(sphinganine-1-phosphate, Sa1P)의 몰비인 Sa/Sa1P는 정상 마우스에서 약 10이었고 자폐증 마우스에서 약 8로 정상 마우스에서 더 높게 나타났다(도 5). 스핑고신, 스핑가닌, 스핑고신-1-포스페이트 및 스핑가닌-1-포스페이트 중 둘 이상의 몰비를 측정하여 자폐를 예측 또는 진단할 수 있음을 확인할 수 있었다.
[64]
[65]
[ 실시예 2]
[66]
발프론산 ( valproic acid) 처리로 유도된 자폐 마우스 모델에서 스핑고지질 분석을 통한 정신 장애의 예측 또는 진단
[67]
실시예 2-1. 발프론산을 이용한 자폐 마우스 모델 제작
[68]
인간을 포함한 임신 중인 동물이 발프론산에 노출되면 자폐증을 포함한 정신장애 질환을 가진 태아를 출산하는 것으로 알려져 있다. 발프론산에 의해 자폐증 등 정신 장애 질환이 유발된 태아가 출산될 확률은 발프론산의 영향을 받지 않고 태아난 정상 태아에 비해 수배~수십배 정도로 알려져 있다(Nicolini, C., Fahnestock, M., The valproic acid-induced rodent model of autism, Exp. Neurol. (2017),).
[69]
본 실시예에서는 임신 중인 마우스에 발프론산을 노출시켜 자폐증이 유발된 새끼 마우스를 얻고, 이를 이용하여 실험을 진행하였다.
[70]
임신 중인(임신 10~12일 정도) 암컷 SD 마우스(SD rat)에 10 ㎖/㎏의 발프론산을 피하에 투여하고, 정상적인 환경에서 사육하여 출산을 유도하였다. 태어난 새끼 마우스를 A, B 두 그룹으로 분류하였다. A 그룹의 새끼 마우스는 출생 후 1일 차에 피부와 뇌의 세라마이드를 분석하였고, B 그룹의 새끼 마우스는 출생 후 14 차에 피부와 뇌의 세라마이드를 분석하였다. 발프론산을 처리하지 않은 임신 SD 마우스에서 태어난 새끼 마우스를 대조군으로 사용하였다.
[71]
실시예 2-2. 자폐증 마우스 모델의 뇌 및 피부 지질 분석
[72]
새끼 마우스의 뇌 및 피부의 지질 분석은 실시예 1과 같은 방법으로 진행하였다. 새끼 마우스의 피부 세라마이드 분석은 D-Squame tape (Cu-Derm Corporation, Dallas, USA)를 이용하여 테이프 스트리핑(tape-stripping)을 수행하여 피부 각질층을 채취하였다. 채취한 D-Squame tape에 800㎕의 클로로포름과 400㎕의 메탄올 그리고 1M HCl 300㎕ 및 내부 표준물질로 C17-세라마이드(d17:1/C18:0), C17 스핑고신 일인산 및 C17 스핑고신을 넣고 30분간 지질 성분을 추출하였다. 이 후, 10,000 x g 원심분리를 수행하고 클로로포름 층을 새로운 튜브로 옮겼다. 이어서 진공농축기를 이용하여 농축 후 1000㎕의 메탄올에 재용해하여 시료를 준비하고 시료 10㎕를 LC-MS/MS에 주입하여 스핑고지질을 분석하였다. 질량분석기의 분석은 MRM (multiple reaction mode)를 사용하여 분석을 시행하였다.
[73]
뇌 및 피부의 분석결과는 분석에 사용하기 위해 추출한 단백질을 기준으로 정량하였다(pmol/추출 단백질(mg)).
[74]
자폐증이 유발된 출생 후 1일 째 새끼 마우스 모델에서 뇌의 세라마이드 분석 결과와 피부 세라마이드 분석 결과에서 자폐증 모델의 특이적인 결과가 나타났다. 뇌 및 피부 세라마이드 분석 결과에서 N-acyl장쇄(long N-acyl chain)를 가진 세라마이드인 C24:1 세라마이드, C24 세라마이드, C26:1 세라마이드 및 C26 세라마이드가 대조군(자폐가 유발되지 않은 정상 새끼 마우스)에 비해 감소하는 경향이 나타났다. 뇌 세라마이드 분석 결과에서 C16 세라마이드는 증가하고, C18 세라마이드는 큰 변화가 없었으나, 피부 세라마이드 분석 결과에서는 C16 세라마이드, C16:1세라마이드 및 C18 세라마이드가 증가하는 경향이 나타났다. 특히, 뇌와 피부에서C24:1 세라마이드 및 C24 세라마이드의 감소량은 대조군에 비해(정상 새끼 마우스)에 비해 현저히 감소하는 경향이 나타났다(도 6).
[75]
자폐증이 유발된 출생 후 1일 째 새끼 마우스 모델에서 뇌의 스핑고미엘린 분석 결과와 피부 스핑고미엘린 분석 결과에서 자폐증 모델의 특이적인 결과가 나타났다. 뇌 및 피부 스핑고미엘린 분석 결과에서 N-acyl장쇄(long N-acyl chain)를 가진 스핑고미엘린인 C24:1 스핑고미엘린, C24 스핑고미엘린, C26:1 스핑고미엘린 및 C26 스핑고미엘린이 대조군(자폐가 유발되지 않은 정상 새끼 마우스)에 비해 감소하는 경향이 나타났다. 뇌 스핑고미엘린 분석 결과에서 C16 스핑고미엘린 및 C18 스핑고미엘린은 증가하였으나, 피부 스핑고미엘린 분석 결과에서는 C18 스핑고미엘린은 증가하는 경향이 나타났다. 특히, 뇌와 피부에서 C24:1 스핑고미엘린 및 C24 스핑고미엘린의 감소량은 대조군에 비해(정상 새끼 마우스)에 비해 현저히 감소하는 경향이 나타났다(도 7).
[76]
출생 후 1일 및 14일 후 피부 스핑고지질의 변화 양상을 확인한 결과 출생 후 1일 차에서는 스핑고지질의 변화 양상이 높게 나타났으나 출생 후 14일 차에는 변화 양상이 1일차에 비해 낮게 나타났다. 출생 일 수에 따른 스핑고지질의 변화 양상의 차이는 출생 후 지질 분석을 빠르게 수행할수록 자폐 등 정신 질환 진단의 정확도를 높힐 수 있음을 뒷받침하는 것이었고, 신생아 등 생후 1~2주 사이에도 자폐증과 같은 정신 장애를 조기 진단할 수 있음을 보여주는 것이었다.
[77]
이와 같은 결과를 통해 자폐증과 같은 정신질환을 가지는 동물은 뇌와 피부에서 매우 유사한 지질 구성을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
[78]
이와 같은 결과는 자폐증과 같은 정신 질환의 진단을 위해 척수(척수액)나 뇌 채취 등 고통이 수반되는 침습적인 방법을 사용하지 않고 피부 채취와 같은 비침습적(Non-invasive) 또는 최소 침습적(minimal- invasive) 방법을 통해 자폐증 생후 초기에 진단할 수 있음을 보여주는 것이었다.
[79]
실시예 2-3. 자폐증 마우스 모델의 피부 및 뇌의 조직 검사
[80]
자폐증이 유도된 새끼 마우스의 피부와 뇌의 조직을 전자현미경으로 관찰하였다. 출생 후 1일 차 및 30일 차의 새끼 마우스의 피부와 뇌 조직을 관찰하였다.
[81]
관찰 결과 출생 후 1일차에서는 자폐증이 유도된 발달장애 새끼 마우스의 뇌 및 피부에서 모두 비정상적인 조직 발달 패턴이 나타났으나, 출생 후 30일에서는 비정상적인 조직이 개선됨을 확인할 수 있었다(도 8)
[82]
이러한 결과는 출생 후 피부 지질 분석을 빠르게 수행할수록 자폐 등 정신 질환 진단의 정확도를 높힐 수 있음을 뒷받침하는 것이었고, 신생아 등 생후 1~2주 사이에도 자폐증과 같은 정신 장애를 조기 진단할 수 있음을 보여주는 것이었다.
[83]
[84]
[ 실시예 3]
[85]
경피수분손실의 측정을 통한 정신 장애의 예측 또는 진단
[86]
25명의 자폐증 환자(발달 장애 환자) 및 정상인의 팔 안쪽 피부에서 경피수분손실(trans-epidermal water loss: TEWL;)과 피부 보습 정도(hydration)를 측정하였다. 경피수분손실(g/h/m 2)과 피부보습정도(arbitrary Corneometer ® units)는 MPA5 device (Courage & Khazaka, Cologne, Germany)에 경피수분손실 측정을 위한 probe인 TM300 및 피부보습정도 측정 probe CM825를 각각 연결하여 측정하였다.측정 대상의 평균 나이는 19.2세였다.
[87]
측정결과, 자폐증 환자의 경피수분손실이 정상인에 비하여 현저히 높게 나타났고, 피부 보습 기능도 떨어지는 것을 확인할 수 있었다(도 9).
[88]
이러한 결과는 자폐증 환자의 경우 피부 장벽기능이 정상인에 비해 악화된 것으로, 피부의 지질 분석과 함께 경피수분손실, 피부 보습 정도 등 피부의 장벽기능 측정을 통해 자폐증 환자를 진단할 수 있음을 보여주는 것이었다.
[89]

산업상 이용가능성

[90]
본 발명은 대상체로부터 얻은 피부 조직 시료의 분석을 통해 정신 장애를 예측 또는 진단하여 정신 장애의 예방과 치료에 이용할 수 있고, 정신 장애의 예방과 치료에 필요한 정보를 제공하거나 치료제 개발에 이용할 수 있다.
[91]
[92]

청구범위

[청구항 1]
대상체로부터 얻은 피부 조직 시료를 준비하고, 대상체로부터 얻은 피부 조직 시료의 분석 결과와 대조군으로부터 얻은 피부 조직 시료의 분석결과를 비교하는 정신 장애의 예측 또는 진단 방법.
[청구항 2]
제1항에 있어서, 대상체로부터 얻은 피부 조직 시료의 스핑고지질 또는 스핑고지질 대사물 분석 결과와 대조군으로부터 얻은 피부 조직 시료의 스핑고지질 또는 스핑고지질 대사물 분석 결과를 비교하는 정신 장애의 예측 또는 진단 방법.
[청구항 3]
제1항에 있어서, 상기 피부 조직은 비침습적 방법으로 채취한 것인 정신 장애의 예측 또는 진단 방법.
[청구항 4]
제2항에 있어서, 상기 스핑고지질 또는 스핑고지질의 대사물은 세라마이드(ceramide), 세라마이드-1-인산(ceramide-1-phosphate), 스핑고신(sphingosine), 스핑고신-1-인산(sphingsine-1-phosphate), 스핑고미엘린(sphingomyelin), 글루코실세라마이드(glucosylceramide), 갈락토실세라아미드(galactosylceramide), 피토스핑고신(phytosphingosine), 피토스핑고신-1-인산(phytosphingosine-1-phosphate), 세레브로사이드(cerebroside), 강글리오사이드(ganglioside), 다이하이드로스핑고신(dihydrosphingosine), 술파타이드(sulfatide), 글로보사이드(globoside) 및 아실글리코실세라마이드(acylglucosylceramide) 중 적어도 하나 이상인 정신 장애의 예측 또는 진단 방법.
[청구항 5]
제2항에 있어서, 상기 스핑고지질 또는 스핑고지질의 대사물 분석은 GS-MS(Gas chromatography-mass spectrometry), LS-MS(Liquid chromatography-mass spectrometry), MALDI-TOF MS(Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flightmass spectrometry) 및 TOF-SIMS(Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 분석방법인 정신 장애의 예측 또는 진단 방법.
[청구항 6]
제2항에 있어서, 대상체로부터 얻은 피부 조직 시료의 스핑고지질 또는 스핑고지질 대사물 분석 결과와 대조군으로부터 얻은 시료의 스핑고지질 또는 스핑고지질 대사물 분석 결과를 비교하여, 대상체로부터 얻은 피부 조직 시료 내 세라마이드 함량이 대조군으로부터 얻은 시료 내 세라마이드 함량보다 더 낮으면 정신 장애로 판단하는 정신 장애의 예측 또는 진단 방법.
[청구항 7]
제6항에 있어서, 상기 세라마이드는 C24:1 세라마이드 및 C24 세라마이드인 정신 장애의 예측 또는 진단 방법.
[청구항 8]
제2항에 있어서, 대상체로부터 얻은 피부 조직 시료의 스핑고지질 또는 스핑고지질 대사물 분석 결과와 대조군으로부터 얻은 시료의 스핑고지질 또는 스핑고지질 대사물 분석 결과를 비교하여, 대상체로부터 얻은 피부 조직 시료 내 스핑고미엘린 함량이 대조군으로부터 얻은 시료 내 스핑고미엘린 함량보다 더 낮으면 정신 장애로 판단하는 정신 장애의 예측 또는 진단 방법.
[청구항 9]
제8항에 있어서, 상기 스핑고미엘린은 C24:1 스핑고미엘린 및 C24 스핑고미엘린인 정신 장애의 예측 또는 진단 방법.
[청구항 10]
제2항에 있어서, 대상체로부터 얻은 피부 조직 시료의 스핑고지질 또는 스핑고지질 대사물 분석 결과와 대조군으로부터 얻은 피부 조직 시료의 스핑고지질 또는 스핑고지질 대사물 분석 결과를 비교하여, 대상체로로부터 얻은 피부 조직 시료 내 So(sphingosine)/Sa(sphinganine) 몰비가 대조군으로부터 얻은 피부 조직 시료 내 So(sphingosine)/Sa(sphinganine)몰비보다 더 낮으면 정신 장애로 판단하는 정신 장애의 예측 또는 진단 방법.
[청구항 11]
제2항에 있어서, 대상체로부터 얻은 피부 조직 시료의 스핑고지질 대사물 분석 결과와 대조군으로부터 얻은 피부 조직 시료의 스핑고지질 대사물 분석 결과를 비교하여, 대상체로부터 얻은 피부 조직 시료 내 So(sphingosine)/S1P(sphingosine-1-phosphate) 몰비가 대조군으로부터 얻은 피부 조직 시료 내 So(sphingosine)/S1P(sphingosine-1-phosphate) 몰비보다 더 높으면 정신 장애로 판단하는 정신 장애의 예측 또는 진단 방법.
[청구항 12]
제1항에 있어서, 상기 피부 조직은 피부 각질층인 정신 장애의 예측 또는 진단 방법.
[청구항 13]
제1항에 있어서, 상기 정신 장애는 자폐증, 주의력결핍 과잉행동(ADHD), 주의력결핍질환(ADD), 우울증, 기분 장애, 망상 장애, 강박 장애, 기억 장애, 인지 장애, 공황 발작 및 주의력 장애로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 정신 장애인 예측 또는 진단 방법.
[청구항 14]
대상체로부터 얻은 피부 조직 시료의 경피수분손실(trans epidermal water loss, TEWL)의 측정 결과와 대조군으로부터 얻은 피부 조직 시료의 경피수분손실 측정 결과를 비교하여 정신 장애를 판단하는 정신 장애의 예측 또는 진단 방법.
[청구항 15]
대상체로부터 얻은 피부 조직 시료를 준비하고, 대상체로부터 얻은 피부 조직 시료의 분석 결과와 대조군으로부터 얻은 피부 조직 시료의 분석결과를 비교하는 정신 장애를 예측 또는 진단하기 위한 정보제공방법.

도면

[도1]

[도2]

[도3]

[도4]

[도5]

[도6]

[도7]

[도8]

[도9]