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1. (WO2019043282) COMBINED PRODUCT COMPRISING A MODIFIED MESENCHYMAL STEM CELL AND AN ANTIGENIC SUBSTANCE
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DESCRIPCIÓN

Producto de combinación que comprende una célula madre mesenquimal modificada y una sustancia antigénica.

Campo técnico

La presente solicitud se refiere a un producto de combinación que comprende una célula madre mesenquimal modificada y una sustancia antigénica. El producto de combinación puede usarse como medicamento, en particular, como medicamento para el tratamiento de cáncer. La presente solicitud también se refiere a un método para producir una célula madre mesenquimal modificada que comprende un parásito intracelular y a un kit que comprende una célula madre mesenquimal, una sustancia antigénica y un inhibidor de la proteína o del gen MyD88 y/o un inhibidor del receptor de tipo Toll-like 4 (TLR4) y/o del receptor de tipo Toll-like 9 (TLR9) y/o de cualquier otro receptor TLR cuya señalización intracelular active la proteína MyD88.

Técnica anterior

La viroterapia oncolítica es una modalidad de tratamiento emergente que usa virus competentes para la replicación para atacar células cancerosas. El objetivo principal de este tipo de terapia consiste en usar un virus oncolítico que es capaz de infectar y eliminar células cancerosas sin provocar daños al tejido sano. Aunque la actividad oncolítica del virus es importante, otra cuestión relevante es la respuesta inmunitaria que puede ejercer la terapia sobre un paciente (Russell et al, 2012).

Aunque el interés en la viroterapia ha aumentado a lo largo de los años (Litchy et al, 2014), la idea de usar un virus para tratar el cáncer ya tiene 50 años. La observación de que la administración de determinados virus retrasaba el crecimiento de tumores ya intrigó a los científicos hace 50 años (Kelly y Russell, 2007; Asada, 1974). Sin embargo, en la mayoría de los casos la viroterapia siguió siendo ineficaz porque el virus se aclaraba por el sistema inmunitario o la terapia producía efectos secundarios no deseados.

Estos problemas todavía limitan el uso de viroterapia en la actualidad. La propia respuesta inmunitaria del paciente frente al virus puede provocar la eliminación del virus y sus efectos terapéuticos tras la primera dosis. Además, la incapacidad del virus para alcanzar micrometástasis tras la administración sistémica y la eliminación del virus por el hígado y el bazo (Underhill y Ozinsky, 2002) también reducen la eficacia del virus en el tratamiento de metástasis.

La solución a las limitaciones anteriores se basa en el uso de una célula transportadora, la cual debe transportar el virus al sitio tumoral al tiempo que camufla el virus oncolítico. Mediante esta estrategia de tipo "caballo de Troya" puede ocultarse al virus oncolítico del sistema inmunitario del huésped y puede aumentarse la duración del virus oncolítico. Además, el uso de células que migran hacia el microentorno del tumor aumenta la carga viral en los sitios tumorales relevantes tras la administración sistémica del portador y del virus.

Se ha mostrado que las células madre mesenquimales (MSC) migran hacia tumores y sitios de inflamación (Ling et al, 2010; Murphy et al, 2013; Ramírez et al, 2015). Por tanto, se han implementado MSC en terapias contra el cáncer. En un caso, se han usado MSC como portador para un virus del sarampión oncolítico (ClinicalTrials.gov ID: NCT02068794) y en otro caso se han usado MSC como portador para un adenovirus oncolítico (ClinicalTrials.gov ID: NCT01844661). La terapia con "Celyvir" comprende el uso de células madre mesenquimales como portadores para un adenovirus modificado por ingeniería y se ha usado para tratar pacientes que padecen tumores que no responden al tratamiento (Melen et al, 2016).

Actualmente existe la necesidad de un producto de combinación que pueda usarse para tratar diferentes tipos de cáncer. Un objetivo de la presente solicitud es proporcionar dicho producto de combinación que pueda usarse no sólo para tratar diferentes tipos de cáncer sino también cualquier enfermedad infecciosa ya sea esta viral o bacteriana.

Bibliografía

Asada, T (1974). Treatment of human cáncer with mumps virus. Cáncer 34, 1907-1928.

Kelly, EJ y Russell SJ (2007). History of oncolytic viruses: génesis to genetic engineering. Mol Ther 15 (4), 651-659.

Ling, X, Marini F, Konopleva M, Schober W, Shi Y, Burks J, Clise-Dwyer K, Wang RY, Zhang W, Yuan X, Lu H, Caldwell L, y Andreeff M (2010). Mesenchymal stem cells overexpressing IFN-β inhibit breast cáncer growth and metastases through Stat3 signaling in a syngeneic tumor model. Cáncer Microenviron 3, 83-95.

Litchy BD, Breitbach CJ, Stojdl DF y Bell JC (2014). Going viral with cáncer immunotherapy. Nat Rev Cáncer 14 (8), 559-567.

Melen GJ, Franco-Luzon L, Ruano D, Gonzalez-Murillo A, Alfranca A, Casco F, Lassaletta A,

Alonso M, Madero L, Alemany R, García-Castro J y Ramírez M (2016). Influence of carrier cells on the clinical outcome of children with neuroblastoma treated with high dose of oncolytic adenovirus delivered in mesenchymal stem cells. Cáncer Lett 371 , 161-170.

Murphy MB, Moncivais K, y Caplan Al (2013). Mesenchymal stem cells: environmentally responsible therapeutics for regenerative medicine. Exp Mol Med 45:e54.

Ramírez M, García-Castro J, Melen Gj, González-Murillo A y Franco-Luzón L (2015). Patient-derived mesenchymal stem cells as delivery vehicles for oncolytic virotherapy: novel state-of-the art technology. Oncolytic Virotherapy 4, 149-155.

Russell, SJ, Peng KW y Bell JC (2012). Oncolytic virotherapy. Nat Biotech 30 (7), 658-670.

Underhill, DM y Ozinsky, A (2002). Phagocytosis of microbes: complexity in action. Ann Rev Immunology 20, 825-852.

Figuras

Figura 1 : Caracterización de MSC murinas derivadas de tejido adiposo (mMSC). Las mMSC cultivadas se caracterizan por una morfología de tipo fibroblasto. La imagen de microscopio corresponde a mMSC BL6.

Figura 2: Activación de la ruta de NF-κΒ. a) Se transdujeron las MSC murinas (mMSC) con un sistema de lentivirus para detectar la activación de la ruta de NF-κΒ mediante la expresión de luciferasa tras la infección con ICOVIR-5. Las sombras más oscuras de gris corresponden a Celyvir (células infectadas). La expresión de luciferasa en células TLR4"'" fue significativamente mayor tras la infección con ICOVIR-5. B) La proporción de expresión de luciferasa en células infectadas (Celyvir) con respecto a células no infectadas (mMSC) muestra que la ruta de N F-KB se activó en todos los tipos de célula sometidos a prueba tras la infección con ICOVIR-5. La proporción de expresión de la ruta de NF-κΒ en células TLR4"'" tras la infección con ICOVIR-5 fue significativamente mayor en comparación con células BL6 y BL10. Se consideró que P<0,05 (*) y P<0,01 (**) eran estadísticamente significativos.

Figura 3: Detección de Akt y Jun fosforilados. Se realizó una inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos específicos para pAkt y pJun en células infectadas (Celyvir) 24 horas tras la infección y en células no infectadas (mMSC). Se usó actina como control de carga.

Figura 4: Migración de mMSC infectadas y no infectadas hacia tumores derivados de la línea celular CMT64. A) Imagen de microscopio de células infectadas (Celyvir) y células no infectadas (mMSC) migradas, el campo de visión era de 10X. b) Gráfico que muestra el número de Celyvir y mMSC que migraron hacia las células tumorales CMT 64. Las sombras más oscuras de gris corresponden a Celyvir (células infectadas). C) La proporción de células migradas en Celyvir con respecto a mMSC muestra que la migración era similar en todos los tipos de célula sometidos a prueba tras la infección con ICOVIR-5. Se consideró que P<0,05 (*) era estadísticamente significativo.

Figura 5: Desarrollo de experimento para someter a prueba la eficacia de tratamientos con Celyvir. A) Cronograma de los experimentos realizados in vivo. Se inocularon ratones C57BL/6J con tumores derivados de CMT64-Luc y se trataron cada 5 días con Celyvir. Tras la cuarta dosis, se detuvo el tratamiento con Celyvir y se realizó un seguimiento del desarrollo del tumor. B) Visualización in vivo de los tumores CMT64-Luc para establecer grupos homogéneos. Las imágenes son de 6 ratones al azar y sirven como ejemplos.

Figura 6: Desarrollo del tumor durante el tratamiento con dosis bajas de Celyvir. A) Gráfico que muestra el aumento del volumen del tumor a lo largo del tiempo. Celyvir usando mMSC TLR4"'" y TLR9"'" como portadores ralentizó el crecimiento del tumor en comparación con los demás grupos. B) Gráfico que muestra el aumento del volumen de tumores tratados individuales a lo largo del tiempo en comparación con la media de volumen tumoral del grupo de PBS (línea de color azul oscuro). C) Gráfico que muestra el volumen final de los tumores. Las mMSC TLR4"'" y TLR9"'" redujeron el tamaño final del tumor. D) Gráfico que muestra el peso final de los tumores. El peso de los tumores se correlacionó con su volumen.

Figura 7: Desarrollo del tumor durante el tratamiento con dosis altas de Celyvir. Gráfico que muestra el aumento del volumen del tumor a lo largo del tiempo. El gráfico muestra una reducción del 59,3% del volumen tumoral en el grupo tratado con Celyvir TLR4"'" en comparación con el grupo al que se le administró PBS. B) Gráfico que muestra el aumento del volumen de tumores tratados individuales a lo largo del tiempo en comparación con la media del volumen tumoral del grupo de PBS (línea de color azul oscuro).

Figura 8: Análisis de la población de células inmunitarias que se infiltraron en el tumor usando citometría de flujo. A) Porcentaje de población de células CD45+ que se infiltraron en el tumor. B) Porcentaje de población de células CD3+ que se infiltraron en el tumor. C) Porcentaje de población de células CD4+/CD8+ que se infiltraron en el tumor. Las sombras más oscuras de gris corresponden a células CD4+. D) Proporción de células CD4+/CD8+ que se infiltraron en el tumor. E) Porcentaje de población de células NK que se infiltraron en el tumor. F) Porcentaje de población de células dendríticas que se infiltraron en el tumor. G) Porcentaje de población de macrófagos (M1 es fenotipo proinflamatorio, M2 es fenotipo antiinflamatorio) que se infiltraron en el tumor. Las sombras más oscuras de gris corresponden a células M2. H) Porcentaje de población de neutrófilos (N1 y N2) que se infiltraron en el tumor. Las sombras más oscuras de gris corresponden a células N2. Se consideró que P<0,05 (*) era estadísticamente significativo.

Figura 9: Histología de tumores CMT64-Luc. A) Los tumores tratados con Celyvir TLR4"'" tenían linfocitos infiltrados en su periferia. B) También se observaron eosinófilos infiltrados (flechas) en tumores tratados con Celyvir TLR4"'". C) Esta imagen corresponde a un tumor que no se trató. No se observó ninguna infiltración similar de células inmunitarias en esta muestra ni en el resto de las muestras estudiadas. Todas las muestras se fijaron y se trataron con tinte de hematoxilina/eosina.

Figura 10: Cuantificación de las mesenquimales proinflamatorias secretadas. A) Perfil de expresión representativo de mesenquimales proinflamatorias en células BL10 y TLR4"'" en el estado basal (mMSC) y tras la infección con ICOVIR-5 (Celyvir). En general, el perfil de secreción de células BL10 es mayor que el de células TLR4"'". B) Semicuantificación de mesénquimales proinflamatorias secretadas en células BL10 y TLR4"'" en el estado basal (mMSC) y tras la infección con ICOVIR-5 (Celyvir). C) Cuantificación de la expresión de CXCL10 en células BL10 y TLR4"'" mediante ELISA en un estado basal (mMSC) y tras la infección con ICOVIR-5 (Celyvir). La expresión de CXCL10 en células TLR4"'" es significativamente menor que en células BL10. La expresión de CXCL10 mediante ELISA se correlacionó con su expresión semicuantificada en el panel de matriz de mesenquimales. Se consideró que P<0,05 (*) y P<0,01 (**) eran estadísticamente significativos.

Figura 1 1 : Crecimiento tumoral durante el tratamiento con dosis bajas de Celyvir a tiempo largo. A) Gráfico que muestra el crecimiento del tumor a lo largo del tiempo. Celyvir usando células madre mesenquimales deficientes en TLR4"'" como portadores ralentizó el crecimiento del tumor en comparación con los demás grupos. B) Gráfico de supervivencia considerando como punto final un volumen de 300 mm3. El grupo tratado con células madre mesenquimales deficientes en TLR4"'" presentó una supervivencia significativamente menor que el grupo sin tratar (PBS). Se consideró P<0,05 (*) como estadísticamente significativo c) Gráfico que muestra el crecimiento del tumor a lo largo del tiempo. Celyvir usando células madre mesenquimales deficientes en TLR4"'" y células madre mesenquimales deficientes en MyD88"A como portadores redujeron más eficientemente el crecimiento tumoral en comparación con los demás grupos.

Figura 12. Crecimiento tumoral durante el tratamiento con dosis bajas de Celyvir a tiempo corto. A) Gráfico que muestra el crecimiento del tumor a lo largo del tiempo. Celyvir usando células madre mesenquimales deficientes en TLR4"'" y células madre mesenquimales deficientes en MyD88"A como portadores redujeron más eficientemente y de forma similar el crecimiento tumoral en comparación con los demás grupos.

Figura 13: Migración in vivo de las células madre mesenquimales al tumor. Las células madre mesenquimales se marcaron con el compuesto fluorescente DIR para su monitorización in vivo, se infectaron con el virus oncolítico y se inocularon mediante vía intraperitoneal. La señal fluorescente se cuantificó en el tumor como eficiencia radiante media y eficiencia radiante total a las 48 horas de la administración. Las células madre mesenquimales deficientes en TLR4 y MyD88 (TLR4-/- y MyD88-/-, respectivamente) mostraron una migración significativamente mayor que las células madre mesenquimales BL6. Se consideró que P<0,05 (*) y P<0,01 (**) eran estadísticamente significativos.

Sumario de la invención

La presente solicitud proporciona un producto de combinación, su uso como medicamento y su uso como medicamento para el tratamiento de cáncer. El producto de combinación comprende (i) una célula madre mesenquimal modificada (MSC) en la que TLR4 y/o TLR9 y/o cualquier receptor TLR cuya señalización intracelular active la proteína MyD88 están inhibidos y (ii) una sustancia antigénica. La MSC modificada y la sustancia antigénica pueden comercializarse juntas o por separado. Además, la MSC modificada puede actuar como portador de la sustancia antigénica y la presente solicitud también comprende un método de producción de MSC modificadas que comprenden un parásito intracelular. La presente solicitud también proporciona un kit que comprende una MSC, una sustancia antigénica y un inhibidor de TLR4 y/o TLR9 y/o de cualquier receptor TLR cuya señalización intracelular active la proteína MyD88.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

El término "producto de combinación" puede referirse a (i) un producto compuesto por dos o más componentes regulados que están combinados o mezclados de manera física, química o de otro modo y producidos como una única entidad; (ii) dos o más productos separados envasados juntos en un único envase o como una unidad y compuestos por productos farmacológicos y de dispositivo, productos de dispositivo y biológicos, o productos biológicos y farmacológicos; (iii) un producto farmacológico, de dispositivo o biológico envasado por

separado que según su plan de investigación o etiquetado propuesto está previsto para su uso únicamente con un producto farmacológico, de dispositivo o biológico aprobado y especificado de manera individual en el que se requieren ambos para lograr el uso previsto, la indicación o el efecto y en el que tras la aprobación del producto propuesto se necesitará cambiar el etiquetado del producto aprobado, por ejemplo, para reflejar un cambio en el uso previsto, forma de dosificación, concentración, vía de administración o cambio significativo de la dosis; o (iv) cualquier producto farmacológico, de dispositivo o biológico de investigación envasado por separado que, según su etiquetado propuesto, es para su uso únicamente con otro producto farmacológico, de dispositivo o biológico de investigación especificado de manera individual en el que se requieren ambos para lograr el uso previsto, la indicación o el efecto.

Los términos "tratamiento" y "terapia", tal como se usan en la presente solicitud, se refieren a un conjunto de medios higiénicos, farmacológicos, quirúrgicos y/o físicos usados con la intención de curar y/o aliviar una enfermedad y/o síntomas con el objetivo de remediar el problema de salud. Los términos "tratamiento" y "terapia" incluyen métodos preventivos y curativos, dado que ambos van dirigidos al mantenimiento y/o restablecimiento de la salud de un individuo o animal. Independientemente del origen de los síntomas, enfermedad y discapacidad, la administración de un medicamento adecuado para aliviar y/o curar un problema de salud debe interpretarse como una forma de tratamiento o terapia dentro del contexto de esta solicitud.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de materia de un producto de combinación que tiene un efecto terapéutico y que es capaz de tratar el cáncer.

Los términos "individuo", "paciente" o "sujeto" se usan de manera intercambiable en la presente solicitud y no se pretende que sean limitativos de ninguna manera. El "individuo", "paciente" o "sujeto" puede ser de cualquier edad, sexo y condición física. El término "animal", tal como se usa en la presente solicitud, se refiere a cualquier ser heterótrofo eucariota multicelular que no es un humano.

El término "modificado" se refiere a cualquier materia que se ha alterado con respecto a su forma original. En la presente solicitud el término "modificado" se refiere a cualquier alteración que se basa en la intervención humana.

El término "célula madre mesenquimal" ("MSC") se refiere a células progenitoras multipotentes derivadas del mesodermo. Tienen la capacidad de diferenciarse en células que componen el tejido adiposo, óseo, de cartílago y muscular. Los criterios mínimos establecidos por la Sociedad internacional de terapia celular es que las MSC son positivas para CD70, CD90 y

CD105, y negativas para CD45 y CD34. Pueden encontrarse en casi todos los tejidos, preferiblemente médula ósea, sangre periférica, sangre menstrual, glándula salivar, piel y prepucio, líquido sinovial, endometrio, tejido dental, tejido adiposo y tejidos asociados con recién nacidos incluyendo placenta, cordón umbilical, sangre del cordón umbilical, líquido amniótico y membrana amniótica.

El término "Myeloid differentiation primary response 88" ("MyD88") se refiere a la proteína adaptadora MyD88. Esta proteína es imprescindible para la señalización intracelular de todos los receptores de tipo Toll-like menos del receptor Toll-like de tipo 3.

El término "receptores tipo Toll-like (TLRs, por sus siglas en inglés)" se entiende como receptores o sensores de reconocimiento de membrana evolutivamente conservados, propios de la inmunidad innata que reconocen características presentes en la superficie de patógenos o que son liberados por tejido necrótico. Estas moléculas que se interpretan como "señales de peligro" forman parte de un grupo denominado patrones moleculares asociados a daño (PMAD) integrado por: los patrones moleculares asociados a microorganismos (PMAM) y las alarminas que son proteínas intracelulares liberadas por células necróticas. Los TLRs se unen a través de sus dominios, que contienen repeticiones ricas en leucina (RRL) a los PMAM, y de esa manera las células desencadenan respuestas inmunitarias, entre ellas acciones inflamatorias y antivirales a través de vías de señalización derivadas del receptor intracelular, llamado receptor Toll-like/IL-1 (TIR, por sus siglas en inglés de Toll-like/IL-1 receptor) frente a los patógenos (4-7). Los TLRs fueron llamados así por su similitud con un receptor originalmente involucrado en el desarrollo embrionario de Drosophila melanogaster descubierto en 1985 por el científico alemán Christiane Nüsslein-Volhard. En 1996, varios grupos de investigadores demostraron la importancia de estos receptores frente a los agentes micóticos en la mosca de la fruta. Los TLRs humanos fueron posteriormente identificados y han sido involucrados en la detección de estructuras específicas de etiología viral, microbiana, parasitaria, micótica y a señales de peligro incluso endógenas.

El término "receptor de tipo Toll-like 4" ("TLR4") se refiere a una proteína transmembrana que puede reconocer lipopolisacáridos e iniciar la ruta intracelular de NF-κΒ. Puede encontrarse más información referente a esta proteína en humanos en la base de datos UniProt (UniProtKB - 000206).

El término "receptor de tipo Toll-like 9" ("TLR9") se refiere a una proteína transmembrana que puede reconocer ADN viral y bacteriano e iniciar la ruta intracelular de NF-κΒ. Puede encontrarse más información referente a esta proteína en humanos en la base de datos UniProt (UniProtKB - Q9NR96).

El término "receptor de tipo Toll-like 1" ("TLR1") se refiere a una proteína transmembrana que puede reconocer lipopolisacáridos e iniciar la ruta intracelular de NF-κΒ. Puede encontrarse más información referente a esta proteína en humanos en la base de datos UniProt (UniProtKB - Q15399).

El término "receptor de tipo Toll-like 2" ("TLR2") se refiere a una proteína transmembrana que puede reconocer lipopolisacáridos e iniciar la ruta intracelular de NF-κΒ. Puede encontrarse más información referente a esta proteína en humanos en la base de datos UniProt (UniProtKB - 060603).

El término "receptor de tipo Toll-like 6" ("TLR6") se refiere a una proteína transmembrana que puede reconocer lipopolisacáridos e iniciar la ruta intracelular de NF-κΒ. Puede encontrarse más información referente a esta proteína en humanos en la base de datos UniProt (UniProtKB -Q9Y2C9).

El término "receptor de tipo Toll-like 10" ("TLR10") se refiere a una proteína transmembrana que puede reconocer lipopolisacáridos e iniciar la ruta intracelular de NF-κΒ. Puede encontrarse más información referente a esta proteína en humanos en la base de datos UniProt (UniProtKB -Q9BXR5).

El término "receptor de tipo Toll-like 5" ("TLR5") se refiere a una proteína transmembrana que puede reconocer lipopolisacáridos e iniciar la ruta intracelular de NF-κΒ. Puede encontrarse más información referente a esta proteína en humanos en la base de datos UniProt (UniProtKB -060602).

El término "receptor de tipo Toll-like 7" ("TLR7") se refiere a una proteína transmembrana que puede reconocer lipopolisacáridos e iniciar la ruta intracelular de NF-κΒ. Puede encontrarse más información referente a esta proteína en humanos en la base de datos UniProt (UniProtKB - Q9NYK1).

El término "receptor de tipo Toll-like 8" ("TLR8") se refiere a una proteína transmembrana que puede reconocer lipopolisacáridos e iniciar la ruta intracelular de NF-κΒ. Puede encontrarse más información referente a esta proteína en humanos en la base de datos UniProt (UniProtKB - Q9NR97).

El término "inhibidor del receptor de tipo Toll-like 4" ("inhibidor de TLR4") se refiere a cualquier materia que puede reducir la cantidad y/o actividad de TLR4. Esto puede incluir inhibidores de molécula pequeña bioactivos que inhiben la activación del receptor y/o su capacidad para iniciar la ruta de NF-κΒ, anticuerpos neutralizantes que provocan la internalización de TLR4 y su degradación o que inhiben la capacidad de TLR4 para unirse a un agonista bloqueando el sitio de unión extracelular, o el uso de ARNip o terapia génica para regular por disminución la cantidad de TLR4 presente en la célula o para eliminar completamente la presencia de TLR4 en una célula, es decir desactivación.

El término "inhibidor del receptor de tipo Toll-like 9" ("inhibidor de TLR9") se refiere a cualquier materia que puede reducir la cantidad y/o actividad de TLR9. Esto puede incluir inhibidores de molécula pequeña bioactivos que inhiben la activación del receptor y/o su capacidad para iniciar la ruta de NF-κΒ, anticuerpos neutralizantes que provocan la internalización de TLR9 y su degradación o que inhiben la capacidad de TLR9 para unirse a un agonista bloqueando el sitio de unión extracelular, o el uso de ARNip o terapia génica para regular por disminución la cantidad de TLR9 presente en la célula o para eliminar completamente la presencia de TLR9 en una célula, es decir desactivación.

El término "inhibidor del receptor de tipo Toll-like 1" ("inhibidor de TLR1") se refiere a cualquier materia que puede reducir la cantidad y/o actividad de TLR1. Esto puede incluir inhibidores de molécula pequeña bioactivos que inhiben la activación del receptor y/o su capacidad para iniciar la ruta de NF-κΒ, anticuerpos neutralizantes que provocan la internalización de TLR1 y su degradación o que inhiben la capacidad de TLR1 para unirse a un agonista bloqueando el sitio de unión extracelular, o el uso de ARNip o terapia génica para regular por disminución la cantidad de TLR1 presente en la célula o para eliminar completamente la presencia de TLR1 en una célula, es decir desactivación.

El término "inhibidor del receptor de tipo Toll-like 2" ("inhibidor de TLR2") se refiere a cualquier materia que puede reducir la cantidad y/o actividad de TLR2. Esto puede incluir inhibidores de molécula pequeña bioactivos que inhiben la activación del receptor y/o su capacidad para iniciar la ruta de NF-κΒ, anticuerpos neutralizantes que provocan la internalización de TLR2 y su degradación o que inhiben la capacidad de TLR2 para unirse a un agonista bloqueando el sitio de unión extracelular, o el uso de ARNip o terapia génica para regular por disminución la cantidad de TLR2 presente en la célula o para eliminar completamente la presencia de TLR2 en una célula, es decir desactivación.

El término "inhibidor del receptor de tipo Toll-like 6" ("inhibidor de TLR6") se refiere a cualquier materia que puede reducir la cantidad y/o actividad de TLR6. Esto puede incluir inhibidores de

molécula pequeña bioactivos que inhiben la activación del receptor y/o su capacidad para iniciar la ruta de NF-κΒ, anticuerpos neutralizantes que provocan la internalización de TLR6 y su degradación o que inhiben la capacidad de TLR6 para unirse a un agonista bloqueando el sitio de unión extracelular, o el uso de ARNip o terapia génica para regular por disminución la cantidad de TLR6 presente en la célula o para eliminar completamente la presencia de TLR6 en una célula, es decir desactivación.

El término "inhibidor del receptor de tipo Toll-like 10" ("inhibidor de TLR10") se refiere a cualquier materia que puede reducir la cantidad y/o actividad de TLR10. Esto puede incluir inhibidores de molécula pequeña bioactivos que inhiben la activación del receptor y/o su capacidad para iniciar la ruta de NF-κΒ, anticuerpos neutralizantes que provocan la internalización de TLR10 y su degradación o que inhiben la capacidad de TLR10 para unirse a un agonista bloqueando el sitio de unión extracelular, o el uso de ARNip o terapia génica para regular por disminución la cantidad de TLR10 presente en la célula o para eliminar completamente la presencia de TLR10 en una célula, es decir desactivación.

El término "inhibidor del receptor de tipo Toll-like 5" ("inhibidor de TLR5") se refiere a cualquier materia que puede reducir la cantidad y/o actividad de TLR5. Esto puede incluir inhibidores de molécula pequeña bioactivos que inhiben la activación del receptor y/o su capacidad para iniciar la ruta de NF-κΒ, anticuerpos neutralizantes que provocan la internalización de TLR5 y su degradación o que inhiben la capacidad de TLR5 para unirse a un agonista bloqueando el sitio de unión extracelular, o el uso de ARNip o terapia génica para regular por disminución la cantidad de TLR5 presente en la célula o para eliminar completamente la presencia de TLR5 en una célula, es decir desactivación.

El término "inhibidor del receptor de tipo Toll-like 7" ("inhibidor de TLR7") se refiere a cualquier materia que puede reducir la cantidad y/o actividad de TLR7. Esto puede incluir inhibidores de molécula pequeña bioactivos que inhiben la activación del receptor y/o su capacidad para iniciar la ruta de NF-κΒ, anticuerpos neutralizantes que provocan la internalización de TLR7 y su degradación o que inhiben la capacidad de TLR7 para unirse a un agonista bloqueando el sitio de unión extracelular, o el uso de ARNip o terapia génica para regular por disminución la cantidad de TLR7 presente en la célula o para eliminar completamente la presencia de TLR7 en una célula, es decir desactivación.

El término "inhibidor del receptor de tipo Toll-like 8" ("inhibidor de TLR8") se refiere a cualquier materia que puede reducir la cantidad y/o actividad de TLR8. Esto puede incluir inhibidores de molécula pequeña bioactivos que inhiben la activación del receptor y/o su capacidad para iniciar la ruta de NF-κΒ, anticuerpos neutralizantes que provocan la internalización de TLR8 y su degradación o que inhiben la capacidad de TLR8 para unirse a un agonista bloqueando el sitio de unión extracelular, o el uso de ARNip o terapia génica para regular por disminución la cantidad de TLR8 presente en la célula o para eliminar completamente la presencia de TLR8 en una célula, es decir desactivación.

El término "inhibidor del gen o proteína MyD88" ("inhibidor de MyD88") se refiere a cualquier materia que puede reducir la cantidad y/o actividad de MyD88. Esto puede incluir inhibidores de molécula pequeña bioactivos que inhiben la activación del receptor y/o su capacidad para iniciar la ruta de NF-κΒ, anticuerpos neutralizantes que provocan la internalización de MyD88 y su degradación o que inhiben la capacidad de MyD88 para unirse a un agonista bloqueando el sitio de unión, o el uso de ARNip o terapia génica para regular por disminución la cantidad de MyD88 presente en la célula o para eliminar completamente la presencia de MyD88 en una célula, es decir desactivación.

El término "sustancia antigénica" se refiere a cualquier sustancia que puede provocar una respuesta inmunitaria. Esto incluye proteínas inmunogénicas, ADN, ARN, lipopolisacáridos y cualquier parásito intracelular que comprende sustancias antigénicas. Por ejemplo, la MSC modificada puede modificarse para expresar una proteína antigénica y puede modificarse con un interruptor de emergencia que se activa cuando la MSC modificada está en un entorno hipóxico tal como el entorno que se encuentra comúnmente en tumores sólidos. En un ejemplo alternativo, la MSC modificada puede infectarse con un parásito intracelular que se libera en el sitio tumoral para inducir una respuesta inmunológica dirigida.

El término "parásito intracelular" se refiere a cualquier microparásito que es capaz de crecer y replicarse dentro de una célula huésped. Los ejemplos incluyen: bacterias, virus, protozoos y hongos.

El término "virus oncolítico" se refiere a cualquier virus que infecta y destruye preferiblemente células tumorales. Los ejemplos incluyen: adenovirus, reovirus, virus del sarampión, virus del herpes simple, virus de la enfermedad de Newcastle, virus vaccinia, virus de Coxsackie y virus del valle del Séneca.

Tal como se usa en el presente documento, "portador farmacéuticamente aceptable" o "diluyente farmacéuticamente aceptable" significa todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para principios farmacéuticamente activos se conoce bien en la técnica. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los sujetos receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas y, sin limitar el alcance de la presente invención, incluyen: agentes tamponantes adicionales; conservantes; codisolventes; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; agentes quelantes tales como EDTA; complejos de metales (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); polímeros biodegradables, tales como poliésteres; contraiones formadores de sales, tales como sodio, alcoholes de azúcar polihidroxilados; aminoácidos, tales como alanina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, lisina, ornitina, leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico y treonina; alcoholes de azúcares o azúcares orgánicos, tales como lactitol, estaquiosa, mañosa, sorbosa, xilosa, ribosa, ribitol, mioinisitosa, mioinisitol, galactosa, galactitol, glicerol, ciclitoles (por ejemplo, inositol), polietilenglicol; agentes reductores que contienen azufre, tales como urea, glutatión, ácido tióctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, [alfa]-monotioglicerol y tiosulfato de sodio; proteínas de bajo peso molecular, tales como albúmina sérica humana, albúmina sérica bovina, gelatina u otras inmunoglobulinas; y polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona.

El término "adyuvante farmacéuticamente aceptable" se refiere a todas y cada una de las sustancias que potencian la respuesta inmunitaria del organismo frente a un antígeno. Ejemplos no limitativos de adyuvantes farmacéuticamente aceptables son: alumbre, adyuvante incompleto de Freund, MF59, análogos sintéticos de ARNbc tales como poli(l:C), lipopolisacáridos bacterianos, flagelina bacteriana, imidazolquinolinas, oligodesoxinucleótidos que contienen motivos de CpG específicos, fragmentos de paredes celulares bacterianas tales como muramil dipéptido y Quil-A.

El término "agente quimioterápico" se refiere a cualquier fármaco que puede usarse para tratar una enfermedad. En la presente solicitud, el término "agente quimioterápico" se refiere a cualquier fármaco que puede usarse para tratar el cáncer. Los ejemplos no limitativos incluyen: actinomicina, ácido todo-trans-retinoico, azacitidina, azatioprina, bleomicina, bortezomib, carboplatino, capecitabina, cisplatino, clorambucilo, ciclofosf amida, citarabina, daunorubicina, docetaxel, doxifluridina, doxorubicina, epirubicina, epotilona, etopósido, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, idarubicina, imatinib, irinotecán, mecloretamina, mercaptopurina, metotrexato, mitoxantrona, oxaliplatino, paclitaxel, pemetrexed, tenipósido, tioguanina, topotecán, valrubicina, vemurafenib, vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina.

El término "cáncer" se refiere a un grupo de enfermedades que implican crecimiento celular anómalo con el potencial de invadir o propagarse a otras partes del organismo. Los ejemplos no limitativos incluyen: leucemia granulocítica aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielógena aguda, adenocarcinoma, cáncer suprarrenal, astrocitoma anaplásico, angiosarcoma, cáncer de apéndice, astrocitoma, carcinoma de células básales, linfoma de células B, cáncer del conducto biliar, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, cáncer de médula ósea, cáncer del

intestino, cáncer de cerebro, glioma del tronco encefálico, tumor cerebral, cáncer de mama, tumores carcinoides, cáncer de cuello uterino, colangiocarcinoma, condrosarcoma, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, cáncer de colon, cáncer colorrectal, craneofaringioma, linfoma cutáneo, melanoma cutáneo, astrocitoma difuso, carcinoma ductal in situ, cáncer endometrial, ependimoma, sarcoma epitelioide, cáncer de esófago, sarcoma de Ewing, cáncer del conducto biliar extrahepático, cáncer de ojo, cáncer de las trompas de Falopio, fibrosarcoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, cáncer gastrointestinal, cáncer de carcinoide gastrointestinal, tumores del estroma gastrointestinal, tumor de células germinales, glioblastoma multiforme, glioma, tricoleucemia, cáncer de cabeza y cuello, hemangioendotelioma, linfoma de Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, carcinoma ductal infiltrante, carcinoma lobular infiltrante, cáncer de mama inflamatorio, cáncer intestinal, cáncer del conducto biliar intrahepático, cáncer de mama invasivo/infiltrante, cáncer de células del islote, cáncer de mandíbula, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñon, cáncer de laringe, leiomiosarcoma, metástasis leptomeníngeas, leucemia, cáncer de labio, liposarcoma, cáncer de hígado, carcinoma lobular in situ, astrocitoma de grado bajo, cáncer de pulmón, cáncer de ganglios linfáticos, linfoma, cáncer de mama masculino, carcinoma medular, meduloblastoma, melanoma, meningioma, carcinoma de células de Merkel, condrosarcoma mesenquimatoso, esénquima, mesotelioma, cáncer de mama metastásico, melanoma metastásico, cáncer de cuello escamoso metastásico, gliomas mixtos, cáncer de boca, carcinoma mucinoso, melanoma de la mucosa, mieloma múltiple, micosis fungoide, síndrome mielodisplásico, cáncer de la cavidad nasal, cáncer nasofaríngeo, cáncer de cuello, neuroblastoma, tumores neuroendocrinos, linfoma no Hodgkin, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de células en grano de avena, cáncer ocular, melanoma ocular, oligodendroglioma, cáncer bucal, cáncer de la cavidad bucal, cáncer orofaríngeo, sarcoma osteogénico, osteosarcoma, cáncer de ovarios, cáncer epitelial de ovarios, tumor de células germinales de los ovarios, carcinoma peritoneal primario de los ovarios, tumor del estroma de los cordones sexuales del ovario, enfermedad de Paget, cáncer pancreático, carcinoma papilar, cáncer del seno paranasal, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer pélvico, cáncer de pene, cáncer de los nervios periféricos, cáncer peritoneal, cáncer faríngeo, feocromocitoma, astrocitoma pilocítico, tumor de la región pineal, cáncer de hipófisis, linfoma primario del sistema nervioso central, cáncer de próstata, cáncer rectal, carcinoma de células renales, cáncer de pelvis renal, rabdomiosarcoma, cáncer de la glándula salivar, sarcoma, sarcoma óseo, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma uterino, cáncer de senos, cáncer de piel, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer del intestino delgado, cáncer espinal, cáncer de la columna vertebral, cáncer de la médula espinal, tumor espinal, carcinoma de células escamosas, cáncer de estómago, sarcoma sinovial, linfoma de células T, cáncer de testículos, cáncer de garganta, timoma/carcinoma del timo, cáncer tiroideo, cáncer de lengua, cáncer de amígdalas, cáncer de células de transición, cáncer de mama triple negativo, cáncer de trompas, carcinoma tubular, cáncer uretral, adenocarcinoma uterino, cáncer uterino, cáncer vaginal y cáncer de vulva.

El término "tumor sólido" se refiere a una masa anómala de tejido que habitualmente no contiene quistes o zonas líquidas. Los ejemplos no limitativos incluyen adenocarcinoma, cáncer suprarrenal, astrocitoma anaplásico, angiosarcoma, cáncer de apéndice, astrocitoma, carcinoma de células básales, linfoma de células B, cáncer del conducto biliar, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, cáncer de médula ósea, cáncer del intestino, cáncer de cerebro, glioma del tronco encefálico, tumor cerebral, cáncer de mama, tumores carcinoides, cáncer de cuello uterino, colangiocarcinoma, condrosarcoma, cáncer de colon, cáncer colorrectal, craneofaringioma, linfoma cutáneo, melanoma cutáneo, astrocitoma difuso, carcinoma ductal in situ, cáncer endometrial, ependimoma, sarcoma epitelioide, cáncer de esófago, sarcoma de Ewing, cáncer del conducto biliar extrahepático, cáncer de ojo, cáncer de las trompas de Falopio, fibrosarcoma, cáncer de la vesícula biliar, cáncer gástrico, cáncer gastrointestinal, cáncer de carcinoide gastrointestinal, tumores del estroma gastrointestinal, tumor de células germinales, glioblastoma multiforme, glioma, cáncer de cabeza y cuello, hemangioendotelioma, linfoma de Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, carcinoma ductal infiltrante, carcinoma lobular infiltrante, cáncer de mama inflamatorio, cáncer intestinal, cáncer del conducto biliar intrahepático, cáncer de mama invasivo/infiltrante, cáncer de células del islote, cáncer de mandíbula, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñon, cáncer de laringe, leiomiosarcoma, metástasis leptomeníngeas, cáncer de labio, liposarcoma, cáncer de hígado, carcinoma lobular in situ, astrocitoma de grado bajo, cáncer de pulmón, cáncer de ganglios linfáticos, linfoma, cáncer de mama masculino, carcinoma medular, meduloblastoma, melanoma, meningioma, carcinoma de células de Merkel, condrosarcoma mesenquimatoso, esénquima, mesotelioma, cáncer de mama metastásico, melanoma metastásico, cáncer de cuello escamoso metastásico, gliomas mixtos, cáncer de boca, carcinoma mucinoso, melanoma de la mucosa, mieloma múltiple, micosis fungoide, síndrome mielodisplásico, cáncer de la cavidad nasal, cáncer nasofaríngeo, cáncer de cuello, neuroblastoma, tumores neuroendocrinos, linfoma no Hodgkin, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de células en grano de avena, cáncer ocular, melanoma ocular, oligodendroglioma, cáncer bucal, cáncer de la cavidad bucal, cáncer orofaríngeo, sarcoma osteogénico, osteosarcoma, cáncer de ovarios, cáncer epitelial de ovarios, tumor de células germinales de los ovarios, carcinoma peritoneal primario de los ovarios, tumor del estroma de los cordones sexuales del ovario, enfermedad de Paget, cáncer pancreático, carcinoma papilar, cáncer del seno paranasal, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer pélvico, cáncer de pene, cáncer de los nervios periféricos, cáncer peritoneal, cáncer faríngeo, feocromocitoma, astrocitoma pilocítico, tumor de la región pineal, cáncer de hipófisis, linfoma primario del sistema nervioso central, cáncer de próstata, cáncer rectal, carcinoma de células renales, cáncer de pelvis renal, rabdomiosarcoma, cáncer de la glándula salivar, sarcoma, sarcoma óseo, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma uterino, cáncer de senos,

cáncer de piel, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer del intestino delgado, cáncer espinal, cáncer de la columna vertebral, cáncer de la médula espinal, tumor espinal, carcinoma de células escamosas, cáncer de estómago, sarcoma sinovial, linfoma de células T, cáncer de testículos, cáncer de garganta, timoma/carcinoma del timo, cáncer tiroideo, cáncer de lengua, cáncer de amígdalas, cáncer de células de transición, cáncer de mama triple negativo, cáncer de trompas, carcinoma tubular, cáncer uretral, adenocarcinoma uterino, cáncer uterino, cáncer vaginal y cáncer de vulva.

El término "quimioterapia" se refiere al uso de un agente quimioterápico para tratar una enfermedad. En la presente solicitud, el término "quimioterapia" se refiere al uso de un agente quimioterápico para tratar el cáncer.

El término "radioterapia" se refiere a una terapia que usa radiación ionizante para controlar o destruir células malignas y se usa generalmente como parte de un tratamiento contra el cáncer.

Producto de combinación

La presente invención hace referencia a un producto de combinación que comprende una célula madre mesenquimal modificada en la que el receptor del tipo Toll-like 4 y/o el receptor del tipo Toll-like 9 están inhibidos y una sustancia antigénica. El efecto técnico que se deduce a partir de los ejemplos es que este tipo de células madre mesenquimales infectadas con una sustancia antigénica son menos propensas a ser detectadas por el sistema inmune del paciente antes de llegar al sitio tumoral.

Por lo tanto, la presente solicitud proporciona un producto de combinación que comprende: (i) una MSC modificada en la que TLR4 y/o TLR9 están inhibidos, y (ii) una sustancia antigénica. Sin embargo, con respecto a los receptores TLRs es importante hacer notar que hay dos vías distintas de señalización asociadas con este tipo de receptores: la que requiere la proteína adaptadora MyD88, y la MyD88-independiente. En este sentido, todos los TLRs menos TLR3 señalan por la vía dependiente de MyD88. MyD88 activa NF-κΒ, induciendo la producción de citocinas inflamatorias como IL-1 , IL-8, TNF-alfa, e IL-12.1 MyD88 tiene un dominio TIF que se une al dominio TIF en el receptor activado. Al unirse al TLR, MyD88 recluta cinasas de la familia IRAK a través de su dominio muerte (death domain (DD)).1 Las proteínas IRAK interactúan con TRAF-6, permitiendo que TRAF-6 active al MAPKKK TAK1. TAK1 fosforila el complejo IKK, activándolo. El complejo IKK activado destruye el inhibidor de NF-κΒ (I KB) dejando NF-κΒ libre que puede entrar el núcleo y aumentar la transcripción de ciertos genes.3 También, TAK1 puede estimular la vía AP-1 mediante activación de la vía de cinasas MAP.2 MyD88 unido al TLR7 o TLR9 también puede asociarse con IRF-7 e inducir la producción de

interferón (IFN) de tipo 1.2

Así, se entiende que MyD88 es un gen Master para la señalización de casi todos los TLRs (menos TLR3). Es decir, y en el caso de los seres humanos, MyD88 es un gen Master para la señalización de las siguientes 4 subfamilias de TLRs: TLR1/2/6/10, TLR4, TLR5, y TLR7/8/9, dado que no todas las especies de vertebrados expresan todas las agrupaciones de TLRs y los seres humanos, por ejemplo, carecen de todos los miembros de la familia TLR11.

Pues bien, en las figuras 1 1 a 13 se observa cómo las células madre mesenquimales deficientes en MyD88 tienen el mismo efecto antitumoral (aumentado) que el grupo con células madre mesenquimales deficientes en TLR4. Y ambas tienen más efecto antitumoral que las células madre mesenquimales con un fenotipo silvestre (WT). Además, en la figura 13 se observan los datos de la cuantificación de la llegada de las células al tumor (homing) y cómo las células madre mesenquimales deficientes en TLR4 llegan más al tumor que las de fenotipo silvestre. Lo mismo ocurre de forma incluso más significativa con las células madre mesenquimales deficientes en MyD88. Es decir, dado que MyD88 es, en los seres humanos, un gen Master para la señalización de TLR1/2/6/10, TLR4, TLR5, y TLR7/8/9, se hace plausible, con los resultados proporcionados en la presente memoria, que una célula madre mesenquimal modificada en la que al menos uno cualquiera de los siguientes TLRs esté inhibido: TLR1 , TLR2, TLR6, TLR10, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, o TLR9 o incluso el propio gen MyD88, reduce las posibilidades de que dicha célula sea detectada por el sistema inmune del paciente antes de llegar al sitio tumoral o infeccioso.

Por lo tanto, a raíz de estos resultados y en un primer aspecto, la presente solicitud amplia la definición de producto de combinación dada anteriormente proporcionando un producto de combinación que comprende: (i) una MSC modificada en la que al menos un receptor de tipo Toll-like cuya señalización intracelular active la proteína MyD88 esté inhibido, en particular al menos un receptor de tipo Toll-like seleccionado de la lista que consiste en TLR1 , TLR2, TLR6, TLR10, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, y/ o TLR9 están inhibidos, preferiblemente TLR4 y/o TLR9 están inhibidos, y (ii) una sustancia antigénica. Se hace notar que en una realización alternativa de este primer aspecto, la solicitud proporciona un producto de combinación que comprende: (i) una MSC modificada en la que el gen o la proteína MyD88 están inhibidos, y (ii) una sustancia antigénica.

En una realización preferida, el producto de combinación es una composición. En la composición, el producto de combinación compuesto por (i) la MSC modificada en la que TLR1 , TLR2, TLR6, TLR10, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, TLR9 y/o MyD88, preferiblemente TLR4 y/o TLR9 están inhibidos y (ii) la sustancia antigénica se mezclan y se producen como una única

entidad. Preferiblemente, la MSC modificada en la que TLR1 , TLR2, TLR6, TLR10, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, TLR9 y/o MyD88, preferiblemente TLR4 y/o TLR9 están inhibidos es un portador de la sustancia antigénica.

El término "portador" en la presente solicitud puede referirse a un organismo que porta una sustancia antigénica. En una realización preferida, la MSC modificada en la que TLR1 , TLR2, TLR6, TLR10, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, TLR9 y/o MyD88, preferiblemente TLR4 y/o TLR9 están inhibidos está infectada, transducida y/o transformada con la sustancia antigénica.

En una realización preferida una MSC modificada en la que TLR1 , TLR2, TLR6, TLR10, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, TLR9 y/o MyD88, preferiblemente TLR4 y/o TLR9 están inhibidos y una sustancia antigénica pueden comercializarse por separado o juntas. Si la MSC modificada y la sustancia antigénica se comercializan juntas, pueden comercializarse en un único vial o en dos viales separados envasados en un recipiente y pueden incluir instrucciones sobre cómo combinar la MSC modificada con la sustancia antigénica. Si la MSC modificada y la sustancia antigénica se comercializan por separado, se comercializan con una etiqueta que explica resumidamente que los dos productos deben usarse en conjunto y/o con instrucciones que explican resumidamente el uso de los dos productos en conjunto.

TLR4 puede inhibirse usando un inhibidor de TLR4. En una realización preferida, TLR4 se inhibe usando: (i) ARNip, (ii) vectores para terapia génica, preferiblemente vectores para terapia génica que comprenden el sistema CRISPR/Cas9, (iii) un inhibidor de molécula pequeña bioactivo del receptor de tipo Toll-like 4 seleccionado del grupo que consiste en 3,4,6-triacetato de isopropil-2-(acetilamino)-2-desoxi-a-D-glucopiranósido, resatorvid, eritorán y un péptido con la secuencia KYSFKLILAEYRRRRRRRRR (SEQ ID NO: 1), y/o (iv) un anticuerpo neutralizante que se une a la región extracelular de TLR4. Preferiblemente, TLR4 se inhibe usando: (i) ARN de interferencia pequeño y/o (ii) vectores para terapia génica, preferiblemente vectores para terapia génica que comprenden el sistema CRISPR/Cas9. Lo más preferiblemente, TLR4 se inhibe usando vectores para terapia génica, preferiblemente vectores para terapia génica que comprenden el sistema CRISPR/Cas9.

TLR9 puede inhibirse usando un inhibidor de TLR9. En una realización preferida, TLR9 se inhibe usando: (i) ARN de interferencia pequeño, (ii) vectores para terapia génica, preferiblemente vectores para terapia génica que comprenden el sistema CRISPR/Cas9, (iii) un inhibidor de molécula pequeña bioactivo del receptor de tipo Toll-like 9 seleccionado del grupo que consiste en un nucleótido que comprende la secuencia TTAGGG, ODN 2088, ODN 4084-F, ODN INH-1 , ODN-INH-18, ODN A151 , G-ODN, 3-[4-(6-(3-(dimetilamino)propoxi)benzo[d]oxazol-2-il)fenoxi]-N,N-dimetilpropan-1 -amina, 6-[3-(pirrolidin-1- il)propoxi)-2-(4-(3-(pirrolidin-1-il)propoxi)fenil]benzo[d]oxazol, y/o (iv) un anticuerpo neutralizante que se une a la región extracelular de TLR9. Preferiblemente, TLR9 se inhibe usando: (i) ARN de interferencia pequeño y/o (ii) vectores para terapia génica, preferiblemente vectores para terapia génica que comprenden el sistema CRISPR/Cas9. Lo más preferiblemente, TLR9 se inhibe usando vectores para terapia génica, preferiblemente vectores para terapia génica que comprenden el sistema CRISPR/Cas9.

De manera evidente para la persona experta en la materia y en línea con lo establecido en los párrafos precedentes para los receptores TLR4 y TLR9, el resto de receptores TLRs mencionados a lo largo de la presente memoria, tales como TLR1 , TLR2, TLR6, TLR10, TLR5, TLR7, y TLR8, podrán inhibirse con herramientas similares. Asimismo, el gen o la proteína MyD88 se podrá inhibir usando (i) ARN de interferencia pequeño, (ii) vectores para terapia génica, preferiblemente vectores para terapia génica que comprenden sistemas de edición génica, como por ejemplo el sistema CRISPR/Cas9, o (iii) un inhibidor de molécula pequeña bioactivo del gen MyD88, y/o (iv) un anticuerpo neutralizante que se une a la proteína MyD88.

El término "ARN de interferencia pequeño" ("ARNip") se refiere a una clase de moléculas de ARN, de habitualmente 20-25 pares de bases de longitud, que pueden regular por disminución la traducción de una proteína. En la técnica se conocen métodos para diseñar ARNip adecuados que pueden regular por disminución TLR1 , TLR2, TLR6, TLR10, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, y/o TLR9 y/o MyD88, preferiblemente TLR4 y/o TLR9 (Birmingham et al, 2007. Nat. Protoc. 2(9): 2068-78).

El término "vectores para terapia génica" se refiere a cualquier molécula de ADN usada como vehículo para transportar de manera artificial material genético foráneo al interior de otra célula, en la que puede replicarse y/o expresarse, en el que el material genético foráneo es capaz de modificar el genoma de la célula huésped. Los ejemplos de material genético foráneo capaz de modificar el genoma de la célula huésped incluyen material genético que comprende, entre otros, nucleasas de dedos de zinc (Porteus y Carroll, 2005. Nat. Biotech. 23(8): 967-73) y/o el sistema CRISPR/Cas9 (Ran et al, 2013. Nat. Protoc. 8(11): 2281-308). En una realización preferida, el vector para terapia génica comprende el sistema CRISPR/Cas9. En la técnica se conocen métodos para diseñar un sistema CRISPR/Cas9 adecuado que puede regular por disminución TLR4 y/o TLR9 y/o MyD88 (Ran et al, 2013. Nat. Protoc. 8(1 1): 2281-308; Chari et al, 2015. Nat. Met. 12(9): 823-6; Aach et al, 2014. CasFinder: Flexible algorithm for identifying specific Cas9 targets in genomes. BioRxiv).

La sustancia antigénica puede ser cualquier sustancia que puede producirse por la MSC modificada, produce una respuesta inmunogénica y puede liberarse en el sitio tumoral para

producir una respuesta inmunogénica localizada. En una realización preferida, la sustancia antigénica es un parásito intracelular. Preferiblemente, el parásito intracelular se selecciona del grupo que consiste en bacterias, virus, protozoos y hongos. Más preferiblemente, la sustancia antigénica es un virus oncolítico.

El virus oncolítico puede ser cualquier virus que infecta preferiblemente y destruye células cancerosas. En una realización preferida, el virus oncolítico se selecciona del grupo que consiste en adenovirus, reovirus, virus del sarampión, virus del herpes simple, virus de la enfermedad de Newcastle, virus vaccinia, virus de Coxsackie y virus del valle del Séneca. Preferiblemente, el virus oncolítico es un adenovirus. Más preferiblemente, el virus oncolítico es ICOVIR-5.

El término "ICOVIR-5" se refiere a un adenovirus oncolítico modificado que tiene una actividad que depende de la cantidad de E2F libre en la célula (Cascallo et al, 2007. Mol. Ther. 15(9): 1607-15). En la técnica se conoce un método para producir ICOVIR-5 (Cascallo et al, 2007. Mol. Ther. 15(9): 1607-15).

En una realización preferida, las MSC derivan de médula ósea, placenta, cordón umbilical, membrana amniótica, sangre menstrual, sangre periférica, glándula salivar, piel y prepucio, líquido sinovial, líquido amniótico, endometrio, tejido adiposo, sangre del cordón umbilical y/o tejido dental. Preferiblemente, las MSC derivan de tejido adiposo y/o médula ósea. Más preferiblemente, las MSC derivan de médula ósea. En el estado de la técnica se conocen métodos para obtener MSC a partir de los tejidos anteriores (Ullah et al, 2015. Biosci. Rep. 35(2): e00191).

En una realización preferida, la MSC es alogénica o autóloga con respecto al individuo que padece o corre el riesgo de padecer cáncer. Preferiblemente, la MSC es autóloga.

En un segundo aspecto, la presente solicitud proporciona una composición farmacéutica que comprende una composición y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable y/o un adyuvante farmacéuticamente aceptable, en la que la composición comprende una MSC modificada en la que TLR1 , TLR2, TLR6, TLR10, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, TLR9 y/o MyD88, preferiblemente TLR4 y/o TLR9 están inhibidos, y (ii) una sustancia antigénica.

TLR4 puede inhibirse usando un inhibidor de TLR4. En una realización preferida, TLR4 se inhibe usando: (i) ARNip, (ii) vectores para terapia génica, preferiblemente vectores para terapia génica que comprenden el sistema CRISPR/Cas9, (iii) un inhibidor de molécula pequeña bioactivo del receptor de tipo Toll-like 4 seleccionado del grupo que consiste en 3,4,6- triacetato de isopropil-2-(acetilamino)-2-desoxi-a-D-glucopiranósido, resatorvid, eritorán y un péptido con la secuencia KYSFKLILAEYRRRRRRRRR (SEQ ID NO: 1), y/o (iv) un anticuerpo neutralizante que se une a la región extracelular de TLR4. Preferiblemente, TLR4 se inhibe usando: (i) ARN de interferencia pequeño y/o (ii) vectores para terapia génica, preferiblemente vectores para terapia génica que comprenden sistemas de edición génica, como por ejemplo el sistema CRISPR/Cas9. Lo más preferiblemente, TLR4 se inhibe usando vectores para terapia génica, preferiblemente vectores para terapia génica que comprenden el sistema CRISPR/Cas9.

TLR9 puede inhibirse usando un inhibidor de TLR9. En una realización preferida, TLR9 se inhibe usando: (i) ARN de interferencia pequeño, (ii) vectores para terapia génica, preferiblemente vectores para terapia génica que comprenden sistemas de edición génica, como por ejemplo el sistema CRISPR/Cas9, (iii) un inhibidor de molécula pequeña bioactivo del receptor de tipo Toll-like 9 seleccionado del grupo que consiste en un nucleótido que comprende la secuencia TTAGGG, ODN 2088, ODN 4084-F, ODN INH-1 , ODN-INH-18, ODN A151 , G-ODN, 3-[4-(6-(3-(dimetilamino)propoxi)benzo[d]oxazol-2-il)fenoxi]-N,N-dimetilpropan-1-amina, 6-[3-(pirrolidin-1-il)propoxi)-2-(4-(3-(pirrolidin-1-il)propoxi)fenil]benzo[d]oxazol, y/o (iv) un anticuerpo neutralizante que se une a la región extracelular de TLR9. Preferiblemente, TLR9 se inhibe usando: (i) ARN de interferencia pequeño y/o (ii) vectores para terapia génica, preferiblemente vectores para terapia génica que comprenden sistemas de edición génica, como por ejemplo el sistema CRISPR/Cas9. Lo más preferiblemente, TLR9 se inhibe usando vectores para terapia génica, preferiblemente vectores para terapia génica que comprenden el sistema CRISPR/Cas9.

De manera evidente para la persona experta en la materia y en línea con lo establecido en los párrafos precedentes para los receptores TLR4 y TLR9, el resto de receptores TLRs mencionados a lo largo de la presente memoria, tales como TLR1 , TLR2, TLR6, TLR10, TLR5, TLR7, y TLR8, podrán inhibirse con herramientas similares. Asimismo, el gen o la proteína MyD88 se podrá inhibir usando (i) ARN de interferencia pequeño, (ii) vectores para terapia génica, preferiblemente vectores para terapia génica que comprenden sistemas de edición génica, como por ejemplo el sistema CRISPR/Cas9, o (iii) un inhibidor de molécula pequeña bioactivo del gen MyD88, y/o (iv) un anticuerpo neutralizante que se une a la proteína MyD88.

La sustancia antigénica puede ser cualquier sustancia que puede producirse por la MSC modificada, produce una respuesta inmunogénica y puede liberarse en el sitio tumoral para producir una respuesta inmunogénica localizada. En una realización preferida, la sustancia antigénica es un parásito intracelular. Preferiblemente, el parásito intracelular se selecciona del grupo que consiste en bacterias, virus, protozoos y hongos. Más preferiblemente, la sustancia

antigénica es un virus oncolítico.

El virus oncolítico puede ser cualquier virus que infecta preferiblemente y destruye células cancerosas. En una realización preferida, el virus oncolítico se selecciona del grupo que consiste en adenovirus, reovirus, virus del sarampión, virus del herpes simple, virus de la enfermedad de Newcastle, virus vaccinia, virus de Coxsackie y virus del valle del Séneca. Preferiblemente, el virus oncolítico es un adenovirus. Más preferiblemente, el virus oncolítico es ICOVIR-5.

En una realización preferida, las MSC derivan de médula ósea, placenta, cordón umbilical, membrana amniótica, sangre menstrual, sangre periférica, glándula salivar, piel y prepucio, líquido sinovial, líquido amniótico, endometrio, tejido adiposo, sangre del cordón umbilical y/o tejido dental. Preferiblemente, las MSC derivan de tejido adiposo y/o médula ósea. Más preferiblemente, las MSC derivan de médula ósea. En el estado de la técnica se conocen métodos para obtener MSC a partir de los tejidos anteriores (Ullah et al, 2015. Biosci. Rep. 35(2): e00191).

En una realización preferida, la MSC es alogénica o autóloga con respecto al individuo que padece o corre el riesgo de padecer cáncer. Preferiblemente, la MSC es autóloga.

En una realización preferida, la composición farmacéutica puede comprender además un agente quimioterápico.

Se hace notar que no todas las especies de vertebrados expresan todas las agrupaciones de TLRs, por ejemplo los seres humanos carecen de los miembros de la familia TLR11 , es decir no expresan los siguientes TLR11/12/13/ 21/22/23. Sin embargo, para aquellas especies de vertebrados que sí expresen dichos receptores pertenecientes a la familia TLR11 y que deban ser objeto de tratamiento farmacológico de acuerdo a cualquiera de los aspectos de la presente invención, el producto de combinación y/o la composición farmacéutica de la presente solicitud pueden contener una MSC modificada en la que el receptor tipo Toll-like 1 1 , 12, 13, 21 , 22 y/o 23 están inhibidos, y (ii) una sustancia antigénica.

Para su uso como medicamento o para su uso en el tratamiento de cáncer

En un tercer aspecto, el producto de combinación y/o la composición farmacéutica de la presente solicitud pueden usarse como medicamento. En un cuarto aspecto, el producto de combinación y/o la composición farmacéutica de la presente solicitud pueden usarse en el tratamiento de un tumor sólido.

En una realización preferida, el tumor sólido se selecciona del grupo que consiste en adenocarcinoma, cáncer suprarrenal, astrocitoma anaplásico, angiosarcoma, cáncer de apéndice, astrocitoma, carcinoma de células básales, linfoma de células B, cáncer del conducto biliar, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, cáncer de médula ósea, cáncer del intestino, cáncer de cerebro, glioma del tronco encefálico, tumor cerebral, cáncer de mama, tumores carcinoides, cáncer de cuello uterino, colangiocarcinoma, condrosarcoma, cáncer de colon, cáncer colorrectal, craneofaringioma, linfoma cutáneo, melanoma cutáneo, astrocitoma difuso, carcinoma ductal in situ, cáncer endometrial, ependimoma, sarcoma epitelioide, cáncer de esófago, sarcoma de Ewing, cáncer del conducto biliar extra he pático, cáncer de ojo, cáncer de las trompas de Falopio, fibrosarcoma, cáncer de la vesícula biliar, cáncer gástrico, cáncer gastrointestinal, cáncer de carcinoide gastrointestinal, tumores del estroma gastrointestinal, tumor de células germinales, glioblastoma multiforme, glioma, cáncer de cabeza y cuello, hemangioendotelioma, linfoma de Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, carcinoma ductal infiltrante, carcinoma lobular infiltrante, cáncer de mama inflamatorio, cáncer intestinal, cáncer del conducto biliar intrahepático, cáncer de mama invasivo/infiltrante, cáncer de células del islote, cáncer de mandíbula, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñon, cáncer de laringe, leiomiosarcoma, metástasis leptomeníngeas, cáncer de labio, liposarcoma, cáncer de hígado, carcinoma lobular in situ, astrocitoma de grado bajo, cáncer de pulmón, cáncer de ganglios linfáticos, linfoma, cáncer de mama masculino, carcinoma medular, meduloblastoma, melanoma, meningioma, carcinoma de células de Merkel, condrosarcoma mesenquimatoso, mesenquima, mesotelioma, cáncer de mama metastásico, melanoma metastásico, cáncer de cuello escamoso metastásico, gliomas mixtos, cáncer de boca, carcinoma mucinoso, melanoma de la mucosa, mieloma múltiple, micosis fungoide, síndrome mielodisplásico, cáncer de la cavidad nasal, cáncer nasofaríngeo, cáncer de cuello, neuroblastoma, tumores neuroendocrinos, linfoma no Hodgkin, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de células en grano de avena, cáncer ocular, melanoma ocular, oligodendroglioma, cáncer bucal, cáncer de la cavidad bucal, cáncer orofaríngeo, sarcoma osteogénico, osteosarcoma, cáncer de ovarios, cáncer epitelial de ovarios, tumor de células germinales de los ovarios, carcinoma peritoneal primario de los ovarios, tumor del estroma de los cordones sexuales del ovario, enfermedad de Paget, cáncer pancreático, carcinoma papilar, cáncer del seno paranasal, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer pélvico, cáncer de pene, cáncer de los nervios periféricos, cáncer peritoneal, cáncer faríngeo, feocromocitoma, astrocitoma pilocítico, tumor de la región pineal, cáncer de hipófisis, linfoma primario del sistema nervioso central, cáncer de próstata, cáncer rectal, carcinoma de células renales, cáncer de pelvis renal, rabdomiosarcoma, cáncer de la glándula salivar, sarcoma, sarcoma óseo, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma uterino, cáncer de senos, cáncer de piel, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer del intestino delgado, cáncer espinal, cáncer de la columna vertebral, cáncer de la médula espinal, tumor espinal, carcinoma de células escamosas, cáncer de estómago, sarcoma sinovial, linfoma de células T, cáncer de testículos, cáncer de garganta, timoma/carcinoma del timo, cáncer tiroideo, cáncer de lengua, cáncer de amígdalas, cáncer de células de transición, cáncer de mama triple negativo, cáncer de trompas, carcinoma tubular, cáncer uretral, adenocarcinoma uterino, cáncer uterino, cáncer vaginal y cáncer de vulva. Preferiblemente, el tumor sólido es un cáncer de cerebro, cáncer de pulmón, cáncer de riñon, cáncer de ovarios y/o cáncer de hígado.

En una realización preferida, el producto de combinación y/o la composición farmacéutica de la presente solicitud pueden usarse en el tratamiento de cáncer de cerebro y/o cáncer de pulmón. Preferiblemente, el cáncer de cerebro es un neuroblastoma y/o el cáncer de pulmón es un carcinoma de pulmón.

En una realización preferida, el producto de combinación y/o la composición farmacéutica de la presente solicitud pueden usarse en el tratamiento de cáncer de cerebro. Preferiblemente, el cáncer de cerebro es un neuroblastoma.

En una realización preferida, el producto de combinación y/o la composición farmacéutica de la presente solicitud pueden usarse en el tratamiento de cáncer de pulmón. Preferiblemente, el cáncer de pulmón es un carcinoma de pulmón.

En una realización preferida, el producto de combinación y/o la composición farmacéutica de la presente solicitud pueden usarse en combinación con quimioterapia y/o radioterapia.

Administración

El producto de combinación y/o la composición farmacéutica pueden administrarse a animales y/o humanos. Preferiblemente, el producto de combinación y/o la composición farmacéutica pueden administrarse a un individuo humano. Más preferiblemente, el producto de combinación y/o la composición farmacéutica pueden administrarse a un individuo que es un niño. En una realización preferida, el producto de combinación se administra a un individuo que padece o corre el riesgo de padecer cáncer de cerebro, cáncer de pulmón, cáncer de riñon, cáncer de ovarios y/o cáncer de hígado.

En una realización preferida, el producto de combinación se administra para prevenir la aparición de cáncer. Por ejemplo, el producto de combinación puede administrarse a un animal o individuo que corre el riesgo de desarrollar cáncer. En una realización preferida, el producto de combinación se administra para tratar el cáncer. Por ejemplo, el producto de combinación puede administrarse a un animal o individuo que padece cáncer.

En una realización preferida, el producto de combinación se prepara para las vías de administración intravenosa, intramuscular, subcutánea y/o transdérmica, preferiblemente vías intravenosas.

En una realización preferida, el producto de combinación se administra una vez por semana, mes o año. Preferiblemente, el producto de combinación se administra al menos una vez por semana.

Método para la producción de MSC modificadas que comprenden un parásito intracelular

En un quinto aspecto, la presente solicitud proporciona un método para la producción de células madre mesenquimales modificadas que comprenden un parásito intracelular, que comprende las etapas de:

(1) aislar células madre mesenquimales a partir de una muestra aislada;

(2) cultivar las células madre mesenquimales;

(3) inhibir al menos un receptor de tipo Toll-like cuya señalización intracelular active la proteína MyD88, más particularmente inhibir al menos un receptor de tipo Toll-like seleccionado de la lista que consiste en TLR1 , TLR2, TLR6, TLR10, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, y/o TLR9, preferiblemente TLR4 y/o TLR9, y/o el gen MyD88 de las células madre mesenquimales aisladas; y

(4) infectar las células madre mesenquimales con un parásito intracelular.

En una realización preferida, se aislan MSC a partir de médula ósea, placenta, cordón umbilical, membrana amniótica, sangre menstrual, sangre periférica, glándula salivar, piel y prepucio, líquido sinovial, líquido amniótico, endometrio, tejido adiposo, sangre del cordón umbilical y/o tejido dental aislados. Preferiblemente, las MSC se aislan a partir de tejido adiposo y/o médula ósea aislados. Más preferiblemente, las MSC se aislan a partir de médula ósea aislada. En el estado de la técnica se conocen métodos para obtener MSC a partir de los tejidos anteriores (Ullah et al, 2015. Biosci. Rep. 35(2): e00191).

En una realización preferida, las MSC aisladas son autólogas o alogénicas. Preferiblemente, las MSC aisladas son autólogas. En una realización preferida, las MSC se aislan a partir de un tejido de médula ósea autólogo aislado, en el que el tejido de médula ósea se obtuvo del

paciente que padece o corre el riesgo de padecer cáncer.

En una realización preferida, las MSC se cultivan en una placa de cultivo celular. Preferiblemente, el medio es medio de Eagle modificado por Dulbecco. Más preferiblemente, el medio también se complementa con suero bovino fetal, preferiblemente al 10% (p/v). Lo más preferiblemente, las células se cultivan a 37°C en una atmósfera humidificada con el 5% de C02.

TLR4 puede inhibirse usando un inhibidor de TLR4. En una realización preferida, TLR4 se inhibe usando: (i) ARNip, (ii) vectores para terapia génica, preferiblemente vectores para terapia génica que comprenden sistemas de edición génica, como por ejemplo el sistema CRISPR/Cas9, (iii) un inhibidor de molécula pequeña bioactivo del receptor de tipo Toll-like 4 seleccionado del grupo que consiste en 3,4,6-triacetato de isopropil-2-(acetilamino)-2-desoxi-a-D-glucopiranósido, resatorvid, eritorán y un péptido con la secuencia KYSFKLILAEYRRRRRRRRR (SEQ ID NO: 1), y/o (iv) un anticuerpo neutralizante que se une a la región extracelular de TLR4. Preferiblemente, TLR4 se inhibe usando: (i) ARN de interferencia pequeño y/o (ii) vectores para terapia génica, preferiblemente vectores para terapia génica que comprenden sistemas de edición génica, como por ejemplo el sistema CRISPR/Cas9. Lo más preferiblemente, TLR4 se inhibe usando vectores para terapia génica, preferiblemente vectores para terapia génica que comprenden el sistema CRISPR/Cas9.

TLR9 puede inhibirse usando un inhibidor de TLR9. En una realización preferida, TLR9 se inhibe usando: (i) ARN de interferencia pequeño, (ii) vectores para terapia génica, preferiblemente vectores para terapia génica que comprenden sistemas de edición génica, como por ejemplo el sistema CRISPR/Cas9, (iii) un inhibidor de molécula pequeña bioactivo del receptor de tipo Toll-like 9 seleccionado del grupo que consiste en un nucleótido que comprende la secuencia TTAGGG, ODN 2088, ODN 4084-F, ODN INH-1 , ODN-INH-18, ODN A151 , G-ODN, 3-[4-(6-(3-(dimetilamino)propoxi)benzo[d]oxazol-2-il)fenoxi]-N,N-dimetilpropan-1-amina, 6-[3-(pirrolidin-1-il)propoxi)-2-(4-(3-(pirrolidin-1-il)propoxi)fenil]benzo[d]oxazol, y/o (iv) un anticuerpo neutralizante que se une a la región extracelular de TLR9. Preferiblemente, TLR9 se inhibe usando: (i) ARN de interferencia pequeño y/o (ii) vectores para terapia génica, preferiblemente vectores para terapia génica que comprenden sistemas de edición génica, como por ejemplo el sistema CRISPR/Cas9. Lo más preferiblemente, TLR9 se inhibe usando vectores para terapia génica, preferiblemente vectores para terapia génica que comprenden el sistema CRISPR/Cas9.

De manera evidente para la persona experta en la materia y en línea con lo establecido en los párrafos precedentes para los receptores TLR4 y TLR9, el resto de receptores TLRs

mencionados a lo largo de la presente memoria, tales como TLR1 , TLR2, TLR6, TLR10, TLR5, TLR7, y TLR8, podrán inhibirse con herramientas similares. Asimismo, el gen o la proteína MyD88 se podrá inhibir usando (i) ARN de interferencia pequeño, (ii) vectores para terapia génica, preferiblemente vectores para terapia génica que comprenden sistemas de edición génica, como por ejemplo el sistema CRISPR/Cas9, o (iii) un inhibidor de molécula pequeña bioactivo del gen MyD88, y/o (iv) un anticuerpo neutralizante que se une a la proteína MyD88.

En una realización preferida, la MSC aislada se infecta usando una multiplicidad de infección (MOI) de entre 1 y 1000. Preferiblemente, la MOI es de entre 1 y 500, 50 y 300, 150 y 250 o la MOI es de 200. Preferiblemente, la MOI es de al menos 1 , 10, 50, 150 ó 200 y la MOI es como máximo de 1000, 500, 300 ó 250. Más preferiblemente, la MOI es de 200.

En una realización preferida, el parásito intracelular se selecciona del grupo que consiste en bacterias, virus, protozoos y hongos. Más preferiblemente, la sustancia antigénica es un virus oncolítico.

El virus oncolítico puede ser cualquier virus que infecta preferiblemente y destruye células cancerosas. En una realización preferida, el virus oncolítico se selecciona del grupo que consiste en adenovirus, reovirus, virus del sarampión, virus del herpes simple, virus de la enfermedad de Newcastle, virus vaccinia, virus de Coxsackie y virus del valle del Séneca. Preferiblemente, el virus oncolítico es un adenovirus. Más preferiblemente, el virus oncolítico es ICOVIR-5.

Kit

En un sexto aspecto, la presente solicitud proporciona un kit que comprende (a) una célula madre mesenquimal, (b) una sustancia antigénica y (c) un inhibidor de al menos un receptor de tipo Toll-like cuya señalización intracelular active la proteína MyD88, más particularmente un inhibidor de al menos un receptor de tipo Toll-like seleccionado de la lista que consiste en TLR1 , TLR2, TLR6, TLR10, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, y/o TLR9, preferiblemente TLR4 y/o TLR9, y/o del gen MyD88, de las células madre mesenquimales aisladas. Preferiblemente dicho inhibidor es seleccionado del grupo que consiste en: (i) ARNip, (ii) vectores para terapia génica, preferiblemente vectores para terapia génica que comprenden sistemas de edición génica, como por ejemplo el sistema CRISPR/Cas9, (iii) un inhibidor de molécula pequeña bioactivo del receptor de tipo Toll-like 1 , 2, 6, 10, 4, 5, 7, 8, y/o 9, preferiblemente del 4 seleccionado del grupo que consiste en 3,4,6-triacetato de isopropil-2-(acetilamino)-2-desoxi-a-D-glucopiranósido, resatorvid, eritorán y un péptido con la secuencia KYSFKLILAEYRRRRRRRRR (SEQ ID NO: 1), y/o un inhibidor de molécula pequeña bioactivo

del receptor de tipo Toll-like 9 seleccionado del grupo que consiste en un nucleótido que comprende la secuencia TTAGGG, ODN 2088, ODN 4084-F, ODN INH-1 , ODN-INH-18, ODN A151 , G-ODN, 3-[4-(6-(3-(dimetilamino)propoxi)benzo[d]oxazol-2-il)fenoxi]-N,N-dimetilpropan-1-amina, 6-[3-(pirrolidin-1-il)propoxi)-2-(4-(3-(pirrolidin-1-il)propoxi)fenil]benzo[d]oxazol, y (iv) un anticuerpo neutralizante que se une a la región extracelular del receptor de tipo Toll-like 1 , 2, 6, 10, 4, 5, 7, 8, y/o 9.

3,4,6-Triacetato de isopropil-2-(acetilamino)-2-desoxi-a-D-glucopiranósido se comercializa por Sigma (n.° de producto: SML0832, número CAS: 40592-88-9). Resatorvid se comercializa por Cayman chemical (n.° de producto: SML0832, número CAS: 243984-11-4). Eritorán se comercializa por Eisai Co. (n.° de producto: E5564, número CAS: 185955-34-4). ODN 2088 se comercializa por InvivoGen (n.° de producto: tlrl-2088-1). ODN 4084-F se comercializa por InvivoGen (n.° de producto: tlrl-4084). ODN INH-1 se comercializa por InvivoGen (n.° de producto: tlrl-inh1). ODN-INH-18 se comercializa por InvivoGen (n.° de producto: tlrl-inh18). ODN A151 se comercializa por InvivoGen (n.° de producto: tlrl-ttag 151). G-ODN se comercializa por InvivoGen (n.° de producto: tlrl-godn). 3-[4-(6-(3-(Dimetilamino)propoxi)benzo[d]oxazol-2-il)fenoxi]-N,N-dimetilpropan-1 -amina puede sintetizarse por Eisai Inc. (AT791 ; Lamphier et al, 2014. Mol. Pharmacol. 85(3): 429-40). 6-[3-(Pirrolidin-1-il)propoxi)-2-(4-(3-(pirrolidin-1-il)propoxi)fenil]benzo[d]oxazol puede sintetizarse por Eisai Inc. (E6446; Lamphier et al, 2014. Mol. Pharmacol. 85(3): 429-40).

En una realización preferida, el inhibidor de TLR1 , TLR2, TLR6, TLR10, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, y/o TLR9, preferiblemente TLR4 y/o TLR9 se selecciona del grupo que consiste en: (i) ARNip y (ii) vectores para terapia génica, preferiblemente vectores para terapia génica que comprenden sistemas de edición génica, como por ejemplo el sistema CRISPR/Cas9. Preferiblemente, el inhibidor de TLR4 y/o TLR9 son vectores para terapia génica, preferiblemente vectores para terapia génica que comprenden el sistema CRISPR/Cas9.

La sustancia antigénica puede ser cualquier sustancia que puede producirse por la MSC modificada, produce una respuesta inmunogénica y puede liberarse en el sitio tumoral para producir una respuesta inmunogénica localizada. En una realización preferida, la sustancia antigénica es un parásito intracelular. Preferiblemente, el parásito intracelular se selecciona del grupo que consiste en bacterias, virus, protozoos y hongos. Más preferiblemente, la sustancia antigénica es un virus oncolítico.

El virus oncolítico puede ser cualquier virus que infecta preferiblemente y destruye células cancerosas. En una realización preferida, el virus oncolítico se selecciona del grupo que consiste en adenovirus, reovirus, virus del sarampión, virus del herpes simple, virus de la

enfermedad de Newcastle, virus vaccinia, virus de Coxsackie y virus del valle del Séneca. Preferiblemente, el virus oncolítico es un adenovirus. Más preferiblemente, el virus oncolítico es ICOVIR-5.

Ejemplos

Ejemplo 1 : Aislamiento y caracterización de mMSC

Se obtuvieron mMSC a partir de tejido adiposo abdominal e inguinal de ratones de diferentes razas: ratones C57BL/6J (mMSC BL6), C57BL/10J (mMSC BL10), C57BL/10TLR4"'" (mMSC TLR4"'") y C57BL/10TLR9"'" (mMSC TLR9"'"). Se digirió el tejido adiposo con colagenasa B (2 mg/ml; Roche) durante 45 min a 37°C y se filtró a través de un tamiz celular de malla de nailon de 70 μΜ estéril (Fisher Scientific). Se sembraron las células en una placa de cultivo celular y se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco completo (DMEM) (Lonza): DMEM complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% (Sigma-Aldrich), estreptomicina (100 mg/ml; Lonza), penicilina (100 U/ml; Lonza) y glutamina (2 mM; Lonza) a 37°C en una atmósfera humidificada con el 5% de C02. Se caracterizó que las mMSC tenían una morfología de tipo fibroblasto (véase la figura 1).

Ejemplo 2: Activación de la ruta de NF-κΒ tras la infección viral con ICOVIR-5, ensayo de luciferasa

Se infectaron las mMSC con ICOVIR-5 (un adenovirus oncolítico) a una multiplicidad de infección (MOI) de 200 en 1 mi por 1x106 células durante 2 h a 37°C. La infección se realizó en suspensión en DMEM sin FBS. Se lavaron las células 3 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 min para eliminar el virus del sobrenadante de cultivo celular. Las mMSC infectadas se denominan Celyvir.

Se evaluó la activación de NF-κβ usando un sistema de indicador de luciferasa. Se sembraron 1x105 mMSC en una placa de 6 pocilios con 700 μΙ por pocilio de DMEM complementado con FBS al 10% y se transdujeron con un vector lentiviral no replicativo durante la noche. El vector lentiviral contiene el plásmido pHAGE N F-KB-TA-LUC-U BC-GFP-W (plásmido de Addgene n.° 49343), cuya estructura codifica para la secuencia de unión consenso a NF-κβ en el sentido de 5' del promotor de TA mínimo del virus del herpes simple seguido por el gen de luciferasa de luciérnaga así como el gen de eGFP en el sentido de 5' del promotor de ubiquitina-C. Se evaluó la eficacia de la transducción mediante cuantificación de la expresión de GFP mediante citometría de flujo. Se infectaron las células transducidas con ICOVIR-5 tal como se describió anteriormente y se sembraron 1x104 células por pocilio en placas de 96 pocilios con DMEM

complementado con FBS al 10%. Tras 24 h, se llevó a cabo la lisis celular para la extracción de proteínas totales y se sometió a ensayo la actividad luciferasa con el sistema de ensayo de luciferasa siguiendo las instrucciones del fabricante (Promega Corporation, Madison, Wl, EE.UU.).

La activación de la ruta de NF-κβ es el principal acontecimiento inmunológico inicial que se produce en respuesta a un patógeno. Tal como puede observarse en la figura 2, las células mMSC TLR4"'" mostraron una cantidad aumentada de actividad luciferasa tras la infección con ICOVIR-5. Por tanto, la infección de las células mMSC TLR4"'" con ICOVIR-5 activó la ruta de NF-kB.

Ejemplo 3: Ensayos de Western blot

Se sembraron 5x105 mMSC o Celyvir por pocilio en placas de 6 pocilios con DMEM complementado con FBS al 10%. Tras 3 y 24 h de tratamiento, se extrajeron las proteínas totales con tampón de muestra de SDS (Tris 62,5 mM, pH 6,8, dodecilsulfato de sodio al 2% (SDS), glicerol al 10%, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF), fluoruro de sodio 5 mM (NaF), β-glicerofosfato 20 mM, Na3V04 0,1 mM y cóctel de inhibidores de proteasa 1 :100 (Sigma-Aldrich)) y se congelaron los lisados totales. Se sometieron las muestras a ebullición a 95°C durante 5 min y se sonicaron tres veces durante 30 s cada vez en hielo. Se determinó la concentración de proteínas usando el ensayo de proteínas DC (Bio-Rad). Se añadieron 100 mM de ditiotreitol (DTT) y el 0, 1 % de azul de bromofenol (BPB) a las muestras y se sometieron a ebullición a 95°C durante 5 min.

Se separaron las proteínas mediante electroforesis en electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 10% (SDS-PAGE), se transfirieron a membranas de poli(difluoruro de vinilideno) (PVDF) (Bio-Rad, Hercules, CA) y se bloquearon con leche al 2% en solución salina tamponada con tris (TBS). Los anticuerpos primarios que se usaron fueron anticuerpo monoclonal de ratón anti-c-Jun a una dilución de 1 :1000, anticuerpo anti-p-actina (clon AC-15; Sigma-Aldrich) a 1 :100000 y anticuerpo monoclonal de conejo anti-fosfo-Akt (Ser473, clon 21 18; Epitomics) a una dilución de 1 : 1000. Se lavaron las membranas tres veces con TBS con Tween 20 al 0,1 % (TBS-T) durante 10 min. Los anticuerpos secundarios fueron inmunoglobulinas policlonales de cabra anti-conejo y anti-ratón/HRP (Dako) a una dilución de 1 :3000, y se incubaron durante 1 h a TA. Se detectó la señal de HRP con sustrato de HRP quimioluminiscente de tipo Western Immobilon (Millipore, Darmstadt, Alemania) y se reveló usando un Hyperoprocessor de rayos X (Amersham Pharmacia Biotech). Se digitalizaron las membranas y se cuantificó la expresión de proteínas midiendo el valor gris medio de las bandas en el software Image J. Se restó el fondo de cada membrana de los valores obtenidos.

Akt y Jun se fosforilan como resultado de la activación de TLR4 y TLR9. Akt y Jun se fosforilaron en todas las células 24 horas tras la infección con ICOVIR-5 (véase la figura 3). La ausencia de los TLR en las mMSC no parece modificar la respuesta de las células a una infección con ICOVIR-5.

Ejemplo 4: Ensayo de migración in vitro

Se estudió la capacidad de migración de mMSC y Celyvir usando un ensayo in vitro. Se recubrieron placas Transwell de 24 pocilios (filtros con poros de 8 μηι, BD Biosciences) con gelatina al 0,1 % (Sigma-Aldrich) y se sembraron 5x104 células por pocilio con DMEM sin FBS en la cámara superior. Se sembraron 1x105 células CMT 64 por pocilio con DMEM sin FBS en la cámara inferior como estímulos. Se incubaron insertos durante 24 h a 37°C en una atmósfera humidificada con el 5% de C02. Se realizó un ensayo de control negativo incubando mMSC en la cámara superior en presencia de DMEM sin células en la cámara inferior. Tras 24 h, se lavaron las placas Transwell y se eliminaron las células que no migraron con un hisopo humidificado con PBS. Se fijaron las células migradas con formaldehído al 10% durante 10 min y se tiñeron con violeta cristal. Se contaron las células de 13 campos de alta potencia (HPF) para cada condición.

Las células BL6 y BL10 infectadas con ICOVIR-5 tenían una mayor tendencia a migrar hacia las células CMT 64. Este efecto no pudo medirse en células TL4"A o TLR9"'" que migraron hacia las células CMT64 independientemente de si estaban infectadas o no (véase la figura 4).

Ejemplo 5, 6 y 7: Inducción de tumor y tratamiento antitumoral

Se obtuvo la línea celular CMT 64, un carcinoma de pulmón de células no pequeñas murino, de la colección general ECACC (ECACC 10032301) y se cultivó en DMEM completo a 37°C en una atmósfera humidificada con el 5% de C02. Para la monitorización in vivo, se transdujeron células CMT 64 con un vector lentiviral no replicativo que contenía un cásete de luciferasa de luciérnaga (CMT 64-Luc). Para experimentos in vivo, se establecieron tumores subcutáneos de células CMT 64-Luc mediante inyección de 1x106 células diluidas en 100 μΙ de PBS en ratones C57BL/6J hembra de 7 semanas de edad. Tras 6 días desde la inoculación del tumor, se midió la luminiscencia de los tumores y se establecieron cinco grupos homogéneos (véase la figura 5b) de la siguiente manera: PBS (n=4), Celyvir BL6 (n=6), Celyvir BL10 (n=5), Celyvir TLR4"'" (n=4) y Celyvir TLR9"'" (n=6).

Se realizó un total de dos experimentos in vivo, cada uno de ellos con diferentes dosis: Celyvir de dosis baja (3x104 células/ratón) y Celyvir de dosis alta (5x105 células/ratón) resuspendidos en 200 μΙ de PBS e inyectados por vía intraperitoneal (i.p.). Se administró un total de 4 dosis, separadas 5 días unas de otras. Se realizó un seguimiento del crecimiento tumoral midiendo la longitud (L), anchura (W) y altura (H) con un calibre cada 3-5 días. Se calculó el volumen tumoral como (Ι_χ\Λ/χΗ)π/6, suponiendo que los tumores eran aproximadamente semielipsoides. Tras 30 días desde la inoculación del tumor, se sacrificaron los ratones y se extirparon los tumores y se procesaron para la citometría de flujo y el análisis de histología.

El estudio recibió la aprobación del comité de ética de experimentación con animales en cumplimiento con la directiva de la Unión Europea 86/609. El cuidado y los experimentos con animales se llevaron a cabo según las directrices detalladas en el Real Decreto 1201/2005 de España.

Se compararon los grupos tratados con Celyvir con los grupos de control tratados con PBS. Se usó Celyvir BL6 como control positivo ya que su eficacia se había demostrado anteriormente. En los experimentos realizados con dosis bajas de Celyvir (véase la figura 6), Celyvir TLR4"'" y Celyvir TLR9"'" presentaron los mejores rendimientos. Ambas de estas líneas celulares infectadas disminuyeron tanto el volumen como el peso de los tumores. Se obtuvieron resultados similares con Celyvir TLR4"'" cuando se usaron dosis altas (véase la figura 7).

Ejemplo 8: Citometría de flujo del infiltrado inmune tumoral

Se digirieron los tumores extraídos con colagenasa IV (1 mg/ml) en agitación durante 1 h a 37°C y se homogeneizaron mecánicamente usando una mano de mortero de PTFE de Potter-Elvehjem cuando fue necesario. Se aplastaron los bazos mecánicamente y se usaron como control positivo para las diferentes poblaciones de células inmunitarias. Se filtraron las suspensiones celulares a través de un tamiz celular de malla de nailon de 70 μΜ estéril usando el extremo de caucho de una jeringa de 3 mi en PBS helado y se sometieron los glóbulos rojos a lisis mediante incubación con tampón Quicklysis (Cytognos). Se bloquearon las suspensiones celulares con reactivo de bloqueo de FcR de ratón (Miltenyi) durante 20 min y se incubaron con los siguientes anticuerpos monoclonales de ratón diluidos en PBS durante 20 min a 4°C: anticuerpo anti-CD45 (clon 30-F1 1), anticuerpo anti-CD3 (clon 145-2C11), anticuerpo anti-CD4 (clon GK1.5), CD8 (clon 53-6.7), CD1 1 b (clon M1/70), CD11 c (clon N418), CD206 (clon C068C2), MHCII (clon M5/114.15.2), Ly6C (clon AL-21), Ly6G (clon 1a8-Ly6g) y NK1.1 (clon PK136), todos ellos de eBioScience. Tras la incubación, se lavaron las células y se marcaron con el marcador de viabilidad 7-aminoactinomicina (7AAD) (Fisher Scientific, Waltham, MA) durante 10 min a TA. Se adquirieron muestras con el citómetro de analizador MACSQuant® y

se analizaron usando software de análisis MACSQuantify (Miltenyi Biotec). Se definieron poblaciones inmunitarias de la siguiente manera: leucocitos (CD45+); linfocitos T totales (CD45+ CD3+), subclasificados como linfocitos T cooperadores (CD4+) y linfocitos T citotóxicos (CD8+); células NK (NK1.1+); células dendríticas (NK1.1- CD1 1 b+ CD1 1c+); macrófagos (CD45+ CD11 b+ MHCII+ Ly6G-), subclasificados como M1 proinflamatorio (CD206-) y M2 antiinflamatorio (CD206+); y neutrófilos (CD45+ CD1 1 b+ MHCII- Ly6G+), subclasificados como N1 proinflamatorio (CD206-) y N2 antiinflamatorio (CD206+).

En general, los ratones tratados con Celyvir TLR4"'" mostraron una mayor infiltración de leucocitos en el sitio tumoral (figura 8a). De manera similar, el porcentaje de células CD4+ dentro de la población de células CD3+ parece estar aumentado en comparación con los demás grupos (figura 8c) y la proporción de células CD4+/CD8+ aumenta de manera notable (figura 8d). Tal como se muestra en la figura 8e, los grupos tratados con Celyvir tienen una mayor tendencia a contener un porcentaje superior de células NK en la muestra, especialmente los grupos tratados con Celyvir TLR9"'". El porcentaje de células dendríticas también aumenta en los grupos tratados con Celyvir, especialmente el grupo tratado con Celyvir TLR4"'" (véase la figura 8f).

Los macrófagos y los monocitos son poblaciones heterogéneas que comprenden un subtipo M1 proinflamatorio y un subtipo M2 antiinflamatorio. Aunque los niveles de M1 y M2 aumentaron en el grupo tratado con Celyvir BL10, la proporción entre los dos subtipos parece ser similar a la encontrada en el grupo tratado con PBS (figura 8g). Por otro lado, en el grupo tratado con Celyvir TLR4"'" la proporción de células M1 aumenta, mientras que en el grupo tratado con TLR9"'" parece producirse lo contrario. En los grupos tratados con Celyvir que son deficientes en TLR, hay una tendencia a observar un aumento en el porcentaje de neutrófilos (figura 8h), en el que la proporción de N1/N2 se mantiene en el grupo tratado con Celyvir TLR4" y la proporción disminuyó en el grupo tratado con Celyvir TLR9"'" (figura 8h).

Por tanto, parece que la terapia con Celyvir se basa en la inducción de una respuesta inmunitaria en el sitio tumoral. Por tanto, resulta verosímil que también puedan usarse mMSC que comprenden otros parásitos intracelulares o antígenos para tratar tumores.

Ejemplo 9: Histología de los tumores extirpados

Se fijaron muestras de tumores extirpados en disolución de formaldehído tamponada al 10% durante la noche, se lavaron con PBS y se sumergieron en disolución de sacarosa al 30%, se incrustaron en medio de temperatura de corte óptima (OCT) (Tissue-Tek) y se congelaron. Se obtuvieron secciones de 8 μηι de grosor en un criostato y después se tiñeron con tinción con hematoxilina y eosina siguiendo protocolos de tinción convencionales.

Se validó que podía observarse un mayor grado de infiltración de leucocitos en el sitio tumoral en el grupo tratado con Celyvir TLR4"'" (véase la figura 9). En las muestras, podía incluso observarse la infiltración de lo que parecían ser eosinófilos, lo que no se observó en las muestras de tumor sin tratar.

Ejemplo 10: Micromatriz de citocinas

Se analizó el patrón de citocinas proinflamatorias en Celyvir y mMSC BL10 y TLR4"'" mediante ensayo de matriz de citocinas. Se sembraron 4x104 células por pocilio en placas de 24 pocilios con 1 mi de DMEM complementado con FBS al 10%. Tras 24 h, se recogieron los sobrenadantes y se analizó el patrón de citocinas proinflamatorias usando un kit de panel de matriz de ratón A Proteome Profiler según las indicaciones del fabricante (R&D Systems, Mineápolis, MN). Se digitalizaron las imágenes de matrices y se midió la cuantificación del perfil de citocinas mediante densidad de píxeles de puntos duplicados usando un analizador de matriz de proteínas para el software ImageJ.

Se midió mediante ELISA la cuantificación de citocina CXCL10 secretada por mMSC y Celyvir. Se sembraron 4x104 células por pocilio en placas de 24 pocilios en 1 mi de DMEM complementado con FBS al 20%. Tras 24 h, se recogieron los sobrenadantes y se midieron los niveles de proteína CXCL10 usando el kit de ELISA CRG-2/IP-10 Ray Bio de ratón (RayBiotech, Norcross, GA) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Se midió la cuantificación leyendo la absorbancia a 450 nm usando el lector Infinite® 200 (Tecan, Zúrich, Suiza).

Tal como puede observarse en la figura 10, mMSC TLR4"'" y Celyvir TLR4"'" secretaron generalmente menos citocinas proinflamatorias. De las citocinas estudiadas, hubo un cambio en los niveles de expresión de IL-6, CXCL10, CXCL1 , CCL2, CXCL2, CCL5, TIMP-1 y CXCL12. Sólo CXCL12 se secretó más en mMSC TLR4"'" y Celyvir TLR4"'".

Por tanto, parece que la inhibición/eliminación de TLR4"'" hace que la mMSC infectada sea menos propensa a que la detecte el sistema inmunitario antes de llegar al sitio tumoral. En el sitio tumoral, la mMSC libera el virus que contiene antígeno, lo que induce una respuesta inmunitaria dirigida.

Ejemplo 11 y 12: Inducción de tumor y tratamiento antitumoral

Se establecieron tumores subcutáneos de células CMT 64-Luc mediante inyección de 1x106 células diluidas en 100 μΙ de PBS en ratones C57BL/6J de 7 semanas de edad. 9 días después se establecieron cinco grupos homogéneos (véase la figura 5b) de la siguiente manera: PBS, Celyvir BL/6, Celyvir BL/10, Celyvir TLR4"'" y Celyvir MyD88"A.

Se realizó un total de dos experimentos in vivo, uno a tiempo largo (30 días post-inoculación tumoral, figura 1 1) y otro a tiempo corto (23 días post-inoculación tumoral, figura 12), ambos con dosis baja (1x105 células/ratón) resuspendidos en 200 μΙ de PBS e inyectados por vía intraperitoneal (i.p.). Se administró un total de 4 dosis, separadas 5 días unas de otras. Se realizó un seguimiento del crecimiento tumoral midiendo la longitud (L), anchura (W) y altura (H) con un calibre cada 3-5 días. Se calculó el volumen tumoral como (Ι_χ\Λ/χΗ)π/6, suponiendo que los tumores eran aproximadamente semielipsoides y se gráfico el crecimiento tumoral dividiendo el volumen tumoral del día indicado entre el volumen tumoral de la primera medida. 23 o 30 días tras la inoculación del tumor (respectivamente), se sacrificaron los ratones.

El estudio recibió la aprobación del comité de ética de experimentación con animales en cumplimiento con la directiva de la Unión Europea 86/609. El cuidado y los experimentos con animales se llevaron a cabo según las directrices detalladas en el Real Decreto 1201/2005 de España.

Se compararon los grupos tratados con Celyvir con los grupos de control tratados con PBS. Se usó Celyvir BL/6 como control positivo ya que su eficacia se había demostrado anteriormente. En ambos experimentos, Celyvir TLR4"'" y Celyvir MyD88"A presentaron los mejores rendimientos antitumorales. Este resultado también se vio reflejado al considerar como punto final un volumen tumoral de 300 mm3, presentando el grupo tratado con Celyvir TLR4"'" una mayor supervivencia que el resto de grupos. Este estudio de supervivencia no se realizó con Celyvir MyD88"A.

Ejemplo 13: Análisis in vivo de migración de MSC al tumor

Para la monitorización in vivo del tratamiento Celyvir al tumor, se establecieron tumores subcutáneos en ratones C57BL/6J mediante la inoculación de 1x106 células CMT64-Luc. Las células madre mesenquimales se infectaron con ICOVIR-5 y se marcaron con el compuesto DIR (8,33 mg/ml) durante 30 minutos. Se inocularon 1x106 células/ratón mediante administración intraperitoneal y 48 horas después se midió la señal fluorescente en los tumores mediante el sistema de imagen IVIS 200 (Caliper). Como control negativo se usaron células madre mesenquimales sin mareaje DIR (no fluorescentes).

A las 48 horas, se observó en todos los ratones tratados con Celyvir una migración localizada de las células madre mesenquimales en el tumor. Sin embargo, la señal fluorescente fue mayor en los ratones tratados con células madre mesenquimales deficientes en TLR4 y MyD88 (TLR4-/- y MyD88-/-, respectivamente), presentando en ambos casos una migración significativamente mayor que la de las células madre mesenquimales wildtype (BL6). Se consideró que P<0,05 (*) y P<0,01 (**) eran estadísticamente significativos.