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1. (WO2008062495) LIQUID CHROMATOGRAPH CONTROL DEVICE, LIQUID CHROMATOGRAPHY PERFORMING METHOD AND LIQUID CHROMATOGRAPH CONTROL PROGRAM
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明 細 書

液体ク口マトグラフの制御装置、液体ク口マトグラフィの実行方法及 び液体ク口マトグラフの制御プログラム

技術分野

本発明は、移動相として液体溶媒(溶離液)を用いる液体クロマト グラフィに関し、より詳細には、液体クロマトグラフィを行う際の条 件検討に関する。

背景技術

液体クロマトグラフィにおいては、カラム内に充填された固定相内 に、複数の溶媒が混合された溶離液である移動相に溶解された試料が 通過される。このとき、カラム内に導入された試料内の各成分は固定 · 相との相互作用や移 »相との親和性等により、それぞれ力ラムを通過 する時間が異なるため、カラムから排出される時点では各成分が分離 される。固定相との相互作用が強い、又は移動相との親和性の弱い物 質がカラム中に長く留まり、カラムから遅く排出されることとなる。 上記示した液体クロマトグラフィと同じ原理により行われる薄層ク 口マトグラフィ(T L C ) がある。薄層クロマトグラフィでは、薄層 とされた固定相(充填剤)に用いられる物質に試料が 1滴垂らされ、 この薄層が移動層となる溶離液中に浸漬される。そして、毛管現象に より溶離液が薄層に吸い上げられると共に試料が吸い上げられる作用 によりクロマトが行われる。この結果から、試料の溶離液に対する移 動度 Rf を求めることができる。このようにして任意の溶媒比の溶離液 で行われる T L Cにて求められる移動度 Ri力 S、液体クロマトグラフィ の分離度 Rsに相関性があることが知られている。

しかしながら、上記の移動度 Rf と分離度 Rs との相関性の具体的指 標は明らかにされておらず、 T L Cにおける結果を液体クロマトグラ フィに利用することは行われていない。そのため、現状では、液体ク ロマトグラフィにおいてよりよい分離度 Rs を設定してクロマトを行う ために、まず、ある値の移動度 Rf にて液体クロマトグラフィを行い、 その結果に基づき、溶離液に含まれる極性溶媒と非極性溶媒との割合 を変更する等行って、最適の分離度 Rs を探し設定することが行われて いる。例えば、設定した移動度よりも高い移動度となれば、溶.離液に おける極性溶媒の割合を減少させて、再ぴ液体ク口マトグラフィを行 う必要がある。そのめ、最適の分離を行うための移動度の値が設定 されるまで極性溶媒と非極性溶媒との割合を変えて液体クロマトグラ フィを繰り返し行う必要があり、作業が煩雑で時間がかかり、溶離液 が多量に必要とされるという問題がある。

本発明は上記問題に鑑みなされたものであり、煩雑な作業を行うこ となく適切な移動度 Rf となる溶離液条件でクロマトグラフィを実行す ることができる液体ク口マトグラフィの制御装置、液体クロマトグラ フィの実行方法及ぴ液体ク口マトグラフィの制御プログラムを提供す ることを目的とする。

■発明の開示

本発明者は、上記問題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、溶離液 の各成分の混合比と試料の移動度との関係が比例関係であること、 そして、溶離液の各成分の混合比に対する試料の移動度 Rf の変化率は 、試料の種類が変わっても同じであるという知見を得た。

本発明はこの知見に基づいてなされたものであって、本発明の液体 クロマトグラフィの制御装置は、薄層クロマトグラフの分離において 複数の成分を特定混合比で含む溶離液を用いて分離を行ったときの試 料の移動度 Rf の実測値を前記特定混合比に関連づけて記憶するための 実測値記憶手段と、前記溶離液における各成分の混合比の変化に対す る試料の移動度 Rf の変化率を記憶するための移動度変化率記憶手段と 、前記実測値記憶手段に記憶された前記特定混合比に対する移動度 Rf の実測値と、前記移動度変化率記憶手段に記憶された移動度 Rf の変化 率とに基づいて、特定移動度 RfO が得られる前記溶離液の混合比を求 めるための混合比演算手段と、前記混合比演算手段での演算結果に基 づいて、試料の移動度 Rfが前記特定移動度 RfO となるようにカラムに 送液される前記溶離液の混合比を制御する制御信号を出力するための 混合比制御手段とを備えている。

また、本発明の液体クロマトグラフィの実行方法は、複数の成分を 特定混合比で含む溶離液を用いたときの試料の移動度 Rf の実測値を T L Cを行って求める第 1の工程と、前記第 1の工程で求められた移動 度 Rf の実測値及びこの実測値が求められた前記溶離液の前記特定混合 比に基づいて、前記溶離液における成分の混合比の変化に対する試 料の移動度 Rfの変化率を利用することにより、特定移動度 RfOが得ら れる前記溶離液の混合比を求める第 2の工程と、前記第 2の工程で求 められた前記特定移動度 RfO が得られる混合比を有する前記溶離液を カラムに送液する第 3の工程とを備えている。

上記の構成によると、任意の特定混合比における試料の移動度 Rf を 薄層クロマトグラフィで求めておけば、所望の特定移動度 RfO での溶 離液の混合比を知ることができる。そのため、煩雑な作業を行うこと なく適切な移動度 RfO となる溶離液条件でク口マトグラフィを実行す ることができる。

本発明の液体クロマトグラフの制御装置において、前記移動度変化 率記憶手段が、含有成分の組合せの異なる別種類の溶離液ごとに、各 成分の混合比の変化に対する試料の移動度 Rf の変化率を記憶すること が可能であってよい。

上記の構成によれば、液体クロマトグラフの制御装置を、含有成分 の組合せの異なる多様な種類の溶離液に対して使用することができる

また、另リの観点において、本発明は液体クロマトグラフの制御プロ グラムであって、コンピュータを上記のような液体クロマトグラフの 制御装置として機能させることが可能なプログラムである。なお、こ のプログラムは、 C D— R OM、 F D、 MOなどのリムーバプノレ型記 録媒体やハードディスクなどの固定型記録媒体に記録して配布可能で ある他、有線又は無線の電気通信手段によってインターネットなどの 通信ネットワークを介して配布可能である。

図面の簡単な説明

第 1図は、 T L Cを行う装置を示す斜視図である。

第 2図は、 T L Cを行う際のシリカゲル薄層板の模式図であり、 ( a ) は T L C前、(b ) は T L C後をそれぞれ示している。

第 3図は、本発明が適用される液体クロマトグラフ装置を示す模式 図である。

第 4図は、本発明の一実施の形態による液体クロマトグラフ制御装 置のブロック図である。

第 5図は、第 4図に示す液体ク口マトグラフ制御装置のディスプレ ィへの表示例を描いた図面である。

第 6図は、本発明の一実施の形態による液体クロマトグラフの実行 方法のフローチャートである。

第 7図は、混合比を横軸に、移動度 Rf を縦軸にとったグラフである

発明を実施するための最良の形態

本発明の好適な実施の形態を、第 1図〜第 7図に基づいて以下に説 明する。

第 1図において、薄層クロマトグラフィ(T L C ) に用いられる T L C装置 1を示す。丁1^。装置1は、試料 3が表面に 1滴垂らされた シリカゲル薄層板 2と、容器 5に貯留された溶離液 4とを備えている 。尚、試料 3、シリカゲル薄層板 2を形成するシリカゲル、及び溶離 液 4は、後述する液体クロマトグラフィに用いられるのと同等のもの である。

第 3図において、液体クロマトグラフ装置 1 1を示す。液体クロマ トグラフ装置 1 1は、溶媒 Aが貯留された容器 1 2と、溶媒 Bが貯留 された容器 1 3と、溶媒 Aと溶媒 Bとが連結された位置に設けられた 電磁弁 1 4と、溶離液 4が貯留される混合器 1 5と、ポンプ 1 6と、 インジェクター 1 7と、カラム 1 8と、検出器 1 9と、フラクション レクタ一 2 0とが、この順に配置され経路が形成されている。そし て、電磁弁 1 4に液体クロマトグラフ制御装置 2 1が接続されている

容器 1 2には溶媒 Aが、容器 1 3には溶媒 Bが貯留されている。尚 、用いられる溶媒は 2種類に限定されず、使用状態,目的に応じて数 を増やしてもよい。 -一般に、溶媒 A ·溶媒 Bには、非極性分子と極性 分子との組合せで用いられる。

ポンプ 1 6は、液体クロマトグラフ装置 1 1の回路において、容器 1 5 ·電磁弁 1 4を介して溶媒 A '溶媒 Bを汲み上げる。電磁弁 1 4 は、液体クロマトグラフ制御装置 2 1からの制御信号により、汲み上 げられる溶媒を溶媒 A又は溶媒 Bから選択する。電磁弁 1 4での各溶 媒の選択時間に応じて混合器 1 5内での溶媒 A、 Bの混合比が決定さ れる。混合器 1 5は、汲み上げられた溶媒 A及び溶媒 Bが一旦貯留さ れ、溶離液 1 0とされる。この溶離液 1 0は、後述するように、算出 された混合比を有するものである。

ィンジェクタ一 1 7は、試料 3を有しており、溶離液 1 0が通過す ることで試料 3が送出されるようになっている。この試料 3は、第 1 図における試料 3と同じものである。尚、インジェクター 1 7は 1本 に限定されず、選択的に経路を選ぶことができる並設された複数のィ ンジェクタ一とし、複数の試料について連続的に作業を行うことも可 能である。

カラム 1 8には固定相が充填されており、混合溶媒 1 0が通過する ことで液体クロマトグラフが行われる。この固定相としては、第 1図 におけるシリカゲル薄層板 2を形成するシリカゲルが用いられている 。尚、カラムは 1本に限定されず、選択的に経路を選ぶことができる 並設された複数のカラムとし、複数種類の液体クロマトグラフィを行 うことも可能である。

検知器 1 9は、カラム 1 8にて行われる液体クロマトグラフの結果 の検出を行う。そして、フラクションコレクター 2 0は、複数の試験 管を有しており、検知器 1 9の分析結果により、試料 3に含まれる成 分毎に各試験管に分取されるようになっている。

また、'液体ク口マトグラフ制御装置 2 1は、例えば汎用のパーソナ ルコンピュータなどの情報処理装置によって構成されており、第 4図 に示すように、混合比演算部 2 2 a及び混合比制御部 2 2 bを有する C P U 2 2と、実測値記憶部 2 5 a及び移動度変化率記憶部 2 5 bを 有するメモリ 2 5と、ハードディスク 2 6と、入出力部 2 8とを備え ている。入出力部 2 8には、例えばキーボードやマウスなどから構成 された入力部 2 9と、液体クロマトグラフィの実行過程における様々 な情報をオペレータに知らせるためのディスプレイ 3 0と、 C P Uの 混合比制御部 2 2 bからの指示に基づいて電磁弁 1 4の開閉信号を送 出する電磁弁操作部 3 1とが接続されている。

ハードディスク 2 6には、一実施の形態による液体ク口マトグラフ の制御プログラムを含む各種のソフトウエアが記憶されている。そし て、これらのハードウェア及びソフトウェアが組み合わされることに よって、上述の各部 2 2 a、 2 2 b、 2 5 a , 2 5 bが構築されてい る。なお、このプログラムは、 C D— R OM、 F D、 MOなどのリム 一バブル型記録媒体に記録しておくことにより、任意のコンピュータ にインストー/レすることが可能である。

実測値記憶部 2 5 aは、薄層クロマトグラフィの分離において複数 の成分を特定混合比で含む溶離液を用いて分離を行ったときの試料の 移動度 Rf の実測値を当該特定混合比に関連づけて記憶する。実測値記 憶部 2 5 aに記憶すべきデータは、液体クロマトグラフ装置 1 1を用 いて液体クロマトグラフィを行う前に予め薄層クロマトグラフィを行 つて得られたものであって、オペレータによって入力部 2 9から入力 されてよレ、。

移動度変化率記憶部 2 5 bは、溶離液における各成分の混合比の変 化に対する試料の移動度 Rf の変化率を記憶している。移動度変化率記 憶部 2 5 bに記憶されたデータは、含有成分の組合せの異なる別種類 の溶離液ごとに予め薄層クロマトグラフィを行って得られたものであ る。ハードディスク 2 6には、含有成分の組合せの異なる別種類の溶 離液について、それぞれ移動度 Rf の変化率が格納されている。そして 、本実施の形態による制御プログラムが実行されるときに、実測値記 憶部 25 aに記億された特定混合比にかかる種類の溶離液に対する移 動度 Rfの変化率だけがメモリ 25にロードされる。

混合比演算部 22 aは、実測値記憶部 25 aに記憶された特定混合 比に対する移動度 Rf の実測値と、移動度変化率記憶部 25 bに記憶さ れた移動度 Rf の変化率とに基づいて、特定移動度 RfOが得られる溶離 液の混合比を求める。混合比演算部 22 aでの詳細な動作については 後述する。

混合比制御部 22 bは、混合比演算部 22 aでの演算結果に基づい て、試料の移動度 Rfが特定移動度 RfD となるようにカラムに送液され る溶離液の混合比を制御する制御信号を出力する。この制御信号は入 出力部 28から電磁弁操作部 31に供給される。

ディスプレイ 30には、第 5図に示すように、グラフ 5 1と、ダラ フ 52と、グラジェント条件表 53とが表示される。

グラフ 5 1は、混合器 1 5からカラム 1 8に供給される溶離液 10 の混合比(BZA+B) の時間変化を表したものであり、横軸が経過 時間、縦軸が溶離液に含まれる溶媒 Bの割合である。横軸には、時間 巾 54が W (wa i t)、 G (g r a d i e n t)、 T (t o p)、 FW (f o r wa r d w a s h ) N E Q ( e q u i 1 i b r a t i o n) の順に設定されている。グラフ 52は、横軸が経過時間、縦軸が吸光 度である。グラフ 5 2は試料 3の流出曲線であり、試料 3に含まれる 成分がカラム 1 8から排出されたときに突出した値を示す。グラジェ ント条件表 53は、時間巾毎の、溶離液 10に含まれる溶媒 Aと溶媒 B'との混合比が表示されている。尚、時間巾 Gにおいては、 Wでの混 合比を徐々に Tでの混合比にまで直線的に増加させる。

次に、本発明の液体クロマトグラフの実行方法の一実施の形態につ いて説明する。

(第 1の工程)まず、溶媒 A ·溶媒 Bを特定混合比で含む溶離液 4 を用いたときの、試料 3の移動度 Rf の実測値を、オペレータが薄層ク 口マトグラフィ(TLC) を行って求める。

TLCでは、まず、第 2図(a) に示すように、試料 3が 1滴垂ら された状態のシリカゲル薄層 2が、第 1図に示すように溶離液 4中に 浸漬される。すると、毛管現象により混合溶液 4がシリカゲル薄層 2 に吸い上げられてゆく。これに伴い、試料 3も上方に移動する。溶離 液 4及び試料 3の移動が終了すると、第 2図(b) に示すように、試 料 3は試料 3 'の位置に移動する。このとき、試料 3の混合溶液 4中 に浸漬される前の位置から、溶離液 4の上端までの距離を 1. 0とし て、その 1. 0に対する試料 3 一までの距離が移動度 Rf として求めら れる。

(第 2の工程)以下の工程は液体ク口マトダラフ制御装置 21にお いて行われる。液体クロマトグラフ制御装置 21の CPU 22は、第 6図のステップ S 1において、第 1の工程の TLCで得られた移動度 Rf の実測値が入力部 29から入力されたかどうかを操り返して判断す る。そして、移動度 Rf の実測値が入力された場合には(S 1 : YE S)、ステップ S 2において、移動度 Rf の実測値と共に、これが求め られたときにおける混合溶液 4の溶媒 Aと溶媒 Bとの混合比(特定混 合比)をメモリ 25の実測値記憶部 25 aに記憶する。

次に、ステップ S 3において、実測値記憶部 25 aに記憶された特 定混合比にかかる種類の溶離液について、各成分の混合比の変化に対 する試料の移動度 Rf の変化率のデータがハードディスク 26から読み 出されて移動度変化率記憶部 25 bにロードされる。

そして、ステップ S 4において、混合比演算部 2 2 aは、実測値記 憶部 2 5 aに記憶された特定混合比に対する移動度 Rf の実測値と、移 動度変化率記憶部 2 5 bに記憶された移動度 Rf の変化率とに基づいて 、溶離液の混合比と移動度 Rf との関係を一対一に定める。つまり、移 動度変化率記憶部 2 5 bに記憶されているのは移動度 Rf の変化率に過 ぎないので、混合比を横軸に移動度 Rf を縦軸にとったグラフである第 7図に示すように、移動度変化率記憶部 2 5 bの記憶内容からは、溶 離液の混合比と移動度 Rf との関係を一対一に定めることはできず、両 者の関係を表す直線が直線 6 1、 6 2、 6 3、 6 4 (これらはすべて 移動度変化率記憶部 2 5 bに記憶された移動度 Rf の変化率に従った傾 きを有している)などの無数の直線のいずれかであるということしか 分からない。そのため、実測値記憶部 2 5 aに記憶された特定混合比 X0に対する移動度 Rf の実測値 Rflを用いて、これら無数の直線の中 から座標(X0, Rfl) を通過するものを、実際に移動度 Rf と混合比 との関係を表すものとして選択する。例えば、第 7図に示す例では、 混合比演算部 2 2 aは、両者の関係を表すものとして直線 6 3を選択 する。

さらに、ステップ S 5では、混合比演算部 2 2 aが、液体クロマト グラフ装置 1 1で試料の分取を行う際に必要とされる特定移動度 RfO に対する混合比を、ステップ S 4で定められた一対一の関係に基づい て算出する。例えば、第 5図のグラフ 5 1に示すようなグラジェント 処理を行う場合、混合比演算部 2 2 aは、第 7図に示すように、時間 巾 「W」及び「T」のときの各特定移動度 Rf0w、 RfOt に対する混合 比 Xw、 Xt を直線 6 3に基づいて求める。このようにして求められた 混合比は、メモリ 2 5内の所定領域に書き込まれ、第 5図のグラジェ ント条件表 5 3に示すようにディスプレイ 3 0に表示される。

なお、ステップ S 5において、グラフ 5 1に示す溶離液 1 0の混合 比の時間変化や、グラフ 5 2に示す試料 3の流出曲線がさらに算出さ れてもよい。

ここで、混合比の時間変化算出及び試料 3の流出曲線算出に関連し て、さらに説明する。

上述したように、実際のサンプルで行った T L Cの目的成分の移動 度 Rf 値から最適分離を行う移動度が決定されることになり、 1回の T L C実験で最適分離の溶離液条件を決めることができる。また同時に 、このときに決定された溶鎖夜条件下では、目的物の移動度 Rf から次 の式により実際のクロマトでの目的成分の保持時間 t R も決定される 。ただし、 t oは非保持成分の保持時間である。

Rf= 1 Z ( k ' + 1 )

k ' - ( t R- t 0) / t 0

そのため、目的成分を完全に溶出させるための全クロマト時間を自 動的に決定することができる。なお、ステップ溶出、グラジェント溶 出の場合、ァイソクラティック溶出よりも t R が短くなるため、全ク ロマト時間内に目的成分の溶出が可能である。

(第 3の工程)ステップ S 6において、混合比制御部 2 2 bは.、ス テツプ S 5で求められた混合比を有する溶離液 1 0が所定時間だけ力 ラム 1 8に送液されるような制御信号を電磁弁操作部 3 1に順次出力 する。電磁弁操作部 3 1はこの制御信号に基づいて電磁弁 1 4を開閉 させる信号を電磁弁 1 4に供給する。これにより、カラム 1 8内での 試料の移動度 Rf を、確実に特定移動度 Rfl)又はその近傍とすることが できるので、良好な試料の分離を行わせることができる。

また、本実施の形態では、含有成分の組合せの異なる別種類の溶離 液ごとに、各成分の混合比の変化に対する試料の移動度 Rf の変化率が ハードディスク 2 6に記憶されており、必要な変化率だけを移動度変 化率記憶部 2 5 bに記億させることができる。そのため、液体クロマ トグラフ制御装置 2 1を、含有成分の組合せの異なる多様な種類の溶 離液に対して使用することができる。

以上、本発明の好適な実施の形態について説明したが、本発明は上 述の実施の形態に限られるものではなく、特許請求の範囲に記載した 限りにおいて様々な設計変更が可能なものである。例えば、液体クロ マトグラフ装置 1 1の具体的な構成は様々な形態に変更することがで きる。また、移動度変化率記憶部 2 5 bは、各成分の混合比の変化に 対する試料の移動度 Rf の変化率を 1種類の溶離液だけについて記憶可 能であってもよい。また、液体クロマトグラフ制御装置 2 1のハード ゥェァ構成は任意に変更可能である。

産業上の利用可能性

本宪明によると、任意の特定混合比における試料の移動度 Rf を薄層 クロマトグラフィで求めておけば、所望の特定移動度 Rfl) での溶離液 の混合比を知ることができる。そのため、煩雑な作業を行うことなく 適切な移動度 RfO となる溶離液条件でクロマトグラフィを実行するこ とができる。したがって、クロマトグラフィの作業性を大幅に改善す ることができる。