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1. (KR1020140101018) 피내주사용 히알루론산 겔
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피내주사용 히알루론산 겔 {HYALURONIC ACID GEL FOR INTRADERMAL INJECTION}
기 술 분 야
 본 발명은 피하 또는 피내주사용 히알루론산계 삽입물에 관한 것이다.
배경기술
 산 형태 또는 염 형태 (히알루론산 염)의 히알루론산 (HA)은 세포외 기질의 주성분이다. 연골과 같은 "경질"이라 불리는 조직에 존재하는 콘드로이틴황산과 같은 기타 글리코사미노글리칸과는 달리 "연질"이라 불리는 연결조직에 특히 존재한다. 따라서 피부에서 상당량 발견된다.
 HA는 선형의 비-황산화 글리코사미노글리칸이며, D-글루코론산 및 N-아세틸-D-글루코사민의 반복단위들로 구성된다 (Tammi R., Agren UM., Tuhkanen AL., Tammi M. Hyaluronan metabolism in skin. Progress in Histochemistry & Cytochemistry. 29(2) : 1 -81 , 1994)
 정상 피부에서, HA는 진피 섬유아세포 및 표피 각질세포에 의해 합성된다 (Tammi R., 상기 인용문헌). 음전하를 가지는 잔기들로 인하여, HA는 수분 펌프 역할을 하여 피부의 탄력을 유지시킨다. HA는 영양소, 호르몬, 비타민 및 연결조직 무기염을 확산시키고 염증반응을 일으킬 수 있는 대사폐기물을 제거하는데 중요한 역할을 한다. 노령화됨에 따라, HA 함량 및 중합도가 감소되어 연결조직에서 보유된 수분 함량이 감소하게 된다. 이후 피부는 노화과정을 통하여 섬유화 증가 및 탄성섬유 함량 감소에 이르게된다. 정상 인간 피부에서는, HA는 고분자량 고분자 (600,000-1,000,000 Da)로 존재한다. (i) 각질세포에 의한 내화 및 (ii) 히알루론산분해효소에 의한 중간 크기 단편 (600,000-300,000)으로의 세포내 단편화를 통하여 피부에서 HA의 생리적 분해가 일어난다. 단편 HA는 각질세포에 의해 방출되어 기저막을 거쳐 림프관으로 직접 방출된다 (Tammi R. 등, 상기 인용문헌)
 피부학에서 히알루론산 (HA) 역할은 상처 치료 및 수화 분야를 포함한 여러분야에서 공지되어 있다. 히알루론산은 매우 빈번하게 결합단백질 및 특히 막수용체 CD44와의 상호작용을 통하여 작용한다 (Tool B.P. 2001, Sem. CeIl. Devel. Biol. 12 : 79-87 , Liao Y-H., Stuart A.J., Drug Delivery, 12 : 327-342, 2005)
 본 수용체의 활성은 형태형성, 세포증가 및 증식, 혈관형성 및 세포이동에서의 역할을 통하여 발현된다 (G.Weindl, M.Schaller, Skin Pharm. Physiol. 2004 ; 17 ; 207-213). 문헌에서의 자료에 의하면 이러한 여러 작용은 세포 환경, 히알루론산 분자량 및 농도의 함수이다. 예를들면, 고분자량은 혈관형성을 억제하고, 올리고당은 이를 자극한다.
 일본특허출원 JP11279042에 의하면 황산화 히알루론산 단편 (HAF) (분자량 1 내지 50kDa)의 피부 탄력 유지 및 각질화 회피 작용을 보여준다.
 관련하여 HA 단편들 (분자량 50 내지 750 kDa)에 대한 최근 연구에 의하면, 각질세포에 의한 히알루론산 합성의 촉진을 보여준다 (특허출원 FR 2 865 651, WO 2005/082327). 이러한 증식활성은 정확한 분자량을 가지는 HA에 의해 유도되며, 더 높은 또는 낮은 분자량에서는 나타나지 않는다.
 미용학 분야에서, 히알루론산계 다양한 주사용 제품들이 있다. 메조테라피에서, 비타민, 항산화제, 무기염 또는 히알루론산 용액이 이용된다. 비타민은 세포대사를 자극하고 유지하여 콜라겐 생성을 촉진하며, 항산화제는 노화에 대항하며 무기염은 세포효소활성에 필수적이다. 히알루론산의 역할은 피부 공간 및 보습을 유지하며 자유라디칼에 의한 분해에 대항하는 보호막을 형성하는 것이다 (H.Trommer, S.Wartewig, Int. Journ. Of Pharm. 254(2003) 223-234). 충분한 농도에서, 히알루론산은 세포 증식 및 콜라겐 신생-합성을 위한 최적 환경을 만든다.
 진피 및 표피에서 자유라디칼을 생성하는 산화적 스트레스는 피부노화 및 주름살, 미세한 라인 형성 및 조직 처짐과 관련된다.
 또한, 자유라디칼은 생체내 히알루론산 분해와 관련되고, 이는 조직 처짐 및 이들의 조기노화에 더욱 기여된다고 알려져 있다 (Mendoza G., et al, Carbohydrate Research 342, 2007, 96-102).
 세포외 기질 (ECM)은 조직에 대한 구조 및 조절 역할을 가는 동적 구조이다. ECM은 콜라겐 및 탄력섬유, 또한 기본 매질 (주로 물, 무기염 및 프로테오글리칸)로 구성된다. 본 기질은 피부 부어오름 및 견고성, 탄력성 및 긴장성과 같은 기계적 특성을 부여한다.
 콜라겐 거대분자는 섬유상 단백질이며, 공유 및 수소결합에 의해 연결된 3개의 폴리펩티드 사슬들로 형성된다. 19개 타입들의 콜라겐이 알려져 있으며, 이들의 반은 피부에 있다. 대다수의 진피 콜라겐들은 원섬유성 콜라겐 I, III 및 IV에 속한다.
 청소년의 진피 조성은 80%의 타입 I 콜라겐 및 20% 타입 III 콜라겐이나; 이러한 비율은 노화 결과 노령화되면서 변경된다.
 탄력소는 진피 내에 섬유로 구성되는 단백질이며, 피부에 탄력성 및 유연성을 부여한다. 이러한 탄력소는 소수성 아미노산이 풍부하다.
 ECM은 상처치료와 같은 일부 생리과정, 배 발생 또는 혈관형성뿐 아니라 관절염, 급성 동맥경화증, 죽경화증과 같은 병리상태들, 및 전이가 동반된 종양이 진행되는 동안 분해되어 기능을 수행한다 (Fisher et al, 1997. N. England J. Med. , 337, 1419-28 ; Shapiro, 1998. Current Oponions in CeIl Biology, 10, 602-608).
 ECM 성분들은 금속단백질 또는 MMP라고 불리는 엔도펩티다제 효소에 의해 주로 분해된다. 이러한 MMP는 상처치료과정 또한 피부이완 및 피부노화의 제1 신호인 주름살 형성에 능동적으로 기여한다. MMP 군들은 약 22개의 효소들로 구성되며 이들은 분해하는 기질 특이성에 따라 구분된다.
 MMP-1, 또는 사이질 콜라겐분해효소는 주로 타입 III 원섬유성 콜라겐뿐 아니라 I, II, VII, VIII 및 X 콜라겐의 삼중나선을 분해한다.
 MMP-3은 파이브로넥틴 및 라미닌과 같은 당단백질, 일부 프로테오글리칸, 탄력소, 젤라틴 및 콜라겐 IV 및 V를 분해한다. 이들 두 MMP들은 각질세포 및 섬유아세포에 의해 발현된다.
  주름제거 분야에서, 화학적 가교 HA 겔이 피내 주사되어 주름에 의한 함몰부위를 채울 수 있다. 가교에 의해 진피 내에서 생성물 지속성이 증가될 수 있다. 따라서, 생성물이 각 개인의 유전 프로필에 따라 적합하게 주사된다면, 생성물은 4-6 또는 8 개월 동안이라도 함몰부위를 채울 수 있다. 이후 진피에 완전히 재흡수된다.
 이러한 HA 또는 가교 HA계 겔들은 주름으로 인한 피부 함몰부위에서 기계적 충진 효과에 의해 주름을 감소시킬 수 있다. 이러한 생성물들은 단지 기계적 효과가 부여되는 것이고 어떠한 방식으로도 탄력성 및 견고성과 같은 피부 기계적 성질을 유지하기 위하여 필요한 피부 노화 및 ECM 분해에 대한 예방적 또는 치료적 방법을 제공하지 못한다. 이러한 삽입물들이, 주름 또는 미세한 라인들을 근절한다고 하더라도, 시간 경과에 따라 제한적이며, ECM에 의해 나타나는 구조와 관련하여 피부 자체 노화에 대한 영향을 부분적으로 가리는 효과가 있을 뿐이다.
 현재 여러 생성물이 이러한 용도로 적용되고 있다. 겔 또는 실리콘 오일은 사용하기 용이하지만 주사 지점 바로 아래 위치된 조직으로 이동되는 단점이 있다. 만성염증현상 또는 알레르기반응이 있을 수 있다. 또한, 실리콘은 생분해성이 아니므로 간과 같은 소정 기관에 잔류할 수 있다. 고분자 입자들의 상이한 현탁액들도 제안되었으나 대부분 거부반응, 감염 또는 염증을 일으켰다. 마지막으로 콜라겐 현탁액들이 최근 이용되었다. 그러나, 콜라겐은 상대적으로 신속하게 (1 내지 3 개월) 재흡수되고, 소 또는 돼지 유래 원에 따라 알레르기반응을 일으킬 수 있다.
발명의 상세한 설명
   해결하려는 과제
 주름 제거뿐 아니라 진피 및 표피를 소생시키고 세포 노화를 동반하는 피부노화 과정을 제한할 수 있는, 상기 단점이 없는, 또는 사용이 간단하며 편리한 방식의 주사용 삽입물이 요청된다.
   과제의 해결 수단
 따라서 본 발명은 피하 또는 피내주사용 단일상의 하이드로겔 형태의 삽입물에 관한 것이며, 중량비로 0.5% 내지 5%, 바람직하게는 0.5% 내지 4%, 더욱 바람직하게는 2%의 히알루론산이 생리적으로 허용 가능한 담체 유체에 포함하며, 여기서 가교 겔 형태의 히알루론산은 중량비로 50% 내지 95%, 바람직하게는 60% 내지 90%, 더욱 바람직하게는 85%이며; 자유형태 또는 생리적으로 허용 가능한 염 형태의 히알루론산은 중량비로 5% 내지 50%, 바람직하게는 10% 내지 30%, 더욱 바람직하게는 15%이며; 히알루론산 분자량은 500 내지 2800 kDa, 바람직하게는 750 내지 2600 kDa, 더욱 바람직하게는 800 내지 2500 kDa, 더더욱 바람직하게는 1000 내지 1500 kDa이며, 가교 겔의 히알루론산 중량 및 자유 히알루론산 중량의 비율은 1:1 내지 1:0.05인 것을 특징으로 한다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
 본 발명의 특정 예에 의하면, 미세한 주름 치료를 위한 본 발명의 삽입물 적용에 있어서, 삽입물은 가교 히알루론산 약 80% 및 자유 히알루론산 약 20%로 구성된다. 깊은 주름 치료에 있어서, 가교 히알루론산은 바람직하게는 약 85%이며, 자유 히알루론산은 약 15%일 수 있다.
 본 발명에 있어서, 히알루론산 또는 HA는 비-황산화 선형 글리코사미노글리칸으로 정의되며, 이는 D-글루코룬산 및 N-아세틸-D-글루코사민 반복단위들로 이루어진다.
 단일상 하이드로겔은 단일한 균일상에서의 하이드로겔을 정의한다.
 생리적으로 허용 가능한 히알루론산염은 특히 나트륨 및 칼륨염뿐 아니라 이들의 혼합물을 정의한다. 바람직하게는, 염은 나트륨염이다.
 바람직하게는, 본 발명에 의한 가교 히알루론산으로 이루어진 겔은 200 내지 2000 Pa.s, 바람직하게는 500 내지 1800 Pa.s, 더욱 바람직하게는 1000 내지 1800 Pa.s 점도를 가진다.
 깊은 주름 치료용 삽입물의 경우, 즉 85% 가교 히알루론산으로 구성되는 경우, 점도는 약 1000 내지 1500 Pa.s를 가지며, 특히 약 1200 Pa.s이다. 가벼운 주름용 삽입물의 경우, 따라서 가교 히알루론산이 덜 포함되는, 즉 약 80% 가교 히알루론산의 경우, 삽입물의 점도는 약 200 내지 500 Pa.s를 가지며, 특히 바람직하게는 약 350 Pa.s이다.
 본 기재에서, 표기된 점도는 0.01s -1 전단속도에 대하여 측정된 수치이다.
 바람직하게는, 본 발명에 의한 겔을 구성하는 가교 히알루론산은 1000 내지 6000 kDa, 더욱 바람직하게는 1000 내지 4000 kDa 분자량을 가진다.
 본 발명의 바람직한 측면에 의하면, 주사용 삽입물은 콘드로이틴황산을 더욱 포함할 수 있다.
 바람직하게는 콘드로이틴황산은 총 중량에 대하여 0.05% 내지 5% 포함된다.
 바람직하게는, 콘드로이틴황산은 2 내지 80 kDa, 더욱 바람직하게는 20 내지 50 kDa 분자량을 가진다.
 본 발명에 의한 삽입물은 다양한 통상의 첨가물을 포함할 수 있다. 예를들면, 염료, 착색 안료, 식물성 오일, 증점제, pH 조절제 및 오스몰농도 조절제가 예시될 수 있다.
 자유 히알루론산 또는 생리적으로 허용 가능한 염은 바람직하게는 가교 히알루론산 겔 내부에 균일하게 분산된다.
 담체 유체는 바람직하게는 파이로젠이 제거된 무균성 등장 버퍼이다.
 본 발명에 의한 주사용 삽입물은 바람직하게는 피부-미용에서 사용되는 최소한 하나의 기타 활성물질을 더욱 포함할 수 있다.
 바람직하게는, 피부-미용 활성물질은 비타민, 항산화제, 무기염, 방부제 및 콘드로이틴황산에서 선택된다.
 본 발명의 특정 예에 의하면, 주사용 삽입물은, 피부 수준에서 항산화제로 기능하는 만니톨을 포함하며, 산화적 스트레스에 의해 피부 내에서 생성되는 자유라디칼에 의한 HA 분해를 방지한다. 만니톨 및 HA 결합에 의해 자유라디칼에 의한 손상을 보호하는 것으로 기재되어 있다 (Belda et al, 2005, J. Cataract Refract. Surg., 31 : 1213-1218) 따라서 본 발명의 일 측면은 항산화제로서 만니톨을 포함하는 상기 정의된 주사용 삽입물을 제공하는 것이다.
 본 발명의 다른 측면은 피부를 자유라디칼로부터 보호하고 및/또는 포함된 히알루론산 분해를 제한하기 위하여 본 발명에 의한 주사용 삽입물에서의 만니톨 용도에 관한 것이다.
 따라서 본 발명은 피부를 자유라디칼로부터 보호하고 및/또는 피부의 히알루론산 분해를 제한하고 및/또는 피부노화를 방지하기 위한 삽입물 제조에 있어서, 만니톨과 같은 항산화제 존재하에서, 분자량 500 내지 2800 kDa, 바람직하게는 750 내지 2600 kDa, 더욱 바람직하게는 1000 내지 1500 kDa의 자유 형태 히알루론산 또는 생리적으로 허용 가능한 염의 용도에 관한 것이다.
 본 발명에 의한 삽입물은 얕은, 중간 또는 깊은 피부로 주사된다.
 본 삽입물은 주사될 때, 세포 증식 촉진에 의한 섬유아세포 상승 및 콜라겐 신생-합성을 유발시키는 장점이 있다. 섬유아세포 활성은 이후 세포외 기질 재구성과 관련된 기작을 조절하여 피부 소생으로 발현된다.
 본 발명에 의한 삽입물은 피부 함몰부위에 대한 기계적 채움에 의해 주름을 감소시키는 직접적이고도 즉각적 효과 및 콜라겐 합성 자극 및 MMP 조절에 의한 세포 재생이라는 장기적인 간접적 효과라는 이중적인 장점을 제시한다.
 가교 히알루론산은 기계적인 채움 효과에 직접 기여하고 가교 성질로 인하여 이러한 효과를 비-가교 HA보다 더욱 장기적으로 유지할 수 있다.
 또한, 본 발명에 의한 삽입물에 포함된 자유 HA는 콜라겐 III의 과-발현뿐 아니라 MMP-1의 과-발현을 억제한다. 이러한 MMP-1에 대한 조절 작용 외에도, 피부의 견고성 및 탄력성이라는 기계적 특성을 유지하는데 중요한 구조인, ECM의 해체를 제한하는데 기여한다.
 또한 콜라겐 III/콜라겐 I 비율은 피부 노화로 증가한다는 것이 알려져 있다 (Weber et al, 1984, J. Invest. Dermatol, 82, 156-60). 본 발명에 의하면, 본 발명에 의한 삽입물에 사용되는 자유 HA 일부는 타입 I 콜라겐에 영향을 주지않고 타입 III 콜라겐 발현을 억제하는 것이 관찰되므로, 본 발명에 의한 삽입물은 콜라겐 III/콜라겐 I 비율을 젊은 조직에서 측정되는 수준으로 회복시킬 수 있다고 생각된다.
 따라서 본 발명의 목적은 콜라겐 III/콜라겐 I 비율을 청년 조직에서 측정되는 수준으로 유지 및 회복시키는 약제 제조에 있어서 본 발명에 의한 삽입물의 용도이다.
 500 내지 2800 kDa 분자량의 자유 HA 및 가교 HA 겔의 결합을 통하여 즉각적 방식으로 피부의 공간을 수화시키고 유지할 수 있다. 또한, 이것은 주로 자유 HA 존재로 인하여 피부의 섬유아세포 상승을 유도하고, 이러한 섬유아세포 촉진은 가교 HA 겔 생체내 분해가 진행되는 기간에 걸쳐 연장된다.
 본 발명에 의한 삽입물은 섬유아세포 자극을 유도하고 MMP 억제를 통하여 ECM 분해를 억제하며 젊은 조직에서 관찰되는 상태로 돌려 콜라겐 합성을 조절할 수 있는 자유 HA를 내부에 포함하는 가교 HA로 구성된 3차원적 그물망으로 이해될 수 있다.
 이러한 자유 HA는 본 3차원적 가교 HA 매트릭스로부터 능동 확산에 의해 및 주사 후 수 주 및 개월 동안 가교 HA 매트릭스의 시간경과에 따른 분해를 통하여 점차적으로 방출된다. 이러한 점차적 방출은 이러한 자유 HA 분자들을 통한 생체내 세포자극의 이러한 회춘 작용은 상기 매트릭스 내에서 생물학적 분해로부터 수 주동안 보존될 수 있고 따라서 단독으로 주사되는 경우보다 더 장기간에 걸쳐 이들 작용이 발휘될 수 있다.
 따라서 본 발명은 주름을 채우고 및 표피 세포를 상승시키고 및/또는 피부의 견고성 및 탄력성과 같은 기계적 성질을 유지하기 위한 피하 삽입물 제조에 있어서, 가교 히알루론산 겔 내부에 분산된, 분자량 500 내지 2800 kDa, 바람직하게는 750 내지 2600 kDa, 더욱 바람직하게는 800 내지 2500 kDa, 더더욱 바람직하게는 1000 내지 1500 kDa의 자유 형태 히알루론산 또는 생리적으로 허용 가능한 염의 용도에 관한 것이다.
 따라서 본 발명에 의한 삽입물은 주름을 팽창시키고 재형성하는 가교 겔의 기계적 효과 및 자유 HA의 생물학적 작용이 조합된 것이다.
 또한 본 발명은 상기와 같은 주사용 삽입물을 함유한 주사기 형태의 키트에 관한 것이다.
 또한 본 발명은 약제로서의 상기 삽입물에 관한 것이다.
 또한 본 발명은 이러한 삽입물의 피하 주사로 구성되는, 주름, 미세한 라인, 피부 함몰부위 및/또는 흉터를 채우기 위한 상기 주사용 삽입물의 용도에 관한 것이다.
 본 발명에 의한 주사용 삽입물은 표피 및 진피 대사 자극 및/또는 표지 세포 활성 촉진을 위한 약제 제조에 사용될 수 있다.
 본  발명에  의한  주사용  삽입물은  피부의  항산화  활성  자극  및/또는    피부  노화  방지를  위한  약제  제조에  사용될  수  있다.
 본 발명은 또한 본 발명에 의한 최소한 하나의 주사용 삽입물의 주사로 구성되는, 주름 및/또는 미세한 라인들을 채우기 위한 미용방법에 관한 것이다.
 또한 본 발명은 상기 주사용 삽입물 제조방법에 관한 것이다. 이것은 본 분야의 기술자에 의해 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있으며, 예를들면, 디에폭시, 특히 부탄디올 디글리시딜 에테르 (BDDE) 또는 1,2,7,8-디에폭시-옥탄에 의해 제조될 수 있다. 1.5 내지 6시간 45-55℃ 수조에서 가교될 때, 염기 매질에서 가교되면, 디에폭시 농도는 예를들면 히알루론산에 대하여 5 내지 15%로 가변될 수 있다. 가교 겔은 이후 본 분야의 기술자의 고전적 방법으로 정제된다: 미량의 잔류 가교제를 제거하기 위한 여러 탈이온 수조들, 알콜성 침전, 투석 등. 이러한 정제 겔에, 미리 적절한 버퍼에서 수화된 적절한 분자량의 HA가 첨가된다. 최종 생성물은 최종 탈기되고 주사기 또는 임의의 기타 적절한 용기에 담기고 고압반응으로 멸균된다.
 본 발명에 의한 바람직한 절차는 다음과 같은 단계들로 이루어진다:
 1) 다음 단계들에 의한 가교 겔 제조단계:
 - 염기성 유체에 히알루론산 첨가,
 - 느린 교반 및 고온 가교하에서 팽화 및 균질화,
 - 등장제 (iso-osmolarizing agent) 첨가된 약 pH 7 버퍼 용액에서 가교 젤의 중화 및 팽화,
 - 가교제 제거
 2) 다음에 의한 자유 히알루론산 제조단계:
 - 등장의 약 pH 7 버퍼용액에 자유 히알루론산 첨가:
 - 팽화,
 3) 단계 1)에서 얻어진 가교 겔 및 단계 2)에서 얻어진 자유 히알루론산 겔과의 혼합,
 4) 선택적 탈기 및 병 또는 주사기에 임의적 포장 및 멸균.
 바람직하게는 멸균 이후 겔의 pH는 약 7이며, 오스몰농도는 약 250 내지 350 mOsm, 바람직하게는 300 내지 320 mOsm이다.
 본 발명은 비-제한적으로 하기 예들에 의해 기술될 것이다.
 실시예 1
 -건강 섬유아세포; - 노화 섬유아세포 (H 2O 2로  산화적  스트레스에  의함)에  대한    여러  분자량의  HA  활성  특성.
 MMP-1 (콜라겐분해효소 1)은 사이질 콜라겐분해효소이며, 콜라겐 I 및 III과 같은 원섬유성 콜라겐의 삼중나선을 분해한다. 피부에서, 이것은 섬유아세포 및 각질세포에 의해 발현되고 분비된다. MMP-1은 노화에 관여된다. 노화 과정에서 이것의 과-생성은 견고성 및 탄력성의 상실 및 주름 형성과 연관된다. 노화가 H 2O 2에 의해 유도될 때, 섬유아세포에서 MMP-1의 상당한 증가가 관찰된다. 따라서 이러한 과생성을 감소시킬 수 있는 주요 활성물질은 "항-노화" 특성이 있다.
 섬유아세포는  청년  개체로부터  수술실  잔여물에서  배출된  피부에서  얻어졌다.  시료는  PBS  및  에탄올로  세척되었다.  피부  작은  조각들은  절단되어  배양접시에  분배되어  섬유아세포  증식에  유리한  매질  (DMEM  +  10%  SVF)에  담겼다.    프리모신이    매질에  첨가되었다.  이것은  항생,  항균  및  항-마이크로플라즈마이다.  배양접시는  배양기에  놓였다.  
 노화 유도를 위하여, 섬유아세포가 배양접시에서 식종되었다. 24시간 후, 실험 활성물질이 적합한 농도로 DMEM에 첨가되었다. 배양 24시간 후, 세포는 산화적 스트레스를 받았다. 이들은 37℃에서 2시간 동안, 75uM H 2O 2 PBS 용액에서 배양되었다. 세포노화를 유도하는 급성 스트레스가 관여된다. 이후 섬유아세포는 10% SVF가 첨가된 완전한 DMEM에 다시 담겼다. 섬유아세포는 스트레스 완료 후 72시간 노화되었다.
 1.1 배양 프로토콜
 노화 섬유아세포: HA가 최종 1ug/ml 농도가 되도록 첨가되었고, H 2O 2 스트레스에서 24시간 배양되었다.
 건강 섬유아세포: HA가 1ug/ml 농도에서 24시간 배양되었다.
 1.2 실험종료 후 (5일, 즉 72시간, 스트레스-이후) Rneasy 추출 키트 (퀴아젠)을 이용한 RNA 추출
 1.3 전체 RNA 분석
 전체 RNA의 정성 및 정량 분석이 RNA 6000 Nano LabChip assay kit 및 Bioanalyzer 2100 장비 (Agilent)를 이용하여 수행되었다. 이것은 나노칩 상에서 시료의 전기영동이동 원리에 기초한 것이다. 28s/18s 리보솜 RNA 비율이 계산된다; 이것은 RNA 완전성에 대한 평가 정보이다. 또한, 게놈 DNA에 대한 RNA 순도가 추정된다.
 1.4 실시간 PCR로 전사속도 분석
 실시간 PCR을 이용하여 세포용해물에 존재하는 유전자의 mRNA로부터 역전사에 의해 얻어진 cDNA 증폭으로 관심 유전자의 전사적 발현 수준이 정량될 수 있다. 반응혼합물은 cDNA 및 관심 프라이머들 및 무엇보다도 Taq 중합효소 및 DNA 이중나선의 작은 홈에 대한 개재제 (intercalating agent): Sybr Green (형광 개재제)를 함유한 iQ SybrGreen Supermix (Biorad) 용액과의 혼합물로 이루어진다. 반응은 Icycler IQ thermocycler (Biorad)에서 수행된다; 연속하여 변성/하이브리드화/연장 사이클이 이어진다.
 1.4.1 역전사: 전체 RNA는 역전사 시스템 (Promega) 및 Gene Amp PCT 시스템 2400 (Perkin Elmer)에 의해 cDNA로 "역전사"된다.
 1.4.2 관심 유전자 전사속도 측정: 관심 유전자 발현 수준은, 노화에 따라 약간 다른 기준 유전자 발현 수준으로 정규화된다. 관심 유전자 발현 수준은 식: 2 (CTmin-CT), 여기서 CT는 "사이클 역가", 에 따라 계산된다.
 선택된 3개의 기준 유전자들의 발현 수준에 대하여 계산식: 2 (CTmin-CT)/(정규화 인자)에 따라 정규화된다.
 1.5 MMP-1 발현 결과
 H 2O 2로 배양된 노화 섬유아세포는 정상 섬유아세포에 비하여 2.14 배 MMP-1 발현되었다 (따라서 노화는 적절히 유도되었다). 비타민 E 존재하에서 (양성대조군), 노화 섬유아세포에 의한 MMP-1 과발현은 40%로 감소되었다.
 MMP-1 과발현은 HA 450 kDa (10 ug/ml) 존재에서 40% 감소하였고, HA 800 kDa (10 ug/ml) 존재에서 75%, HA 1500 kDa (10 ug/ml) 존재에서 71%, HA 2600 kDa (10 ug/ml) 존재에서 83% 감소하였다.
 1.6 타입 I 및 타입 III 콜라겐 발현 결과
 H 2O 2로 배양된 노화 섬유아세포에 대하여, 타입 I 콜라겐 전사 억제가 측정되었다; 이러한 억제는 도너들에 의존되는 것으로 보였다. 타입 I 전사가 H 2O 2 스트레스에 의해 24% 억제되는 도너들의 하나에 대하여, 여러 크기의 HA는 콜라겐 합성을 회복하지 않는다.
 노화 섬유아세포에 대하여, 타입 III 콜라겐 전사의 +163 내지 +304% 증가가 측정되었다. 타입 III 콜라겐의 전사가 H 2O 2 스트레스에 의해 +304% 자극되는 도너에 대하여, 여러 크기의 자유 HA는 콜라겐 합성을 억제한다. 450 kDa HA는 약 25% 억제하고, 800 kDa 이상의 HA는 약 100% 전사를 억제하여, 젊은 섬유아세포의 수준으로 회복시킨다.
 1.7 결론
 본 실험결론은, 노화가 유도된 모델에서 HA는 항-MMP-1 활성을 가지는 (따라서 잠재적으로 항-노화활성을 가지는 항산화제) 것으로 보인다. 더 높은 분자량 (800, 1500 및 2600 kDa)의 HA는 450 kDa HA보다 더욱 효과적인 것으로 보인다.
 본 실험조건에서, 450 kDa 분자량의 HA는 MMP-1에 대하여 활성이다. 800 kDa 이상의 분자량을 가지는 HA는 과발현을 -75에서 -83%로 억제하므로 더욱 활성이다.
 한편, 이러한 결과는 여러 자유 HA는 타입 I 콜라겐 합성에 작용하지 않는다는 것을 보인다.
 마지막으로, 자유 HA는 타입 III 콜라겐 과발현을 억제하고, 이것은 특히 800 kDa 및 이상의 분자량 HA에서 현저하고, -118에서 -93%로 과발현을 억제한다.
 따라서, MMP-1에 대한 이들의 조절작용에 대하여, 본 발명에 의한 삽입물에 포함된 자유 HA는 MEC 해체 및 분해를 제한한다. 또한, 콜라겐 III/콜라겐 I 비율이 노화 중에 증가한다는 사실로부터 본 발명에 의한 삽입물에 포함된 HA는 청소년 조직에서 측정된 비율로 회복시킨다.
 실시예 2: 본 발명에 의한 삽입물 제조
 2.1  가교  HA    제조
 1.6 MDa 분자량 히알루론산나트륨 5g이 1% 수산화나트륨 (35.6g)에 첨가되었다. 혼합물은 1시간 및 30분 동안 비연속적으로 균질화되었다. BDDE 315mg이 균질 HA/NaOH 혼합물에 첨가되고 밀폐되어 50℃ 수조에 2시간 방치되었다. 혼합물은 1N HCl 5g을 첨가하여 중화되었다.
 얻어진 겔에 등장성뿐 아니라 안정한 중성 pH를 보장하는 EDI 및 염들을 원하는 농도로 첨가되어 HA 20mg/g 농도의 겔이 생성되었다.
 2.2 삽입물 제조
 이러한 정제 겔에 미리 인산염 버퍼에서 수화된 1.2 MDa HA가 첨가된다. 60g의 농도 20mg/g 인 HA 겔 1.2 MDa이 얻어진 가교 겔 226g에 첨가된다. 두 겔들은 표준 블레이드 혼합기에서 1 내지 2시간 동안 균질화된다.
 최종 생성물은 탈기되고, 주사기에 포장되고, 예를들면 125℃, 7분, 127℃, 4분, 또는 130℃, 3분 주기로 스팀 고압반응기에 의해 멸균되었다.
 멸균 후, 생성물 pH는 7.1이고, 오스몰농도는 320 mOsm이며, 유동특성으로는 탄성율 G'은 1 Hz 주파수에서 45 Pa.s이다. 최종 겔 농도는 예상 농도는 20mg/g 이나 19.8 mg/g으로 분석된다 (유럽 약전 방법에 의해, 카바졸로 평가).