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1. (JP2003240765 ) APPARATUS FOR CONTROLLING LIQUID CHROMATOGRAPH, METHOD FOR EXECUTING LIQUID CHROMATOGRAPHY, AND PROGRAM FOR CONTROLLING LIQUID CHROMATOGRAPH
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【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、移動相として液体溶媒(溶離液)を用いる液体クロマトグラフィに関し、より詳細には、液体クロマトグラフィを行う際の条件検討に関する。
【0002】
【従来の技術】液体クロマトグラフィにおいては、カラム内に充填された固定相内に、複数の溶媒が混合された溶離液である移動相に溶解された試料が通過される。このとき、カラム内に導入された試料内の各成分は固定相との相互作用や移動相との親和性等により、それぞれカラムを通過する時間が異なるため、カラムから排出される時点では各成分が分離される。固定相との相互作用が強い、又は移動相との親和性の弱い物質がカラム中に長く留まり、カラムから遅く排出されることとなる。
【0003】上記示した液体クロマトグラフィと同じ原理により行われる薄層クロマトグラフィ(TLC)がある。薄層クロマトグラフィでは、薄層とされたカラム内の固定相に用いられる物質に試料が1滴垂らされ、この薄層が移動層となる溶離液中に浸漬される。そして、毛管現象により溶離液が薄層に吸い上げられると共に試料が吸い上げられる作用により、試料の溶離液に対する移動度R fを求めることができる。このようにして任意の溶媒比の溶離液で行われるTLCにて求められる移動度R fが、液体クロマトグラフィの分離度R sに相関性があることが知られている。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の移動度R fと分離度R sとの相関性の具体的指標は明らかにされておらず、TLCにおける結果を液体クロマトグラフィに利用することは行われていない。そのため、現状では、液体クロマトグラフィにおいて分離度R sを設定するために、まず、ある値の移動度R fにて液体クロマトグラフィを行い、その結果に基づき、溶離液に含まれる極性分子溶媒と非極性分子溶媒との割合を変更する等行って、分離度R sを探し設定することが行われている。例えば、設定した移動度よりも高い移動度となれば、溶離液における極性分子の割合を減少させて、再び液体クロマトグラフィを行う必要がある。そのため、移動度の値が設定されるまで液体クロマトグラフィを繰り返し行う必要があり、作業が煩雑で時間がかかり、溶離液が多量に必要とされるという問題がある。
【0005】本発明は上記問題に鑑みなされたものであり、煩雑な作業を行うことなく適切な移動度R fとなる溶離液条件でクロマトグラフィを実行することができる液体クロマトグラフィの制御装置、液体クロマトグラフィの実行方法及び液体クロマトグラフィの制御プログラムを提供することを目的とする。
【0006】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記問題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、溶離液の各成分の混合比と試料の移動度R fとの関係が比例関係であること、そして、溶離液の各成分の混合比に対する試料の移動度R fの変化率は、試料の種類が変わっても同じであるという知見を得た。
【0007】本発明はこの知見に基づいてなされたものであって、請求項1に記載の液体クロマトグラフィの制御装置は、薄層クロマトグラフの分離において複数の成分を特定混合比で含む溶離液を用いて分離を行ったときの試料の移動度R fの実測値を前記特定混合比に関連づけて記憶するための実測値記憶手段と、前記溶離液における各成分の混合比の変化に対する試料の移動度R fの変化率を記憶するための移動度変化率記憶手段と、前記実測値記憶手段に記憶された前記特定混合比に対する移動度R fの実測値と、前記移動度変化率記憶手段に記憶された移動度R fの変化率とに基づいて、特定移動度R f0が得られる前記溶離液の混合比を求めるための混合比演算手段と、前記混合比演算手段での演算結果に基づいて、試料の移動度R fが前記特定移動度R f0となるようにカラムに送液される前記溶離液の混合比を制御する制御信号を出力するための混合比制御手段とを備えていることを特徴としている。
【0008】請求項3に記載の液体クロマトグラフィの実行方法は、複数の成分を特定混合比で含む溶離液を用いたときの試料の移動度R fの実測値をTLCを行って求める第1の工程と、前記第1の工程で求められた移動度R fの実測値及びこの実測値が求められた前記溶離液の前記特定混合比に基づいて、前記溶離液における各成分の混合比の変化に対する試料の移動度R fの変化率を利用することにより、特定移動度R f0が得られる前記溶離液の混合比を求める第2の工程と、前記第2の工程で求められた前記特定移動度R f0が得られる混合比を有する前記溶離液をカラムに送液する第3の工程とを備えていることを特徴としている。
【0009】上記の構成によると、任意の特定混合比における試料の移動度R fを薄層クロマトグラフィで求めておけば、所望の特定移動度R f0での溶離液の混合比を知ることができる。そのため、煩雑な作業を行うことなく適切な移動度R f0となる溶離液条件でクロマトグラフィを実行することができる。
【0010】請求項2に記載の液体クロマトグラフの制御装置は、前記移動度変化率記憶手段が、含有成分の組合せの異なる別種類の溶離液ごとに、各成分の混合比の変化に対する試料の移動度R fの変化率を記憶することが可能であることを特徴としている。
【0011】上記の構成によれば、液体クロマトグラフの制御装置を、含有成分の組合せの異なる多様な種類の溶離液に対して使用することができる。
【0012】また、請求項4に記載の液体クロマトグラフの制御プログラムは、コンピュータを請求項1のような液体クロマトグラフの制御装置として機能させることが可能なプログラムであり、請求項1と同様の作用効果を奏する。なお、請求項4に記載されているプログラムは、CD−ROM、FD、MOなどのリムーバブル型記録媒体やハードディスクなどの固定型記録媒体に記録して配布可能である他、有線又は無線の電気通信手段によってインターネットなどの通信ネットワークを介して配布可能である。
【0013】
【発明の実施の形態】本発明の好適な実施の形態を、図1〜図7に基づいて以下に説明する。
【0014】図1において、薄層クロマトグラフィ(TLC)に用いられるTLC装置1を示す。TLC装置1は、試料3が表面に1滴垂らされたシリカゲル薄層板2と、容器5に貯留された溶離液4とを備えている。尚、試料3、シリカゲル薄層板2を形成するシリカゲル、及び溶離液4は、後述する液体クロマトグラフィに用いられるのと同等のものである。
【0015】図3において、液体クロマトグラフ装置11を示す。液体クロマトグラフ装置11は、溶媒Aが貯留された容器12と、溶媒Bが貯留された容器13と、溶媒Aと溶媒Bとが連結された位置に設けられた電磁弁14と、溶離液4が貯留される混合器15と、ポンプ16と、インジェクター17と、カラム18と、検出器19と、フラクションコレクター20とが、この順に配置され経路が形成されている。そして、電磁弁14に液体クロマトグラフ制御装置21が接続されている。
【0016】容器12には溶媒Aが、容器13には溶媒Bが貯留されている。尚、用いられる溶媒は2種類に限定されず、使用状態・目的に応じて数を増やしてもよい。一般に、溶媒A・溶媒Bには、非極性分子と極性分子との組合せで用いられる。
【0017】ポンプ16は、液体クロマトグラフ装置11の回路において、容器15・電磁弁14を介して溶媒A・溶媒Bを汲み上げる。電磁弁14は、液体クロマトグラフ制御装置21からの制御信号により、汲み上げられる溶媒を溶媒A又は溶媒Bから選択する。電磁弁14での各溶媒の選択時間に応じて混合器15内での溶媒A、Bの混合比が決定される。混合器15は、汲み上げられた溶媒A及び溶媒Bが一旦貯留され、溶離液10とされる。この溶離液10は、後述するように、算出された混合比を有するものである。
【0018】インジェクター17は、試料3を有しており、溶離液10が通過することで試料3が送出されるようになっている。この試料3は、図1における試料3と同じものである。尚、インジェクター17は1本に限定されず、選択的に経路を選ぶことができる並設された複数のインジェクターとし、複数の試料について連続的に作業を行うことも可能である。
【0019】カラム18には固定相が充填されており、混合溶媒10が通過することで液体クロマトグラフが行われる。この固定相としては、図1におけるシリカゲル薄層板2を形成するシリカゲルが用いられている。尚、カラムは1本に限定されず、選択的に経路を選ぶことができる並設された複数のカラムとし、複数種類の液体クロマトグラフィを行うことも可能である。
【0020】検知器19は、カラム18にて行われる液体クロマトグラフの結果の検出を行う。そして、フラクションコレクター20は、複数の試験管を有しており、検知器19の分析結果により、試料3に含まれる成分毎に各試験管に分取されるようになっている。
【0021】また、液体クロマトグラフ制御装置21は、例えば汎用のパーソナルコンピュータなどの情報処理装置によって構成されており、図4に示すように、混合比演算部22a及び混合比制御部22bを有するCPU22と、実測値記憶部25a及び移動度変化率記憶部25bを有するメモリ25と、ハードディスク26と、入出力部28とを備えている。入出力部28には、例えばキーボードやマウスなどから構成された入力部29と、液体クロマトグラフィの実行過程における様々な情報をオペレータに知らせるためのディスプレイ30と、CPUの混合比制御部22bからの指示に基づいて電磁弁14の開閉信号を送出する電磁弁操作部31とが接続されている。
【0022】ハードディスク26には、一実施の形態による液体クロマトグラフの制御プログラムを含む各種のソフトウェアが記憶されている。そして、これらのハードウェア及びソフトウェアが組み合わされることによって、上述の各部22a、22b、25a、25bが構築されている。なお、このプログラムは、CD−ROM、FD、MOなどのリムーバブル型記録媒体に記録しておくことにより、任意のコンピュータにインストールすることが可能である。
【0023】実測値記憶部25aは、薄層クロマトグラフィの分離において複数の成分を特定混合比で含む溶離液を用いて分離を行ったときの試料の移動度R fの実測値を当該特定混合比に関連づけて記憶する。実測値記憶部25aに記憶すべきデータは、液体クロマトグラフ装置11を用いて液体クロマトグラフィを行う前に予め薄層クロマトグラフィを行って得られたものであって、オペレータによって入力部29から入力されてよい。
【0024】移動度変化率記憶部25bは、溶離液における各成分の混合比の変化に対する試料の移動度R fの変化率を記憶している。移動度変化率記憶部25bに記憶されたデータは、含有成分の組合せの異なる別種類の溶離液ごとに予め薄層クロマトグラフィを行って得られたものである。ハードディスク26には、含有成分の組合せの異なる別種類の溶離液について、それぞれ移動度R fの変化率が格納されている。そして、本実施の形態による制御プログラムが実行されるときに、実測値記憶部25aに記憶された特定混合比にかかる種類の溶離液に対する移動度R fの変化率だけがメモリ25にロードされる。
【0025】混合比演算部22aは、実測値記憶部25aに記憶された特定混合比に対する移動度R fの実測値と、移動度変化率記憶部25bに記憶された移動度R fの変化率とに基づいて、特定移動度R f0が得られる溶離液の混合比を求める。混合比演算部22aでの詳細な動作については後述する。
【0026】混合比制御部22bは、混合比演算部22aでの演算結果に基づいて、試料の移動度R fが特定移動度R f0となるようにカラムに送液される溶離液の混合比を制御する制御信号を出力する。この制御信号は入出力部28から電磁弁操作部31に供給される。
【0027】ディスプレイ30には、図5に示すように、グラフ51と、グラフ52と、グラジエント条件表53とが表示される。
【0028】グラフ51は、混合器15からカラム18に供給される溶離液10の混合比(B/A+B)の時間変化を表したものであり、横軸が経過時間、縦軸が溶離液に含まれる溶媒Bの割合である。横軸には、時間巾54がW(wait)、G(gradient)、T(top)、FW(forward wash)、EQ(equilibration)の順に設定されている。グラフ52は、横軸が経過時間、縦軸が吸光度である。グラフ52は試料3の流出曲線であり、試料3に含まれる成分がカラム18から排出されたときに突出した値を示す。グラジエント条件表53は、時間巾毎の、溶離液10に含まれる溶媒Aと溶媒Bとの混合比が表示されている。尚、時間巾Gにおいては、Wでの混合比を徐々にTでの混合比にまで直線的に増加させる。
【0029】次に、本発明の液体クロマトグラフの実行方法の一実施の形態について説明する。
【0030】(第1の工程)まず、溶媒A・溶媒Bを特定混合比で含む溶離液4を用いたときの、試料3の移動度R fの実測値を、オペレータが薄層クロマトグラフィ(TLC)を行って求める。
【0031】TLCでは、まず、図2(a)に示すように、試料3が1滴垂らされた状態のシリカゲル薄層2が、図1に示すように溶離液4中に浸漬される。すると、毛管現象により混合溶液4がシリカゲル薄層2に吸い上げられてゆく。これに伴い、試料3も上方に移動する。溶離液4及び試料3の移動が終了すると、図2(b)に示すように、試料3は試料3´の位置に移動する。このとき、試料3の混合溶液4中に浸漬される前の位置から、溶離液4の上端までの距離を1.0として、その1.0に対する試料3´までの距離が移動度R fとして求められる。
【0032】(第2の工程)以下の工程は液体クロマトグラフ制御装置21において行われる。液体クロマトグラフ制御装置21のCPU22は、図6のステップS1において、第1の工程のTLCで得られた移動度R fの実測値が入力部29から入力されたかどうかを繰り返して判断する。そして、移動度R fの実測値が入力された場合には(S1:YES)、ステップS2において、移動度R fの実測値と共に、これが求められたときにおける混合溶液4の溶媒Aと溶媒Bとの混合比(特定混合比)をメモリ25の実測値記憶部25aに記憶する。
【0033】次に、ステップS3において、実測値記憶部25aに記憶された特定混合比にかかる種類の溶離液について、各成分の混合比の変化に対する試料の移動度R fの変化率のデータがハードディスク26から読み出されて移動度変化率記憶部25bにロードされる。
【0034】そして、ステップS4において、混合比演算部22aは、実測値記憶部25aに記憶された特定混合比に対する移動度R fの実測値と、移動度変化率記憶部25bに記憶された移動度R fの変化率とに基づいて、溶離液の混合比と移動度R fとの関係を一対一に定める。つまり、移動度変化率記憶部25bに記憶されているのは移動度R fの変化率に過ぎないので、混合比を横軸に移動度R fを縦軸にとったグラフである図7に示すように、移動度変化率記憶部25bの記憶内容からは、溶離液の混合比と移動度R fとの関係を一対一に定めることはできず、両者の関係を表す直線が直線61、62、63、64(これらはすべて移動度変化率記憶部25bに記憶された移動度R fの変化率に従った傾きを有している)などの無数の直線のいずれかであるということしか分からない。そのため、実測値記憶部25aに記憶された特定混合比X 0に対する移動度R fの実測値R f1を用いて、これら無数の直線の中から座標(X 0,R f1)を通過するものを、実際に移動度R fと混合比との関係を表すものとして選択する。例えば、図7に示す例では、混合比演算部22aは、両者の関係を表すものとして直線63を選択する。
【0035】さらに、ステップS5では、混合比演算部22aが、液体クロマトグラフ装置11で試料の分取を行う際に必要とされる特定移動度R f0に対する混合比を、ステップS4で定められた一対一の関係に基づいて算出する。例えば、図5のグラフ51に示すようなグラジエント処理を行う場合、混合比演算部22aは、図7に示すように、時間巾「W」及び「T」のときの各特定移動度R f0w、R f0tに対する混合比X w、X tを直線63に基づいて求める。このようにして求められた混合比は、メモリ25内の所定領域に書き込まれ、図5のグラジエント条件表53に示すようにディスプレイ30に表示される。
【0036】なお、ステップS5において、グラフ51に示す溶離液10の混合比の時間変化や、グラフ52に示す試料3の流出曲線がさらに算出されてもよい。
【0037】(第3の工程)ステップS6において、混合比制御部22bは、ステップS5で求められた混合比を有する溶離液10が所定時間だけカラム18に送液されるような制御信号を電磁弁操作部31に順次出力する。電磁弁操作部31はこの制御信号に基づいて電磁弁14を開閉させる信号を電磁弁14に供給する。これにより、カラム18内での試料の移動度R fを、確実に特定移動度R f0又はその近傍とすることができるので、良好な試料の分離を行わせることができる。
【0038】また、本実施の形態では、含有成分の組合せの異なる別種類の溶離液ごとに、各成分の混合比の変化に対する試料の移動度R fの変化率がハードディスク26に記憶されており、必要な変化率だけを移動度変化率記憶部25bに記憶させることができる。そのため、液体クロマトグラフ制御装置21を、含有成分の組合せの異なる多様な種類の溶離液に対して使用することができる。
【0039】以上、本発明の好適な実施の形態について説明したが、本発明は上述の実施の形態に限られるものではなく、特許請求の範囲に記載した限りにおいて様々な設計変更が可能なものである。例えば、液体クロマトグラフ装置11の具体的な構成は様々な形態に変更することができる。また、移動度変化率記憶部25bは、各成分の混合比の変化に対する試料の移動度R fの変化率を1種類の溶離液だけについて記憶可能であってもよい。また、液体クロマトグラフ制御装置21のハードウェア構成は任意に変更可能である。
【0040】
【発明の効果】請求項1、3、4の発明によると、任意の特定混合比における試料の移動度R fを薄層クロマトグラフィで求めておけば、所望の特定移動度R f0での溶離液の混合比を知ることができる。そのため、煩雑な作業を行うことなく適切な移動度R f0となる溶離液条件でクロマトグラフィを実行することができる。
【0041】また、請求項2の発明によると、液体クロマトグラフの制御装置を、含有成分の組合せの異なる多様な種類の溶離液に対して使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】TLCを行う装置を示す斜視図である。
【図2】TLCを行う際のシリカゲル薄層板の模式図であり、(a)はTLC前、(b)はTLC後をそれぞれ示している。
【図3】本発明が適用される液体クロマトグラフ装置を示す模式図である。
【図4】本発明の一実施の形態による液体クロマトグラフ制御装置のブロック図である。
【図5】図4に示す液体クロマトグラフ制御装置のディスプレイへの表示例を描いた図面である。
【図6】本発明の一実施の形態による液体クロマトグラフの実行方法のフローチャートである。
【図7】混合比を横軸に、移動度R fを縦軸にとったグラフである。
【符号の説明】
1 TLC装置
2 シリカゲル薄層板
3 試料
4 溶離液
5 容器
6 検出器
11 液体クロマトグラフ装置
12、13 容器
14 電磁弁
15 混合器
16 ポンプ
17 インジェクター
18 カラム
20 フラクションコレクター
21 液体クロマトグラフ制御装置
22 CPU
22a 混合比演算部(混合比演算手段)
22b 混合比制御部(混合比制御手段)
25 メモリ
25a 実測値記憶部(実測値記憶手段)
25b 移動度変化率記憶部(移動度変化率記憶手段)
26 ハードディスク
28 入出力部
29 入力部
30 ディスプレイ
31 電磁弁操作部