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1. (CN107735430) PRODUCTION METHOD FOR RUBBER PARTICLES HAVING MEMBRANE-BINDING PROTEIN BOUND THERETO, PRODUCTION METHOD FOR PNEUMATIC TIRE, AND PRODUCTION METHOD FOR RUBBER PRODUCT
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与膜结合蛋白质结合的橡胶颗粒的制造方法,充气轮胎的制 造方法和橡胶制品的制造方法


技术领域
本发明涉及与膜结合蛋白质结合的橡胶颗粒的制造方法,充气轮胎的制造方法以及橡胶制品的制造方法。
背景技术
制备膜结合蛋白质的常规方法需要培养大量的过量表达膜结合蛋白质的细胞(例如大肠杆菌,酵母),用表面活性剂提取膜结合蛋白质,并纯化提取的蛋白质。然而,用于提取膜结合蛋白质的最佳表面活性剂根据不同蛋白质而不同,并且合适的表面活性剂的选择在膜结合蛋白质的制备中是重要的。
由于其疏水性,膜结合蛋白质甚至难以纯化。此外,一旦它们被表面活性剂溶解,它们的结构发生改变,因此当再次结合到膜上时,蛋白质并不总是保持其原始结构。
为了揭示膜结合蛋白质的真正功能和活性,有必要评估当蛋白质结合膜时,具有适当结构的蛋白质的功能。然而,由于上述原因,这种评估在技术上被认为是困难的。
最近,已经尝试通过无细胞蛋白质合成制造膜结合蛋白质来合成和收集保留其生物学功能(即天然状态)的膜蛋白质,而不是在培养的细胞中制造膜结合蛋白质,并允许蛋白质用脂质体(人造膜)代替细胞膜(参见例如专利文献1)。还公开了:其中通过无细胞蛋白质合成来合成膜结合蛋白质,并且通过将产生的膜结合蛋白质嵌入被固定在基板上的脂质双层中来固定所产生的膜结合蛋白质的方法;和在膜囊泡存在下通过无细胞蛋白质合成实现膜结合蛋白质的高产率合成(参见例如专利文献2和3)。
引用列表
专利文献
专利文献1:JP 2005-225796 A
专利文献2:JP 2010-132594 A
专利文献3:JP 5383197B
发明内容
技术问题
如上所述,已经研究了在脂质体,脂质双层或膜囊泡存在下的膜结合蛋白质的无细胞蛋白质合成。脂质体是人工产生的由磷脂,甘油糖脂,胆固醇或其他组分形成的脂质双层膜。因此,没有蛋白质与生成的脂质体的表面结合。
相比之下,虽然从产胶植物的胶乳中收集的橡胶颗粒也涂覆有脂质膜,但是该橡胶颗粒的膜是天然衍生的膜,其中在植物中合成的蛋白质已经结合到膜的表面。橡胶颗粒的脂质膜通常被认为是单层的。
在上述情况下,还没有尝试在橡胶颗粒存在下进行膜结合蛋白质的无细胞蛋白质合成。
本发明旨在解决上述问题,提供一种通过无细胞蛋白质合成来制造与膜结合蛋白质结合的橡胶颗粒的方法。
解决技术问题的方案
本发明涉及一种制造与膜结合蛋白质结合的橡胶颗粒的方法,该方法包括如下步骤:在橡胶颗粒和含有对膜结合蛋白质进行编码的mRNA的无细胞蛋白质合成溶液的存在下进行蛋白质合成以将膜结合蛋白质结合到橡胶颗粒。
优选地,无细胞蛋白质合成溶液含有胚芽提取物。
优选地,胚芽提取物衍生自小麦。
优选地,橡胶颗粒以5~50g/L的浓度存在于无细胞蛋白质合成溶液中。
优选地,橡胶颗粒在与无细胞蛋白质合成溶液组合之前,用表面活性剂洗涤橡胶颗粒。
优选地,表面活性剂是两性表面活性剂,橡胶颗粒用表面活性剂以在表面活性剂的临界胶束浓度的三倍内的浓度洗涤。
优选地,表面活性剂是CHAPS。
优选地,蛋白质合成通过透析法进行。
优选地,在蛋白质合成反应期间另外加入对膜结合蛋白质进行编码的mRNA。
本发明还涉及一种充气轮胎的制造方法,该方法包括以下步骤:由通过橡胶颗粒的制造方法制造的橡胶颗粒合成橡胶;混炼橡胶与添加剂以获得混炼的混合物;由混炼的混合物制造生胎;和对生胎进行硫化。
本发明还涉及一种橡胶制品的制造方法,该方法包括以下步骤:由通过橡胶颗粒的制造方法制造的橡胶颗粒合成橡胶;混炼橡胶与添加剂以获得混炼的混合物;由混炼的混合物形成生胶制品;并对生胶制品进行硫化。
发明的有益效果
本发明的制造与膜结合蛋白质结合的橡胶颗粒的方法包括如下步骤:在橡胶颗粒和含有对膜结合蛋白质进行编码的mRNA的无细胞蛋白质合成溶液的存在下进行蛋白质合成,以将膜结合蛋白质结合到橡胶颗粒上。因此,可以通过无细胞蛋白质合成制造与膜结合蛋白质结合的橡胶颗粒,在保持其原始结构的同时将膜结合蛋白质与橡胶颗粒结合,以改变橡胶颗粒的性质。
本发明的充气轮胎的制造方法包括以下步骤:由通过本发明的橡胶颗粒的制造方法制造的橡胶颗粒合成橡胶;混炼橡胶与添加剂以获得混炼的混合物;由混炼的混合物制造生胎;和对生胎进行硫化。利用这种方法,充气轮胎由橡胶颗粒制成的橡胶制成,该橡胶颗粒通过可以在橡胶颗粒生产过程中改变橡胶颗粒性能的方法制成。因此,可以有效地利用植物资源生产环保的充气轮胎。
本发明的橡胶制品的制造方法包括以下步骤:由通过本发明的橡胶颗粒的制造方法制造的橡胶颗粒合成橡胶;混炼橡胶与添加剂以获得混炼的混合物;由混炼的混合物形成生胶制品;并硫化生胶制品。通过该方法,橡胶制品由橡胶颗粒制造的橡胶制造,该橡胶颗粒通过在橡胶颗粒的制造中能够改变橡胶颗粒的性能的方法制造。因此,可以有效利用植物资源生产环保的橡胶制品。
附图说明
图1是显示实施例的透析处理的概要图。
图2是显示实施例1~3和比较例1的SDS-PAGE结果的电泳图。
图3是显示比较例2的SDS-PAGE结果的电泳图。
具体实施方式
本发明的制造与膜结合蛋白质结合的橡胶颗粒的方法包括如下步骤:在橡胶颗粒和含有用于膜结合蛋白质编码的mRNA的无细胞蛋白质合成溶液的存在下进行蛋白质合成,以将膜结合蛋白质结合到橡胶颗粒上。换句话说,可以通过在橡胶颗粒和含有用于膜结合蛋白质编码的mRNA的无细胞蛋白质合成溶液的存在下,更具体地说,使用橡胶颗粒与含有用于膜结合蛋白质编码的mRNA的无细胞蛋白质合成溶液的混合物,进行蛋白质合成而将膜结合蛋白质与橡胶颗粒结合。
如前所述,由于脂质体是由磷脂,甘油糖脂,胆固醇或其他组分人工产生的脂质双层膜,所以没有蛋白质与生成的脂质体的表面结合。相比之下,虽然从产胶植物的胶乳中收集得到的橡胶颗粒也涂覆有脂质膜,但是橡胶颗粒的膜是天然衍生的膜,其中在植物中合成的蛋白质已经结合到膜的表面。因此,预期额外的蛋白质与已经结合和涂覆蛋白质的橡胶颗粒的结合比与未结合任何蛋白质的脂质体的结合更困难。还存在已经结合到橡胶颗粒上的蛋白质可以抑制无细胞蛋白质合成的问题。
由于这些原因,已经预期在橡胶颗粒存在下进行无细胞蛋白质合成时存在困难。在这种情况下,本发明人进行了研究,以过去从未尝试过的在橡胶颗粒存在下进行膜结合蛋白质的无细胞蛋白质合成,并且首次发现与膜结合蛋白质结合的橡胶颗粒可以通过在橡胶颗粒存在下进行无细胞蛋白质合成而产生。利用该方法,可以在保持其原始结构的同时将膜结合蛋白质与橡胶颗粒结合,以改变橡胶颗粒的性质。
本发明的制造方法只要其包括上述步骤,可以包括任何其他步骤,并且每个步骤可以进行一次或重复多次。
在本发明中,将与橡胶颗粒结合的膜结合蛋白质的量没有特别限定。
其中,在无细胞蛋白质合成溶液和橡胶颗粒的存在下,通过蛋白质合成将膜结合蛋白质与橡胶颗粒的结合意味着,例如通过蛋白质合成而合成的膜结合蛋白质被完全或部分地结合到橡胶颗粒中或插入到橡胶颗粒的膜结构中。不限于这些实施方案,还包括其中例如蛋白质定位在橡胶颗粒的表面或内部的实施方案。此外,与橡胶颗粒结合的膜结合蛋白质的概念还包括其中蛋白质与另一与上述橡胶颗粒结合的膜结合蛋白质形成复合物从而以复合物的形式存在橡胶颗粒中的实施方案。
橡胶颗粒的来源没有特别限制。例如,橡胶颗粒可以来自产胶植物的胶乳,例如巴西橡胶树(Hevea brasiliensis),蒲公英橡胶草(Taraxacum kok-saghyz),银胶菊(Parthenium argentatum),苦苣菜(Sonchus oleraceus)或橡皮树(Ficus elastica)。
橡胶颗粒的粒径也没有特别限定。可以对具有预定粒径的橡胶颗粒进行分选和使用,或者可以使用具有不同粒径的橡胶颗粒的混合物。当将具有预定粒径的橡胶颗粒进行分选和使用时,橡胶颗粒可以是具有小粒径的小橡胶颗粒(SRP)或具有大粒径的大橡胶颗粒(LRP)。
可以采用常用的方法来分选具有预定粒径的橡胶颗粒,包括例如包括离心的方法,优选多级离心。具体方法包括以如下顺序进行离心:以500-1,500×g离心,以1,700-2,500×g离心,以7,000-9,000×g离心,以15,000-25,000×g离心,以40,000-60,000×g离心。每次离心处理的持续时间优选为20分钟以上,更优选为30分钟以上,进一步优选为40分钟以上,但优选为120分钟以下,更优选为90分钟以下。每次离心处理的温度优选为0℃至10℃,更优选为2℃至8℃,特别优选为4℃。
用于膜结合蛋白质编码的mRNA用作可以翻译以合成膜结合蛋白质的翻译模板。在本发明的制造方法中,可以是用于单种膜结合蛋白质编码的mRNA或用于膜结合蛋白质编码的两种以上mRNA的混合物。换句话说,在本发明中,可以将一种或两种以上的膜结合蛋白质结合到橡胶颗粒上。
用于膜结合蛋白质编码的mRNA的制备方法没有特别限定,只要所制备的mRNA用作可以翻译以合成膜结合蛋白质的翻译模板即可。例如,mRNA可以通过如下方式制备:例如通过热酚法从例如生物体的组织中提取总RNA,由总RNA合成cDNA,使用基于编码感兴趣的膜结合蛋白质的基因的核苷酸序列数据制备的引物获得编码感兴趣的膜结合蛋白质的基因的DNA片段,并进行DNA片段的通常的体外转录反应。
用于膜结合蛋白质编码的mRNA的来源没有特别限定,但优选为植物,更优选选自橡胶树(Hevea)属、苦苣菜(Sonchus)属、银胶菊(Taraxacum)属和蒲公英(Parthenium)属的植物中的至少一种。其中,mRNA更优选来源于选自巴西橡胶树(Hevea brasiliensis),苦苣菜(Sonchus oleraceus),银胶菊(Parthenium argentatum),和蒲公英橡胶草(Taraxacumkok-saghyz)中的至少一种植物,特别优选巴西橡胶树。
该植物没有特别的限制,其实例包括橡胶树属,如巴西橡胶树;苦苣菜属,如苦苣菜(Sonchus oleraceus),花叶滇苦菜(Sonchus asper)和苣荬菜(Sonchus brachyotus);一枝黄花属,如北美一枝黄花(Solidago altissima),毛果一枝黄花亚种.积雪草(Solidago virgaurea subsp.Asiatica),毛果一枝黄花亚种.leipcarpa(Solidagovirgaurea subsp.leipcarpa),毛果一枝黄花亚种.leipcarpa f.paludosa(Solidagovirgaurea subsp.leipcarpa f.paludosa),毛果一枝黄花亚种.gigantea,和Solidagogigantea Ait.var.leiophylla Fernald;向日葵属,例如油葵(Helianthus annus),绢毛葵(Helianthus argophyllus),Helianthus atrorubens,Helianthus debilis,千瓣葵(Helianthus decapetalus),和Helianthus giganteus;蒲公英属,例如蒲公英(Taraxacum),Taraxacum venustum H.Koidz,Taraxacum hondoense Nakai,Taraxacumplatycarpum Dahlst,Taraxacum japonicum,Taraxacum officinale Weber,Taraxacumkok-saghyz,和Taraxacum brevicorniculatum;榕树属,如Ficus carica,Ficuselastica,Ficus pumila L.,Ficus erecta Thumb.,Ficus ampelas Burm.f.,Ficusbenguetensis Merr.,Ficus irisana Elm.,Ficus microcarpa L.f.,Ficus septicaBurm.f.,和Ficus benghalensis;银胶菊属,例如银胶菊(Parthenium argentatum),解热银胶菊(Parthenium hysterophorus),和豚草(Parthenium hysterophorus);莴苣(Lactuca sativa);孟加拉榕树(Ficus benghalensis);和拟南芥(Arabidopsisthaliana)。
膜结合蛋白质可以是固有地具有结合生物体中的膜的性质的任何蛋白质。它可能是固有地存在于产胶植物中的橡胶颗粒上的蛋白质,或天然橡胶颗粒中不存在的蛋白质,优选固有地存在于产胶植物中的橡胶颗粒上的蛋白质。膜结合蛋白质与膜结合的方式没有特别限定。可以是结合到大部分的膜表面上的膜结合蛋白质,或者插入并结合到膜上的膜结合蛋白质,或与膜结合蛋白质形成复合物从而存在于膜表面上的蛋白质。
固有地存在于产胶植物中的橡胶颗粒上的膜结合蛋白质的实例包括顺式异戊烯基转移酶(CPT),Nogo-B受体(NgBR),橡胶延伸因子(REF),小橡胶颗粒蛋白(SRPP),β-1,3-葡聚糖酶和橡胶蛋白。
根据结合模式,这种膜结合蛋白质大致分为内在膜结合蛋白质,其具有一个或多个嵌入在脂质膜中的结构域;和外周膜结合蛋白质,其仅结合到脂质膜的表面上。大多数内在膜结合蛋白质具有跨越脂质膜的一个或多个跨膜结构域。
内在膜结合蛋白质的实例包括用作受体的蛋白质,例如G蛋白偶联受体和用作通道例如离子通道的蛋白质。具体实例包括细胞色素b561和毒蕈碱性乙酰胆碱(muscarinicacetylcholine)受体(多通道跨膜蛋白),和P450-还原酶(N-末端单通道跨膜蛋白)。
此外,外周膜结合蛋白质的具体实例包括细胞色素b5(C-末端锚定蛋白)。
膜结合蛋白质优选是固有地存在于产胶植物中的橡胶颗粒上并且参与橡胶合成的蛋白质。通过将这种参与橡胶合成的蛋白质结合到橡胶颗粒中,可以增加橡胶颗粒的橡胶合成活性,从而允许在反应容器(例如试管,工业厂房)中更有效地生产橡胶。
具体而言,膜结合蛋白质更优选为选自CPT,NgBR,REF和SRPP中的至少一种,还更优选选自CPT,NgBR和REF中的至少一种,特别优选CPT和/或NgBR。
在本发明中,膜结合蛋白质的无细胞蛋白质合成在橡胶颗粒存在下进行。可以以与现有技术相似的方式,使用本发明的无细胞蛋白质合成溶液进行该无细胞蛋白质合成。所用的无细胞蛋白质合成系统可能是常见的无细胞蛋白质合成手段,如快速翻译系统RTS500(罗氏诊断Roshe Diagnostics);或根据Proc.Natl.Acad.Sci.美国,97:559-564(2000),日本JP-A 2000-236896,日本JP-A 2002-125693,和日本JP-A 2002-204689制备的小麦胚芽提取物,或使用小麦胚芽提取物的无细胞蛋白质合成系统(JP-A 2002-204689,Proc.Natl.Acad.Sci.,美国,99:14652-14657(2002))。其中优选使用胚芽提取物的系统。因此,在本发明的另一个合适的实施方案中,无细胞蛋白质合成溶液含有胚芽提取物。
胚芽提取物的来源没有特别限制。从翻译效率的观点来看,当通过无细胞蛋白质合成来合成植物膜结合蛋白质时,优选使用植物来源的胚芽提取物。特别优选使用小麦来源的胚芽提取物。因此,在本发明的另一个合适的实施方案中,胚芽提取物源自小麦。
用于制备胚芽提取物的方法没有特别限制,可以按照例如JP-A 2005-218357中所述的常规进行。
本发明中使用的无细胞蛋白质合成溶液优选还含有环状核苷单磷酸衍生物或其盐(以下也简称为“活性增强剂”)。通过包含活性增强剂可进一步增加蛋白质合成活性。
环状核苷单磷酸衍生物或其盐没有特别限制,只要其能够增加无细胞蛋白质的合成活性即可。实例包括腺苷-3',5'-环状单磷酸及其盐;腺苷-3',5'-环状单硫代磷酸(Sp-异构体)及其盐;腺苷-3',5'-环状单硫代磷酸(Rp-异构体)及其盐;鸟苷-3',5'-环状单磷酸及其盐;鸟苷-3',5'-环状单硫代磷酸(Sp-异构体)及其盐;鸟苷-3',5'-环状单硫代磷酸(Rp-异构体)及其盐;8-溴代腺苷-3',5'-环状单磷酸(溴代-cAMP)及其盐;8-(4-氯代苯硫基)腺苷-3',5'-环状单磷酸(氯代苯硫基-cAMP)及其盐;5,6-二氯代-1-β-D-呋喃核糖基苯并咪唑腺苷-3',5'-环状单磷酸(二氯代呋喃核糖基苯并咪唑cAMP)及其盐;腺苷-2',5'-环状单磷酸及其盐;腺苷-2',5'-环状单硫代磷酸(Sp-异构体)及其盐;腺苷-2',5'-环状单硫代磷酸(Rp-异构体)及其盐;鸟苷-2',5'-环状单磷酸及其盐;鸟苷-2',5'-环状单硫代磷酸(Sp-异构体)及其盐;和鸟苷-2',5'-环状单硫代磷酸(Rp-异构体)及其盐。
与环状核苷单磷酸酯衍生物形成盐的碱没有特别限制,只要其为生物化学上可接受的并且与衍生物形成盐即可。优选的是例如碱金属原子如钠或钾,以及有机碱如三羟基氨基甲烷等。
在这些活性增强剂中,特别优选腺苷-3',5'-环状单磷酸或腺苷-3',5'-环状单磷酸钠盐。这些活性增强剂可以单独使用,也可以两种以上组合使用。
活性增强剂可以预先掺入到本发明的无细胞蛋白质合成溶液中。如果活性增强剂在溶液中不稳定,则优选在无细胞蛋白质合成溶液和橡胶颗粒的存在下进行的蛋白质合成反应期间添加。
活性增强剂的添加量没有特别限制,只要活性增强剂的浓度能够激活(增加)本发明的无细胞蛋白质合成溶液中的蛋白质合成反应即可。具体地说,反应体系中的最终浓度通常可以至少为0.1毫摩尔/升。浓度的下限优选为0.2毫摩尔/升,更优选为0.4毫摩尔/升,特别优选为0.8毫摩尔/升,浓度的上限优选为24毫摩尔/升,更优选为6.4毫摩尔/升,特别优选3.2毫摩尔/升。
本发明的添加活性增强剂的无细胞蛋白质合成溶液的温度没有特别限定,但优选为0℃~30℃,更优选为10℃~26℃。
除了用于膜结合蛋白质编码的mRNA(翻译模板)外,本发明的无细胞蛋白质合成溶液还含有ATP,GTP,磷酸肌酸,肌酸激酶,L-氨基酸,钾离子,镁离子,和蛋白质合成所需的其它组分,以及任选的活性增强剂。这种无细胞蛋白质合成溶液可以作为无细胞蛋白质合成反应体系。
由于如JP-A 2005-218357中所述制备的胚芽提取物含有蛋白质合成反应所需量的tRNA,因此当将上述制备的胚芽提取物在无细胞蛋白质合成溶液中使用时,不需要添加单独制备的tRNA。换句话说,可以根据需要将tRNA加入到无细胞蛋白质合成溶液中。
在本发明中,在橡胶颗粒和含有用于膜结合蛋白质编码的mRNA的无细胞蛋白质合成溶液的存在下进行蛋白质合成。具体地说,这可以在蛋白质合成之前或之后的合适时间点,优选蛋白质合成之前,通过将橡胶颗粒添加到无细胞蛋白质合成溶液中来完成。
橡胶颗粒优选以5至50g/L的浓度存在于无细胞蛋白质合成溶液中。换句话说,优选在1L无细胞蛋白质合成溶液中存在5~50g的橡胶颗粒。当无细胞蛋白质合成溶液中存在的橡胶颗粒的浓度小于5g/L时,不能通过分离处理(例如超速离心)形成用于收集与合成的膜结合蛋白质结合的橡胶颗粒的橡胶层,因此可能难以收集与合成的膜结合蛋白质结合的橡胶颗粒。此外,当存在于无细胞蛋白质合成溶液中的橡胶颗粒的浓度超过50g/L时,橡胶颗粒会结块,使得合成的膜结合蛋白质可能不能很好地与橡胶颗粒结合。橡胶颗粒的浓度更优选为10~40g/L,进一步优选为15~35g/L,特别优选为15~30g/L。
在橡胶颗粒和无细胞蛋白质合成溶液存在下的蛋白质合成中,随着反应进行,可以适当添加另外的橡胶颗粒。无细胞蛋白质合成溶液和橡胶颗粒优选在无细胞蛋白质合成系统活化的时期(例如将橡胶颗粒加入到无细胞蛋白质合成溶液中之后的3至48小时,优选3至30小时,更优选3至24小时)内一起存在。
橡胶颗粒不必受任何处理,例如,在与无细胞蛋白质合成溶液组合之前进行预处理。然而,可以预先用表面活性剂从橡胶颗粒中除去膜结合蛋白质,以通过本发明的方法增加存在于橡胶颗粒上的膜结合蛋白质中期望被结合的膜结合蛋白质的比例。因此,在本发明的另一个合适的实施方案中,本发明中使用的橡胶颗粒在与无细胞蛋白质合成溶液组合之前用表面活性剂洗涤。
表面活性剂没有特别限制,其实例包括非离子表面活性剂和两性表面活性剂。其中,非离子表面活性剂和两性表面活性剂是适用的,这是因为它们对膜上的蛋白质只具有较小的变性作用,两性表面活性剂是特别合适的。因此,在本发明的另一个合适的实施方案中,表面活性剂是两性表面活性剂。
这些表面活性剂可以单独使用,也可以两种以上组合使用。
非离子表面活性剂的实例包括聚氧化烯醚非离子表面活性剂,聚氧化烯酯非离子表面活性剂,多元醇脂肪酸酯非离子表面活性剂,糖脂肪酸酯非离子表面活性剂,烷基多糖苷非离子表面活性剂和聚氧化烯聚葡糖苷非离子表面活性剂;和聚氧化烯烷基胺和烷基链烷醇酰胺。
其中优选聚氧化烯醚非离子表面活性剂或多元醇脂肪酸酯非离子表面活性剂。
聚氧化烯醚非离子表面活性剂的实例包括聚氧化烯烷基醚,聚氧化烯烷基苯基醚,聚氧化烯多元醇烷基醚和聚氧化烯单-,二-或三苯乙烯基苯基醚。其中,聚氧化烯烷基苯基醚是合适的。多元醇优选为C2-C12多元醇,如乙二醇,丙二醇,甘油,山梨糖醇,葡萄糖,蔗糖,季戊四醇或脱水山梨糖醇。
聚氧化烯酯非离子表面活性剂的实例包括聚氧化烯脂肪酸酯和聚氧化烯烷基松香酸酯。
多元醇脂肪酸酯非离子表面活性剂的实例包括C2-C12多元醇的脂肪酸酯和聚氧化烯多元醇的脂肪酸酯。更具体的实例包括山梨糖醇脂肪酸酯,脱水山梨糖醇脂肪酸酯,甘油脂肪酸酯,聚甘油脂肪酸酯和季戊四醇脂肪酸酯,以及前述的聚环氧烷加合物(例如聚氧化烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯,聚氧化烯甘油脂肪酸酸酯)。其中,脱水山梨糖醇脂肪酸酯是合适的。
糖脂肪酸酯非离子表面活性剂的实例包括蔗糖,葡萄糖,麦芽糖,果糖和多糖的脂肪酸酯,以及前述的聚环氧烷加合物。
烷基多糖苷非离子表面活性剂的实例包括具有例如葡萄糖,麦芽糖,果糖或蔗糖作为糖苷的那些,例如前述的烷基葡糖苷,烷基聚葡糖苷,聚氧化烯烷基葡糖苷和聚氧化烯烷基聚葡糖苷,以及脂肪酸酯。也可以使用任何前述的聚环氧烷加合物。
这些非离子表面活性剂中的烷基的实例包括C4-C30直链或支链,饱和或不饱和的烷基。聚氧化烯基可以具有C2-C4亚烷基,例如可以具有约1~50摩尔的环氧乙烷。脂肪酸的实例包括C4-C30直链或支链,饱和或不饱和的脂肪酸。
在非离子表面活性剂中,特别优选聚氧乙烯亚乙基(10)辛基苯基醚(Triton X-100)或脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Span 20),因为他们具有在保持橡胶颗粒的膜稳定的同时适度去除膜结合蛋白质的能力,并且还对蛋白质只具有较小变性作用。
两性表面活性剂的实例包括两性离子表面活性剂如季铵基/磺酸盐基(-SO 3 H)表面活性剂,水溶性季铵基/磷酸酯基表面活性剂,水不溶性季铵基/磷酸酯基表面活性剂和季铵基/羧基表面活性剂。这些两性离子表面活性剂中的酸基可以是盐。
特别地,两性离子表面活性剂优选在分子中具有正电荷和负电荷。酸基的酸解离常数(pKa)优选为5以下,更优选为4以下,进一步优选为3以下。
两性表面活性剂的具体实例包括磺基甜菜碱铵,例如3-[3-(胆酰胺丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸盐(CHAPSO),3-[3-(胆酰胺丙基)-二甲基氨基]-丙磺酸盐(CHAPS),N,N-双(3-D-葡糖酰胺丙基)-胆酰胺,正十八烷基-N,N'-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸盐,正癸基-N,N'-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸盐,正十二烷基-N,N'-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸盐,正十四烷基-N,N'-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸盐(ZwittergentTM-3-14},正十六烷基-N,N'-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸盐和正十八烷基-N,N'-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸盐;磷酸胆碱如正辛基磷酸胆碱,正壬基磷酸胆碱,正癸基磷酸胆碱,正十二烷基磷酸胆碱,正十四烷基磷酸胆碱和正十六烷基磷酸胆碱;和磷脂酰胆碱如二月桂酰磷脂酰胆碱,二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱,二棕榈酰磷脂酰胆碱,二硬脂酰磷脂酰胆碱,二油酰磷脂酰胆碱和二亚油酰磷脂酰胆碱。其中,3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-丙烷磺酸盐(CHAPS)是特别优选的,因为其具有适度去除膜结合蛋白质,同时保持橡胶颗粒的膜稳定的能力。
用于处理的表面活性剂的浓度优选在所用表面活性剂的临界胶束浓度(CMC)的三倍以内。如果用浓度超过临界胶束浓度三倍的表面活性剂处理橡胶颗粒,则橡胶颗粒的膜的稳定性可能会降低。其浓度更优选在CMC的2.5倍以内,进一步优选在2.0倍以内。浓度的下限优选为CMC的0.05倍以上,更优选为0.1倍以上,进一步优选为0.3倍以上。
可用于根据本发明的蛋白质合成的反应体系或装置的实例包括分批方法(Pratt,J.M.等,转录和翻译(Transcription and Translation),Hames,179-209,B.D.&Higgins,S.J.编辑,IRL出版社,牛津(1984)),一种连续的无细胞蛋白质合成系统,其中将氨基酸,能量源和其它组分连续供入反应体系(Spirin,A.S.等,Science,242,1162-1164(1988)),透析法(Kigawa等,日本分子生物学会第21届年会(21st Annual Meeting of the MolecularBiology Society of Japan),WID 6)和叠层法(PROTEIOSTM小麦胚芽无细胞蛋白质合成核心试剂盒说明书(instruction manual of PROTEIOSTM wheat germ cell-free proteinsynthesis core kit),Toyobo株式会社)。可以使用另一种方法以根据需要向蛋白质合成反应体系提供模板RNA,氨基酸,能量源和其它组分,并根据需要排出合成产物或分解产物。
其中,叠层法具有易于操作的优点,但不幸的是,橡胶颗粒分散在反应溶液中,因此难以有效地结合合成的膜结合蛋白质。相反,透析法中,由于作为待合成的膜结合蛋白质的原料的氨基酸可以通过透析膜,而橡胶颗粒不能通过,所以能够防止橡胶颗粒的分散,从而可以将合成的膜结合蛋白质有效地结合到橡胶颗粒上。因此,优选透析法。
透析法是指使用本发明的蛋白质合成用反应溶液作为内部透析液以及通过能够传质的透析膜将内部透析液与外部透析液分离的装置进行蛋白质合成的方法。具体地说,例如,可选地在预培养适量的时间之后,将翻译模板加入到除了翻译模板之外的合成反应溶液中,然后将溶液作为内部反应溶液放入合适的透析容器中。透析容器的实例包括具有附接到底部的透析膜的容器(例如Dialysis Cup 12,000,购自Daiichi Kagaku)和透析管(例如12,000,购自三光纯药株式会社Sanko Junyaku Co.,Ltd.)。所使用的透析膜的分子量截止值为10,000道尔顿或更高,优选约12,000道尔顿。
使用的外部透析液是含有氨基酸的缓冲液。当反应速度下降时,通过用新鲜溶液代替外部透析液可以提高透析效率。根据所使用的蛋白质合成系统适当选择反应温度和时间。例如,在使用小麦衍生的胚芽提取物的系统的情况下,反应通常可以在10℃至40℃,优选18℃至30℃,更优选20℃至26℃进行10分钟至48小时,优选10分钟至30小时,更优选10分钟至24小时。
由于用于编码本发明的无细胞蛋白质合成溶液中包含的膜结合蛋白质的mRNA容易分解,所以可以在蛋白质合成反应中额外地适当添加mRNA,使蛋白质合成更有效。因此,在本发明的另一个合适的实施方案中,在蛋白质合成反应期间另外加入用于膜结合蛋白质编码的mRNA。
mRNA的添加时间,添加次数,添加量和其他条件没有特别限制,可以适当选择。
在本发明的制造方法中,收集橡胶颗粒的步骤可以任选地在进行蛋白质合成的步骤之后进行,该蛋白质合成在橡胶颗粒和含有用于膜结合蛋白质编码的mRNA的无细胞蛋白质合成溶液的存在下进行,以将膜结合蛋白质结合到橡胶颗粒。
橡胶颗粒收集步骤可以通过可以收集橡胶颗粒的任何方法进行。它可以通过用于收集橡胶颗粒的常规方法进行。具体实例包括使用离心的方法。当通过离心方法收集橡胶颗粒时,可以适当地选择离心力,离心时间和离心温度,以便能够收集橡胶颗粒。例如,离心时的离心力优选为15,000×g以上,更优选为20,000×g以上,进一步优选为25,000×g以上。此外,由于离心力增加过大,不会产生相对应的高的分离效果,所以离心力的上限优选为50,000×g以下,更优选为45,000×g以下。离心时间优选为20分钟以上,更优选为30分钟以上,进一步优选为40分钟以上。另外,由于离心时间增加过长,也不会产生对应高的分离效果,所以离心时间的上限优选为120分钟以下,更优选为90分钟以下。
从保持与橡胶颗粒结合的膜结合蛋白质的活性的观点出发,离心温度优选为0℃~10℃,更优选为2℃~8℃,特别优选为4℃。
橡胶颗粒和无细胞蛋白质合成溶液分别通过离心分离成上层和下层。然后可以除去作为下层的无细胞蛋白质合成溶液以收集与膜结合蛋白质结合的橡胶颗粒。收集的橡胶颗粒可以重悬浮在具有中性pH值的适当的缓冲液中进行储存。
如上所述,根据本发明,通过在橡胶颗粒和无细胞蛋白质合成溶液的存在下进行蛋白质合成,可以将膜结合蛋白质与橡胶颗粒结合,所述无细胞蛋白质合成溶液含有用于膜结合蛋白质编码的mRNA。因此,本发明的另一方面涉及将膜结合蛋白质与橡胶颗粒结合的方法,其包括在橡胶颗粒和含有用于膜结合蛋白质编码的mRNA的无细胞蛋白质合成溶液存在下进行蛋白质合成的步骤,从而将膜结合蛋白质结合到橡胶颗粒上。
在橡胶颗粒和含有用于膜结合蛋白质编码的mRNA的无细胞蛋白质合成溶液的存在下进行蛋白质合成以将膜结合蛋白质结合到橡胶颗粒上的步骤如上所述。
(橡胶制品的制造方法)
本发明的橡胶制品的制造方法包括以下步骤:由通过制造橡胶颗粒的方法制造的橡胶颗粒合成橡胶;混炼橡胶与添加剂以获得混炼的混合物;由混炼的混合物形成生胶产品;并硫化生胶制品。
橡胶制品没有特别限制,只要它是可以由橡胶,优选天然橡胶制成的橡胶制品即可,并且实例包括充气轮胎,橡胶辊,橡胶挡板,手套和医用橡胶管。
当橡胶制品是充气轮胎时,或者换句话说,当本发明的橡胶制品的制造方法是本发明的充气轮胎的制造方法时,生胶制品形成步骤对应于由混炼的混合物制造生胎的步骤,并且硫化步骤对应于硫化生胎的步骤。因此,本发明的充气轮胎的制造方法包括以下步骤:由通过制造橡胶颗粒的方法制造的橡胶颗粒合成橡胶;混炼橡胶与添加剂以获得混炼的混合物;由混炼的混合物制造生胎;并对生胎进行硫化。
<合成步骤>
在合成步骤中,由通过制造橡胶颗粒的方法制造的橡胶颗粒合成橡胶。由橡胶颗粒合成橡胶可以通过常规方法进行,例如通过将橡胶颗粒与作为橡胶原料的基材在例如反应容器(例如试管或工业设备)中混合来进行。
<混炼步骤>
在混炼步骤中,将合成步骤中获得的橡胶与添加剂混炼,得到混炼的混合物。
在合成步骤中获得的橡胶可以通过对合成橡胶颗粒进行以下固化步骤来制备。
<固化步骤>
对合成橡胶颗粒进行固化步骤。固化方法没有特别限定,例子包括向例如乙醇,甲醇,丙酮等不溶解聚类异戊二烯(天然橡胶)的溶剂中添加橡胶颗粒的方法;以及向橡胶颗粒添加酸的方法。橡胶(天然橡胶)可以通过固化步骤从橡胶颗粒中作为固体被回收。所得橡胶(天然橡胶)可以在使用前根据需要进行干燥。
添加剂没有特别限定,可以使用在橡胶制品的制造中使用的添加剂。例如,在橡胶制品是充气轮胎的情况下,添加剂的例子包括除从橡胶颗粒中获得的橡胶以外的橡胶组分,增强填料如碳黑,二氧化硅,碳酸钙,氧化铝,粘土,滑石,硅烷偶联剂,氧化锌,硬脂酸,加工助剂,各种抗氧化剂,软化剂如油,蜡,硫化剂如硫和硫化促进剂。
混炼步骤中的混炼可以使用开式辊磨机,班伯里密炼机,内部混合机或其他橡胶混炼机进行。
<生胶制品形成步骤(在轮胎的情况下生胎制造步骤)>
在生胶制品形成步骤中,由在混炼步骤中得到的混炼混合物形成生胶制品(在轮胎的情况下为生胎)。
生胶制品的形成方法没有特别限制,可以适当地使用形成生胶制品的方法。例如,在橡胶制品是充气轮胎的情况下,混炼步骤中得到的混炼混合物可以根据轮胎部件的形状挤出,然后以通常的方式在轮胎成型机上形成并与其他轮胎部件组装在一起以构建生胎(未硫化轮胎)。
<硫化步骤>
在硫化步骤中,将生胶制品形成步骤中得到的生胶制品硫化,得到橡胶制品。
对生胶制品进行硫化的方法没有特别限制,可以适当地使用硫化生胶制品的方法。例如,在橡胶制品是充气轮胎的情况下,可以通过在硫化机中进行加热和加压来硫化生胶制品形成步骤中得到的生胎(未硫化轮胎),得到充气轮胎。
实施例
参照实施例具体说明本发明,但本发明不限于这些实施例。
(实施例1)
[从三叶橡胶树胶乳中提取总RNA]
通过热酚法从巴西橡胶树的胶乳中提取总RNA。向6mL胶乳中加入6mL 100mM乙酸钠缓冲液和1mL 10%SDS溶液,然后加入在65℃预热的12mL水饱和苯酚。将混合物在65℃下培育5分钟,在涡旋混合器中搅拌,并在室温下以7,000rpm离心10分钟。离心后,将上清液转移到新试管中,加入12mL苯酚:氯仿(1:1)溶液,并将混合物振荡搅拌2分钟。搅拌后,将所得混合物在室温下以7,000rpm再次离心10分钟,将上清液转移至新试管中,加入12mL氯仿:异戊醇(24:1)溶液,混合物摇动搅拌两分钟。搅拌后,将所得混合物在室温下以7,000rpm再次离心10分钟,将上清液转移到新试管中,加入1.2mL 3M乙酸钠溶液和13mL异丙醇,并将混合物在涡流混合器中搅拌。将所得混合物在-20℃下培育30分钟以沉淀总RNA。将培育的混合物在4℃以15,000rpm离心10分钟,除去上清液以收集总RNA沉淀物。收集的总RNA用70%乙醇洗涤两次,并溶于无RNA酶的水中。
[由总RNA合成cDNA]
由收集的总RNA合成cDNA。使用PrimeScript II第1链cDNA合成试剂盒(Takara BioInc.)按照其说明书进行cDNA合成。
[由cDNA获得CPT基因]
将制备的第1链cDNA用作模板以获得CPT基因。使用KOD-plus-Neo(Toyobo Co.,Ltd.)按照其说明书进行PCR。PCR反应涉及35个循环,每个循环由98℃下10秒,58℃下30秒和68℃下1分钟组成。
使用以下引物获得CPT基因。
引物1:5’-tttggatccgatggaattatacaacggtgagagg-3’
引物2:5’-tttgcggccgcttattttaagtattccttatgtttctcc-3’
如上所述制备CPT基因(HRT1)。对该基因进行测序以鉴定全长核苷酸序列和氨基酸序列。HRT1的核苷酸序列由SEQ ID NO:3给出。HRT1的氨基酸序列由SEQ ID NO:4给出。
[载体(Vector)构建]
将获得的DNA片段进行dA加入,然后使用pGEM-T Easy Vector System(Promega)插入到pGEM-T Easy Vector中以制备pGEM-HRT1。
[大肠杆菌的转化]
用制备的载体转化大肠杆菌DH5α,将转化体在含有氨苄青霉素和X-gal的LB琼脂培养基上培养,并通过蓝/白筛选选择携带引入靶基因的大肠杆菌细胞。
[质粒提取]
用含有靶基因的质粒转化的大肠杆菌细胞在LB液体培养基上在37℃下培养过夜。培养后,收集细胞,并收集质粒。使用FastGene Plasmid迷你试剂盒(Nippon Genetics Co.,Ltd.)进行质粒收集。
通过序列分析确认收集的插入质粒的基因的核苷酸序列中没有突变。
[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]
将上述[Vector构建]得到的pGEM-HRT1用限制酶Bam HI和Not I处理,并插入到已经用限制酶Bam HI和Not I类似地处理的pEU-E01-His-TEV-MCS-N2无细胞表达载体中以制备pEU-His-N2-HRT1。
[大肠杆菌的转化]
用制备的载体转化大肠杆菌DH5α,将转化体在含有氨苄青霉素和X-gal的LB琼脂培养基上培养,并通过菌落PCR选择携带引入靶基因的大肠杆菌细胞。
[质粒提取]
用含有靶基因的质粒转化的大肠杆菌细胞在LB液体培养基上在37℃下培养过夜。培养后,收集细胞,并收集质粒。使用FastGene Plasmid迷你试剂盒(Nippon Genetics Co.,Ltd.)进行质粒收集。
[橡胶颗粒的制备]
橡胶颗粒通过五级离心由三叶橡胶树胶乳制备。向900mL的三叶橡胶树胶乳中加入100mL含有20mM二硫苏糖醇(DTT)的1M Tris缓冲液(pH7.5)以制备胶乳溶液。将胶乳溶液以下列不同速度分阶段离心:1,000×g,2,000×g,8,000×g,20,000×g,50,000×g。每个阶段的离心在4℃下进行45分钟。向在50,000×g离心后留下的橡胶颗粒层中加入3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基氨基]-丙烷磺酸盐(CHAPS)(终浓度为0.1~2.0×CMC(0.1~2.0倍临界胶束浓度CMC)),以洗涤橡胶颗粒。洗涤后,通过超速离心(40,000×g,4℃,45分钟)收集橡胶颗粒,并重新悬浮于等量的含有2mM二硫苏糖醇(DTT)的100M Tris缓冲液(pH7.5)中。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤1:mRNA转录反应)]
使用WEPRO7240H表达试剂盒(CellFree Sciences Co.,Ltd.)进行无细胞蛋白质合成。根据WEPRO7240H表达试剂盒的方案,使用上述[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]中获得的pEU-His-N2-HRT1作为模板进行mRNA转录反应。
[mRNA的纯化]
转录反应后,通过乙醇沉淀纯化得到的mRNA。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤2:通过透析进行蛋白质合成)]
将以下量的物质加入到透析杯(MWCO 12000,Bio-Teck)中。根据WEPRO7240H表达试剂盒的方案制备总量为60μL的反应溶液。向反应溶液中加入1-2mg橡胶颗粒。另外将650μL的SUB-AMIX加入到2号PP容器(Maruemu容器)中。
将透析杯放置在2号PP容器中,并在26℃下开始蛋白质合成反应。在反应开始后,进行两次mRNA的添加和外部透析溶液(SUB-AMIX)的替换。
反应进行24小时。图1示出了透析过程的示意图。
[反应后的橡胶颗粒的收集]
将透析杯中的溶液转移到新的1.5μL管中,通过超速离心(40,000×g,4℃,45分钟)收集反应后的橡胶颗粒,并重新悬浮在等量的含有2mM二硫苏糖醇(DTT)的100M Tris缓冲液(pH7.5)中。
[CPT与橡胶颗粒的结合的验证]
通过SDS-PAGE验证CPT与橡胶颗粒的结合。蛋白质用CBB染色。
使用由Nihon Eido Corp.购得的迷你板式凝胶电泳室进行SDS-PAGE。使用的SDS-PAGE分离凝胶为15%丙烯酰胺凝胶,并使用通用电泳条件。使用的标记是可从Apro ScienceInc.获得的XL-ladder(Broad)。
此外,对无细胞蛋白质合成反应后的透析杯中的少量溶液(分离蛋白质合成溶液之前)和通过超速离心收集反应后的橡胶颗粒之后得到的上清液(分离的上清液)进行取样,并进行SDS-PAGE。
实施例1(泳道4至6)中的SDS-PAGE电泳图像显示在图2中。图2显示,尽管在如箭头所示的反应后(在分离蛋白质合成溶液之前),在无细胞蛋白质合成溶液中立刻观察到CPT的表达),但在用于收集橡胶颗粒的分离后获得的上清液(分离的上清液)中没有观察到CPT的表达,并且仅在反应后的橡胶颗粒部分中观察到。这证明表达的CPT与橡胶颗粒结合。
(实施例2)
[从三叶橡胶树胶乳中提取总RNA]
按照与实施例1相同的方法进行。
[由总RNA合成cDNA]
按照与实施例1相同的方法进行。
[由cDNA获得NgBR基因]
将制备的第1链cDNA用作模板以获得NgBR基因。使用KOD-plus-Neo(Toyobo Co.,Ltd.)按照其说明书进行PCR。PCR反应涉及35个循环,每个循环由98℃下10秒,58℃下30秒和68℃下1分钟组成。
使用以下引物获得NgBR基因。
引物3:5'-tttctcgagatggatttgaaacctggagctg-3'
引物4:5'-tttctcgagtcatgtaccataattttgctgcac-3'
如上所述制备NgBR基因(HRTBP)。对该基因进行测序以鉴定全长核苷酸序列和氨基酸序列。HRTBP的核苷酸序列由SEQ ID NO:7给出。HRTBP的氨基酸序列由SEQ ID NO:8给出。
[载体构造]
将获得的DNA片段进行dA加入,然后使用pGEM-T Easy Vector System(Promega)插入到pGEM-T Easy Vector中以制备pGEM-HRTBP。
[大肠杆菌的转化]
按照与实施例1相同的方法进行,但使用制备的载体。
[质粒提取]
按照与实施例1相同的方法进行。
[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]
用限制酶Xho I处理上述〔载体构建〕中得到的pGEM-HRTBP,插入到用限制酶Xho I类似地处理的pEU-E01-MCS-TEV-His-C1无细胞表达载体中以制备pEU-C1-HRTBP。
[大肠杆菌的转化]
按照与实施例1相同的方法进行,但使用制备的载体。
[质粒提取]
按照与实施例1相同的方法进行。
[橡胶颗粒的制备]
按照与实施例1相同的方法进行。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤1:mRNA转录反应)]
使用WEPRO7240H表达试剂盒(CellFree Sciences Co.,Ltd.)进行无细胞蛋白质合成。使用上述[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]中获得的pEU-C1-HRTBP和实施例1中[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]中得到的pEU-His-N2-HRT1作为模板根据WEPRO7240H表达试剂盒的方案进行mRNA转录反应。
[mRNA的纯化]
转录反应后,通过乙醇沉淀纯化得到的mRNA。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤2:通过透析进行蛋白质合成)]
按照与实施例1相同的方法进行,但使用上述mRNA。
[反应后的橡胶颗粒的收集]
按照实施例1那样地收集反应后的橡胶颗粒,并重新悬浮于等量的含有2mM二硫苏糖醇(DTT)的100M Tris缓冲液(pH7.5)中。
[CPT和NgBR与橡胶颗粒的结合验证]
按照实施例1那样地,通过SDS-PAGE验证CPT和NgBR与橡胶颗粒的结合。
此外,对无细胞蛋白质合成反应后的透析杯中的少量溶液(分离蛋白质合成溶液之前)和通过超速离心收集反应后的橡胶颗粒之后得到的上清液(分离的上清液)进行取样,并进行SDS-PAGE。
实施例2(泳道7~9)中的SDS-PAGE电泳图像如图2所示。图2显示,尽管在如箭头所示的反应后(分离蛋白质合成溶液之前),在无细胞蛋白质合成溶液中立即观察到CPT和NgBR的表达,但在用于收集橡胶颗粒的分离后获得的上清液(分离的上清液)中没有观察到,仅在反应后的橡胶颗粒部分中观察到。这证明表达的CPT和NgBR与橡胶颗粒结合。
(比较例1)
[橡胶颗粒的制备]
按照与实施例1相同的方法进行。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤1:mRNA转录反应)]
使用WEPRO7240H表达试剂盒(CellFree Sciences Co.,Ltd.)进行无细胞蛋白质合成。根据WEPRO7240H表达试剂盒的方案,使用pEU-E01-His-TEV-MCS-N2无细胞表达载体作为模板进行mRNA转录反应。
[mRNA的纯化]
转录反应后,通过乙醇沉淀纯化得到的mRNA。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤2:通过透析进行蛋白质合成)]
按照与实施例1相同的方法进行,但使用上述mRNA。
[反应后的橡胶颗粒的收集]
按照实施例1那样地收集反应后的橡胶颗粒,并重新悬浮于等量的含有2mM二硫苏糖醇(DTT)的100M Tris缓冲液(pH7.5)中。
[SDS-PAGE]
如实施例1那样使反应后的橡胶颗粒进行SDS-PAGE。
此外,对无细胞蛋白质合成反应后的透析杯中的少量溶液(分离蛋白质合成溶液之前)和通过超速离心收集反应后的橡胶颗粒之后得到的上清液(分离的上清液)进行取样,并进行SDS-PAGE。
比较例1(泳道1~3)的SDS-PAGE电泳图像示于图2中。由于比较例1是使用未引入待表达的靶基因的载体的对照实验,而图2所示的蛋白质条带主要是用于无细胞蛋白质合成反应的试剂中已经存在的蛋白质。通过比较比较例1和实施例1~3,靶蛋白的表达作为实施例1~3中新检测的蛋白质条带被观察到。
(实施例3)
[从拟南芥中提取总RNA]
通过热酚法从拟南芥中提取总RNA。在研钵中研磨用液氮冷冻的幼苗。向其中加入400μL水饱和酚(80℃)和400μLRNA提取缓冲液(80℃,100mM LiCl,100mM Tris-HCl(pH8.0),10mM EDTA和1%SDS),然后涡旋30秒。向其中加入400μL氯仿/异戊醇(24:1),然后涡旋30秒。将混合物在4℃和15,000rpm下离心15分钟,并收集上层相。将上层相与500μL的4M LiCl混合,然后在-80℃下放置1小时。将混合物在4℃和15,000rpm下离心15分钟,除去上清液,得到沉淀物,然后将其溶解于400μLDEPC处理过的水中。将溶液与880μL乙醇和40μL 3MNaOAc混合。将混合物在4℃和15,000rpm下离心15分钟,除去上清液,得到沉淀物,然后用300μL的70%乙醇洗涤。将混合物在4℃和15,000rpm下离心5分钟,除去上清液,得到沉淀物,然后将其溶解在30μLDEPC处理过的水中。为了从提取的总RNA中除去任何基因组DNA污染物,使用DNase I(Takara Bio Inc.)或DNase I重组,无RNA酶(Roche)进行DNA酶处理。在任一情况下,在制造商推荐的条件下制备50μL反应溶液,然后在37℃下温育30分钟。反应后,将溶液与350μLDEPC处理过的水和400μL苯酚混合,并在室温和15,000rpm下离心15分钟。收集上层相,并与880μL乙醇和40μL3M NaOAc混合。将混合物在4℃和15,000rpm下离心15分钟,除去上清液,得到沉淀物,然后用300μL的70%乙醇洗涤。将混合物在4℃和15,000rpm下离心,除去上清液,得到沉淀物,然后将其溶解在50μLDEPC处理过的水中。
[由总RNA合成cDNA]
按照与实施例1相同的方法进行。
[由cDNA获得CPT基因]
将制备的第1链cDNA用作模板以获得CPT基因。使用KOD-plus-Neo(Toyobo Co.,Ltd.)按照其说明书进行PCR。PCR反应涉及35个循环,每个循环由98℃下10秒,58℃下30秒,68℃下1分钟组成。
使用以下引物获得CPT基因。
引物5:5'-ggatccgatgttgtctattctctctc-3'
引物6:5'-actagttcaaacccgacagccaaatcg-3'
如上所述制备单个CPT基因(AtCPT5)。对该基因进行测序以鉴定全长核苷酸序列和氨基酸序列。AtCPT5的核苷酸序列由SEQ ID NO:11给出。AtCPT5的氨基酸序列由SEQ IDNO:12给出。
[载体构建]
将获得的DNA片段进行dA加入,然后使用pGEM-T Easy Easy vector(Promega)插入到pGEM-T Easy vector中以制备pGEM-AtCPT5。
[大肠杆菌的转化]
按照与实施例1相同的方法进行,但使用制备的载体。
[质粒提取]
按照与实施例1相同的方法进行。
[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]
用限制酶BamHI和SpeI处理上述[载体构建]中得到的pGEM-AtCPT5,并插入到已经用限制酶Bam HI和Spe I类似地处理的pEU-E01-His-TEV-MCS-N2无细胞表达载体中以制备pEU-His-N2-AtCPT5。
[大肠杆菌的转化]
按照与实施例1相同的方法进行,但使用制备的载体。
[质粒提取]
按照与实施例1相同的方法进行。
[橡胶颗粒的制备]
按照与实施例1相同的方法进行。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤1:mRNA转录反应)]
使用WEPRO7240H表达试剂盒(CellFree Sciences Co.,Ltd.)进行无细胞蛋白质合成。使用上述[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]中获得的pEU-His-N2-AtCPT5作为模板,按照WEPRO7240H表达试剂盒的方案进行mRNA转录反应。
[mRNA的纯化]
转录反应后,通过乙醇沉淀纯化得到的mRNA。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤2:通过透析进行蛋白质合成)]
按照与实施例1相同的方法进行,但使用上述mRNA。
[反应后的橡胶颗粒的收集]
如实施例1那样收集反应后的橡胶颗粒,并重新悬浮于等量的含有2mM二硫苏糖醇(DTT)的100M Tris缓冲液(pH7.5)中。
[AtCPT5与橡胶颗粒的结合验证]
通过如实施例1中的SDS-PAGE验证了AtCPT5与橡胶颗粒的结合。
此外,对无细胞蛋白质合成反应后的透析杯中的少量溶液(分离蛋白质合成溶液之前)和通过超速离心收集反应后的橡胶颗粒之后得到的上清液(分离的上清液)进行取样,并进行SDS-PAGE。
实施例3(泳道10至12)中的SDS-PAGE电泳图像显示在图2中。图2显示,尽管在如箭头所示的反应之后(在分离蛋白质合成溶液之前),在无细胞蛋白质合成溶液中立即观察到AtCPT5的表达,但在用于收集橡胶颗粒的分离后获得的上清液(分离的上清液)中没有观察到,仅在反应后的橡胶颗粒部分观察到。这证明表达的AtCPT5与橡胶颗粒结合。
[橡胶颗粒的橡胶合成活性的测定]
实施例1和比较例1中收集的反应后的橡胶颗粒的橡胶合成活性也按如下测定。
首先,将50mM Tris-HCl(pH7.5),2mM DTT,5mM MgCl 2 ,15μM法呢基二磷酸酯(FPP),100μM1-14C异戊烯基二磷酸酯([1-14C]IPP,比活性5Ci/mol)和10μL橡胶颗粒溶液混合以制备反应溶液(总共100μL),然后在30℃下反应16小时。
反应后,向溶液中加入200μL饱和NaCl,混合物用1mL二乙醚萃取,以萃取异戊烯醇等。接着,用1mL用盐水饱和的BuOH从水相中提取聚异戊二烯基二磷酸酯,然后用1mL甲苯/己烷(1:1)从水相中进一步提取超长链的聚类异戊二烯(天然橡胶),然后测定放射性。使用液体闪烁计数器通过14C计数测定各相的放射性。较高的放射性(dpm)表明较高的天然橡胶产量和较高的橡胶合成活性。
实施例1中收集的反应后的橡胶颗粒的橡胶合成活性在比较例1设定为100%的情况下为200%。
这些结果表明,与CPT结合的橡胶颗粒表现出比未结合CPT的橡胶颗粒更高的橡胶合成活性。这也证明了实施例1中CPT与橡胶颗粒结合。
(比较例2)
[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]
使用JP 2005-218357A中描述的含有GFP基因的质粒GFP/pEU(WO 01/27260)作为用于无细胞蛋白质合成的载体。
[橡胶颗粒的制备]
按照与实施例1相同的方法进行。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤1:mRNA转录反应)]
使用WEPRO7240H表达试剂盒(CellFree Sciences Co.,Ltd.)进行无细胞蛋白质合成。根据WEPRO7240H表达试剂盒的方案,使用上述[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]中获得的GFP/pEU作为模板进行mRNA转录反应。
[mRNA的纯化]
转录反应后,通过乙醇沉淀纯化得到的mRNA。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤2:通过透析进行蛋白质合成)]
按照与实施例1相同的方法进行,但使用上述mRNA。
[反应后的橡胶颗粒的收集]
如实施例1那样收集反应后的橡胶颗粒,并重新悬浮于等量的含有2mM二硫苏糖醇(DTT)的100M Tris缓冲液(pH7.5)中。
[GFP(绿色荧光蛋白质)与橡胶颗粒的结合的验证]
通过如实施例1中的SDS-PAGE验证GFP与橡胶颗粒的结合。
此外,对无细胞蛋白质合成反应后的透析杯中的少量溶液(分离蛋白质合成溶液之前)和通过超速离心收集反应后的橡胶颗粒之后得到的上清液(分离的上清液)进行取样,并进行SDS-PAGE。
比较例2(泳道1~3)的SDS-PAGE电泳图如图3所示。图3显示,尽管在如箭头所示的反应后(在分离蛋白质合成溶液之前)在无细胞蛋白质合成溶液中立即观察到GFP的表达,但仅在用于收集橡胶颗粒的分离后得到的上清液(分离的上清液)中观察到GFP的表达,而在反应后的橡胶颗粒部分未观察到GFP的表达。这证明表达的非膜结合GFP未与橡胶颗粒结合。
(比较例3)
[橡胶颗粒的制备]
橡胶颗粒通过五级离心由三叶橡胶树胶乳制备。向900mL的三叶橡胶树胶乳中加入100mL含有20mM二硫苏糖醇(DTT)的1M Tris缓冲液(pH7.5)以制备胶乳溶液。将胶乳溶液以下列不同速度分阶段离心:1,000×g,2,000×g,8,000×g,20,000×g,50,000×g。每个阶段的离心在4℃下进行45分钟。向在50,000×g下离心后留下的橡胶颗粒层中加入终浓度为1.0-2.0×CMC(临界胶束浓度CMC的1.0至2.0倍)的3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-丙磺酸盐(CHAPS)以洗涤橡胶颗粒。洗涤后,通过超速离心(40,000×g,4℃,45分钟)收集橡胶颗粒,并重新悬浮于等量的含有2mM二硫苏糖醇(DTT)的100M Tris缓冲液(pH7.5)中。
[从橡胶颗粒中分离蛋白质]
橡胶颗粒在4℃下用CHAPS以10×CMC浓度(10倍临界胶束浓度CMC)处理过夜,以分离蛋白质。处理后,通过超速离心(40,000×g,4℃,45分钟)将经洗涤的橡胶颗粒从含有分离的蛋白质的水相中分离出来。
[通过透析法将蛋白质与橡胶颗粒重新结合]
为了将蛋白质重新结合到洗涤后的橡胶颗粒上,将洗涤后的橡胶颗粒和含有分离的蛋白质的水相再次混合,并将混合物包裹在透析膜中。将透析膜浸没在体积大于内部溶液体积1000倍的外部溶液(含有2mM二硫苏糖醇(DTT)的100mM Tris缓冲液(pH7.5))中,进行透析。在每两个小时用新的外部溶液更换该外部溶液的同时,进行透析总共8小时,从而除去表面活性剂。
[橡胶颗粒的橡胶合成活性的测定]
如果通过透析过程将蛋白质重新结合到橡胶颗粒上,与透析之前相比,橡胶颗粒的橡胶合成活性将会改善。因此,将透析前的橡胶颗粒的橡胶合成活性与透析后的橡胶合成活性进行比较。如上所述测量橡胶颗粒的橡胶合成活性。
然后,以百分数表示橡胶合成活性,其中在上述[橡胶颗粒的制备]中收集的橡胶颗粒(未处理的橡胶颗粒)被设定为等于100%。
结果如表1所示。
[表1]
橡胶合成活性(%)
未处理的橡胶颗粒 100
洗涤后的橡胶颗粒(透析前) 5.6
洗涤后的橡胶颗粒(透析后) 4.3
如表1所示,橡胶颗粒的橡胶合成活性从透析前到透析后并没有提高。这表明通过仅混合橡胶颗粒和蛋白质,蛋白质不能与橡胶颗粒结合。
(序列表自由文本)
SEQ ID NO:1:引物1
SEQ ID NO:2:引物2
SEQ ID NO:3:编码来自巴西橡胶树的HRT1的基因的核苷酸序列
SEQ ID NO:4:来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列
SEQ ID NO:5:引物3
SEQ ID NO:6:引物4
SEQ ID NO:7:编码来自巴西橡胶树的HRTBP的基因的核苷酸序列
SEQ ID NO:8:来自巴西橡胶树的HRTBP的氨基酸序列
SEQ ID NO:9:引物5
SEQ ID NO:10:引物6
SEQ ID NO:11:编码来自拟南芥的AtCPT5的基因的核苷酸序列
SEQ ID NO:12:来自拟南芥的AtCPT5的氨基酸序列
序列表
<110> 住友橡胶工业株式会社
国立大学法人东北大学
<120> 与膜结合蛋白质结合的橡胶颗粒的制造方法,充气轮胎的制造方法和橡胶制品的制造方法
<130> SR2338WO
<140> PCT/JP2016/065942
<141> 2016-05-31
<150> JP 2015-131023
<151> 2015-06-30
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-1
<400> 1
tttggatccg atggaattat acaacggtga gagg 34
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-2
<400> 2
tttgcggccg cttattttaa gtattcctta tgtttctcc 39
<210> 3
<211> 873
<212> DNA
<213> 巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)
<400> 3
atggaattat acaacggtga gaggccaagt gtgttcagac ttttagggaa gtatatgaga 60
aaagggttat atagcatcct aacccagggt cccatcccta ctcatattgc cttcatattg 120
gatggaaaca ggaggtttgc taagaagcat aaactgccag aaggaggtgg tcataaggct 180
ggatttttag ctcttctgaa cgtactaact tattgctatg agttaggagt gaaatatgcg 240
actatctatg cctttagcat cgataatttt cgaaggaaac ctcatgaggt tcagtacgta 300
atggatctaa tgctggagaa gattgaaggg atgatcatgg aagaaagtat catcaatgca 360
tatgatattt gcgtacgttt tgtgggtaac ctgaagcttt taagtgagcc agtcaagacc 420
gcagcagata agattatgag ggctactgcc aacaattcca aatgtgtgct tctcattgct 480
gtatgctata cttcaactga tgagatcgtg catgctgttg aagaatcctc tgaattgaac 540
tccaatgaag tttgtaacaa tcaagaattg gaggaggcaa atgcaactgg aagcggtact 600
gtgattcaaa ttgagaacat ggagtcgtat tctggaataa aacttgtaga ccttgagaaa 660
aacacctaca taaatcctta tcctgatgtt ctgattcgaa cttctgggga gacccgtctg 720
agcaactact tactttggca gactactaat tgcatactgt attctcctca tgcactgtgg 780
ccagagattg gtcttcgaca cgtggtgtgg gcagtaatta acttccaacg tcattattct 840
tacttggaga aacataagga atacttaaaa taa 873
<210> 4
<211> 290
<212> PRT
<213> 巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)
<400> 4
Met Glu Leu Tyr Asn Gly Glu Arg Pro Ser Val Phe Arg Leu Leu Gly
1 5 10 15
Lys Tyr Met Arg Lys Gly Leu Tyr Ser Ile Leu Thr Gln Gly Pro Ile
20 25 30
Pro Thr His Ile Ala Phe Ile Leu Asp Gly Asn Arg Arg Phe Ala Lys
35 40 45
Lys His Lys Leu Pro Glu Gly Gly Gly His Lys Ala Gly Phe Leu Ala
50 55 60
Leu Leu Asn Val Leu Thr Tyr Cys Tyr Glu Leu Gly Val Lys Tyr Ala
65 70 75 80
Thr Ile Tyr Ala Phe Ser Ile Asp Asn Phe Arg Arg Lys Pro His Glu
85 90 95
Val Gln Tyr Val Met Asp Leu Met Leu Glu Lys Ile Glu Gly Met Ile
100 105 110
Met Glu Glu Ser Ile Ile Asn Ala Tyr Asp Ile Cys Val Arg Phe Val
115 120 125
Gly Asn Leu Lys Leu Leu Ser Glu Pro Val Lys Thr Ala Ala Asp Lys
130 135 140
Ile Met Arg Ala Thr Ala Asn Asn Ser Lys Cys Val Leu Leu Ile Ala
145 150 155 160
Val Cys Tyr Thr Ser Thr Asp Glu Ile Val His Ala Val Glu Glu Ser
165 170 175
Ser Glu Leu Asn Ser Asn Glu Val Cys Asn Asn Gln Glu Leu Glu Glu
180 185 190
Ala Asn Ala Thr Gly Ser Gly Thr Val Ile Gln Ile Glu Asn Met Glu
195 200 205
Ser Tyr Ser Gly Ile Lys Leu Val Asp Leu Glu Lys Asn Thr Tyr Ile
210 215 220
Asn Pro Tyr Pro Asp Val Leu Ile Arg Thr Ser Gly Glu Thr Arg Leu
225 230 235 240
Ser Asn Tyr Leu Leu Trp Gln Thr Thr Asn Cys Ile Leu Tyr Ser Pro
245 250 255
His Ala Leu Trp Pro Glu Ile Gly Leu Arg His Val Val Trp Ala Val
260 265 270
Ile Asn Cys Gln Arg His Tyr Ser Tyr Leu Glu Lys His Lys Glu Tyr
275 280 285
Leu Lys
290
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-3
<400> 5
tttctcgaga tggatttgaa acctggagct g 31
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-4
<400> 6
tttctcgagt catgtaccat aattttgctg cac 33
<210> 7
<211> 774
<212> DNA
<213> 巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)
<400> 7
atggatttga aacctggagc tggagggcag agagttaatc gattagtgga tccgattagt 60
tatcattttc ttcaatttct gtggcgtact ctacatcttc ttgtcagctt atggtacctt 120
caagttagta tggtccaaat gatcgaaggc tttctaatct ctagtggact tgtgaaacgc 180
tatggagccc tcgatattga caaggtccgg taccttgcca ttgtggtaga tagtgaagaa 240
gcttaccaaa tttctaaagt tattcagctt ttgaaatggg tggaagatat gggtgtgaaa 300
catttatgcc tctatgattc aaaaggagtt ctcaagacaa acaagaaaac catcatggag 360
agtttgaaca atgctatgcc atttgaggaa gcagttgaaa aagatgtttt actggaccag 420
aaacagatga ctgtggaatt tgcttccagc tccgatggaa aggaagcaat aaccagggca 480
gctaacgtac tctttatgaa gtatttgaag tatgctaaaa ctggtgtagg aaaggaagaa 540
ccatgcttta cagaagatca aatggatgag gcactaaaag ctataggtta caaagggccg 600
gaacctgact tgctattaat ttatggacct gttagatgcc atctaggttt ctcaccgtgg 660
agacttcgat atactgagat ggtgcatatg ggacccttga ggtacatgaa cctcggttca 720
ctaaaaaagg ccattcacag gttcacaaca gtgcagcaaa attatggtac atga 774
<210> 8
<211> 257
<212> PRT
<213> 巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)
<400> 8
Met Asp Leu Lys Pro Gly Ala Gly Gly Gln Arg Val Asn Arg Leu Val
1 5 10 15
Asp Pro Ile Ser Tyr His Phe Leu Gln Phe Leu Trp Arg Thr Leu His
20 25 30
Leu Leu Val Ser Leu Trp Tyr Leu Gln Val Ser Met Val Gln Met Ile
35 40 45
Glu Gly Phe Leu Ile Ser Ser Gly Leu Val Lys Arg Tyr Gly Ala Leu
50 55 60
Asp Ile Asp Lys Val Arg Tyr Leu Ala Ile Val Val Asp Ser Glu Glu
65 70 75 80
Ala Tyr Gln Ile Ser Lys Val Ile Gln Leu Leu Lys Trp Val Glu Asp
85 90 95
Met Gly Val Lys His Leu Cys Leu Tyr Asp Ser Lys Gly Val Leu Lys
100 105 110
Thr Asn Lys Lys Thr Ile Met Glu Ser Leu Asn Asn Ala Met Pro Phe
115 120 125
Glu Glu Ala Val Glu Lys Asp Val Leu Leu Asp Gln Lys Gln Met Thr
130 135 140
Val Glu Phe Ala Ser Ser Ser Asp Gly Lys Glu Ala Ile Thr Arg Ala
145 150 155 160
Ala Asn Val Leu Phe Met Lys Tyr Leu Lys Tyr Ala Lys Thr Gly Val
165 170 175
Gly Lys Glu Glu Pro Cys Phe Thr Glu Asp Gln Met Asp Glu Ala Leu
180 185 190
Lys Ala Ile Gly Tyr Lys Gly Pro Glu Pro Asp Leu Leu Leu Ile Tyr
195 200 205
Gly Pro Val Arg Cys His Leu Gly Phe Ser Pro Trp Arg Leu Arg Tyr
210 215 220
Thr Glu Met Val His Met Gly Pro Leu Arg Tyr Met Asn Leu Gly Ser
225 230 235 240
Leu Lys Lys Ala Ile His Arg Phe Thr Thr Val Gln Gln Asn Tyr Gly
245 250 255
Thr
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-5
<400> 9
ggatccgatg ttgtctattc tctcttc 27
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-6
<400> 10
actagttcaa acccgacagc caaatcg 27
<210> 11
<211> 909
<212> DNA
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 11
atgttgtcta ttctctcttc tcttttatct ctcctttttc tgtttatcat ctcttgtttc 60
ttcatcacaa gccatttttg gttccctctt tccttgccaa aaatactcgg attcatcaaa 120
atcacatctt cgagagacga ttatgacaac gagcaacgtg acgagggaac ttatgtggta 180
ggagtggagg agctacaaag agagctgatg ccaagacatg tggcagtgat aatggacgga 240
aaccggagat gggccaaacg ggccggattg ctgacgtcac aaggccacga ggccggagct 300
aaacggctta tagagttctc cgagctttgc tttaaattgg ggattcatac agtttcagct 360
tttgccttct ccacagagaa ttggggaaga cacaagattg aggttaagtg cttgatgtct 420
ttgatccaac attacctcaa gtccaagatc caatatttcc aaagagagga aactcgagtt 480
tctgttatcg ggaacctaac gaagatccct gagtctctcc tccgaacagt ccaagagata 540
gaggaagcta cgagaagcta taagaagaag catctcatat tggcaataga ttacagcggg 600
agattagaca tcttgcgagc ttgcaagagt attgtgaaga aatcagaaaa agggttgatc 660
cgagaggaag atgtagacga ggcattgatc gaaagagagc ttctgacaaa ttgtactgag 720
ttcccaagtc ctgatctatt gattaggaca agtggagaac agaggattag taacttcttc 780
ttgtggcaac ttgcttatac agagctcttc ttctcgccgg tcctttggcc tgatttcgat 840
aaggataagc ttctagaggc cctggtttcg tatcagcgcc gggaaagacg atttggctgt 900
cgggtttga 909
<210> 12
<211> 302
<212> PRT
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 12
Met Leu Ser Ile Leu Ser Ser Leu Leu Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ile
1 5 10 15
Ile Ser Cys Phe Phe Ile Thr Ser His Phe Trp Phe Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Pro Lys Ile Leu Gly Phe Ile Lys Ile Thr Ser Ser Arg Asp Asp Tyr
35 40 45
Asp Asn Glu Gln Arg Asp Glu Gly Thr Tyr Val Val Gly Val Glu Glu
50 55 60
Leu Gln Arg Glu Leu Met Pro Arg His Val Ala Val Ile Met Asp Gly
65 70 75 80
Asn Arg Arg Trp Ala Lys Arg Ala Gly Leu Leu Thr Ser Gln Gly His
85 90 95
Glu Ala Gly Ala Lys Arg Leu Ile Glu Phe Ser Glu Leu Cys Phe Lys
100 105 110
Leu Gly Ile His Thr Val Ser Ala Phe Ala Phe Ser Thr Glu Asn Trp
115 120 125
Gly Arg His Lys Ile Glu Val Lys Cys Leu Met Ser Leu Ile Gln His
130 135 140
Tyr Leu Lys Ser Lys Ile Gln Tyr Phe Gln Arg Glu Glu Thr Arg Val
145 150 155 160
Ser Val Ile Gly Asn Leu Thr Lys Ile Pro Glu Ser Leu Leu Arg Thr
165 170 175
Val Gln Glu Ile Glu Glu Ala Thr Arg Ser Tyr Lys Lys Lys His Leu
180 185 190
Ile Leu Ala Ile Asp Tyr Ser Gly Arg Leu Asp Ile Leu Arg Ala Cys
195 200 205
Lys Ser Ile Val Lys Lys Ser Glu Lys Gly Leu Ile Arg Glu Glu Asp
210 215 220
Val Asp Glu Ala Leu Ile Glu Arg Glu Leu Leu Thr Asn Cys Thr Glu
225 230 235 240
Phe Pro Ser Pro Asp Leu Leu Ile Arg Thr Ser Gly Glu Gln Arg Ile
245 250 255
Ser Asn Phe Phe Leu Trp Gln Leu Ala Tyr Thr Glu Leu Phe Phe Ser
260 265 270
Pro Val Leu Trp Pro Asp Phe Asp Lys Asp Lys Leu Leu Glu Ala Leu
275 280 285
Val Ser Tyr Gln Arg Arg Glu Arg Arg Phe Gly Cys Arg Val
290 295 300