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1. (WO2019038461) ATTENUATED INFLUENZA VIRUS AND USE THEREOF AS A VACCINE
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DESCRIPCIÓN

Virus de la gripe atenuado y su uso corno vacuna

La invención se refiere a un virus de la gripe A recombinante atenuado y a su uso como vacuna contra la gripe. Por lo tanto, la invención pertenece al campo de la medicina y la inmunología, principalmente, el tratamiento profiláctico y terapéutico de la infección por el virus de la gripe.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Los virus de la gripe (Orthomyxoviridae) son virus de ARN de cadena negativa con envoltura con un genoma segmentado. Se dividen en dos géneros: uno que incluye virus de la gripe A y B y el otro que consiste en virus de la gripe C, basado en diferencias antigénicas significativas entre su nucleoproteína y las proteínas de la matriz. Los tres tipos de virus también difieren en patogenicidad y organización genómica. El tipo A se encuentra en una amplia gama de animales de sangre caliente, pero los tipos B y C son predominantemente patógenos humanos. Los virus de la gripe A se subdividen adicionalmente por la caracterización antigénica de la hemaglutinina (HA) y las glicoproteínas de superficie de NA que se proyectan desde la superficie del virión. Actualmente hay 15 subtipos de HA y nueve subtipos de NA. Los virus de la gripe A infectan una gran variedad de animales, incluyendo aves, cerdos, caballos, seres humanos y otros mamíferos. Las aves acuáticas sirven como reservorio natural para todos los subtipos conocidos de el virus de la gripe A y probablemente son la fuente de material genético para las cepas de influenza pandémica humana.

A diferencia de los paramixovirus relacionados, los virus de la gripe tienen un genoma de ARN segmentado. Los virus de la gripe A y B contienen ocho segmentos de genes discretos que codifican al menos una proteína cada uno y están cubiertos con proyecciones de tres proteínas: HA, NA, y matriz 2 (M2). Cada segmento de ARN del virus de la gripe está encapsidado por nucleoproteínas (NP) para formar complejos de ribonucleoproteína (RNP). Las tres proteínas de la polimerasa están asociadas con el extremo del complejo RNP. Las RNP están

rodeadas por una membrana con la proteína de matriz (matriz 1) como parte integral. La porción de fosfolípidos de la envoltura se deriva de la membrana de la célula hospedadora. También se encuentra dentro de la partícula vírica la proteína no estructural 2 (NS2). Las pautas de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para la nomenclatura de los virus de la gripe son las siguientes. Primero, se designa el tipo de virus (A, B o C), luego el hospedador (si no es humano), el lugar de aislamiento, el número de aislamiento y el año de aislamiento (separados por barras). Para la gripe A, los subtipos HA y NA se indican entre paréntesis. Por ejemplo, las cepas incluidas en la vacuna trivalente reciente son: al menos una cepa A (H1N1) tipo pdm09, otra H3N2 y una cepa B. Desde 1977, ha habido dos subtipos del virus de la gripe A que circulan entre los humanos: H1 N1 y H3N2. (La composición actual recomendada de la vacuna contra la gripe incluye (datos de la OMS): Virus tipo A/Michigan/45/2015 (H1 N1)pdm09; un virus tipo A/Hong Kong/4801 2014 (H3N2); y un virus tipo B/Brisbane/60/2008).

Las cepas de gripe pueden caracterizarse antigénicamente aprovechando la capacidad de los virus de la gripe para aglutinar eritrocitos in vitro, o pueden caracterizarse genéticamente mediante la comparación de secuencias de los segmentos génicos individuales. Las directrices de la OMS y los Centros Colaboradores de la OMS brindan orientación sobre la identificación de la identidad individual de los segmentos de ARN que comprenden el genoma de la gripe; los segmentos de ácido nucleico del virus de la gripe A y B que codifican la nucleoproteína (NP), la polimerasa básica 1 (PB1), la polimerasa básica 2 (PB2), la polimerasa ácida (PA), la hemaglutinina (HA), la neuraminidasa (NA), las proteínas matri cíales (M1 y M2) y la proteína no estructural (NS1 y NS2), y los segmentos de ácido nucleico del virus de la gripe C que codifican la nucleoproteína (NP), la polimerasa básica 1 (PB1), la polimerasa básica 2 (PB2) , la glicoproteína de tipo hemaglutinina-neuraminidasa (HN), las proteínas de matriz (M1 y M2), y la proteína no estructural (NS1 y NS2).

El aislamiento del virus, la prueba de inhibición de la hemaglutinación (IH), la detección del antígeno mediante inmunoensayo, las pruebas serológicas, la demostración de la actividad de NA en las secreciones, o los ensayos de base molecular pueden realizarse para el diagnóstico específico de la infección por el virus de la gripe. Las muestras se pueden recolectar como esputo, hisopos nasofaríngeos, o lavados nasofaríngeos obtenidos mediante gárgaras de una solución salina tamponada. El estándar para el diagnóstico de la gripe ha sido la caracterización inmunológica después del cultivo. El análisis serológico proporciona un método preciso pero retrospectivo para la infección por virus de la gripe porque requiere la recolección de sueros tanto agudos como convalecientes.

Como resultado de una mayor esperanza de vida en muchos países, muchas más personas corren el riesgo de complicaciones, la carga de los sistemas de atención médica durante las epidemias de gripe es más ampliamente reconocida, y los viajes internacionales más frecuentes han creado oportunidades para la propagación del virus, mientras que la introducción de nuevos productos ha aumentado las opciones para la prevención y el tratamiento de la enfermedad. Aproximadamente 50 países cuentan con programas nacionales de inmunización contra la gripe financiados por el gobierno y la vacuna está disponible en muchos otros. Las recomendaciones específicas para el uso de la vacuna varían, pero generalmente implican inmunización anual para individuos de edad avanzada y aquellos mayores de 6 meses que tienen un mayor riesgo de enfermedad grave debido a una afección médica crónica preexistente. En algunos países, la vacuna se usa para reducir la propagación de la gripe a aquellos con mayor riesgo médico.

Las vacunas inactivadas se clasifican en varios tipos, dependiendo de si contienen partículas de virus completas, partículas de virus parcialmente alteradas (vacunas divididas) o antígenos de envoltura purificada (vacunas de subunidad). Algunas vacunas de subunidades se han combinado con un adyuvante o sistema de administración. Algunos países han autorizado vacunas atenuadas contra la gripe para ciertos grupos diana. Se han utilizado dos formulaciones diferentes de 1 vacuna en adultos y niños sanos en la Federación de Rusia, y se ha ensayado exhaustivamente otra vacuna viva. Sin embargo, hasta que las vacunas vivas atenuadas estén más ampliamente disponibles, aún no se recomiendan generalmente para la prevención de la gripe. Se han desarrollado dos clases de agentes antivirales para la prevención y el tratamiento de la gripe. Los inhibidores de M2, amantadina y rimantadina, están limitados al tratamiento de virus de la gripe A y también se ha informado que son eficaces en la prevención de la infección. Si bien ambos productos causan algunos efectos secundarios, los efectos secundarios neurológicos significativos son más comunes con la amantadina. Los inhibidores de la neuraminidasa, tales como zanamivir y oseltamivir, se han autorizado recientemente para el tratamiento de la gripe de tipo A y B en varios países, y se ha informado que son eficaces para la profilaxis. Se han detectado mutantes resistentes en pacientes que reciben ambas clases de agente antiviral. Si bien esto no se considera actualmente un problema importante de salud pública, la situación puede cambiar si estos medicamentos se usan a gran escala.

Ya se ha demostrado que las vacunas actuales contra la gripe no protegen a las personas sin tratar, un hecho que adquiere importancia inmediata en caso de un brote de gripe pandémica cuando muchas personas que no han tenido una infección de gripe antes están entonces en riesgo. Los virus generalmente inician su ciclo de vida uniéndose a los receptores de la superficie de la célula hospedadora, entrando en las células y desproveyéndolas de su ácido nucleico viral, seguido de la replicación del genoma viral. Después de que se sintetizan nuevas copias de proteínas víricas y genes, estos componentes se ensamblan en viriones de progenie, que después salen de la célula. Durante la etapa de ensamblaje, el virus de progenie debe seleccionar su ácido nucleico genómico de manera eficiente a partir de un gran conjunto de ácidos nucleicos virales y celulares presentes en el citoplasma. El empaquetamiento de genomas virales en viriones típicamente implica el reconocimiento por parte de componentes virales de una secuencia de actuación cis en el ácido nucleico viral, la denominada "señal de empaquetamiento".

Las partículas del virus de la gripe defectuosas pueden ser útiles como candidatas a vacunas porque inducirán anticuerpos contra otras proteínas víricas además de HA y NA y, si pueden entrar en la célula hospedadora, porque pueden inducir respuestas inmunes celulares contra el virus (por ejemplo, linfocitos T auxiliares, linfocitos T citotóxicos), además de las respuestas humorales. Hasta ahora, la producción de partículas defectuosas del virus de la gripe se ha logrado por transfección, reduciendo las posibilidades de producir grandes cantidades de dichas partículas. Una alternativa a este enfoque será producir partículas de virus que son condicionalmente defectuosas, lo que les permite replicar en un sistema de

producción definido, pero no en células normales o sistemas de producción. Con este fin, las células del sistema de producción se modificarían para permitir la producción de uno o más de los genes del virus de la gripe o productos genéticos, permitiendo la complementación trans de una partícula defectuosa del virus de la gripe. En el laboratorio, se ha observado la complementación trans de partículas del virus de la gripe cuando los virus de la gripe de interferencia defectuosa se complementan en las mismas células por virus que portan la versión de tipo silvestre del segmento del gen interferente defectuoso. Este "sistema natural" de complementación trans no es útil para producir partículas del virus de la gripe condicionalmente defectuoso definidas. En primer lugar, este sistema requiere la complementación de un virus (parcialmente) defectuoso por al menos un virus (parcialmente) competente de replicación que puede dar como resultado la producción no deseada de virus completamente infecciosos. En segundo lugar, debido a que la producción de partículas interferentes defectuosas se produce al azar para los diferentes segmentos de genes, no es posible producir partículas de virus condicionalmente defectuosas definidas.

Las partículas del virus de la gripe condicionalmente defectuosas pueden basarse en la eliminación de segmentos genéticos completos o partes de los mismos. La capacidad de producir partículas de virus definidas condicionalmente defectuosas eliminando segmentos genéticos enteros (y produciendo uno o más productos genéticos codificados in-trans) será limitada si el empaquetamiento del genoma del virus de la gripe depende de la presencia de los 8 segmentos, que es un tema de mucho debate (véase en otra parte de esta descripción). Si el proceso de empaquetamiento requiere la presencia de los 8 segmentos de genes, no se sabe si todos los segmentos de genes deben estar presentes en una forma de longitud completa, lo que complica aún más la producción de partículas de virus condicionalmente defectuosas.

Por lo tanto, existe en el estado de la técnica la necesidad de proporcionar nuevas partículas virales del virus de la gripe que puedan usarse como vacunas contra la infección por virus de la gripe y superar las deficiencias de la técnica anterior.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han descubierto que una mutación de poiimerasa detectada en un caso de virus de la gripe A letal (F-IAV), concretamente, la mutación D529N de la subunidad PA (PA) de la poiimerasa viral, se asocia con una producción reducida de genomas vírales defectuosos (DVG) y un resultado grave de la invención, lo que sugiere que la baja abundancia de DVG constituye un nuevo marcador de virulencia patogénica en seres humanos que puede identificarse mediante la detección de la mutación PA D529N. Adicionalmente, durante los ensayos realizados por los inventores para llegar a esta conclusión, encontraron que una mutación en la subunidad PB2 de la poiimerasa del virus de la gripe A (F-IAV), concretamente la mutación PB2 A221T, está asociada con una alta producción de DVG y una leve gravedad de la infección de gripe A.

Los inventores analizaron virus recombinantes portadores de las mutaciones identificadas en un virus de resultado letal (F-IAV, mutaciones PB2 A221T y PA D529N) o en otros segmentos del IAV, tal como las mutaciones M1 S30N y M2 V86S (véanse los Ejemplos). Mientras que la mutación no patogénica PB2 A221T acumula altos niveles de DVG en células cultivadas y se atenúa en ratones (dando como resultado una baja gravedad de la infección por IAV), la mutación PA D529N reduce la acumulación de DVG en solitario o junto con un cambio PB2 A221T (Figura 5A) o con mutaciones M1 S30N y M2 V86S (Figura 5C) (que da como resultado una alta gravedad de la infección por A IV). Adicionalmente, la actividad de la poiimerasa y la velocidad de replicación vírica no se ven significativamente afectadas en estos virus.

Estos hallazgos permiten al experto en la materia usar mutaciones PB2 A221T y PA D529N como indicativas de la gravedad de una infección por virus de la gripe A (IAV), y desarrollar IAV atenuados útiles como vacunas debido a la presencia de dichas mutaciones en sus genomas, en solitario o junto con otras mutaciones tales como M1 S30N y M2 V86S. En vista de lo anterior, a continuación se describirá un conjunto de aspectos inventivos.

Polinucleótidos de la invención

En un aspecto, la invención se refiere a un polinucieótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de polimerasa ácida (PA) del virus de la gripe A (AIV), en lo sucesivo en el presente documento polinucieótido I de la invención, donde dicha proteína PA comprende

(a) una secuencia de aminoácidos que comprende una identidad de secuencia de, al menos, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % con la SEQ ID NO: 1 , y

(b) una sustitución de aminoácidos en la posición D529N correspondiente a la posición 529 de la SEQ ID NO: 1 determinada por el alineamiento óptimo de ambas secuencias.

Como se usa en el presente documento, el término "polinucieótido" se refiere a un biopolímero compuesto por 13 o más monómeros de nucleótidos unidos covalentemente en una cadena. Como se usa en el presente documento, los términos "aislado" y/o "purificado" se refieren a la preparación, aislamiento y/o purificación in vitro de una molécula de ácido nucleico tal como un vector o un virus de la invención, de manera que no se asocia con sustancias in vivo, o se purifica sustancialmente a partir de sustancias in vitro.

En el presente aspecto, el polinucieótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína PA de IAV. La proteína PA del IAV desempeña un papel esencial en la transcripción y replicación del ARN viral formando el complejo de la polimerasa heterotrimérica junto con las subunidades PB1 y PB2. El complejo transcribe ARNm virales mediante el uso de un mecanismo único denominado robo de estructuras CAP que consiste en el secuestro y escisión de los pre-ARNm con estructura CAP de la célula hospedadora. Estos ARN cortos se usan luego como cebadores para la transcripción de los ARNm virales. La proteína PA del IAV tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 1 (GenBank: ACP44156.1)

El polinucleótido I de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína PA del virus de la gripe A que comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de, al menos, el 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % con la SEQ ID NO: 1 y una sustitución de aminoácidos en la posición D529N correspondiente a la posición 529 de la SEQ ID NO: 1 determinada por el alineamiento óptimo de ambas secuencias.

En la presente invención, "identidad" o "identidad de secuencia" se entiende que se refiere al grado de similitud entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos obtenidas alineando las dos secuencias. Dependiendo del número de residuos comunes entre las secuencias alineadas, se obtendrá un grado diferente de identidad, expresado como un porcentaje. Se dice que las secuencias de nucleótidos son homologas cuando exhiben un cierto grado de identidad. El grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar mediante métodos convencionales, por ejemplo, mediante algoritmos de alineamiento de secuencias estándar conocidos en el estado de la técnica, tales como, por ejemplo, BLAST [Altschul S.F. et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990 Oct 5; 215(3): 403-10], Los programas BLAST, por ejemplo, BLASTN, BLASTX y T BLASTX, BLASTP y TBLASTN, son de dominio público en el sitio web del The National Center for Biotechonology Information (NCBI). El experto en la técnica entiende que las mutaciones en la secuencia de nucleótidos de los genes que conducen a sustituciones conservadoras de aminoácidos en posiciones no críticas para la funcionalidad de la proteína son mutaciones evolutivamente neutras que no afectan a su estructura global o su funcionalidad.

Además, la proteína PA de la presente invención comprende una sustitución de aminoácidos en la posición D529N correspondiente a la posición 529 de la SEQ ID NO: 1. Como sabe el experto, una sustitución se refiere al reemplazo del aminoácido que ocupa una posición con un aminoácido diferente. Por lo tanto, la secuencia de aminoácidos de la proteína PA de la presente invención comprende una asparagina (N) en la posición correspondiente o equivalente a la posición 529 de la SEQ ID NO: 1, donde dicha posición equivalente se determina por alineamiento óptimo de ambas secuencias (La herramienta básica de alineamiento local se ha descrito en el párrafo anterior). La secuencia SEQ ID NO: 1 muestra un ácido aspártico (D) en la posición 529 que, en la proteína PA de la presente invención, se reemplaza con una asparagina (N), dando lugar a la mutación D529N.

El término "posición" cuando se usa de acuerdo con la descripción se refiere a la posición de un aminoácido dentro de una secuencia de aminoácidos representada en el presente documento o la posición de un nucleótido dentro de una secuencia de ácido nucleico representada en el presente documento. La expresión "posición correspondiente" como se usa en el presente documento también incluye que una posición no solo está determinada por el número de nucleótidos/aminoácidos anteriores, sino que se debe ver más bien en el contexto de la porción circunyacente de la secuencia. Por consiguiente, la posición de un nucleótido dado de acuerdo con la descripción que puede estar sustituido puede variar debido a la deleción o adición de nucleótidos en cualquier parte de una secuencia de nucleótidos del virus de la gripe (mutante o silvestre), incluyendo el promotor y/o cualquier otra secuencia reguladora o gen (incluyendo exones e intrones). Para determinar si un residuo de aminoácido de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido del virus de la gripe, que es diferente de un residuo de aminoácido de un polipéptido de un polipéptido conocido, corresponde a una cierta posición en la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido conocido, un experto en la técnica puede usar medios y métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, alineamientos, ya sea manualmente o mediante el uso de programas informáticos tales como BLAST2.0, cualquier otro programa adecuado que sea adecuado para generar alineamientos de secuencia.

Como se ha explicado previamente, el polinucleótido I de la invención puede comprender otras secuencias de nucleótidos que codifican proteínas mutantes adicionales. Por lo tanto, en una realización particular, el polinucleótido I de la invención comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de polimerasa 2 básica (PB2) del virus de gripe A que comprende

(a) una secuencia de aminoácidos que comprende una identidad de secuencia de, al menos, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % con la SEQ ID NO: 2, y

(b) una sustitución de aminoácidos en la posición A221T correspondiente a la posición 221 de la SEQ ID NO: 2 determinada por el alineamiento óptimo de ambas secuencias.

La proteína PB2 del IAV es la proteína básica de la polimerasa 2 responsable de la unión de la 5' cap de los pre-ARNm celulares que posteriormente se escinden después de 10-13 nucleótidos por la subunidad PA que lleva la actividad endonucleasa. Desempeña un papel en el inicio de la replicación del genoma viral y modula la actividad del complejo de ribonucleoproteína (RNP). Además, participa en la inhibición de la inducción de interferón de tipo I a través de la interacción e inhibición de la proteína de señalización antiviral mitocondrial MAVS. La proteína PB2 del IAV comprende la secuencia SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO: 2 (GenBank: ACP44157.1)


La proteína PB2 codificada por el polinucleótido i de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que comprende una identidad de secuencia de, al menos, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % con la SEQ ID NO: 2, y (b) una sustitución de aminoácidos en la posición A221T correspondiente a la posición 221 de la SEQ ID NO: 2 determinada por el alineamiento óptimo de ambas secuencias.

La proteína PB2 de la presente invención comprende una sustitución de aminoácidos en la posición A221T correspondiente a la posición 221 de la SEQ ID NO: 2. Esto significa que la secuencia de aminoácidos de la proteína PB2 de la presente invención comprende una alanina (A) en la posición equivalente o correspondiente a la posición 221 de la SEQ ID NO: 2, donde dicha posición equivalente se determina por alineamiento óptimo de ambas secuencias (La herramienta básica de alineamiento local se ha descrito en los párrafos anteriores). La secuencia SEQ ID NO: 2 muestra una treonina (T) en la posición 221 que, en la proteína PB2 de la presente invención, se reemplaza con una alanina (A), dando lugar a la mutación A221T.

En otra realización particular, el polinucleótido I de la invención comprende además

(i) una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de matriz 1 (M1) del virus de la gripe A que comprende

(a) una secuencia de aminoácidos que comprende una identidad de secuencia de, al menos, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % con la SEQ ID NO: 3, y (b) una sustitución de aminoácidos en la posición S30N correspondiente a la posición 30 de la SEQ ID NO: 3 determinada por el alineamiento óptimo de ambas secuencias, y/o

(ii) una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de matriz 2 (M2) del virus de la gripe A que comprende

(a) una secuencia de aminoácidos que comprende una identidad de secuencia de, al menos, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % con la SEQ ID NO: 4 determinada por el alineamiento óptimo de ambas secuencias, y

(b) una sustitución de aminoácidos en la posición V86S correspondiente a la posición 86 de la SEQ ID NO: 4.

La proteína M1 de IAV desempeña un papel crítico en la replica ción del virus, desde la entrada del virus y el desrevestimiento al ensamblaje y la gemación de la partícula del virus. Durante la entrada del virus en la célula, el canal iónico M2 acidifica el núcleo del virión interno, induciendo la disociación M1 de la ribonucleoproteína (RNP). Las RNP libres de M1 se transportan al núcleo, donde puede tener lugar la transcripción y replicación vírica. La proteína M1 del IAV comprende la secuencia SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 3 (GenBank: ACP44152.1)


La proteína M1 codificada por el polinucleótido I de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que comprende una identidad de secuencia de, al menos, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % con la SEQ ID NO: 3, y (b) una sustitución de aminoácidos en la posición S30N correspondiente a la posición 30 de la SEQ ID NO: 3 determinada por el alineamiento óptimo de ambas secuencias.

La proteína M1 de la presente invención comprende una sustitución de aminoácidos en la posición S30N correspondiente a la posición 30 de la SEQ ID NO: 3. Esto significa que la secuencia de aminoácidos de la proteína M1 de la presente invención comprende una serina (S) en la posición equivalente o correspondiente a la posición 30 de la SEQ ID NO: 3, donde dicha posición equivalente se determina por alineamiento óptimo de ambas secuencias (La herramienta básica de

alineamiento local se ha descrito en los párrafos anteriores). La secuencia SEQ ID NO: 3 muestra una asparagina (N) en la posición 30 que, en la proteína M1 de la presente invención, se reemplaza con una serina (S), dando lugar a la mutación S30N.

La proteína M2 de IAV forma un canal iónico selectivo de protones que es necesario para la liberación eficiente del genoma viral durante la entrada del virus. Después de unirse a la superficie de la célula, el virión entra en la célula por endocitosis. La acidificación del endosoma desencadena la actividad del canal iónico M2. Se cree que la entrada de protones en el interior del virión interrumpe las interacciones entre la ribonucleoproteína vírica (RNP), la proteína de matriz 1 (M1) y las bicapas lipídicas, liberando de este modo el genoma viral de la interacción con proteínas víricas y permitiendo que los segmentos de ARN migren al núcleo de la célula hospedadora, donde se produce la transcripción y replicación del ARN del virus de la gripe. También desempeña un papel en la ruta secretora de las proteínas víricas. La proteína M2 del IAV comprende la secuencia SEQ ID NO: 4.

SEQ ID NO: 4 (GenBank: ACP44153.1)

La proteína M2 codificada por el polinucleótido de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que comprende una identidad de secuencia de, al menos, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % con la SEQ ID NO: 4, y (b) una sustitución de aminoácidos en la posición V86S correspondiente a la posición 86 de la SEQ ID NO: 4 determinada por el alineamiento óptimo de ambas secuencias.

La proteína M2 de la presente invención comprende una sustitución de aminoácidos en la posición V86S correspondiente a la posición 86 de la SEQ ID NO: 4. Esto significa que la secuencia de aminoácidos de la proteína M2 de la presente invención comprende una valina (V) en la posición equivalente o correspondiente a la posición 86 de la SEQ ID NO: 4, donde dicha posición equivalente se determina por alineamiento óptimo de ambas secuencias (La herramienta básica de

alineamiento local se ha descrito en los párrafos anteriores). La secuencia SEQ ID NO: 4 muestra una serína (S) en la posición 86 que, en la proteína M2 de la presente invención, se reemplaza con una valina (V), dando lugar a la mutación V86S.

Como se ha explicado al comienzo de la presente invención, los inventores han encontrado que una mutación en la polimerasa 2 básica (PB2) del virus de la gripe A (F-IAV), concretamente la mutación PB2 A221T, está asociada con una alta producción de DVG y una leve gravedad de la infección de gripe A.

Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de polimerasa básica 2 (PB2) del virus de la gripe A, en lo sucesivo en el presente documento polinucleótido II de la invención, donde dicha proteína PB2 comprende

(a) una secuencia de aminoácidos que comprende una identidad de secuencia de, al menos, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % con la SEQ ID NO: 2, y (b) una sustitución de aminoácidos en la posición A221T correspondiente a la posición 221 de la SEQ ID NO: 2 determinada por el alineamiento óptimo de ambas secuencias.

En una realización particular, el polinucleótido II de la invención comprende además (i) una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de matriz 1 (M1) del virus de la gripe A que comprende

(a) una secuencia de aminoácidos que comprende una identidad de secuencia de, al menos, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % con la SEQ ID NO: 2 determinada por el alineamiento óptimo de ambas secuencias, y

(b) una sustitución de aminoácidos en la posición S30N correspondiente a la posición 30 de la SEQ ID NO: 3 determinada por el alineamiento óptimo de ambas secuencias, y/o

(¡i) una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de matriz 2 (M2) del virus de la gripe A que comprende

(a) una secuencia de aminoácidos que comprende una identidad de secuencia de, al menos, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % con la SEQ ID NO: 3, y

(b) una sustitución de aminoácidos en la posición V86S correspondiente a la

posición 86 de la SEQ ID NO: 4 determinada por el alineamiento óptimo de ambas secuencias.

Por lo tanto, en vista de lo anterior, la presente invención incluye

- un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína PB2 mutante de IAV;

- un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína PB2 mutante de IAV y una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína M1 mutante de IAV;

- un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína PB2 mutante de IAV y una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína M2 mutante de IAV; y

- un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína PB2 mutante de IAV, una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína mutante M1 de IAV y una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína mutante M2 de IAV.

La expresión "proteína de polimerasa 2 básica", "proteína M1", "proteína M2" y las mutaciones correspondientes "A221T", "S30N" y "V86S" respectivamente, se han explicado en párrafos anteriores, así como las expresiones "identidad de secuencia" y "sustitución de aminoácidos".

Como se usa en el presente documento, el término "polinucleótido" se refiere a un biopolímero compuesto por 13 o más monómeros de nucleótidos unidos covalentemente en una cadena, dando como resultado una molécula de ácido nucleico. La expresión "molécula de ácido nucleico" como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier ácido nucleico en cualquier configuración posible, tal como monocatenario, bicatenario o una combinación de los mismos. Los ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo, moléculas de ADN, moléculas de ARN, análogos del ADN o ARN generados usando análogos de nucleótidos o utilizando química de ácidos nucleicos, moléculas de ácidos nucleicos bloqueadas (LNA), moléculas de ácidos nucleicos de proteínas (PNA) y moléculas de tecto-ARN. El ADN o ARN puede ser de origen genómico o sintético y puede ser monocatenario o bicatenario.

Dicho ácido nucleico puede ser, por ejemplo, ARNm, ARNc, ARNv, ARN sintético, ADN genómico, ADN sintético de ADNc, un copolímero de ADN y ARN, oligonucleótidos, polímeros mixtos, cadenas tanto de sentido como antisentido, o puede contener bases de nucleótidos no naturales o derivatizadas. Sin embargo, en otra realización particular, los polinucleótidos I y II de la invención son ADN o ARN. Un ácido nucleico respectivo puede contener además análogos de nucleótidos no naturales y/o estar unido a una etiqueta de afinidad o a un marcador. Cuando se hace referencia en el presente documento, los términos y expresiones "secuencia(s) de nucleótidos", "polinucleótido(s)", "secuencia(s) de ácidos nucleicos", "ácido(s) nucleico", "molécula de ácido nucleico" se usan indistintamente.

Se conocen muchos análogos de nucleótidos y pueden emplearse en los métodos de la invención. Un análogo de nucleótido es un nucleótido que contiene una modificación en, por ejemplo, los restos de base, azúcar o fosfato. Como un ejemplo ilustrativo, se sabe que una sustitución de residuos 2 -OH de ARNsi con residuos 2'F, 2'0-Me o 2Ή mejora la estabilidad in vivo del ARN respectivo. Las modificaciones en el resto base incluyen modificaciones naturales y sintéticas de A, C, G y T/U, diferentes bases de purina o pirimidina, tales como uracilo-5-ilo, hipoxantin-9-ilo y 2-aminoadenin-9-ilo , así como las bases de nucleótidos distintas de purinas o de pirimidinas. Otros análogos de nucleótidos sirven como bases universales. Las bases universales incluyen 3-nitropirroi y 5-nitroindol. Las bases universales pueden formar un par de bases con cualquier otra base. Las modificaciones de base a menudo se pueden combinar, por ejemplo, con una modificación de azúcar, tal como, por ejemplo, 2'-0-metoxieti!o, por ejemplo, para lograr propiedades únicas tales como mayor estabilidad dúplex.

El polinucleótido de la invención se puede incorporar dentro de un vector, principalmente un vector de expresión, para expresar las proteínas codificadas por este. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un vector, en lo sucesivo en el presente documento el vector de la invención, que comprende el polinucleótido I o II de la invención.

Los términos "expresión" y "expresado", como se usan en el presente documento,

se usan en su significado más amplio, para indicar que una secuencia incluida en una molécula de ácido nucleico y que codifica un péptido/proteína se convierte en su producto peptídico/proteico. Por lo tanto, cuando el ácido nucleico es ADN, la expresión se refiere a la transcripción de una secuencia del ADN en ARN y a la traducción del ARN en proteína. Cuando el ácido nucleico es ARN, la expresión puede incluir la replicación de este ARN en copias de ARN adicionales y/o la transcripción inversa del ARN en ADN y opcional mente la transcripción de este ADN en una o más moléculas de ARN adicionales. En cualquier caso, la expresión de ARN incluye la traducción de cualquiera de las especies de ARN proporcionadas/producidas en proteínas. Por lo tanto, la expresión se realiza por traducción e incluye uno o más procesos seleccionados del grupo que consiste en transcripción, transcripción inversa y replicación. La expresión de la proteína o péptido del miembro de la pluralidad de péptidos y/o proteínas se puede realizar usando un sistema de expresión in vitro. Tal sistema de expresión puede incluir un extracto celular, típicamente de bacterias, reticulocitos de conejo o germen de trigo. Muchos sistemas adecuados están disponibles comercialmente. La mezcla de aminoácidos utilizada puede incluir aminoácidos sintéticos, si se desea, para aumentar la cantidad o diversidad posible de proteínas producidas en la biblioteca. Esto se puede lograr cargando ARNt con aminoácidos artificiales y usando estos ARNt para la traducción in vitro de las proteínas a seleccionar. Se dice que una molécula de ácido nucleico, tal como ADN, es "capaz de expresar" un péptido/proteína si contiene secuencias de nucleótidos que contienen información reguladora transcripcional y traduccional, y tales secuencias están operativamente unidas a secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido. Una realización adecuada para fines de expresión, es el uso de un vector, en particular un vector de expresión. Por lo tanto, la presente invención también proporciona una célula hospedadora transformada/transfectada con un vector de expresión.

Un vector de expresión puede incluir una o más secuencias reguladoras y ser capaz de dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los que está unido operativamente. Un enlace operable es un enlace en el que una secuencia de nucleótidos codificante de interés está unida a una o más secuencias reguladoras de tal forma que puede permitirse la expresión de la secuencia de nucleótidos que se busca expresar. Por lo tanto, una secuencia reguladora unida operativamente a una secuencia codificante es capaz de realizar la expresión de la secuencia codificante, por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula cuando el vector se introduce en la célula. No es necesario que una secuencia reguladora respectiva sea contigua a la secuencia de codificación, siempre que funcione para dirigir la expresión de la misma. Por lo tanto, por ejemplo, pueden estar presentes secuencias interpuestas transcritas aún no traducidas entre una secuencia promotora y la secuencia codificante y la secuencia promotora todavía se puede considerar "unida operativamente" a la secuencia codificante.

La expresión "secuencia reguladora" incluye promotores transcripcionales controlables, operadores, potenciadores, silenciadores, terminadores transcripcionales, regiones no traducidas 5' y 3' que interactúan con las proteínas celulares hospedadoras para realizar la transcripción y la traducción y otros elementos que pueden controlar la expresión génica incluyendo los codones de inicio y de terminación. Las secuencias reguladoras pueden ser nativas (homólogas), o pueden ser extrañas (heterólogas) a la célula y/o a la secuencia de nucleótidos que se usa. La naturaleza precisa de las secuencias reguladoras necesarias para la expresión de la secuencia génica puede variar de organismo a organismo, pero en general debe incluir una región promotora que, en procariotas, contiene tanto el promotor (que dirige el inicio de la transcripción de ARN), así como las secuencias de ADN que, al transcribirse en ARN, señalizarán el inicio de la síntesis. Dichas regiones incluirán normalmente aquellas secuencias 5' no codificantes implicadas en el inicio de la transcripción y traducción, tales como la caja TATA, la secuencia protectora o la secuencia CAAT. Estas secuencias reguladoras generalmente se seleccionan individualmente para una determinada realización, por ejemplo, para que se use una determinada célula. El experto en la técnica sabrá que la expresión apropiada en una célula procariota también requiere la presencia de un sitio de unión a ribosoma aguas arriba de la secuencia que codifica la secuencia del gen.

Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a una célula hospedadora, en lo sucesivo en el presente documento célula hospedadora de la invención, que comprende el polinucleótido I o II o el vector de la invención.

La expresión "célula hospedadora", como se usa en el presente documento, incluye cualquier tipo de célula que sea susceptible de transformación, transfección, transducción y similares con una molécula de ácido nucleico o con un vector de expresión que comprende el polinucleótido I o II de la presente invención.

La presente invención también se refiere a células hospedadoras recombinantes, que comprenden el polinucleótido I o II aislado de la invención, que se usan ventajosamente en la producción recombinante de las proteínas. Se introduce un vector en una célula hospedadora de manera que el vector se mantenga como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicante. La expresión "célula hospedadora" incluye cualquier progenie de una célula precursora que no es idéntica a la célula precursora debido a mutaciones que se producen durante la replicación.

La célula hospedadora puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de las proteínas de la presente invención, por ejemplo, un procariota o un eucariota tal como una célula de mamífero, insecto, planta o fúngica. Sin embargo, en una realización particular, la célula hospedadora es una célula eucariota, preferiblemente, una célula MDCK.

La célula hospedadora procariota puede ser cualquier bacteria Gram positiva o una bacteria Gram negativa. Las bacterias Gram positivas incluyen, pero sin limitación, Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus, y Oceanobacillus. Las bacterias Gran negativas incluyen, pero sin limitación, E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, llyobacter, Neisseria, y Ureaplasma.

Ejemplos de las células hospedadoras fúngicas incluyen, sin limitación, Aspergillus (por ejemplo, célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae), Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis (por ejemplo, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora), Chrysosporium (por ejemplo, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannico!a, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum), Coprinus (por ejemplo, Coprinus cinereus), Coriolus (por ejemplo, Coriolus hirsutus), Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium (por ejemplo, célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reíiculatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, o Fusarium venenatum), Humicola (por ejemplo, Humicola insolens, Humicola lanuginosa), Magnaporthe, Mucor (por ejemplo, Mucor miehei), Myceliophthora (por ejemplo, Myceliophthora thermophila), Neocallimastix, Neurospora (por ejemplo, Neurospora crassa), Paecilomyces, Penicillium (por ejemplo, Penicillium purpurogenum), Phanerochaete (por ejemplo, Phanerochaete chrysosporium), Phlebia (por ejemplo, Phlebia radiata), Piromyces, Pleurotus (por ejemplo, Pleurotus eryngii), Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia (por ejemplo, Thielavia terrestris), Tolypocladium, Trametes (por ejemplo, Trametes villosa o Trametes versicolor), o célula de Trichoderma (por ejemplo, célula de Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride).

La célula hospedadora también puede ser una célula de levadura. "Levadura" como se usa en el presente documento incluye levadura ascosporógena (Endomycetales), levadura basidiosporógena y levadura que pertenece a Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Más preferiblemente, la célula hospedadora de levadura es una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces (por ejemplo, Kluyveromyces lactis), Pichia (por ejemplo, Pichia pastoris), Saccharomyces (por ejemplo, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, o Saccharomyces oviformis, etc.), Schizosaccharomyces, o Yarrowia (Yarrowia lipolytica).

Adicionalmente, cualquier célula que soporte la replicación eficiente del virus de la gripe se puede emplear para aislar y/o propagar el virus de la gripe, por ejemplo, cualquier célula aviar o de mamífero, tal como un ser humano, por ejemplo, células 293T o PER.C6®, o caninos, bovinos, equinos, felinos, porcinos, ovinos, roedores, por ejemplo visón, por ejemplo, células MvLuI , o hámster, por ejemplo, células CHO, primate no humano, por ejemplo, células Vero o células de vertebrados superiores no primates, por ejemplo, células MDCK, incluyendo células mutantes tales como células AX4. Los virus aislados pueden usarse para preparar un virus reagrupado. En una realización, las células hospedadoras para la producción de vacunas son líneas celulares o cepas celulares continuas de mamífero o ave. Se puede realizar una caracterización completa de las células que se utilizarán, de manera que se puedan incluir las pruebas apropiadas de pureza del producto final. Los datos que se pueden usar para la caracterización de una celda incluyen (a) información sobre su origen, derivación e historial de pases; (b) información sobre su crecimiento y características morfológicas; (c) resultados de pruebas de agentes adventicios; (d) características distintivas, tales como patrones bioquímicos, inmunológicos y citogenéticos que permiten que las células se reconozcan claramente entre otras líneas celulares; y (e) resultados de ensayos de tumorigenicidad. En una realización, el nivel de pase, o la duplicación de población, de la célula hospedadora utilizada es lo más bajo posible.

En una realización, las células son líneas celulares continuas certificadas por la OMS, o certificables. Los requisitos para certificar dichas líneas celulares incluyen la caracterización con respecto al menos a uno de genealogía, características de crecimiento, marcadores inmunológicos, susceptibilidad a virus, tumorigenicidad y condiciones de almacenamiento, así como mediante pruebas en animales, huevos y cultivo celular. Dicha caracterización se usa para confirmar que las células están libres de agentes adventicios detectables. En algunos países, la carología (karyology) también puede ser necesaria. Además, la tumorigenicidad puede ensayarse en células que están en el mismo nivel de pase que las utilizadas para la producción de vacunas. El virus puede purificarse mediante un proceso que se ha demostrado que proporciona resultados consistentes, antes de la producción de la vacuna (véase, por ejemplo, World Health Organization, 1982).

El virus producido por la célula hospedadora puede estar altamente purificado antes de la formulación de vacuna o de terapia génica. Generalmente, los procedimientos de purificación dan como resultado una eliminación extensa del ADN celular y otros componentes celulares, y agentes adventicios. También se pueden usar procedimientos que degradan o desnaturalizan de manera extensa el ADN.

Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un virus, en lo sucesivo en el presente documento virus de la invención, que comprende el polinucleótido I o II de la invención o el vector de la invención.

Como se explicó al comienzo de esta descripción, el virus de la presente invención se atenúa debido a los polinucleótidos de la invención, que comprende las mutaciones mencionadas anteriormente.

En la presente invención, un virus atenuado (i) no altera sustancialmente la síntesis y el procesamiento de proteínas víricas en una célula infectada; (ii) produce cantidades similares de viriones por célula infectada como virus de tipo silvestre (wt); y/o (iii) muestra una infectividad específica del virión sustancialmente menor que el virus wt. En realizaciones adicionales, el virus atenuado induce una respuesta inmune sustancialmente similar en un animal hospedador como el virus de tipo silvestre correspondiente.

El término "atenuado" también incluye los genomas virales defectuosos (DVG) producidos por el virus de la invención. Como se explica al comienzo de la presente descripción, el virus que comprende los polinucleótidos de la invención afecta la producción de DVG en el sujeto que ha sido infectado. Por lo tanto, la presente invención también incluye los genomas virales defectuosos (DVG) producidos por el virus de la invención.

Se pueden introducir otras mutaciones atenuantes en genes del virus de la gripe mediante mutagénesis dirigida para rescatar virus infecciosos que portan estos genes mutantes. Las mutaciones atenuantes se pueden introducir en regiones no codificantes del genoma, así como en regiones codificantes. Dichas mutaciones atenuantes también se pueden introducir en genes tales como los genes HA o NA.

Por lo tanto, también pueden generarse nuevos virus donantes con mutaciones atenuantes introducidas por mutagénesis dirigida, y dichos nuevos virus donantes pueden usarse en la producción de candidatos de vacunas recombinantes atenuadas de una manera análoga a la descrita anteriormente para el virus donante CA De forma similar, otras cepas donantes atenuadas conocidas y adecuadas pueden recombinarse con el virus de la gripe para obtener vacunas atenuadas adecuadas para su uso en la vacunación de mamíferos.

En una realización, dichos virus atenuados mantienen los genes del virus que codifican determinantes antigénicos sustancialmente similares a los de los aislados clínicos originales. Esto se debe a que el propósito de la vacuna atenuada es proporcionar sustancialmente la misma antigenicidad que el aislado clínico original del virus, mientras que al mismo tiempo carece de patogenicidad en la medida en que la vacuna causa una probabilidad mínima de inducir una condición de enfermedad grave en el mamífero vacunado.

Una preparación de virus aislada se obtiene generalmente por cultivo ¡n vitro y propagación y está sustancialmente libre de otros agentes infecciosos. Como se usa en el presente documento, "sustancialmente libre" significa que los agentes infecciosos distintos del virus de la invención están por debajo del nivel de detección para un agente infeccioso particular usando métodos de detección estándar para ese agente. Un virus "recombinante" es uno que ha sido manipulado in vitro, por ejemplo, usando técnicas de ADN recombinante, para introducir cambios en el genoma viral, o generado artificialmente de otro modo.

En una realización particular, el virus es un virus de la gripe. Existen tres tipos de virus de la gripe: virus de la gripe A, virus de la gripe B y virus de la gripe C. No obstante, en una realización particular, el virus es un virus de la gripe A.

Una vez que las proteínas o el virus se producen cultivando la célula hospedadora, se pueden detectar o aislar usando métodos conocidos en la técnica y se pueden incorporar en una composición a administrar a un sujeto.

Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a una composición, en lo

sucesivo en el presente documento composición de la invención, que comprende el polinucleótido I o II de la invención, el vector, la célula hospedadora y/o el virus de la invención.

De acuerdo con las técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, la composición de acuerdo con la presente invención se puede formular con excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptable. Por lo tanto, en una realización particular, la composición de la invención comprende además un adyuvante y/o excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptable.

Como se usa en el presente documento, el término "adyuvante" se referirá a cualquier agente adecuado para potenciar la inmunogenicidad de un antígeno y potenciar una respuesta inmune en un sujeto. Numerosos adyuvantes, incluyendo adyuvantes en forma de partículas, adecuados para su uso con vacunas tanto a base de proteínas como de ácidos nucleicos, y métodos para combinar adyuvantes con antígenos, se conocen bien por los expertos en la técnica. Los adyuvantes adecuados para vacunas a base de ácido nucleico incluyen, pero sin limitación, Quil A, imiquimod, resiquimod e interleucina-12 administrados en forma de proteína purificada o ácido nucleico. Los adyuvantes adecuados para su uso con inmunización de proteínas incluyen, pero sin limitación, alumbre, adyuvante incompleto de Freund (FIA), saponina, Quil A y QS-21. El adyuvante puede ser un componente de la composición o, si se desea, puede administrarse individualmente al sujeto.

El término "excipiente" se refiere a una sustancia que ayuda a absorber cualquiera de los componentes de la composición de la invención, estabiliza dichos componentes o ayuda en la preparación de la composición farmacéutica en el sentido de darle consistencia o proporcionar sabores que la hacen más agradable. Por lo tanto, los excipientes podrían tener la función de mantener los componentes unidos entre sí, tal como, por ejemplo, almidones, azúcares o celulosas, una función edulcorante, una función colorante, la función de proteger el medicamento, tal como, por ejemplo, aislarlo del aire y/o humedad, una función de relleno para un comprimido, cápsula o cualquier otra forma de formulación, tal como, por ejemplo, fosfato cálcico dibásico, una función desintegrante para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otros tipos de excipientes no mencionados en este párrafo. Por lo tanto, el término "excipiente" se define como cualquier material que, incluido en las formas galénicas, se añade a los principios activos o a sus asociaciones para permitir su preparación y estabilidad, modificar sus propiedades organolépticas o determinar las propiedades físicas/químicas de la composición farmacéutica y su biodisponibilidad. El "excipiente farmacéuticamente aceptable" debería permitir la actividad de los compuestos de la composición farmacéutica, es decir, para que sea compatible con dichos componentes. Los ejemplos de excipientes son aglutinantes, cargas, desintegrantes, lubricantes, recubrimientos, edulcorantes, saporíferos y colorantes. Los ejemplos no limitantes más específicos de excipientes aceptables son almidones, azúcares, xilitol, sorbitol, fosfato de calcio, grasas esteroideas, talco, sílice o glicerina, entre otros. Asimismo, se dice que una composición, que incluye sus componentes, es "farmacológicamente aceptable" si su administración puede ser tolerada por un sujeto receptor, tal como un mamífero o un ave.

El término "vehículo" es preferiblemente una sustancia inerte. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Por lo tanto, el vehículo es una sustancia que se usa para diluir cualquiera de los componentes de la composición de la presente invención en un volumen o peso determinado, o incluso sin diluir dichos componentes, es capaz de permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma al medicamento. El vehículo es farmacéuticamente aceptable. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo farmacéuticamente aceptable es el diluyente.

La composición se puede administrar mediante cualquier ruta de administración apropiada; para este fin, dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada para la ruta de administración seleccionada.

Ejemplos de rutas de administración de una composición farmacéutica de la invención incluyen administración oral, transdérmica y parenteral. Las rutas de administración adecuadas pueden incluir, por ejemplo, administración de depósito, oral, rectal, transmucosa o intestinal; administración parenteral, incluyendo

inyecciones intramusculares, subcutáneas, intravenosas, intramedulares, así como inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intraperítoneales, intranasales o intraoculares.

Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas del virus en forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones del virus se pueden preparar como suspensiones de inyección oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos iipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones de inyección acuosa pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol o dextrano. En algunas realizaciones, un principio activo, tal como un virus como se ha descrito anteriormente, puede estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos (SPF), antes del uso. Como ejemplo ilustrativo, para la inyección, se puede formular una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención como una solución acuosa, por ejemplo en tampones fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hanks, solución de Ringer o tampón de solución salina fisiológica. Para la administración oral, se puede formular fácilmente una composición farmacéutica respectiva combinando el virus con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Dichos vehículos permiten que un virus de la invención se formule como comprimidos, pildoras, pastillas, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones y similares, para ingestión oral por un paciente a tratar.

Las preparaciones farmacéuticas para su uso oral se pueden obtener añadiendo un excipiente sólido, moliendo opcional mente una mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, cargas tales como azúcares, incluyendo lactosa, glucosa, sacarosa, manitol o sorbitol; almidones y derivados de los mismos, tales como almidón de maíz, dextrina y almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, almidón de hidroxipropilo, almidón de trigo, gelatina, goma de tragacanto, metilceiulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona (PVP); preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, metilcelulosa, carboxilmetilcelulosa e hidroxipropilcelulosa; compuestos inorgánicos, tales como cloruro sódico, ácido bórico, sulfato de calcio, fosfato de calcio y carbonato de calcio precipitado. Si se desea, pueden añadirse agentes disgregantes, tales como la polivinilpirrolidona reti culada, agar, o ácido algínico o una sal del mismo, tal como alginato sódico.

Los núcleos de grageas están dotados de revestimientos adecuados. Para este fin, se pueden usar soluciones de azúcar concentradas que pueden contener opcional mente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, ge! de carbopol, polietilenglico! y/o dióxido de titanio, soluciones de laca, y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Se pueden añadir colorantes o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de grageas para identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de virus.

Los agentes de fluidización adecuados incluyen, pero sin limitación, óxido de magnesio, silicato de aluminio sintético, ácido metasilícico, óxido de magnesio y aluminio, ácido silícico hidratado, ácido silícico anhidro, talco, estearato de magnesio y caolín. Los agentes de unión adecuados incluyen, pero sin limitación, polietilenglico!, polivinilpirrolidina, polialcohol vinílico, goma arábiga, tragacanto, alginato sódico, gelatina y gluten. Los estabilizantes adecuados incluyen, pero sin limitación, proteínas, tales como albúmina, protamina, gelatina y globulina; y aminoácidos y sales de los mismos. Los espesantes adecuados incluyen, pero sin limitación, sacarosa, glicerina, metilcelulosa y carboximetilcelulosa. Los agentes de ajuste de pH adecuados incluyen, pero sin limitación, ácido clorhídrico, hidróxido sódico, fosfatos, ci tratos y carbonatos.

Las composiciones farmacéuticas que se pueden usar por vía oral incluyen, pero sin limitar a, cápsulas duras hechas de gelatina, así como cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un plastifi cante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener el virus atenuado en mezcla con una carga tal como lactosa, aglutinantes tales como almidones, y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En las cápsulas blandas, los virus pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como

aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden añadir estabilizadores. Todas las formulaciones para administración oral deben estar en dosificaciones adecuadas para tal administración.

Para administración bucal, una composición farmacéutica respectiva puede adoptar la forma de comprimidos o pastillas formuladas de manera convencional.

Para administración por inhalación, una composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la presente invención se puede administrar convenientemente en forma de una presentación en aerosol de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diciorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, la gelatina para su uso en un inhalador o insuflador pueden formularse conteniendo una mezcla en polvo del virus y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

Una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede comprender además o adicionalmente, al menos un compuesto quimioterapéutico, por ejemplo, para terapia génica, inmunosupresores, agentes antiinflamatorios o potenciadores inmunitarios, y para vacunas, productos quimioterapéuticos que incluyen, pero sin limitación, gammaglobulina , amantadina, guanidina, hidroxibencimidazol, interferón-a, interferón-β, interferón-γ, factor de necrosis tumoral alfa, tiosemicarbarzonas, metisazona, rifampicina, ribavirina, un análogo de pirímidina, un análogo de purína, foscarnet, ácido fosfonoacético, aciclovir, didesoxinucleósidos, un inhibidor de proteasa, o ganciclovir.

La composición también puede contener cantidades variables pero pequeñas de formaldehído libre de endotoxinas, y conservantes, que se han encontrado seguros y que no contribuyen a los efectos indeseables en el organismo al que se administra la composición.

Preferiblemente, la composición proporcionada por esta invención comprende el

virus de la invención, preferiblemente, un virus de la gripe, más preferiblemente, un virus de la gripe A.

Una composición farmacéutica que comprende el virus de la gripe de la presente invención se puede fabricar de una manera que se conoce por sí misma, por ejemplo, por medio de procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, fabricación en grageas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización.

Como se explicará más adelante en la presente descripción, la composición de la invención se puede usar para provocar una respuesta inmune en un sujeto. Por lo tanto, en una realización particular, la composición es una composición inmunogénica tal como una vacuna.

El término "vacuna" o la expresión "composición de vacuna" se usan de forma intercambiable en el presente documento y se refieren a una composición que comprende al menos un componente inmunológicamente activo que induce una respuesta inmune en un sujeto contra virus de la gripe, y/o protege al sujeto de la gripe o una posible muerte debido a la gripe, y puede incluir o no uno o más componentes adicionales que mejoran la actividad inmunológica del componente activo. Una vacuna puede comprender adicionalmente componentes adicionales típicos de composiciones farmacéuticas como se ha explicado en párrafos anteriores. Dicho al menos un componente inmunológicamente activo es un virus de la presente invención. La vacuna de la presente invención es para uso humano y/o veterinario.

Una vacuna de la invención incluye un virus de la gripe recombinante aislado de la invención, y opcionalmente uno o más virus aislados diferentes que incluyen otros virus de la gripe aislados, una o más proteínas inmunogénicas o glicoproteínas de uno o más virus de la gripe aislados o uno o más patógenos diferentes, por ejemplo, una proteína inmunogénica de una o más bacterias, virus distintos del virus de la gripe, levadura u hongos, o ácido nucleico aislado que codifica una o más proteínas víricas (por ejemplo, vacunas de ADN), incluyendo una o más proteínas inmunogénicas del virus de la gripe aislado de la invención. En una

realización, los virus de la gripe de la invención pueden ser vectores de vacunas para el virus de la gripe u otros patógenos.

La heterogeneidad en una vacuna puede proporcionarse mezclando virus de la gripe replicados para al menos dos cepas de virus de la gripe, tales como 2-20 cepas o cualquier intervalo o valor en la misma. Se pueden proporcionar vacunas para variaciones en una única cepa de un virus de la gripe, usando técnicas conocidas en la técnica.

La administración de la composición puede ser para un propósito "profiláctico" o "terapéutico". Cuando se proporcionan profilácticamente, las composiciones de la invención que son vacunas se proporcionan antes de que se manifieste cualquier síntoma o signo clínico de una infección por patógeno. La administración profiláctica de la composición sirve para prevenir o atenuar cualquier infección posterior. La administración profiláctica de la composición sirve para prevenir o atenuar uno o más síntomas o signos clínicos asociados con la enfermedad.

Una "dosis profilácticamente eficaz" es cualquier cantidad de una vacuna que, al administrarse a un sujeto propenso a la infección vírica o propenso a la aflicción con un trastorno asociado con el virus, induce en el sujeto una respuesta inmune que protege al sujeto de ser infectado por el virus o verse afectado por el desorden. "Proteger" al sujeto significa reducir la probabilidad de que el sujeto se infecte con el virus, o disminuir la probabilidad de la aparición del trastorno en el sujeto, en al menos dos veces, preferiblemente al menos diez veces. Por ejemplo, si un sujeto tiene un 1% de probabilidades de infectarse con un virus, una reducción del doble en la probabilidad de que el sujeto se infecte con el virus daría como resultado que el sujeto tenga una probabilidad del 0,5 % de infectarse con el virus. Mucho más preferiblemente, una "dosis profilácticamente eficaz" induce en el sujeto una respuesta inmune que evita completamente que el sujeto se infecte por el virus, o evita la aparición del trastorno en el sujeto en su totalidad.

Cuando se proporciona terapéuticamente, se proporciona una vacuna vírica tras detectar un síntoma o signo clínico de infección real. La administración terapéutica del uno o más compuestos sirve para atenuar cualquier infección real. Cuando se

proporciona terapéuticamente, se proporciona una composición de terapia génica tras la detección de un síntoma o signo clínico de la enfermedad. La administración terapéutica del uno o más compuestos sirve para atenuar un síntoma o signo clínico de esa enfermedad.

Como se usa en el presente documento, una "dosis terapéuticamente efectiva" es cualquier cantidad de una vacuna que, cuando se administra a un sujeto afectado por un trastorno contra el cual la vacuna es eficaz, induce en el sujeto una respuesta inmune que causa que el sujeto experimente una reducción, remisión o regresión del trastorno y/o sus síntomas. En realizaciones preferidas, se evita la recurrencia del trastorno y/o sus síntomas. En otras realizaciones preferidas, el sujeto se cura del trastorno y/o sus síntomas.

Se entiende que la "dosificación eficaz" puede depender de la especie, edad, sexo, salud y peso del receptor, tipo de tratamiento concurrente, si lo hubiera, frecuencia de tratamiento, y la naturaleza del efecto deseado. Los intervalos de dosis eficaces proporcionados a continuación no están destinados a limitar la invención y representan intervalos de dosis.

La dosificación de una vacuna de virus vivos, atenuados o inactivos para un animal, tal como un organismo adulto de mamífero, puede ser de aproximadamente 102 a 1015, por ejemplo, de aproximadamente 103 a aproximadamente 1012, de aproximadamente 103 a aproximadamente 1010, de aproximadamente 103 a aproximadamente 108, de aproximadamente 10s a aproximadamente 108, de aproximadamente 103 a aproximadamente 106, de aproximadamente 104 a aproximadamente 108, de aproximadamente 104 a aproximadamente 107, de aproximadamente 104 a aproximadamente 108 o de aproximadamente 104 a aproximadamente 10s unidades formadoras de placa (UFP)/kg, o cualquier intervalo o valor en las mismas. La dosis de vacuna inactivada puede variar de aproximadamente 0,1 a 1000, por ejemplo, de 10 a 100 g, tal como aproximadamente 15 μg, de proteína HA. Sin embargo, la dosis debe ser una cantidad segura y eficaz según lo determinado por los métodos convencionales, usando las vacunas existentes como punto de partida.

Usos de los polinucleótidos de la invención

En otro aspecto, la invención se refiere al uso del polinucleótido I o II, el vector o la célula hospedadora de la invención para producir in vitro un virus atenuado, preferiblemente, un virus de la gripe atenuado, más preferiblemente, un virus de la gripe A atenuado.

Un IAV atenuado, vivo se puede preparar (a) introduciendo en una célula hospedadora el vector de la invención, o cultivando la célula hospedadora de la invención y (b) aislando el IAV infeccioso de dicha célula hospedadora.

Como alternativa, se puede preparar un IAV atenuado vivo introduciendo en una célula hospedadora vectores diferentes, comprendiendo cada vector un polinucleótido que comprende un gen diferente del IAV y, una vez que las proteínas se han traducido, se ensamblan para formar un IAV completo. Por ejemplo, un IAV atenuado se puede preparar (a) introduciendo en una célula hospedadora (i) un vector que comprende el gen PA de IAV como se describe en el presente documento, y (ii) una pluralidad de vectores que comprenden los genes de IAV restantes necesarios para formar un IAV infeccioso; y (b) aislando el IAV infeccioso de dicha célula hospedadora. Los genes de IAV restantes requeridos para formar un IAV infeccioso son un gen PB1, un gen PB2, un gen HA, un gen NA, un gen NS1, un gen NS2, un gen M1, un gen M2 y un NP. Estos genes pueden codificar las proteínas de tipo silvestre de las proteínas de IAV o mutantes como se representa en la presente descripción.

Los métodos para la preparación de un IAV atenuado vivo comprenden además preferiblemente la etapa de (c) formular dicho IAV con un vehículo farmacéuticamente aceptable para obtener una composición farmacéutica como se describe en los párrafos anteriores.

La presente invención también contempla un IAV atenuado vivo que puede obtenerse mediante los métodos descritos anteriormente. El término "atenuado" se ha explicado previamente en la presente descripción.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso del polinucleótido I o II, el vector, la célula hospedadora y/o el virus de la invención en la fabricación de un medicamento.

En el contexto de la presente invención, el término "medicamento" es equivalente al término "composición" como se define en los aspectos de la invención anteriores descritos en la presente descripción. Por lo tanto, la administración de la composición o medicamento puede ser para un propósito "profiláctico" o "terapéutico". Estos términos han sido explicados en párrafos anteriores.

La "protección" proporcionada no necesita ser absoluta, es decir, no es necesario prevenir o erradicar totalmente la infección de gripe, si hay una mejora estadísticamente significativa en comparación con una población de control o un conjunto de mamíferos. La protección puede limitarse a mitigar la gravedad o la rapidez de la aparición de los síntomas o los signos clínicos de la infección por el virus de la influenza.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso del polinucleótido I o II, el vector, la célula hospedadora y/o el virus de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la gripe, preferiblemente, una infección por el virus de la gripe A.

El término "influenza" cuando se usa en el presente documento, además de ser parte del nombre de los virus de la gripe de la presente invención, se refiere a la enfermedad y/o síntomas causados por los virus de gripe. Los síntomas de la gripe pueden comenzar repentinamente uno o dos días después de la infección. Por lo general, los primeros síntomas son escalofríos o sensación de frío, pero la fiebre también es común al principio de la infección, con temperaturas corporales que varían de 38-39 °C a 42°C. Muchos sujetos están tan enfermos que están confinados en la cama por varios días, con molestias y dolores en todo el cuerpo, que son peores en la espalda y las piernas. Los síntomas de la gripe pueden incluir fiebre y frialdad extrema (escalofríos, temblores (rigor)), tos, congestión nasal, dolores en el cuerpo, especialmente articulaciones y garganta, fatiga, dolor de cabeza, ojos irritados y llorosos, ojos, piel (especialmente de la cara), boca,

garganta y nariz enrojecidos, en niños, síntomas gastrointestinales tales como diarrea y dolor abdominal (puede ser grave en niños con gripe B).

El término "tratar" (o "tratamiento") se refiere a procesos que implican ralentizar, interrumpir, detener, controlar, parar, reducir o revertir el avance o gravedad de un síntoma, trastorno, afección o enfermedad existentes, pero no necesariamente implican una eliminación total de todos los síntomas, afecciones o trastornos relacionados con la enfermedad. El tratamiento de un trastorno o enfermedad puede, por ejemplo, detener el avance del trastorno o la enfermedad (por ejemplo, no empeorar los síntomas) o retrasar el avance del trastorno o la enfermedad (en caso de que la detención del avance sea de naturaleza transitoria solamente). El "tratamiento" de un trastorno o enfermedad también puede conducir a una respuesta parcial (por ejemplo, mejora de los síntomas) o a una respuesta completa (por ejemplo, desaparición de los síntomas) del sujeto/paciente que padece el trastorno o la enfermedad. Por consiguiente, el "tratamiento" de un trastorno o enfermedad también puede referirse a una mejora del trastorno o enfermedad, que puede, por ejemplo, conducir a una detención del avance del trastorno o enfermedad o un retraso en el avance del trastorno o enfermedad.

En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso del polinucleótido I o II de la invención, el vector, la célula hospedadora, el virus y/o la composición de la invención para provocar una respuesta inmune en un sujeto, preferiblemente, una respuesta inmune contra un virus de la gripe, más preferiblemente contra un virus de la gripe A.

Provocar una respuesta inmune protectora en un sujeto puede conseguirse, por ejemplo, administrando una dosis primaria de una vacuna a un sujeto, seguido después de un período de tiempo adecuado por una o más administraciones posteriores de la vacuna. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente un período de tiempo adecuado entre las administraciones de la vacuna, y usualmente es del orden de varias semanas a meses. La presente invención no está limitada, sin embargo, a ningún método, ruta o frecuencia particular de administración.

Una "respuesta inmune" a un antígeno o composición de vacuna es el desarrollo en

un sujeto de una respuesta inmune humoral y/o mediada por células a moléculas presentes en el antígeno o la composición de vacuna de interés. Para los fines de la presente invención, una "respuesta inmune humoral" es una respuesta inmune mediada por anticuerpos e implica la generación de anticuerpos con afinidad para el antígeno/vacuna de la invención, mientras que una "respuesta inmune mediada por células" es una mediada por linfocitos T y/u otros glóbulos blancos. Se provoca una "respuesta inmune mediada por células" mediante la presentación de epítopos antigénicos en asociación con moléculas de Clase I o Clase II del complejo de histocompatibilidad principal (MHC). Esto activa los linfocitos T auxiliares CD4+ específicos de antígeno o los linfocitos T citotóxicos CD8+ ("CTL"). Los CTL tienen especificidad para antígenos peptídicos que se presentan en asociación con proteínas codificadas por el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) y se expresan en las superficies de las células. Los CTL ayudan a inducir y promover la destrucción intracelular de microbios intracelulares, o la lisis de células infectadas con dichos microbios. Otro aspecto de la inmunidad celular implica una respuesta específica de antígeno por los linfocitos T auxiliares. Los linfocitos T auxiliares actúan para ayudar a estimular la función, y enfocar la actividad de las células efectoras no específicas contra las células que presentan antígenos peptídicos en asociación con las moléculas del MHC en su superficie. Una "respuesta inmune mediada por células" también se refiere a la producción de citocinas, quimiocinas y otras moléculas similares producidas por linfocitos T activados y/u otros glóbulos blancos, incluidos los derivados de los linfocitos T CD4+ y CD8+. La capacidad de un antígeno o composición particular para estimular una respuesta inmunológica mediada por células puede determinarse mediante una serie de ensayos, tales como ensayos de linfo-proliferación (activación de linfocitos), ensayos de células CTL citotóxicas, mediante el ensayo de linfocitos T específicos para el antígeno en un sujeto sensibilizado, o mediante la medición de la producción de citocinas por los linfocitos T en respuesta a la reestimulación con antígeno. Dichos ensayos se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Erickson et al., J. Immunol. (1993) 151 :4189-4199; Doe et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24:2369-2376. Una "cantidad inmunológicamente eficaz" o una "cantidad inmunizante eficaz", usados en el presente documento indistintamente, se refiere a la cantidad de antígeno o vacuna suficiente para provocar una respuesta inmune, ya sea una respuesta celular (linfocito T) o humoral (linfocito B o anticuerpo), según se mide por ensayos

estándar conocidos por los expertos en la técnica. La eficacia de un antígeno como inmunógeno puede medirse mediante ensayos de proliferación, mediante ensayos citolíticos, tales como ensayos de liberación de cromo para medir la capacidad de un linfocito T para lisar su célula diana específica, o midiendo los niveles de actividad de los linfocitos B midiendo los niveles de anticuerpos circulantes específicos para el antígeno en suero.

La "respuesta inmune" es preferiblemente una respuesta inmune "protectora". Una respuesta inmune "protectora" se refiere a la capacidad de una vacuna para provocar una respuesta inmune, ya sea humoral o mediada por células, o ambas, que sirve para proteger al mamífero de la gripe.

La protección proporcionada no necesita ser absoluta, es decir, no es necesario evitar totalmente la gripe ni que los virus de la gripe sean totalmente erradicados, si hay una mejora estadísticamente significativa en comparación con una población control de mamíferos. La protección puede limitarse a mitigar la gravedad o la rapidez de aparición de los síntomas de la gripe. La respuesta inmune es preferiblemente suficiente para tratar y/o prevenir la gripe. Cuando se usa en el presente documento, el término "tratar" o "prevenir" la gripe se refiere a inhibir al menos la replicación de IAV, IBA o ICV, respectivamente, para inhibir la transmisión de la gripe, y/o evitar que el IAV, IBV o ICV, respectivamente, se establezca en sí mismo en un sujeto, y/o para mejorar o aliviar los síntomas de la enfermedad causada por IAV, IBV o ICV, respectivamente. El término "vacunación" o "inmunización" (pueden usarse indistintamente) cuando se usa en el presente documento, incluye tratamiento y/o prevención de la gripe.

Preferiblemente, una respuesta inmune protectora incluye lo siguiente: un virus de la gripe de la presente invención (en particular IAV) o una composición que comprende dicho IAV como se describe en el presente documento confiere a una muestra de suero de un sujeto (incluyendo un mamífero o ave), a cuyo sujeto se ha administrado al menos una dosis de aproximadamente 104 a aproximadamente 105 UFP/kg del virus de la gripe de la presente invención, un título de inhibición de la hemaglutinina (Hl) preferiblemente de al menos aproximadamente 1 :520, cuando se prueba contra el mismo virus de la gripe (particularmente IAV) que no tiene una o más de las mutaciones silenciosas como se describe en el presente documento.

Además, o como alternativa, una respuesta inmune protectora incluye preferiblemente que un virus de la gripe de la presente invención (en particular IAV) o una composición que comprende dicho IAV como se describe en el presente documento, confiere protección contra una dosis letal de 10-100 veces contra IAV de tipo salvaje, es decir, que no tiene una o más de las mutaciones silenciosas como se describe en el presente documento.

Los ejemplos de mamíferos adecuados que pueden ser el objeto de la composición o vacunas de la presente invención incluyen, pero sin limitación, un ratón, una rata, una vaca, una cabra, una oveja, un cerdo, un perro, un gato, un caballo, una cobaya, un canino, un hámster, un visón, una foca, una ballena, un camello, un chimpancé, un mono rhesus y un ser humano. Los ejemplos de aves adecuadas incluyen, pero sin limitación, un pavo, un pollo, un ganso, un pato, una cerceta, un ánade real, un estornino, un ánade rabudo, una gaviota, un cisne, una pintada o un ave acuática por nombrar algunos. Los informes indican además que el rango del hospedador del virus de la gripe A puede estar expandiéndose, de manera que puede requerirse administrar un virus de la invención a cualquier ave o mamífero adicional. Como se ha explicado anteriormente, un virus de la gripe B infecta casi exclusivamente a seres humanos, mientras que el virus de la gripe A infecta a una gran diversidad de mamíferos, incluidas las aves de corral.

En otro aspecto, la invención se refiere a un kit, en lo sucesivo en el presente documento kit de la invención, que comprende el polinucleótido I o II, el vector, la célula hospedadora, el virus y/o la composición de la invención.

La invención también proporciona un kit para la inmunización de un sujeto con un virus atenuado de la invención. El kit comprende el virus atenuado, un vehículo farmacéuticamente aceptable, un aplicador y un material de instrucciones para el uso del mismo. Se puede preferir más de un virus cuando sea deseable inmunizar un hospedador contra varios aislados diferentes de un virus particular. La invención incluye otras realizaciones de kits que se conocen por los expertos en la técnica. Las instrucciones pueden proporcionar cualquier información que sea útil para

dirigir la administración de los virus atenuados.

Otro componente que puede estar presente en el kit es un envase que permite mantener los reactivos dentro de límites determinados. Los materiales adecuados para preparar dichos envases incluyen vidrio, plástico (polietileno, polipropileno, policarbonato y similares), botellas, viales, papel, sobrecitos, y similares. El kit de la invención puede contener adicionalmente instrucciones para usar los reactivos en el método de la invención. Dichas instrucciones se pueden encontrar en forma de material impreso o en forma de soporte electrónico que puede almacenar instrucciones de tal forma que un sujeto las pueda leer, tales como medios de almacenamiento electrónico (discos magnéticos, cintas y similares), medios ópticos (CD-ROM, DVD) y similares. Los medios pueden contener adicionalmente, o como alternativa, sitios web de Internet que proporcionen dichas instrucciones.

Métodos de la invención

En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para evaluar en un sujeto la gravedad de una infección por virus de la gripe, en lo sucesivo en el presente documento método de la invención, que comprende detectar en una muestra biológica aislada de dicho sujeto, el polinucleótido I o el virus de acuerdo con la invención, donde si se detecta dicho polinucleótido, la infección que padece el sujeto es más grave que en un sujeto que no presente el polinucleótido I o el virus de la invención.

Al realizar el método de la presente invención, se obtiene una muestra del sujeto. El término "muestra", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier muestra que pueda obtenerse y aislarse del sujeto. Los ejemplos de muestras incluían, sin limitación, sangre, suero, saliva, semen, esputo, líquido cefalorraquídeo (CSF), lágrimas, moco, sudor y extractos cerebrales. La expresión "muestra aislada" significa que la muestra se ha extraído del sujeto y no comprende uno o más o todos los constituyentes naturales con los que está asociada en la naturaleza.

Los ejemplos de sujetos adecuados incluyen, pero sin limitación, mamíferos (por

ejemplo, un ratón, una rata, una vaca, una cabra, una oveja, un cerdo, un perro, un gato, un caballo, una cobaya, un canino, un hámster, un visón, una foca, una ballena, un camello, un chimpancé, un mono rhesus, un ser humano, etc.) o aves (por ejemplo, un pavo, un pollo, un ganso, un pato, una cerceta, un ánade real, un estornino, un ánade rabudo, una gaviota, un cisne, una gallina pintada o aves acuáticas, por nombrar algunos). Los informes indican además que el rango del hospedador del virus de la gripe A puede estar expandiéndose, de manera que puede requerirse administrar un virus de la invención a cualquier ave o mamífero adicional.

El método de la invención comprende detectar en una muestra biológica aislada de dicho sujeto, el polinucleótido I o el virus de acuerdo con la presente invención. Los métodos para detectar y aislar el polinucleótido I o el virus son ampliamente conocidos en la técnica y son práctica habitual para el experto en la técnica.

Como se usa en el presente documento, la expresión "infección grave" se refiere a un sujeto que padece un perfil clínico compatible con la gripe y necesita ser hospitalizado debido a un perfil clínico que muestra neumonía, fallo multiorgánico y choque séptico y que requiere la admisión en la unidad de cuidados intensivos (UCI).

En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para evaluar en un sujeto la gravedad de una infección por virus de la gripe que comprende detectar en una muestra biológica aislada de dicho sujeto, el polinucleótido II o el virus de acuerdo con la invención, donde si se detecta dicho polinucleótido, la infección que padece el sujeto es menos grave que en un sujeto que no presente el polinucleótido II o el virus de la invención.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para estimular una respuesta inmune en un sujeto contra la infección por virus de la gripe A que comprende administrar a dicho sujeto el polinucleótido II o el virus de acuerdo con la invención, donde si se detecta dicho polinucleótido, la infección padecida por el sujeto es menos grave que en un sujeto que no presente el polinucleótido II o el virus de la invención.

Como se usa en el presente documento, "administrar" se refiere a la administración usando cualquiera de los diversos métodos y sistemas de administración conocidos por los expertos en la técnica. La administración puede realizarse, por ejemplo, por vía intranasal, intraperitoneal, intracerebral, intravenosa, oral, transmucosa, subcutánea, transdérmica, intradérmica, intramuscular, tópica, parenteral, mediante implante, intratecal, intralinfática, intralesional, pericárdica o epidural. Un agente o composición también puede administrarse en un aerosol, tal como para administración pulmonar y/o intranasal. La administración puede realizarse, por ejemplo, una vez, una pluralidad de veces, y/o durante uno o más periodos extendidos. Estos sistemas de administración se han explicado previamente en la presente descripción.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la técnica al que pertenece esta invención. Los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento pueden usarse en la práctica de la presente invención. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variaciones no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Objetos, ventajas y características adicionales de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica tras el examen de la descripción o pueden aprenderse mediante la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden ser limitantes de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Diferentes cantidades de genomas defectuosos se detectan en virus de un caso letal o leve. (A) Esquema de genomas defectuosos del virus de la gripe (DVG). Los cuadrados de color negro representan las lecturas correspondientes a saltos. (B) Proporción de DVG, calculada como lecturas de saltos/lecturas por millón (RPM) que alinean con el genoma viral , determinada en viriones purificados de un caso letal (F) o leve (M) de una infección pandémica de IAV 2009. La proporción de DVG de M-IAV se toma como 1 y se muestra el cambio

de veces para F-IAV. (C). Representación de escala logarítmica de distribución de DVG por segmento calculada como RPM de saltos que alinean cada segmento viral, analizados en viriones purificados de F y M-IAV. Segmentos virales , PB1 , PB2, PA, HA, NP, NA, M, NS.

Figura 2. Se producen genomas defectuosos durante la infección por el virus de la gripe y se incorporan a los viriones. (A) Cebadores utilizados en PCR para detectar el genoma viral (negro) o los DVG (rojo). (B) Detección de DVG (arriba) o genoma viral (abajo) del segmento PA en viriones de sobrenadantes de cultivos celulares infectados con F o M. Los asteriscos representan bandas correspondientes a los DVG clonados y secuenciados. (C) Detección de DVG (arriba) o genoma viral (abajo) del segmento PA en viriones de tres clones purificados por placa independientes (.1 , .2, .3) de F o M-IAV. Los asteriscos representan bandas correspondientes a los DVG clonados y secuenciados. (D) Acumulación de DVG después de pases ciegos seriados del clon M-IAV.1 y F-IAV.2. Los pases seriados de cada clon se repitieron dos veces (P1-3.1 y P1-3.2). B-D, tamaño de marcadores de ADN indicado en nucleótidos.

Figura 3. Los genomas virales defectuosos se producen durante la infección por F y M-IAV del virus de la gripe. (A, B) Acumulación de DG después de pases seriados (P1, P2, P3) de dos lotes diferentes de M-IAV y F-IAV. Tamaño de marcadores de ADN indicado en nucleótidos. (C) Controles de especificidad por RT-PCR. Se usaron cebadores y condiciones de amplificación para el fragmento interno correspondiente al segmento de longitud completa (cebadores Int) con un plásmido que codifica el segmento PB2 de longitud completa (dilución 1 o 1/100) o con DG purificados (dilución 1 o 1/100). Los cebadores y las condiciones de RT-PCR para la amplificación de DG (cebadores Ext) se usaron con un plásmido que codificaba el segmento PB2 de longitud completa (dilución 1 o 1/100) o con DG purificados (dilución 1 o 1/100).

Figura 4. Alineamiento de secuencias de DG clonadas. Los clones de DG amplificados por PCR del segmento PB2 de (A) aislados clínicos de M-IAV (clones 1 y 2) y F-IAV, o (B) los virus recombinantes PA mut y PB2 mut se alinean con la secuencia de referencia A/Cal/04/09.

secuencias UTR, cebadores para la secuenciación de DG,


secuencias PB2.

Figura 5. Secuencia de los clones de DG del segmento PB2. Secuencia de los clones de DG correspondientes al segmento PB2 de (A) aislados clínicos de M-IAV (clones 1 y 2) y F-IAV o (B) virus recombinantes PA mut PB2 mut. Las secuencias subrayadas representan los cebadores usados para la secuenciación. Las cajas de color gris provienen del extremo 5' del segmento PB2 fusionado a las cajas de color blanco que provienen del extremo 3'.

Figura 6. Diferentes niveles de inducción de la respuesta antivírica en células infectadas por F o M-IAV. (A) La inducción de la expresión de GFP después de la infección de Α549/ρΓ(!ΡΝ-β) en células moi 3.GFP se cuantificó mediante FACS, usando el virus ANSI como referencia, y se representa el porcentaje de células positivas para GFP. Los resultados mostrados son representativos de 3 experimentos independientes, en los que se midieron 10.000 eventos para cada muestra. La significación se determinó mediante ANOVA de dos vías con prueba post hoc de Bonferroni, * p <0,05¡ *** p <0,001. (B) Se infectaron células epiteliales de pulmón humano cultivadas (A549) a moi 3 con stocks de F y M-IAV o (C) con clones purificados en placas de F o M-IAV. A las horas indicadas después de la infección (hpi), se usaron muestras para detectar las proteínas indicadas por Western blot. MOCK, células tratadas con PBS como control negativo; ANSI , células infectadas con virus de la gripe que carecen de proteína NS1 como control positivo de la activación de la respuesta inmune innata después de la infección por el virus de la gripe. La infección vírica se detectó con anticuerpo específico para NP, usando β-actina como control de carga. Los experimentos B y C se realizaron por triplicado y se muestran datos representativos. La cuantificación y el análisis de significación de los triplicados se muestran en la Figura 7.

Figura 7. Acumulación cuantitativa de proteínas antivíricas en células infectadas por F y M-IAV. (A) Se infectaron células epiteliales de pulmón humano cultivadas (A549) con stocks de F y M-IAV o (B) con clones purificados en placas de F o M-IAV a moi 3. 24 horas después de la infección (hpi), se usaron muestras para detectar las proteínas indicadas por Western blot. Las células MOCK se

trataron con PBS como control negativo y se usaron como fondo para el análisis cuantitativo. El anticuerpo β-actina se usó como control de carga. Las barras de error indican la media ± DE de tres experimentos independientes (*p <0,05, **p <0,01 mediante la prueba t de Student).

Figura 8. Se producen genomas defectuosos durante la infección por el virus de la gripe y se incorporan a los viríones ín vivo. Detección por PCR de DVG (arriba) o genoma viral (abajo) del segmento PA en extractos de pulmón (A) y en viríones purificados de pulmones (B) de ratones infectados con aislados de F o M-IAV. Tamaño de la escalera de ADN indicado en nucleótidos.

Figura 9. Los virus recombinantes tienen actividad de polimerasa comparable y se replican de manera similar en cultivo celular. (A) Se usaron las células HEK293T para la reconstitución de CAT RNP in vivo (véase Métodos), que indica la actividad de polimerasa viral. 24 h después de la reconstitución, la proteína CAT en el extracto celular total se analizó mediante ELISA. MOCK, se omitieron los plásmidos que expresan PB1 o NP. CTRL-CAT indica acumulación de CAT en células transfectadas exclusivamente con plásmido pHHNS-CAT. Se realizaron tres experimentos independientes; valores mostrados como media (%) ± DE. La significación se determinó mediante ANOVA de dos vías con prueba post hoc de Bonferroni (ns no significativo). (B) Se controló la acumulación de las proteínas víricas PB1 y NP en extractos celulares usados para análisis CAT, usando GADPH como control de carga. (C) Se infectaron células A549 cultivadas a 3 ufp/célula con los virus recombinantes indicados en la Tabla 1. A la hpi, se usaron muestras para detectar las proteínas indicadas por Western blot. Se realizaron tres experimentos independientes y uno de ellos se muestra como representativo. (D) Se infectaron células A549 cultivadas a 103 ufp/célula con los virus recombinantes indicados en la Tabla 1. A la hpi indicada, se recogieron los sobrenadantes y se determinó el título del virus mediante ensayo de placas de lisis en células MDCK. Se realizaron tres experimentos independientes por triplicado; valores mostrados como media ± DE. La significación se determinó mediante ANOVA de dos vías con prueba post hoc de Bonferroni (ns no significativo).

Figura 10. El virus recombinante CAL tiene números de DVG tan bajos como

F-IAV. Proporción de DVG en virus recombinantes CAL y aislados clínicos de F y M-IAV. El virus recombinante CAL se ha usado como estructura principal para generar virus mutantes en el presente estudio. Representación del diagrama de dispersión de las proporciones de DVG, calculadas como lecturas de saltos/lecturas por millón (RPM) que alinean el genoma viral. El color negro indica virus recombinante CAL de tipo silvestre, el color gris indica F-IAV, el color gris claro indica el M-IAV.

Figura 11. La mutación PA D529N presente en un virus de un caso letal reduce los niveles de DVG en viríones de virus recombinantes con dos entornos genéticos diferentes. (A) Proporción de DVG calculada como lecturas de saltos/lecturas por millón (RPM) que alinean el genoma viral, analizada en viriones purificados a partir de virus recombinantes generados en el fondo genético A/H1 N1/California/04/09. La proporción de DVG del virus recombinante CAL se toma como 1 y se muestra un cambio en veces para los virus mutantes frente a CAL. CAL, virus recombinante de tipo silvestre; PB2 mut, virus recombinante que lleva la mutación PB2 221T; PA mut, virus recombinante que lleva la mutación PA 529N; PB2/PA mut virus recombinante que lleva las mutaciones PB2 221T y PA 529N (polimerasa de tipo F). (B) Proporción de DVG como se describe en la parte A, el virus recombinante CAL se toma como 1. M mut que lleva las mutaciones M1 S30N y M2 V86S; M-PA mut, virus recombinante que porta las mutaciones M1 S30N, M2 V86S y PA 529N. (C) Distribución de DVG por segmento calculada como RPM de salto que alinean cada segmento viral, analizados en viriones purificados de virus recombinantes CAL, PB2 mut, PA mut y PB2/PA mut, M mut y M-PA mut (D) proporción de DVG, como se describe en (A) y (B), de todos los virus recombinantes. CAL se toma como 1 y se muestra el cambio en veces para los demás virus. Segmentos virales, PB1, PB2, PA, HA, NP, NA, M, NS.

Figura 12. Cantidad diferente de genomas defectuosos y la activación de la respuesta antiviral se produce durante la infección por virus de la gripe recombinantes. (A) Detección de DVG del segmento PA en viriones de virus recombinantes CAL, PA mut, PB2 mut y PB2/PA mut. (B) Las células epiteliales de pulmón humanas cultivadas (A549) se infectaron con cepas de virus recombinantes PB2 mut, PA mut o PB2/PA mut a moi 1. Se determinó la acumulación intracelular de DVG a las horas indicadas después de la infección (hpi). Tamaño del marcadorde ADN indicado en nucleótidos. (C) Las células epiteliales de pulmón humanas cultivadas (A549) se infectaron con cepas de virus recombinantes CAI PB2 mut, PA mut o PB2/PA mut a moi 1. 16 horas después de la infección (hpi), se usaron muestras para detectar las proteínas indicadas por Western blot. MOCK, células tratadas con PBS como control negativo; ANSI, células infectadas con virus de la gripe que carecen de proteína NS1 como control positivo de la activación de la respuesta inmune innata después de la infección por el virus de la gripe. La infección vírica se detectó con anticuerpo específico para NP, usando β-actina como control de carga. Los experimentos B y C se realizaron por triplicado y se muestran datos representativos. La cuantificación y el análisis de significación de los triplicados se muestran en la Figura 13.

Figura 13. Acumulación cuantitativa de DVG en células infectadas con virus recombinantes. Se infectaron células epiteliales de pulmón humano cultivadas (A549) con las reservas de virus mutantes indicadas a moi 1. Se determinó la acumulación intracelular de DVG en las horas indicadas posteriores de la infección (hpi) como la relación entre DVG y genomas virales de longitud completa (como se muestra en la Figura 12). Las barras de error indican la media ± DE tres experimentos independientes (*p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001 por ANOVA de dos vías con la prueba post hoc de Bonferroni).

Figura 14. Acumulación cuantitativa de proteínas anti vi rales en células infectadas con virus recombinantes. Se infectaron células epiteliales de pulmón humano cultivadas (A549) con CAL o stocks de virus mutantes a moi 1. A las 16 horas después de la infección (hpi), se usaron muestras para detectar (A) proteína Mx o (B) proteína ISG56 mediante Western blot. Las células MOCK se trataron con PBS como control negativo y se usaron como fondo para el análisis cuantitativo. El anticuerpo β-actina se usó como control de carga. Las barras de error indican la media ± DE de tres experimentos independientes (*p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001 por ANOVA de dos vías con la prueba post hoc de Bonferroni).

Figura 15. La mutación PA D529N presente en virus de un caso letal aumenta la mortalidad In vivo. (A) A los ratones (n = 5) se les inoculó por vía intranasal 108- 102 ufp de cada virus recombinante o se pseudo-infectaron como control, mock. La tasa de supervivencia para cada grupo de animales se controló diariamente durante 14 días después de la infección (dpi). (B) Se muestra la dosis que causó el 50% de mortalidad de ratones en cada infección (LD50).

Figura 16. La mutación PA D529N presente en virus de un caso letal aumenta la patogenicidad in vivo. (A) A los ratones (n = 5) se les inoculó por vía intranasal diferentes dosis (106-102 ufp) de cada virus recombinante rCAL, PA mut, PB2 mut o PB2/PA o se pseudo-infectaron como control, mock. El peso corporal para cada grupo de animales se controló diariamente durante 14 días después de la infección (dpi). (B) Los ratones (n = 5) se inocularon por vía intranasal con una dosis subletal de cada virus recombinante o PBS (MOCK) como control. Los pesos corporales se determinaron diariamente durante 10 días y se muestran como un porcentaje del peso corporal en la inoculación (tiempo 0). La significación se determinó mediante A NOVA de dos vías con la prueba post hoc de Bonferroni (*p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001).

Figura 17. La mutación PA D529N presente en un virus de un caso letal aumenta la patogenicidad e induce una respuesta inmune alterada in vivo. Los ratones (n = 5) se inocularon por vía intranasal con una dosis subletal (103 ufp) de cada virus recombinante o PBS (MOCK) como control. A la dpi indicada, se determinaron los títulos víirales en los pulmones (ufp/g de tejido) (A). Los neutrófilos (B) y los macrófagos alveolares (C) se cuantifi carón en los pulmones (% de células) a la dpi indicada. La significación se determinó mediante la prueba t de Student (*p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001).

Figura 18. Lesiones histológicas encontradas en pulmones de ratones inoculados con M o F-IAV. (A, B) Tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de pulmones de ratones inoculados con M-IAV. (A) Congestión e infiltrados linfoides difusos en el intersticio, barra = 50 pm, (B) perivasculitis leve: observar infiltrados inflamatorios leves de linfocitos alrededor de una arteriola pequeña y difusos en el tejido intersticial, barra = 50 μηι. (C-E); H&E de pulmón de ratón inoculado con F-IAV. (C) infiltrados inflamatorios moderados de linfocitos alrededor de un bronquiolo dilatado, barra = 50 μιη, (D) Hiperplasia grave de células fagocíticas en el

intersticio, barra = 20 μιη, (E) Perivasculitis leve: cantidad moderada de células linfoides infiltradas alrededor de una arteríola pulmonar, barra = 50 μητ Las flechas muestran algunos ejemplos de la lesión indicada en cada caso.

Figura 19. Los virus aislados de pacientes graves o fallecidos infectados con el virus de la gripe tienen bajos números de DVG. (A) Características de los pacientes incluidos en este estudio. Hombre (M), mujer (F). 1: UCI, unidad de cuidados intensivos. 2: MV y ETI >96 h, necesaria ventilación mecánica e intubación endotraqueal durante más de 96 horas. 3: ARDS, síndrome de dificultad respiratoria aguda. 4: Los factores de comorbilidad incluyen cardiopatía, diabetes, embarazo, enfermedad pulmonar, inmunodeficiencia, insuficiencia renal, obesidad o enfermedad cardiopulmonar. (B) Representación del diagrama de dispersión de las proporciones de DVG, calculadas como lecturas en saltos/lecturas por millón (RPM) que alinean el genoma viral, que se encuentra en viriones aislados de pacientes infectados con virus de la gripe A. Los cuadros rojos y azules indican los intercuartiles con valores que representan el 50 % intermedio de la población. Casos graves/letales, n = 6; Casos leves, n = 6. Las barras horizontales dentro de cada cuadro indican el valor mediano. La significación se determinó mediante una prueba de Mann-Whitney de dos colas; p = 0,0152 (*p <0,05).

Figura 20. Los virus aislados de pacientes graves o fallecidos infectados con el virus de la gripe tienen bajos números de DVG. Proporciones de DVG, calculadas como lecturas de salto por millón (RPM) que alinean el genoma viral, que se encuentra en viriones aislados de pacientes infectados con virus de la gripe A. Virus de casos graves/letales, SF1-SF6; Virus de casos leves, M1-M6.

Figura 21. Distribución de DVG por segmento viral en IAV de casos altamente graves/letales y leves. Números absolutos de distribución de DVG por segmento calculados como RPM de saltos que alinean cada segmento viral, analizados en viriones purificados de A) Virus de casos graves/letales, SF1-SF6; B) virus de casos leves, M1-M6. Segmentos virales, PB1, PB2, PA, HA, NP, NA, M, NS. Ha de apreciarse que estas distribuciones de DG son relativas a todos los DG que se encuentran en cada virus, y sus cantidades no son estrictamente comparables de un virus a los demás.

Figura 22. Distribución de DVG por segmento viral en casos graves/ietales y leves de IAV. Representación de la escala logarítmica de la distribución de DVG por segmento calculada como lecturas de saltos por millón (RPM) que alinean cada segmento viral, analizados en viriones purificados de A) Virus de casos graves/letales, SF1-SF6; B) virus de casos leves, M1-M6. Segmentos virales, PB1, PB2, PA, HA, NP, NA, M, NS. Ha de apreciarse que estas distribuciones de DVG son relativas a todos los DVG que se encuentran en cada virus, y sus cantidades no son estrictamente comparables de un virus a los demás.

Figura 23. Los virus aislados de pacientes graves o fallecidos infectados con el virus de la gripe tienen bajos números de DVG en los tres segmentos de subunidades de polimerasa. Representación del diagrama de dispersión de las proporciones de DVG, calculadas como lecturas de saltos/lecturas por millón (RPM) que alinean el genoma viral, que se encuentra en viriones aislados de pacientes infectados con virus de la gripe A. Los cuadros rojos y azules indican los intercuartiles con valores que representan el 50 % intermedio de la población. Casos graves/letales, n = 6; Casos leves, n = 6. Las barras horizontales dentro de cada cuadro indican el valor mediano. La significación se determinó mediante una prueba de Mann-Whitney de dos colas; p = 0,0124 (*p <0,05).

EJEMPLO

I. MATERIAL Y MÉTODOS

Declaración de ética

Todos los procedimientos que requerían el uso de animales cumplieron la legislación española y europea sobre vivisección y uso de organismos genéticamente modificados, y los protocolos fueron aprobados por el National Center for Biotechnology Ethics Committees on Animal Experimentation y el Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) Bioethics Subcommittee (permiso 11014). Se siguieron las directrices incluidas en la legislación española vigente sobre protección de animales utilizados en investigación y otros objetivos científicos (RD 53/2013) y la actual Directiva de la Unión Europea 2014/11/UE sobre protección para animales utilizados en experimentación y otros fines científicos.

El National Influenza Center de Madrid (Instituto de Salud Carlos III) y otros laboratorios regionales de diferentes regiones españolas, constituyeron la red ReLEG incluida en el Sistema de Vigilancia de la Gripe en España (SVGE), que controló la circulación de los virus de la gripe cada temporada de gripe como parte de la vigilancia en todo el país. Los virus descritos en este estudio se han detectado dentro de esta actividad de vigilancia. No se necesita un consentimiento informado para este estudio, ya que los pacientes de los que se aislaron estos virus eran anónimos.

Biosegurídad

Los experimentos de cultivo celular y modelo de ratón realizados con virus recombinantes portadores de mutaciones detectadas en un caso letal de IAV se realizaron en condiciones BSL2+ y en un aislador biológico en instalaciones de animales BSL2+, respectivamente.

Materiales biológicos

Las líneas celulares utilizadas en este estudio fueron células de riñón canino MDCK (ATCC), epitelio pulmonar humano A549 (ATCC) (Giard DJ, et al., 1973. J Nati Cáncer Inst.; 51(5):1417-23) y riñón embrionario humano HEK293T (ATCC) (Graham FLet al. 1977, J Gen Viral. 1977; 36(1):59-74).

Aislados virales clínicos

Los virus utilizados en el presente estudio se seleccionaron según los siguientes criterios para los pacientes de los que se aislaron los virus. Los pacientes incluidos en la cohorte grave/letal fueron casos confirmados de gripe A (H1N1)pdm09, mayores de 4 y menores de 65 años, ingresados en la unidad de cuidados intensivos (UCI) y con la información relacionada con los factores de riesgo reflejados en su historia clínica. Aquellos pacientes que desarrollaron una enfermedad muy grave no mostraron ninguna comorbilidad asociada con la

infección grave por el virus de la la gripe A, y los pacientes fallecidos presentaron algunas enfermedades comórbidas. Los pacientes leves fueron casos confirmados de gripe A (H1N1) pdm09, mayores de 4 y menores de 65 años, que desarrollaron enfermedad leve y fueron controlados por centros médicos centinela incluidos en el Sistema Nacional de Vigilancia de la Gripe en España. La selección de casos para esta cohorte leve se realizó al azar en los pacientes que cumplen los criterios descritos anteriormente y cuyos virus aislados eran del mismo linaje filogenético de San Petersburgo que los de la cohorte grave/letal, de acuerdo con su gen HA. Se recogieron muestras respiratorias en medio de transporte de virus (MEM, 200 U/ml de penicilina, 200 μg/ml de estreptomicina, 200 U/ml de micostatina y fracción V de albúmina sérica bovina al 0,25 %) y se enviaron al Centro Nacional de la Gripe en España.

Todos los virus de la gripe A se aislaron en el National Influenza Centre (CNM, ISCIII) a partir de muestras respiratorias enviadas para caracterización virológica por el Sistema de Vigilancia de la Gripe en España (SVGE). El National Influenza Center en Madrid y otros laboratorios regionales constituyen la red RELEG del SVGE, que controla la circulación de virus en cada temporada de gripe como parte de la vigilancia nacional. Todos los virus de pacientes leves o graves/letales se aislaron de las vías respiratorias superiores, exudados faríngeos o nasofaríngeos. Se usaron monocapas semiconfluentes de células MDCK para el aislamiento viral primario. Las monocapas se inocularon con 200 μί de muestras homogeneizadas; cuando el efecto citopático fue del 75-100 %, los cultivos se cosecharon y los sobrenadantes se usaron para la generación de reserva de virus mediante la inoculación de células MDCK.

Mutagénesis de plásmidos pCAGG-PB2 y PA derivados de CAL/04/09

Se diseñaron mutaciones específicas en plásmidos de expresión pCAGGS derivados de la cepa CAL utilizando el kit de mutagénesis de sitio dirigido QuickChangeTM (Stratagene) como se recomendó por el fabricante. Estos materiales se desarrollaron utilizando la tecnología licenciada (Kawaoka-P99264US virus de la gripe recombinante para vacunas y terapia génica).

Ensayo de minireplicón

El ensayo de minireplicón recombinante se realizó esencialmente como se describe (Marcos- Villar L, et al., 2016, J Viral.; 90(7): 3694-707). En resumen, se transfectaron cultivos de células HEK293T (2,5 x 108 células) con una mezcla de plásmidos que expresaban los componentes RNP (pCMVPA, 2,5 ng; pCMVPBI , 12,5 ng; pCMVPB2, 12,5 ng; y pCMVNP, 500 ng) y un plásmido genómico que expresaba un gen indicador de cloranfenicol acetiltransferasa tipo ARN viral (vRNA) (pHHCAT, 500 ng) usando la técnica de fosfato de calcio (Wigler M, et al., 1979. Proc Nati Acad Sci USA.; 76(3): 1373-6). 20 h después de la transfección, se prepararon extractos celulares totales y se determinó la acumulación de CAT mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA, GE Healthcare), usando enzima CAT purificada como patrón.

Generación virus de la gripe recombinantes

Se diseñaron mutaciones específicas en plásmidos pHH genómicos de virus recombinantes derivados de la cepa A/H 1 1 /California/04/2009 usando el kit de mutagénesis de sitio dirigido QuickChange (Stratagene) según lo recomendado por el fabricante. Estos materiales se desarrollaron utilizando la tecnología licenciada (Ref. Kawaoka-P99264US Virus de la gripe recombinantes para vacunas y terapia génica). Las mutaciones se rescataron en virus infecciosos mediante técnicas estándar (Falcón A, et al., 2004. J Viral.; 78: 3880-8; Neumann G, et al. 1999. Proc Nati Acad Sci USA.; 96:9345-50.). En resumen, para rescatar el virus infeccioso de los ADNc, se cotransfectaron 105 células 293T HEK con una mezcla de 12 ADN plasmídicos (100 ng cada uno) que incluían (i) 8 plásmidos genómicos, cada uno con un ADNc del segmento viral bajo el control del promotor poli y (ii) 4 plásmidos de expresión que codifican las tres subunidades de polimerasa y NP. La transfección se realizó con Lipofectamine Plus (Gibco) en las condiciones recomendadas por el fabricante. 16 h después de la transfección, las células transfectadas se pusieron en placas sobre un exceso de células MDCK. Cuando fue evidente un efecto citopático, el medio sobrenadante se recogió y se usó para el ensayo en placas en células MDCK para estimar el título viral. El sobrenadante se usó para producir una reserva vírica a una baja multiplicidad de infección. La identidad de los virus mutantes rescatados se determinó por secuenciación de ADN derivados de los segmentos de ARN PA y PB2 por amplificación PCR de transcripción inversa (RT-PCR).

Generación de reservas víricas

Los sobrenadantes de células cosechadas inoculadas con muestras clínicas o transfectadas con plásmidos para la generación de virus recombinantes se titularon mediante ensayo en placas estándar. Estos primeros pases de cada virus se usaron para inocular células MDCK frescas a una baja multiplicidad de infección controlada indicada (0,0001 moi). Todas las reservas víricas utilizadas para estudios adicionales tenían un título viral de aproximadamente 107 ufp/ml.

Purificación de viriones y aislamiento de ARN

Para la purificación del virus, los sobrenadantes de cultivo de células MDCK infectadas con 10"4 moi se centrifugaron (10 min, 3110 g, 4°C). Los sobrenadantes se sedimentaron a través de un gradiente escalonado de sacarosa (tampón TNE, sacarosa al 50% y al 33% en Tris-HCI 50 mM, NaCI 100 mM, EDTA 5 mM, pH 7,5) (1 h, 274000 g, 4°C). Se recogió la interfase del 50 al 33 %, se diluyó en tampón TNE, y se sedimentó a través de un cojín de sacarosa al 33 % en TNE (2 h, 112000 g, 4°C). Para la purificación de virus aislados de pulmón de ratón infectado, se usó el protocolo anterior con modificación del volumen de gradiente de sacarosa y rotores según el volumen de muestra. Para el aislamiento, el ARN en viriones purificados se trató con SDS al 0,5 % y 200 g/ml de proteinasa K en TNE (2 h, 37°C), seguido de extracción con fenol-cloroformo-isoamilalcohol-hidroxiquinoleína y precipitación con etanol (Perales B et al., 1996, J Virol.; 70(3): 1678-86). El ADN se eliminó mediante el tratamiento con ADNasa (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La calidad y la cantidad de cada preparación de ARN se controlaron usando un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Las cantidades apropiadas de cada muestra se analizaron mediante secuenciación de alto rendimiento (véase a continuación).

Western blotting

Para la detección de proteínas víricas y celulares, se recogieron extractos celulares totales y se realizaron ensayos de Western blot como se describe (Falcón A, et al., 2004, J Viral.; 78: 3880-8). Se usaron anticuerpos contra GAPDH, β-actina (ambos de Sigma), ISG56, Mx1 (ambos de Santa Cruz), NP (Jorba, Coloma et al., 2009 PLoS Pathog. 5 (5): e1000462.) y PB1 (González y Ortín, 1999, EMBO J.; 18 (13): 3767-75).

Secuenciación profunda

La secuenciación para F y M-IAV descritos previamente aislados durante la temporada de gripe de 2009-2010 (5) se realizó con lllumina Genome Analyzer llx usando la química de secuenciación de lllumina v5 y lecturas simples de 36 pb. La llamada base se realizó utilizando lllumina pipeline versión 1.7.0 (dentro de SCS 2.8). Todos los demás virus se secuenciaron con química TruSeq v3 y lecturas simples de 50 pb en un lllumina HiSeq 2000.

Análisis de datos de secuenciación profunda

Alineamiento de lectura corta contra el genoma de la gripe

Para cada muestra, las secuencias de FASTQ se alinearon contra el genoma del virus de la gripe (A/California/04/09) con TopHat2 (Kim D, et al., 2013, Genome Biol.; 14(4): R36), permitiendo intervalos de tamaño de intrón entre 5 y 100000 nucleótidos. Samtools (Li H, et al. 2009, Bioinformatics; 25(16): 2078-9) se usó para extraer lecturas que se alineaban como dos fragmentos separados (lecturas en saltos) de los archivos BAM generados por TopHat2. Solamente se seleccionaron lecturas que se dividieron en dos fragmentos que se alinean en posiciones de segmentos distantes (lecturas en saltos). Los alineamientos se realizaron usando todos los parámetros predeterminados con solo una excepción: Ha habido más restricción que en el programa predeterminado y se han tenido en cuenta solamente lecturas en saltos soportadas por al menos cuatro nucleótidos en un lado de la unión. Adicionalmente, solo se tuvieron en cuenta los alineamientos principales y se descartaron los alineamientos secundarios propuestos por el

programa.

Determinación de consenso de secuencia vírica

Para determinar la secuencia de consenso de cada virus, se analizaron la cobertura y la composición de nucleótidos de lecturas alineadas. Se consideraron las posiciones de nucleótidos con una identidad de >75 %. Se usaron Samtools mpileup (Li H, et al. 2009, Bioinformatics; 25(16): 2078-9) y se utilizaron guiones php internos.

Cuantifícación, filtrado y normalización de uniones

Solamente se seleccionaron segmentos defectuosos generados por dos o más lecturas en saltos que incluyen exactamente las mismas coordenadas y que generan un tamaño de segmento de ARN teórico final de≤1000 nucleótidos. Para las muestras del año 2009, no se pudo determinar la orientación de lectura, ya que el protocolo de secuencia aplicado no era específico de cadena. En las muestras restantes, solamente se contaron las lecturas de la cadena de ARN genómico. Para cada muestra, los valores de lecturas en saltos por millón (RPM) se calcularon como la suma de todas las lecturas en saltos seleccionadas divididas por el número de lecturas totales que se alinearon con el genoma del virus de la gripe, luego se multiplicaron por 106. Para el análisis de lecturas en saltos por segmento, los valores de RPM se normalizaron con respecto a lecturas totales alineadas con cada segmento de ARN del genoma.

Número de acceso a la secuencia de nucleótidos.

Los datos de RNA-Seq obtenidos en este estudio se han depositado en la base de datos de NCBI-SRA (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) con n.° de acceso SRP077920.

Detección de DVG

Se usó RT-PCR para los segmentos PA o PB2 para determinar la presencia de

DVG y su cantidad relativa con respecto al ARN de longitud completa del mismo segmento viral. Para detectar segmentos de longitud completa, se usaron cebadores internos para amplificar un fragmento central, que no está presente en los DVG. Para detectar los DVG, se usaron la misma muestra de ARN y los cebadores externos del segmento PA en una reacción separada. Se aplicaron tiempos de amplificación cortos para la detección tanto del fragmento interno correspondiente al segmento de longitud completa como de los DVG, para permitir la detección de ARN de hasta 1000 nt de longitud. El método se ilustra en la Figura 2A. La reacción de transcripción inversa se realizó durante 30 min (42°C) seguida de PCR (35 rondas a 94°C durante 30 s, 53°C/58°C durante 40 s, y 68°C durante 40 s usando el kit Titan-One RT-PCR (Roche)). Como control de especificidad, los cebadores y las condiciones de RT-PCR para la amplificación de DVG se usaron con un plásmido que codifica el segmento de PA de longitud completa, y no se obtuvo ningún producto de amplificación (Figura 3C). Adicionalmente, se usaron cebadores y condiciones de amplificación para el fragmento interno correspondiente al segmento de longitud completa con DVG purificados, y no se obtuvo ningún producto de amplificación (Figura 3C).

Clonación y secuenciación de DVG

Los DVG de viriones purificados cultivados en células y de tejidos de pulmón de ratones infectados se amplificaron por RT-PCR (kit Titan-One RT-PCR, Roche) como se indicó anteriormente. Los productos obtenidos se amplificaron con Taq Polymerase (Sigma) para la posterior clonación en el vector pGEM-T usando el kit pGEM-T Easy (Promega). Los clones seleccionados se secuenciaron por el método de Sanger y las secuencias obtenidas se analizaron para confirmar que correspondían a genomas defectuosos, incluyendo los extremos 3' y 5" y una gran deleción interna del segmento viral de longitud completa.

Infecciones víricas en cultivo celular

Las células epiteliales alveolares de pulmón humano cultivadas (A549) se infectaron a 1Cr3 ufp/célula (baja multiplicidad de infección; moi) o 3 ufp/célula (alta moi). Después de 1 h, el virus no unido se aclaró con PBS ácido (pH 5,3) y en

diversos momentos (horas después de la infección; hpi), se recogieron los sobrenadantes celulares y se usaron para la titulación del virus mediante ensayo en placa.

Infecciones víricas ¡n vivo

Para evaluar la patogenicidad de los virus, se infectaron 5 ratones hembras BALB/c AnNHsd (6-7 semanas de edad) por vía intranasal con diferentes dosis (106-102) de cada uno de los virus de la gripe recombinantes descritos aquí, o se infectaron con mock. Los animales se controlaron diariamente en busca de signos clínicos y pesos corporales durante dos semanas. Por razones éticas, los ratones fueron sacrificados cuando presentaban una pérdida de peso del 25 %.

Para el experimento de cinética, se infectaron 5 ratones hembra BALB/c (6-7 semanas de edad) por vía intranasal con una dosis subletal (103 ufp/50 μΙ de DMEM) de virus de la gripe recombinante PA mut, PB2 mut o PB2/PA mut, o se infectaron con mock (50 μΙ de DMEM). Los ratones se sacrificaron a 1, 2, 4 y 7 dpi por inhalación de CO2 y se sometieron a necropsia.

Estimación del título viral en órganos extraídos

Las muestras de pulmón se homogeneizaron en PBS-BSA al 0,3 %-penicilina/estreptomicina (100 lU/ml) usando un Douncer electrónico (IKA T10 basic, Workcenter). Las muestras de pulmón se homogeneizaron 1 minuto a velocidad máxima a 4 °C y los residuos se sedimentaron por centrifugación (2000 g, 5 min, 4°C). El título viral se determinó mediante ensayo en placas estándar en células MDCK.

Preparación de suspensión de células de pulmón

Las muestras de pulmón se mantuvieron en medio RMPI a 4°C. Las muestras de tejido se trituraron en trozos muy pequeños antes de la digestión con 180 g/ml de liberasa (Roche) y 40 g/ml de ADNasa I (Roche) en medio RMPI durante 30 minutos a 37°C. Los fragmentos digeridos se filtraron con un filtro de celda de nylon de 40 mm (BD Falcon) y se resuspendieron con RMPI-FBS al 3 %. Después de la centrifugación de las muestras (1640 rmp, 5 min, 4°C) se realizaron etapas adicionales para la lisis de eritrocitos. El sedimento celular se incubó durante 1 ,5-2 minutos con 1 mi de tampón de lisis de eritrocitos a TA. La lisis se inhibe mediante la adición de 9 mi de PBS-EDTA 5 mM-FBS al 3%. Después, las muestras se filtraron de nuevo con un filtro de células de nylon de 40 mm y se sedimentaron por centrifugación (1640 rpm, 5 min, 4°C).

Análisis de citometría de flujo

Las suspensiones celulares se distribuyeron en placas de 96 pocilios y se incubaron primero con colorante LIVE/DEAD violeta (Invitrogen) durante 30 min a 4°C, se lavaron 2 veces con PBS y luego se incubaron durante 15 min a 4°C con anticuerpo Fe bloque CD16 de rata. Las muestras se analizaron mediante tinción de suspensión celular con uno o más anticuerpos marcados con fluorocromos mezclados en PBS durante 30 minutos a 4°C en la oscuridad. Los anticuerpos utilizados fueron CD45 conjugado con PerCP-Cy5.5 (clon 30-F11) (BioLegend), CD11b conjugado con PeCy7 (clon M1/70) (BioLegend), CD11c conjugado con APC (clon N418) (eBIOSCIENCE) y Ly6G conjugado con PE (clon 1A8) (BDBIOSCIENCE). Las muestras se fijaron por incubación con formaldehído al 4 % durante 20 min, se sedimentaron por centrifugación (700 rmp, 5 min, 4°C) y se lavaron una vez con PBS. Después de la centrifugación (700 rmp, 5 min, 4°C), las células se resuspendieron en 0,4 mi de PBS y se mantuvieron a 4°C durante una noche en la oscuridad. El análisis de citometría de flujo se realizó en un citómetro LSR II (BD Biosciences). Los datos se analizaron utilizando el software CelIQuestPro.

Histopatología

Los pulmones animales se fijaron en formalina al 10%, se incluyeron en parafina, se cortaron en secciones de 5 mm de espesor y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) por métodos convencionales.

Localización de mutaciones en estructuras tridimensionales

El programa UCSF Chimera 1.10.2 se usó para la localización estructural de mutaciones específicas en la polimerasa del virus de la gripe. La estructura de la única polimerasa del virus de la gripe A con el número de acceso 4WSB, o la estructura de la forma dimerizada del complejo de polimerasa del virus de la gripe A en el Banco de datos de proteínas (PDB) con el número de acceso 3J9B se han usado como plantillas.

Estadística

La prueba t de Student y ANOVA de dos vías se usaron como se indica en cada experimento y figura. Se aplicó una prueba U no paramétrica de Mann-Whitney para estimar la significación estadística de las diferencias entre RPM. Para el análisis se usó GraphPad Prism v. 5.00 (www.graphpad.com).

II. RESULTADOS

La virulencia y la patogenicidad de F y M-IAV se correlacionan con la abundancia de DVG

Previamente se caracterizaron dos aislados virales, el F-IAV derivado de un caso letal en una persona joven sin comorbilidades conocidas previamente conocidas y el M-IAV, de un paciente joven con síntomas leves.

Historia de virus

Se aislaron F y M-IAV de las muestras del tracto respiratorio superior de los pacientes infectados. Los virus se cultivaron en cultivo celular y en condiciones normalizadas para eliminar las posibles diferencias debidas al estado clínico, el momento del muestreo y los antecedentes genéticos de los pacientes infectados. Para eso, las reservas víricas de F y M-IAV se generaron por infección de cultivos celulares a una baja multiplicidad de infección (0,0001 moi) para limitar la producción de DVG y los virus obtenidos de este pase se usaron para los siguientes ensayos.

Acumulación DVG de Fy M-IAV en cultivo celular

Como se describe, F-IAV crece más rápido en cultivo celular y es más patógeno en ratones que M-IAV. El ARN del genoma viral obtenido a partir de viriones purificados se secuenció profundamente y la comparación de la secuencia consenso mostró varios cambios de aminoácidos que podrían ser responsables de su distinta patogenicidad. El análisis detallado de la secuenciación masivade ARN mostró que, además de los ARN virles de longitud completa, se observaron ARN genómicos defectuosos (DVG) en estas muestras. Las grandes deleciones internas que generan pequeños DVG activan la respuesta inmune innata, y los ARN virales del virus de la gripe preferiblemente≤1000 nucleótidos (nt) se unen al sensor viral RIG-I; por lo tanto, solo se analizaron DVG de hasta 1000 nt en este estudio (Figura 1A). La proporción entre las lecturas de secuencias correspondientes a los sitios de eliminación de DVG (lecturas de unión) y las lecturas de virus totales se calcularon para cada virus (proporción de DVG); se observó una proporción inferior de DVG de 10 veces en el F-IAV que el M-IAV (Figura 1 B y Figura 10). DVG encontrados en F y M-IAV derivados de los segmentos de ARN que codifican las subunidades de la polimerasa viral como se ha descrito previamente (Figura 1C). Para estimar la capacidad de estos virus para generar DVG, se analiza la cantidad de DVG frente a ARN viral completo del mismo segmento de genoma mediante RT-PCR tanto en las reservas iniciales como durante el ciclo de replicación viral, realizando pases ciegos en serie de reservas de F y M-IAV a 3 ufp/célula. Esta condición de alta multiplicidad de infección permitirá una generación exacerbada de DVG. Los resultados (Figura 2 y Figura 3) mostraron que la reserva inicial de M-IAV contenía más DVG que el aislado de F-IAV (Figura 2B), y esta diferencia también se observó en tres clones de F y M-IAV purificados por placa independientes (Figura 2C). Ambos, F y M-IAV, acumularon más DVG a lo largo de pases seriados. Sin embargo, M-IAV lo hizo más rápidamente que F-IAV (Figura 2D y Figura 3A, B). La capacidad distintiva de generar DVG por estos virus se corroboró usando dos cepas víricas diferentes (Figura 3A, B), y un clon purificado en placa de F o M-IAV (Figura 2D). Algunos DVG amplificados por RT-PCR (indicados con asteriscos en las Figuras 2B y 2C) se clonaron y se secuenciaron para corroborar que estos productos de amplificación corta corresponden a segmentos de ARN viral con

grandes deleciones internas (Figura 4A y Figura 5A).

Respuesta antiviral de células infectadas con F y M-IAV

Para controlar la activación de la respuesta celular antiviral inducida por estos virus, se evaluó la cascada de inducción de interferón (IFN) tras la infección de células A 549 que expresan proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control del promotor de IFN (células A549/pr (IFN- β).GFP). La expresión de GFP actúa como un marcador para la activación de la ruta de inducción de IFN en estas células.

Estas células se infectaron con M- o F-IAV a moi 3, o mock, se pseudo-infectaron como control. Como control positivo, las células se infectaron con el virus Del NS1 , un virus de la gripe que no puede contrarrestar la respuesta antiviral. La producción de GFP se cuantificó mediante citometría de flujo a 8, 15 o 24 hpi, y los resultados indicaron que el virus DeINSI induce grandes cantidades de GFP y F-IAV fue un inductor de IFN peor que M-IAV (0,3 veces, p <0,001) (Figura 6). Para evaluar mejor la respuesta antiviral mediada por estos virus, las células A549 se infectaron con DeINSI, M o F-IAV, o se infectaron con mock, y la acumulación de genes estimulados con IFN (ISG), proteínas Mx e ISG56, se controló por Western blot. Las células infectadas con F-IAV acumularon niveles más bajos de proteínas Mx e ISG56 que M-IAV (0,29 y 0,48 veces, respectivamente, p <0,01) (Figura 6B y Figura 7A). Se observó el mismo resultado para los clones F y M-IAV obtenidos a partir de placas purificadas (0,31-0,38 veces, respectivamente, p <0,001) (Figura 6C y Figura 7B). La diferencia en la inducción de la respuesta antiviral innata en células epiteliales de pulmón humano infectado coincide con las diferencias en la acumulación de DVG (Figura 1, Figuras 2B-D y Figuras 3A, B), lo que concuerda con informes anteriores.

Acumulación de DVG y Fy M-IVA en pulmones de ratones infectados

Dado que F-IAV es más virulento que M-IAV en el modelo murino, se probó si estas capacidades distintas para generar DVG eran aparentes in vivo; la acumulación de DVG y genoma viral se analizó en los pulmones de ratones infectados con M- y F-IAV. En el tejido pulmonar completo (Figura 8A) y en los viriones purificados del

pulmón (Figura 8B), la acumulación de DVG fue mayor en ratones infectados con M que en los ratones infectados con F-IAV. Por lo tanto, existe una clara correlación entre la acumulación de DVG mediada por F- y M-IAV y su patogenicidad en el modelo murino.

Las mutaciones específicas en la polimerasa de un virus de caso letal determinan la acumulación de DVG

La comparación de las secuencias consenso de F- y M-IAV mostró nueve cambios de aminoácidos en el aislado F tomando como referencia la cepa A/California/04/2009. Los cambios en las subunidades de la polimerasa viral PA (D529N) y PB2 (A221T) y la glicoproteína de superficie HA (S127L) encontrados en <1 % de los virus que circulaban durante la temporada de gripe de 2009 se consideraron específicos y potencialmente responsables de la diferencia en virulencia. Dado que los DVG son producidos principalmente por la polimerasa viral, los cambios de PA D529N y PB2 A 221T en las subunidades de la polimerasa se seleccionaron como supuestos responsables de la baja producción de DVG y del aumento de la patogenicidad del F-IAV.

Para caracterizar adicionalmente el papel de las mutaciones en las subunidades F-IAV de la polimerasa como determinantes de la virulencia, se generaron sobre el virus A/H 1 1 /California/04/09 (CAL), virus de la gripe recom binantes portadores de la combinación de mutaciones PA D529N y PB2 A221T (PB2/PA mut; polimerasa de tipo F-IAV), o virus portadores de una única mutación PA D529N (PA mut) o PB2 A221T (PB2 mut) (Tabla 1). Estos virus se cultivaron en cultivo celular a baja moi (0,0001) para limitar la producción de DVG y los virus obtenidos de este pase se usaron para los siguientes ensayos.



Aminoácido encontrado en virus F muy poco representado (<1 %) en ios virus H1N1 que circularon hasta diciembre de 2009, pero no en los virus que circularon en las temporadas de gripe entre 2010-2016.

2. Aminoácido encontrado en el virus F muy poco representado (<1 %) en los virus H1 N1 que circularon hasta abril de 2016.

Tabla 1. Aminoácidos presentes en las posiciones PB2 221 y PA 529 en virus circulantes A(H1N1)pdm09. Se muestran aislados de casos letales (F-IAV) y casos leves (M-IAV) y virus recombinantes generados y analizados en este estudio.

La actividad de las polimerasas reconstituidas de estos tres virus mutantes y el virus de tipo silvestre se evaluó en primer lugar en un ensayo de mini-replicón, que no mostró diferencias significativas (Figuras 9A, B). A continuación, la cinética de crecimiento en cultivo celular mostró que todos los virus recombinantes acumulan niveles similares de proteínas víricas en un ensayo de replicación de ciclo único (Figura 9C) y se replicaron a una velocidad similar en un ensayo de ciclo múltiple (Figura 9D).

Análisis de secuenciación profunda de virus recombinantes

La secuenciación masiva de ARN a partir de viriones purificados de virus recombinantes mutantes y de tipo silvestre mostró que el virus CAL acumula bajos niveles de DVG, lo que coincide con la alta virulencia indicada de la cepa de referencia CAL, y es similar al F-IAV (Figura 10). Los virus PB2/PA mut y PA mut mostraron una acumulación de DVG similar al virus CAL (cambio de 2,6 y 1,3 veces, respectivamente, Figura 11 A), mientras que PB2 mut tenía una relación de DVG 27 veces mayor que el virus CAL, que era casi 11 veces mayor que PB2/PA mut (con la polimerasa tipo F) (Figura 11 A).

La proporción de DVG del virus CAL se toma como 1 y la proporción de DVG de los otros virus recombinantes se indica como cambio en veces de CAL. Se determinó la distribución de DVG por segmento viral para todos los DVG encontrados en cada virus recombinante (Figura 11 C), y se observó que los DVG se derivan de varios segmentos. Estos datos indicaron que la mutación PB2 A221T permitía una alta acumulación de DVG (Figura 11A, comparar CAL frente a PB2 mut), mientras que la mutación PA D529N restringía su acumulación (Figura 11A, comparar PB2 mut frente a PB2/PA mut). La combinación de los cambios de PA y PB2, que imita a la polimerasa del F-IAV, conduce a una acumulación baja de DVG, como también se observa para el propio F-IAV.

Para confirmar que la mutación PA D529N en F-IAV tiene un efecto importante en la capacidad de producir números bajos de DVG, se generaron virus CAL recombinantes portadores de mutaciones en genes distintos de las subunidades de la polimerasa, tal como genes virales de matriz 1 (M1) y matriz 2 (M2) (M1 S30N + M2 V86S). Estas mutaciones permiten que el virus de la gripe acumule un gran número de DVG en una cepa vírica H3N2. Se ha realizado una secuenciación masiva de ARN de viriones purificados de virus recombinantes con estas mutaciones M1/M2, en solitario (M mut) o con estas mutaciones M1/M2 y la mutación PA D529N (M-PA mut). El número y la distribución de DVG en estos viriones se muestran en las Figuras 11B y 11C. Se encontró un aumento de DVG de 37 veces en M mut en comparación con el virus CAL de tipo silvestre (wt) (Figura 11C), de acuerdo con la capacidad de las mutaciones M1/M2 para aumentar los DVG en un virus de la gripe H3N2. Como se predijo, la introducción de la mutación PA D529N en el fondo de M mut disminuyó la proporción de DVG (4 veces, Figura 11 B, comparar M-PA mut frente a M mut).

Además, el análisis completo del genoma viral corroboró que cada virus recombinante portaba la mutación o combinación de mutaciones específicas, y no se detectaron mutaciones compensatorias. Por lo tanto, las diferencias en la acumulación de DVG están mediadas exclusivamente por las mutaciones genéticamente introducidas.

De este modo, PA D529N presente en un virus de casos letales puede disminuir la cantidad de DVG en dos fondos genéticos diferentes (Figura 11 D), lo que refuerza la idea de que esta mutación confiere esta capacidad.

Acumulación de DVG de virus recombinantes en cultivo celular

De manera similar a F- y M-IAV, se evaluó la acumulación de DVG de reservas víricas mediante el análisis de la cantidad de DVG frente a ARN viral completo del mismo segmento del genoma por RT-PCR como se ha descrito previamente (Figura 2A y Figura 3A). Este análisis mostró que la reserva de virus PB2 mut tenía más DVG que el virus CAL wt o el virus que portaba la mutación PA 529 N (PA mut) y que la mutación PA es capaz de reducir esta gran acumulación (comparar PB2 mut frente a PB2/PA mut Figura 12). Algunos de los productos DVG amplificados por RT-PCR se clonaron (indicados con asteriscos en la Figura 12 A) y se secuenciaron para corroborar que corresponden a segmentos de ARN viral con grandes deleciones internas (Figura 4B y Figura 5B). Además, se infectaron cultivos de células epiteliales de pulmón humano en 3 unidades formadoras de placa (ufp)/célula y se evaluó la acumulación de DVG a lo largo del tiempo para cada virus mutante en estas condiciones en las que la producción de DVG está exacerbada. Los extractos de ARN total se obtuvieron a las 4, 8 o 12 horas después de la infección (hpi). La estimación de la cantidad de DVG frente al ARN viral completo del mismo segmento del genoma se analizó mediante RT-PCR como se ha descrito previamente (Figura 2A y Figura 3A). Este análisis mostró que todos los virus generan y acumulan DVG en las células infectadas y el virus PB2 mut produce DVG a una velocidad mayor que el virus PA mut (5,4 veces, p <0,05 a 4 hpi y 9 veces, p <0,001 a 8 hpi) y el virus PB2/PA mut (13 veces, p <0,01 a 4 hpi y 5,8 veces, p <0,001 a 8 hpi) (Figura 12B y Figura 13).

Respuesta antiviral de virus recombinantes

A continuación, se evaluó la inducción de la respuesta antiviral por los diferentes virus recombinantes mediante el control de la acumulación de proteínas antivirales Mx e ISG56 por Western blot a 16 hpi. El tratamiento con IFN o la infección con el virus Del NS1 se usó como control positivo de la inducción de la respuesta antiviral en estas células. Las células PB2 mut infectadas acumulan una cantidad mayor de Mx que las otras células infectadas por virus recombinantes CAL, PA mut o PB2/PA mut (4,4 veces, 2,0 veces y 3,5 veces, p <0,001, respectivamente) (Figura 12C y Figura 14A). Se obtuvieron resultados similares para la acumulación de ISG56 en células infectadas con PB2 mut en comparación con células infectadas con CAL, PA mut o PB2/PA mut (3,5 veces, 2 veces y 2,3 veces, p <0,001, respectivamente) (Figura 12C y Figura 14B). Hubo una clara correlación entre la inducción de la respuesta antiviral (Figura 12) y la acumulación de DVG (Figura 12A) como se ha descrito previamente para Fy M-IAV (Figura 1 B y Figuras 6B-C) y para otros virus.

Correlación entre la acumulación de DVG y la patogenicidad In vivo

Para evaluar la patogénesis inducida por los diferentes virus recombinantes portadores de mutaciones presentes en F-IAV, se infectaron ratones con diversas dosis de virus CAL, PB2 mut, PA mut o virus PB2/PA mut o con DMEM como control. La supervivencia (Figura 15A) y el peso corporal (Figura 16 A) se controlaron diariamente durante dos semanas y se determinó la dosis letal 50 (DL50) para cada virus. Los virus CAL, PB2 mut, PA mut y PB2/PA mut mostraron una LD50 de 1x10s, >106, 3x103 y 3,5x10*, respectivamente (Figura 15B). Estos datos confirmaron que el virus CAL es patógeno en ratones e indicaron que la mutación PA D529N aumentó en gran medida la patogenicidad, lo que sugiere un efecto decisivo de este cambio en la polimerasa sobre el resultado de la enfermedad. PB2 mut, que acumula altos niveles de DVG, se atenuó en gran medida en comparación con el virus CAL. La reconstitución del virus que contiene polimerasas tipo F (PB2/PA mut) redujo notablemente la acumulación de DVG (Figura 11 A) y condujo a una mayor patogenicidad en comparación con el virus PB2 mut (Figuras 15A y 15B).

Además, se evaluó la patogenicidad de los virus M mut y M-PA mut de la misma manera que se indicó anteriormente y los resultados muestran que la introducción de las mutaciones M1 + M2 en los fondos de CAL wt o PA mut condujo a una clara atenuación del virus en ratones, ya que la LD50 aumentó de 1 x 105 o 3 x 103, respectivamente, a > 5 x 105 en ambos casos (Figura 15). La patogenicidad del virus M-PA mut fue mayor que la del virus M mut, como se indica por la pérdida de peso corporal después de la infección subletal (Figura 16B).

Para evaluar adicionalmente las diferencias de patogenicidad entre los virus portadores de mutaciones presentes en F-IAV, los ratones se infectaron con una dosis sub-letal (103 ufp) de virus mutantes recombinantes, o se pseudo-infectaron como control mock. Las muestras se recuperaron varios días después de la infección (dpi) y los títulos virales se determinaron en el pulmón (Figura 17A). Los ratones infectados con PA mut mostraron los títulos más altos a 1, 2 y 4 dpi y la cinética de replicación de virus más rápida, mientras que los ratones infectados con PB2 mut mostraron los títulos más bajos probados en todo momento.

Respuesta inmune de virus recombinantes en ratones infectados

La patogenicidad del virus depende de la naturaleza del virus, las condiciones del hospedador y su respuesta rápida y adecuada a la infección. Hemos descrito previamente el mayor daño en el tejido pulmonar inducido por F-IAV en comparación con ratones infectados con M-IAV. Además, se ha observado que F-IAV parece inducir una mayor inflamación en los pulmones de los animales infectados que M-IAV; proliferación de macrófagos como una lesión representativa de neumonía intersticial junto con vasculitis a medida que se mostraba la acumulación de neutrófilos (Figura 18). Para ver si los virus recombinantes producían una respuesta inmune diferente, se controló mediante análisis de citometría de flujo la presencia de neutrófilos y macrófagos alveolares en pulmones infectados por PA mut, PB2 mut o PB2/PA varios días después de la infección de infección sub-letal (Figuras 17B y 17C). Los virus recombinantes con cambio de PA D529N (PA mut y PB2/PA mut) indujeron mayor infiltración de neutrófilos y depleción significativa de macrófagos alveolares que el virus PB2 mut atenuado a 2 dpi en los pulmones de animales infectados (Figuras 17B y 17C). Estas dos alteraciones en la respuesta inmune celular observadas para los virus portadores del cambio de PA D529N se han descrito como factores esenciales para las infecciones letales del virus de la gripe y están de acuerdo con el papel del cambio de PA D529N en la patogenicidad in vivo.

En conjunto, estos datos demuestran que un PA D529N mutado derivado de un IAV de caso letal disminuye la generación de DVG y respalda la idea de que la

acumulación reducida de DVG es un determinante patogénico para el virus de la gripe en ratones. Estos resultados corroboran la importancia de la baja abundancia de DVG en el resultado letal de la gripe.

El bajo número de DVG se asocia con un resultado grave o letal en seres humanos

A continuación, se quiso examinar si la acumulación de DVG desempeña un papel en la patogenicidad de los virus de la gripe en seres humanos. Se realizó una secuenciación masiva de ARN de virus aislados de muestras respiratorias de una cohorte seleccionada de pacientes infectados por virus de tipo A(H1N1)pdm09. Esta cohorte incluye pacientes con resultados altamente graves, incluyendo neumonía grave y síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) que requirieron ingreso a la unidad de cuidados intensivos (UCI) con ventilación mecánica e intubación endotraqueal durante más de 96 horas (Figura 19A) de la temporada de gripe de 2012-2013 en España. Para una caracterización más precisa de la patogenicidad intrínseca de estos virus, solo se incluyeron aquellos aislados de pacientes sin comorbilidades conocidas y con edades inferiores a 65 años y mayores de 4 (Figura 19A). Esta cohorte (n = 4) es una representación fiel (80-100%) del total de casos confirmados de gripe H1N1 grave según estos criterios en la temporada de gripe española de 2012-2013 (n = 4-5) (Tabla 2). Adicionalmente, se evaluaron dos virus aislados de pacientes fallecidos que cumplieron estos criterios, pero que, de otro modo, mostraron afecciones médicas subyacentes; cohorte total grave/letal n = 6 (Figura 19A). Estos virus se compararon con los aislados de una cohorte (n = 6) de pacientes con IAV leve detectados a través del sistema regular de vigilancia de la gripe.

Tabla 2. Datos epidemiológicos para la temporada de gripe en España de 2012-2013. Los datos epidemiológicos, incluida la información de comorbilidades, informados por el National Epidemilogical Influenza Center se muestran para las temporadas de gripe en España de 2012-2013.

Historial de virus aislados de pacientes gra ves/fallecidos o leves

Todos estos virus se obtuvieron de exudados del tracto respiratorio superior. De forma similar a la descrita anteriormente para F y M-IAV, se aislaron los virus de cada muestra clínica y se determinó el título de cada virus aislado para este primer pase. Para obtener las cantidades necesarias para purificar los viriones correspondientes, todos los virus se cultivaron en cultivo celular en condiciones normalizadas a una baja multiplicidad de infección controlada para limitar la producción de DVG, como se indica en la sección de material y métodos. Este procedimiento eliminará las diferencias en la cantidad de ARN debido al estado clínico, el tiempo o el sitio de muestreo y los antecedentes genéticos de los pacientes infectados, y los virus obtenidos de este pase se usaron para la secuenciación masiva.

Acumulación de DVG de virus de pacientes infectados

Se ha obtenido la secuencia consenso de todos los virus leves y graves/letales y no se detectó ninguna de las mutaciones de modulación de DVG anteriores en ninguno de ellos. Adicionalmente, se analizó en detalle la secuencia consenso de las tres subunidades polimerasas para todos los virus evaluados y se seleccionaron las mutaciones encontradas en cualquiera de los virus graves/letales que no estaban presentes en los virus leves. La prevalencia de estos cambios en los virus H N1 que circulaban en los seres humanos se calculó utilizando todas las secuencias disponibles en la base de datos de recursos de la gripe del NCBI hasta marzo de 2016. Estas mutaciones presentes en <1 % de los virus circulantes se seleccionaron como mutaciones exclusivas putativas adicionales graves/letales (Tabla 3).


Tabla 3. Mutaciones exclusivas encontradas en la polimerasa vírica de los virus de cohorte graves/letales.

Además de los ARN virales de longitud completa, se observaron DVG en todas las muestras. La proporción entre las lecturas de secuencia correspondientes a los sitios de eliminación de DVG (lecturas de unión) y las lecturas de virus totales se calculó para cada virus (proporción de DVG); se observó una reducción de 10 veces en la proporción de DVG en virus aislados de casos graves/letales (n = 6) en comparación con los de pacientes leves (n = 6; p = 0,0152) (Figura 19B y Figura 20). La distribución de DVG por segmento viral para los DVG totales encontrados en cada virus se muestra para toda la colección de virus graves/letales (Figura 21A y Figura 22A) y leves (Figura 21 B y Figura 22 B). Dado que se ha descrito que la mayoría de los DVG se generan en los segmentos de la polimerasa viral, también se ha evaluado estadísticamente la cantidad de DVG generados exclusivamente en esos segmentos (Figura 23). Se puede observar que la diferencia en estos tres segmentos es de hecho mayor (23 veces, p = 0,0124) que en el genoma viral completo. Estos dos datos apoyan la idea de que los virus con baja abundancia de DVG tienen un papel en el desenlace grave y letal en pacientes infectados con ¡AV.