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1. (WO2017006859) METHOD FOR DETECTING TARGET NUCLEIC ACID
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明 細 書

発明の名称 標的核酸の検出法

技術分野

0001  

背景技術

0002   0003   0004  

先行技術文献

特許文献

0005  

発明の概要

発明が解決しようとする課題

0006  

課題を解決するための手段

0007   0008   0009   0010  

発明の効果

0011  

図面の簡単な説明

0012  

発明を実施するための形態

0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049  

実施例

0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061   0062   0063   0064   0065   0066   0067   0068   0069   0070   0071   0072   0073   0074   0075  

産業上の利用可能性

0076   0077  

請求の範囲

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12  

図面

1   2   3  

明 細 書

発明の名称 : 標的核酸の検出法

技術分野

[0001]
 本発明は、2段階の核酸増幅反応を利用する標的核酸の増幅と固相担体上にて核酸増幅産物を検出することを含む、標的核酸の検出方法に関する。

背景技術

[0002]
 今日、分子生物学の研究分野や、遺伝子検査や病原体検査等の臨床応用の分野において、標的核酸を特異的に検出する方法は非常に重要な技術となっている。その中でも、核酸増幅反応と核酸クロマトグラフィーとを利用する標的核酸の検出方法は、その迅速性と簡便性から注目を集めている。この検出方法は概ね、標的核酸に特異的なプライマーにタグを付して用いて、標的核酸を含むDNAを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応(以下、「PCR」と記載する)等の核酸増幅反応を行い、得られた増幅産物を、多孔質状の固相担体内をキャピラリー現象により拡散・移動させ、増幅産物の両端に付されたタグを介して標識及び固相担体に捕捉・結合し、標的核酸を目視にて検出する(特許文献1)。
[0003]
 しかしながら、この検出方法においては、増幅産物の両端に付されたプライマー由来のタグに依拠して、標識及び固相担体への捕捉・結合を行っているために、標的核酸に由来する特異的な増幅産物と非特異的な反応により形成されるプライマーダイマーとを区別できない場合があり、プライマーダイマーの検出に基づいて偽陽性判定を行う虞があった。
[0004]
 そのため、本検出方法においては、このようなプライマーダイマーの非特異的な検出を回避して、高い判定精度が得られるような改善が望まれていた。

先行技術文献

特許文献

[0005]
特許文献1 : WO2012/070618

発明の概要

発明が解決しようとする課題

[0006]
 本発明は、核酸増幅反応と固相担体上にて核酸増幅産物を検出すること(例えば、核酸クロマトグラフィー法)を含む標的核酸の検出方法において、プライマーダイマーの非特異的な検出を回避することを可能とする、判定精度の高い新たな検出方法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0007]
 核酸増幅反応においてプライマーダイマーの形成を防ぐためには、核酸増幅反応のサイクル数を少なくすることが必要であるが、当該サイクル数を少なくした場合には、標的核酸のコピー数を核酸クロマトグラフィー法等により目視で検出可能な程度に増大させることができない場合があり、検出感度を低下させ得る。したがって、核酸クロマトグラフィー法等により目視で検出可能な程度に標的核酸のコピー数を増大させながらも、プライマーダイマーの形成を防ぐことを可能とする手法が要求される。
[0008]
 本発明者らは、標的核酸の増幅を2段階の核酸増幅反応(Nested-PCR法)を実施すること、すなわちタグが付されていないプライマーセットを用いて行う1段階目の核酸増幅反応とタグが付されたプライマーセットを用いて行う2段階目の核酸増幅反応とを実施することにより、1段階目の核酸増幅反応により標的核酸のコピー数を増大させることができ、タグが付されたプライマーセットを利用する2段階目の核酸増幅反応をダイマー形成が生じないサイクル数で実施することによって、標的核酸を核酸クロマトグラフィー法等により特異的にかつ高い感度にて検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
[0009]
 すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
[1] 標的核酸の検出方法であって、
(a)標的核酸の第1の塩基配列と相同な配列を含むプライマーと、該第1の塩基配列の下流側に位置する第2の塩基配列の相補鎖配列と相同な配列を含むプライマーからなる第1のプライマーセットを用いて、試験DNAを鋳型として核酸増幅反応を実施することにより、第1の核酸増幅産物を得る工程、
(b)該第1の塩基配列の下流側かつ該第2の塩基配列の上流側に位置する第3の塩基配列と相同な配列を含むプライマーと、該第3の塩基配列の下流側かつ該第2の塩基配列の上流側に位置する第4の塩基配列の相補鎖配列と相同な配列を含むプライマーからなる第2のプライマーセットであって、いずれか一つのプライマーが標識物質と結合可能な第1のタグと結合されており、かつ他方のプライマーが固相担体と結合可能な第2のタグと結合されている、該第2のプライマーセットを用いて、該第1の核酸増幅産物を鋳型として核酸増幅反応を実施することにより、各端に該第1のタグ及び該第2のタグがそれぞれ付加された第2の核酸増幅産物を得る工程、
(c)該第2の核酸増幅産物と、第1のタグと結合可能な標識物質とを接触させることにより、標識された核酸増幅産物を得る工程、
(d)該標識された核酸増幅産物と、固相担体とを接触させることにより、該標識された核酸増幅産物を該固相担体に捕捉する工程、ならびに
(e)該固相担体に捕捉された該標識された核酸増幅産物を検出する工程、
を含む、上記方法。
[2] 前記工程(a)と前記工程(b)とを、同一の反応容器内で連続して行うことを特徴とする、[1]の方法。
[3] 前記工程(a)における核酸増幅反応のアニーリング温度が、前記工程(b)における核酸増幅反応のアニーリング温度より高いことを特徴とする、[1]又は[2]の方法。
[4] 前記工程(b)における核酸増幅反応の増幅サイクル数が、前記工程(a)における核酸増幅反応の増幅サイクル数より少ないことを特徴とする、[1]~[3]のいずれかの方法。
[5] (a)標的核酸の第1の塩基配列と相同な配列を含むプライマーと、該第1の塩基配列の下流側に位置する第2の塩基配列の相補鎖配列と相同な配列を含むプライマーからなる第1のプライマーセット、
 (b)該第1の塩基配列の下流側かつ該第2の塩基配列の上流側に位置する第3の塩基配列と相同な配列を含むプライマーと、該第3の塩基配列の下流側かつ該第2の塩基配列の上流側に位置する第4の塩基配列の相補鎖配列と相同な配列を含むプライマーからなる第2のプライマーセットであって、いずれか一つのプライマーが標識物質と結合可能な第1のタグと結合されており、かつ他方のプライマーが固相担体と結合可能な第2のタグと結合されている、該第2のプライマーセット、
 (c)該第1のタグと結合可能な標識物質、ならびに、
 (d)該第2のタグと結合可能な固相担体、
を含む、標的核酸を検出するためのキット。
[6] 前記第2のプライマーセットにおける、前記第1のタグおよび前記第2のタグの少なくとも一方が、オリゴヌクレオチドからなるタグであることを特徴とする、[5]のキット。
[7] 前記オリゴヌクレオチドからなるタグが、DNAポリメラーゼ反応を抑制または停止可能なスペーサーを介してプライマーと結合されていることを特徴とする、[6]のキット。
[8] 前記スペーサーが、アゾベンゼン、脂肪鎖、又はInverted塩基であることを特徴とする、[7]のキット。
[9] 前記第1のタグがオリゴヌクレオチドからなるタグであり、標識物質が該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、[6]~[8]のいずれかのキット。
[10] 前記第1のタグがビオチン、ジゴキシゲニン、及びFITCから選択されるいずれかの低分子化合物からなるタグであり、標識物質が該タグと結合可能なタンパク質を含む、[6]~[9]のいずれかのキット。
[11] 前記第2のタグがオリゴヌクレオチドからなるタグであり、固相担体が該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、[6]~[10]のいずれかのキット。
[12] 前記第1のプライマーセットに含まれる一又は両方のプライマーのTm値が、前記第2のプライマーセットに含まれる一又は両方のプライマーのTm値よりも高いことを特徴とする、[5]~[11]のいずれかのキット。
[0010]
 本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-134659号の開示内容を包含する。

発明の効果

[0011]
 本発明によれば、核酸増幅反応と固相担体上にて核酸増幅産物を検出すること(例えば、核酸クロマトグラフィー法)を含む標的核酸の検出方法において、プライマーダイマーの非特異的な検出を回避することを可能とする、判定精度の高い検出方法を提供することができる。

図面の簡単な説明

[0012]
[図1] ラテラルフロー型核酸検出デバイスの模式図を示す。1:固相担体、2:コンジュゲートパッド、3:サンプルパッド、4:吸収パッド、5:基材、6:捕捉手段。
[図2] 実施例にて利用した各プライマーの認識配列に対応する領域を示す。
[図3] (A)実施例1にてアウタープライマーセット及びインナープライマーセットを用いたNested-PCR法により得られた増幅産物を、核酸検出デバイスを用いて検出した結果を示す写真図である。(B)比較例1にてインナープライマーのみを用いたPCR法により得られた増幅産物を、核酸検出デバイスを用いて検出した結果を示す写真図である。各図において数値は反応系に加えた鋳型DNA量を示す。

発明を実施するための形態

[0013]
I.標的核酸の検出方法
 本発明に係る標的核酸の検出方法は、概ね以下の工程:
標的核酸を増幅する工程、
増幅した標的核酸を標識する工程、及び
標識した標的核酸を固相担体に捕捉、検出する工程、を含む。以下、各工程について説明する。
[0014]
1.標的核酸を増幅する工程
 本発明方法において、標的核酸の増幅はNested-PCR法を利用して行うことができる。すなわち、第1のプライマーセットを用いて、試験DNAを鋳型として第1の核酸増幅反応を実施し第1の核酸増幅産物を得て、次いで、それぞれタグが結合された第2のプライマーセットを用いて、第1の核酸増幅産物を鋳型として第2の核酸増幅反応を実施し第2の核酸増幅産物を得る工程を含む。本手法によれば、第1のプライマーセットを用いて第1の核酸増幅反応を実施し、標的核酸を含む(存在する場合)第1の核酸増幅産物のコピー数を増大させることができ、これによりタグが結合された第2のプライマーセットを用いた第2の核酸増幅反応のサイクル数を減らし、タグが結合された第2のプライマーセットのプライマーダイマーの形成を抑制できると共に、検出するのに十分なコピー数の標的核酸を含む(存在する場合)所望の第2の核酸増幅産物を得ることができる。さらに、第1のプライマーセット及び第2のプライマーセットをそれぞれ用いた2段階の核酸増幅反応を経ることにより、標的核酸に対する指向性を高めることができ、標的核酸とは異なる非特異的な核酸増幅を低減又は回避することができる。
[0015]
 本発明において「標的核酸」とは検出すべき任意の核酸配列又は核酸分子を意味し、天然のものであっても、人工的に合成されたものであってもよく、特に限定されない。標的核酸としては例えば、特定の形質を有することや、特定の疾患の発症もしくは発症の可能性を示す遺伝子マーカー、細菌やウイルス等の病原体由来の遺伝子、アレルギー物質由来の遺伝子、一塩基多型や先天的もしくは後天的変異を示す塩基配列等が挙げられるが、これらに限定されない。
[0016]
 本発明方法において、「第1のプライマーセット」及び「第2のプライマーセット」に含まれる各プライマー(所謂、順方向(フォワード)プライマー及び逆方向(リバース)プライマー)は、Nested-PCR法における一般的な手法に従って設計することができる(中山広樹著「バイオ実験イラストレイテッド 3 本当にふえるPCR」秀潤社発行、1997年)。
[0017]
 「第1のプライマーセット」は標的核酸である二本鎖DNAの一の鎖上の特定の塩基配列(第1の塩基配列)と相同な配列を含むか、当該配列からなるプライマーと、当該第1の塩基配列より下流側(3’側)に位置する特定の塩基配列(第2の塩基配列)の相補鎖配列と相同な配列(すなわち、二本鎖DNAの他方の鎖の塩基配列と相同な配列)を含むか、当該配列からなるプライマーとの組合せとすることができる。ここで「相同な配列」を有するプライマーには、前記第1の塩基配列と同一な配列、及び前記第2の塩基配列の相補鎖配列と同一な配列だけでなく、標的核酸と結合し核酸増幅反応を促すことができるかぎり、前記第1の塩基配列及び前記第2の塩基配列の相補鎖配列において1~数個の塩基の欠失、置換、付加または挿入を有する塩基配列や、前記第1の塩基配列及び前記第2の塩基配列の相補鎖配列とBLAST(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information(米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール))等(例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ)を用いて計算したときに、85%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは99%以上の配列同一性を有する塩基配列を有するプライマーも含まれる。ここで「1~数個」とは特に限定されないが、例えば、1から10個、好ましくは1から5個である(以下においても、同じ意味で使用する)。
[0018]
 第1のプライマーセットのプライマーの大きさは、8塩基以上、12塩基以上、又は15塩基以上の長さとすることができ、上限は特に限定されないが、50塩基以下、40塩基以下、又は30塩基以下の長さとすることができる。各プライマーの大きさは、同一であっても良いし、異なっていても良い。
[0019]
 第1のプライマーセットは、第2のプライマーセットを用いた第2の核酸増幅反応におけるアニーリング温度よりも、5℃以上、好ましくは10℃以上、さらに好ましくは15℃以上、高いアニーリング温度を有する第1の核酸増幅反応の条件下において標的核酸を増幅することが可能なものとすることができる。すなわち、第1のプライマーセットに含まれるいずれか一つ、より好ましくは両方のプライマーのTm値は、第2のプライマーセットに含まれるいずれか一つ、より好ましくは両方のプライマーのTm値よりも、5℃以上、好ましくは10℃以上、さらに好ましくは15℃以上、高くなるように設計することができる。これにより第1のプライマーセットを用いた第1の核酸増幅反応系に第2のプライマーセットが含まれる場合においても、第1のプライマーセットのTm値に合わせた高いアニーリング温度で第1の核酸増幅反応を実施することにより、第2のプライマーセットの標的核酸への結合やプライマーダイマーの形成を抑制又は回避することができる。なお、第2のプライマーセットにおける各プライマーの「Tm値」は、下記タグ領域やスペーサー領域を含めない領域に基づいて算出される値を意味する。
[0020]
 「第2のプライマーセット」は、前記第1の塩基配列より下流側(3’側)に位置し、かつ前記第2の塩基配列の上流側(5’側)に位置する特定の塩基配列(第3の塩基配列)と相同な配列を含むか、当該配列からなるプライマーと、当該第3の塩基配列より下流側(3’側)に位置し、かつ前記第2の塩基配列の上流側(5’側)に位置する特定の塩基配列(第4の塩基配列)の相補鎖配列(すなわち、二本鎖DNAのうち他方の鎖の塩基配列と相同な配列)と相同な配列を含むか、当該配列からなるプライマーとの組合せとすることができる。すなわち、第2のプライマーセットは、第1のプライマーセットに挟まれた領域(つまり、第1の核酸増幅産物)内に設計することができる。ここで「相同な配列」を有するプライマーには、前記第3の塩基配列と同一な配列、及び前記第4の塩基配列の相補鎖配列と同一な配列だけでなく、標的核酸と結合し核酸増幅反応を促すことができるかぎり、前記第3の塩基配列及び前記第4の塩基配列の相補鎖配列において1~数個の塩基の欠失、置換、付加または挿入を有する塩基配列や、前記第3の塩基配列及び前記第4の塩基配列の相補鎖配列とBLAST等(例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ)を用いて計算したときに、85%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは99%以上の配列同一性を有する塩基配列を有するプライマーも含まれる。あるいは、別の実施形態では、第2のプライマーセットのいずれか一方のプライマーは、第1のプライマーセットのいずれか一方のプライマーの配列全体又はその一部の配列と同一の配列を有していても良い。
[0021]
 第2のプライマーセットのプライマーの大きさは、8塩基以上、12塩基以上、又は15塩基以上の長さとすることができ、上限は特に限定されないが、50塩基以下、40塩基以下、又は30塩基以下の長さとすることができる。各プライマーの大きさは、同一であっても良いし、異なっていても良い。なお、ここで「プライマーの大きさ」とは、下記タグ領域やスペーサー領域を含めない大きさを意味する。
[0022]
 第1のプライマーセット及び第2のプライマーセットの各プライマーの設計は、公知のプライマー設計ソフト・設計サイト等を用いて行うことができる。このようなプライマー設計ソフト・設計サイトとしては例えば、OligoEvaluator(Sigma-Aldrich)、Primer3(National Human Genome Research Institute)、Primer-BLAST(NCBI)等を利用することができる(これらに限定はされない)。
[0023]
 第1のプライマーセット及び第2のプライマーセットの各プライマーの製造は、公知の手法により行うことができ、DNA合成装置を利用して行ってもよいし、あるいは受託合成サービスを利用して行うことができる。
[0024]
 なお、本明細書中、第1のプライマーセットに含まれるプライマーを「アウタープライマー」と記載し、第2のプライマーセットに含まれるプライマーを「インナープライマー」と記載する場合がある。
[0025]
 第2のプライマーセットにおける各プライマーの5’端には、タグが結合されている。タグは、標識物質と結合可能な第1のタグ及び固相担体と結合可能な第2のタグより選択され、第2のプライマーセットにおける各プライマー(順方向(フォワード)プライマー及び逆方向(リバース)プライマー)にいずれかのタグがそれぞれ結合される。「第1のタグ」は下記にて詳述する標識物質と結合可能なものであればよく、核酸(DNA、RNA、オリゴヌクレオチドなど)、タンパク質、ペプチド、もしくは低分子化合物(例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、FITC等)、またはそれらの組合せからなるものを利用することができ、特に限定はされない。好ましくは、オリゴヌクレオチドを含むか、オリゴヌクレオチドからなるものである。「第2のタグ」は下記にて詳述する固相担体と結合可能なものであればよく、核酸(DNA、RNA、オリゴヌクレオチドなど)、タンパク質、ペプチド、もしくは化合物、またはそれらの組合せからなるものを利用することができ、特に限定はされない。好ましくは、オリゴヌクレオチドを含むか、オリゴヌクレオチドからなるものである。
[0026]
 プライマーとタグとは任意の手段により結合することができ、直接的に、又は間接的に結合することができる。ただし、プライマーに結合されるタグが核酸よりなる場合、核酸増幅反応により当該タグ領域がプライマー領域と共に二本鎖化されないように、DNAポリメラーゼ反応の進行を抑制または停止することが可能なスペーサーを介して、プライマーとタグとは結合される。このような「スペーサー」としては、鋳型鎖に含まれたときに、DNAポリメラーゼ反応の進行を抑制または停止することができ、タグ領域の二本鎖化を防ぐものであればよい。DNAポリメラーゼによる伸長には、鋳型となる核酸(または塩基)が必要であり、鋳型がないとDNA鎖は伸長しない。すなわち、当該スペーサーは、DNAポリメラーゼによるDNA伸長反応の鋳型となり得ない構造を有している。このようなスペーサーとしては、例えば、L型核酸、ペプチド核酸(PNA)、架橋化核酸(Bridged Nucleic Acid(BNA)もしくはLocked Nucleic Acid(LNA))などの人工核酸塩基、下記式Iで表されるアゾベンゼン構造を有するスペーサー、アルキレン鎖やポリオキシアルキレン鎖などの脂肪鎖、Inverted塩基(天然核酸塩基を5’-5’結合、あるいは3’-3’結合で連結したもの)、強固なヘアピン構造やシュードノット構造を有する核酸配列等が挙げられるがこれらに限定はされない。
[0027]
[化1]


[0028]
 スペーサーとして脂肪鎖を用いる場合、鎖長の元素数は2以上40以下が好ましい。元素数が1以下では、DNAポリメラーゼの伸長反応の阻害が不完全になり、2本鎖化を抑制できず、元素数が40を超えると水への溶解性が低下するからである。DNAポリメラーゼ反応の阻害効率を考慮すると、脂肪鎖の鎖長は元素数2以上36以下が好ましく、3以上18以下がより好ましい。脂肪鎖スペーサーとしては、例えば、以下の式IIで表されるスペーサーが挙げられる。
  5’-O-C 2m-O-3’ (式II)
(式中、5’は、5’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、3’は、3’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、mは2以上40以下の整数を表す。)
式IIにおいてmは好ましくは2以上36以下であり、より好ましくは3以上18以下であり、さらに好ましくは3または6である。
[0029]
 第1の核酸増幅反応及び第2の核酸増幅反応は、一般的なPCR法に従って行うことができる。すなわち、標的核酸を含む鋳型DNAに対し、上記の第1のプライマーセット及び第2のプライマーセットをそれぞれ用いてPCRを行った場合に、所望の領域が増幅されるPCR条件にて行うことができる。
[0030]
 第1の核酸増幅反応においては、試験DNAを鋳型DNAとして利用する。「試験DNA」とは標的核酸を含む可能性のあるDNA試料を意味し、例えば、動物や植物もしくはその一部(器官、組織、細胞など)、微生物、ウイルス、飲食品等の試料に由来するDNAやそれら試料より調製されたcDNAが挙げられる(これらに限定はされない)。試験DNAは、試料より抽出・精製された形態であってもよいし、粗精製された形態であってもよい。あるいは、細胞や組織の一部等をそのまま試験DNAとして、反応系に含めることもできる。
[0031]
 第2の核酸増幅反応においては、第1の核酸増幅反応によって産生された第1の核酸増幅産物を鋳型DNAとして利用する。第2の核酸増幅反応におけるPCRのサイクル数は、第1の核酸増幅反応におけるPCRのサイクル数と比べて少ないことが好ましい。第2の核酸増幅反応におけるPCRのサイクル数を少なくすることにより、第2のプライマーセットによるプライマーダイマーの形成を抑制又は回避することができる。プライマーダイマーの形成の有無は、第2の核酸増幅産物を常法に従ってアガロースゲル等の適当なゲルにて電気泳動することによって確認することができ、プライマーダイマーの形成を生じない第2の核酸増幅反応におけるPCRのサイクル数を適宜設定することができる。
[0032]
 PCRに用いるDNAポリメラーゼは、耐熱性のDNAポリメラーゼであればよく、特に限定はされない。本発明においては、市販のDNAポリメラーゼを利用することが可能であり、例えばTaKaRa Ex Taq(登録商標)やKOD DNAポリメラーゼ等を好適に利用することができる。また、温度、時間、緩衝液の組成等は、用いるDNAポリメラーゼや、プライマーの配列、および目的の核酸増幅領域の大きさ等に応じて、適宜選択することができる。
[0033]
 第1の核酸増幅反応と第2の核酸増幅反応とは別個の反応容器内で順次行ってもよいし、あるいは第1の核酸増幅反応と第2の核酸増幅反応とを同一の反応容器内で連続して行ってもよい。第1の核酸増幅反応と第2の核酸増幅反応とを別個の反応容器内で順次行うとは、第1の核酸増幅反応後、得られた第1の核酸増幅産物を取り出し(必要に応じて希釈した後)、DNAポリメラーゼや第2のプライマーセット等を含んでなる別個に用意された第2の核酸増幅反応系に加えて第2の核酸増幅反応を行うことを意味する。一方、第1の核酸増幅反応と第2の核酸増幅反応とを同一の反応容器内で連続して行うとは、第1の核酸増幅反応後、第1の核酸増幅産物を取り出すことなく、第2の核酸増幅反応を実施することを意味する。第1の核酸増幅反応と第2の核酸増幅反応とを同一の反応容器内で連続して行う場合において、第2のプライマーセットは第1の核酸増幅反応の開始前に予め反応系に添加されていてもよいし、第1の核酸増幅反応後、第2の核酸増幅反応開始前に反応系に添加されてもよい。また、必要に応じて、第1の核酸増幅反応後、第2の核酸増幅反応開始前に、DNAポリメラーゼを補充してもよい。好ましくは、第1の核酸増幅反応と第2の核酸増幅反応とは、操作容易性から同一の反応容器内で連続して行う。さらに、好ましくは、第1の核酸増幅反応と第2の核酸増幅反応とを同一の反応容器内で連続して行い、第2のプライマーセットは第1の核酸増幅反応の開始前に予め反応系に添加される。この場合、第1のプライマーセットに含まれるいずれか一つ、より好ましくは両方のプライマーのTm値は、第2のプライマーセットに含まれるいずれか一つ、より好ましくは両方のプライマーのTm値よりも高いことが好ましい。これにより第1のプライマーセットを用いた第1の核酸増幅反応におけるアニーリング温度は、第2のプライマーセットを用いた第2の核酸増幅反応におけるアニーリング温度よりも高い温度条件にて実施することが可能であり、第1の核酸増幅反応条件下にて第2のプライマーセットが試験DNA中に含まれる標的核酸と結合することやプライマーダイマーの形成を抑制又は回避することができる。
[0034]
2.増幅した標的核酸を標識する工程
 上記核酸増幅により得られた、標的核酸を含む(存在する場合)第2の核酸増幅産物は、第2のプライマーセットに起因する第1のタグ及び第2のタグをそれぞれ各端に有する。第2の核酸増幅産物の標識は、標識物質を当該標識物質と結合可能な第1のタグと接触及び結合させることにより行うことができる。標識物質は第2の核酸増幅産物の検出を可能とするものであればよく特に限定はされないが、好ましくは第2の核酸増幅産物の目視検出を可能とするものである。このような標識物質としては、着色粒子、色素、酵素(ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ等)等が挙げられるが、好ましくは着色粒子である。「着色粒子」とは、金属コロイド(例えば、金、銀、銅、白金等)粒子、着色されたラテックス粒子、色素を包含するシリカナノ粒子等が挙げられるが、これらに限定はされない。標識物質の大きさは第2の核酸増幅産物を固相担体に捕捉するのを妨げるものでなく、かつ検出の際に発色の良いものであればよく、下記固相担体や核酸検出デバイスの各種多孔質部材の孔径よりも小さなサイズとなるように、適宜選択することができる。例えば、標識物質の大きさはおよそ500nm以下、好ましくはおよそ0.1nm~250nm、より好ましくはおよそ1nm~100nmの粒径とすることができる。
[0035]
 標識物質と第1のタグとの接触及び結合は、直接的結合であっても、間接的結合であってもよく、結合手段は利用する標識物質と第1のタグに応じて適宜好適なものを選択することができ、核酸-核酸相互作用、タンパク質-タンパク質相互作用、低分子化合物-タンパク質相互作用等を利用することができる。例えば、第1のタグがオリゴヌクレオチドを含む場合、標識物質を当該オリゴヌクレオチドの塩基配列と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドに結合することによって、両者のオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションさせることによって、標識物質と第1のタグとを間接的に結合することができる。標識物質とオリゴヌクレオチドとの結合はペプチド、タンパク質、核酸などを介して行ってもよいし、適当な官能基を介して行ってもよい。ハイブリダイゼーションの条件は、ハイブリダイゼーションが生じる条件であればよく特に限定はされないが、例えば20℃~40℃にて、10mM~50mMのリン酸を含む緩衝液(pH6.5~7.5)中で反応させることにより行うことができる。ハイブリダイゼーション効率を高めるべく、緩衝液にはさらに塩化ナトリウム等の塩を含めることができる。あるいは、第1のタグが低分子化合物であるビオチンを含む場合、標識物質をアビジン(ストレプトアビジン)に結合することによって、両者を結合することができる。また、第1のタグが低分子化合物であるジゴキシゲニンやFITCを含む場合、標識物質を抗DIG抗体や抗FITC抗体に結合することによって、両者を結合することができる。
[0036]
3.標識した標的核酸を固相担体に捕捉、検出する工程
 上記標識された第2の核酸増幅産物は、固相担体に捕捉し、検出することができる。第2の核酸増幅産物の固相担体への捕捉(すなわち、結合)は、固相担体と第2の核酸増幅産物における当該固相担体と結合可能な第2のタグとを接触させることにより行うことができる。固相担体は特に限定はされないが、樹脂、金属、多糖類、鉱物等からなるものを利用することができ、メンブレン、フィルム、不織布、プレート、ゲル等の形状とすることができる。好ましくは固相担体は、溶液中の第2の核酸増幅産物や標識物質が展開できるように多孔質構造を有するものである。本発明において利用可能な固相担体としては、例えば、ろ紙、ニトロセルロースメンブレン、ポリエーテルスルフォンメンブレン、ナイロンメンブレンや乾燥させた各種ゲル(シリカゲル、アガロースゲル、デキストランゲル、ゼラチンゲル)等が挙げられる。固相担体の大きさ及び形態は、各種操作や検出に適切なものを適宜選択することができる。
[0037]
 固相担体と第2のタグとの接触及び捕捉(すなわち、結合)は、直接的結合であっても、間接的結合であってもよく、結合手段は利用する固相担体と第2のタグに応じて適宜好適なものを選択することができる。例えば、第2のタグがオリゴヌクレオチドを含む場合、固相担体に当該オリゴヌクレオチドの塩基配列と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドを固定化してタグ捕捉手段とし、両者のオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションさせることによって、固相担体と第2のタグとを間接的に結合することができる。固相担体へのオリゴヌクレオチドの固定化はペプチド、タンパク質、核酸などを介して行ってもよいし、適当な官能基を介して行ってもよい。オリゴヌクレオチドを固相担体に固定化する場合、特定の領域に限局して固定化することによって、捕捉された第2の核酸増幅産物は所定の領域のみに限局して検出されるため、陽性又は陰性の判別を容易にすることができる。ハイブリダイゼーションの条件は、上記した条件により行うことができる。
[0038]
 第2の核酸増幅産物の検出は、固相担体に捕捉された第2の核酸増幅産物に結合した上記標識物質を検出、好ましくは目視検出することにより行うことができる。標的核酸が存在する場合には、固相担体に捕捉・結合された核酸増幅反応産物の標識物質が検出される。当該検出の有無を指標にして、第2の核酸増幅反応産物中の標的核酸の有無を判別することができる。
[0039]
4.核酸検出デバイス
 上記の「増幅した標的核酸を標識する工程」及び「標識した標的核酸を固相担体に捕捉、検出する工程」は核酸クロマトグラフィーを利用する核酸検出デバイスを用いて行うことができる。当該核酸検出デバイスを利用することにより、第2の核酸増幅産物中の標的核酸の有無を、特殊な装置を必要とすることなく検出・判別することができ、簡便かつ迅速に結果を得ることができる。
[0040]
 核酸検出デバイスは、核酸クロマトグラフィー法により標識された核酸増幅産物を検出するために利用される公知の核酸検出デバイス(WO2012/070618)を利用することができる。
[0041]
 本発明にて利用可能な核酸検出デバイスの一実施形態の模式図を図1に示すが、核酸検出デバイスは本実施形態に限定されるものではない。なお、以下の説明において、各部材に付された符号は、図1中に示される符号に対応する。
[0042]
 図1の核酸検出デバイスは、基材(5)の上に、第2の核酸増幅産物を添加するためのサンプルパッド(3)、標識物質を配置したコンジュゲートパッド(2)、標識された第2の核酸増幅産物を捕捉するための固相担体(1)及び吸収パッド(4)を順次重ねて配置してなる。固相担体(1)には、標識された第2の核酸増幅産物を捕捉するための手段(捕捉手段)(6)(例えば、上記オリゴヌクレオチド等)が限局して配置・固定化されている。サンプルパッド(3)、コンジュゲートパッド(2)、固相担体(1)及び吸収パッド(4)は上記固相担体として利用可能な多孔質構造を有する部材よりなる。これらは同一の部材より構成されていてもよいし、異なる部材より構成されていてもよい。基材(5)はその上に配置された各種部材を支持することができ、核酸検出デバイスの操作を容易にするものであればよく、例えば樹脂、金属、鉱物等からなるものを利用することができる。標識物質を展開溶液中に混合する場合には、コンジュゲートパッド(2)は省略することができる。
[0043]
 第2の核酸増幅反応後、得られた第2の核酸増幅反応産物はサンプルパッド(3)に添加する。核酸増幅反応後の反応液をそのまま滴下してもよいし、適当な展開溶液(例えば、リン酸緩衝液、Tris緩衝液、グッド緩衝液、SSC緩衝液)と共に滴下してもよい。展開溶液には必要に応じて、界面活性剤、塩、タンパク質、核酸等をさらに含めることができる。サンプルパッド(3)に添加された第2の核酸増幅反応産物は、図1中の矢印で示す方向に上流から下流に向かってキャピラリー現象により展開する。
[0044]
 第2の核酸増幅反応産物は標識物質が配置されたコンジュゲートパッド(2)を通過する際に、標識物質と接触し第1のタグを介して標識物質により標識される。
[0045]
 次いで、標識された第2の核酸増幅反応産物は、固相担体(1)を通過する際に、捕捉手段(6)と接触し、第2のタグを介して固相担体(1)に捕捉・結合される。
[0046]
 標的核酸が存在する場合には、捕捉手段(6)により固相担体(1)に捕捉・結合された核酸増幅反応産物の標識物質が捕捉手段(6)の領域に検出される。標識物質が目視確認できるものであれば、標識物質に起因して捕捉手段(6)の領域が呈色する。当該標識物質の検出(呈色)の有無を指標にして、第2の核酸増幅反応産物中の標的核酸の有無を判別することができる。
[0047]
II.核酸検出キット
 本発明に係る核酸検出キットは、上記の第1のプライマーセット、第2のプライマーセット、標識物質及び固相担体を含み、上記本発明における核酸の検出方法において利用することができる。標識物質及び固相担体は、上記核酸検出デバイスの形態とすることができる。
[0048]
 核酸検出キットにはさらに、PCR用緩衝液、dNTPs、DNAポリメラーゼ、核酸クロマトグラフィー展開溶液等を含めることができる。
[0049]
 以下、実施例により本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例
[0050]
(実施例1)
(I)金コロイド結合オリゴヌクレオチドの作製
 Gold Colloid(40nm,9.0×10 10(粒子数/ml)、British Biocell International社製)と下記配列番号1で表されるチオール基含有オリゴヌクレオチドを混合し、50℃で16時間インキュベートした。6000rpmで15分間遠心分離し、上清を除去し、0.05M塩化ナトリウム、5mMリン酸バッファー(pH7)を添加し混和後、再度50℃で40時間インキュベートした。
[0051]
 インキュベート後、遠心(6000rpm、15分間)を行い、上清を除去し、5mMリン酸バッファー(pH7)を添加した。このバッファー置換を再度行った。
[0052]
 調製した金コロイド溶液をグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲートパッドとした。
 (チオール基含有オリゴヌクレオチド):5’-CTATAAACCCAGTGAAAAATGTTGCCA-SH-3’(配列番号1)
[0053]
(II)タグ捕捉手段を固定化したメンブレンの作製
 タグ捕捉手段として、下記配列番号2で表されるオリゴヌクレオチドプローブを含む溶液を、メルクミリポア社製ニトロセルロースメンブレン(Hi-Flow180)に、ディスペンサーを用いてライン状に塗布した。その後40℃で30分間乾燥させることでタグ捕捉手段を備えたメンブレンとした。
 (オリゴヌクレオチドプローブ):5’-ATCACACATTAGCTGTCACTCGATGCA-3’(配列番号2)
[0054]
(III)ラテラルフロー型核酸検出デバイスの作製
 作製したラテラルフロー型核酸検出デバイスは、図1の模式図に示される検出デバイスに準拠して作製した。
[0055]
 すなわち、基材(5)としてポリプロピレン製バッキングシート(Lohmann社)、コンジュゲートパッド(2)として上記(I)で作製したコンジュゲートパッド、固相担体(1)及び捕捉手段(6)として上記(II)で作製したタグ捕捉手段を備えたメンブレン、サンプルパッド(3)としてグラスファイバー製のサンプルパッド、吸収パッド(4)としてセルロース製の吸収パッドを、それぞれ図1に示すように互いに重なり合わせて貼り合わせ、ラテラルフロー型核酸検出デバイスを作製した。
[0056]
(IV)標的検出用プライマーの設計
 本実施例では、配列番号3で表される合成核酸を鋳型DNAとし、PCR増幅を行った場合に、鋳型配列の特定領域の約230塩基対が増幅するようにインナープライマーF(配列番号4)及びインナープライマーR(配列番号5)を設計した。
[0057]
 さらに各インナープライマーのそれぞれ上流側(5’末端側)に、インナープライマーの認識配列を挟むようにアウタープライマーF(配列番号6)及びアウタープライマーR(配列番号7)を設計した。
[0058]
 設計に際しては、アウタープライマーのTm値が、インナープライマーのTm値より10℃以上高くなるように設計した。
[0059]
 各プライマーの配列及びTm値を表1に示す。また、各プライマーの認識配列に対応する領域を図2に示す。
[0060]
[表1]


[0061]
 各インナープライマーの5’末端には、ポリメラーゼ反応阻害領域であるアゾベンゼンを有するスペーサー(上記式(I)で表される)を介して、下記タグ配列1(配列番号8)及びタグ配列2(配列番号9)をそれぞれ連結し、インナープライマー-Tag1-F(配列番号10)及びインナープライマー-Tag2-R(配列番号11)を作製した。
(タグ配列1):5’-TCGAGTGACAGCTAATGTGTGATT-3’(配列番号8)
(タグ配列2):5’-ATTTTTCACTGGGTTTATAGT-3’(配列番号9)
(インナープライマー-Tag1-F):5’-TCGAGTGACAGCTAATGTGTGATT-X-CGGAGGTTCCGCAAAAGATG-3’(配列番号10)
(インナープライマー-Tag2-R):5’-ATTTTTCACTGGGTTTATAGT-X-CCTCCAGAGTGATCGATGTT-3’(配列番号11)
(上記配列中、「X」とはスペーサーを示す)
[0062]
(V)標的核酸の増幅反応
 PCR試薬はTaKaRa Ex Taq(登録商標)Hot Start Version(タカラバイオ)を用い、1×EX Taqバッファー、各0.2mM dNTPs、0.5μMインナープライマー-Tag1-F、0.5μMインナープライマー-Tag2-R、0.11μMアウタープライマーF、0.11μMアウタープライマーR、0.9375Unit TaKaRa EX Taq(登録商標)、鋳型合成DNA(配列番号3)(0pg/test,0.5pg/test,5pg/test,又は50pg/test)を含む反応溶液にて、Nested-PCR反応を行った。
[0063]
 反応条件は、95℃で2分後、95℃で10秒、72℃で20秒を1セットとして55サイクル実施し、その後、90℃で5秒、60℃で10秒、72℃で10秒を1セットとして15サイクル実施し、増幅産物を得た。得られた増幅産物は各インナープライマーに起因する1本鎖DNAからなるタグ配列を有する。
[0064]
(VI)ラテラルフロー型核酸検出デバイスを用いた増幅産物の検出
 上記(V)にて得られた増幅産物を、上記(III)で作製したラテラルフロー型核酸検出デバイスにて検出を行った。
[0065]
 Nested-PCR後の反応溶液(5μL)をデバイス上のサンプルパッドに添加し、さらに80μLの展開溶液(1×SSC,1%Tween20,0.1%SDS)を添加することで、反応溶液を展開した。室温で10分後、メンブレン上のライン状に固定化されたタグ捕捉手段の着色の有無を確認した。
[0066]
 結果を図3(A)に示す。0.5pg/testの鋳型合成DNAを添加したサンプルにおいても、適切に金コロイドに由来する赤色ラインが観察され、鋳型合成DNAに由来する増幅産物を検出することができた。一方、鋳型合成DNAを添加しないサンプル(0pg/test)においては着色を認めず、増幅産物に由来しない非特異的な着色は示さないことが確認された。
[0067]
(比較例1)
 実施例1で作製したタグ配列を連結したインナープライマーのみを用いて、配列番号3で表される合成核酸を鋳型DNAとしてPCR増幅を行った。PCR試薬はTaKaRa Ex Taq(登録商標)Hot Start Version(タカラバイオ)を用い、1×EX Taqバッファー、各0.2mM dNTPs、0.4μMインナープライマー-Tag1-F、0.4μMインナープライマー-Tag2-R、0.9375Unit TaKaRa EX Taq(登録商標)、鋳型合成DNA(配列番号3)(0pg/test,0.5pg/test,5pg/test,又は50pg/test)を含む反応溶液にて、PCR反応を行った。
[0068]
 反応条件は定法に従い、95℃で2分後、95℃で20秒、60℃で30秒、72℃で30秒を1セットとして40サイクル実施し、増幅産物を得た。得られた増幅産物は、実施例1と同様にラテラルフロー型核酸検出デバイスにて増幅産物の検出を行った。
[0069]
 結果を図3(B)に示す。鋳型合成DNAを添加しないサンプル(0pg/test)においても、非特異的な着色が認められた。この着色の原因について、増幅産物をアガロースゲル電気泳動法により解析したところ、プライマーダイマーの形成が認められ、これが非特異的に検出されたことが判明した。
[0070]
(実施例2)
 実施例1に記載のPCR条件のうち、第2の増幅工程は、プライマーダイマーによる非特異増幅を生じない15サイクルに固定し、第1の増幅工程のサイクル数を10サイクルから60サイクルの範囲で増減した場合の感度、特異度を検討した。
[0071]
 結果を以下の表2に示す。第1の増幅工程におけるサイクル数が25以上の場合、鋳型DNAに特異的な着色が確認された。また、50サイクル以上の場合、鋳型DNAが0.5pg/testであっても特異的な着色が確認された。第2の増幅工程を15サイクルにした条件では、鋳型合成DNAを添加しないサンプル(0pg/test)の疑陽性着色は確認されなかった。
[0072]
(比較例2)
 比較例1に記載のPCR条件のうち、PCRにおけるサイクル数を10サイクルから60サイクルの範囲で変え、各PCR条件における検出能を評価した。実施例1と同様の条件にてラテラルフロー型核酸検出デバイスを用いて増幅産物の検出試験を行った。
[0073]
 結果を以下の表2に示す。PCRにおけるサイクル数が25サイクル以上の場合、着色が確認された。しかし、鋳型合成DNAを添加しないサンプル(0pg/test)においても疑陽性着色が確認された。このため、いずれの条件においても陽性・陰性判定は不可となった。
[0074]
[表2]


[0075]
 以上の結果より、本発明方法によれば、プライマーダイマーによる非特異的な増幅産物の検出を回避することができ、標的核酸に由来する増幅産物を簡便かつ効率的に、また高感度にて検出することができる。

産業上の利用可能性

[0076]
 本発明は、核酸増幅法により得られたDNA断片を検出する工程を含む各種試験及び研究に利用することができる。より具体的には、本発明によれば、分子生物学の研究分野、病原体の検出、飲食品中のアレルゲンの検出、家畜管理、塩基多型の検出、疾患(例えば癌等)の検出を簡便かつ迅速に行うことができる。本発明はこのような分野において大いに貢献することが期待される。
[0077]
 本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

請求の範囲

[請求項1]
 標的核酸の検出方法であって、
(a)標的核酸の第1の塩基配列と相同な配列を含むプライマーと、該第1の塩基配列の下流側に位置する第2の塩基配列の相補鎖配列と相同な配列を含むプライマーからなる第1のプライマーセットを用いて、試験DNAを鋳型として核酸増幅反応を実施することにより、第1の核酸増幅産物を得る工程、
(b)該第1の塩基配列の下流側かつ該第2の塩基配列の上流側に位置する第3の塩基配列と相同な配列を含むプライマーと、該第3の塩基配列の下流側かつ該第2の塩基配列の上流側に位置する第4の塩基配列の相補鎖配列と相同な配列を含むプライマーからなる第2のプライマーセットであって、いずれか一つのプライマーが標識物質と結合可能な第1のタグと結合されており、かつ他方のプライマーが固相担体と結合可能な第2のタグと結合されている、該第2のプライマーセットを用いて、該第1の核酸増幅産物を鋳型として核酸増幅反応を実施することにより、各端に該第1のタグ及び該第2のタグがそれぞれ付加された第2の核酸増幅産物を得る工程、
(c)該第2の核酸増幅産物と、第1のタグと結合可能な標識物質とを接触させることにより、標識された核酸増幅産物を得る工程、
(d)該標識された核酸増幅産物と、固相担体とを接触させることにより、該標識された核酸増幅産物を該固相担体に捕捉する工程、ならびに
(e)該固相担体に捕捉された該標識された核酸増幅産物を検出する工程、
を含む、上記方法。
[請求項2]
 前記工程(a)と前記工程(b)とを、同一の反応容器内で連続して行うことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
[請求項3]
 前記工程(a)における核酸増幅反応のアニーリング温度が、前記工程(b)における核酸増幅反応のアニーリング温度より高いことを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
[請求項4]
 前記工程(b)における核酸増幅反応の増幅サイクル数が、前記工程(a)における核酸増幅反応の増幅サイクル数より少ないことを特徴とする、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
[請求項5]
 (a)標的核酸の第1の塩基配列と相同な配列を含むプライマーと、該第1の塩基配列の下流側に位置する第2の塩基配列の相補鎖配列と相同な配列を含むプライマーからなる第1のプライマーセット、
 (b)該第1の塩基配列の下流側かつ該第2の塩基配列の上流側に位置する第3の塩基配列と相同な配列を含むプライマーと、該第3の塩基配列の下流側かつ該第2の塩基配列の上流側に位置する第4の塩基配列の相補鎖配列と相同な配列を含むプライマーからなる第2のプライマーセットであって、いずれか一つのプライマーが標識物質と結合可能な第1のタグと結合されており、かつ他方のプライマーが固相担体と結合可能な第2のタグと結合されている、該第2のプライマーセット、
 (c)該第1のタグと結合可能な標識物質、ならびに、
 (d)該第2のタグと結合可能な固相担体、
を含む、標的核酸を検出するためのキット。
[請求項6]
 前記第2のプライマーセットにおける、前記第1のタグおよび前記第2のタグの少なくとも一方が、オリゴヌクレオチドからなるタグであることを特徴とする、請求項5に記載のキット。
[請求項7]
 前記オリゴヌクレオチドからなるタグが、DNAポリメラーゼ反応を抑制または停止可能なスペーサーを介してプライマーと結合されていることを特徴とする、請求項6に記載のキット。
[請求項8]
 前記スペーサーが、アゾベンゼン、脂肪鎖、又はInverted塩基であることを特徴とする、請求項7に記載のキット。
[請求項9]
 前記第1のタグがオリゴヌクレオチドからなるタグであり、標識物質が該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項6~8のいずれか一項に記載のキット。
[請求項10]
 前記第1のタグがビオチン、ジゴキシゲニン、及びFITCから選択されるいずれかの低分子化合物からなるタグであり、標識物質が該タグと結合可能なタンパク質を含む、請求項6~9のいずれか一項に記載のキット。
[請求項11]
 前記第2のタグがオリゴヌクレオチドからなるタグであり、固相担体が該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項6~10のいずれか一項に記載のキット。
[請求項12]
 前記第1のプライマーセットに含まれる一又は両方のプライマーのTm値が、前記第2のプライマーセットに含まれる一又は両方のプライマーのTm値よりも高いことを特徴とする、請求項5~11のいずれか一項に記載のキット。

図面

[ 図 1]

[ 図 2]

[ 図 3]