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1. (WO2017002458) PHASE CONTRAST MICROSCOPE AND IMAGING METHOD
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明 細 書

発明の名称 位相差顕微鏡および撮像方法

技術分野

0001  

背景技術

0002   0003   0004   0005   0006   0007  

先行技術文献

特許文献

0008  

発明の概要

発明が解決しようとする課題

0009   0010   0011  

課題を解決するための手段

0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033  

発明の効果

0034   0035  

図面の簡単な説明

0036  

発明を実施するための形態

0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061   0062   0063   0064   0065   0066   0067   0068   0069   0070   0071   0072   0073   0074   0075   0076   0077   0078   0079   0080   0081   0082   0083   0084   0085   0086   0087   0088   0089   0090   0091   0092   0093   0094   0095   0096   0097   0098   0099   0100   0101   0102   0103   0104   0105   0106   0107   0108   0109   0110   0111   0112   0113   0114   0115   0116   0117   0118  

符号の説明

0119  

請求の範囲

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22  

図面

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15  

明 細 書

発明の名称 : 位相差顕微鏡および撮像方法

技術分野

[0001]
 本発明は、液体中の観察対象を位相差計測する位相差顕微鏡および撮像方法に関するものである。

背景技術

[0002]
 近年、幹細胞などの培養された透明な細胞を非染色に観察する方法として位相差計測が広く使われ始めている。そして、このような位相差計測を行うものとして位相差顕微鏡が使用されている。
[0003]
 一般的な位相差顕微鏡においては、リング状の照明光が観察対象に照射され、観察対象を通過した直接光と回折光が位相板に入射される。そして、直接光は位相板のリング部分によって減光され、回折光は位相板の透明な部分を通過し、この直接光と回折光とが結像されることによって明暗のコントラストのついた像を撮像することができる。
[0004]
 ここで、たとえば位相差顕微鏡によって培養液中の細胞などを観察する場合、培養液の表面張力の影響によって培養液の液面にメニスカスが形成される。そして、このメニスカスのレンズ作用によってリング状の照明光の光軸がシフトし、位相板に入射される直接光と回折光とに影響を及ぼして明瞭な位相差像が得られない問題がある。
[0005]
 このような培養液のメニスカスの影響を抑制するため、種々の方法が提案されている。たとえば、特許文献1においては、対物レンズの瞳位置のリング状の位相膜の形状と、光学素子によって形成されるリング状の照明光の形状とを瞳像検出器によって検出し、その検出された座標データに基づいて、光学素子のリング状開口の形状を制御することが提案されている。
[0006]
 また、特許文献2においては、メニスカスの影響ではないが、培養容器の底面の湾曲や培養容器の傾斜によって照明光の光軸がずれることを考慮し、照明光の光軸ずれを検出し、その光軸ずれに応じて位相板を移動させることが提案されている。
[0007]
 また、特許文献3においては、メニスカスの影響を抑制するため、スリット板または位相板を移動させることが提案されている。

先行技術文献

特許文献

[0008]
特許文献1 : 特開2010-271537号公報
特許文献2 : 特開2007-293267号公報
特許文献3 : 特開2009-122356号公報

発明の概要

発明が解決しようとする課題

[0009]
 しかしながら、メニスカスの形状は、培養容器の素材および培養容器内に収容される液体の性質などによって決定し、様々な形状となる可能性がある。特に、経時的に複数回の撮影を行うタイムラプス撮影を行う場合には、培養液の蒸発によって培養容器内の培養液の水位も経過時間に応じて変化するため、メニスカスの形状も時間の経過に応じて変化することになる。
[0010]
 したがって、メニスカスの形状をできるだけ正確に把握し、その形状に応じた光学系の調整が必要となるが、特許文献1~特許文献3には、様々なメニスカスの形状を正確に把握する方法については何も提案されていない。
[0011]
 本発明は、上記の問題に鑑み、容器内に収容された液体の液面に形成されるメニスカスの形状を正確に把握し、そのメニスカスに起因する照明光の屈折の影響を高精度に取り除くことができる位相差顕微鏡および撮像方法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0012]
 本発明の位相差顕微鏡は、液体および観察対象が収容された容器に対して位相差計測のための位相差計測用照明光を照射する位相差計測用照明光照射部と、位相差計測用照明光を照射した観察対象を撮像する撮像部と、容器内の液体の液面形状を計測するための液面計測用照明光を液体の液面に対して照射する液面計測用照明光照射部と、液面計測用照明光の照射によって容器内の液体の液面を透過した透過光を検出する透過光検出部と、透過光を透過光検出部の検出面に集光する結像光学系の焦点面と容器との相対的な位置関係を変更する焦点面変更部と、焦点面と容器との相対的な位置毎の透過光の検出信号に基づいて、液体の液面形状を推定する液面形状推定部と、光学特性が調整可能であり、容器内の液体の液面形状に起因する位相差計測用照明光の屈折を光学特性に応じて調整する調整光学系と、液面形状推定部によって推定された液面形状に基づいて、調整光学系の光学特性を調整するための調整情報を取得する調整情報取得部とを備えたことを特徴とする。
[0013]
 また、本発明の位相差顕微鏡において、調整情報取得部によって取得された調整情報に基づいて、調整光学系の光学特性を調整する調整光学系制御部を備えることができる。
[0014]
 また、本発明の位相差顕微鏡において、焦点面変更部は、結像光学系に含まれる光学素子を光軸方向に移動させることによって、焦点面と容器との相対的な位置関係を変更することができる。
[0015]
 また、本発明の位相差顕微鏡において、焦点面変更部は、容器を結像光学系の光軸方向に移動させることによって、焦点面と容器との相対的な位置関係を変更することができる。
[0016]
 また、本発明の位相差顕微鏡において、焦点面変更部は、結像光学系に設けられた焦点距離の異なる複数の光学素子の交換によって、焦点面と容器との相対的な位置関係を変更することができる。
[0017]
 また、本発明の位相差顕微鏡において、液面形状推定部は、液体の液面上の液面計測用照明光の照射位置の情報および予め設定された液面の曲面を表す情報と、液体の液面上の少なくとも1点に対して液面計測用照明光を照射した場合の透過光の検出信号とに基づいて、液面形状を推定することができる。
[0018]
 また、本発明の位相差顕微鏡において、液面形状推定部は、液体の液面上の液面計測用照明光の照射位置の情報および予め設定された液面の曲面を表す情報のうちのいずれか一方の情報と、液体の液面上の少なくとも3点に対して液面計測用照明光を照射した場合の透過光の検出信号とに基づいて、液面形状を推定することができる。
[0019]
 また、本発明の位相差顕微鏡において、液面形状推定部は、液体の液面上の少なくとも9点に対して液面計測用照明光を照射した場合の透過光の検出信号に基づいて、液面形状を推定することができる。
[0020]
 また、本発明の位相差顕微鏡において、液面形状推定部は、液体の液面の重心位置からの距離が異なる各周上についてそれぞれ1回のみ液面形状の推定を行うことができる。
[0021]
 また、本発明の位相差顕微鏡において、液面計測用照明光照射部は、液体の液面上の複数の点に液面計測用照明光を照射する場合、点毎に異なる形状パターンを有する液面計測用照明光を照射することができる。
[0022]
 また、本発明の位相差顕微鏡において、液面計測用照明光照射部は、液体の液面上の複数の点に液面計測用照明光を照射する場合、点毎に異なるタイミングで液面計測用照明光を照射することができる。
[0023]
 また、本発明の位相差顕微鏡において、液面計測用照明光照射部は、液体の液面上の複数の点に液面計測用照明光を照射する場合、点毎に異なる波長を有する液面計測用照明光を照射することができる。
[0024]
 また、本発明の位相差顕微鏡において、液面形状推定部は、液面計測用照明光が照射された液面上の点の液面形状の推定結果を用いて補間することによって、液面計測用照明光が照射されていない液面上の点の液面形状の推定を行うことができる。
[0025]
 また、本発明の位相差顕微鏡において、液面形状推定部は、液面形状の推定結果を記憶することができ、液面形状推定部によって上記推定結果が記憶された後の時点で、再び液面の液面形状の推定を行う場合には、液面計測用照明光照射部は、前記推定結果が記憶される前の時点で液面形状の推定を行った場合よりも液面計測用照明光の液面上の照射点の数を減らすことができ、液面形状推定部は、その減らされた照射点の透過光の検出信号に基づく液面形状の推定結果と記憶した液面形状の推定結果とに基づいて、後の時点での液面形状の推定を行うことができる。
[0026]
 また、本発明の位相差顕微鏡において、液面計測用照明光照射部は、予め設定されたパターンを有するパターン光を液面計測用照明光として照射することができる。
[0027]
 また、本発明の位相差顕微鏡において、パターン光は、格子状のパターンであることが好ましい。
[0028]
 また、本発明の位相差顕微鏡において、パターン光は、同心円のパターンであることが好ましい。
[0029]
 また、本発明の位相差顕微鏡において、パターン光によって形成される像上の予め設定された複数の位置にそれぞれ異なる形状の像を形成することができる。
[0030]
 また、本発明の位相差顕微鏡において、パターン光によって形成される像上の予め設定された複数の位置にそれぞれ異なる色の像を形成することができる。
[0031]
 また、本発明の位相差顕微鏡において、調整情報取得部は、推定された液面形状に基づいて、液体の液面形状に起因する位相差計測用照明光の光路ずれを算出し、その算出した光路ずれに基づいて、調整光学系の調整情報を取得することができる。
[0032]
 また、本発明の位相差顕微鏡において、液面形状推定部は、液面の曲面情報および位置情報を算出することによって、液面形状を推定することができる。
[0033]
 本発明の撮像方法は、液体および観察対象が収容された容器内の液体の液面に対して、容器内の液体の液面形状を計測するための液面計測用照明光を照射し、液面計測用照明光の照射によって容器内の液体の液面を透過した透過光を透過光検出部によって検出し、透過光を透過光検出部の検出面に集光する結像光学系の焦点面と容器との相対的な位置関係を変更して、焦点面と容器との相対的な位置毎の透過光の検出信号を取得し、焦点面と容器との相対的な位置毎の透過光の検出信号に基づいて、液体の液面形状を推定し、その推定した液面形状に基づいて、液面形状に起因する光の屈折を調整する調整光学系の光学特性を調整するための調整情報を取得し、その調整情報に基づいて、調整光学系の光学特性を調整し、調整光学系の光学特性を調整した後、容器に対して位相差計測のための位相差計測用照明光を照射し、位相差計測用照明光を照射した観察対象を撮像することを特徴とする。

発明の効果

[0034]
 本発明の位相差顕微鏡および撮像方法によれば、液体および観察対象が収容された容器内の液体の液面に対して、容器内の液体の液面形状を計測するための液面計測用照明光を照射し、液面計測用照明光の照射によって容器内の液体の液面を透過した透過光を透過光検出部によって検出する。さらに、透過光を透過光検出部の検出面に集光する結像光学系の焦点面と容器との相対的な位置関係を変更して、焦点面と容器との相対的な位置毎の透過光の検出信号を取得し、焦点面と容器との相対的な位置毎の透過光の検出信号に基づいて、液体の液面形状を推定するようにしたので、容器内に収容された液体の液面に形成されるメニスカスの形状を正確に把握することができる。
[0035]
 そして、その推定した液面形状に基づいて、液面形状に起因する光の屈折を調整する調整光学系の光学特性を調整するための調整情報を取得し、その調整情報に基づいて、調整光学系の光学特性が調整された後、容器に対して位相差計測のための位相差計測用照明光を照射し、位相差計測用照明光を照射した観察対象を撮像するようにしたので、メニスカスに起因する位相差計測用照明光の屈折の影響を高精度に取り除くことができ、より適切な位相差画像を取得することができる。

図面の簡単な説明

[0036]
[図1] 本発明の位相差顕微鏡の一実施形態を用いた顕微鏡システムの概略構成を示す図
[図2] スリット板の構成の一例を示す図
[図3] 調整用光学素子の位置、光軸の回転および屈折力の調整を模式的に示す図
[図4] 位相板の構成の一例を示す図
[図5] メニスカスが形成されていないと想定した場合に、撮像部の検出面上に結像される各照射点に対応するレーザ光の像P1~P9の位置を示す図
[図6] メニスカスが形成されていると想定した場合に、撮像部の検出面上に結像される各照射点に対応するレーザ光の像P1~P9の位置を示す図
[図7] 液面形状の推定方法を説明するための図
[図8] 本発明の位相差顕微鏡の一実施形態を用いた顕微鏡システムの作用を説明するためのフローチャート
[図9] 撮像領域内の9つの照射点に液面計測用照明光を照射して液面形状を推定する場合を説明するための図
[図10] 撮像領域内の3つの照射点に液面計測用照明光を照射して液面形状を推定する場合を説明するための図
[図11] 撮像領域を渦巻き状に変更しながら位相差画像を撮像する方法を説明するための図
[図12] 縞状のパターンを有する液面計測用照明光の一例を示す図
[図13] 同心円のパターンを有する液面計測用照明光の一例を示す図
[図14] 9つの液面計測用照明光の照射点をウェル全体に設定してウェル全体の液面形状を推定する場合を説明するための図
[図15] 3つの液面計測用照明光の照射点をウェル全体に設定してウェル全体の液面形状を推定する場合を説明するための図

発明を実施するための形態

[0037]
 以下、本発明の位相差顕微鏡および撮像方法の一実施形態を用いた顕微鏡システムについて、図面を参照しながら詳細に説明する。図1は、本実施形態の顕微鏡システムの概略構成を示す図である。
[0038]
 本実施形態の顕微鏡システムは、図1に示すように、位相差計測用照明光照射部10と、液面計測用照明光照射部15と、調整光学系20と、結像光学系30と、撮像部40と、顕微鏡制御装置50と、表示装置70と、入力装置80とを備えている。
[0039]
 本実施形態の顕微鏡システムにおいては、調整光学系20と結像光学系30との間に、ステージ61が設けられており、このステージ61上に、液体である培養液Cおよび観察対象Sが収容された培養容器60が設置される。そして、本実施形態の顕微鏡システムは、X方向、Y方向およびZ方向にステージ61を移動させるステージ駆動部62を備えている。X方向およびY方向は、観察対象設置面Pに平行な面上において互いに直交する方向であり、Z方向は、X方向およびY方向に直交する方向である。
[0040]
 本実施形態の顕微鏡システムにおいては、上述した位相差計測用照明光照射部10、液面計測用照明光照射部15、調整光学系20、結像光学系30、撮像部40、ステージ61およびステージ駆動部62から位相差顕微鏡本体が構成され、顕微鏡制御装置50は、この位相差顕微鏡本体を制御するものである。以下、位相差顕微鏡本体の具体的な構成を説明する。
[0041]
 位相差計測用照明光照射部10は、培養容器60内に収容された観察対象Sに対して、いわゆる位相差計測のための照明光を照射するものであり、本実施形態では、その位相差計測用照明光としてリング状照明光を照射する。具体的には、本実施形態の位相差計測用照明光照射部10は、白色光を出射する白色光源11と、リング形状のスリットを有し、白色光源11から出射された白色光が入射されてリング状照明光を出射するスリット板12と、スリット板12から射出されたリング状照明光が入射され、その入射されたリング状照明光を観察対象Sに対して照射するコンデンサレンズ13とを備えている。
[0042]
 図2は、スリット板12の具体的な構成を示す図である。図2に示すように、スリット板12は、白色光源11から出射された白色光を遮光する遮光板12bに対して白色光を透過するリング形状のスリット12aが設けられたものであり、白色光がスリット12aを通過することによってリング状照明光が形成される。
[0043]
 なお、本実施形態においては、上述したようにスリット板12を用いてリング状照明光を形成するようにしたが、リング状照明光を形成する方法としては、これに限らず、たとえば空間光変調素子などを用いてリング状照明光を形成するようにしてもよい。
[0044]
 また、本実施形態においては、位相差計測用照明光としてリング状照明光を用いるようにしたが、リング状以外の形状を有する照明光でもよく、後述する位相板と共役な形状となっていれば三角形状や四角形状などその他の形状でもよい。
[0045]
 ステージ61上に設置された培養容器60は、その底面が観察対象設置面Pであり、観察対象設置面Pには観察対象Sとして細胞群などが配置される。そして、培養容器60内には培養液Cが満たされており、この培養液Cの液面には、凹形状のメニスカスが形成される。培養容器60としては、シャーレおよび複数のウェルが配列されたウェルプレートなどがある。ウェルプレートの場合、各ウェルに観察対象Sおよび培養液Cが収容され、ウェル毎にメニスカスが形成される。
[0046]
 また、本実施形態においては、培養液中で培養される細胞群を観察対象Sとしたが、観察対象Sとしてはこのような培養中のものに限らず、水、ホルマリン、エタノール、およびメタノールなどの液体中において固定された細胞を観察対象Sとしてもよい。この場合も、容器内のこれらの液体の液面にメニスカスが形成される。
[0047]
 調整光学系20は、上述したメニスカスの液面形状に起因する位相差計測用照明光の屈折を調整するものである。本実施形態の調整光学系20は、調整用光学素子21と、調整光学系駆動部22とを備えている。
[0048]
 調整用光学素子21は、屈折力を有するものであり、具体的には、電圧印加によって屈折力が変化する液晶レンズ、レンズの曲率半径を変更可能な液体レンズ、および焦点距離を変更可能な空間光変調器などを用いることができる。調整用光学素子21として、レンズを用いる場合には、入射面または出射面に曲率を有する平凸面レンズを用いてもよいし、入射面および出射面の両方に曲率を有する両凸面レンズを用いるようにしてもよい。
[0049]
 調整光学系駆動部22は、後述する調整光学系制御部51から出力された制御信号に基づいて、調整用光学素子21の屈折力を変更して焦点距離を調整するものである。具体的には、調整用光学素子21として液晶レンズまたは空間光変調器を用いる場合には、液晶レンズまたは空間光変調器に対して所望の焦点距離に応じた電圧を印加するものである。また、調整用光学素子21として液体レンズを用いる場合には、所望の焦点距離に応じて液体レンズ内の液体の量を調整し、これにより液体レンズの曲率半径を調整するものである。
[0050]
 また、調整光学系駆動部22は、調整光学系制御部51から出力された制御信号に基づいて、調整用光学素子21の位置および調整用光学素子21の光軸方向を変更する機構を備えたものである。具体的には、調整光学系駆動部22は、X方向、Y方向およびZ方向に調整用光学素子21の位置を変更可能な機構を備えている。また、調整光学系駆動部22は、調整用光学素子21の光軸を回転させる機構を備えたものである。図3Iは、X方向、Y方向およびZ方向への調整用光学素子21の位置の変更を模式的に示す図である。また、図3IIは、調整用光学素子21の光軸のX軸回り(θ)の回転調整、Y軸回り(φ)の回転調整およびZ軸回り(ρ)の回転調整を模式的に示す図である。また、図3IIIは、調整用光学素子21の屈折力の調整を模式的に示すものである。なお、図3IIIでは、調整用光学素子21の曲率半径を調整することによって屈折力を調整する例を示しているが、屈折力を調整する方法としては、これに限らず、たとえば、調整用光学素子21として液晶レンズや空間光変調器を用いる場合には、印加電圧を調整することによって、屈折力を調整するようにすればよい。
[0051]
 また、本実施形態においては、調整用光学素子21をX方向、Y方向およびZ方向に移動させるようにしたが、この調整用光学素子21の移動による光学的な作用と同等の作用を得られるのであれば、必ずしも調整用光学素子21を移動させなくてもよい。たとえば、調整用光学素子21として液晶レンズや空間光変調器を用いる場合には、印加電圧を調整することによって、調整用光学素子21の移動よる光軸のシフトと同様の作用効果を得るようにしてもよい。また、調整用光学素子21の光軸方向についても同様に、必ずしも調整用光学素子21自体を回転させる必要はなく、印加電圧を調整することによって、調整用光学素子21自体の回転による光軸の回転と同様の作用効果を得るようにしてもよい。
[0052]
 また、本実施形態においては、調整用光学素子21をX方向およびY方向に移動するようにしたが、これに限らず、ステージ61をX方向およびY方向に移動させることによって、調整用光学素子21と培養容器60内に形成されたメニスカスとのX方向およびY方向についての相対的な位置関係を変更するようにしてもよい。
[0053]
 また、本実施形態においては、1つの調整用光学素子21を用いるようにしたが、焦点距離の異なる複数の調整用光学素子21を切り替えることによって屈折力を調整するようにしてもよい。その場合、調整用光学素子21の交換は、自動で行うようにしてもよいし、手動で行うようにしてもよい。複数の調整用光学素子21を手動で交換する場合には、たとえば後述する液面形状推定部54によって推定された液面形状に基づいて、適切な調整用光学素子21の種類の情報を表示装置70に表示させ、その表示に基づいて、ユーザが手動で調整用光学素子21を交換するようにしてもよい。
[0054]
 結像光学系30は、対物レンズ31と、位相板32と、結像レンズ33と、結像光学系駆動部34とを備えたものである。図4は、位相板32の具体的な構成を示す平面図である。図4に示すように、位相板32は、リング状照明光の波長に対して透明な透明板32bに対して位相リング32aを形成したものである。なお、上述したスリット12aの大きさは、この位相リング32aと共役な関係にある。
[0055]
 位相リング32aは、入射された光の位相を1/4波長ずらす位相膜と、入射された光を減光する減光フィルタとがリング状に形成されたものである。位相板32に入射された直接光は位相リング32aを通過することによって位相が1/4波長ずれるとともに、その明るさが弱められる。一方、観察対象Sによって回折された回折光は大部分が位相板32の透明板32bを通過し、その位相および明るさは変化しない。
[0056]
 対物レンズ31は、結像光学系駆動部34によってZ方向に移動するものである。観察対象Sの位相差画像を撮像する場合には、結像光学系駆動部34によって対物レンズ31をZ方向へ移動させることによってオートフォーカス制御が行われ、撮像部40によって撮像される画像のコントラストが調整される。
[0057]
 また、培養容器60内の培養液Cの後述する液面形状の推定を行う場合には、結像光学系駆動部34によって対物レンズ31をZ方向(対物レンズ31の光軸方向)へ移動させることによって結像光学系30の焦点面の位置が変更される。すなわち、結像光学系30の焦点面と培養容器60との相対的な位置関係が変更される。この液面形状の推定を行う場合における結像光学系30の焦点面の位置の変更については、後で詳述する。なお、本実施形態においては、結像光学系駆動部34が、本発明の焦点面変更部に相当するものである。
[0058]
 結像レンズ33は、位相板32を通過した直接光および回折光が入射され、これらの光を撮像部40に結像するものである。なお、本実施形態においては、上述したように結像光学系30に含まれる対物レンズ31をZ方向に移動させるようにしたが、結像レンズ33をZ方向に移動させることによって結像光学系30の焦点面を変更するようにしてもよい。
[0059]
 結像光学系駆動部34は、上述したように対物レンズ31をZ方向に移動させる機構を備えたものである。
[0060]
 撮像部40は、結像レンズ33によって結像された観察対象Sの位相差画像を撮像する撮像素子を備えたものである。撮像素子としては、CCD(charge-coupled device)イメージセンサやCMOS(Complementary Metal-Oxide Semiconductor)イメージセンサなどを用いることができる。
[0061]
 液面計測用照明光照射部15は、レーザ光源16と、ダイクロイックミラー17とを備えている。レーザ光源16は、調整光学系20の調整用光学素子21と培養容器60との間に設置されたダイクロイックミラー17に向けてレーザ光を出射するものである。このレーザ光は、培養容器60内の培養液Cの液面形状を計測するための液面計測用照明光である。なお、このレーザ光の波長は、位相差計測用照明光の波長とは異なる波長である。
[0062]
 ダイクロイックミラー17は、レーザ光源16から出射されたレーザ光を培養液Cの液面に向けて反射し、かつ位相差計測用照明光を透過する光学特性を有するものである。なお、必ずしも位相差計測用照明光を透過するダイクロイックミラーを用いる必要はなく、レーザ光源16から出射されたレーザ光を反射する単なるミラーを用いるようにしてもよい。その場合、位相差計測を行う場合には、位相差計測用照明光の光路上からミラーを退避させるようにすればよい。
[0063]
 液面計測用照明光照射部15のレーザ光源16から出射されたレーザ光は、ダイクロイックミラー17によって反射された後、培養容器60内の培養液Cを透過し、さらに結像光学系30を透過して撮像部40によって検出される。撮像部40によって検出された透過光の検出信号は、顕微鏡制御装置50の後述する液面形状推定部54に出力される。なお、本実施形態においては、撮像部40が、本発明の透過光検出部に相当するものである。すなわち、本実施形態では、観察対象Sを撮像する撮像部40を、液面計測用照明光を検出する透過光検出部として兼用するようにしているが、このような構成に限らず、透過光検出部を撮像部40とは別個に設けるようにしてもよい。具体的には、位相板32と結像レンズ33との間に配置され、位相差計測用照明光を透過し、液面計測用照明光を反射するダイクロイックミラーと、そのダイクロイックミラーによって反射された液面計測用照明光を検出する撮像素子とを透過光検出部として別に設けるようにしてもよい。
[0064]
 そして、本実施形態においては、液面形状計測用照明光であるレーザ光は、培養液Cの液面上における複数の照射点に照射される。ここで、本実施形態では、後述するようにステージ61をX方向およびY方向に移動させることによって、培養容器60(たとえばウェル)内を位相差計測用照明光で走査し、1つのウェル内で分割された複数の撮像領域毎の位相差画像を撮像する。そして、本実施形態では、この各撮像領域内において、少なくとも9個の照射点にレーザ光が照射される。9個の照射点は、3行×3列でそれぞれ予め設定された間隔で配置される。9個の照射点は、撮像領域内において均一に分散させて配置することが望ましい。
[0065]
 図5は、たとえば培養液Cの液面上にメニスカスが形成されていないと想定した場合に、撮像部40の検出面D上に結像される各照射点に対応するレーザ光の像P1~P9の位置を示している。これに対し、図6は、培養液Cの液面上にメニスカスが形成されている場合に、撮像部40の検出面D上に結像される各照射点に対応するレーザ光の像P1~P9の位置を示している。図6に示すように、培養液Cの液面上に形成されたメニスカスの形状に起因してレーザ光が培養液Cの液面で屈折し、これにより検出面Dに結像される各照射点に対応するレーザ光の像P1~P9の位置関係は、図5に示す位置関係から矢印方向にずれることになる。
[0066]
 本実施形態においては、ステージ駆動部62によってステージ61をX方向およびY方向に移動させることによって、図5に示す各照射点にレーザ光が順次照射される。すなわち、照射点毎に異なるタイミングでレーザ光が照射される。ただし、これに限らず、たとえばレーザ光源16およびダイクロイックミラー17の位置をX方向およびY方向に移動させることによって、図5に示す各照射点にレーザ光を順次照射するようにしてもよい。また、本実施形態においては、3行×3列の9個の照射点にレーザ光を照射するようにしたが、照射点の数はこれに限らず、4行×4列の16個としてもよいし、5行×5列の25個としてもよい。
[0067]
 レーザ光の照射点の数は、撮像領域の大きさまたは培養液Cの液面の大きさに応じて変更するようにしてもよく、たとえば撮像領域の大きさの情報または培養容器60の大きさもしくは種類の情報に基づいて照射点の数を自動的に変更するようにしてもよい。撮像領域の大きさの情報および培養容器60の大きさまたは種類の情報については、たとえばユーザが入力装置80を用いて設定入力するようにしてもよい。
[0068]
 顕微鏡制御装置50は、CPU(Central Processing Unit)やストレージデバイスを備えたコンピュータから構成されるものである。
[0069]
 顕微鏡制御装置50は、具体的には、図1に示すように、調整光学系駆動部22を制御する調整光学系制御部51と、結像光学系駆動部34を制御する結像光学系制御部52と、ステージ駆動部62を制御するステージ制御部53と、上述した液面形状計測用照明光であるレーザ光の照射によって撮像部40により検出された透過光の検出信号に基づいて、培養容器60内の培養液Cの液面形状を推定する液面形状推定部54と、液面形状推定部54によって推定された液面形状に基づいて、調整光学系20の光学特性を調整するための調整情報を取得する調整情報取得部55とを備えている。
[0070]
 ここで、本実施形態の液面形状推定部54による液面形状の推定について、詳細に説明する。
[0071]
 本実施形態においては、上述したように液面形状計測用照明光であるレーザ光が、培養液Cの液面上の撮像領域内の9個の照射点に照射される。そして、この際、各照射点について、それぞれ結像光学系30の焦点面の位置が変更され、焦点面の位置を変更する毎にレーザ光が照射され、それぞれの透過光が撮像部40によって検出される。液面形状推定部54は、この焦点面の位置毎に検出された透過光の像の検出面上におけるずれ量に基づいて、各照射点の位置における培養液Cの水位の情報を算出し、その算出した水位の情報に基づいて撮像領域内の培養液Cの液面形状を推定する。なお、本実施形態においては、上述したように照射点毎にそれぞれ異なるタイミングでレーザ光を照射するので、焦点面の位置を変更する前の透過光の結像位置と、焦点面の位置を変更した後の透過光の結像位置との対応関係を容易に認識することができる。
[0072]
 具体的には、図7に示すように、対物レンズ31を含む結像光学系30の焦点面がS1の位置に設定されている場合、任意の照射点に対してレーザ光Laを照射すると、メニスカスに起因する液面の傾きによって透過光の光路は角度θだけ屈折し、焦点面S1上における透過光の結像位置はF1となり、照射位置に対してxだけずれることになる。
[0073]
 次に、対物レンズ31をZ方向に移動させることによって結像光学系30の焦点面をS2の位置に変更し、同一の照射点に対してレーザ光Laを照射した場合、同様に液面の傾きによって透過光の光路は角度θだけ屈折するが、このとき焦点面S2上における透過光の結像位置はF2となり、焦点面S1上における透過光の結像位置F1からΔxだけずれることになる。このずれ量Δxが、撮像部40によって検出される。すなわち、焦点面をS1に設定してレーザ光を照射した場合における撮像部40の検出面上の透過光の結像位置と、焦点面をS2に設定してレーザ光を照射した場合における撮像部40の検出面上の透過光の結像位置とに基づいて、上述したずれ量Δxを算出することができる。なお、ここでは、実際に撮像部40の検出面上において検出されたずれ量がΔxであるとして説明を進める。また、ここでは、分かりやすくするためX方向についてのみ説明するが、実際にはY方向へのずれ量も含めて液面形状の推定を行うものとする。
[0074]
 次に、焦点面S1と焦点面S2とのZ方向についての変更量をΔLとすると、図7に示すように、x、Δx、LおよびΔLの関係は、下式の関係となるので、Lの値を算出することができる。
Δx/x=ΔL/L
L=(ΔL/Δx)×x
 Lは、撮像部40の検出面から培養液Cの液面までの距離であり、培養液Cの水位の情報を含むものであるので、各照射点について、それぞれLの値を算出することによって、撮像領域内の培養液Cの液面形状を推定することができる。9個の照射点以外の点のLについては、たとえば9個の照射点についてそれぞれ算出されたLに基づいて内挿および外挿して算出するようにすればよい。内挿については線形補間を用いるようにしてもよい。また、メニスカスがなす曲面を表す関数を予め設定しておき、その関数にフィッティングすることによって、内挿および外挿するようにしてもよい。なお、メニスカスがなす曲面を表す関数についても、たとえば撮像領域の大きさの情報または培養容器60の大きさもしくは種類の情報に基づいて自動的に変更するようにしてもよい。培養容器60の大きさまたは種類の情報については、たとえばユーザが入力装置80を用いて設定入力するようにしてもよい。
[0075]
 液面形状推定部54は、上記のようにして撮像領域内の培養液Cの液面上の点のZ方向の位置を算出することによって液面形状を推定し、その推定結果を調整情報取得部55に出力する。
[0076]
 調整情報取得部55は、上述したように液面形状推定部54によって推定された液面形状に基づいて、調整光学系20の光学特性を調整するための調整情報を取得するものである。具体的には、本実施形態の調整情報取得部55は、液面形状推定部54によって推定された液面形状に基づいて、撮像領域内の少なくとも1つの照射点における液面の傾斜角を取得し、その傾斜角と培養液Cの屈折率とに基づいて、撮像領域内の照射点における光の屈折角θを算出する。そして、調整情報取得部55は、撮像領域内の照射点の光の屈折角θの情報を調整情報として調整光学系制御部51に出力する。
[0077]
 調整光学系制御部51は、調整情報取得部55によって算出された照射点の光の屈折角θの情報に基づいて、調整光学系20の光学特性を調整するものである。具体的には、調整光学系制御部51には、照射点における屈折角θと、調整光学系20の調整用光学素子21の調整量とを対応付けたルックアップテーブルが予め設定されている。そして、調整光学系制御部51は、入力された照射点の位置の屈折角θの情報に基づいて、上記ルックアップテーブルを参照して調整光学系20の調整用光学素子21の調整量を取得し、その調整量に応じた制御信号を調整光学系駆動部22に出力するものである。なお、調整光学系20の調整用光学素子21の調整量としては、上述したように調整用光学素子21のX方向、Y方向およびZ方向の位置、屈折力並びに光軸方向などがある。
[0078]
 調整光学系制御部51から出力された制御信号は、調整光学系駆動部22に入力され、調整光学系駆動部22は、入力された制御信号に基づいて、調整用光学素子21の屈折力、X方向、Y方向およびZ方向の位置、並びに光軸方向を調整することによって光学特性を調整する。
[0079]
 なお、複数の調整用光学素子21を交換することによってメニスカスに起因する屈折を調整する場合には、調整情報取得部55は、液面形状推定部54によって推定された液面形状に応じた光学特性を有する調整用光学素子21の種類を特定する情報を調整情報として取得する。調整情報取得部55には、液面形状とその液面形状に対応する調整用光学素子21の種類を特定する情報とが対応づけられたテーブルが予め設定されているものとする。
[0080]
 そして、調整情報取得部55において取得された調整用光学素子21の種類を特定する情報は、調整光学系制御部51に出力され、調整光学系制御部51は、入力された情報に基づいて、液面形状に応じた調整用光学素子21に自動的に切り替える。なお、調整用光学素子21の種類を特定する情報を表示装置70に表示させてユーザに報知させることによって、ユーザが手動で調整用光学素子21を交換するようにしてもよい。
[0081]
 結像光学系制御部52は、結像光学系駆動部34を駆動制御することによって対物レンズ31をZ方向に移動させるものである。具体的には、本実施形態の結像光学系制御部52は、上述したように観察対象Sの位相差画像を撮像する場合には、結像光学系駆動部34によって対物レンズ31をZ方向へ移動させることによってオートフォーカス制御するものである。
[0082]
 また、培養容器60内の培養液Cの液面形状の推定を行う場合には、結像光学系駆動部34によって対物レンズ31をZ方向へ移動させることによって、結像光学系30の焦点面と培養容器60との相対的な位置関係を変更するものである。
[0083]
 ここで、培養液Cの液面形状の推定を行う場合における対物レンズ31のZ方向への移動量ΔLについて、図7を参照しながら説明する。移動量ΔLは、培養液Cの液面の最大高さをL max、撮像部40の撮像素子の分解能をΔx minとすると、メニスカスに起因する光路のずれを検出するために必要な対物レンズ31のZ方向への移動量ΔLは、下式によって求めることができる。なお、θ maxは、光路がxだけずれたときの、Lとxがなす角度の許容限界であり、調整用光学素子21の性能によって決まるものである。
x=L max×tanθ max
ΔL=L max×(Δx min/x)=Δx min/tanθ max
 ステージ制御部53は、ステージ駆動部62を駆動制御することによってステージ61をX方向、Y方向およびZ方向に移動させるものである。ステージ制御部53は、上述したようにステージ61をX方向およびY方向に移動させることによって、1つのウェル内を位相差計測用照明光で走査し、1つのウェル内で分割された複数の撮像領域毎の位相差画像を撮像するものである。
[0084]
 また、顕微鏡制御装置50には、入力装置80と表示装置70とが接続されている。入力装置80は、キーボードやマウスなどの入力デバイスを備えたものであり、ユーザによる設定入力を受け付けるものである。特に、本実施形態における入力装置80は、上述したように培養容器60の大きさまたは種類の情報の設定入力を受け付けるものである。
[0085]
 表示装置70は、液晶ディスプレイなどの表示デバイスから構成されるものであり、撮像部40において撮像された位相差画像などを表示するものである。なお、表示装置70をタッチパネルで構成し、その画面を押圧することにより設定入力可能とすることによって、表示装置70が入力装置を兼ねてもよい。
[0086]
 次に、本実施形態の顕微鏡システムの作用について、図8に示すフローチャートを参照しながら説明する。
[0087]
 まず、観察対象Sおよび培養液Cが収容された培養容器60がステージ61上に設置される。そして、ステージ61が、ステージ駆動部62によって、ウェル内の複数の撮像領域のうちの最初の撮像領域(たとえば図9に示す撮像領域R)に位相差計測用照明光が照射される位置まで移動し、位相差計測用照明光がその撮像領域に照射される(S10)。位相差計測用照明光の照射によって最初の撮像領域の位相差画像が撮像部40によって撮像される。そして、その位相差画像が結像光学系制御部52に入力され、結像光学系制御部52は、入力された位相差画像のコントラストが最大となるようにオートフォーカス制御を行う(S12)。
[0088]
 次に、オートフォーカス制御が行われた後、ステージ61が、撮像領域内の9個の液面計測用照明光の照射点のうちの最初の照射点(たとえば図9に示す照射点P1)に液面計測用照明光が照射される位置まで移動し、液面計測用照明光としてレーザ光が培養液Cの液面に対して照射される(S14)。そして、培養液Cおよび結像光学系30を透過した透過光が撮像部40によって検出され、その検出信号に基づいて、透過光の像の結像位置の情報が取得される(S16)。
[0089]
 次に、結像光学系駆動部34により対物レンズ31がZ方向に移動することによって、結像光学系30の焦点面と培養容器60との相対的な位置関係が変更され(S18)、再び液面計測用照明光としてレーザ光が培養液Cの液面に対して照射される(S20)。そして、培養液Cおよび結像光学系30を透過した透過光が撮像部40によって再び検出され、その検出信号に基づいて、透過光の像の結像位置の情報が取得される(S22)。
[0090]
 そして、焦点面の位置を変更する前の透過光の結像位置の情報と、焦点面の位置を変更した後の透過光の結像位置の情報とが液面形状推定部54によって取得され、結像位置のずれ量が算出され、そのずれ量に基づいて、上述した演算により培養液Cの水位の情報Lが算出される。
[0091]
 次いで、S14~S22までの処理が、残りの8個(図9に示す照射点P2~P9)の照射点についても同様に行われ、各照射点について、透過光の結像位置のずれ量が算出され、そのずれ量に基づいて、培養液Cの水位の情報Lが算出される。そして、液面形状推定部54は、上述したようにして取得された各照射点に対応する培養液Cの水位の情報Lに基づいて、最初の撮像領域内の培養液Cの液面形状を推定する(S24)。
[0092]
 液面形状の推定結果は調整情報取得部55に出力され、調整情報取得部55は、推定された液面形状に基づいて、調整光学系20の光学特性を調整するための調整情報を取得する(S26)。そして、調整情報取得部55によって取得された調整情報は調整光学系制御部51に出力され、調整光学系制御部51は、入力された調整情報に基づいて、調整光学系20の光学特性を調整する(S28)。
[0093]
 そして、上記のようにして調整光学系20の光学特性が調整されて、これにより培養液Cの液面に形成されたメニスカスによる屈折の影響が取り除かれた後、再び最初の撮像領域に位相差計測用照明光が照射される(S30)。そして、位相差計測用照明光の照射によって最初の撮像領域の最終的な位相差画像が撮像部40によって撮像される(S32)。
[0094]
 そして、その位相差画像が、顕微鏡制御装置50におけるメモリなどからなる記憶部(図示省略)に記憶される。
[0095]
 次いで、ステージ駆動部62によりステージ61がX方向およびY方向に移動することによって撮像領域が移動し、各撮像領域について、上記と同様にして、オートフォーカス制御、液面形状の推定、調整光学系20の調整および位相差画像の撮像が行われ、各撮像領域の位相差画像が、顕微鏡制御装置50における記憶部に順次記憶される。
[0096]
 そして、顕微鏡制御装置50において各撮像領域の位相差画像が合成されることによって、1つのセル全体の合成位相差画像が生成され、その合成位相差画像が表示装置70に表示される(S34)。
[0097]
 上記実施形態の顕微鏡システムによれば、培養液Cおよび観察対象Sが収容された培養容器60内の液面に対して液面計測用照明光を照射し、その液面計測用照明光の照射によって培養容器60内の培養液Cを透過した透過光を撮像部40によって検出する。さらに、結像光学系30の焦点面と培養容器60との相対的な位置関係を変更して焦点面の位置毎の透過光の検出信号を取得し、焦点面の位置毎の透過光の検出信号に基づいて、液体の液面形状を推定するようにしたので、培養容器60内に収容された培養液Cの液面に形成されるメニスカスの形状を正確に把握することができる。
[0098]
 そして、その推定した液面形状に基づいて、液面形状に起因する光の屈折を調整する調整光学系20の光学特性を調整するための調整情報を取得し、その調整情報に基づいて、調整光学系20の光学特性が調整された後、培養容器60に対して位相差計測用照明光を照射し、位相差計測用照明光を照射した観察対象を撮像するようにしたので、メニスカスに起因する位相差計測用照明光の屈折の影響を高精度に取り除くことができ、より適切な位相差画像を取得することができる。
[0099]
 なお、上記実施形態の顕微鏡システムにおいては、対物レンズ31をZ方向に移動させることによって、結像光学系30の焦点面と培養容器60との相対的な位置関係を変更するようにしたが、これに限らず、ステージ61をZ方向に移動させることにより培養容器60をZ方向に移動させることによって、結像光学系30の焦点面と培養容器60との相対的な位置関係を変更するようにしてもよい。
[0100]
 また、上記実施形態の顕微鏡システムにおいては、撮像領域内の9個の照射点に液面計測用照明光を照射するようにしたが、照射点の数はこれに限らず、たとえば撮像領域内の少なくとも1つの照射点に液面計測用照明光を照射し、その照射点が含まれる撮像領域の位置情報(本発明における照射点の位置情報に相当する)と、透過光の検出信号と、予め設定された液面の曲面を表す情報とに基づいて、液面形状を推定するようにしてもよい。具体的には、たとえば撮像領域内の重心位置に液面計測用照明光を照射し、上述したように結像光学系30の焦点面の位置を変更して透過光の結像位置のずれ量を取得することによって上記重心位置における水位の情報Lを取得し、その水位の情報Lを予め設定された液面の曲面の頂点に設定することによって、液面全体の形状を推定するようにしてもよい。予め設定された液面の曲面を表す情報としては、たとえば曲面を表す関数などがある。この液面の曲面を表す情報は、照射点が含まれる撮像領域の位置情報に応じて変更することが望ましい。
[0101]
 また、図10に示すように、撮像領域R内の少なくとも3つの照射点に液面計測用照明光を照射し、その照射点が含まれる撮像領域の位置情報と、透過光の検出信号とに基づいて、液面形状を推定するようにしてもよい。具体的には、たとえば、図10に示すように、ウェルw(液面)の重心位置から外周に向けて伸びる直線上の撮像領域内の位置に3つの照射点を設定し、その3つの照射点に対して液面計測用照明光を照射する。なお、このとき3つの照射点の間隔を等間隔にすることによって液面形状の推定の精度を上げることができる。
[0102]
 そして、各照射点について、上述したように結像光学系30の焦点面の位置を変更して透過光の結像位置のずれ量を取得することによって各照射点における水位の情報Lを取得する。液面上に形成されるメニスカスの曲面はウェルwの中心gに対して点対称な形状であるので、3つの照射点に対応する水位の情報Lを結んで得られた曲線を回転させることによって撮像領域内Rの液面の形状を推定することができる。なお、上記曲線の求め方については、照射点が含まれる撮像領域の位置情報に応じて変更することが望ましい。
[0103]
 また、液面の曲面を表す関数などの情報が予め設定されている場合には、その関数に3つの照射点に対応する水位の情報Lをフィッティングして液面の形状を推定するようにしてもよい。この場合、照射点が含まれる撮像領域の位置情報は必ずしも必要ない。
[0104]
 また、図11に示すように、1つのウェルw内において撮像領域Rを外周から中心に向けて渦巻き状に変更しながら各撮像領域の位相差画像を撮像する場合には、ウェルw(液面)の重心位置からの距離が異なる各周上についてそれぞれ1つの撮像領域について1回のみ液面形状の推定を行うようにしてもよい。
[0105]
 また、上記実施形態の顕微鏡システムにおいては、9個の照射点に対して、それぞれ異なるタイミングで液面計測用照明光を照射するようにしたが、9個の照射点に対して同時に液面計測用照明光を照射するようにしてもよい。この場合、各照射点について、結像光学系30の焦点面の位置の変更前後での透過光の結像位置の対応付けを容易にするため、照射点毎にそれぞれ異なる形状パターンを有する液面計測用照明光を照射するようにしてもよい。そして、各照射点について、同じ形状パターンを有する透過光の像同士を対応付けることによって、透過光の結像位置のずれ量を取得するようにしてもよい。
[0106]
 また、各照射点について、結像光学系30の焦点面の位置の変更前後の透過光の結像位置の対応付けを容易にするため、照射点毎にそれぞれ異なる色(波長)を有する液面計測用照明光を照射するようにしてもよい。そして、各照射点について、同じ色の透過光の像同士を対応付けることによって、透過光の結像位置のずれ量を取得するようにしてもよい。なお、この場合、撮像部40の撮像素子としては、カラーフィルタを有する撮像素子が用いられる。
[0107]
 また、上記実施形態の顕微鏡システムを用いて、経時的に複数枚の位相差画像の撮像を行ういわゆるタイムラプス撮影を行う場合には、時間の経過とともに培養液Cの量や粘度などが変化してメニスカスの形状が変化することが考えられる。したがって、位相差画像の撮像を行う度に上述した液面形状の推定を行い、その推定結果に基づいて調整光学系20の光学特性を調整することが望ましい。そして、このように経時的に複数回の液面形状の推定を行う場合には、過去の液面形状の推定結果を用いることによって、今回の液面形状を推定する際に設定する液面計測用照明光の照射点の数を減らすようにしてもよい。
[0108]
 具体的には、液面形状推定部54に過去の液面形状の推定結果を記憶しておき、今回、過去に液面形状の推定を行った際に設定した照射点の数よりも少ない数の照射点を設定する。そして、その照射点に液面計測用照明光を照射することによって、各照射点について液面の水位の情報Lを取得し、過去に推定した液面形状を今回取得した水位の情報Lにフィッティングすることによって今回の液面形状の推定結果を取得するようにしてもよい。
[0109]
 また、上記実施形態の顕微鏡システムにおいては、液面計測用照明光としてスポット光であるレーザ光を照射するようにしたが、これに限らず、予め設定されたパターンを有するパターン光を液面計測用照明光として照射するようにしてもよい。
[0110]
 具体的には、図12に示すような、格子状のパターンを有する液面計測用照明光を照射するようにしてもよい。この場合、格子の交点を上述した照射点とし、結像光学系30の焦点面の位置の変更前後における交点の結像位置のずれ量を取得し、そのずれ量に基づいて、交点の位置に対応する液面上の位置の水位の情報Lを取得するようにすればよい。
[0111]
 なお、図12に示すような格子状のパターンを有する液面計測用照明光を照射する場合、結像光学系30の焦点面の位置の変更前後での交点の結像位置の対応付けを容易にするため、格子状のパターン光の交点の位置に、それぞれ異なる形状の像を形成するマークのパターンを形成するようにしてもよい。マークのパターンとしては、たとえば星形状や円形状のパターンなどがある。または、格子状のパターン光の交点の位置の色(波長)を異なるものとしてもよい。
[0112]
 また、パターンを有する液面計測用照明光としては、格子状のパターンに限らず、図13に示すような同心円のパターンを有する液面計測用照明光を照射するようにしてもよい。この場合、同心円とX方向およびY方向に延びる直線との交点を上述した照射点とし、結像光学系30の焦点面の位置の変更前後における上記交点の結像位置のずれ量を取得し、そのずれ量に基づいて、上記交点の位置に対応する液面上の位置の水位の情報Lを取得するようにすればよい。
[0113]
 なお、同心円のパターンを有する液面計測用照明光を照射する場合にも、結像光学系30の焦点面の位置の変更前後での交点の結像位置の対応付けを容易にするため、同心円のパターン光の上記交点の位置に、それぞれ異なる形状の像を形成するマークのパターンを形成するようにしてもよい。または、同心円のパターン光の上記交点の位置の色(波長)を異なるものとしてもよい。
[0114]
 また、上記実施形態の顕微鏡システムにおいては、撮像領域毎にそれぞれ液面形状の推定を行うようにしたが、これに限らず、たとえば、図14に示すように、1つのウェルw内に少なくとも9個の液面計測用照明光の照射点を均一に設定し、その透過光の検出信号に基づいて、各照射点の位置における水位の情報Lを取得し、その水位の情報からウェルw全体の液面形状の推定を行うようにしてもよい。
[0115]
 また、図15に示すように、ウェルwの重心位置から外周に向けて伸びる直線上の位置に等間隔で3つの照射点を設定し、その透過光の検出信号に基づいて、各照射点の位置における水位の情報Lを取得し、その各照射点に対応する水位の情報Lを結んで得られた曲線を360度回転させることによってウェルw全体の液面形状の推定を行うようにしてもよい。
[0116]
 なお、上述したようにウェルw全体の液面形状の推定を行う場合も、ウェルw内の撮像領域毎に屈折角θを求め、その屈折角θに基づいて調整光学系20の光学特性を調整するようにすればよい。
[0117]
 また、上記実施形態の顕微鏡システムにおいては、液面上に形成されたメニスカスに起因する位相差計測用照明光の屈折の影響を取り除くために調整用光学素子21を設けるようにしたが、必ずしもこのような調整用光学素子21を設けなくてもよい。たとえば、調整情報に基づいて、スリット板12をX方向およびY方向に移動させたり、位相板32をX方向およびY方向に移動させたりして、メニスカスに起因する位相差計測用照明光の屈折の影響を取り除くようにしてもよい。すなわち、本発明における調整光学系として、スリット板12や位相板32を用いるようにしてもよい。
[0118]
 また、上記実施形態の顕微鏡システムにおいては、調整用光学素子21をコンデンサレンズ13と培養容器60との間に設けるようにしたが、調整用光学素子21の位置はこの位置に限らず、たとえば白色光源11とスリット板12との間、位相板32とコンデンサレンズ13との間、および培養容器60と対物レンズ31との間などその他の位置に設けるようにしてもよい。

符号の説明

[0119]
10  位相差計測用照明光照射部
11  白色光源
12  スリット板
12a スリット
12b 遮光板
13  コンデンサレンズ
15  液面計測用照明光照射部
16  レーザ光源
17  ダイクロイックミラー
20  調整光学系
21  調整用光学素子
22  調整光学系駆動部
30  結像光学系
31  対物レンズ
32  位相板
32a 位相リング
32b 透明板
33  結像レンズ
34  結像光学系駆動部
40  撮像部
50  顕微鏡制御装置
51  調整光学系制御部
52  結像光学系制御部
53  ステージ制御部
54  液面形状推定部
55  調整情報取得部
60  培養容器
61  ステージ
62  ステージ駆動部
70  表示装置
80  入力装置

請求の範囲

[請求項1]
 液体および観察対象が収容された容器に対して位相差計測のための位相差計測用照明光を照射する位相差計測用照明光照射部と、
 前記位相差計測用照明光を照射した前記観察対象を撮像する撮像部と、
 前記容器内の液体の液面形状を計測するための液面計測用照明光を前記液体の液面に対して照射する液面計測用照明光照射部と、
 前記液面計測用照明光の照射によって前記容器内の液体の液面を透過した透過光を検出する透過光検出部と、
 前記透過光を前記透過光検出部の検出面に集光する結像光学系の焦点面と前記容器との相対的な位置関係を変更する焦点面変更部と、
 前記焦点面と前記容器との相対的な位置毎の前記透過光の検出信号に基づいて、前記液体の液面形状を推定する液面形状推定部と、
 光学特性が調整可能であり、前記容器内の液体の液面形状に起因する前記位相差計測用照明光の屈折を前記光学特性に応じて調整する調整光学系と、
 前記液面形状推定部によって推定された液面形状に基づいて、前記調整光学系の光学特性を調整するための調整情報を取得する調整情報取得部と、
 を備えたことを特徴とする位相差顕微鏡。
[請求項2]
 前記調整情報取得部によって取得された調整情報に基づいて、前記調整光学系の光学特性を調整する調整光学系制御部をさらに備えた請求項1記載の位相差顕微鏡。
[請求項3]
 前記焦点面変更部が、前記結像光学系に含まれる光学素子を光軸方向に移動させることによって、前記焦点面と前記容器との相対的な位置関係を変更する請求項1または2記載の位相差顕微鏡。
[請求項4]
 前記焦点面変更部が、前記容器を前記結像光学系の光軸方向に移動させることによって、前記焦点面と前記容器との相対的な位置関係を変更する請求項1または2記載の位相差顕微鏡。
[請求項5]
 前記焦点面変更部が、前記結像光学系に設けられた焦点距離の異なる複数の光学素子の交換によって、前記焦点面と前記容器との相対的な位置関係を変更する請求項1または2記載の位相差顕微鏡。
[請求項6]
 前記液面形状推定部が、前記液体の液面上の前記液面計測用照明光の照射位置の情報および予め設定された前記液面の曲面を表す情報と、前記液体の液面上の少なくとも1点に対して前記液面計測用照明光を照射した場合の前記透過光の検出信号とに基づいて、前記液面形状を推定する請求項1から5いずれか1項記載の位相差顕微鏡。
[請求項7]
 前記液面形状推定部が、前記液体の液面上の前記液面計測用照明光の照射位置の情報および予め設定された前記液面の曲面を表す情報のうちのいずれか一方の情報と、前記液体の液面上の少なくとも3点に対して前記液面計測用照明光を照射した場合の前記透過光の検出信号とに基づいて、前記液面形状を推定する請求項1から5いずれか1項記載の位相差顕微鏡。
[請求項8]
 前記液面形状推定部が、前記液体の液面上の少なくとも9点に対して前記液面計測用照明光を照射した場合の前記透過光の検出信号に基づいて、前記液面形状を推定する請求項1から5いずれか1項記載の位相差顕微鏡。
[請求項9]
 前記液面形状推定部が、前記液体の液面の重心位置からの距離が異なる各周上についてそれぞれ1回のみ前記液面形状の推定を行う請求項1から8いずれか1項記載の位相差顕微鏡。
[請求項10]
 前記液面計測用照明光照射部が、前記液体の液面上の複数の点に前記液面計測用照明光を照射する場合、前記点毎に異なる形状パターンを有する前記液面計測用照明光を照射する請求項1から9いずれか1項記載の位相差顕微鏡。
[請求項11]
 前記液面計測用照明光照射部が、前記液体の液面上の複数の点に前記液面計測用照明光を照射する場合、前記点毎に異なるタイミングで前記液面計測用照明光を照射する請求項1から9いずれか1項記載の位相差顕微鏡。
[請求項12]
 前記液面計測用照明光照射部が、前記液体の液面上の複数の点に前記液面計測用照明光を照射する場合、前記点毎に異なる波長を有する前記液面計測用照明光を照射する請求項1から9いずれか1項記載の位相差顕微鏡。
[請求項13]
 前記液面形状推定部が、前記液面計測用照明光が照射された前記液面上の点の液面形状の推定結果を用いて補間することによって、前記液面計測用照明光が照射されていない前記液面上の点の液面形状の推定を行う請求項1から12いずれか1項記載の位相差顕微鏡。
[請求項14]
 前記液面形状推定部が、前記液面形状の推定結果を記憶し、
 前記液面形状推定部によって前記推定結果が記憶された後の時点で、再び前記液面の液面形状の推定を行う場合には、
 前記液面計測用照明光照射部が、前記推定結果が記憶される前の時点で前記液面形状の推定を行った場合よりも前記液面計測用照明光の前記液面上の照射点の数を減らし、
 前記液面形状推定部が、前記減らされた照射点の前記透過光の検出信号に基づく液面形状の推定結果と前記記憶した液面形状の推定結果とに基づいて、前記後の時点での液面形状の推定を行う請求項1から13いずれか1項記載の位相差顕微鏡。
[請求項15]
 前記液面計測用照明光照射部が、予め設定されたパターンを有するパターン光を前記液面計測用照明光として照射する請求項1から5いずれか1項記載の位相差顕微鏡。
[請求項16]
 前記パターン光が、格子状のパターンを有する請求項15記載の位相差顕微鏡。
[請求項17]
 前記パターン光が、同心円のパターンを有する請求項15記載の位相差顕微鏡。
[請求項18]
 前記パターン光によって形成される像上の予め設定された複数の位置にそれぞれ異なる形状の像が形成される請求項15から17いずれか1項記載の位相差顕微鏡。
[請求項19]
 前記パターン光によって形成される像上の予め設定された複数の位置にそれぞれ異なる色の像が形成される請求項15から17いずれか1項記載の位相差顕微鏡。
[請求項20]
 前記調整情報取得部が、前記推定された液面形状に基づいて、前記液体の液面形状に起因する前記位相差計測用照明光の光路ずれを算出し、該算出した光路ずれに基づいて、前記調整光学系の調整情報を取得する請求項1から19いずれか1項記載の位相差顕微鏡。
[請求項21]
 前記液面形状推定部が、前記液面の曲面情報および位置情報を算出することによって、前記液面形状を推定する請求項1から20いずれか1項記載の位相差顕微鏡。
[請求項22]
 液体および観察対象が収容された容器内の前記液体の液面に対して、前記容器内の液体の液面形状を計測するための液面計測用照明光を照射し、
 前記液面計測用照明光の照射によって前記容器内の液体の液面を透過した透過光を透過光検出部によって検出し、
 前記透過光を前記透過光検出部の検出面に集光する結像光学系の焦点面と前記容器との相対的な位置関係を変更して、該焦点面と該容器との相対的な位置毎の前記透過光の検出信号を取得し、
 前記焦点面と前記容器との相対的な位置毎の前記透過光の検出信号に基づいて、前記液体の液面形状を推定し、
 該推定した液面形状に基づいて、該液面形状に起因する光の屈折を調整する調整光学系の光学特性を調整するための調整情報を取得し、
 該調整情報に基づいて、前記調整光学系の光学特性を調整し、
 前記調整光学系の光学特性を調整した後、前記容器に対して位相差計測のための位相差計測用照明光を照射し、
 前記位相差計測用照明光を照射した前記観察対象を撮像することを特徴とする撮像方法。

図面

[ 図 1]

[ 図 2]

[ 図 3]

[ 図 4]

[ 図 5]

[ 図 6]

[ 図 7]

[ 図 8]

[ 図 9]

[ 図 10]

[ 図 11]

[ 図 12]

[ 図 13]

[ 図 14]

[ 図 15]