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1. (WO2015129686) 標的DNAに変異が導入された植物細胞、及びその製造方法
Document

明 細 書

発明の名称 標的DNAに変異が導入された植物細胞、及びその製造方法

技術分野

0001  

背景技術

0002   0003   0004   0005   0006   0007  

先行技術文献

非特許文献

0008  

発明の概要

発明が解決しようとする課題

0009  

課題を解決するための手段

0010   0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019  

発明の効果

0020  

図面の簡単な説明

0021  

発明を実施するための形態

0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061   0062   0063   0064   0065   0066   0067   0068   0069   0070   0071   0072   0073   0074   0075  

実施例

0076   0077   0078   0079   0080   0081   0082   0083   0084   0085   0086   0087   0088   0089   0090   0091   0092   0093   0094   0095   0096   0097   0098   0099   0100   0101   0102   0103   0104   0105   0106   0107   0108   0109   0110   0111   0112   0113   0114   0115   0116   0117   0118   0119  

産業上の利用可能性

0120   0121   0122   0123  

請求の範囲

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  

図面

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14  

明 細 書

発明の名称 : 標的DNAに変異が導入された植物細胞、及びその製造方法

技術分野

[0001]
 本発明は、標的DNAに変異が導入された植物細胞、該植物細胞を含む植物体、並びに該植物体の子孫、クローン及び繁殖材料に関する。また、本発明は、前記植物細胞の製造方法、その製造方法に用いるためのDNA構築物、並びにそのDNA構築物を含むキットに関する。

背景技術

[0002]
 ジーンターゲッティング(GT)は、DNAの塩基配列の相同性を利用した組換えによりゲノム上の標的DNAを任意に改変する技術であり、植物の分野においても、基礎研究と育種素材の開発とにおいて非常に有望な技術である。
[0003]
 しかしながら、高等植物における相同組換えの頻度は低く、GTを介して標的DNAを改変すべく、標的DNAに相同な配列上に任意の変異を持つベクター(GTベクター)を細胞外から導入した際には、その殆どはゲノム中にランダムに挿入されてしまう。そこで、GTに成功した細胞を効率よく選抜するためにポジティブ・ネガティブ選抜法が開発されている。この方法は、GTベクターがゲノムにランダムに組み込まれた細胞をネガティブ選抜マーカー遺伝子の発現で排除し、GTによって標的DNAに変異が導入された細胞をポジティブ選抜マーカー遺伝子の発現によって単離する選抜法である(非特許文献1)。
[0004]
 しかしながら、この方法を用いた場合、ポジティブ選抜マーカー遺伝子の発現カセットが標的DNAに残ってしまうため、標的DNAに必要な変異のみを導入したい場合はこのカセットを除去する必要がある。この点に関し、これまでに、部位特異的組換え酵素を用いてGT後にポジティブ選抜マーカー遺伝子を除去する系が報告されている。しかしながら、この系を用いるとマーカー除去後に部位特異的組換え酵素の認識配列が残ってしまう。短い塩基配列の挿入も周辺の遺伝子の発現に影響を及ぼすことも報告されているため、自然突然変異と同等な変異の導入系を構築するに際し、GT後に足跡が残らないマーカー除去を行える技術の開発が待ち望まれていた。
[0005]
 マーカー遺伝子を除去する技術に関し、本発明者らは以下の知見を明らかにしている。すなわち先ず、マーカー遺伝子と、その両端に配置したヌクレアーゼI-SceIの認識部位とが挿入されているレポーター遺伝子を有するT-DNAを、植物細胞に導入する。そして、レポーター遺伝子がゲノムDNAにランダムに挿入された植物細胞においてI-SceIを発現させることにより、レポーター遺伝子からマーカー遺伝子を除去できることを示している。この手法において、前述の部位特異的組換え酵素を利用した場合と同様に、単に2カ所のI-SceI認識部位を利用して選抜マーカー遺伝子を切り出しただけでは切断末端の再結合が生じ、I-SceI認識部位がゲノムDNA内に残ってしまう。そのため、本発明者らは、さらに前記T-DNAにおいて、該認識部位の外側600bpの配列を一致(重複)させる工夫を行った。これにより、マーカー遺伝子の切り出し後に、切断末端の当該重複DNA配列間にて相同組換えが生じ、I-SceI認識部位も除去することができた(非特許文献2)。
[0006]
 しかしながら、非特許文献2に記載の方法においては、I-SceIを発現させる前に前記重複DNA配列間にて相同組換えが生じてしまい、かなりのマーカー遺伝子がゲノムDNAから除去されてしまうため、マーカー遺伝子の発現を指標として、レポーター遺伝子がゲノムDNAにランダムに挿入された植物細胞を選択することが困難であるという問題があった。
[0007]
 したがって、このような重複DNA配列間の相同組換えによるマーカー遺伝子除去技術を、GTに応用するためには、標的DNAに変異が導入された細胞をマーカー遺伝子の発現を指標として安定的に選択するためのさらなる技術の開発が必要であった。

先行技術文献

非特許文献

[0008]
非特許文献1 : Terada R.ら、Plant Biotechnol.、2010年、27巻、29~37ページ
非特許文献2 : Yong-Ik Kwonら、Plant Cell Physiol.、2012年、53巻、12号、2142~2152ページ

発明の概要

発明が解決しようとする課題

[0009]
 本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、相同組換えにより植物細胞のゲノム上の標的DNAに変異を導入する方法において、該変異が導入された植物細胞の選択を、マーカー遺伝子の発現を指標として安定的に行うことを可能とし、さらに選択された細胞において、マーカー遺伝子等の不要な配列を除去し、標的DNAに必要な変異のみを導入することを可能とすることを目的とする。

課題を解決するための手段

[0010]
 本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、植物細胞において、マーカー遺伝子等の不要な配列を残すことなく、必要な変異のみを標的DNAに導入することを可能とするため、図1に示す系を構想した。
[0011]
 すなわち先ず、図1の第1工程に示すように、標的DNAと相同な第1のDNA及び第2のDNAと、マーカー遺伝子とを含むDNA構築物を、植物細胞に導入することによって、相同組換えを生じさせる。
[0012]
 なお、このDNA構築物においては、
(a)前記マーカー遺伝子の5’側に第1のヌクレアーゼ認識部位を介して第1の相同DNAが付加されており、
(b)前記マーカー遺伝子の3’側に第2のヌクレアーゼ認識部位を介して第2の相同DNAが付加されており、
(c)第1の相同DNAの3’末端領域と第2の相同DNAの5’末端領域とが相同な30~500ヌクレオチドからなるDNA配列(短鎖重複DNA配列)であり、
(d)第1の相同DNA及び第2の相同DNAの少なくとも1のDNAにおいて、前記短鎖重複DNA配列以外の領域に所望の変異が導入されている。
[0013]
 そのため、植物細胞のゲノムDNA上の標的DNAと、第1及び第2の相同DNAとの相同組換えが生じることにより、第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位に挟まれた前記マーカー遺伝子と前記変異とが当該標的DNAに導入されることになる。
[0014]
 そして、前記マーカー遺伝子の発現を指標としたスクリーニングを行うことにより、前記変異等が標的DNAに導入された植物細胞を選抜する。
[0015]
 さらに、図1の第2工程に示すように、このようにして選抜された細胞に、第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識するヌクレアーゼを発現させ、該ヌクレアーゼにより第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位を切断し、前記マーカー遺伝子を前記標的DNAから除去する。さらに切断された第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位に隣接する前記短鎖重複DNA配列間で相同組換えが生じ、これらヌクレアーゼ認識部位も除去する。
[0016]
 したがって、この構想によれば、標的DNAに所望の変異のみを有する変異植物体を作製することが可能となる。
[0017]
 そこで、図1に示す系を実際に構築し、その有効性を検証した。その結果、植物細胞において、相同組換えによりゲノムDNA内に挿入されたマーカー遺伝子をヌクレアーゼにより除去することができ、さらにヌクレアーゼ認識部位に隣接する30ヌクレオチドの配列を一致(重複)させることにより、該認識部位も痕跡残すことなく除去できることが初めて明らかになった。しかも、前記短鎖重複DNA配列の長さを30ヌクレオチドに抑えることにより、非特許文献2において示されていたような、ヌクレアーゼを発現させる前に、短鎖重複DNA配列間における相同組換えは生じにくく、変異等が導入された植物細胞の選択を、マーカー遺伝子の発現を指標として安定的に行うことができた。
[0018]
 なお、図13に示す系を用い、短鎖重複DNA配列のヌクレオチド数と、ヌクレアーゼ非発現下における該短鎖重複DNA配列間の相同組換えの頻度との関連を評価した結果、短鎖重複DNA配列の長さを1000ヌクレオチドとした際には、ヌクレアーゼを発現させる前であっても解析に用いた細胞塊(カルス)の約30パーセントにおいて相同組換えが生じた細胞が存在した。一方、前記短鎖重複DNA配列の長さを30ヌクレオチドとした際には、ヌクレアーゼ非発現下における相同組換えの発生は完全に抑えられていた。
[0019]
 したがって、本発明は、標的DNAのみならず、該DNA以外の領域においても、マーカー遺伝子等の不要な配列を残すことなく、必要な変異のみが標的DNAに導入された植物細胞の製造方法、該方法により製造された植物細胞、並びに該製造方法に用いるためのキット等に関し、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
(1) 下記工程(i)~(iii)を含む、標的DNAに変異が導入された植物細胞の製造方法
 (i)標的DNAと相同な第1のDNA及び第2のDNAと、マーカー遺伝子とを含むDNA構築物であって、下記(a)~(d)の特徴を有するDNA構築物を、植物細胞に導入する工程、
(a)前記マーカー遺伝子の5’側に第1のヌクレアーゼ認識部位を介して第1の相同DNAが付加されており、
(b)前記マーカー遺伝子の3’側に第2のヌクレアーゼ認識部位を介して第2の相同DNAが付加されており、
(c)第1の相同DNAの3’末端領域と第2の相同DNAの5’末端領域とが相同な30~500ヌクレオチドからなるDNA配列(短鎖重複DNA配列)であり、
(d)第1の相同DNA及び第2の相同DNAの少なくとも1のDNAにおいて、前記短鎖重複DNA配列以外の領域に所望の変異が導入されている
 (ii)第1及び第2の相同DNAと前記標的DNAとの相同組換えにより、第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位に挟まれた前記マーカー遺伝子と前記変異とが当該標的DNAに導入されている植物細胞を、前記マーカー遺伝子の発現を指標として選択する工程、
 (iii)工程(ii)にて選択された細胞に、第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識するヌクレアーゼを発現させ、前記マーカー遺伝子、並びに第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位を当該標的DNAから除去する工程。
(2) 前記ヌクレアーゼはI-SceIである、(1)に記載の方法。
(3) (1)又は(2)に記載の方法により製造された、標的DNAに変異が導入された植物細胞。
(4) 標的DNAと相同な第1のDNA及び第2のDNAと、マーカー遺伝子とを含むDNA構築物であって、下記(a)~(d)の特徴を有するDNA構築物が導入されることにより、第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位に挟まれた前記マーカー遺伝子と下記変異とが、第1及び第2の相同DNAとの相同組換えによって標的DNAに導入された植物細胞
(a)前記マーカー遺伝子の5’側に第1のヌクレアーゼ認識部位を介して第1の相同DNAが付加されており、
(b)前記マーカー遺伝子の3’側に第2のヌクレアーゼ認識部位を介して第2の相同DNAが付加されており、
(c)第1の相同DNAの3’末端領域と第2の相同DNAの5’末端領域とが相同な30~500ヌクレオチドからなるDNA配列(短鎖重複DNA配列)であり、
(d)第1の相同DNA及び第2の相同DNAの少なくとも1のDNAにおいて、前記短鎖重複DNA配列以外の領域に所望の変異が導入されている。
(5) 前記ヌクレアーゼはI-SceIである、(4)に記載の植物細胞。
(6) (3)~(5)のうちのいずれか一に記載の細胞を含む植物体。
(7) (6)に記載の植物体の子孫又はクローンである植物体。
(8) (6)又は(7)に記載の植物体の繁殖材料。
(9) 標的DNAと相同な第1のDNA及び第2のDNAと、マーカー遺伝子とを含むDNA構築物であって、下記(a)~(d)の特徴を有するDNA構築物
(a)前記マーカー遺伝子の5’側に第1のヌクレアーゼ認識部位を介して第1の相同DNAが付加されており、
(b)前記マーカー遺伝子の3’側に第2のヌクレアーゼ認識部位を介して第2の相同DNAが付加されており、
(c)第1の相同DNAの3’末端領域と第2の相同DNAの5’末端領域とが、相同な30~500ヌクレオチドからなるDNA配列(短鎖重複DNA配列)であり、
(d)第1の相同DNA及び第2の相同DNAの少なくとも1のDNAにおいて、前記短鎖重複DNA配列以外の領域に所望の変異が導入されている。
(10) (1)又は(2)に記載の方法に用いるための、下記(a)及び(b)を含むキット
(a)(9)に記載のDNA構築物
(b)第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識するヌクレアーゼを、植物細胞内に発現させるためのDNA構築物。

発明の効果

[0020]
 本発明によれば、相同組換えにより植物細胞のゲノム上の標的DNAに変異を導入する方法において、該変異が導入された植物細胞の選択を、マーカー遺伝子の発現を指標として安定的に行うことを可能となる。さらに、選択された細胞において、マーカー遺伝子等の不要な配列を除去し、標的DNAに必要な変異のみを導入することも可能となる。

図面の簡単な説明

[0021]
[図1] 本発明の、標的DNAに変異が導入された植物細胞の製造方法を示す概略図である。図中、GTベクター上の「Posi」と記載された矢印は、マーカー遺伝子(ポジティブ選抜マーカー遺伝子)を示し、GTベクター上の対になっており、「Nega」と付されている矢印はネガティブ選抜マーカー遺伝子を示す。星印は、標的DNAに導入される所望の変異部位を示す。ヌクレアーゼと付された矢印は、該ヌクレアーゼをコードするDNAを示し、「認識部位」は、該ヌクレアーゼが特異的に認識し切断する部位を示す。また、Posiと記載された矢印に認識部位を介して付加されている白抜きの四角は、短鎖重複DNA配列を示す。さらに、ヌクレアーゼと付された矢印の両側と、GTベクター上の対になっている矢印の両側とに付されている黒い棒は、GTベクター及びヌクレアーゼをコードするDNAを植物細胞にアグロバクテリウムを介して導入する際に利用される、右側境界配列(RB)及び左側境界配列(LB)を示す。なお、図中の表記については、図2、3、5及び9においても同様である。
[図2] 本発明の植物細胞の製造方法において、標的DNAをイネPDS遺伝子座とし、ヌクレアーゼをI-SceIとした際の態様を示す概要図である。すなわち、ポジティブ選抜マーカー遺伝子の5’側に第1のヌクレアーゼ認識部位(I-SceIフォワード、18ヌクレオチド)を介して、PDS遺伝子の7311~7340位のヌクレオチドからなる領域に相同な、短鎖重複DNA配列(PDS 7311-7340、30ヌクレオチド)が付加されており、該マーカー遺伝子の3’側に第2のヌクレアーゼ認識部位(I-SceIリバース、18ヌクレオチド)を介して、PDS遺伝子の7311~7340位のヌクレオチドからなる領域に相同な、短鎖重複DNA配列(PDS 7311-7340、30ヌクレオチド)が付加されており、また第1のヌクレアーゼ認識部位と第2のヌクレアーゼ認識部位とは逆向きに配置されていることを示す概略図である。図中、矢頭は、I-SceIの切断部位を示し、その具体的な切断様式を図中の下部に示す。
[図3] 本発明の植物細胞の製造方法の工程(ii)において選択された植物細胞(GT候補カルス)を対象とし、標的DNA(PDS遺伝子座)にマーカー遺伝子が挿入されているかどうかを調べるために行われた、PCR分析の概略図である。
[図4] 図3に示すPCR分析の結果を示す、ゲル電気泳動の写真である。
[図5] 本発明の植物細胞の製造方法の工程(ii)において選択され、図3に示すPCRによりマーカー遺伝子の挿入が確認された植物細胞(GT候補カルス)を対象とし、該挿入が相同組換えによるものなのか、ランダム挿入によるものなのかを調べるために行われた、サザンブロット分析の概略図である。
[図6] 図5に示すサザンブロット分析の結果を示す、メンブレンの写真である。なお、図中、WT(野生型イネ)以外はGT候補カルスの分析結果を示す。また、このサザンブロット分析において、相同組換えが生じた場合には9985bpのバンドのみが検出される。9985bp以外のバンドは、ネガティブ選抜マーカー遺伝子が削れたGTベクターのランダムな挿入であると考えられる。
[図7] I-SceIを植物細胞においてβ-エストラジオールに応じて誘導的に発現させるために、該細胞内に導入されたI-SceI発現コンストラクト(#1045)の構成を示す、概略図である。
[図8] #1045の作製工程を示す概略図である。
[図9] 相同組換えにより標的DNAにおけるマーカー遺伝子の挿入が確認された植物細胞(GTカルス)においてI-SceIを発現させることにより、ポジティブ選抜マーカーが除去されかどうかを調べるために行われた、サザンブロット分析の概略図である。
[図10] 図9に示すサザンブロット分析の結果を示す、メンブレンの写真である。図中、「WT」は野生型イネについての分析結果を示し、「R304S-4」、「R304S-11」及び「R304S-14」は、#1045により形質転換する前のGTカルスについて分析した結果を示す。その他は、#1045による形質転換体をβ-エストラジオール処理して得られた再分化個体について分析した結果を示す。また、アステリスクのついた個体はマーカー遺伝子が除去されていた個体であり、無印の個体はマーカー遺伝子が残存していた個体である。なお、図中の表記は図12においても同様である。
[図11] GTカルスにおいてI-SceIを発現させることにより、マーカー遺伝子が除去されかどうかを調べるために行われた、#1045を対象とするプローブを用いたサザンブロット分析の概略図である。
[図12] 図11に示すサザンブロット分析の結果を示す、メンブレンの写真である。なお、図中、同一のバンドパターンを示す再分化植物体は同一細胞由来と考えられる。
[図13] 短鎖重複DNA配列のヌクレオチド数と、ヌクレアーゼ非発現下における該短鎖重複DNA配列間の相同組換えの頻度との関連を評価するためのレポーター系を示す概略図である。
[図14] 図13に示すレポーター系を用いて得られた解析結果を示すグラフである。図中、横軸は、図13に示すレポーター系における短鎖重複DNA配列のヌクレオチド数を示し、縦軸は、図13に示すレポーター系を導入したカルスにおいて、該レポーターの発現が検出されたカルスの割合を示す。

発明を実施するための形態

[0022]
 本発明の植物細胞の製造方法は、下記工程(i)~(iii)を含む、標的DNAに変異が導入された植物細胞の製造方法である
 (i)標的DNAと相同な第1のDNA及び第2のDNAと、マーカー遺伝子とを含むDNA構築物であって、下記(a)~(d)の特徴を有するDNA構築物を、植物細胞に導入する工程、
(a)前記マーカー遺伝子の5’側に第1のヌクレアーゼ認識部位を介して第1の相同DNAが付加されており、
(b)前記マーカー遺伝子の3’側に第2のヌクレアーゼ認識部位を介して第2の相同DNAが付加されており、
(c)第1の相同DNAの3’末端領域と第2の相同DNAの5’末端領域とが相同な30~500ヌクレオチドからなるDNA配列(短鎖重複DNA配列)であり、
(d)第1の相同DNA及び第2の相同DNAの少なくとも1のDNAにおいて、前記短鎖重複DNA配列以外の領域に所望の変異が導入されている
 (ii)第1及び第2の相同DNAと前記標的DNAとの相同組換えにより、第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位に挟まれた前記マーカー遺伝子と前記変異とが当該標的DNAに導入されている植物細胞を、前記マーカー遺伝子の発現を指標として選択する工程、
 (iii)工程(ii)にて選択された細胞に、第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識するヌクレアーゼを発現させ、前記マーカー遺伝子、並びに第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位を当該標的DNAから除去する工程。
[0023]
 かかる方法によれば、後述の実施例において示す通り、植物細胞のゲノムDNA上の標的DNA及び前記DNA構築物との間で相同組換えが生じることにより、第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位に挟まれたマーカー遺伝子と所望の変異とが当該標的DNAに導入されることになる。そして、該マーカー遺伝子の発現を指標としたスクリーニングを行うことにより、前記変異等が標的DNAに導入された植物細胞を選抜することができ、さらに、第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識するヌクレアーゼを発現させることにより、該ヌクレアーゼにより第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位が切断され、前記マーカー遺伝子を前記標的DNAから除去することが可能となる。次いで、切断された第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位に隣接する前記短鎖重複DNA配列間で相同組換えが生じ、これらヌクレアーゼ認識部位も除去することができる。したがって、本発明によれば、相同組換えにより植物細胞のゲノム上の標的DNAに変異を導入する方法において、該変異が導入された植物細胞の選択を、マーカー遺伝子の発現を指標として安定的に行うことを可能となる。さらに、選択された細胞において、マーカー遺伝子等の不要な配列を除去し、標的DNAに必要な変異のみを導入することも可能となる(図1参照)。
[0024]
 本発明の製造方法の工程(i)において、標的DNAに変異を導入するために植物細胞に導入される「DNA構築物」は、標的DNAと相同な第1のDNA及び第2のDNAと、マーカー遺伝子とを含むDNA構築物であって、前記(a)~(d)の特徴を有するDNA構築物である。
[0025]
 本発明において「標的DNA」とは、変異導入の対象となるゲノム上のDNAを意味する。標的DNAは、植物細胞のゲノムDNAから任意に選択することができ、またタンパク質をコードするDNAであってもよく、機能性RNA等のノンコーディングRNAをコードするDNAであってもよい。さらに、標的DNAには、タンパク質やノンコーディングRNAをコードしていない領域(UTR等)のみならず、タンパク質をコードする転写産物やノンコーディングRNAの発現を調節する領域も含まれる。また、標的DNAは、通常内因性のものであるが、植物細胞のゲノムDNAに外来的に挿入されているDNAであってもよい。
[0026]
 標的DNAに導入される「変異」としては、特に制限はなく、ナンセンス変異、フレームシフト変異、挿入変異又はスプライス部位変異等のヌル変異であってもよく、サイレント変異であってもよい。また、標的DNAにおける変異としては、例えば、該DNAにおける、1又は複数のヌクレオチドの欠失、置換、付加及び/又は挿入が挙げられる。さらに、標的DNAにおける変異の個数としても、特に制限はなく、1個でもよく、また複数個でもよい。
[0027]
 「標的DNAと相同なDNA」とは、前述のゲノム上の標的DNAと相同性を有するDNAを意味し、本発明のDNA構築物においては、後述のマーカー遺伝子の5’側に後述の第1のヌクレアーゼ認識部位を介して付加されている第1の相同DNAと、後述のマーカー遺伝子の3’側に後述の第2のヌクレアーゼ認識部位を介して付加されている第2の相同DNAとがある。
[0028]
 第1の相同DNA及び第2の相同DNAのヌクレオチド数としては、該相同DNAと標的DNAとの間で相同組換えが生じ得る数であればよく、各々通常、500~7000ヌクレオチド(好ましくは1000~5000ヌクレオチド、より好ましくは2000~4000ヌクレオチド、さらに好ましくは約3000ヌクレオチド(例えば、2500~3000))である。
[0029]
 また、本発明において、第1の相同DNAの3’末端領域と第2の相同DNAの5’末端領域とは、相同な30~500ヌクレオチドからなるDNA配列(本発明においては「短鎖重複DNA配列」とも称する)である必要があり、好ましくは、相同な30~300ヌクレオチドからなるDNA配列であり、より好ましくは、相同な30~100ヌクレオチドからなるDNA配列である。前記短鎖重複DNA配列のヌクレオチド数が前記下限未満では、第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識するヌクレアーゼにより当該ヌクレアーゼ認識部位が切断された後に、短鎖重複DNA配列間における相同組換えが生じにくく、第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位が標的DNA内に残存し易い傾向にある。他方、前記上限を超えると、第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識するヌクレアーゼにより当該ヌクレアーゼ認識部位が切断される前に、短鎖重複DNA配列間で相同組換えが生じてしまい、当該ヌクレアーゼ認識部位及びこれら認識部位に挟まれているマーカー遺伝子が標的DNAから除去され易くなる。そのため、工程(ii)において、マーカー遺伝子の発現を指標として、所望の変異等が標的DNAに導入されている植物細胞を選択しにくい傾向にある。
[0030]
 また、第1の相同DNA及び第2の相同DNAの少なくとも1のDNAにおいて、前記変異は、前記短鎖重複DNA配列以外の領域に導入されている必要がある。標的DNAに導入された前記変異を、短鎖重複DNA配列間の相同組換えにより除去されることなく、標的DNAに残すためである。
[0031]
 第1の相同DNA及び第2の相同DNAと後述のマーカー遺伝子との間に付加される、第1及び第2のヌクレオチド認識配列は、後述のヌクレアーゼにより特異的に認識されて切断される配列であればよい。また、第1及び第2のヌクレオチド認識配列は同一のヌクレアーゼに特異的に認識される配列であってもよく、異なるヌクレアーゼに各々特異的に認識される配列であってもよいが、後述の工程(ii)において発現させるヌクレアーゼを1種類とすることにより、形質転換等の作業の手間を抑えるという観点から、同一のヌクレアーゼに特異的に認識される配列であることが好ましい。さらに、第1及び第2のヌクレオチド認識配列が同一のヌクレアーゼに特異的に認識される配列であり、該配列が非対称配列である場合には、第1のそれの向きは第2のそれと逆向きになっていることが好ましい。第1のヌクレオチド認識配列と第2のそれとが同じ向きとなっている場合には、ヌクレアーゼによって切断された際に、該切断によって生じた末端配列どうしの再結合が生じ易くなり、短鎖重複DNA配列間における相同組換えが生じにくくなるからである。
[0032]
 第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位を介して挟まれている「マーカー遺伝子」は、その発現が標的DNAが導入された少数の形質転換細胞を大多数の非形質転換細胞の中から効率良く選択するための指標となるものであればよく、例えば、導入された細胞の増殖に必須なタンパク質又は該増殖を促進するタンパク質をコードする遺伝子(いわゆる、薬剤耐性遺伝子等のポジティブ選抜マーカー遺伝子)、ルシフェラーゼ遺伝子、GFP遺伝子、CFP遺伝子、YFP遺伝子、DsRed遺伝子等のレポーター遺伝子が挙げられるが、マーカー遺伝子の発現を検出するために煩雑な操作(例えば、FACSによるスクリーニング)を必要としないという観点から、薬剤耐性遺伝子が好ましい。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、ネオマイシン(G418等)耐性遺伝子(NPTII遺伝子)、ハイグロマイシン耐性遺伝子(ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、hpt)、カナマイシン耐性遺伝子、ALS(AHAS)遺伝子やPPO遺伝子等の除草剤耐性遺伝子が挙げられる。
[0033]
 また、本発明のDNA構築物においては、前記マーカー遺伝子に、導入された植物細胞において該遺伝子がコードするタンパク質を発現させるための制御領域が作動可能に連結されている。
[0034]
 該タンパク質を恒常的に発現させる場合には、制御領域として、例えば、カリフラワーモザイクウィルス(CaMV)35Sプロモーター、G10-90プロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、トウモロコシ由来のポリユビキチン1プロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、イネ由来の伸長因子1αプロモーター等のプロモーターと、該プロモーター等により誘導された遺伝子の転写を終結するためのターミネーター配列(エンドウマメ由来のルビスコE9遺伝子ターミネーター(Tpea rbs E9)、エンドウマメ由来のルビスコ3A遺伝子ターミネーター(Tpea 3A)、イネ由来の熱ショックタンパク質17.3ターミネーター、イネ由来の熱ショックタンパク質16.9aターミネーター、イネ由来のアクチンターミネーター、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素(OCS)遺伝子のターミネーター、CaMV 35Sターミネーター等)が挙げられる。さらに、遺伝子の発現効率を高めるために、CaMV 35Sエンハンサー、転写エンハンサーE12、オメガ配列等のエンハンサー等のエンハンサーも、前記制御領域には含まれていてもよい。
[0035]
 また、タンパク質を誘導的に発現させる場合には、例えば、イネキチナーゼ遺伝子のプロモーター、タバコのPRタンパク質遺伝子のプロモーター、イネlip19遺伝子のプロモーター、イネhsp80遺伝子及びhsp72遺伝子のプロモーター、シロイヌナズナのrab16遺伝子プロモーター、パセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター、トウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター、エストラジオール(β-エストラジオール)、テトラサイクリン、デキサメタゾン等の薬剤に応答して発現を誘導するプロモーター等の、刺激に応答して発現を誘導するプロモーターが好適に用いられる。
[0036]
 また、前記マーカー遺伝子の他、本発明のDNA構築物においては、第1及び第2のヌクレオチド認識配列の間に配置されている限り、他のDNAが挿入されていてもよい。かかる他のDNAとしては特に制限はないが、例えば、前記マーカー遺伝子等が挿入された標的DNAがコードするタンパク質等を不活性化するという観点から、ターミネーターが挙げられる。また、前記DNA構築物を導入した後に、標的DNAからマーカー遺伝子等を除去させるためにヌクレアーゼを発現させるためのDNA構築物を再度導入する工程を省略できるという観点から、当該ヌクレアーゼを誘導的に発現させることが可能なDNA構築物(発現カセット)が挙げられる。
[0037]
 本発明の「DNA構築物」において、第1の相同DNAの5’末端及び第2の相同DNAの3’末端に、導入された細胞の増殖を阻害するタンパク質又は該増殖を抑制するタンパク質をコードする遺伝子(いわゆる、ネガティブ選抜マーカー遺伝子)が付加されていてもよい(図1の「GTベクター」参照)。
[0038]
 「ネガティブ選抜マーカー遺伝子」としては、例えば、ジフテリアトキシンαサブユニット(DT-A)遺伝子、codA遺伝子、エクソトキシンA遺伝子、リシントキシンA遺伝子、シトクロムP-450遺伝子、RNase T1遺伝子、バルナーゼ遺伝子が挙げられるが、これらの中では、イネカルス等に関して、ネガティブ選抜効率と、細胞間移行能がないために周囲の細胞に悪影響を及ぼさないという観点から、DT-A遺伝子が好ましい。また、ネガティブ選抜マーカー遺伝子には、前述のマーカー遺伝子同様、本発明のDNA構築物においては、導入された植物細胞において該遺伝子がコードするタンパク質を発現させるための制御領域が作動可能に連結されている。
[0039]
 そして、このようなネガティブ選抜マーカー遺伝子を含むDNA構築物を植物細胞に導入した際に、DNA構築物の一部(標的DNAと相同なDNA)が相同組換えにより標的DNAに組み込まれれば、ネガティブ選抜マーカー遺伝子は該相同DNAの外側にあるため、該細胞のゲノムDNAに挿入されることはない。そのため、植物細胞は該遺伝子の影響を受けることなく増殖することができる。一方、DNA構築物が植物細胞のゲノムDNAにランダムに挿入された際には、ネガティブ選抜マーカー遺伝子も挿入されうるため、ランダム挿入が生じた植物細胞の増殖は抑制又は阻害されうる。したがって、ネガティブ選抜マーカー遺伝子を含むDNA構築物を植物細胞に導入することにより、ランダム挿入は生じず、相同組換えにより、標的DNAに変異が導入された植物細胞を効率よく選択することができる。
[0040]
 以上、本発明の「DNA構築物」について説明したが、本発明の製造方法の工程(i)において、かかるDNA構築物を植物細胞に導入する方法としては特に制限はなく、アグロバクテリウムを介する方法、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法(エレクトロポーレーション)、パーティクルガン法等、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。
[0041]
 次に、本発明の製造方法の工程(ii)においては、第1及び第2の相同DNAと前記標的DNAとの相同組換えにより、第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位に挟まれた前記マーカー遺伝子と前記変異とが当該標的DNAに導入されている植物細胞を、前記マーカー遺伝子の発現を指標として選択する。
[0042]
 かかる「選択」は、当業者であれば用いるマーカー遺伝子の種類に合わせて適宜公知の手法により選択して行うことができる。例えば、薬剤耐性遺伝子を用いた場合には、工程(i)において本発明のDNA構築物を導入した植物細胞を、対応する薬剤存在下にて培養することにより、標的DNAに変異等が導入された植物細胞を選択することができる。GFP遺伝子等のレポーター遺伝子を用いた場合には、工程(i)において本発明のDNA構築物を導入した植物細胞をFACS等にかけることにより、標的DNAに変異等が導入された植物細胞を選択することができる。
[0043]
 また、該工程においては、前記マーカー遺伝子の発現を指標として選択する他、前記変異及び前記マーカー遺伝子等が相同組換えによって標的DNAに導入されたことを、PCR法、シークエンシング法、サザンブロット法、CAPS(切断増幅多型配列)法等により確認してもよい。
[0044]
 次に、工程(ii)にて選択された細胞に、第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識するヌクレアーゼを発現させ、前記マーカー遺伝子、並びに第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位を当該標的DNAから除去する。
[0045]
 本発明における「ヌクレアーゼ」は、特定の配列を認識し、該配列内部を切断できる酵素であればよく、例えば、I-SceI、I-CreI等のホーミングエンドヌクレアーゼ、ZFN(ジンクフィンガーヌクレアーゼ)、TALEN、CRISPR/Cas9等の人工ヌクレアーゼが挙げられるが、切断活性が高く、またイネ等のゲノムDNAにおいて認識配列が存在せず、標的DNA以外の領域に変異を導入しにくいという観点から、I-SceIが好ましい。
[0046]
 なお、I-CreI等のホーミングエンドヌクレアーゼについては、Belfort M.ら、Nucleic Acids Res、1997年、25巻、17号、3379~3388ページの記載を参照して、特にI-SceIについては、Puchta H.ら、Nucleic Acids Res.、1993年、21巻、22号、5034~5040ページ、Salomon&Puchta、EMBO J.、1998年、17巻、20号、6086~6095ページ等の記載も参照して、ZFNについては、特許第4350907号公報、特許第4555292号公報等の記載を参照して、TALENについては、特表2012-514976号公報、特表2013-513389号公報等の記載を参照して、CRISPR/Cas9については、Jinekら、Sciene、2012年、337巻、816~821ページ、Maliら、Sciene、2013年、339巻、823~826ページ等の記載を参照して、当業者であれば適宜これらのヌクレアーゼをコードするDNAを調製することができる。さらに、これら文献の記載に基づき、前記第1及び第2のヌクレアーゼ認識配列も調製することもできる。
[0047]
 また、本発明において「ヌクレアーゼ」には、機能性タンパク質が付加していてもよい。機能性タンパク質は、ヌクレアーゼのN末側、C末側のどちらか一方若しくは両側に、直接的に又は間接的に付加させることができる。機能性タンパク質としては特に制限はなく、ヌクレアーゼに付与したい機能に応じて適宜選択される。例えば、該ヌクレアーゼの検出等をし易くするという観点から、緑色蛍光タンパク質(GFP)、ルシフェラーゼタンパク質、FLAG-タグタンパク質(登録商標、Sigma-Aldrich社)、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)タンパク質が挙げられる。また、ヌクレアーゼを安定的に核内において機能させるという観点から、核内移行シグナルが付加されていてもよい。
[0048]
 また、工程(iii)における、ヌクレアーゼの発現は、刺激に応じて誘導される発現であってもよく、恒常的な発現であってもよいが、刺激に応じて誘導される発現の方が好ましい。本発明のDNA構築物を導入する植物細胞として、事前に調製して樹立した、刺激に応じて誘導的にヌクレアーゼを発現できる植物細胞を用いれば、その後の形質転換にかかる手間を省き、時間も短縮することができるからである。さらに、かかる手間及び時間を抑えることにより、カルスを経ることに伴う自然変異の生じ易さや、培養期間の長さに伴う再分化効率の低下等も抑えることができることから、ヌクレアーゼの発現は、刺激に応じて誘導される方が好ましい。
[0049]
 また、工程(iii)において、ヌクレアーゼを誘導的に発現させる方法としては、例えば、該ヌクレアーゼをコードする遺伝子を含み、該遺伝子を誘導的に発現させるための制御領域を備えたDNA構築物を、導入した植物細胞を発現誘導の条件である刺激の存在下培養する方法が挙げられる。
[0050]
 ヌクレアーゼを誘導的に発現させるための当該DNA構築物を、植物細胞に導入する時期としては、工程(i)において、標的DNAと相同なDNAを含む前述のDNA構築物の導入と同時であってもよく、それよりも前であってもよい。さらには、工程(ii)において、前記マーカー遺伝子の発現を指標とする選択の前であってもよく、その選択の後であってもよいが、前述の観点から、工程(i)の前に導入し、刺激に応じて誘導的にヌクレアーゼを発現できる植物細胞として樹立しておくことが好ましい。
[0051]
 また、ヌクレアーゼを「誘導的に発現させるための制御領域」としては、上述の「本発明のDNA構築物」の説明の際に列挙した「誘導的に発現させる場合の制御領域」を用いることができるが、薬剤処理の有無により発現の有無を厳密に制御できる観点から、β-エストラジオールに応答して発現を誘導するプロモーターが好ましい。
[0052]
 かかるプロモーターとしては、後述の実施例において示すような、大腸菌のSOSレギュロン(regulon)のリプレッサーであるLexAの部分配列、HSV(単純ヘルペスウイルス)由来のVP16の転写活性ドメイン及びエストロゲン受容体の制御領域(ER)が融合した合成転写活性化因子XVEと、β-エストラジオールとが結合することによって活性化されるLexA応答配列を備えたプロモーター(例えば、PLex-46)が挙げられる(図7参照)。
[0053]
 一方、ヌクレアーゼを恒常的に発現させる方法としては、特に制限はないが、例えば、該ヌクレアーゼをコードする遺伝子を含み、該遺伝子を恒常的に発現させるための制御領域を備えたDNA構築物を、工程(ii)にて選択された細胞に導入する方法が挙げられる。さらに、導入された該DNA構築物は、恒常かつ安定的にヌクレアーゼを発現させるという観点から、植物細胞のゲノムDNAに挿入されていることが好ましい。
[0054]
 ヌクレアーゼを「恒常的に発現させるための制御領域」としては、上述の「本発明のDNA構築物」の説明の際に列挙した「恒常的に発現させる場合の制御領域」を用いることができる。
[0055]
 さらに、ヌクレアーゼを恒常的又は誘導的に発現させるためのDNA構築物には、該DNA構築物が導入された植物細胞を効率よく選択できるという観点から、前述のレポーター遺伝子、薬剤耐性遺伝子が含まれていてもよい。
[0056]
 また、ヌクレアーゼを恒常的に発現させるためのDNA構築物を植物細胞に導入する方法としては特に制限はなく、アグロバクテリウムを介する方法、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法、パーティクルガン法等、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。
[0057]
 そして、このようにして、工程(ii)にて選択された細胞に、前述のヌクレアーゼを発現させることにより、該ヌクレアーゼにより第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位が切断され、前記マーカー遺伝子を前記標的DNAから除去することが可能となる。さらに切断された第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位に隣接する前記短鎖重複DNA配列間で相同組換えが生じ、これらヌクレアーゼ認識部位も除去することができ、ひいては、相同組換えにより植物細胞のゲノム上の標的DNAに変異を導入する方法において、該変異が導入された植物細胞の選択を、マーカー遺伝子の発現を指標として安定的に行うことを可能となる。さらに、選択された細胞において、マーカー遺伝子等の不要な配列を除去し、標的DNAに必要な変異のみを導入することも可能となる(図1参照)。
[0058]
 また、本発明の製造方法においては、前記短鎖重複DNA配列間における相同組換え効率を向上させるという観点から、RecQl4及び/又はExo1を前記ヌクレアーゼと共に発現させてもよい。RecQl4及びExo1については非特許文献2の記載を参照のこと。
[0059]
 <植物細胞>
 前述の通り、本発明の製造方法によれば、標的DNAに所望の変異のみが導入されている植物細胞を得ることができる。したがって、本発明は、前記製造方法により製造された、標的DNAに変異が導入された植物細胞を提供するものである。
[0060]
 また、後述の実施例において示す通り、相同組換えにより第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位に挟まれた前記マーカー遺伝子と所望の変異とが標的DNA内に挿入された植物細胞は、本発明において初めて作製されたものであり、前述の通り、標的DNAに所望の変異のみが導入された植物細胞を作製する上で有用である。
[0061]
 したがって、本発明は、標的DNAと相同な第1のDNA及び第2のDNAと、マーカー遺伝子とを含むDNA構築物であって、上記(a)~(d)の特徴を有するDNA構築物が導入されることにより、第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位に挟まれた前記マーカー遺伝子と下記変異とが、第1及び第2の相同DNAとの相同組換えによって標的DNAに導入された植物細胞をも提供するものである。
[0062]
 本発明において「植物」とは特に制限はなく、例えば、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ等の単子葉植物や、タバコ、ジャガイモ、ナス、ナタネ等の双子葉植物が挙げられる。また、「植物細胞」には、培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。さらに、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス、未熟胚、花粉等が含まれる。
[0063]
 <植物体等>
 本発明の植物細胞は、再生させることにより植物体を得ることができる。特に、本発明の製造方法により製造された植物細胞は、標的DNAに所望の変異のみを有しているため、このような植物細胞から再生させた植物体は、当該変異に伴い、表現型が変化しうる。したがって、本発明の方法を利用すれば、植物の育種を効率的に行うことが可能であり、また標的DNAの機能を効率よく分析することが可能となる。
[0064]
 植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。例えば、アラビドプシスであればAkamaら(Plant Cell Reports 12: 7-11, 1992)に記載の方法が挙げられ、イネであればDatta(In Gene Transfer To Plants(Potrykus I and Spangenberg Eds.)pp66-74,1995)に記載された方法、Tokiら(Plant Physiol.100:1503-1507,1992)に記載された方法、Christouら(Bio/technology,9:957-962,1991)に記載された方法及びHieiら(Plant J.6:271-282,1994)に記載された方法が挙げられ、オオムギであれば、Tingayら(Plant J.11:1369-1376,1997)に記載された方法、Murrayら(Plant Cell Report 22:397-402,2004)に記載された方法、及びTravallaら(Plant Cell Report 23:780-789,2005)に記載された方法が挙げられ、トウモロコシであればShillitoら(Bio/Technology,7:581,1989)に記載された方法やGorden-Kammら(Plant Cell 2:603,1990)に記載された方法が挙げられ、トマトであればMatsukuraら(J.Exp.Bot.,44:1837-1845,1993)に記載された方法が挙げられ、ダイズであれば、特許公報(米国特許第5,416,011号)に記載された方法が挙げられ、ジャガイモであればVisserら(Theor.Appl.Genet,78:594,1989)に記載された方法が挙げられ、タバコであればNagataとTakebe(Planta,99:12,1971)に記載された方法が挙げられる。ここに挙げた以外の植物についても、例えば、田部井豊編「形質転換プロトコール植物編」((株)化学同人発行)に記載された方法を用いることによって、当業者であれば植物体への再生が可能である。
[0065]
 一旦、このようにして標的DNAに変異が導入された細胞を含む植物体が得られれば、該植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料(例えば、種子、果実、切穂、株、カルス、プロトプラスト等)を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。したがって、本発明には、本発明の植物細胞を含む植物体、該植物体の子孫及びクローン、並びに該植物体、その子孫、及びクローンの繁殖材料が含まれる。
[0066]
 また、本発明の製造方法において製造された植物細胞の標的DNAにおいては、所望の変異のみが導入されているが、通常、該細胞においては外来的に導入されたヌクレアーゼをコードするDNAが残存することとなる。しかしながら、本発明の製造方法において製造された植物細胞を含む植物体と、野生型のそれとを交配させ、戻し交配を行うことにより、ヌクレアーゼをコードするDNAをも除去することができる。
[0067]
 また、本発明は、本発明の植物細胞、植物体、繁殖材料から製造される加工物をも提供する。本発明における加工物としては特に制限はなく、従来より植物から作られている加工物全般のことであり、例えば、植物体からの抽出液、植物体の乾燥粉末、加工食品が挙げられる。より具体的には、イネであれば米飯及び煎餅等、小麦であればパン及び麺類等、トウモロコシであればコーン油、コーンスターチ及びコーンチップス等、ダイズであれば大豆油、豆腐及び納豆等、ジャガイモであればポテトチップス及びデンプン等、トマトであればケッチャップ等、キャノーラであればキャノーラ油等が挙げられる。
[0068]
 <キット等>
 前述の通り、本発明のDNA構築物は、本発明の製造方法において有用であり、その有効性も本発明において初めて示されたものである。したがって、本発明は、標的DNAと相同な第1のDNA及び第2のDNAと、マーカー遺伝子とを含むDNA構築物であって、上記(a)~(d)の特徴を有するDNA構築物をも提供するものである。
[0069]
 また、前述の通り、ヌクレアーゼを植物細胞内で恒常的に発現させるためのDNA構築物も本発明の製造方法において有用である。したがって、本発明は、本発明の製造方法に用いるための、下記(A)及び(B)を含むキットをも提供するものである。
(A)標的DNAと相同な第1のDNA及び第2のDNAと、マーカー遺伝子とを含むDNA構築物であって、上記(a)~(d)の特徴を有するDNA構築物
(B)第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識するヌクレアーゼを植物細胞内に発現させるためのDNA構築物。
[0070]
 これらDNA構築物については各々、上述の本発明の製造方法における工程(i)及び(iii)についての記載の通りであるが、これらの形態は1本鎖DNAであってもよく、2本鎖DNAであってもよい。また、直鎖状DNAであってもよく、環状DNAであってもよく、前述の植物細胞への導入方法に適した形態に調製し得る。
[0071]
 例えば、アグロバクテリウムを介して植物細胞に導入する場合には、前記DNA構築物の形態として、pBI系、pPZP系又はpSMA系のベクター等が挙げられ、また、より好適な形態として、バイナリーベクター系のベクター(pZHG、pKOD4、pBI121、pBI101、pBI101.2、pBI101.3、pBIG2113等)が挙げられる。
[0072]
 また、電気穿孔法等の他の方法により植物細胞に導入する場合には、前記DNA構築物の形態として、例えば、pUC18、pUC19、pUC9等のpUC系ベクターが挙げられる。さらに、CaMV、インゲンマメモザイクウイルス(BGMV)、タバコモザイクウイルス(TMV)等の植物ウイルスベクターの形態も、前記DNA構築物はとり得る。
[0073]
 また、このようなDNA構築物は、後述の実施例において示す通り、PCR法、制限酵素処理、クローニング法等の公知の遺伝子組換え技術を利用して当業者であれば適宜調製することができる、また、市販の自動化DNA配列合成装置等を用いて化学的に合成することもできる。
[0074]
 さらに、(A)に記載のDNA構築物の作製において、当業者であれば部位特異的変異誘発法(例えば、Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA.82,488-492に記載の方法)等により、標的DNAと相同なDNAに、所望の変異を導入することができる。
[0075]
 また、ヌクレアーゼを植物細胞内に高発現させるという観点から、(B)に記載のDNA構築物には、該DNA構築物を導入する植物のコドン使用頻度に最適化したヌクレアーゼをコードするDNAが挿入されていてもよい。
実施例
[0076]
 以下、実施例及び参考例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
[0077]
 本発明者らは、ジーンターゲティング(GT、相同組換えにより植物細胞のゲノム上の標的DNAに変異を導入する方法)において、該変異が導入された植物細胞の選択を、マーカー遺伝子の発現を指標として安定的に行うことを可能とし、その後、選択された細胞において、マーカー遺伝子等の不要な配列を除去し、標的DNAに必要な変異のみを導入することを可能とするため、図1に示す系を構想した。
[0078]
 すなわち先ず、図1の第1工程に示すように、標的DNAと相同な第1のDNA及び第2のDNAと、マーカー遺伝子(ポジティブ選抜マーカー遺伝子)とを含むDNA構築物を、植物細胞に導入することによって、相同組換えを生じさせる。
[0079]
 なお、このDNA構築物においては、
(a)前記マーカー遺伝子の5’側に第1のヌクレアーゼ認識部位を介して第1の相同DNAが付加されており、
(b)前記マーカー遺伝子の3’側に第2のヌクレアーゼ認識部位を介して第2の相同DNAが付加されており、
(c)第1の相同DNAの3’末端領域と第2の相同DNAの5’末端領域とが、相同な30~500ヌクレオチドからなるDNA配列(短鎖重複DNA配列)であり、
(d)第1の相同DNA及び第2の相同DNAの少なくとも1のDNAにおいて、前記短鎖重複DNA配列以外の領域に所望の変異が導入されている。
[0080]
 そのため、植物細胞のゲノムDNA上の標的DNAと、第1及び第2の相同DNAとの相同組換えが生じることにより、第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位に挟まれた前記マーカー遺伝子と前記変異とが当該標的DNAに導入されることになる。
[0081]
 また、この際、前記相同DNAの外側にネガティブ選抜マーカー遺伝子を配することにより、前記DNA構築物が、標的DNA以外の領域にランダムに挿入された細胞は排除されることとなる。
[0082]
 そして、前記マーカー遺伝子の発現を指標としたスクリーニングを行うことにより、前記変異等が標的DNAに導入された植物細胞を選抜する。
[0083]
 さらに、図1の第2工程に示すように、このようにして選抜された細胞に、第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識するヌクレアーゼを発現させ、該ヌクレアーゼにより第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位を切断し、前記マーカー遺伝子を前記標的DNAから除去する。さらに切断された第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位に隣接する前記短鎖重複DNA配列間で相同組換えが生じ、これらヌクレアーゼ認識部位も除去する。
[0084]
 したがって、この構想によれば、標的DNAに所望の変異のみを有する変異植物体を作製することが可能となる。
[0085]
 そこで、以下に示す方法にて、図1に示す系を構築し、その有効性を検証した。なお、本実施例においては、標的DNA及び該DNAに導入する変異として、イネフィトエン不飽和化酵素(Phytoendesaturase(PDS))遺伝子及びR304S変異(CGA->AGT)を選択した。また、ヌクレアーゼとしてI-SceIを選択し、ポジティブ選抜マーカー遺伝子及びネガティブ選抜マーカー遺伝子として、NPTII遺伝子及びDT-A(ジフテリアトキシンαサブユニット)遺伝子を各々選択した。
[0086]
 (実施例1)
 <ジーンターゲッティング(GT)ベクターの構築>
 PDS遺伝子座を標的としたGTベクター(ポジティブ・ネガティブ選抜ベクター)を以下のようにして構築した。
[0087]
 該構築において、先ず、ポジティブ選抜マーカー遺伝子の上流PDSゲノム配列をクローニングした。すなわち、イネ(品種:日本晴)からゲノムDNAを「Endo M.ら、Plant J.、2007年、52巻、157~166ページ」に記載の方法で調製した。当該ゲノムDNAを鋳型に、2回のPCRを行い、PCR産物をpCR-Blunt II-TOPOベクター(lifetechnologies社製)にクローニングした。クイックチェンジII XL 部位特異的突然変異誘発キット(Agilent社製)により、PCR産物中のPacI認識部位をHpaI認識部位に置換した後、AscI認識部位及びPacI認識部位を利用してPCR産物を切り出し、同じくAscI及びPacIにて処理したpE(L1-L4)にクローニングした。PCRに用いたプライマーは以下の通りである。
<1st PCR>
AscPDS 4.7kF  5’-ttctggcgcgccTGCATGAGGAGGCAAACGAGGTCCT-3’(配列番号:1)
I-SceI PDS 7.3kR  5’-ACCCTGTTATCCCTAGCTTAAACCTGTGCAAAAGGATCTGGGCA-3’(配列番号:2)
<2nd PCR >
AscPDS4.7kF  5’-ttctggcgcgccTGCATGAGGAGGCAAACGAGGTCCT-3’(配列番号:3)
Pac I-SceI PDS 7.3kR  5’-GAAGTTAATTAATTACCCTGTTATCCCTAGCTTAAACCT-3’(配列番号:4)。
[0088]
 次に、ポジティブ選抜マーカー遺伝子の下流PDSゲノム配列をクローニングした。すなわち、上述のイネ(品種:日本晴)ゲノムDNAを鋳型に、2回のPCRを行い、PCR産物をpCR-Blunt II-TOPOベクター(Life Technologies社製)にクローニングした。クイックチェンジII XL 部位特異的突然変異誘発キット(Agilent社製)により、PCR産物中にR304S変異(CGA->AGT)を導入した後、AscI認識部位及びPacI認識部位を利用してPCR産物を切り出し、同じくAscI及びPacIにて処理したpE(L3-L2)にクローニングした。PCRに用いたプライマーは以下の通りである。
<1st PCR>
I-SceI PDS 7.3kF  5’-ACCCTGTTATCCCTATGCCCAGATCCTTTTGCACAGGTTTAAGCT-3’(配列番号:5)
Pac PDS 10kR  5’-ATTGTTAATTAAagtgagtgcaaagggagaTAAGGTCTCT-3’(配列番号:6)
<2nd PCR>
Asc I-SceI PDS 7.3kF  5’-AATTGGCGCGCCATTACCCTGTTATCCCTATGCCCAGATCCT-3’(配列番号:7)
Pac PDS 10kR  5’-ATTGTTAATTAAagtgagtgcaaagggagaTAAGGTCTCT-3’(配列番号:6)。
[0089]
 そして、LRクロナーゼIIプラス(登録商標、Life Technologies社製)を用いて、pKDO4、pE(L1-L4)PDS5’、pE(R4-R3)TacP35SnptIIThsp17.3、pE(L3-L2)PDS3’を連結することにより、GTベクターを構築した。
[0090]
 このようにして構築したGTベクターにおいて、ポジティブ選抜マーカー遺伝子(NPTII遺伝子)の両端にはI-SceIの認識配列18bpが存在する。そのため、図1に示す通り、該GTベクターを用いた形質転換により、該遺伝子がPDS遺伝子座(標的DNA)に導入されている植物細胞において、I-SceIを発現させた場合には、I-SceI配列が切断され、ポジティブ選抜マーカー遺伝子が該標的DNAから除去されることとなる。しかし、単に2カ所のI-SceI認識部位を利用してポジティブ選抜マーカー遺伝子を切り出しただけでは切断末端の再結合が生じ、I-SceI認識部位が残ってしまう。そこで、図2に示す通り、I-SceI認識部位に隣接する領域において、イネゲノム配列を30bp重複させておき、マーカー遺伝子除去後に切断末端の短鎖重複DNA配列(PDS 7311-7340)間で相同組換えを生じさせることで、一切痕跡を残さずにポジティブ選抜マーカーを除去できる仕掛けが、GTベクターには施してある。さらに、当該GTベクターにおいて、図2に示す通り、ポジティブ選抜マーカー遺伝子の5’末端側に隣接して配置するI-SceI認識部位と、3’末端側に隣接して配置するI-SceI認識部位とは逆向きにしてある。これらI-SceI認識部位が同じ向きとなっている場合には、I-SceIによって切断された際に、該切断によって生じた末端配列どうしの再結合が生じ易くなり、前述の短鎖重複DNA配列間における相同組換えが生じにくくなるからである。
[0091]
 なお、図2に記載の、短鎖重複DNA配列「PDS 7311-7340」、並びにI-SceI認識部位「I-SceIフォワード」及び「I-SceIリバース」の配列を、各々配列番号:8~10に示す。
[0092]
 (実施例2)
 次に、前記GTベクターを用い、以下に示す方法にて、標的DNAに所望の変異のみを有する植物体の作製を試みた。
[0093]
 すなわち先ず、前記GTベクターをエレクトロポレーション法によりアグロバクテリウムEHA105株に導入した。そして、イネへの形質転換を、「Toki S.、Plant Mol. Biol. Rep.、1997年、15巻、16~21ページ」及び「Toki S.ら、Plant J.、2006年、47巻、969~976ページ」に記載された方法(アグロバクテリウム法)により行った。より具体的には、イネ種子(品種:日本晴)を滅菌し、カルス化培地に置床した後、3週間培養し、生じたカルスに前述のGTベクターを有するアグロバクテリウムを感染させた。イネカルスとアグロバクテリウムとの共存培養を行った後、アグロバクテリウムを除菌した。次いで、イネカルスを選抜培地(G418 35mg/L入N6D固形培地)に置床し、GT候補カルス(G418耐性カルス)の選抜を行った。得られた結果を後述の表1に示す。
[0094]
 なお、この選抜培地での培養において、GTベクターが形質転換されていない細胞はG418感受性を示し、増殖しない。GTベクターが形質転換されたが、イネゲノム中にランダムに挿入された細胞はネガティブ選抜マーカーであるジフテリアトキシンαサブユニット(DT-A)により増殖することができない。したがって、選抜培地上ではGTに成功したカルスが増殖することとなる。
[0095]
 次に、G418を含む培地上で増殖してきたカルスからゲノムDNAを調製し、これらカルスにおいて標的DNA(PDS遺伝子座)にポジティブ選抜マーカー遺伝子が挿入されているか、PCRによる確認を行った。GTに成功するとPDSの第6イントロン内にポジティブ選抜マーカー遺伝子が挿入される。そこで、ポジティブ選抜マーカー遺伝子上に位置するフォワードプライマー(Thsp17.3F)とGTベクター上には含まれないPDS下流遺伝子の下流に位置するリバースプライマー(PDS-10.15kR)とを用いたPCRを行った。また、ポジティブ選抜マーカー遺伝子上に位置するリバースプライマー(TactP35S554R)とGTベクター上には含まれないPDS上流に位置するフォワードプライマー(PDS-4.2kR)とを用いたPCRを行った(図3参照)。得られた結果を後述の表1に示す。また、結果のいくつかの例を図4に示す。なお、これらのプライマーの組み合わせでは、ランダムに挿入されたGTベクターは増幅されず、GTにより内在PDS遺伝子座にポジティブ選抜マーカー遺伝子が挿入された場合のみPCR産物が増幅されることとなる。また、使用したプライマーの配列は以下の通りである。
Thsp17.3F  5’-ACATACCCATCCAACAATGTTCAATCCCTT-3’(配列番号:11)
PDS-10.15kR  5’-TGGATTTGTAGAGTTAGAAATACCTGACTT-3’(配列番号:12)
PDS-4.2kF  5’-TGATGGACTGATTGGCTGATGGTGGT-3’(配列番号:13)
TactP35S 554R  5’-CTGACGATGAGAATATATCTGATGCTGTGA-3’(配列番号:14)。
[0096]
 さらに、サザンブロット法により、GTを確認した(図5参照)。すなわち、前述のPCRによって同定したGT細胞からゲノムDNAを抽出し、該DNAをSacIにて処理し、ポジティブ選抜マーカー遺伝子であるNPTII遺伝子上に位置するプローブを用いた検出を行った。得られた結果を表1及び図6に示す。なお、サザンブロットは「Endo M.ら、Plant J.、2007年、52巻、157~166ページ」に記載の方法にて行った。また、検出に用いたプローブ(DIGプローブ)作製に用いたプライマー及びそれらの配列は以下の通りである。
nptII+23Fw  5’-TTGAACAAGATGGATTGCAC-3’(配列番号:15)
nptII+527Rv  5’-GGCATCGCCATGTGTCACGA-3’(配列番号:16)。
[0097]
[表1]


[0098]
 表1に示す通り、上述の形質転換実験を2回行い、計1440個のカルスをGTベクターの形質転換に用い、55個のG418耐性カルスを得た。そして、これら55個のG418耐性カルスからDNAを調製し、前述のPDS遺伝子座においてGTが生じた場合のみ増幅するPCRを行った結果、11カルスにおいて増幅が見られた。
[0099]
 さらに、この11カルスについて、サザンブロット解析によるGTの確認を行い、ポジティブ選抜マーカー遺伝子上に位置するプローブにより検出を行った結果、表1及び図6に示す通り、8カルス(GTカルス)において、GTが生じた際に出現する約10kbのバンドが検出された。したがって、GT効率は、供試カルスに対して0.6%(8/1440)、ポジティブ・ネガティブ選抜で得られたカルスに対しては14.5%(8/55)であった。
[0100]
 次に、標的DNAにおけるGTが確認された前述のカルスにおいて、I-SceIを発現させ、該標的DNAからポジティブ選抜マーカー遺伝子を除去した。
[0101]
 該除去に際して先ず、I-SceIをカルス内にて刺激(β-エストラジオール)に応じて誘導的に発現させるために、I-SceI発現コンストラクト(#1045、図7参照)を図8に示す工程にて作製した。すなわち、pER8(Zuo J.ら、Plant J.、2000年、24巻、265~273ページ 参照)のマルチクローニングサイト(MCS)中のGFPをコードするDNAをI-SceIをコードするDNAに置換することにより、β-エストラジオール依存的にI-SceIを発現させるためのベクター(#1045)を構築すべく、先ずpER8中のPLex-46とTpea3Aとの間を、pUC19AM(pUC19のMCSの両端にAscI認識部位及びPacI認識部位を付加したベクター)中のSphI認識部位及びKpnI認識部位間に置換したベクター(#1041)を作製した。次に、PLex-46とTpea3Aとの間にある、XhoI認識部位及びSpeI認識部位にNLS-FLAG-I-SceIをクローニングし、#1042を作製した。また、バイナリーベクターであるpZH2B(Kuroda M.ら、Biosci Biotechnol Biochem、2010年、74巻、11号、2348~2351ページ 参照)のSalI認識部位及びKpnI認識部位に、pER8中のPG10-90とTpea rbs E9との間をクローニングし、#106を作製した。そして、#106のAscI認識部位とSalI認識部位との間に、#1042のAscI認識部位とのMluI認識部位との間をクローニングし、#1045を作製した。なお、使用したI-SceI遺伝子(Puchta H.ら、Nucleic Acids Res.、1993年、21巻、22号、5034~5040ページ 参照)は、Puchtaらから分譲を受けた遺伝子である。
[0102]
 次に、GT当代のカルスにおいてポジティブ選抜マーカー遺伝子を除去するため、前述の通りGTが確認された8個のGTカルスに対して、#1045を有するアグロバクテリウムを感染させ、その後、ハイグロマイシンを含むN6D固形培地上で2週間培養し、#1045形質転換細胞の選抜を行った。なお、形質転換は、前述のGTベクターを用いた形質転換同様に行った。
[0103]
 次に、#1045を形質転換したGTカルスを、β-エストラジオール5uMを含むN6D固形培地に移植し、I-SceIの発現誘導を行った。当該培地上でカルスを2週間培養し、増殖及びI-SceIの発現誘導を行った後、β-エストラジオールを含まない再分化培地に移植し、カルスから植物体の再生を行い、95個体の再分化個体を得た。
[0104]
 次に、得られた再分化個体において、I-SceIを発現させたことにより、標的DNAからポジティブ選抜マーカー遺伝子が除去されたかどうかを分析するため、これら再分化個体から抽出したゲノムDNAを鋳型として、以下のプライマーを用いて、ポジティブ選抜マーカー遺伝子を含む断片を増幅するPCRを行った。
PDS-6.2kF  5’-AGGTAGAAATGCCATGCGGGAAGT-3’(配列番号:17)
PDS-8.33kR  5’-TCCGACTTGGAACCAAATAATTCA-3’(配列番号:18)。
[0105]
 なお、このPCRにおいて、ポジティブ選抜マーカー遺伝子が残っているPDS遺伝子座では約6kbのPCR産物が生じ、野生型PDS遺伝子座及び、GT後にポジティブ選抜マーカー遺伝子が除去されたPDS遺伝子座では約2kbのPCR産物が生じることとなる。
[0106]
 さらに、前記PCRにてポジティブ選抜マーカー遺伝子が除去されたと考えられたカルスについて、前記PCR産物をダイレクトシークエンスにより、それらの配列を同定した。なお、PCR産物をダイレクトシークエンスした場合、相同組換えによって痕跡無くマーカー遺伝子が除去されている個体では、点変異(R304S変異(CGA->AGT))が導入された箇所のみダブルピークとなる。短鎖重複DNA配列が重複して残存している場合や、塩基の挿入、欠失があった場合には、野生型遺伝子座由来のPCR産物と混在するため、波形が二重になる。そのため、波形が二重になったPCR産物に関しては、pCR-Blunt II-TOPOベクター(Life Technologies社製)にクローニングし、そのシークエンスを解析した。得られた結果を表2に示す。シークエンス解析には、ポジティブ選抜マーカーの上流に位置するプライマー(PDS-7.2kF)を用いた。該プライマーの配列は以下の通りである。
PDS-7.2kF  5’-TCACATTGGGAAGAACTGGCAGT(配列番号:19)。
[0107]
[表2]


[0108]
 そして、ダイレクトシークエンス及び、クローニングしたPCR産物をシークエンス解析した結果、表2に示す通り、R304S変異を含むが、相同組換えによってポジティブ選抜マーカーがきれいに除去されており、塩基の挿入や欠失、短鎖重複DNA配列が部分的にも重複して残存することなくきれいに繋がっている配列が検出された植物体9個体を同定した(表2中「痕跡なし」参照)。またこの他に、短鎖重複DNA配列の一部が重複して残存している個体が3個体、短鎖重複DNA配列とは異なる配列が挿入されている個体が1個体あった(表2中「重複配列残存」及び「挿入、欠失あり」参照)
 さらに、痕跡無くポジティブ選抜マーカーが除去されていることが明らかとなった植物体のDNAを用いて、図9に示すサザンブロット解析を行った。GT後に痕跡無くマーカーが除去された場合、PDS遺伝子座に残るのは点変異のみである。すなわち、当該植物体からゲノムDNAを抽出し、SacIにて処理した。次いで、それら処理産物を電気泳動にて分画し、PDS遺伝子をプローブとしたサザンブロット解析を行い、野生型のそれと同一のバンドパターンになることを確認した。得られた結果を図10に示す。なお、検出に用いたDIGプローブの作製に用いたプライマーは以下の通りである。
PDS-8.7kF  5’-TGCAAGGTACTAACTAGGAGACATT-3’(配列番号:20)
PDS-9.33kR  5’-TTGTAAACAGATCTGTAACAGTGA-3’(配列番号:21)。
[0109]
 図10に示す通り、サザンブロット解析の結果、PCR産物のシークエンス解析によって、痕跡無くマーカーが除去されていることが確認された個体では野生型と同じバンドパターンを示し、マーカーが抜けていなかった個体では#1045を形質転換する前のGTカルスと同じバンドパターンを示した。
[0110]
 また、図10に示したメンブレンをストリピングし、#1045上に位置するHPT遺伝子をプローブにサザンブロットを行った(図11参照)。その結果、図12に示す通り、I-SceIのゲノム内への挿入が確認された。
[0111]
 したがって、前記95個体のGTカルスから、9個体のポジティブ選抜マーカーが除去された形質転換イネ個体(9.5%)を得ることができた。
[0112]
 (参考例1)
 非特許文献2においては、マーカー遺伝子と、その両端に配置したヌクレアーゼI-SceIの認識部位とが挿入されているレポーター遺伝子を有するT-DNAを、植物細胞に導入し、レポーター遺伝子がゲノムDNAにランダムに挿入された植物細胞においてI-SceIを発現させることにより、レポーター遺伝子からマーカー遺伝子を除去できることが示されている。さらに前記T-DNAにおいて、該認識部位の外側600bpの配列を一致(重複)させることにより、マーカー遺伝子の切り出し後に、切断末端の当該重複DNA配列間にて相同組換えが生じ、I-SceI認識部位も除去することができることが示されている。
[0113]
 しかしながら、非特許文献2に記載の方法においては、I-SceIを発現させる前に前記重複DNA配列間にて相同組換えが生じてしまい、かなりのマーカー遺伝子がゲノムDNAから除去されてしまうため、マーカー遺伝子の発現を指標として、レポーター遺伝子がゲノムDNAにランダムに挿入された植物細胞を選択することが困難となる。
[0114]
 一方、本発明によれば、上述の通り、短鎖重複DNA配列を少なくとも30ヌクレオチドとすることにより、相同組換えにより植物細胞のゲノム上の標的DNAに変異を導入する方法において、該変異が導入された植物細胞の選択を、マーカー遺伝子の発現を指標として安定的に行うことができる。さらに、選択された細胞において、マーカー遺伝子等の不要な配列を除去し、標的DNAに必要な変異のみを導入することもできる。
[0115]
 そこで、短鎖重複DNA配列のヌクレオチド数と、ヌクレアーゼ非発現下における該短鎖重複DNA配列間の相同組換えの頻度との関連を、図13に示すレポーター系を構築して評価した。
[0116]
 すなわち先ず、図13に示す、マーカー遺伝子(NPTII遺伝子)と、その両端に配置したI-SceIの認識部位とが挿入されているレポーター遺伝子(ルシフェラーゼ遺伝子)を有するT-DNAを構築した。
[0117]
 なお、当該T-DNAにおいて、該認識部位の外側1000ヌクレオチド、500ヌクレオチド又は30ヌクレオチドの配列は一致(重複)させてある。そのため、このT-DNAが導入されたイネカルスにおいて、これら重複配列間で相同組換えが生じた場合には、マーカー遺伝子及び認識部位がレポーター遺伝子より除去される。そして、該遺伝子が再構築され、コードするルシフェラーゼタンパク質の発現が可能となるため、その基質であるルシフェリンの分解の際に生じる化学発光を通して、前記相同組換えの有無を解析することができる。
[0118]
 前記重複配列の長さが異なる3種類のT-DNAを各々、上述の実施例同様の方法にてイネカルスに導入し、その2カ月後にこれらカルスにおけるルシフェラーゼによる化学発光を検出した。得られた結果を図14に示す。
[0119]
 図14に示す通り、重複配列を1000ヌクレオチドとした系においては、I-SceIを発現させなくとも、24カルス中、一部であってもルシフェラーゼによる発光が検出されたカルスは8個あり、約30%ものカルスにおいて、該重複配列間で相同組換えが生じていることが認められた。一方、重複配列を500ヌクレオチドとすることにより、その頻度を約15%まで低減させることができ、さらに30ヌクレオチドとすることで、I-SceI非発現下における相同組換えの発生を完全に抑えられることが明らかになった。

産業上の利用可能性

[0120]
 導入する変異そのものが選抜形質を付与しない遺伝子をターゲットとするGTでは、外来の選抜マーカーを利用する必要がある。また、内在遺伝子に必要最低限の改変を加えたい場合、ひいては、自然突然変異と同等の変異の導入を目的とする場合、GT後に選抜マーカーを痕跡なく除去する技術は非常に重要である。
[0121]
 上述の通り、本発明によれば、相同組換えにより植物細胞のゲノム上の標的DNAに変異を導入する方法において、該変異が導入された植物細胞の選択を、マーカー遺伝子の発現を指標として安定的に行うことを可能とし、その後、選択された細胞において、マーカー遺伝子等の不要な配列を除去し、標的DNAに必要な変異のみを導入することが可能となる。
[0122]
 したがって、本発明の標的DNAに変異が導入された植物細胞の製造方法等は、遺伝子の機能解析等の基礎研究において有用である。また、必要最低限の遺伝子改変により作出された有用作物は、従来の遺伝子組換え作物以上に社会的に受容され易いと考えられることから、本発明は育種素材の開発において非常に有用である。
[0123]
配列番号:1~7及び11~21
<223> 人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号:8
<223> PDS 7311-7340
配列番号:9
<223> I-SceIフォワード
配列番号:10
<223> I-SceIリバース

請求の範囲

[請求項1]
 下記工程(i)~(iii)を含む、標的DNAに変異が導入された植物細胞の製造方法
 (i)標的DNAと相同な第1のDNA及び第2のDNAと、マーカー遺伝子とを含むDNA構築物であって、下記(a)~(d)の特徴を有するDNA構築物を、植物細胞に導入する工程、
(a)前記マーカー遺伝子の5’側に第1のヌクレアーゼ認識部位を介して第1の相同DNAが付加されており、
(b)前記マーカー遺伝子の3’側に第2のヌクレアーゼ認識部位を介して第2の相同DNAが付加されており、
(c)第1の相同DNAの3’末端領域と第2の相同DNAの5’末端領域とが、相同な30~500ヌクレオチドからなるDNA配列(短鎖重複DNA配列)であり、
(d)第1の相同DNA及び第2の相同DNAの少なくとも1のDNAにおいて、前記短鎖重複DNA配列以外の領域に所望の変異が導入されている
 (ii)第1及び第2の相同DNAと前記標的DNAとの相同組換えにより、第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位に挟まれた前記マーカー遺伝子と前記変異とが当該標的DNAに導入されている植物細胞を、前記マーカー遺伝子の発現を指標として選択する工程、
 (iii)工程(ii)にて選択された細胞に、第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識するヌクレアーゼを発現させ、前記マーカー遺伝子、並びに第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位を当該標的DNAから除去する工程。
[請求項2]
 前記ヌクレアーゼはI-SceIである、請求項1に記載の方法。
[請求項3]
 請求項1又は2に記載の方法により製造された、標的DNAに変異が導入された植物細胞。
[請求項4]
 標的DNAと相同な第1のDNA及び第2のDNAと、マーカー遺伝子とを含むDNA構築物であって、下記(a)~(d)の特徴を有するDNA構築物が導入されることにより、第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位に挟まれた前記マーカー遺伝子と下記変異とが、第1及び第2の相同DNAとの相同組換えによって標的DNAに導入された植物細胞
(a)前記マーカー遺伝子の5’側に第1のヌクレアーゼ認識部位を介して第1の相同DNAが付加されており、
(b)前記マーカー遺伝子の3’側に第2のヌクレアーゼ認識部位を介して第2の相同DNAが付加されており、
(c)第1の相同DNAの3’末端領域と第2の相同DNAの5’末端領域とが、相同な30~500ヌクレオチドからなるDNA配列(短鎖重複DNA配列)であり、
(d)第1の相同DNA及び第2の相同DNAの少なくとも1のDNAにおいて、前記短鎖重複DNA配列以外の領域に所望の変異が導入されている。
[請求項5]
 前記ヌクレアーゼはI-SceIである、請求項4に記載の植物細胞。
[請求項6]
 請求項3~5のうちのいずれか一項に記載の細胞を含む植物体。
[請求項7]
 請求項6に記載の植物体の子孫又はクローンである植物体。
[請求項8]
 請求項6又は7に記載の植物体の繁殖材料。
[請求項9]
 標的DNAと相同な第1のDNA及び第2のDNAと、マーカー遺伝子とを含むDNA構築物であって、下記(a)~(d)の特徴を有するDNA構築物
(a)前記マーカー遺伝子の5’側に第1のヌクレアーゼ認識部位を介して第1の相同DNAが付加されており、
(b)前記マーカー遺伝子の3’側に第2のヌクレアーゼ認識部位を介して第2の相同DNAが付加されており、
(c)第1の相同DNAの3’末端領域と第2の相同DNAの5’末端領域とが、相同な30~500ヌクレオチドからなるDNA配列(短鎖重複DNA配列)であり、
(d)第1の相同DNA及び第2の相同DNAの少なくとも1のDNAにおいて、前記短鎖重複DNA配列以外の領域に所望の変異が導入されている。
[請求項10]
 請求項1又は2に記載の方法に用いるための、下記(a)及び(b)を含むキット
(a)請求項9に記載のDNA構築物
(b)第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識するヌクレアーゼを、植物細胞内に発現させるためのDNA構築物。

図面

[ 図 1]

[ 図 2]

[ 図 3]

[ 図 4]

[ 図 5]

[ 図 6]

[ 図 7]

[ 図 8]

[ 図 9]

[ 図 10]

[ 図 11]

[ 図 12]

[ 図 13]

[ 図 14]