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1. WO2010067578 - 新規なアミノ酸脱水素酵素、およびL-アミノ酸、2-オキソ酸、又はD-アミノ酸の製造方法

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明 細 書

発明の名称 新規なアミノ酸脱水素酵素、およびL-アミノ酸、2-オキソ酸、又はD-アミノ酸の製造方法

技術分野

0001  

背景技術

0002   0003   0004   0005   0006  

先行技術文献

特許文献

0007  

非特許文献

0008  

発明の概要

発明が解決しようとする課題

0009  

課題を解決するための手段

0010   0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039  

発明の効果

0040  

図面の簡単な説明

0041  

発明を実施するための形態

0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061   0062   0063   0064   0065   0066   0067   0068   0069   0070   0071   0072   0073   0074   0075   0076   0077   0078   0079   0080   0081   0082   0083   0084   0085   0086   0087   0088   0089   0090   0091   0092   0093   0094   0095   0096   0097   0098   0099   0100   0101   0102   0103   0104   0105   0106   0107   0108   0109   0110   0111   0112   0113   0114   0115   0116   0117   0118   0119   0120   0121   0122   0123   0124   0125   0126   0127   0128   0129   0130   0131   0132   0133   0134   0135   0136   0137   0138   0139   0140   0141   0142   0143  

実施例

0144   0145   0146   0147   0148   0149   0150   0151   0152   0153   0154   0155   0156   0157   0158   0159   0160   0161   0162   0163   0164   0165   0166   0167   0168   0169   0170   0171   0172   0173   0174   0175   0176   0177  

請求の範囲

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23   24   25  

図面

1   2   3  

明 細 書

発明の名称 : 新規なアミノ酸脱水素酵素、およびL-アミノ酸、2-オキソ酸、又はD-アミノ酸の製造方法

技術分野

[0001]
 本発明は、微生物の生産する新規なアミノ酸脱水素酵素、これをコードするDNA、及びアミノ酸脱水素酵素を生産する能力を有する微生物あるいは形質転換体を用いたアミノ酸脱水素酵素の製造方法、また、アミノ酸脱水素酵素を用いた効率的なL-アミノ酸、2-オキソ酸、又はD-アミノ酸の製造方法に関するものである。

背景技術

[0002]
 アミノ酸脱水素酵素とは、補酵素依存的に2-オキソ酸を還元的にアミノ化する反応、およびその逆反応であるアミノ酸を酸化的に脱アミノ化する反応を触媒する酵素である。例えばアンモニアと補酵素の存在下、2-オキソ酸から高い立体選択性でL-アミノ酸を生成するなど、産業上有用な活性をもつことが知られている。L-アミノ酸は、食品や飼料、農薬、工業用薬品、化粧品や医薬品等の合成中間体として有用であり、また有機合成における光学分割剤やキラルビルディングブロック剤としても重要である。
[0003]
 アミノ酸脱水素酵素として、例えばフェニルアラニン脱水素酵素(酵素番号[EC1.4.1.20])やロイシン脱水素酵素(酵素番号[EC1.4.1.9])等を挙げることができる。フェニルアラニン脱水素酵素を産生する微生物としては、例えばロドコッカス エスピー(Rhodococcus sp.)(特許文献1)、ロドコッカス マリス(Rhodococcus maris)(非特許文献1)、バチラス バディウス(Bacillus badius)(特許文献2)、バチラス スフェリカス(Bacillus sphaericus)(非特許文献2)、マイクロバクテリウム エスピー(Microbacterium sp.)(非特許文献3)、サーモアクチノマイセス インターメディウス(Thermoactinomyces intermedius)(特許文献3)、ブレビバクテリウム エスピー(Brevibacterium sp.)(特許文献4)およびスポロサルシナ ウレアエ(Sporosarcina ureae)(特許文献5、非特許文献4)等の微生物が知られている。
[0004]
 アミノ酸脱水素酵素は、酵素が作用しやすい化合物種の違いに応じて分類されている。例えばロイシン脱水素酵素は、L-ロイシン、L-バリン、L-イソロイシンなどの分岐鎖アミノ酸やL-ノルバリンなどの短鎖の直鎖状アミノ酸、およびそれらに対応する2-オキソ酸にはよく作用するが、L-フェニルアラニンやL-チロシンなどの芳香族アミノ酸およびそれらに対応する2-オキソ酸にはほとんど作用しない。それに対して、フェニルアラニン脱水素酵素は前述の芳香族アミノ酸、およびそれらに対応する2-オキソ酸であるフェニルピルビン酸や4-ヒドロキシフェニルピルビン酸によく作用することが知られている。しかしながら、これまで知られているフェニルアラニン脱水素酵素は、ナフチルピルビン酸あるいはホモフェニルピルビン酸等のように、フェニルピルビン酸と比較して、側鎖が大きな構造である2-オキソ酸に対しては活性が弱い(非特許文献2、非特許文献3)。L-2-ナフチルアラニン、L-ホモフェニルアラニン等の非天然アミノ酸は、農薬、工業用薬品、化粧品や医薬品等の合成中間体として有用である。
[0005]
 また、フェニルアラニン脱水素酵素遺伝子の形質転換体での発現に関しては、例えば、ロドコッカス エスピー(Rhodococcus sp.)(非特許文献5)、バチラス バディウス(Bacillus badius)(非特許文献6)、バチラス スフェリカス(Bacillus sphaericus)(非特許文献7)、スポロサルシナ ウレアエ(Sporosarcina ureae)(特許文献6)、サーモアクチノマイセス インターメディウス(Thermoactinomyces intermedius)(非特許文献8)由来の遺伝子について知られている。
[0006]
 また、ロドコッカス エスピー(Rhodococcus sp.)由来、バチラス スフェリカス(Bacillus sphaericus)由来、あるいはサーモアクチノマイセス インターメディウス(Thermoactinomyces intermedius)由来のフェニルアラニン脱水素酵素と補酵素再性能を有する酵素を2-オキソ酸に作用させ、L-アミノ酸へと変換する反応はすでに知られている(特許文献1、非特許文献9、非特許文献10)
 また、牛肝臓由来のグルタミン酸脱水素酵素、あるいはクロストリジューム サーモアセティカム(Clostridium thermoaceticum)由来のロイシン脱水素酵素とD-アミノ酸オキシダーゼおよび補酵素再生能を有する酵素をラセミ体アミノ酸に作用させ、D-アミノ酸を2-オキソ酸あるいはイミノ酸を経て、L-アミノ酸へと変換する反応はすでに知られている(非特許文献10、非特許文献11)。

先行技術文献

特許文献

[0007]
特許文献1 : 特開昭61-146183号公報
特許文献2 : 特開昭63-32482号公報
特許文献3 : 特開昭63-304980号公報
特許文献4 : 特開昭59-198972号公報
特許文献5 : 特開昭61-239887号公報
特許文献6 : 特開昭63-157986号公報

非特許文献

[0008]
非特許文献1 : Journal of Bacteriology, vol.171(1), p30 (1989)
非特許文献2 : 有機合成化学、1989年、47巻、8号、749頁
非特許文献3 : Arch. Microbiol., vol.169, p.220 (1998)
非特許文献4 : J. of Biological Chemistry, vol.262(21), p10346 (1987)
非特許文献5 : J. of Biological Chemistry, vol.269(23), p16203 (1994)
非特許文献6 : Eur. J. Biochem., vol.168, p153 (1987)
非特許文献7 : Agric. Biol. Chem., vol.51, p2621 (1987)
非特許文献8 : J. Biochem., vol.109(3), p371 (1991)
非特許文献9 : J. Org. Chem., vol.55, p5567 (1990)
非特許文献10 : Biomolecular Engineering, vol.17, p167 (2001)
非特許文献11 : J. Chem. Soc.: Chem. Commun., vol.13, p947 (1990)

発明の概要

発明が解決しようとする課題

[0009]
 本発明の目的は、フェニルピルビン酸に加え、側鎖が大きいため、従来知られているアミノ酸脱水素酵素では反応性が低かったナフチルピルビン酸およびホモフェニルピルビン酸等の2-オキソ酸に対しても高い活性を有する新規なアミノ酸脱水素酵素を提供することにある。また、本発明の目的は、当該アミノ酸脱水素酵素のアミノ酸配列、その遺伝子のDNA配列を明らかにし、当該酵素を生産する能力を有する微生物あるいは形質転換体、及びそれらを用いた当該アミノ酸脱水素酵素の製造方法を提供することにある。さらに本発明の目的は、当該アミノ酸脱水素酵素を利用した効率的なL-アミノ酸、2-オキソ酸、又はD-アミノ酸の製造方法を提供することにある。

課題を解決するための手段

[0010]
 本発明者らは上記課題に鑑み、広く土壌よりアミノ酸脱水素酵素活性を有する微生物を探索した結果、優れた新規な性質を有するアミノ酸脱水素酵素を高生産するロドコッカス(Rhodococcus)属細菌を新たに分離した。そして、当該微生物からアミノ酸脱水素酵素を単離、精製し、アミノ酸脱水素酵素遺伝子の単離、ならびに宿主微生物での発現を達成した。さらに、本発明で得たアミノ酸脱水素酵素を単独、あるいは補酵素再生能を有する酵素と組み合わせて2-オキソ酸、ラセミ体アミノ酸、又はL-アミノ酸に作用させることにより、L-アミノ酸、2-オキソ酸、又はD-アミノ酸を製造することが可能となり、本発明を完成するに至った。さらに、本発明で得たアミノ酸脱水素酵素をD-アミノ酸オキシダーゼおよび補酵素再性能を有する酵素と組み合わせて、ラセミ体アミノ酸、又はD-アミノ酸に作用させることにより、L-アミノ酸を製造することが可能となり、本発明を完成するに至った。
[0011]
 本発明は、以下の1または複数の特徴を有する。
1)本発明は、以下の(a)、(b)、(c)、(d)、(e)又は(f)のDNAである:
(a) 配列表配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA
(b) 配列表配列番号1に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(c) 配列表配列番号1に示されるアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(d) 配列表配列番号2に示される塩基配列からなるDNA
(e) 配列表配列番号2に示される塩基配列において1若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および/または付加された塩基配列を有し、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(f) 配列表配列番号2に示される塩基配列と70%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
[0012]
 2)本発明は、以下の(g)、(h)又は(i)のポリペプチドである:
(g) 配列表配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(h) 配列表配列番号1に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド
(i) 配列表配列番号1に示されるアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
[0013]
 3)本発明は、アミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドであって、一般式(1)
[0014]
[化1]


[0015]
(式中、R'は置換基を有していてもよい炭素数5~20のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数5~20のアルケニル基、置換基を有していてもよい炭素数5~20のアルキニル基、置換基を有していてもよい炭素数4~20のアリール基、または置換基を有していてもよい炭素数5~20のアラルキル基を示す。また、Xは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を示す。)で表される2-オキソ酸に対する活性を有し、かつナフチルピルビン酸に対する活性が、フェニルピルビン酸に対する活性の1/50以上であるポリペプチドである。
4)本発明は、上記一般式(1)において、R'がインドリルメチル基あるいはフェニルエチル基である前記ポリペプチドである。
5)本発明は、ロドコッカス(Rhodococcus)由来である前記ポリペプチドである。
[0016]
 6)本発明は、前記DNAを含む組換えプラスミドである。
[0017]
 7)本発明は、前記組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体である。
8)本発明は、前記DNA、及びシャペロンをコードするDNAで形質転換して得られる形質転換体である。
[0018]
 9)本発明は、前記ポリペプチドを生産する能力を有し、かつ、ロドコッカス(Rhodococcus)属に属する微生物である。
[0019]
 10)本発明は、前記ポリペプチドを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物中に当該ポリペプチドを蓄積させ、これを採取するアミノ酸脱水素酵素の製造方法である。
11)本発明は、前記ポリペプチド(アミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド)、形質転換体、または微生物を、一般式(2)
[0020]
[化2]


[0021]
(式中、Rは置換基を有していてもよい炭素数1~20のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数2~20のアルケニル基、置換基を有していてもよい炭素数2~20のアルキニル基、置換基を有していてもよい炭素数4~20のアリール基、または置換基を有していてもよい炭素数5~20のアラルキル基を示す。また、Xは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を示す。)で表される2-オキソ酸に作用させ、
一般式(3)
[0022]
[化3]


[0023]
(式中、RおよびXは前記と同じ)で表されるL-アミノ酸を製造する方法である。
[0024]
 11)本発明は、前記ポリペプチド(アミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド)、形質転換体、または微生物を、D-アミノ酸オキシダーゼ存在下、
一般式(4)
[0025]
[化4]


[0026]
(式中、RおよびXは前記と同じ)で表されるラセミ体アミノ酸、又は
一般式(5)
[0027]
[化5]


[0028]
(式中、RおよびXは前記と同じ)で表されるD-アミノ酸に作用させ、
一般式(3)
[0029]
[化6]


[0030]
(式中、RおよびXは前記と同じ)で表されるL-アミノ酸を製造する方法である。
[0031]
 12)本発明は、前記ポリペプチド(アミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド)、形質転換体、または微生物を、
一般式(3)
[0032]
[化7]


[0033]
(式中、RおよびXは前記と同じ)で表されるL-アミノ酸、又は
一般式(4)
[0034]
[化8]


[0035]
(式中、RおよびXは前記と同じ)で表されるラセミ体アミノ酸に作用させ、
一般式(2)
[0036]
[化9]


[0037]
(式中、RおよびXは前記と同じ)で表される2-オキソ酸、又は
一般式(5)
[0038]
[化10]


[0039]
(式中、RおよびXは前記と同じ)で表されるD-アミノ酸を製造する方法である。

発明の効果

[0040]
 本発明は上述の構成からなり、従来から報告のあるアミノ酸脱水素酵素では反応性が低かった基質に対して高い反応性を示す新規なアミノ酸脱水素酵素を効率よく製造することができる。また、当該アミノ酸脱水素酵素、または、当該アミノ酸脱水素酵素を生産する形質転換体、または微生物を利用することで、効率良くL-アミノ酸、2-オキソ酸、又はD-アミノ酸を製造することができる。

図面の簡単な説明

[0041]
[図1] 図1は、本発明の実施形態としてのアミノ酸脱水素酵素の作用温度と相対活性との関係(至適温度を含む)を示すグラフである。
[図2] 図2は、本発明の実施形態としてのアミノ酸脱水素酵素の作用pHと相対活性との関係(至適pHを含む)を示すグラフである。
[図3] 図3は、本発明の実施形態としてのアミノ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミドpRPD002の構成を示す図である。

発明を実施するための形態

[0042]
 以下、実施形態に基づいて本発明を詳細に説明する。本発明の範囲は、実施形態および実施例によって限定されるものではない。
[0043]
 1.ポリペプチド
 まず、本発明の実施形態としてのポリペプチドについて説明する。実施形態としてのポリペプチドは、アミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドであって、以下のような理化学的性質を有することを特徴とする。
[0044]
 1)作用
 アンモニアおよび補酵素の存在下、2-オキソ酸を還元的にアミノ化してL-アミノ酸を生成する。あるいは補酵素の存在下、L-アミノ酸を酸化的に脱アミノ化し、2-オキソ酸、アンモニアを生成する。
[0045]
 2)分子量
 分子量約94,000
 サブユニットの分子量約46,000。
[0046]
 3)作用温度の範囲
 温度範囲:少なくとも約5℃~約70℃
 至適温度:約45℃~約50℃
 温度範囲とは酵素が好適に作用する温度範囲であり、至適温度は酵素が最も好適に作用する温度である。本酵素は上記温度範囲以外の温度でも作用する。
[0047]
 4)作用pHの範囲
 pH範囲:少なくとも約7.1~約11.0
 至適pH約8.8~約10.0;
 pH範囲とは酵素が好適に作用するpH範囲であり、至適pHは酵素が最も好適に作用するpHである。本酵素は上記範囲以外のpHでも作用する。
5)比活性)
 純粋酵素1mgあたり  204unit(30℃)。
1分間に1μmolのNADHを消費する酵素量を1unitと定義する。
[0048]
 6)基質特異性
 フェニルピルビン酸と比較して、ナフチルピルビン酸、インドールピルビン酸、あるいはホモフェニルピルビン酸等の側鎖が大きな構造の2-オキソ酸に対しても高い活性を有する。ここでいう高い活性とは、フェニルピルビン酸に対する活性の1/50以上、好ましくは1/25以上、さらに好ましくは1/10以上の活性を有することをいう。
[0049]
 また、側鎖が大きな構造の2-オキソ酸とは、前記一般式(1)おいて、R'が置換基を有していてもよい炭素数5~20のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数5~20のアルケニル基、置換基を有していてもよい炭素数5~20のアルキニル基、置換基を有していてもよい炭素数4~20のアリール基、または置換基を有していてもよい炭素数5~20のアラルキル基である2-オキソ酸を表す。
[0050]
 上記R'における置換基を有していてもよい炭素数5~20のアルキル基としては、特に限定されず、例えば、ペンタニル基、ヘキサニル基、ヘプタニル基、オクタニル基等が挙げられる。
[0051]
 置換基を有していてもよい炭素数5~20のアルケニル基としは、特に限定されず、例えば、ペンテニル基、ヘキセニル基、ヘプテニル基、又はオクテニル基等が挙げられる。
[0052]
 置換基を有していてもよい炭素数5~20のアルキニル基としては、特に限定されず、例えば、ペンチニル基、ヘキシニル基、ヘプチニル基、又はオクチニル基等が挙げられる。
[0053]
 置換基を有していてもよい炭素数4~20のアリール基としては、特に限定されず、例えば、フェニル基、4-ヒドロキシフェニル基、アントラニル基、ピリジル基、ピリミジル基、インダニル基、インデニル基、又はナフチル基等が挙げられる。
[0054]
 置換基を有していてもよい炭素数5~20のアラルキル基とは、特に限定されず、例えば、インドリルメチル基、ナフチルメチル基、アントラニルメチル基、インダニルメチル基、インデニルメチル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、フェニルブチル基、ジフェニルメチル基等が挙げられる。
[0055]
 置換基としては、アミノ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、アルキル基、アラルキル基、アリール基、アルカノイル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、又はハロゲン原子等が挙げられる。
[0056]
 また、Xは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を表し、特に限定されないが、例えば、水素原子、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどが挙げられる。
[0057]
 実施形態のアミノ酸脱水素酵素は、その基質特異性からフェニルアラニン脱水素酵素(酵素番号[EC1.4.1.20])に分類される。他のフェニルアラニン脱水素酵素と比べて、例えば以下のような異なる性質を有している。
[0058]
 (a)分子量39,500のサブユニットからなるホモ四量体構造であるロドコッカス エスピー(Rhodococcus sp.)(特許文献1、非特許文献5)のフェニルアラニン脱水素酵素とは、酵素の分子量および構造が大きく異なる。またアミノ酸配列でも大きく異なる(アミノ酸配列同一性66.9%)。さらに、フェニルピルビン酸に対する酵素活性を100とした場合、インドールピルビン酸および4-ヒドロキシピルビン酸に対する酵素活性がそれぞれ3および5であり、酵素活性の比率が大きく異なる。
[0059]
 (b)分子量36,000のサブユニットからなるホモ二量体構造であるロドコッカス マリス(Rhodococcus maris) (非特許文献1)のフェニルアラニン脱水素酵素とは、酵素の分子量が大きく異なる。また、フェニルピルビン酸に対する酵素活性を100とした場合、インドールピルビン酸および2-オキソ-4-(メチルチオ)ブタン酸に対する酵素活性がそれぞれ5および9であり、酵素活性の比率が大きく異なる。
[0060]
 (c)分子量41,000~42,000のサブユニットからなるホモ八量体構造であるバチラス バディウス(Bacillus badius)(非特許文献2、非特許文献6)のフェニルアラニン脱水素酵素とは、酵素の分子量および構造が大きく異なる。またアミノ酸配列でも大きく異なる(アミノ酸配列同一性36.1%)。
[0061]
 (d)分子量39,000のサブユニットからなるホモ八量体構造であるバチラス スフェリカス(Bacillus sphaericus)(非特許文献2、非特許文献7)のフェニルアラニン脱水素酵素とは、酵素の分子量および構造が大きく異なる。またアミノ酸配列でも大きく異なる(アミノ酸配列同一性36.6%)。さらに、フェニルピルビン酸に対する酵素活性を100とした場合、ナフチルピルビン酸、ホモフェニルピルビン酸、およびインドールピルビン酸に対する酵素活性がそれぞれ、0.46、3.4、および0.39であり、酵素活性の比率が大きく異なる。
[0062]
 (e)分子量41,000のサブユニットからなるホモ八量体構造であるマイクロバクテリウム エスピー(Microbacterium sp.)(非特許文献3)のフェニルアラニン脱水素酵素とは、酵素の分子量および構造が大きく異なる。また、フェニルピルビン酸に対する酵素活性を100とした場合、ホモフェニルピルビン酸に対する酵素活性が0.1であり、酵素活性の比率が大きく異なる。
[0063]
 (f)分子量41,000のサブユニットからなるホモ六量体構造であるサーモアクチノマイセス インターメディウス(Thermoactinomyces intermedius)(特許文献3、非特許文献8)のフェニルアラニン脱水素酵素とは、酵素の分子量および構造が大きく異なる。またアミノ酸配列でも大きく異なる(アミノ酸配列同一性32.9%)。さらに、フェニルピルビン酸に対する酵素活性を100とした場合、4-ヒドロキシフェニルピルビン酸に対する酵素活性が0であり、酵素活性の比率が大きく異なる。
[0064]
 (g)分子量66,000±5000のサブユニットからなるホモ二量体構造であるブレビバクテリウム エスピー(Brevibacterium sp.)(特許文献4)のフェニルアラニン脱水素酵素とは、酵素の分子量が大きく異なる。また、純粋酵素の比活性も大きく異なる。
[0065]
 (h)分子量39,000のサブユニットからなるホモ八量体構造であるスポロサルシナ ウレアエ(Sporosarcina ureae)(特許文献5、非特許文献4)のフェニルアラニン脱水素酵素とは、酵素の分子量および構造が異なる。またアミノ酸配列でも大きく異なる(アミノ酸配列同一性35.4%)。さらに、フェニルピルビン酸に対する酵素活性を100とした場合、インドールピルビン酸に対する酵素活性が0.73であり、酵素活性の比率が大きく異なる。
[0066]
 なお、実施形態における「配列同一性」は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等を使用して求めることができる。ここでは、例示としてGENETYX Ver.7遺伝情報処理ソフトウェア/Windows版(ゼネティックス社製)のホモロジー検索を使用した。
[0067]
 2.アミノ酸脱水素酵素活性測定
 実施形態において、ポリペプチドのアミノ酸脱水素酵素活性測定は、例えば、10mMの基質フェニルピルビン酸を含む0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.0)1.5mlに、0.5M NH /NH Cl緩衝液(pH9.0)1.2ml、3mMの補酵素NADHを含む0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.0)0.2ml、および適宜希釈した酵素溶液0.1mlを添加し、30℃で1分間反応させた際の、波長340nmにおける吸光度の減少速度から算出できる。実施形態では、特に明記しない場合を除き、本方法を用いてアミノ酸脱水素酵素活性を測定した。
[0068]
 3.微生物
 実施形態のポリペプチドは、アミノ酸脱水素酵素活性を有する微生物から取得できる。同ポリペプチドを生産する微生物であれば特に限定されないが、例えばロドコッカス(Rhodococcus)属に属する微生物が挙げられ、なかでもロドコッカス キングシェンギ(Rhodococcus qingshengii)が好ましく、より好ましくはロドコッカス キングシェンギ(Rhodococcus qingshengii)KNK2108株である。
[0069]
 上記のロドコッカス キングシェンギ(Rhodococcus qingshengii)KNK2108株は、本発明において発明者らが分離、取得した菌株であり、平成20年11月26日に受託番号FERM BP-11067として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(〒305-8566 茨城県つくば市東1丁目1番1号 つくばセンター中央第6)に寄託されている。
[0070]
 以下に、ロドコッカス キングシェンギ(Rhodococcus qingshengii)KNK2108株の菌学的性質を示す。
[0071]
 1.形態
1)桿菌 rod-coccus cycleあり
 24時間:直径0.7-0.8μm×1.5-2.5μm程度
 72時間:直径0.6-0.7μm×1.0-1.2μm程度
2)グラム染色:陽性。
3)運動性:無し。
4)胞子の有無:無し。
5)寒天平板培地培養でのコロニー形態:円形、周縁全縁、半球状、表面の形状スムーズ、不透明、粘稠度バター様、淡いオレンジ色。
[0072]
 2.培養的性質
1)生育温度試験:37℃(+)、45℃(-)。
[0073]
 3.生理学的性質
1)カタラーゼ反応:+
2)オキシダーゼ反応:-
3)グルコースからの酸/ガス産生(酸産生/ガス産生):-/-
4)O/Fテスト(酸化/発酵):-/-
5)発酵性試験
 グルコース:-
 リボース:-
 キシロース:-
 マンニトール:-
 マルトース:-
 乳糖:-
 白糖:-
 グルコーゲン:-
6)生化学試験
 硝酸塩還元:-
 ピラジンアミダーゼ:-
 ピロリドニルアリルアミダーゼ:-
 アルカリフォスフォターゼ:+
 β-グルクロニダーゼ:-
 β-ガラクトシダーゼ:-
 α-グルコシダーゼ:+
 N-アセチル-β-グルコサミニダーゼ:-
 エスクリン(β-グルコシダーゼ):-
 ウレアーゼ:+
 ゼラチン加水分解:-
7)嫌気での生育:-
8)デンプンの加水分解:-
9)MR(メチルレッド試験):-
10)VP(アセトイン産生):-。
[0074]
 上記の菌学的性質、及び、16SrDNA配列解析から、KNK2108株はロドコッカス キングシェンギ(Rhodococcus qingshengii)と同定された。
[0075]
 なお、実施形態のポリペプチドを生産する微生物は、上述した微生物の野生株であっても良いし、変異改良された変異株であってもよい。変異株は、UV照射や、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)、エチルメタンスルフォネート(EMS)等の薬剤による処理といった当業者に周知の方法で取得することができる。
[0076]
 本発明のポリペプチドを生産する微生物を培養する培地としては、その微生物が増殖し得るものである限り特に限定されない。例えば、炭素源として、グルコース、シュークロース等の糖質、エタノール、グリセロール等のアルコール類、オレイン酸、ステアリン酸等の脂肪酸及びそのエステル類、菜種油、大豆油等の油類、窒素源として、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、ふすま、酵母エキスなど、無機塩類として、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウムなど、他の栄養源として、麦芽エキス、肉エキス等を含有する通常の液体培地が使用され得る。
[0077]
 更に、アミノ酸脱水素酵素の生産を増強させるような物質、例えば、アミノ酸又はアミノ酸誘導体を少量添加することもできる。これらアミノ酸脱水素酵素生産増強物質の培地中濃度は、0.001重量%以上、10重量%以下、好ましくは0.01重量%以上、1重量%以下の範囲から選ばれる。
[0078]
 培養は通常好気的に行い、温度として10℃以上、60℃以下、好ましくは20℃以上、50℃以下の範囲、pHとしては3以上、11以下、好ましくはpH5以上、9以下の範囲が用いられ、培養時間は1日以上、5日間以下程度で行い得る。また、回分式、連続式のいずれの培養方法でもよい。
[0079]
 培養終了後に培養液から遠心分離などにより菌体を集め、超音波破砕などの手段により菌体を破砕して粗酵素液を得る。この粗酵素液を、塩析法、カラムクロマトグラフィー法などにより精製することで、本発明のポリペプチドを得ることができる。
[0080]
 4.アミノ酸配列
 本発明のポリペプチドは、上記のように微生物から取得される天然酵素であってもよいし、遺伝子組換え技術を利用して生産される組換え酵素であってもよい。天然酵素としては、配列表の配列番号1に示されるポリペプチドをあげることができる。
[0081]
 また、本発明の実施形態としてのポリペプチドは、配列表配列番号1に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドであってもよいし、配列番号1に示されるアミノ酸配列と70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、より好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドであってもよい。「数個のアミノ酸」とは、アミノ酸脱水素酵素活性が失われない限り、その個数は制限されないが、例えば25アミノ酸以下であり、好ましくは20アミノ酸以下、より好ましくは15アミノ酸以下、さらに好ましくは10アミノ酸以下、最も好ましくは、5、4、3、または2個以下である。
[0082]
 また、「アミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド」とは、上記の活性測定条件において、配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いた場合の10%以上、好ましくは40%以上、より好ましくは60%以上、さらに好ましくは80%以上の活性を示すポリペプチドのことをいう。
[0083]
 5.DNA
 本発明の実施形態としての「DNA」について説明する。本発明のDNAは、上記のようなポリペプチドをコードするDNAであればよい。配列表の配列番号2で示されるDNAであってもよいし、配列表配列番号2に示される塩基配列において1若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および/または付加された塩基配列を有し、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNAであってもよい。「数個の塩基」とは、DNAによってコードされるポリペプチドがアミノ酸脱水素酵素活性を失われない限り、その個数は制限されないが、好ましくは50塩基以下であり、より好ましくは30塩基以下、さらに好ましくは20塩基以下、最も好ましくは、10、9、8、7、6、5、4、3、または2個以下である。
[0084]
 また、配列番号2で示される塩基配列と70%以上、好ましくは75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、より好ましくは99%以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNAであってもよい。
[0085]
 また、本発明のDNAとしては、配列表配列番号2で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAにストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNAであってもよい。
[0086]
 ここで「配列表配列番号2に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA」とは、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を実施した際に、配列表配列番号2に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAと、特異的にハイブリッドを形成し得るDNAを言う。
[0087]
 ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、75mMクエン酸三ナトリウム、750mM塩化ナトリウム、0.5%ドデシル硫酸ナトリウム、0.1%ウシ血清アルブミン、0.1%ポリビニルピロリドン、および、0.1%Ficoll 400(アマシャムバイオサイエンス株式会社製)の組成からなる水溶液中、65℃でハイブリダイズさせた後に、15mMクエン酸三ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、および0.1%ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、60℃で洗浄が行われる条件を言う。好ましくは、上記条件でハイブリダイズさせた後に、15mMクエン酸三ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、および0.1%ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、65℃で洗浄が行われる条件であり、より好ましくは、1.5mMクエン酸三ナトリウム、15mM塩化ナトリウム、および0.1%ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、65℃で洗浄が行われる条件である。
[0088]
 本発明のDNA(アミノ酸脱水素酵素遺伝子)は、前述したようなアミノ酸脱水素酵素活性を有する微生物から取得することができる。目的のDNAを取得するには、例えば以下の方法によることができる。
[0089]
 まず、アミノ酸脱水素酵素活性を有する微生物より精製されたアミノ酸脱水素酵素のN末端のアミノ酸配列を、気相プロテイン・シークエンサーなどで決定する。また、精製されたアミノ酸脱水素酵素にV8プロテアーゼ等のプロテアーゼを作用させて適当な大きさのポリペプチドに消化した後、HPLC等を用いて得られたポリペプチドを精製し、上記と同様の方法に従って内部アミノ酸配列を決定する。このようにして得られたN末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列にもとづいて設計したDNAプライマーを合成する。
[0090]
 次に、アミノ酸脱水素酵素の起源となる微生物より、染色体DNAを単離する。染色体DNAは、培養された細胞から、UltraClean Microbial DNA Isolation Kit(MO BIO Laboratories, Inc.社製)等を用いて得られる。この染色体DNAを鋳型に、上記のDNAプライマーを用いてPCRを行うことで、目的遺伝子の一部を取得できる。
[0091]
 次に、既に取得した部分遺伝子のさらにN末側とC末側をコードするDNA断片を、インバースPCR法により取得することができる(例えばNucleic Acids Res., vol.16, p8186 (1988)を参照)。このDNA断片の塩基配列を決定後、酵素のN末端をコードするDNAよりも上流、C末端をコードするDNAより下流と推定されるDNAの塩基配列にもとづきDNAプライマーを作成して、この配列の間のDNAを先に得た染色体DNAを鋳型としたPCRにより増幅することで目的アミノ酸脱水素酵素遺伝子の全長を含むDNA断片を取得できる。
[0092]
 次いで、得られたアミノ酸脱水素酵素遺伝子を含むDNA断片をベクターDNAとT4 DNAリガーゼなどを用いて結合させることにより組換えプラスミドを得ることができる。このプラスミドを用いて、ベクターに挿入したアミノ酸脱水素酵素遺伝子を含むDNA断片部分の塩基配列を解析、アミノ酸脱水素酵素のN末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列をコードする塩基があることを確認し、また、これより翻訳開始部位と終止コドンを確認することでオープンリーディングフレームを決定する。
[0093]
 6.形質転換体・ベクター
 上記方法によって取得したDNA、または該DNAをベクターに組み込んで得られる組換えプラスミドを用いることにより、宿主微生物を形質転換し形質転換体を得ることができる。
[0094]
 宿主、ベクターとしては、「組換えDNA実験指針」(科学技術庁研究開発局ライフサイエンス課編:平成8年3月22日改定)に記載の宿主―ベクター系を用いることができる。
[0095]
 例えば、宿主としては、エシェリヒア(Escherichia)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、フラボバクテリウム(Flavobacterium)属、バチルス(Bacillus)属、セラチア(Serratia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、アセトバクター(Acetobacter)属、グルコノバクター(Gluconobacter)属、ラクトバチルス(Lactobacillus)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、又はロドコッカス(Rhodococcus)属に属する微生物を用いることができる。
[0096]
 ベクターは上記の宿主内で自律複製できる微生物由来のプラスミド、ファージまたはその誘導体が使用できる。なかでも、宿主微生物としてエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ベクターとして当該微生物中で自律複製できるベクターを用いるのが好ましい。このようなベクターとしては、例えば、pUC18、pUC19、pBR322、pACYC184、pSTV28、pSTV29、pSC101、pT7Blue、又はpUCNT、若しくはそれらの誘導体を挙げることができる。それらの誘導体とは、酵素の生産量上昇、プラスミド安定化を目的として、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、SD配列、複製開始部位(ori)、その他の調節などに関わる遺伝子を改質したもの、また、薬剤耐性、クローニング部位の制限酵素サイトを改質したものなどを指す。
[0097]
 形質転換体によっては、生産された酵素が不溶化し、インクルージョンボディーを形成する場合がある。このような場合には、培養条件を変更する、宿主微生物を変更する、あるいは目的遺伝子とシャペロン遺伝子を宿主微生物内で同時発現させることで、酵素の不溶化を回避できる場合がある。シャペロンとは、生体内で、蛋白質の正常な立体構造への折りたたみを介助する役割を持つ蛋白質である(例えばAppl. Biochem. Biotech., vol.66, pp197-238 (1997)を参照)。
[0098]
 形質転換体の一例として、ロドコッカス キングシェンギ(Rhodococcus qingshengii)KNK2108株から上記のようにして取得したDNAをpUCT(pUCNT(WO94/03613参照)のNdeIサイトを破壊したプラスミドベクター)に組み込んだ組換えプラスミドpRPD002を用いて、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)HB101を形質転換し、形質転換体エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)HB101(pRPD002)を得ることができる。
[0099]
 エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)HB101の菌学的性質は、「BIOCHEMICALS FOR LIFE SCIENCE」(東洋紡績株式会社、1993年、116-119頁)およびその他種々の公知文献に記載されており当業者に周知である。エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)HB101(pRPD002)は、遺伝子組換えによって特定の酵素を産生し得る性質以外は、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)HB101と同様の菌学的性質を有する。
[0100]
 なお、本発明で用いた組換えDNA技術は当該分野において周知であり、例えば、Molecular Cloning 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)、 (Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)に記載されている。
[0101]
 7.形質転換体等の培養
 本発明のアミノ酸脱水素酵素を生産しうる上記形質転換体等を培養することにより当該酵素を大量に生産することができ、L-アミノ酸、2-オキソ酸、又はD-アミノ酸の製造に利用することができる。
[0102]
 微生物の培養は、通常の培地を用いて行えば良い。培養に使用する培地としては、炭素源、窒素源および無機塩類などの栄養素を含む通常の培地で良い。これに、ビタミン、アミノ酸などの有機微量栄養素を添加すると、好ましい結果が得られる場合が多い。炭素源としては、グルコースやシュークロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類などが適宜使用される。窒素源としては、アンモニウム塩、アンモニア水、アンモニアガス、尿素、酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカーなどが用いられる。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、鉄塩、硫酸塩、塩素などが用いられる。
[0103]
 培養は温度範囲25℃から40℃で行えるが、25℃から37℃が特に好ましい。また、pHは4から8で培養できるが5から7.5が好ましい。また、回分式、連続式のいずれの培養方法でもよい。
[0104]
 必要に応じてイソプロピル-1-チオ-β―D-ガラクトサイド(IPTG)、ラクトース等の添加等の酵素誘導のための処理を行なうこともできる。
[0105]
 8.L-アミノ酸等の製造方法
 実施形態で得られるアミノ酸脱水素酵素を使用することによる、効率的なL-アミノ酸、2-オキソ酸、又はD-アミノ酸の製造方法について説明する。2-オキソ酸は、ラセミ体アミノ酸、又はL-アミノ酸にアミノ酸脱水素酵素を作用させ、L-アミノ酸を酸化することにより得ることができる(酸化的脱アミノ化反応)。D-アミノ酸は、前記酸化的脱アミノ化反応において、ラセミ体アミノ酸を基質とした時の残基質として得ることが可能である。L-アミノ酸は、2-オキソ酸にアミノ酸脱水素酵素を作用させ、2-オキソ酸を還元的にアミノ化することにより得ることができる(還元アミノ化反応)。またL-アミノ酸は、ラセミ体アミノ酸、又はD-アミノ酸にD-アミノ酸オキシダーゼを作用させ、D-アミノ酸を2-オキソ酸へと酸化し、さらにアミノ酸脱水素酵素を接触せしめ、反応させることにより、L-アミノ酸へと変換することもできる(立体反転反応)。
[0106]
 9.D-アミノ酸オキシダーゼ
 ここでD-アミノ酸オキシダーゼとは、酸素の存在下、D-アミノ酸を酸化し、2-オキソ酸、過酸化水素、及びアンモニアを生成する酵素である。本発明で用いるD-アミノ酸オキシダーゼとしては、動物、植物、微生物由来のものが使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。D-アミノ酸オキシダーゼの生産能力を有する微生物としては、例えば、以下の公知の当該酵素の生産能力を有する微生物である、アースロバクター(Arthrobacter)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、キャンディダ(Candida)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、クルブラリア(Curvularia)属、エクソフィアラ(Exophiala)属、フサリウム(Fusarium)属、ジベレラ(Gibberella)属、ハンセヌラ(Hansenula)属、クオエッケラ(Kloeckera)属、クリベロマイセス(Kluyveromyces)属、ニューロスポラ(Neurospora)属、ピキア(Phichia)属、ロドスポリディウム(Rhodosporidium)属、ロドトルラ(Rhodotorula)属、スポロボロマイセス(Sporobolomyces)属、トリゴノプシス(Trigonopsis)属、バーチシリウム(Verticillium)属、及びヤロヴィア(Yarrowia)属等が挙げられる。
[0107]
 好ましくはキャンディダ(Candida)属に属する微生物由来の酵素が挙げられ、なかでもキャンディダ インターメディア(Candida intermedia)由来の酵素が好ましく、さらに好ましくは、キャンディダ インターメディア(Candida intermedia)NBRC0761株由来の酵素が挙げられる。
[0108]
 D-アミノ酸オキシダーゼを効率良く高生産する高活性菌を得るためには、周知のとおり、形質転換微生物を作成することが有効である。作成方法としては、例えばWO07/015511記載のように、D-アミノ酸オキシダーゼ活性を示す菌株からD-アミノ酸オキシダーゼ遺伝子をクローニングした後、適当なベクターとの組換えプラスミドを作成して、これを用いて適当な宿主菌を形質転換することで得られる。なお、組換えDNA技術については当該分野において周知である。
[0109]
 このようにして得られたD-アミノ酸オキシダーゼを高生産する形質転換体としてはWO07/015511記載の、キャンディダ インターメディア(Candida intermedia)NBRC0761株由来のD-アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含有するエシェリヒア コリ(Escherichia coli)HB101(pCDA003)(FERM BP-10639)又はエシェリヒア コリ(Escherichia coli)JM109(pCDA003)(FERM BP-10638)を挙げることができる。
[0110]
 これら形質転換体によるD-アミノ酸オキシダーゼ、あるいは前述のD-アミノ酸オキシダーゼ活性を示す菌株によるD-アミノ酸オキシダーゼの生産は、例えば、WO07/015511記載の、通常の栄養培地を用いて培養を行なえば良く、必用に応じて、酵素誘導のための処理を行うこともできる。
[0111]
 10.補酵素再生系
 アミノ酸脱水素酵素による還元アミノ化反応は、NADHのような還元型の補酵素を必要とし、当該反応の進行に伴い、補酵素NADHは酸化型に変換される。この酸化型の補酵素を還元型に変換する能力(以後、還元型補酵素再生能と呼ぶ)を有する酵素、および、当該酵素の基質となる化合物を、アミノ酸脱水素酵素と共存させて当該反応を行うことにより、補酵素の使用量を大幅に削減できる。
[0112]
 還元型補酵素再生能を有するポリペプチドとしては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、グルコース-6-リン酸脱水素酵素、又はグルコース脱水素酵素などを使用できる。
[0113]
 好適には、ギ酸脱水素酵素が使用される。ギ酸脱水素酵素としては、植物、微生物由来のものが使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。微生物としては、当該酵素の生産能力を有する微生物であればいずれも利用できるが、例えば、以下の公知の、当該酵素の生産能力を有する微生物である、キャンディダ(Candida)属、クロイッケラ(Kloeckera)属、ピキア(Pichia)属、リポマイセス(Lipomyces)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、モラキセラ(Moraxella)属、ハイホマイクロビウム(Hyphomicrobium)属、パラコッカス(Paracoccus)属、チオバシラス(Thiobacillus)属、アンシロバクター(Ancylobacter)属がある。
[0114]
 好ましくはチオバシラス(Thiobacillus)属、アンシロバクター(Ancylobacter)属に属する微生物由来の酵素が挙げられる。さらに好ましくはチオバシラス エスピー(Thiobacillus sp.)KNK65MA(FERM BP-7671)、アンシロバクター アクアティカス(Ancylobacter aquaticus)KNK607M株(FERM BP-7335)由来の酵素が挙げられる。
[0115]
 ギ酸脱水素酵素を効率良く高生産する高活性菌を得るためには、周知のとおり、形質転換微生物を作成することが有効である。作成方法としては、例えばWO03/031626記載のように、ギ酸脱水素酵素活性を示す菌株からギ酸脱水素酵素遺伝子をクローニングした後、適当なベクターとの組換えプラスミドを作成して、これを用いて適当な宿主菌を形質転換することで得られる。なお、組換えDNA技術については当該分野において周知である。
[0116]
 このようにして得られたギ酸脱水素酵素を高生産する形質転換体としてはWO03/031626記載の、チオバシラス エスピー(Thiobacillus sp.)KNK65MA(FERM BP-7671)由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を含有するエシェリヒア コリ(Escherichia coli)HB101(pFT001)(FERM BP-7672)又はエシェリヒア コリ(Escherichia coli)HB101(pFT002)(FERM BP-7673)、又はWO02/46427記載の、アンシロバクター アクアティカス(Ancylobacter aquaticus)KNK607M株(FERM BP-7335)由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を含有するエシェリヒア コリ(Escherichia coli)HB101(pFA001)(FERM BP-7334)を挙げることができる。
[0117]
 これら形質転換体によるギ酸脱水素酵素の生産、あるいは前述のギ酸脱水素酵素活性を示す菌株によるギ酸脱水素酵素の生産は、例えば、WO03/031626記載の、通常の栄養培地を用いて培養を行なえば良く、必用に応じて、酵素誘導のための処理を行うこともできる。
[0118]
 アミノ酸脱水素酵素による酸化的脱アミノ化反応は、NADのような酸化型の補酵素を必要とし、当該反応の進行に伴い、補酵素NADは還元型に変換される。この還元型の補酵素を酸化型に変換する能力(以後、酸化型補酵素再生能と呼ぶ)を有する酵素、および、当該酵素の基質となる化合物を、アミノ酸脱水素酵素と共存させて当該反応を行うことにより、補酵素の使用量を大幅に削減できる。
[0119]
 酸化型補酵素再生能を有するポリペプチドとしては、例えばNADHオキシダーゼ等が挙げられる。NADHオキシダーゼは、補酵素再生反応のための基質として酸素が利用できること、その多くがNADHに特異的であり、また触媒される反応が不可逆的である点などにおいて好ましい。なお、NADHオキシダーゼには水を生成するもの(水生成型NADHオキシダーゼ)と過酸化水素を生成するもの(過酸化水素生成型NADHオキシダーゼ)の2種が知られているが、過酸化水素は酵素などに悪影響を与えることが知られており、その点で、水生成型NADHオキシダーゼがより好ましい。
[0120]
 上記水生成型NADHオキシダーゼの酵素源としては、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、ラクトバシルス(Lactobacillus)属、ラクトコッカス(Lactococcus)属、ロイコノストック(Leuconostock)属、エンテロコッカス(Entrococcus)属、ペディオコッカス(Pediococcus)属、メタノコッカス(Methanococcus)属、セルプリナ(Serpulina)属、マイコプラズマ(Mycoplasma)属、ジアルディア(Giardia)属からなる群から選ばれた微生物由来の酵素群が挙げられ、好ましくはストレプトコッカス(Streptococcus)属微生物、さらに好ましくはストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、さらに好ましくはストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)NCIMB11723由来の酵素群が挙げられる。ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)NCIMB11723由来の水生成型NADHオキシダーゼは、そのアミノ酸配列およびそれをコードするDNAの塩基配列はすでに報告されている(特開平8-196281)。
[0121]
 11.カタラーゼの添加
 前記立体反転反応には、カタラーゼを添加してもよい。カタラーゼを添加しない場合にも反応は進行し、生成物を得ることができるが、D-アミノ酸オキシダーゼ反応で生成する過酸化水素により基質、反応中間体、あるいは生成物が分解され、収率が低下する可能性がある。カタラーゼを添加することで、そのような基質、反応中間体、あるいは生成物の分解を抑えることができ、収率の向上が期待できる。カタラーゼは過酸化水素を水と酸素に分解する反応を触媒する酵素である。
[0122]
 カタラーゼとしては、動物、植物、微生物由来のものが使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。微生物としては、当該酵素の生産能力を有する微生物であればいずれも利用できるが、例えば、以下の公知の、当該酵素の生産能力を有する微生物である、エシェリヒア(Escherichia)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、マイクロコッカス(Micrococcus)属、又はロドシュードモナス(Rhodopseudomonas)属等がある。
[0123]
 また、市販の酵素も使用することもできる。市販酵素としては例えば、Catazyme25L(Novozyme社製)、Terminox Ultra 200L(Novozyme社製)、CATALASE(Beef Liver)(P-L Biochemcals,Inc.社製)がある。
[0124]
 12.形質転換体等
 なお、本発明において使用するアミノ酸脱水素酵素、補酵素再生能を有する酵素、D-アミノ酸オキシダーゼ、カタラーゼは、それぞれの酵素遺伝子を導入した形質転換体を育種し、培養して生産したものを使用してもよいし、複数の酵素遺伝子を導入した形質転換体を育種し、培養して生産したものを使用してもよい。
[0125]
 本発明において、生産されたアミノ酸脱水素酵素、補酵素再生能を有する酵素、D-アミノ酸オキシダーゼ、およびカタラーゼは、酵素自体として用いることができるほか、微生物もしくはその処理物としても用いることができる。ここで、微生物の処理物とは、例えば、粗抽出液、培養菌体凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、またはそれらの菌体の破砕物を意味する。
[0126]
 更にそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化して得た固定化酵素として用いられ得る。固定化は当業者に周知の方法である架橋法、共有結合法、物理的吸着法、包括法などで行い得る。
[0127]
 13.L-アミノ酸等の生産
 本発明の酸化的脱アミノ化反応による2-オキソ酸、又はD-アミノ酸の生産、還元アミノ化反応によるL-アミノ酸の生産、又は立体反転反応によるL-アミノ酸の生産は以下の方法で行なうことができる。
[0128]
 酸化的脱アミノ化反応の基質としては、前記一般式(3)で表されるL-アミノ酸、又は前記一般式(4)で表されるラセミ体アミノ酸が挙げられる。還元アミノ化反応の基質としては、前記一般式(2)で表される2-オキソ酸が挙げられる。立体反転反応の基質としては、前記一般式(4)で表されるラセミ体アミノ酸、又は前記一般式(5)で表されるD-アミノ酸が挙げられる。
[0129]
 これらの基質において、Rは置換基を有していてもよい炭素数1~20のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数2~20のアルケニル基、置換基を有していてもよい炭素数2~20のアルキニル基、置換基を有していてもよい炭素数4~20のアリール基、または置換基を有していてもよい炭素数5~20のアラルキル基を示す。
[0130]
 上記Rにおける置換基を有していてもよい炭素数1~20のアルキル基としては、特に限定されず、例えば、メチル基、イソプロピル基、イソブチル基、1-メチルプロピル基、カルバモイルメチル基、2-カルバモイルエチル基、ヒドロキシメチル基、1-ヒドロキシエチル基、メルカプトメチル基、2-メチルチオエチル基、(1-メルカプト-1-メチル)エチル基、4-アミノブチル基、3-グアニジノプロピル基、4(5)-イミダゾールメチル基、エチル基、n-プロピル基、n-ブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンタニル基、ヘキサニル基、ヘプタニル基、オクタニル基、2,2-ジメチルプロピル基、クロロメチル基、メトキシメチル基、2-ヒドロキシエチル基、3-アミノプロピル基、2-シアノエチル基、3-シアノプロピル基、4-(ベンゾイルアミノ)ブチル基、又は2-メトキシカルボニルエチル基等が挙げられる。
[0131]
 置換基を有していてもよい前記炭素数2~20のアルケニル基としては、特に限定されず、例えば、エテニル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、ヘプテニル基、又はオクテニル基等が挙げられる。
[0132]
 置換基を有していてもよい前記炭素数2~20のアルキニル基としては、特に限定されず、例えば、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基、ヘプチニル基、又はオクチニル基等が挙げられる。

 置換基を有していてもよい炭素数5~20のアラルキル基としては、特に限定されず、例えば、ベンジル基、インドリルメチル基、チアゾールメチル基、4-ヒドロキシベンジル基、ナフチルメチル基、アントラニルメチル基、ピリジルメチル基、ピリミジルメチル基、インダニルメチル基、インデニルメチル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、フェニルブチル基、ジフェニルメチル基、2-フルオロベンジル基、3-フルオロベンジル基、4-フルオロベンジル基、又は3,4-メチレンジオキシベンジル基等が挙げられる。
[0133]
 置換基を有していてもよい炭素数4~20のアリール基としては、フェニル基、4-ヒドロキシフェニル基、アントラニル基、ピリジル基、ピリミジル基、インダニル基、インデニル基、又はナフチル基等が挙げられる。
[0134]
 置換基としては、アミノ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、アルキル基、アラルキル基、アリール基、アルカノイル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、又はハロゲン原子等が挙げられる。
[0135]
 また、Xは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を表し、特に限定されないが、例えば、水素原子、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどが挙げられる。 14.酸化的脱アミノ化反応
 酸化的脱アミノ化反応では、上記基質に前述のアミノ酸脱水素酵素、前述の補酵素再生能を有する酵素とその基質となる化合物を同時に存在させ、水性媒体中で反応を行なう。上記酸化的脱アミノ化反応には、NAD等の補酵素を添加してもよい。NAD等の補酵素を添加しない場合にも、微生物中に存在するNAD等の補酵素により反応が進行する場合もあるが、NAD等の補酵素を添加することで、反応の効率が向上することが期待できる。NAD等の補酵素の添加濃度としては、基質に対して、好ましくは0当量以上、2当量以下、より好ましくは0.00001当量以上、0.1当量以下、さらに好ましくは0.0001当量以上、0.01当量以下である。
[0136]
 15.還元アミノ化反応
 還元アミノ化反応では、上記基質に前述のアミノ酸脱水素酵素、アンモニア又はその塩、および前述の補酵素再生能を有する酵素とその基質となる化合物を同時に存在させ、水性媒体中で反応を行なう。上記還元アミノ化反応には、NAD等の補酵素を添加してもよい。NAD等の補酵素を添加しない場合にも、微生物中に存在するNAD等の補酵素により反応が進行する場合もあるが、NAD等の補酵素を添加することで、反応の効率が向上することが期待できる。NAD等の補酵素の添加濃度としては、基質に対して、好ましくは0当量以上、2当量以下、より好ましくは0.00001当量以上、0.1当量以下、さらに好ましくは0.0001当量以上、0.01当量以下である。
[0137]
 16.立体反転反応
 立体反転反応では、上記基質に前述のD-アミノ酸オキシダーゼ、前述のアミノ酸脱水素酵素および補酵素再生能を有する酵素とその基質となる化合物を同時に存在させ、水性媒体中で反応を行なう。反応にはカタラーゼを添加してもよい。カタラーゼを添加することでD-アミノ酸オキシダーゼの反応で生成する過酸化水素を分解し、基質、反応中間体、あるいは生成物の分解を抑えることができる。
[0138]
 また、上記反応にFADを添加してもよい。FADはD-アミノ酸オキシダーゼの補酵素であり、添加することにより、反応の効率が向上することが期待できる。FADの添加濃度としては、基質に対して、好ましくは0当量以上、10当量以下、より好ましくは0当量以上、1当量以下、さらに好ましくは0当量以上、0.1当量以下である。
[0139]
 また、上記立体反転反応にはNAD等の補酵素を添加してもよい。NAD等の補酵素を添加しない場合にも、微生物中に存在するNAD等の補酵素により反応が進行する場合もあるが、NAD等の補酵素を添加することで、反応の効率が向上することが期待できる。NAD等の補酵素の添加濃度としては、基質に対して、好ましくは0当量以上、2当量以下、より好ましくは0.00001当量以上、0.1当量以下、さらに好ましくは0.0001当量以上、0.01当量以下である。
[0140]
 また、上記立体反転反応にアンモニア又はその塩を添加してもよい。アンモニアの添加濃度としては、基質に対して、好ましくは0当量以上、10当量以下、より好ましくは0当量以上、2当量以下、さらに好ましくは0.1当量以上、1.5当量以下である。
[0141]
 上記酸化的脱アミノ化反応、還元アミノ化反応、および立体反転反応の基質の仕込み濃度は0.1%(w/v)以上、90%(w/v)以下、好ましくは1%(w/v)以上、60%(w/v)以下で溶解または懸濁した状態で反応を行い、上記酸化的脱アミノ化反応、還元アミノ化反応、および立体反転反応における反応温度は10℃以上、80℃以下、好ましくは20℃以上、60℃以下の適当な温度で調節し、pH4以上、12以下、好ましくはpH6以上、11以下に保ちつつ暫時静置または攪拌すればよい。また、基質は一括添加してもよいし、分割添加してもよいし、連続的に添加してもよい。上記酸化的脱アミノ化反応、還元アミノ化反応、および立体反転反応は、バッチ法または連続方式で行い得る。
[0142]
 本発明の酸化的脱アミノ化反応、還元アミノ化反応、および立体反転反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。水性媒体としては、水、緩衝液、これらにエタノールのような水溶性有機溶媒を含む水性媒体、あるいは、水に溶解しにくい有機溶媒、たとえば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、n-ヘキサンなどの有機溶媒を含む水性媒体との2層系などの適当な溶媒を用いることができる。さらに必用に応じて、抗酸化剤、界面活性剤、補酵素、金属などを添加することもできる。
[0143]
 17.生成物の単離
 生成したL-アミノ酸、2―オキソ酸、又はD-アミノ酸の単離は、常套分離方法、例えば、抽出、濃縮、晶析、またはカラムクロマトグラフィーなどの分離方法や、それらの組み合わせにより分離、精製することができる。
実施例
[0144]
 以下に本発明の具体的な実施例を示す。しかし、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
[0145]
  (実施例1)アミノ酸脱水素酵素の単離・精製
 ロドコッカス キングシェンギ(Rhodococcus qingshengii)KNK2108株を、500ml坂口フラスコ内で滅菌した50mlの培地(肉エキス1.0%、ポリペプトン1.0%、イーストエキス0.5%、NaCl0.3%、滅菌前pH7.0)に植菌して30℃で23時間、好気的に振とう培養した。この培養液30mlを5Lジャーファーメンター内で滅菌した3Lの培地A(L-Phe1.0%、ポリペプトン0.1%、イーストエキス0.1%、肉エキス0.1%、KH PO 0.45%、Na HPO 0.62%、MgSO ・7H O0.02%、CaCl ・2H O0.0002%、ZnSO ・7H O0.00004%、FeCl ・6H O0.00002%、アデカノールLG1090.01%、滅菌前pH7.0)に植菌して通気量0.3vvm、攪拌450rpm、30℃で31時間、好気的に培養した。
[0146]
 培養終了後、遠心分離で菌体を集菌して、10%のグリセリンを含む0.1M Tris(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)-塩酸緩衝液(pH8.0)に菌体を懸濁後、超音波により菌体を破砕し、これを遠心分離した。上清に硫酸アンモニウムを50%飽和で加えた時に塩析する沈殿を遠心分離で取得した。この画分を20%のグリセリンを含む0.1M Tris(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)-塩酸緩衝液(pH8.0)に溶解、同緩衝液で透析後、DEAE-TOYOPEAL(東ソー社製)にアプライしてカラムクロマトグラフィーを行い、同緩衝液で洗浄後、同緩衝液で0Mから0.4Mの塩化ナトリウムの濃度勾配をかけて溶出し、活性のあるフラクションを集めた。この活性画分を、Blue-sepharose(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)にアプライしてカラムクロマトグラフィーを行い、20%のグリセリンを含む0.1M Tris(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)-塩酸緩衝液(pH8.0)で0Mから0.4Mの塩化ナトリウムの濃度勾配をかけて溶出した。得られた活性画分に、終濃度1Mとなるように硫酸アンモニウムを溶解した後、RESOURCE PHE 6ml(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)を用いてカラムクロマトグラフィーを行ない、20%のグリセリンを含む0.1M Tris(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)-塩酸緩衝液(pH8.0)で1Mから0Mの硫酸アンモニウムの濃度勾配をかけて溶出した。ここで得られた活性画分をSDS-ポリアクリルアミド電気泳動によって分析したところ、アミノ酸脱水素酵素は単一バンドとして検出され、精製酵素の純粋性が確認できた。
[0147]
  (実施例2)アミノ酸脱水素酵素の性質
 実施例1で得られた精製アミノ酸脱水素酵素の性質を以下のように調べた。
[比活性]
 アミノ酸脱水素酵素の活性測定は、10mMの基質フェニルピルビン酸を含む0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.0)1.5mlに、0.5M NH /NH Cl緩衝液(pH9.0)1.2ml、3mMの補酵素NADHを含む0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.0)0.2ml、および適宜希釈した酵素溶液0.1mlを添加し、30℃で1分間反応させた際の、波長340nmにおける吸光度の減少速度から算出した。このとき1分間に1μmolのNADHを消費する酵素量を1unitと定義した。また、タンパク質の定量は、BSAを標準タンパク質としてBradford法で行った。精製したアミノ酸脱水素酵素の比活性は204unit/mgタンパク質(30℃)であった。
[0148]
 [作用温度の範囲・至適温度]
 作用温度の範囲と至適温度を調べた。30℃での活性を100%とした場合の各温度での相対活性を図1に示した。本酵素は少なくとも検討した5~70℃の範囲でよく作用し、至適温度は45℃~50℃であった。
[0149]
 [作用pHの範囲・至適pH]
 作用pHの範囲と至適pHを調べた。pH7.0から7.9の範囲では0.1Mのリン酸カリウム緩衝液を、pH7.9から8.8の範囲では0.1MのTris-塩酸緩衝液を、pH8.8から10.5までの範囲では0.1Mの炭酸ナトリウム緩衝液を、pH10.5から11.0の範囲では0.1Mのグリシン/塩化ナトリウム/水酸化ナトリウム緩衝液を使用し、pH9.0での活性を100%とした場合の各pHでの相対活性を図2に示した。本酵素は少なくとも検討したpH7.1~11.0の範囲で作用し、至適pHは8.8~10.0であった。
[0150]
 [分子量の測定]
 実施例1で得られた精製アミノ酸脱水素酵素を含む画分を、限外濾過膜(分画分子量10,000)を用いて濃縮した後、Superdex 200 HR 10/30(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)にアプライしてFPLCによるゲルろ過クロマトグラフィーを行い、0.15Mの塩化ナトリウムと20%のグリセリンを含む0.1M Tris(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)-塩酸緩衝液(pH8.0)で溶出した。標準タンパク質の溶出時間と比較して分子量を測定したところ、約94,000(86,000以上、98,000以下)であった。また、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動により標準タンパク質との移動度と比較してサブユニット分子量を測定したところ、約46,000(43,000以上、49,000以下)であり、本発明のアミノ酸脱水素酵素は同一のサブユニットからなる2量体構造であった。
[0151]
 [基質特異性]
 精製アミノ酸脱水素酵素の基質特異性を調べた。前記酵素活性測定における基質フェニルピルビン酸をそれぞれの基質に変更し、酵素活性を測定した。ただし、ナフチルピルビン酸に対する酵素活性は、ナフチルピルビン酸1.0mg、硫酸アンモニウム12.3mgおよびNADH6.1mgを含む0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.0)100μlに、適宜希釈した酵素溶液100μlを添加し、30℃で30分間に生成する2-ナフチルアラニンの増加量をHPLCで定量することにより求めた。HPLC分析は、カラム:COSMOSIL 5C18-ARII(4.6mm×250mm、ナカライテスク社製)、溶離液:10mMリン酸カリウム緩衝液(pH2.0)/アセトニトリル=5/1、流速:1.0ml/min、カラム温度:40℃、検出:210nmで行なった。このとき1分間に1μmolの2-ナフチルアラニンを生成する酵素量を1unitと定義した。また、インドールピルビン酸に対する酵素活性は、インドールピルビン酸2.0mg、硫酸アンモニウム26.0mgおよびNADH7.6mgを含む0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.0)100μl、適宜希釈した酵素溶液100μlを添加し、30℃で30分間に生成するL-トリプトファンの増加量をHPLCで定量することにより求めた。HPLC分析は、カラム:CROWNPAK CR-(4.6mm×150mm、ダイセル社製)、溶離液:HClO 水溶液(pH2.0)、流速:1.0ml/min、カラム温度:30℃、検出:210nmで行なった。このとき1分間に1μmolのL-トリプトファンを生成する酵素量を1unitと定義した。表1は、フェニルピルビン酸に対する活性を100%としたときの相対活性値を示す。
[0152]
[表1]


[0153]
  (実施例3)アミノ酸脱水素酵素のN末端アミノ酸配列および内部アミノ酸配列決定
 実施例1で得られた精製アミノ酸脱水素酵素を、逆相HPLC(カラム:YMC-Pack PROTEIN-RP(YMC社製)、溶離液:20%アセトニトリル水溶液~80%アセトニトリル水溶液のグラジエント、流速:1ml/min、カラム温度:25℃、検出:230nm)により分取精製した後、N末端のアミノ酸配列を気相プロテイン・シークエンサーPPSQ-33A(島津社製)を用いて決定した。さらに、実施例1で精製したアミノ酸脱水素酵素にV8プロテアーゼ(Wako社製)を4Mの尿素の存在下作用させて生成したポリペプチド断片を上記と同様の逆相HPLCを用いて精製した後、上記と同様の方法でアミノ酸脱水素酵素の内部アミノ酸配列を決定した。
[0154]
  (実施例4)アミノ酸脱水素酵素遺伝子の単離
 ロドコッカス キングシェンギ(Rhodococcus qingshengii)KNK2108株を、試験管内で滅菌した5mlの培地(肉エキス1.0%、ポリペプトン1.0%、イーストエキス0.5%、NaCl0.3%、滅菌前pH7.0)に植菌して30℃で38時間、好気的に振とう培養した。得られた菌体から、UltraClean Microbial DNA Isolation Kit(MO BIO Laboratories, Inc.社製)を用いて染色体DNAを調製した。N末端アミノ酸配列にもとづいて設計したDNAプライマー(Primer-1:配列表の配列番号3)と、内部アミノ酸配列にもとづいて設計したDNAプライマー(Primer-2:配列表の配列番号4)を用いて、先に得た染色体DNAを鋳型にPCRを行った。PCRは、鋳型DNA100ngにEx TaqDNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)0.25μl、10×Ex Taq Buffer(タカラバイオ社製)5μl、2.5mM各dNTP溶液4μl、20μMプライマー水溶液各2μlを添加し、さらに滅菌水を加えて総量が50μlになるように調整した反応液を調製し、熱変性(94℃、60秒)、アニーリング(48℃、60秒)、伸長反応(72℃、60秒)を30サイクル繰り返した後、4℃まで冷却することにより行なった。この結果、目的のアミノ酸脱水素酵素遺伝子の一部(部分遺伝子と称す)を取得した。この部分遺伝子の塩基配列をDNAシーケンサー3130xl Genetic Analyzer(Applied Biosystems社製)を用いて決定した。
[0155]
 次に、目的遺伝子の全長を取得するために以下の操作を行った。上記部分遺伝子において、酵素のN末端側、C末端側それぞれの部分に相当する塩基配列にもとづき、部分遺伝子の外側方向へ向けたDNAプライマー(Primer-3:配列表の配列番号5、及び、Primer-4:配列表の配列番号6)を合成した。このプライマーを用い、先に得た染色体DNAを制限酵素BamHI、あるいはHincIIで分解したものをT4 DNAリガーゼを用いて環化させて得たDNAを鋳型に、インバースPCRを行った。PCRは、基本的に上記と同様に行ったが、熱変性(96℃、30秒)、アニーリング(60℃、60秒)、伸長反応(72℃、300秒)とした。
[0156]
 これにより、既に取得した部分遺伝子のさらに外側の遺伝子部分を含むDNA断片を取得した。このDNA断片の塩基配列を上記と同様の方法で決定後、先の部分遺伝子の塩基配列と合わせることで、配列表の配列番号7に示す開始コドンから終止コドンまでを含むアミノ酸脱水素酵素遺伝子の全塩基配列を決定した。決定した全塩基配列中に、実施例3で、精製したアミノ酸脱水素酵素を用いて決定したN末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列をコードする塩基が含まれることを確認した。次にアミノ酸脱水素酵素遺伝子のN末端、C末端部分にそれぞれ制限酵素EcoRI及びKpnIの切断部位を結合させた配列を持つプライマー(Primer-5:配列表の配列番号8、Primer-6:配列表の配列番号9)を用いて、この間のDNAを先に得た染色体DNAを鋳型にPCRにより増幅することで、配列表配列番号2に示されるオープンリーディングフレームのDNA断片を取得した。PCRは、鋳型DNA100ngにPrimeSTARDNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)0.5μl、5×PrimeSTAR Buffer(タカラバイオ社製)10μl、2.5mM各dNTP溶液4μl、20μMプライマー水溶液各0.5μlを添加し、さらに滅菌水を加えて総量が50μlになるように調整した反応液を調製し、熱変性(98℃、10秒)、アニーリング(55℃、5秒)、伸長反応(72℃、90秒)を25サイクル繰り返した後、4℃まで冷却することにより行なった。
[0157]
  (実施例5)アミノ酸脱水素酵素遺伝子を発現する組換えプラスミドの作成
 実施例4で得られたDNA断片を制限酵素EcoRIとKpnIで切断し、同酵素で切断したベクタープラスミドpUCT(pUCNT(WO94/03613参照)のNdeIサイトを破壊したプラスミドベクター)とT4 DNAリガーゼを用いて結合することで、図3の制限酵素地図で表され、アミノ酸脱水素酵素遺伝子を大量に発現できるように設計されたプラスミドpRPD002を取得した。
[0158]
  (実施例6)アミノ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換え体DNAを用いた形質転換体の作成
 実施例5で得られたプラスミドpRPD002をエシェリヒア コリ(Escherichia coli)HB101のコンピテントセルと混合することで形質転換を行い、培地(トリプトン10g、イーストエキス5g、塩化ナトリウム10g、寒天15g、アンピシリン100mg、脱イオン水にて1lにメスアップ、滅菌前pH7.0、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する)にプレーティングして、アミノ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換え体DNAを含有する形質転換体エシェリヒア コリ(Escherichia coli)HB101(pRPD002)をコロニーとして取得した。
[0159]
 得られた形質転換体のコロニーを、試験管内にて滅菌した6mlの培地(トリプトン16g、イーストエキス10g、塩化ナトリウム5g、アンピシリン100mg、脱イオン水にて1lにメスアップ、滅菌前pH7.0、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する)に植菌後、37℃で24時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、0.1M Tris-塩酸緩衝液(pH8.0)に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離により菌体由来の不溶物を除去して、形質転換体のアミノ酸脱水素酵素液を取得した。得られた酵素液を用いて、実施例2に示す方法でアミノ酸脱水素酵素活性を測定したところ、アミノ酸脱水素酵素活性が確認された。
[0160]
  (実施例7)アミノ酸脱水素酵素活性菌を利用した還元アミノ化反応によるL-アミノ酸合成
 ロドコッカス キングシェンギ(Rhodococcus qingshengii)KNK2108株を、試験管内にて滅菌した6mlの実施例1記載の培地Aに植菌して30℃で48時間、好気的に振とう培養した。得られた培養液5ml分の菌体を遠心分離により集菌し、1.0mlの0.1M Tris-塩酸緩衝液(pH8.0)に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。得られた粗酵素液150μl、ナフチルピルビン酸1.5mg、硫酸アンモニウム1.9mg、NADH9.5mg、0.1M Tris-塩酸緩衝液(pH8.0)150μlを混合して、30℃で16時間反応した後、反応液を水で50倍希釈して、遠心上清をHPLCで分析し、L-ナフチルアラニンを定量した。
[0161]
 HPLC分析は次に示す条件で実施した。カラム:CHIROBIOTIC T(4.6mm×250mm、ASTEC社製)、溶離液:水/エタノール=3/7、流速:0.6ml/min、カラム温度:40℃、検出:210nm。その結果、反応収率54.6mol%でL-ナフチルアラニンが生成した。
[0162]
  (実施例8)形質転換体を利用したL-アミノ酸の合成
 実施例6で得たアミノ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体エシェリヒア コリ(Escherichia coli)HB101(pRPD002)を培養液から遠心分離により集菌し、0.1M Tris-塩酸緩衝液(pH8.0)に懸濁して超音波により菌体を破砕し、菌体破砕液を調製した。また、後述する方法で得たギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体を培養液から遠心分離により集菌し、0.1M Tris-塩酸緩衝液(pH8.0)に懸濁して超音波により菌体を破砕し、菌体破砕液を調製した。また、後述する方法で得たD-アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体を培養液から遠心分離により集菌し、0.1M Tris-塩酸緩衝液(pH8.0)に懸濁して超音波により菌体を破砕し、菌体破砕液を調製した。それらの菌体破砕液を、DL-ナフチルアラニン、DL-ホモフェニルアラニン、又はDL-トリプトファンのそれぞれに作用させて、立体反転反応により対応するL-アミノ酸を合成した。
[0163]
 ギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体の培養液は次のようにして得た。チオバシラス エスピー(Thiobacillus sp.)KNK65MA(FERM BP-7671)由来のギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体であるエシェリヒア コリ(Escherichia coli)HB101(pFT002)(FERM BP-7673)を、試験管内で滅菌した6mlの培地(トリプトン16g、イーストエキス10g、塩化ナトリウム5g、水1l、滅菌前pH7)に接種して、30℃で24時間振とう培養した。また、D-アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体の培養液は次のようにして得た。キャンディダ インターメディア(Candida intermedia)NBRC0761株由来のD-アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体であるエシェリヒア コリ(Escherichia coli)HB101(pCDA003)(FERM BP-10639)を、試験管内で滅菌した6mlの培地(トリプトン16g、イーストエキス10g、塩化ナトリウム5g、水1l、滅菌前pH7)に接種して、37℃で24時間振とう培養した。
[0164]
 (8-1)DL-ナフチルアラニンからL-ナフチルアラニンの合成
 前記のアミノ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体エシェリヒア コリ(Escherichia coli)HB101(pRPD002)の培養液10ml分、前記のD-アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体の培養液10ml分、前記のギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体培養液10ml分の各菌体を、遠心分離により集菌し、それぞれ1mlの0.1M Tris-塩酸緩衝液(pH8.0)に懸濁して超音波により菌体を破砕し、菌体破砕液を調製した。得られた菌体破砕液と、DL-ナフチルアラニン10mg、カタラーゼ(Catazyme25L、Novozyme社製)2μl、NAD 0.37mg、ギ酸アンモニウム27mg、0.1M Tris-塩酸緩衝液(pH8.0)を混合して1.0mlになるように反応液を調製し、30℃で19時間反応した。反応液を水で20倍希釈して、遠心上清をHPLCで分析し、アミノ酸を定量した。HPLC分析によるアミノ酸の定量は実施例7と同条件で実施した。その結果、ラセミ体アミノ酸に対して97.0mol%の反応収率で、光学純度100%eeのL-ナフチルアラニンが得られた。
[0165]
 (8-2)DL-ホモフェニルアラニンからL-ホモフェニルアラニンの合成
 上記実施例(8-1)と同様に調製した菌体破砕液と、DL-ホモフェニルアラニン10mg、カタラーゼ(Catazyme25L、Novozyme社製)2μl、NAD 0.37mg、ギ酸アンモニウム27mg、0.1M Tris-塩酸緩衝液(pH8.0)を混合して1.0mlになるように反応液を調製し、30℃で19時間反応した。反応液を水で20倍希釈して、遠心上清をHPLCで分析し、アミノ酸を定量した。HPLC分析によるアミノ酸の定量は実施例7と同条件で実施した。その結果、ラセミ体アミノ酸に対して98.6mol%の反応収率で、光学純度100%eeのL-ホモフェニルアラニンが得られた。
[0166]
 (8-3)DL-トリプトファンからL-トリプトファンの合成
 上記実施例(8-1)と同様に調製した菌体破砕液と、DL-トリプトファン10mg、カタラーゼ(Catazyme25L、Novozyme社製)2μl、NAD 0.37mg、ギ酸アンモニウム27mg、0.1M Tris-塩酸緩衝液(pH8.0)を混合して1.0mlになるように反応液を調製し、30℃で19時間反応した。反応液を水で20倍希釈して、遠心上清をHPLCで分析し、アミノ酸を定量した。HPLC分析によるアミノ酸の定量は実施例7と同条件で実施した。その結果、ラセミ体アミノ酸に対して94.5mol%の反応収率で、光学純度100%eeのL-トリプトファンが得られた。
[0167]
  (実施例9)アミノ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換え体DNA、及びシャペロン遺伝子を含む組換え体DNAを用いた形質転換体の作製
 実施例5で得られたプラスミドpRPD002、及び市販のシャペロンプラスミドpGro7(Takara社製、シャペロンプラスミドセット)をエシェリヒア コリ(Escherichia coli)HB101のコンピテントセルと混合し形質転換を行うことで、アミノ酸脱水素酵素遺伝子、及びシャペロン遺伝子を発現できる形質転換体エシェリヒア コリ(Escherichia coli)HB101(pRPD002、pGrO7)を作製した。
[0168]
  (実施例10)形質転換体を用いたアミノ酸脱水素酵素の生産
 実施例9で得た形質転換体エシェリヒア コリ(Escherichia coli)HB101(pRPD002、pGrO7)を、試験管内にて滅菌した6mlの培地(トリプトン16g、イーストエキス10g、塩化ナトリウム5g、アンピシリン100mg、クロラムフェニコール100mg、脱イオン水にて1lにメスアップ、滅菌前pH7.0、ただしアンピシリン、及びクロラムフェニコールは滅菌後に添加する)に接種して、30℃で24時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液1mlから遠心分離により菌体を集菌し、0.1M Tris-塩酸緩衝液(pH8.0)1mlに懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離により菌体由来の不溶物を除去して、形質転換体の無細胞抽出液(可溶性画分)を取得した。菌体由来の不溶物は、0.1M Tris-塩酸緩衝液(pH8.0)1mlで再懸濁し、これを不溶性画分溶液とした。また、実施例6で得た形質転換体エシェリヒア コリ(Escherichia coli)HB101(pRPD002)から上記と同様の方法(ただし、培地にはクロラムフェニコールを添加しない)で、形質転換体の無細胞抽出液(可溶性画分)と不溶性画分溶液を取得した。
[0169]
 それぞれの形質転換体から得た可溶性画分と不溶性画分を、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動によって分析したところ、形質転換体エシェリヒア コリ(Escherichia coli)HB101(pRPD002)では、アミノ酸脱水素酵素の大部分が、不溶性画分に存在していたのに対し、形質転換体エシェリヒア コリ(Escherichia coli)HB101(pRPD002、pGrO7)では、アミノ酸脱水素酵素の大部分が、可溶性画分に存在することが確認された。
[0170]
 また、それぞれの形質転換体から得た無細胞抽出液を用いて、実施例2に示す方法でアミノ酸脱水素酵素活性を測定したところ、形質転換体エシェリヒア コリ(Escherichia coli)HB101(pRPD002、pGrO7)から得た無細胞抽出液は、形質転換体エシェリヒア コリ(Eschesrichia coli)HB101(pRPD002)から得た無細胞抽出液の約61倍のアミノ酸脱水素酵素活性を示した。
[0171]
  (実施例11)アミノ酸脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素遺伝子を含むベクターで形質転換された形質転換体の作製
 ロドコッカス キングシェンギ(Rhodococcus qingshengii)KNK2108株(FERM BP-11067)由来のアミノ酸脱水素酵素遺伝子(配列番号2)の5’末端側にNdeI認識部位を、3’末端側にEcoRI認識部位を付加した遺伝子を、DNAポリメラーゼPrimeSTAR(宝酒造社製)を用いたPCRを行い取得した。上記のPCRで得られたDNA断片をプラスミドpUCN18(PCR法によりpUC18(タカラバイオ社製、GenBank Accession No.L09136)の185番目のTをAに改変してNdeIサイトを破壊し、更に471-472番目のGCをTGに改変することにより新たにNdeIサイトを導入したプラスミド)のlacプロモーターの下流のNdeI認識部位とEcoRI認識部位の間に挿入し、組換えベクターpNRHを構築した。構築した組換えベクターpNRHを用いて、エシェリヒア コリ(Escherichia coli)HB101コンピテントセル(タカラバイオ社製)を形質転換し、エシェリヒア コリ(Escherichia coli)HB101(pNRH)を得た。得られた形質転換体を、試験管内にて滅菌した6mlの培地(トリプトン16g、イーストエキス10g、塩化ナトリウム5g、アンピシリン100mg、脱イオン水にて1lにメスアップ、滅菌前pH7.0、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する)に接種して、30℃で24時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN社製)を用いてプラスミドpNRHを抽出した。
[0172]
 次に、チオバシラス エスピー(Thiobacillus sp.)KNK65MA(FERM BP-7671)由来のギ酸脱水素酵素遺伝子(WO03/031626記載の配列表配列番号3参照)の5’末端側にEcoRI認識部位を、3’末端側にKpnI認識部位を付加した遺伝子を、DNAポリメラーゼPrimeSTAR(宝酒造社製)を用いたPCRを行い取得した。得られたDNA断片を上記で構築したプラスミドpNRHのEcoRI認識部位とKpnI認識部位の間に挿入し、組換えベクターpNRHSFDを構築した。組換えベクターpNRHSFDを用いて、エシェリヒア コリ(Escherichia coli)HB101コンピテントセル(タカラバイオ社製)を形質転換することで、アミノ酸脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体エシェリヒア コリ(Escherichia coli)HB101(pNRHSFD)を作製した。
[0173]
  (実施例12)アミノ酸脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素遺伝子を含むベクターで形質転換された形質転換体を用いたL-ナフチルアラニンの合成
 実施例11で得た形質転換体エシェリヒア コリ(Escherichia coli)HB101(pNRHSFD)を試験管内にて滅菌した6mlの培地(トリプトン16g、イーストエキス10g、塩化ナトリウム5g、アンピシリン100mg、脱イオン水にて1lにメスアップ、滅菌前pH7.0、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する)に接種して、30℃で24時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、0.1M Tris-塩酸緩衝液(pH8.0)に懸濁して超音波により菌体を破砕し、菌体破砕液を調製した。また、実施例8と同様の方法で、D-アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体の菌体破砕液を調製した。調製したそれぞれの菌体破砕液と、DL-ナフチルアラニン10mg、カタラーゼ(Catazyme25L、Novozyme社製)2μl、NAD 0.37mg、ギ酸アンモニウム27mg、0.1M Tris-塩酸緩衝液(pH8.0)を混合して1.0mlになるように反応液を調製し、30℃で19時間反応した。反応液を水で20倍希釈して、遠心上清をHPLCで分析し、アミノ酸を定量した。HPLC分析によるアミノ酸の定量は実施例7と同条件で実施した。その結果、ラセミ体アミノ酸に対して94.2mol%の反応収率で、光学純度100%eeのL-ナフチルアラニンが得られた。
[0174]
  (実施例13)アミノ酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、及びD-アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含むベクターで形質転換された形質転換体の作製
 キャンディダ インターメディア(Candida intermedia)NBRC0761株由来のD-アミノ酸オキシダーゼ遺伝子(WO07/015511記載の配列表配列番号2参照)の5’末端側にKpnI認識部位を、3’末端側にBamHI認識部位を付加した遺伝子を、DNAポリメラーゼPrimeSTAR(宝酒造社製)を用いたPCRを行い取得した。得られたDNA断片を実施例11で構築したプラスミドpNRHSFDのKpnI認識部位とBamHI認識部位の間に挿入し、組換えベクターpNRHSFDCDAを構築した。組換えベクターpNRHSFDCDAを用いて、エシェリヒア コリ(Escherichia coli)HB101コンピテントセル(タカラバイオ社製)を形質転換することで、アミノ酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、及びD-アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体エシェリヒア コリ(Escherichia coli)HB101(pNRHSFDCDA)を作製した。
[0175]
  (実施例14)アミノ酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、及びD-アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含むベクターで形質転換された形質転換体を利用したL-アミノ酸の合成
 (14-1)DL-ナフチルアラニンからL-ナフチルアラニンの合成
 実施例13で作製したアミノ酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、及びD-アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体エシェリヒア コリ(Escherichia coli)HB101(pNRHSFDCDA)を、試験管内にて滅菌した6mlの培地(トリプトン16g、イーストエキス10g、塩化ナトリウム5g、アンピシリン100mg、脱イオン水にて1lにメスアップ、滅菌前pH7.0、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する)に接種して、30℃で24時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液10ml分から遠心分離により菌体を集菌し、1mlの0.1M Tris-塩酸緩衝液(pH8.0)に懸濁することで菌体濃縮液を調製した。得られた菌体濃縮液と、DL-ナフチルアラニン10mg、カタラーゼ(Catazyme25L、Novozyme社製)2μl、NAD 0.37mg、ギ酸アンモニウム27mg、0.1M Tris-塩酸緩衝液(pH8.0)を混合して1.0mlになるように反応液を調製し、30℃で24時間反応した。反応液を水で20倍希釈して、遠心上清をHPLCで分析し、アミノ酸を定量した。HPLC分析によるアミノ酸の定量は実施例7と同条件で実施した。その結果、ラセミ体アミノ酸に対して89.6mol%の反応収率で、光学純度95.9%eeのL-ナフチルアラニンが得られた。
[0176]
 (14-2)DL-ホモフェニルアラニンからL-ホモフェニルアラニンの合成
 上記実施例(14-1)と同様に調製した菌体濃縮液と、DL-ホモフェニルアラニン10mg、カタラーゼ(Catazyme25L、Novozyme社製)2μl、NAD 0.37mg、ギ酸アンモニウム27mg、0.1M Tris-塩酸緩衝液(pH8.0)を混合して1.0mlになるように反応液を調製し、30℃で24時間反応した。反応液を水で20倍希釈して、遠心上清をHPLCで分析し、アミノ酸を定量した。HPLC分析によるアミノ酸の定量は実施例7と同条件で実施した。その結果、ラセミ体アミノ酸に対して102.7mol%の反応収率で、光学純度100%eeのL-ホモフェニルアラニンが得られた。
[0177]
 (14-3)DL-トリプトファンからL-トリプトファンの合成
 上記実施例(14-1)と同様に調製した菌体濃縮液と、DL-トリプトファン10mg、カタラーゼ(Catazyme25L、Novozyme社製)2μl、NAD 0.37mg、ギ酸アンモニウム27mg、0.1M Tris-塩酸緩衝液(pH8.0)を混合して1.0mlになるように反応液を調製し、30℃で24時間反応した。反応液を水で20倍希釈して、遠心上清をHPLCで分析し、アミノ酸を定量した。HPLC分析によるアミノ酸の定量は実施例7と同条件で実施した。その結果、ラセミ体アミノ酸に対して97.3mol%の反応収率で、光学純度100%eeのL-トリプトファンが得られた。

請求の範囲

[請求項1]
 以下の(a)、(b)、(c)、(d)、(e)又は(f)のDNA:
(a)配列表配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA;
(b)配列表配列番号1に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA;
(c)配列表配列番号1に示されるアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA;
(d)配列表配列番号2に示される塩基配列からなるDNA;
(e)配列表配列番号2に示される塩基配列において1若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および/または付加された塩基配列を有し、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA;
(f) 配列表配列番号2に示される塩基配列と70%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
[請求項2]
 以下の(g)、(h)又は(i)のポリペプチド:
(g)配列表配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(h)配列表配列番号1に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド;
(i)配列表配列番号1に示されるアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
[請求項3]
 アミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドであって、
一般式(1)
[化1]


(式中、R'は置換基を有していてもよい炭素数5~20のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数5~20のアルケニル基、置換基を有していてもよい炭素数5~20のアルキニル基、置換基を有していてもよい炭素数4~20のアリール基、または置換基を有していてもよい炭素数5~20のアラルキル基を示す。また、Xは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を示す。)で表される2-オキソ酸に対する活性を有し、かつナフチルピルビン酸に対する活性が、フェニルピルビン酸に対する活性の1/50以上であるポリペプチド。
[請求項4]
 上記一般式(1)において、R'がインドリルメチル基あるいはフェニルエチル基である請求項3記載のポリペプチド。
[請求項5]
ロドコッカス(Rhodococcus)由来である請求項2から4のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[請求項6]
ロドコッカス キングシェンギ(Rhodococcus qingshengii)由来である請求項2から5のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[請求項7]
ロドコッカス キングシェンギ(Rhodococcus qingshengii)KNK2108由来である請求項2から6のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[請求項8]
請求項1記載のDNAをベクターに挿入して得られる組換えプラスミド。
[請求項9]
請求項8記載の組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体。
[請求項10]
請求項1記載のDNA、及びシャペロンをコードするDNAで形質転換して得られる形質転換体。
[請求項11]
前記宿主微生物がエシェリヒア コリ(Escherichia coli)である請求項9又は10に記載の形質転換体。
[請求項12]
請求項2から4のいずれか1項に記載のポリペプチドを生産する能力を有し、かつ、ロドコッカス(Rhodococcus)属に属する微生物。
[請求項13]
ロドコッカス キングシェンギ(Rhodococcus qingshengii)である請求項12記載の微生物。
[請求項14]
ロドコッカス キングシェンギ(Rhodococcus qingshengii)KNK2108である請求項12記載の微生物。
[請求項15]
請求項2から7のいずれか1項に記載のポリペプチドを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物中に当該ポリペプチドを蓄積させ、これを採取するアミノ酸脱水素酵素の製造方法。
[請求項16]
前記微生物が、請求項9又は10記載の形質転換体、又は、請求項12記載の微生物である、請求項15に記載のアミノ酸脱水素酵素の製造方法。
[請求項17]
請求項2から7のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項9又は10記載の形質転換体、または請求項12の微生物を、
一般式(2)
[化2]


(式中、Rは置換基を有していてもよい炭素数1~20のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数2~20のアルケニル基、置換基を有していてもよい炭素数2~20のアルキニル基、置換基を有していてもよい炭素数4~20のアリール基、または置換基を有していてもよい炭素数5~20のアラルキル基を示す。Xは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を示す。)で表される2-オキソ酸に作用させ、
一般式(3)
[化3]


(式中、RおよびXは前記と同じ)で表されるL-アミノ酸を製造する方法。
[請求項18]
還元型補酵素再生能を有する酵素の存在下にて行う、請求項17記載のL-アミノ酸の製造方法。
[請求項19]
請求項2から7のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項9又は10記載の形質転換体、または請求項12の微生物を、D-アミノ酸オキシダーゼ存在下、
一般式(4)
[化4]


(式中、RおよびXは前記と同じ)で表されるラセミ体アミノ酸、又は
一般式(5)
[化5]


(式中、RおよびXは前記と同じ)で表されるD-アミノ酸に作用させ、
一般式(3)
[化6]


(式中、RおよびXは前記と同じ)で表されるL-アミノ酸を製造する方法。
[請求項20]
還元型補酵素再生能を有する酵素の存在下にて行う、請求項19記載のL-アミノ酸の製造方法。
[請求項21]
カタラーゼ存在下にて行う、請求項19又は20記載のL-アミノ酸の製造方法。
[請求項22]
請求項2から7のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項9又は10記載の形質転換体、または請求項12の微生物を、
一般式(3)
[化7]


(式中、RおよびXは前記と同じ)で表されるL-アミノ酸、又は
一般式(4)
[化8]


(式中、RおよびXは前記と同じ)で表されるラセミ体アミノ酸に作用させ、
一般式(2)
[化9]


(式中、RおよびXは前記と同じ)で表される2-オキソ酸、又は
一般式(5)
[化10]


(式中、RおよびXは前記と同じ)で表されるD-アミノ酸を製造する方法。
[請求項23]
酸化型補酵素再性能を有する酵素の存在下にて行う、請求項22記載の2-オキソ酸、又はD-アミノ酸の製造方法。
[請求項24]
前記ポリペプチドが請求項9又は10に記載の形質転換体、又は請求項12記載の微生物が生産するアミノ酸脱水素酵素である、請求項17から21のいずれか1項に記載のL-アミノ酸の製造方法。
[請求項25]
前記ポリペプチドが請求項9又は10に記載の形質転換体、又は請求項12記載の微生物が生産するアミノ酸脱水素酵素である、請求項22又は23に記載の2-オキソ酸、又はD-アミノ酸の製造方法。

図面

[ 図 1]

[ 図 2]

[ 図 3]