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1. (WO2008123408) 3次元顕微鏡および3次元画像取得方法
Document

明 細 書

発明の名称 3次元顕微鏡および3次元画像取得方法

技術分野

0001  

背景技術

0002   0003   0004   0005   0006   0007   0008  

発明の開示

発明が解決しようとする課題

0009   0010  

課題を解決するための手段

0011   0012  

発明の効果

0013  

図面の簡単な説明

0014  

発明を実施するための最良の形態

0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061   0062   0063   0064   0065   0066   0067   0068   0069   0070   0071   0072   0073   0074   0075   0076   0077   0078   0079   0080   0081  

請求の範囲

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16  

図面

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  

明 細 書

3次元顕微鏡および3次元画像取得方法

技術分野

[0001]
 本発明は、3次元顕微鏡および3次元画像取得方法に関する。

背景技術

[0002]
 生物学、医学および薬学などの分野において利用される顕微鏡などの観察装置として、以下のものが開発されている。
[0003]
 共焦点顕微鏡は生物、医療、薬学等の分野で広く利用されている。共焦点顕微鏡においては、試料を染色しなければならず、生きたままの細胞を見るには不向きである。共焦点顕微鏡において、試料を染色しないでも画像が得られるが、生体試料のような弱散乱物体の場合は透過共焦点顕微鏡では像のコントラストが悪くなり、反射共焦点顕微鏡では正確な物体像を再現できない。
[0004]
 非線形顕微鏡は、試料を染色しないで観察するためのツールとして開発された。非線形顕微鏡においては、第二高調波(SHG)、 第三高調波(THG)、 コヒーレント・アンチストークス・ラマン散乱(CARS)などが利用されている。非線形顕微鏡は、光源にハイパワーのパルスレーザーを使用するので使い勝手が良くない。
[0005]
 位相差顕微鏡は、透明物体を高コントラストな像に変換するので、生体試料を観測するのに最も簡便に使える道具の一つである。しかし、位相差顕微鏡によっては、2次元画像しか得られない。
[0006]
 ホログラフィーによれば3次元画像が得られるが、分解能が不十分である。ホログラフィーを使用した顕微鏡技術は、たとえば非特許文献1に記載されている。
[0007]
 光学コヒーレント・トモグラフィー(OCT)は生体試料を観察するための優れたデバイスである。しかし、OCTにおいては、光源のスペクトル幅で奥行き分解能が決まり、分解能を上げるためには広帯域光源開発が必須である。
[0008]
他方、工業用途として、たとえば、ガラス内部の欠陥の画像化に対するニーズがある。しかし、屈折率分布と吸収率分布を分離して3次元的に画像化する装置は開発されてない。
非特許文献1 : Etienne Cuche, Pierre Marquet and Christian Depeursinge, “Simultaneous amplitude-contrast and quantitative phase-contrast microscopy by numerical reconstruction of Fresnel off-axis holograms”, Appl. Opt. 38, 6994-7001(1999)

発明の開示

発明が解決しようとする課題

[0009]
 したがって、生物学、医学および薬学などの分野において、高い3次元分解能を有し、試料を染色する必要がなく、使い勝手のよい顕微鏡に対するニーズがある。
[0010]
 また、工業用途として、屈折率分布と吸収率分布を分離して3次元的に画像化する顕微鏡に対するニーズがある。

課題を解決するための手段

[0011]
 本発明を例示する第1の態様に従えば、物体に対して光を複数の照射方向から順次照射する第1光学系と、前記物体から発生する回折光と参照光とを撮像部に導く第2光学系と、前記回折光と前記参照光との干渉像を撮像する撮像部と、前記撮像部によって取得された前記照射方向ごとの干渉像から前記物体の3次元画像を生成する処理装置と、を含み、前記処理装置は、前記照射方向ごとの干渉像から前記回折光の複素振幅を求め、該複素振幅から前記物体の3次元画像を生成するように構成されたことを特徴とする3次元顕微鏡が提供される。
[0012]
 本発明を例示する第2の態様に従えば、物体に対して光を複数の照射方向の平面波で順次照射し、前記物体から発生する回折光と参照光との干渉像を照射方向ごとに取得し、照射方向ごとに取得された干渉像から前記回折光の複素振幅を求め、該複素振幅から前記物体の3次元画像を生成することを特徴とする3次元画像生成方法が提供される。

発明の効果

[0013]
本発明によれば、高い3次元分解能を有し、試料を染色する必要がなく、使い勝手のよい顕微鏡が得られる。

図面の簡単な説明

[0014]
[図1] 本発明の一実施形態による3次元顕微鏡の構成を示す図である。
[図2] 2次元撮像装置の構成を示す図である。
[図3] 試料ホルダおよび2枚の第1対物を示す図である。
[図4] ホログラム・データから3次元画像を生成する方法を示す流れ図である。
[図5] ホログラム・データから3次元画像を生成する方法を示す流れ図である。
[図6] ホログラム・データから3次元画像を生成する方法を示す流れ図である。
[図7] ホログラム・データから3次元画像を生成する方法を説明するための図である。
[図8] ホログラム・データから3次元画像を生成する方法を説明するための図である。
[図9] 透過側および反射側の2個の瞳関数からなる3次元入射瞳関数を示す図である。
[図10] 水中の第1対物レンズについて、NA=1.2である場合のOTFを示す図である。

発明を実施するための最良の形態

[0015]
 図1は本発明の一実施形態による3次元顕微鏡の構成を示す図である。
[0016]
 本実施形態による3次元顕微鏡においては、光源101からの光を、平面波として試料ホルダ119内の試料物体(以下、単に物体とも呼称する)に照射し、物体のフーリエ面上に配置された2次元撮像装置165上において物体光と参照光とを干渉させてホログラム・データ(干渉像)を生成する。光源101からの光を物体に照射する際に、傾きを変えることのできる走査ミラー(両面ミラー)103によって照射方向を変化させ、照射方向ごとにホログラム・データ(干渉像)を生成し取得する。2次元撮像装置165によって取得された、照射方向ごとのホログラム・データを処理装置201によって処理することにより物体の3次元画像を生成する。以下に詳細に説明する。
[0017]
 図1に示した光学系において、全ての連続する2つのレンズの組は無限遠系結像系になっている。
[0018]
 光源101としてホログラム用の安定でコヒーレント長の長い近赤外レーザー(波長850nm)を用いる。
[0019]
 光源101によって生成され、第1光学系によって物体に照射される光について説明する。光源101からの光の偏光方向は、紙面に垂直な偏光(S偏光)である。光源101からの光は、走査ミラー103およびミラー105によって反射され、ビームスプリッタ107および第2対物レンズ109を透過し、偏光ビームスプリッタ111によって反射される。その後、光源101からの光は、偏光素子113を透過し、ミラー115によって反射され、2枚の第1対物レンズの一方117を透過し、平面波として試料ホルダ119内の物体に照射される。偏光素子113は、ノイズを除去するために設置されている。
[0020]
 ここで、走査ミラー103は、光源101からの光が試料ホルダ119内の物体を2次元的に走査するように傾きを変えることができるように構成されている。光源101からの光の物体に対する最大入射角度は約64°、第1対物レンズ117の物体側の開口数(NA)は水浸状態で1.2である。第2対物レンズ109の焦点距離は第1対物レンズ117の焦点距離の60倍であるため、走査ミラー103の最大傾き角度は約1°である。
[0021]
 物体によって散乱されず物体をそのまま透過した0次光について説明する。0次光は、2枚の第1対物レンズの他方121を透過し、半波長板123を透過する。0次光は、半波長板123を透過することによってP偏光に変えられる。その後、0次光は、ミラー125によって反射され、偏光素子127、偏光ビームスプリッタ111および第2対物レンズ109を透過し、ビームスプリッタ107およびミラー129によって反射され、走査ミラー103に到達する。ここで、偏光素子127は、ノイズを除去するために設置されている。走査ミラー103の中心は、光軸上における試料物体の中心の共役位置に配置されている。0次光の方向は、走査ミラー(両面ミラー)103によって反射されることによって、傾いていない走査ミラー103によって反射された方向と同一の方向となる。すなわち、0次光の方向は、走査ミラー103の傾きに無関係に一定の方向となる。その後、0次光は、わずかな透過率を有する直径約200μmの微小ミラー137に到達する。ここで、微小ミラー137は、2枚の第1対物レンズ117および121の共通焦点面(物体の中心面)のフーリエ面に位置する。0次光の大部分は、微小ミラー137に反射され、コリメートレンズ163によってコリメートされた後、参照光として使われる。このように、0次光は、第2光学系によって2次元撮像装置165に到達する。微小ミラー137を透過した一部の0次光については後で説明する。
[0022]
 物体によって散乱された透過回折光について説明する。透過回折光は、0次光と同様の経路を通り、2枚の第1対物レンズ117および121の共通焦点面(物体の中心面)のフーリエ面に位置する微小ミラー137で一部(低周波成分)はカットされる。透過回折光の残りは、微小ミラー137によって反射されずに進行し、偏光ビームスプリッタ143および149を透過し、2枚の第1対物レンズ117および119の共通焦点面のフーリエ面または微小ミラー137の共役位置に配置された2次元撮像装置165に到達する。このように、透過回折光は、第2光学系によって2次元撮像装置165に到達する。
[0023]
 物体によって散乱された反射回折光について説明する。反射回折光は、第1の対物レンズ117を透過した後、ミラー115、偏光ビームスプリッタ111、ビームスプリッタ107、ミラー129および走査ミラー(両面ミラー)103によって反射される。その後、反射回折光の一部は、微小ミラー137でカットされるが、残りは、微小ミラー137によって反射されずに進行し、偏光ビームスプリッタ143、ミラー151および偏光ビームスプリッタ149で反射され、半波長板155を透過する。反射回折光の偏光は、半波長板155を透過することによって、P偏光に変えられる。その後、反射回折光は、ビームスプリッタ157を透過し、2次元撮像装置165に到達する。このように、反射回折光は、第2光学系によって2次元撮像装置165に到達する。
[0024]
 わずかな透過率を有する微小ミラー137を透過した一部の0次光は、微小1/4波長板139を透過する。一部の0次光は、微小1/4波長板139を透過することによって円偏光にされた後、偏光ビームスプリッタ143によって2成分に分離される。2成分は、それぞれ、透過回折光および反射回折光とともに2次元撮像装置165に到達する。
[0025]
 図2は、2次元撮像装置165の構成を示す図である。2次元撮像装置165は、透過回折光用撮像装置と反射回折光用撮像装置とを含む。2次元撮像装置165は、たとえば、CCDやCMOSを含むデジタルカメラである。透過回折光用撮像装置および反射回折光用撮像装置は、たとえば、1024x1024個の画素をそれぞれ備える。透過回折光、反射回折光および参照光は、2次元撮像装置165の観察面においてP偏光であるので、透過回折光および反射回折光は、参照光と干渉し、透過回折光用撮像装置および反射回折光用撮像装置によってホログラム・データを取得することができる。
[0026]
 走査ミラー103によって、光源101からの光の試料物体への照射方向が変化しても、走査ミラー103の中心は、光軸上における試料物体の中心の共役位置に配置されているので、透過回折光および反射回折光は、2次元撮像装置165に対して垂直に入射する。光源101からの光の試料物体への照射方向が変化すると、透過回折光用撮像装置上における透過回折光の円形領域は、透過回折光用撮像装置上において移動し、反射回折光用撮像装置における反射回折光の円形領域は、反射回折光用撮像装置上において移動する。図2に示すように、0次光(参照光)は、透過回折光用撮像装置および反射回折光用撮像装置の観察面の中心位置で固定される。0次光(参照光)の方向は、走査ミラー103の傾きに無関係に一定の方向となり、常に微小ミラー137の中心で反射されるので、0次光(参照光)の2次元撮像装置165に対する入射角度は、光源101からの光の試料物体への照射方向が変化しても変化しない。走査ミラー103によって、光源101からの光の試料物体への照射方向を変化させて、照射方向ごとに、透過回折光用撮像装置および反射回折光用撮像装置によってホログラム・データを取得する。
[0027]
 図3は、試料ホルダ119、および2枚の第1対物レンズ117、121を示す図である。本実施形態において第1対物レンズ117、121は、フーリエレンズである。フーリエレンズにおいて、瞳の収差は適切に補正され、
[数1]


の条件が満たされる。ここで、hは瞳面における主光線の高さ、Fは焦点距離、θは、物体面の中心から放射された主光線の、光軸に対する角度を表す。第1対物レンズ117、121の物体側の開口数(NA)は、水浸状態で1.2であり、検出面側の開口数(NA)は、空気中で0.0075である。第2対物レンズ109の焦点距離は200mmであり、第1対物レンズ117、121の倍率が60倍であれば、第1対物レンズ117、121の焦点距離は、水中で約4.4mmである。試料における視野は、約50μmである。2次元撮像装置165は、第1対物レンズ117、121の瞳面に共役に配置される。第1対物レンズ117、121の瞳面と2次元撮像装置165の検出面との間の光学系が、倍率βの像形成光学系であるとすると、
[数2]


となる。ここで、NA 0は、第1対物レンズ117および121の物体側の開口数、μは、2次元撮像装置165の1画素の幅、Nは、2次元撮像装置165の1辺に対応する画素数を示す。2次元撮像装置165の1辺の長さは、μNであり、2次元撮像装置165上の回折光による円形領域の直径の2倍である。
[0028]
 試料の観察可能体積は、試料の両側の2個の開口板1191および1193の円形開口部によって制限される。開口部の直径は、照射光の断面の3倍であり、試料の厚さの3倍である。照射光は、第1対物レンズ117の瞳面上の1点に収束した後に、平面波に変換され、試料に入射する。開口面上の照射光の断面は、入射角度に関係なく円形となる。このことは、フーリエレンズの特徴の一つである。第1対物レンズ121の瞳面上における散乱光の開口数は、絞りにより0次光の開口数の3倍に制限される。
[0029]
 2次元撮像装置165の検出面で回折光と参照光とが干渉した光強度(ホログラム・データ)を検出し、デジタルホログラム技術により光強度を回折光の振幅に変換する。その際、図1のように参照光の検出面の法線に対する入射角度をφとすると、
[数3]


となるように角度を調整する。ここで、λは参照光の波長、μは2次元撮像装置165の1画素の幅である。つまり、検出面上の参照光の位相の1周期が4画素分になるようにする。図2に示す透過回折光用撮像装置および反射回折光用撮像装置の1辺に対応する空間周波数の差は
[数4]


に設定してある。ここで、NA 0は、第1対物レンズ117および121の物体側の開口数である。上記空間周波数のフーリエ変換に対応する実空間における物体のサイズDは
[数5]


となる。ここで、Nは、透過回折光用撮像装置および反射回折光用撮像装置の1辺に対応する画素数である。開口板1191および1193の円形開口部の直径Rと物体の直径Dは
[数6]


の関係を有する。
[数7]


であるとすると、実空間において再現される物体のサイズD/4は、約45μmである。また、分解能λ/(2NA 0)は、354nmである。
[0030]
 本実施形態においては、試料物体に対して、照射光の2次元走査を行うことによってホログラム・データを取得し、該ホログラム・データに基づいて試料物体の3次元画像を生成する。3次元画像に対する3次元マトリクスのサイズが256 3であるとすると、最大解像度を得るには、128 2×π/4の走査方向(照射方向)が必要である。ここで、係数π/4は、円形瞳を意味する。走査方向の数は、画像の質と走査時間とを考慮して減少させてもよい。
[0031]
 ホログラム・データから3次元画像を生成する方法について以下に説明する。
[0032]
 3次元物体の光散乱振幅(複素振幅)
[数8]


で与えられる。ここで、係数εは十分に小さい実数を表す。また、
[数9]


は屈折率分布による光散乱振幅であり、
[数10]


は平均屈折率に対する比屈折率分布を表している。
[数11]


は、吸収率分布を示している。吸収率分布による散乱光と屈折率分布による散乱光は位相がπ/2ずれる。物体によって散乱されず、物体をそのまま透過する0次光は式(1)における右辺第1項の1に対応している。
[0033]
 上記の散乱光振幅を物体のフーリエ面(2次元撮像装置165の検出面)で観測したホログラム・データは、
[数12]


をフーリエ変換したものに対応する。ホログラム・データにおいて、0次光に対応する部分は、座標原点のデルタ関数となる。
[0034]
 可視化した3次元像は、散乱振幅
[数13]


の絶対値の2乗に対応する。そこで、そのまま散乱振幅の絶対値の2乗をとると、
[数14]


となり、DC(直流)成分に吸収率分布が加わったものが得られる。このDC成分を抑えればコントラストの高い像となる。εの2乗の項は小さいため無視される。
[0035]
 つぎに、散乱振幅の0次光の位相をπ/2ずらして絶対値の2乗をとると、
[数15]


となり、DC成分に屈折率分布が加わったものが得られる。このDC成分を抑えればコントラストの高い像となる。εの2乗の項は小さいため無視される。
[0036]
 このように、式(2)および(3)に基づいて、吸収率分布の3次元画像および屈折率分布の3次元画像を分離して生成することができる。
[0037]
 図4乃至図6は、ホログラム・データから3次元画像を生成する方法を示す流れ図である。図4乃至図6に示した方法は、処理装置201によって実行される。処理装置201は、走査ミラー103に照射方向を設定し、2次元撮像装置165から照射方向ごとのホログラム・データを受け取る。
[0038]
 図7および図8は、ホログラム・データから3次元画像を生成する方法を説明するための図である。
[0039]
 図4のステップS0410において、ホログラム・データをフーリエ変換する。光源101からの、全ての照射方向の光によって生成された透過回折光および反射回折光のホログラム・データを、2次元撮像装置165によって取得した後、NxN画素のホログラム・データを処理装置201によってフーリエ変換する。
[0040]
 演算の結果、図7(A)の右上に示すように、物体波の複素振幅が一方の側に得られ、共役物体波の複素振幅が他方の側に現れる。なお、図7(A)では、反射回折光の成分の図示を省略し、透過回折光の成分のみを示している。
[数16]


[0041]
の関係により、物体波と共役物体波は重なるが、サイズがN/4である、物体波と共役物体波の中央部分は重ならない。参照光の発光は、図1に示す減衰器159によって、最大強度の位置において透過光の約100倍(振幅で10倍)に調整されるので、直流光によって生成される中央の明るいスポットのみが現れる。減衰量を調整することができるように、参照光の光路に減衰量の異なる複数の減衰器を選択的に配置することができるようにしてもよい。中央の明るいスポット周囲に現れると考えられる物体波の自己相関は無視しうる。
[0042]
 図4のステップS0420において、図7(A)の右下に示すように
[数17]


の物体波の部分が切り取られ、再現される物体のサイズは、D/4に制限される。切り取られた2次元マトリクスに逆フーリエ変換が施され、瞳面における回折光の複素振幅が得られる。
[0043]
 図4のステップS0430において、図7(A)の左下に示すように、直径N/8の円が切り取られる。そして、図7(B)に示すように、透過回折光の成分および反射回折光の成分のそれぞれが、波数空間にマップされた「部分球面」に投影される。第1対物レンズの入射瞳は無限遠に位置し、参照球面の半径は無限大であるため、回折光が到達する検出面を波数空間として扱うのが便利である(例えば、渋谷眞人・大木裕史著 ”光学ライブラリー1 回折と結像の光学” 朝倉書店 P17~P24を参照)。部分球面は、
[数18]


要素の3次元マトリクス内に存在する。図7(B)に示すように、部分球面上の要素以外の全ての要素の複素振幅は、ゼロに設定される。このステップにおいて、複素振幅は部分球面上に、Z方向(周波数空間における光軸方向)に投影される。部分球面の(x,y)要素がZ方向における2個の3D画素からなる場合に、振幅は2個の3D画素に均等に分配される。このステップは、実空間においてアーティファクトを生じうるが、Z方向に数個の要素を含むガウス関数によってコンボリューションをとった部分球面を使用することによって誤差は減少する。部分球面がデジタル化された後、複素振幅は、ガウス分布の重みをつけてデジタル部分球面に投影される。この場合に、Z方向の実空間における画像の周辺の強度は弱くなる。
[0044]
 図8(A)に示すように、照明光が試料に照射され、0次光(直接透過光)と透過回折光は透過回折光用撮像装置に到達し、0次光と反射回折光は反射回折光用撮像装置に到達する。これらの回折光(0次光も含む)は前述のとおり、参照光との干渉縞として撮像され、処理装置によって回折光の複素振幅が得られ、透過回折光および反射回折光の複素振幅はそれぞれ部分球面に光軸方向に投影される。そして、図8(B)に示すように、周波数空間内のそれぞれの部分球面は、0次光が周波数原点に一致するように配置される。このように構成することにより、系の光学伝達関数(OFT)の物理的性質を描写することができる。物体の構造はフーリエ変換により、無数の3次元格子に分解されるが、それぞれの格子において、法線方向をベクトルの向き、空間周波数をベクトルの大きさとしてもつベクトルを格子ベクトルと呼称する。系が、それぞれの部分球面に対応するホログラムの測定の段階で誤差を有しなければ、周波数空間の原点の偏角はゼロである。0次光に対応する複素振幅は、透過成分の部分球面S T上に存在する。反射成分の部分球面S に対しては、0次光の複素振幅は、反射成分の部分球面S から離れ、原点(透過成分の部分球面S T上に存在する)に位置する。反射成分の部分球面S は、2次元撮像装置165上において0次光が撮像素子に到達する位置に対応する位置に穴を有する。すなわち、反射成分に対して、2次元撮像装置165上に到達する0次光は、反射成分の部分球面S から引かれ、反射成分の位相誤差補正に使用される。反射成分に対する部分球面および0次光は同一の球上に存在する。透過成分および反射成分に対する2個の3次元マトリクスは加えられ、互いに向かい合う2個の部分球面からなるマトリクスが得られる。同一の半径および曲率を有する2個の部分球面からなるマトリクスを、以下においてツイン球面と呼称する。
[0045]
 図4のステップS0440において、ツイン球面から物体の3次元画像を求める。全ての照明方向に対して、ツイン球面の複素振幅を計算した後、図8(C)に示すように、0次光に対応する位置が3次元マトリクスの原点に配置されるようにそれぞれのツイン球面を並行移動する。
[0046]
 測定中の温度変化や振動によって、透過回折光、反射回折光および参照光の3経路の間で相対的な光路長の差が変化しうる。複数回の測定の間で、それぞれのホログラムに対する位相差が発生しうる。すなわち、透過回折光、反射回折光および参照光の3経路の間の相対的な光路長の変化に対して、ツイン球面の透過成分および反射成分の相対的な位相差が存在する。上記位相差を最小とするために、ツイン球面を形成するように2個の部分球面を加える前に、透過(反射) 成分に対する部分球面は、透過(反射) 成分用の2次元撮像装置に到達する0次光の位相項で割られる。このように、0次光によってそれぞれのホログラムに対する位相補正が行われ、3次元マトリクスの原点における位相はゼロであることが保障される。
[0047]
 また、図1に示すように、試料ホルダ119および偏光ビームスプリッタ111を含むループ部分110において、透過回折光(0次光を含む)および反射回折光の相対光路長は、測定中に波長オーダーで変化し、それが位相誤差として残る可能性がある。そこで、ループ部分110を堅固な構造としてもよい。
[0048]
 ツイン球面から物体の3次元画像を求める方法は二つある。以下に、二つの方法について説明する。
[0049]
 図5は、第1の方法を示す流れ図である。
[0050]
 図5のステップS0510において、吸収率分布の3次元画像を求める場合には、照射方向ごとに、ツイン球面をフーリエ変換し絶対値の2乗を計算する。屈折率分布の3次元画像を求める場合には、照射方向ごとに、0次光のみにπ/2の位相シフトを加えた後、ツイン球面をフーリエ変換し絶対値の2乗を計算する。
[0051]
 図5のステップS0520において、全ての照射方向に対する絶対値の2乗を加算することによって、実空間において
[数19]


のサイズの物体の3次元画像が得られる。第1の方法は、従来のケーラー照明光学系による像形成に対応している。
[0052]
 図6は、第2の方法を示す流れ図である。
[0053]
 図6のステップS0610において、全ての照射方向に対するツイン球面の3次元マトリクスをコヒーレントに加算することによって周波数領域における合計振幅が得られる。
[0054]
 図6のステップS0620において、吸収率分布の3次元画像を求める場合には、合計振幅をフーリエ変換し絶対値の2乗を取ることによって物体の3次元画像が得られる。屈折率分布の3次元画像を求める場合には、3次元マトリクスの原点にπ/2の位相シフトを加えた後、合計振幅をフーリエ変換し絶対値の2乗を取ることによって物体強度が再現される。
[0055]
 試料物体が低コントラスト物体であれば、第1の方法および第2の方法によって得られる像は同一の光学特性を有する。
[0056]
 本発明による3次元顕微鏡により、屈折率分布と吸収分布を有する物体の、屈折率分布の3次元画像および吸収分布の屈折率分布の3次元画像が分離して得られる。
[0057]
 第1の方法および第2の方法を、以下においてより詳細に説明する。
[0058]
 図9は、透過側および反射側の2個の瞳関数からなる3次元入射瞳関数を示す図である。瞳関数は、周波数空間にあると考える。
[0059]
 透過側に対する3次元瞳関数
[数20]


および反射側に対する3次元瞳関数
[数21]


を考える。ここで、
[数22]


である。ここで、アスタリスクは複素共役を表す。簡単のために、透過(反射)側に対する瞳関数は、部分球面上で1であり、瞳球の外側で0であると仮定する。すなわち、
[数23]


光源からの光の波数
[数24]


が瞳関数
[数25]


上を走査され、物体から発生した回折光が、瞳
[数26]


の両側を通って伝達される。0次光の振幅は、2次元撮像装置165に到達する前に係数
[数27]


により減衰器159によって減衰される。物体の振幅が
[数28]


によって与えられると、光源からの光の所定の波数
[数29]


に対して、ツイン球面上の複素振幅は、
[数30]


となる。ここで、吸収物体の場合はそのままの0(x)を用い、位相物体の場合は0次光の位相をπ/2シフトさせた0(x)を用いる。このとき、全体の位相を適当に選べば、0(x)を実数にすることができる。
[0060]
 第1の方法に基づいて、再現される物体の画像の放射照度は、
[数31]


となる。ここで、
[数32]


である。式(5)においては、複素振幅のフーリエ変換の絶対値の2乗が、照射方向に関して積分されている。
[0061]
 3次元入射瞳関数
[数33]


のフーリエ変換は、3次元コヒーレント点像分布関数(point spread function)
[数34]


に等しい。点像分布関数は、以下の関係を有する。
[数35]


瞳関数は、光軸に回転対称であるので、
[数36]


となる。ここで、
[数37]


であり、上記は、3次元相互強度(3-D mutual intensity)と呼称される。
[0062]
 低コントラスト物体
[数38]


を考える。ここで、係数ε は十分に小さな実数、o(x)はDC成分を除いた光散乱振幅を表す。ただし、
[数39]


である。式(6)に
[数40]


を挿入することによって、
[数41]


となる。ここで、最後の項においてパーシバルの定理
[数42]


および
[数43]


を使用し、
ε 0
の2次項は無視する。さらに簡単な計算により、
[数44]


となる。ここで、
[数45]


であり、
[数46]


は、
[数47]


のフーリエ変換である。3次元光学伝達関数(OTF)は、
[数48]


と定義される。光学伝達関数は、入射瞳
[数49]


と光源からの光に対する透過側の瞳
[数50]


との間の相関関数に等しい。すなわち、
[数51]


である。
[0063]
 図10は、水中の第1対物レンズについて、NA=1.2である場合のOTFを示す図である。OTFは、
[数52]


方向に回転対称であり、光軸の方向における空間周波数である。図10には、
[数53]


軸を含む断面が描かれている。従来の位相差顕微鏡技術と同様に、0次光の付近を伝播する散乱波は、微小ミラーによってさえぎられるので、光軸に沿った空間周波数は、透過成分および反射成分の両方に分解することはできないことに留意すべきである。深さ分解能は、反射成分から得られ、反射成分に対応するOFTの部分は、失われた円錐形(missing cone)として知られる領域に位置する。透過成分および反射成分に対応するOFTの二つの部分のギャップが存在し、該ギャップにおける空間周波数は分解できないが、より大きなNAの対物レンズを使用することによって減少させることができる。
[0064]
 物体の複素振幅が、低コントラスト屈折率分布を有する3次元位相物体に対して成立する実数値関数
[数54]


であれば、式(8)は、
[数55]


は、3次元点像分布関数である。低コントラスト物体
[数56]


に変換することができる。このことは、物体の当初のコントラストは、
0
は、0次光の減衰によって
[数57]


まで強められる。最終的に、物体の再現に対する簡単な式
[数58]


が得られる。上記の方法によって再現された画像の放射照度は、強調されたコントラストを有する、物体強度の、3次元点像関数によるコンボリューションによって表される。
[0065]
 第2の方法において、画像の放射照度は、
[数59]


によって与えられる。ここで、パーシバルの定理が使用される。式(11)において、複素振幅を照射方向ごとに積分した後、積分値をフーリエ変換し、絶対値の2乗を求める。試料が低コントラスト物体であれば、
[数60]


を式(11)に代入すると
[数61]


が得られる。ここで、
[数62]


であり、
ε 0
の2次項は無視する。すなわち、式(12)より、試料が低コントラスト物体である限り、第2の方法によって再現された物体の画像放射照度は、第1の方法によるものに比例する。第2の方法は、最終段階で1回のフーリエ変換を必要とするだけなので、複数回のフーリエ変換を必要とする第2の方法に比較して計算時間は少ない。
[0066]
 画像は、従来の光学系と同様の方法でOTFによってデコンボリューションすることができる。第1の方法において、フーリエ変換する前に、それぞれのシフトされた部分球面をOTFで割る。第2の方法において、絶対値の2乗を取る前に、OTFによって、周波数領域で合計振幅を割ることによってデコンボリューションを行う。両方の方法は、透過成分しかなければ誤差がなく、低周波数物体は、再現する際に、ほとんど誤差無しに解像することができる。
[0067]
 本発明の実施形態の特徴を以下に説明する。
[0068]
 本発明の一実施形態によれば、照射方向ごとの干渉像から物体の吸収率分布の3次元画像および屈折率分布の3次元画像を生成することを特徴とする。
[0069]
 本実施形態によれば、吸収率分布および屈折率分布を有する物体の、吸収率分布の3次元画像および屈折率分布の3次元画像を分離して生成することができる。
[0070]
 本発明の他の実施形態によれば、回折光として、透過回折光および反射回折光を使用することを特徴とする。
[0071]
 本実施形態によれば、回折光として、透過回折光および反射回折光を使用することにより、特に、物体の奥行き方向の高い分解能が得られる。
[0072]
 本発明の他の実施形態によれば、参照光として物体を透過した0次光を使用することを特徴とする。
[0073]
 本実施形態によれば、参照光として物体を透過した0次光を使用するので光学系の構成が簡単になる。
[0074]
 本発明の他の実施形態によれば、参照光として使用される0次光を経路上において減衰させることを特徴とする。
[0075]
 本実施形態によれば、参照光として使用される0次光を経路上において減衰させるので、回折光と比較して強度の大きい0次光によって撮像部が飽和するのが防止される。
[0076]
 本発明の他の実施形態によれば、0次光の一部が参照光と使用される0次光と分離されて、回折光と同じ経路を通るように構成され、干渉像から物体の3次元画像を生成する際に、前記回折光と同じ経路を通った0次光の位相を使用して前記回折光および前記参照光の間の位相誤差を補正することを特徴とする。
[0077]
 本実施形態によれば、個々の干渉の間の位相誤差を最小とすることができる。
[0078]
 本発明の他の実施形態によれば、光を反射する反射鏡を備え、前記反射鏡の傾きを変えることによって物体への前記光の照射方向を変化させ、前記反射鏡が前記物体の共役位置に配置され、0次光が、前記反射鏡に反射され、照射方向に関係なく、前記物体のフーリエ面の中心に集光されることを特徴とする。
[0079]
 本実施形態によれば、0次光が、反射鏡に反射され、照射方向に関係なく、一定の方向に進行して物体のフーリエ面の中心に集光されるので、0次光を参照光として使用するのに都合がよい。
[0080]
 本発明の他の実施形態によれば、物体のフーリエ面の中心に微小反射鏡が配置され、前記微小反射鏡によって参照光として使用される0次光を反射することによって、参照光として使用される0次光の経路を回折光の経路と分離することを特徴とする。
[0081]
 本実施形態によれば、簡単な構成によって参照光として使用される0次光の光路を回折光の光路と分離することができる。

請求の範囲

[1]
 物体に対して光を複数の照射方向から順次照射する第1光学系と、
 前記物体から発生する回折光と参照光とを撮像部に導く第2光学系と、
 前記回折光と前記参照光との干渉像を撮像する撮像部と、
 前記撮像部によって取得された前記照射方向ごとの干渉像から前記物体の3次元画像を生成する処理装置と、を含み、
 前記処理装置は、前記照射方向ごとの干渉像から前記回折光の複素振幅を求め、該複素振幅から前記物体の3次元画像を生成するように構成されたことを特徴とする3次元顕微鏡。
[2]
 前記処理装置が前記照射方向ごとの干渉像から前記物体の吸収率分布の3次元画像および屈折率分布の3次元画像を生成するように構成されたことを特徴とする請求項1に記載の3次元顕微鏡。
[3]
 前記回折光として、透過回折光および反射回折光を使用するように構成されたことを特徴とする請求項1に記載の3次元顕微鏡。
[4]
 前記参照光として、前記物体を透過した0次光を使用するように構成されたことを特徴とする請求項1に記載の3次元顕微鏡。
[5]
 前記参照光として使用される0次光が前記撮像部において飽和しないように、前記第2光学系において減衰部を備えたことを特徴とする請求項4に記載の3次元顕微鏡。
[6]
 前記第2光学系が、0次光の一部が前記参照光として使用される0次光と分離されて、前記回折光と同じ経路を通って前記撮像部に到達するように構成され、
 前記処理装置が、前記回折光と同じ経路を通って前記撮像部に到達した0次光の位相を使用して前記回折光および前記参照光の間の位相誤差を補正するように構成されたことを特徴とする請求項4に記載の3次元顕微鏡。
[7]
 前記第2光学系が、前記光を反射する反射鏡を備え、前記反射鏡の傾きを変えることによって前記物体への前記光の照射方向を変化させるように構成されており、前記反射鏡が前記物体の共役位置に配置され、0次光が、前記反射鏡に反射され、照射方向に関係なく、前記物体のフーリエ面の中心に集光されるように構成されたことを特徴とする請求項4に記載の3次元顕微鏡。
[8]
 前記物体のフーリエ面の中心に微小反射鏡が配置され、前記微小反射鏡によって前記参照光として使用される0次光を反射することによって、前記参照光として使用される0次光の経路を前記回折光の経路と分離するように構成されたことを特徴とする請求項7に記載の3次元顕微鏡。
[9]
 デジタルホログラフィを使用して物体の3次元画像を生成する3次元画像生成方法であって、
 物体に対して光を複数の照射方向から順次照射し、
 前記物体から発生する回折光と参照光との干渉像を照射方向ごとに取得し、
 照射方向ごとに取得された干渉像から前記回折光の複素振幅を求め、該複素振幅から前記物体の3次元画像を生成することを特徴とする3次元画像生成方法。
[10]
 前記照射方向ごとの干渉像から前記物体の吸収率分布の3次元画像および屈折率分布の3次元画像を生成することを特徴とする請求項9に記載の3次元画像生成方法。
[11]
 前記回折光として、透過回折光および反射回折光を使用することを特徴とする請求項9に記載の3次元画像生成方法。
[12]
 前記参照光として0次光を使用することを特徴とする請求項9に記載の3次元画像生成方法。
[13]
 前記参照光として使用される0次光を経路上において減衰させることを特徴とする請求項12に記載の3次元画像生成方法。
[14]
 0次光の一部が前記参照光として使用される0次光と分離されて、前記回折光と同じ経路を通るように構成され、干渉像から前記物体の3次元画像を生成する際に、前記回折光と同じ経路を通った0次光の位相を使用して前記回折光および前記参照光の間の位相誤差を補正することを特徴とする請求項12に記載の3次元画像生成方法。
[15]
 前記光を反射する反射鏡を備え、前記反射鏡の傾きを変えることによって前記物体への前記光の照射方向を変化させ、前記反射鏡が前記物体の共役位置に配置され、0次光が、前記反射鏡に反射され、照射方向に関係なく、前記物体のフーリエ面の中心に集光されることを特徴とする請求項12に記載の3次元画像生成方法。
[16]
 前記物体のフーリエ面の中心に微小反射鏡が配置され、前記微小反射鏡によって前記参照光として使用される0次光を反射することによって、前記参照光として使用される0次光の経路を前記回折光の経路と分離することを特徴とする請求項15に記載の3次元画像生成方法。

図面

[ 図 1]

[ 図 2]

[ 図 3]

[ 図 4]

[ 図 5]

[ 図 6]

[ 図 7]

[ 図 8]

[ 図 9]

[ 図 10]