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1. WO2007132867 - 癌の予防及び治療剤

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[ JA ]
明細書

癌の予防及ぴ治療剤

技術分野

本発明は、 P—糖タンパク質または B C R P発現抑制剤及びそのスクリーニン グ方法に関する。また、本発明は、抗癌剤耐性の獲得が抑制された抗癌剤に関す る。さらに、本発明は、抗癌剤耐性を獲得した癌に対しても有効な癌治療剤に関 する。

発明の背景

ドキソルビシン、ダウノルビシン、ェピルビシン等のアンスラサイクリン類、 ビンクリスチン等のビン力アル力ロイド類、パクリタキセル、ドセタキセル等の タキサン類等の抗癌剤は、抗悪性腫瘍効果が極めて高いことから広く用いられて いるが、反面、骨髄抑制、下痢などの副作用をおこすことが知られている。また、 長期投与により癌が耐性を獲得して抗癌剤の効力が低下すること、摩、者によって は抗癌剤に対して耐性を示すことから化学療法を施すことができないことが知ら れている。

癌細胞によるこれらの抗癌剤に対する耐性獲得のメカニズムについては、以前 からよく研究されており、多くの A B C トランスポーター(AT P結合領域を 1 分子内に有し A T Pによって駆動する膜タンパク質)がこれらの抗癌剤の耐性に 関与していることが知られている。

A B C トランスポーターの一つとして P—糖タンパク質が抗癌剤の耐性に関与 していることが知られている(Pro Natl. Acad. Sci. USA, 84: 3004—3008 (1987) ) 0 すなわち、 P—糖タンパク質を発現する癌では、 P—糖タンパク質が 抗癌剤を細胞外に排出することにより、抗癌剤の細胞内蓄積を減少させる作用を 有することが判明した。この P—糖タンパク質をコードする遺伝子が M D. R (Multi-drug resistance) 1遺伝子である。同様に、 A B C トランスポーター の一つとして B C R P (Breast Cancer Resistance Protein) 力抗 ¾剤の而す性に 関与していることが知られている(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 (26) , 15665—15670.(1998)。

発明の開示

しかしながら、 ABCトランスポーター、特に P—糖タンパク質の発現あるい は発現の増大により抗癌剤耐性を獲得するに至った癌細胞系で、 P—糖タンパク 質の発現を抑制する低分子化合物はあまり知られていない(特開 2006-69910号 公報、特開 2005- 247716号公報)。また、エストロゲン(Estrogen) はヒト培養 乳癌細胞株の P-糖蛋白発現を低下させることが報告されている(Cancer Res. 65: 596-604, 2005、第 64 回日本癌学会学術総会 '総会記事 p425) 。また、 B CRPの発現あるいは発現の増大により抗癌剤耐性を獲得するに至つた癌細胞系 で、 BCRPの発現を抑制する低分子化合物はあまり知られていない(特開 2004 - 123567号公報、 Cancer Res. 65: 596-604, 2005) 。

そこで本発明者は、 ABCトランスポーターである P—糖タンパク質を高発現 している癌細胞を用いて、 P—糖タンパク質発現を抑制する化合物を見出す目的 で種々の物質についてスクリーニングしたところ、 ME K阻害剤及ぴ R a s阻害 剤が P—糖タンパク質発現を顕著に抑制することを見出した。また、 ERK阻害 剤及び R S K阻害剤もまた、 P—糖タンパク質の発現を抑制することも見出し、 本発明を完成するに至った。

さらに、 ABCトランスポーターである B CRPを高発現している癌細胞を用 いて、 ME K阻害剤が BCRP発現を顕著に抑制することを見出した。

すなわち本発明は、次に示す、 MAPK系シグナル伝達阻害剤を含有してなる P—糖タンパク質発現抑制剤、 P—糖タンパク質発現抑制剤をスクリーニングす る方法、抗癌剤耐性抑制剤、癌治療剤などを提供するものである。

また、本発明は、次に示す、 MAPK系シグナル伝達阻害剤を含有してなる B CRP発現抑制剤、 BCRP発現抑制剤をスクリーニングする方法、抗癌剤耐性 抑制剤、癌治療剤などを提供するものである。

( 1 ) M A P K系シグナル伝達阻害剤を含有してなる P—糖タンパク質または B CRP発現抑制剤。

(2) MAPK系シグナル伝達阻害剤が、 MAPK系シグナル伝達に関与するタ ンパク質の発現を阻害する物質または M A P K系シグナル伝達に関与するタンパ ク質の活性を阻害する物質である、上記(1) に記載の P—糖タンパク質または

BCRP発現抑制剤。

(3) MA PK系シグナル伝達阻害剤が、 Ra s P且害剤、 Ra f 阻害剤、 MEK 阻害剤、 ERK阻害剤および RSK阻害剤から選択される 1種又は 2種以上であ る上記(1) または(2) に記載の P—糖タンパク質または BCRP発現抑制剤。 (4) MAPK系シグナル伝達阻害剤が、

(a) R a sタンパク質、 R a f タンパク質、 MEKタンパク質、 ERKタン ノク質または R S Kタンパク質の活性を阻害する低分子化合物、

(b) R a sタンパク質、 R a f タンパク質、 MEKタンパク質、 ERKタン パク質または R S Kタンパク質の発現を阻害する低分子化合物、

(c) R a sタンパク質、 R a f タンパク質、 MEKタンパク質、 ERKタン パク質または RSKタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対する s i RN Aまたは s h RNA及び

(d) R a sタンパク質、 Ra f タンパク質、 MEKタンパク質、 ERKタン パク質または R S Kタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補 的もしくは実質的に相捕的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポ リヌクレオチドから選ばれる少なくとも一種である上記(1) 〜(3) のいずれ かに記載の Ρ—糖タンパク質または B C R Ρ発現抑制剤。

(5) Ra s, Ra f 、 MEK:、 E RKまたは R S K阻害活性を指標として、 Ρ 一糖タンパク質または BCRP発現抑制剤をスクリーニングする方法。 · (6) 上記(1) に記載の P—糖タンパク質または BCRP発現抑制剤を含有し てなる耐性獲得が抑制された抗癌剤。

(6a) P—糖タンパク質の発現を抑制する活性と共に、抗癌活性を有する P— 糖タンパク質発現抑制剤を含有する、上記(6) 記載の抗癌剤。

(6 b) BCRPの発現を抑制する活性と共に、抗癌活性を有する BCRP発現 抑制剤を含有する、上記(6) 記載の抗癌剤。

(6 c) P—糖タンパク質または BCRP発現抑制剤が MEK阻害剤である、.上 記 (6) 又は(6a) 記載の抗癌剤。

(7) 上記(1) に記載の P—糖タンパク質または BCRP発現抑制剤を含有し てなる抗癌剤耐性抑制剤。

(8) MAPK系シグナル伝達阻害剤が、 MAPK系シグナル伝達に関与するタ

ンパク質の発現を阻害する物質または M A P K系シグナル伝達に関与するタンパ ク質の活性を阻害する物質である、上記(7) に記載の抗癌剤耐性抑制剤。

(9) MAPK系シグナル伝達阻害剤が、 Ra s阻害剤、 Ra f 阻害剤、 MEK P且害剤、 ERK阻害剤および RSK阻害剤から選択される 1種又は 2種以上であ る上記(7) または(8) に記載の抗癌剤耐性抑制剤。

(10) 上記(1) に記載の P—糖タンパク質または BCRP発現抑制剤と抗癌 剤とを組み合わせてなる癌治療剤。

(1 1) MAPK系シグナル伝達阻害剤が、 MAPK系シグナル伝達に関与する タンパク質の発現を阻害する物質または M A P K系シグナル伝達に関与するタン パク質の活性を阻害する物質である、上記(10) に記載の癌治療剤。

(12) MAPK系シグナル伝達阻害剤が、 Ra s阻害剤、 Ra f 阻害剤、 ME K阻害剤、 ERK阻害剤および RSK阻害剤から選択される 1種又は 2種以上で ある上記(10) または(1 1) に記載の癌治療剤。

(13) 抗癌剤が、塩酸ドキソルビシン、ダウノマイシン、塩酸ェピルビシン、 アンスラサイクリン類、ビン力アル力ロイド類およびタキサン類から選択される 上記 (10) 〜(12) のいずれかに記載の癌治療剤。

(14) MAPK系シグナル伝達阻害剤の有効量を投与することを特徴とする、 P—糖タンパク質または BCRPの発現を抑制する方法。

(15) MAPK系シグナル伝達阻害剤が、 Ra s阻害剤、 Ra f 阻害剤、 ME K阻害剤、 ERK阻害剤または RSK阻害剤から選択される 1種又は 2種以上で ある上記(4) に記載の P—糖タンパク質または BCRPの発現を抑制する方法。

(16) 上記(1) に記載の P—糖タンパク質または BCRP発現抑制剤を含有 してなる抗癌剤の有効量を投与することによる、癌を治療する方法。

(1 7) 抗癌剤耐性獲得を抑制して癌を治療するものである、請求項 16に記載 の方法。

(18) 抗癌剤の標的癌細胞からの排出を抑制して癌の治療効果を高めるもので ある、請求項 16に記載の方法。

なお、本発明は、がん分子標的治療研究会総会(2006.6.15-16、東京)、第 65 回 日本癌学会学術総会(2006.9.28-30、横浜)、 (The joint meeting of the 3rd ISC international conference on chemotherapeutics and the 11th inte rnational symposium on cancer chemotherapy (2006.12.6-8、東、曰本薬 学会第 127年会 (2007.3.28 - 30、富山)において発表されている。

図面の簡単な説明

図 1は、 MAPKシグナル伝達系、 Aktシグナル伝達系阻害剤による内因性 P—糖 タンパク質発現の抑制を示す図である。

図 2は、 MEK阻害剤 U0126による内因性又は外因性 P—糖タンパク質発現の経 時的な発現抑制を示す図である。

図 3は、 MEK 阻害剤 PD098059 による内因性又は外因性 P—糖タンパク質発現 の経時的な発現抑制を示す図である。

図 4は、 MEK、 ERK、 RSK遺伝子のノックダウンによる内因性又は外因性 P—糖 タンパク質発現の経時的な発現抑制を示す図である。

図 5は、 MEK阻害剤 U0126 による内因性 BCRP発現の経時的な発現抑制を示す 図である。

図 6は、 MEK 阻害剤による、がん細胞におけるパクリタキセルに対する感受性 の増大を示す図である。

図 7は、 MEK 阻害剤による、がん細胞における P-糖タンパク質の蛍光基質 Rhodaminel23の取り込み量の増加を示す図である。

まず、本発明は、 MAPK系シグナル伝達阻害剤を含有してなる P—糖タンパ ク質または BCRP発現抑制剤を提供する。ここで、「MA PK系シグナル伝 達」は、外界からのシグナルを細胞内に伝達する細胞内シグナル伝達経路の一つ であり、 GPCR (Gタンパク質結合受容体)、細胞増殖因子、細胞分化因子、 ストレス刺激等のシグナルによって活性化されることが知られている。 MAPK 系シグナル伝達経路(MAPキナーゼカスケード)は、 MAPKKK (MAPキ ナーゼキ^ ^一ゼキナーゼ)、 MAPKK (MAPキナーゼキナーゼ)、 MAP.キ ナーゼの 3段階のキナーゼによるカスケ一ドを含んでいる。 MAPK系シグナル 伝達経路は、例えば、 MAPKとして、 ERK:、 p 38 MAPK, S APK/ J NK、 ERK 5/BMKなどが、 MAPKKとして、 MEK、 MKKなどが、 MAPKKとして、 Ra f、 Mo s、 T p 1 2、 MLK、 TAK:、 DLK:、 ME

KK:、 ASKなどが知られている。本発明において、 MAPK系シグナル伝達経 路のうち特に対象とする経路は、(1) R a f 又は Mo s (MAPKKK) 、

(2) MEK (MAPKK) 、 (3) ERK (MAPK) の順にシグナルが伝達 される経路である。

「P—糖タンパク質」は、 MDR l (Multidrug Resistance 1) ともよばれる 抗癌剤耐性に関する ABCトランスポーターとして最初に同定されたタンパク質 であり、 MDR1 遺伝子にコードされている。 P—糖タンパク質の遺伝子である MDR1 遺伝子のヒト全長 cDNA の配列は公知である。 MDR1 遺伝子は Gen Bank の accession number M14758 として登録されており、 Cell 47:381 - 389 (1986)など で報告されている。本明細書中、ヒト野生型 MDRl cDNAと称する遺伝子は、ヒト の副腎の cDNA ライブラリーより単離されたものである(Biochem Biophys Res Commun 162: 224-231(1989)) 。

「BCRP (Breast Cancer Resistance Protein) 」は、正常組織では心臓組 織での発現が確認され、癌組織では特に乳ガン組織で高発現することが明らかと なった抗癌剤耐性に関する ABC トランスポーターとして同定されたタンパク質で ある。 BCRP遺伝子にコードされている。 B CRPの遺伝子である BCRP遺伝子の ヒト全長 cDNA の配列は公知である。 BCRP遺伝子は Gen Bank の accession number AB056867 として登録されており、 Doyle, L. A. , Yang, W., Abruzzo, L. V., Krogmann, T., Gao, Y., Rishi, A. K. and Ross, D. D. Amultidrug resistance transporter from human MCF— 7 breast cancer cells Proc. Nat丄. Acad. Sci. U.S.A. 95(26), 15665-15670 (1998)などで報告されている。

「抗癌剤耐性」は、抗癌剤の反復的な投与の結果または先天的に P—糖タンパク 質や BCRPの発現が亢進等している結果、癌の治療または予防の処置において 薬理効果の減少または消失がおこることをいう。

「抗癌剤耐性の獲得」は、抗癌剤の反復的な投与の結果としてその抗癌剤又はそ の類縁抗癌剤への感受性が減弱すること、または、先天的あるいは後天的に何ら かの理由により P—糖タンパク質や BCRPの発現が亢進した状態となった結果 としてその抗癌剤又はその類縁抗癌剤への感受性が減弱していることをいう。 本発明者らは、 P—糖タンパク質または B CRPの発現を MAPK系シグナル 伝達阻害剤.(特に、 Ra f 、 Mo s、 MEK及び ERKが関与するカスケードの

シグナル伝達を阻害する阻害剤)によって抑制できることを見出したものである。 MA P K系シグナル伝達阻害剤とは、 MA P K系シグナル伝達に携わる R a s、 MOS、 Tp I 2、 R a f 、 MEK、 ERK、 RSK:、 MKK、 p 38 MAR K、 SAPK:、 JNK、 MLK:、 MEKK、 MLK、 ASK等の生体内分子の発 現阻害、活性化阻害、不安定化等を介してシグナル伝達を阻害する薬物をいう。 シグナルの阻害には、完全に遮断することも、シグナルが減弱されることも含ま れる。かかる薬物としては、低分子若しくは高分子化合物のほか、 s i RNA、 s hRNA、 抗体、アンチセンス、ペプチド、タンパク質、酵素などを用いるこ とができる。

MAPK系シグナル伝達阻害剤としては、例えば、 MAPK系シグナル伝達に 関与するタンパク質の発現を阻害する物質、 MAPK系シグナル伝達に関与する タンパク質(MAPK系シグナル伝達に関与する遺伝子の翻訳産物を含む)の活 性を阻害する物質など、を用いることができる。ここで、「タンパク質の発現を 阻害する」とは、当該タンパク質の遺伝子の発現阻害を含む、当該タンパク質を コードする遺伝子からタンパク質生成までの一連の事象(例えば、転写(mRN Aの生成)、翻訳(タンパク質の生成)を含む)のうちのいずれかの事象を阻害 することによって、当該タンパク質の生成を阻害することを意味する。「タンパ ク質の活性を阻害する」とは、当該タンパク質が有する生理的作用(例えば、 M A PKシグナル伝達経路における次段階のタンパク質のリン酸化)を阻害するこ とをいい、当該タンパク質を活性型に変換する事象(例えば、リン酸化)を阻害 すること、不安定化(または安定化阻害)などによって当該タンパク質の生理的 作用を抑制することも含む。

MAPK系シグナル伝達に関与するタンパク質(例えば、 Ra sタンパク質、 Ra f タンパク質、 MEKタンパク質、 ERKタンパク質、 RSKタンパク質な ど)を本発明で用いられるタンパク質と称することがある。 MAPK系シグナル 伝達に関与する遺伝子(MAPK系シグナル伝達に関与するタンパク質をコード する遺伝子を含む)を本発明で用いられる遺伝子と称することがある。

本発明で用いられる MAPK系シグナル伝達阻害剤としては、例えば、(a) 本発明で用いられるタンパク質の活性を阻害する低分子化合物、(b) 本発明で 用いられるタンパク質の発現を阻害する低分子化合物、(本発明で用いられ

るタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対する s i RNAまたは s hRN A、 (d) 本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基 配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアン チセンスポリヌクレオチド、(e) 本発明で用いられるタンパク質に対する抗体 、 (f) 本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対する リボザィム、(g) 本発明で用いられるタンパク質に対してドミナントネガティ ブに作用する本発明で用いられるタンパク質の変異体もしくはそれをコードする ポリヌクレオチド、(h) 本発明で用いられるタンパク質に対するアブタマ一な どが挙げられる。

本発明で用いられるタンパク質の発現を阻害する物質としては、本発明で用い られるタンパク質の発現を阻害するものであれば特に制限はないが、例えば、

(i) 本発明で用いられるタンパク質をコードする遺伝子(DNA) から本発明 で用いられるタンパク質をコードする mRNAへの転写を阻害する物質、(ii) 本発明で用いられるタンパク質をコードする mRNAから本発明で用いられるタ ンパク質への翻訳を阻害する物質などが挙げられる。(i) 本発明で用いられる タンパク質をコードする遺伝子(DNA) から本発明で用いられるタンパク質を コードする mRNAへの転写を阻害する物質としては、本発明で用いられるタン パク質をコードする遺伝子(DNA) から本発明で用いられるタンパク質をコー ドする mRNAへの転写を阻害するものであればよく特に制限はないが、例えば、 本発明で用いられるタンパク質をコードする遺伝子(DNA) から mRNAへの 転写に関与する因子に結合し、本発明で用いられるタンパク質をコードする遺伝 子 (DNA) から mRNAへの転写を阻害する物質などが挙げられる。(ii) 本 発明で用いられるタンパク質をコードする mRNAから本発明で用いられるタン パク質への翻訳を阻害する物質としては、本発明で用いられるタンパク質をコー ドする mRNAから本発明で用いられるタンパク質への翻訳を阻害するものであ ればよく特に制限はないが、例えば、本発明で用いられるタンパク質をコードす る niRN Aから本発明で用いられるタンパク質への翻訳に関与する因子に結合し、 本発明で用いられるタンパク質をコ—ドする mRNAから本発明で用いられるタ ンパク質への翻訳を阻害する物質などが挙げられる。このような本発明で用いら れるタンパク質の発現を阻害する物質としては、具体的には、例えば、(b) 本 発明で用いられるタンパク質の発現を阻害する低分子化合物、(c) 本発明で用 いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対する s i R NAまたは s h R N A、 (d) 本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチド の塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有す るアンチセンスポリヌクレオチド、(f) 本発明で用いられるタンパク質をコー ドするポリヌクレオチドに対するリボザィム、などが挙げられる。

本発明で用いられるタンパク質の活性を阻害する物質としては、本発明で用い られるタンパク質の活性を阻害するものであれば特に制限はないが、例えば、 (i) MA P K系シグナル伝達に関与するタンパク質の活性化を阻害する物質、 (ϋ) MA Ρ Κ系シグナル伝達に関与するタンパク質が、その下流の因子(例え ば、タンパク質)を活性化することを阻害する物質などが挙げられる。ここで、 MA P K系シグナル伝達に関与するタンパク質の活性化を阻害するとは、例えば、 M A P系シグナル伝達に関与するタンパク質を活性型に変換する事象(例えば、 リン酸化)を直接的に阻害することを含むが、これに限定されない。例えば、 M A P K系シグナル伝達系の上流の因子(例えば、タンパク質)の発現阻害、活性 化阻害、不安定化(または安定化阻害)などによって MA P K系シグナル伝達に 関与するタンパク質の活性化を阻害することも、 MA P K系シグナル伝達に関与 するタンパク質の活性化を阻害することに含まれる。

MA P K系シグナル伝達阻害剤としては、より具体的には、例えば、 R a s阻 害剤、 R a f 阻害剤、 ME K阻害剤、 E R K阻害剤、 R S K阻害剤などを用いる ことができる。これらの阻害剤は、単独で、必要に応じてそれらの 2種以上を組 み合わせて用いることができる。

R a s阻害剤としては、実施例記載の薬物 ( FTI-277 ) の他、 R115777 (Zarnesta) 、 BMS- 214662、 SCH66336、 L- 778, 123 などが挙げられる。なお、 R115777, BMS- 214662、 SCH66336 はフアルネシル転移酵素阻害剤で、 L- 778, 123 はゲラニルゲラニル転移酵素阻害剤である。これらの阻害剤は、 ras スーパ"フ アミリーの低分子量 Gタンパク質が、細胞の膜構造に結合して機能を発揮するた めに必要な修飾(フアルネシル化とゲラニルゲラ-ル化)を阻害するため、 Ras の活性化を阻害する。なお、 FTI- 277 はフアルネシル転移酵素阻害剤(一般名: N一 [4一 [2— (R).一 amino一 3一 mercaptopropy丄」 amino一 2一 phenyl一 benzoy丄」 mehionineリで あり、 EMD Bioscience 社から入手可能である(Cancer Res. , 59: 4919-4926 (1999)) 。

R a f 阻害剤としては、例えば、 Bay43- 9006 (B- Raf、 C-Raf の選択的阻害剤。 ソラフヱニブ(sorafenib)とも呼ばれる。)などが挙げられる。 R a f 阻害剤と しては、 A— Ra f 、 B-R a f 、 C-R a f 阻害剤が好ましく、なかでも特に 好ましくは B— R a f 阻害剤である。

ME K阻害剤としては、実施例記載の薬物(U0126、 PD098059) の他、 PD184161 (MEK1及び MEK2選択的阻害剤) などが挙げられる。 U0126は MEK1/2 の選択的阻害剤(一般名: l,4-diamino- 2, 3-dicyano- 1,4— bis^—aminophenyl-thio] butadiene) である。 U0126 は、化学合成された有機化合物(1.4- diamino-2, 3-dicyano-l, 4-bis [2-amino-phenylthio] butadiene) で、 MAPKK (MEK) 活性を 阻害し、 ERK 1/ERK 2の活性化を抑制する。 U0126は、 PD098059に比べると Raf による MEK 1/2のリン酸化と MEK 1/2による ERK 1/2のリン酸化の両方を阻害す るため、より効率よく阻害することができる(J. Biol. Chem. , 273: 18623-18632 (1998)) 。 U0126は Cell Signaling Technology社から入手可能である。 PD098059は MEK1の選択的阻害剤(一般名: 2' -Amino- 3' -methoxyf lavone) で、 Promega社から入手可能である。 PD098059は、 MAPK/ERKキナーゼ I (MAPキナー ゼ 'キナーゼ I または MEK 1) に対する強力で、細胞透過性を有する選択的な阻 害剤であり、 MEK1 の活性化をブロックするため次段階の MAP キナーゼのリン酸 化/活性化を阻害する (Exp. Cell Res. 253, 255-270(1999)) 。

また、 MEK阻害剤としては、国際公開第 9837881号パンフレット、国 際公開第 99901426号パンフレツト、特開 2◦ 01— 55376号公報、 国際公開第 200041 505号パンフレツト、国際公開第 200041 994 号パンフレツト、国際公開第 200042002号パンフレツト、国際公開第 2 0◦ 042003号パンフレッ ト、国際公開第 200042022号パンフレツ ト、国際公開第 200042029号パンフレット、国際公開第 200056.7 06号パンフレツト、国際公開第 200068199号パンフレツト、国際公開 第 200068200号パンフレット、 国際公開第 200068201号パンフ レツト、国際公開第 2001 68619号パンフレツト、国際公開第 20023 6570号パンフレツト等に記載の薬物等が挙げられる。なかでも、 MEK1、

W

ME K 2阻害剤が好ましい。

ERKP且害剤としては、例えば、特開 20 0 5— 3 3 0 26 5号公報に記載の Ρ_Ε¾·剤、 ERK inhibitor (Merck Calbiochem社)、 5-Iodotubercidin (Merck Calbiochem社)等が挙げられる。 ERK inhibitor (Merck Calbiochem社)は ERK2特 異的阻害剤(KD=〜5 mM) (—般名: 3- (2- Aminoethyl)-5- ((4-ethoxyphenyl)methy丄 ene—2, 4-thiazolidinedione) である。 ΰ—丄 odotubercidin (Merck Calbiochem社)は ERK2競合的阻害剤(Ki=530 nM) (一般名: 4- Amino- 5- iodo-7- ( β -D-riboiuranosyl) pyrrolo [2, 3-d] -pyrimidine) でめり、 adenosine kinaseも阻害することが知られている(Ki=30 nM) 。なかでも、 ERK1、 ER K 2阻害剤が好ましい。

R S K阻害剤としては、例えば、 Kaemphero 1-3-0- (4, - 0 - acety卜 a - L-rhamnopyranoside)等が挙げられる。 RSK阻害剤としては、 RSK 1、 R SK 2及び RSK 3阻害剤が好ましい。

本発明において好ましく用いられる MAP K系シグナル伝達阻害剤は、例えば、 (a) R a sタンパク質、 R a f タンパク寳、 MEKタンパク質、 ERKタンパ ク質または R SKタンパク質の活性を阻害する低分子化合物、(b) R a sタン パク質、 R a f タンパク質、 MEKタンパク質、 ERKタンパク質または RSK タンパク質の発現を阻害する低分子化合物、(c) R a sタンパク質、 R a f タ ンパク質、 MEKタンパク質、 ERKタンパク質または RSKタンパク質をコー ドするポリヌクレオチドに対する s i RNAまたは s hRNA、(d) R a sタ ンパク質、 R a f タンパク質、 MEKタンパク質、 ERKタンパク質または R S Kタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的 に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、 (e) R a sタンパク質、 R a f タンパク質、 MEKタンパク質、 ERKタンパ ク質または R SKタンパク質に対する抗体、(f) R a sタンパク質、 R a f タ ンパク質、 ME Kタンパク質、 ERKタンパク質または RSKタンパク質に対す るリボザィムなどが挙げられる。これらの物質は、単独で、必要に応じてそれら の 2種以上を組み合わせて用いることができる。

' なお、「低分子化合物」とは、分子量 1 0, 000以下(好ましくは、分子量 5, 0 00以下、より好ましくは分子量 2, 00 0以下、特に好ましくは分子量

700以下)の有機および無機物質を意味する。

Ra sタンパク質は、 GTP結合蛋白質であり、 MAPK系シグナル伝達経路 において MAPKKKである R a f タンパク質にシグナルを伝達する機能を有す る GTP結合蛋白質で、 K— Ra s、 N-R a s、 H— R a sなどが知られてい る。例えば、 Leukemia 17: 1263-1293 (2003)に記載されている。 R a sタンパ ク質の活性の測定は、例えば、 J. Biol. Chem. 277: 7865-7874 (2002)に記載の 方法またはそれに準じる方法に従って測定することができる。

Ra f タンパク質は、 MAPKKKであり、 MA P K系シグナル伝達経路にお いて MAP KKである ME Kタンパク質にシグナルを伝達する機能を有するキナ ーゼで、 A- Ra f 、 B-R a f 、 C- R a f などがある。例えば、 Leukemia 17: 1263-1293 (2003)に記載されている。 R a f タンパク質の活性の測定は、例えば Methods Enzymol. 255: 279-290 (1995)に記載の方法またはそれに準じる方法に 従って測定することができる。

ME Kタンパク質は、 MAPKKであり、 MAPK系シグナル伝達経路におい て MA P Kである E R Kタンパク質にシグナルを伝達する機能を有するキナーゼ で MEK1、 MEK2などがある。例えば、 Leukemia 17: 1263-1293 (2003)に 記載されている。 MEKタンパク質の活性の測定は、例えば、 Science 258: 478-480 (1992)に記載の方法またはそれに準じる方法に従って測定することがで さる。

ERKタンパク質は、 MAPキナーゼであり、種々の転写因子のセリン .スレ ォユン残基をリン酸化して遺伝子発現を促進する機能を有し、 ERK1、 ERK 2などがある。例えば、 World J Gastroenterol. 2006 Apr 21; 12 (15) :2445— 2449. Related Articles, Links などに記載されている。 ERKタンパク質の活 性の測定は、例えば、 orld J Gastroenterol. 2006 Apr 21 ;12 (15) :2445-2449. Related Articles, Links などに記載の方法またはそれに準じる方法に従って測 定することができる。

R S Kタンパク質は、 MAPキナーゼ活性化プロティンキナーゼ(MAPKAPキナー ゼ)で、例えば、 Leukemia 17: 1263-1293 (2003)に記載されている。 RSKタ ンパク質の活性の測定は、例えば、 EMB0 J. 14: 674-684 (1995)に記載の方法ま たはそれに準じる方法に従って測定することができる。

本明細書中、本発明で用いられるタンパク質の活性を、 MA P K系シグナル伝 達経路において次段階のタンパク質にシグナルを伝達する活性(例えば、リン酸 化活性;以下、 ΓΜΑ P K系シグナル伝達経路シグナル伝達活性」ともいう)と 称することもある。

なお、本明細書では、 R a sタンパク質、 R a f タンパク質、 ME Kタンパク 質、 E R Kタンパク質または R S Kタンパク質という用語は、それらと実質的に 同一の活性を有する限り、その変異体をも包含する意味で用いられる。上記タン パク質の変異体としては、例えば、上記文献に記載のアミノ酸配列中の 1または 2個以上 (例えば 1〜 3 0個程度、好ましくは 1〜 1 0個程度、さらに好ましく は数(1〜5 ) 個)のアミノ酸が欠失、置換、付加及び Z又は挿入したアミノ酸 配列を有するタンパク質が挙げられる。アミノ酸配列が挿入、欠失または置換さ れている場合、その揷入、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない

実質的に同質の活性としては、例えば MA P K系シグナル伝達活性などが挙げ られる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に(例、生理学的に、または 薬理学的に)同質であることを示す。したがって、脂肪酸合成酵素活性などが同 等 (例、約 0 . 0 1〜 1 0 0倍、好ましくは約 0 . 1〜 1 0倍、より好ましくは 0 . 5〜2倍)であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分 子量などの量的要素は異なっていてもよい。

本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドとしては、前記した本発明で用 いられるタンパク質の部分ペプチドであって、好ましくは、前記した本発明で用 いられるタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。 例えば、本発明で用いられるタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも 2 0個以上、好ましくは 5 0個以上、さらに好ましくは 7 0個以上、より好まし くは 1 0 0個以上、最も好ましくは 2 0 0個以上のアミノ酸配列を有するぺプチ ドなどが用いられる。

また、本発明で用いられる部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の 1または 2 個以上(好ましくは 1〜2 0個程度、より好ましくは 1〜1 0個程度、さらに好 ましくは数(1〜5 ) 個)のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に 1 または 2個以上(好ましくは 1〜 2 0個程度、より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数(1〜5 ) 個)のアミノ酸が付カ卩し、または、そのアミノ酸 配列に 1または 2個以上(好ましくは 1〜2 0個程度、より好ましくは 1〜1 0 個程度、さらに好ましくは数(1〜5 ) 個)のアミノ酸が挿入され、または、そ のアミノ酸配列中の 1または 2個以上(好ましくは 1〜2 0個程度、より好まし くは 1〜 1 0個程度、さらに好ましくは数(1〜5 ) 個)のアミノ酸が他のアミ ノ酸で置換されていてもよい。

本発明で用いられる部分べプチドまたはそれらの塩は、自体公知のぺプチドの 合成法に従って、あるいは本発明で用いられるタンパク質を適当なぺプチダーゼ で切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例 えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明で用 いられる部分ぺプチドを構成し得る部分べプチドもしくはアミノ酸と残余部分と を縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的の ペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例 えば、以下の(i) 〜(V) に記載された方法が挙げられる。

(i) M. Bodanszky および M. A. 0ndetti、ペプチド . シンセシス(Pept ide Syn thesis; , Interscience Publ ishers, New York (1966 ノ

(liノ Schroederおよび Luebke、ザ *ぺプナド (The Peptide) , Academic Press, New York (1965年)

(i ii) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善 (株)(1975年)

(iv) 矢島治明およぴ榊原俊平、生化学実験講座 1、タンパク質の化学 IV、 20 5、(1977年)

(v) 矢島治明監修、続医薬品の開発、第 14卷、ペプチド合成、広川書店 また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマトダラ フィ一'液体クロマトグラフィー '再結晶などを組み合わせて本発明で用いられ る部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチド が遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によつて適当な塩 に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれ に準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。

P—糖タンパク質発現抑制活性は、後述の実施例にて記載した P—糖タンパク 質発現量をウェスタンプロット法で測定することができる。また、 B C R P発現

抑制活性は、後述の実施例にて記載した BCRP発現量をウェスタンブロット法 で測定することができる。

その他にも FACS によって測定することもできる。 FAC S (Fluorescence activated cell sorting) での測定は、標識抗体を用いて細胞表面に発現してい るであろう P—糖タンパク質を染色し、染色処理後の細胞を液流にのせ、標識量 (P—糖タンパク質量)を測定することによって行うことができる。具体的には、 例えば、ピオチン化 P -糖タンパク質抗体(MRK16) を細胞表面に発現している P -糖タンパク質と反応させた後、 PE標識ストレプトアビジンと反応た後、 FACS で は PEの輝度を測定することにより、細胞表面上に発現している P-糖タンパク質 量を測定できる。

また、 BCRP発現量の FACS (Fluorescence activated cell sorting) での測定は、標識抗体を用いて細胞表面に発現しているであろう BCRPを染色 し、染色処理後の細胞を液流にのせ、標識量(BCRP量)を測定することによ つて行うことができる。具体的には、例えば、ビォチン化 B C R P抗体を細胞表 面に発現している BCRPと反応させた後、 PE標識ストレプトアビジンと反応 た後、 FACSでは PEの輝度を測定することにより、細胞表面上に発現している B CRP量を測定できる。

(a) Ra sタンパク質、 Ra f タンパク質、 ME Kタンパク質、 ERKタンパ ク質または R S Kタンパク質の活性を阻害する低分子化合物

本発明で用いられるタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩は、本発 明で用いられるタンパク質の活性を阻害することができるので、本発明で用いら れるタンパク質の活性を阻害する物質として好適に使用することができる。本発 明で用いられるタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩としては、本発 明で用いられるタンパク質の有する活性(例、 MAPK系シグナル伝達活性)を 阻害しうる化合物またはその塩であればよく特に制限はないが、例えば、本発明 で用いられるタンパク質に結合し、その活性を阻害する化合物またはその塩など が挙げられる。このような化合物またはその塩は、例えば、ペプチド、タンパク 質、非べプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、 動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物であってもよい。該化合物は、新' 規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。該化合物の塩とし ては、例えば、生理学的に許容される金属塩、アンモニゥム塩、有機塩基との塩 、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げら れる。金属塩の好適な例としては、例えばナトリゥム塩、力リゥム塩などのアル カリ金属塩;カルシウム塩、マグネシウム塩、バリゥム塩などのアル力リ土類金 属塩;アルミニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、 例えばトリメチルァミン、トリェチルァミン、ピリジン、ピコリン、 2, 6—ル チジン、エタノーノレアミン、ジエタノールァミン、トリエタノ一ノレアミン、シク 口へキシ^/アミン、ジシクロへキシァミン、 Ν, N'—ジペンジノレエチレンジ ァミンなどとの塩が挙げられる。 '無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸 、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好 適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルォロ酢酸、プロピオン酸、フタル 酸、フマル酸、シユウ酸、酒石酸、マレイン酸、クェン酸、コハク酸、リンゴ酸 、メタンスルホン酸、安息香酸、ベンゼンスルホン酸、 ρ—トルエンスルホン酸 などとの塩が挙げられる。塩基性ァミノ酸との塩の好適な例としては、例えばァ ルギニン、リジン、オル二チンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好 適な例としては、例えばァスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる

このうち、生理学的に許容し得る塩が好ましい。例えば、化合物内に酸性官能 基を有する場合にはアルカリ金属塩(例、ナトリウム塩,カリウム塩など)、ァ ルカリ土類金属塩(例、カルシウム塩,マグネシウム塩,バリウム塩など)など の無機塩、アンモユウム塩など、また、化合物内に塩基性官能基を有する場合に は、例えば臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸など無機酸との塩、または酢酸、フ タル酸、フマル酸、シユウ酸、酒石酸、マレイン酸、クェン酸、コハク酸、メタ ンスルホン酸、 ρ—トルエンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。 このような化合物としては、前述の R a s阻害剤、 R a f 阻害剤、 ME K阻害 剤、 E R K阻害剤、 R S K阻害剤などが挙げられる。また、このような化合物は 、後述するスクリーニング方法によって得ることができる。

(b) R a sタンパク質、 R a f タンパク質、 ME Kタンパク質、 E R Kタンパ ク質または R S Kタンパク質の発現を阻害する低分子化合物

本発明で用いられるタンパク質の発現を阻害する化合物またはその塩は、本発 明で用いられるタンパク質の発現を抑制することができるので、本発明で用いら れるタンパク質の発現を阻害する物質として好適に使用することができる。本発 明で用いられるタンパク質の発現を阻害する化合物またはその塩としては、本発 明で用いられるタンパク質の発現を阻害しうるものであればよく特に制限はない f 例えば、(i) 本発明で用いられるタンパク質をコードする遺伝子(DNA ) から本発明で用いられるタンパク質をコードする mRNAへの転写を阻害する 化合物、(ii) 本発明で用いられるタンパク質をコードする mRNAから本発明 で用いられるタンパク質への翻訳を阻害する化合物などが挙げられる。(i) 本 発明で用いられるタンパク質をコードする遺伝子(DNA) から本発明で用いら れるタンパク質をコードする mRNAへの転写を阻害する化合物としては、本発 明で用いられるタンパク質をコードする遺伝子(DNA) から mRNAへの転写 を阻害するものであればよく特に制限はないが、例えば、本発明で用いられるタ ンパク質をコードする遺伝子(DNA) から mRNAへの転写に関与する因子に 結合し、転写を阻害する化合物などが挙げられる。(ii) 本発明で用いられるタ ンパク質 Aをコードする mRNAから本発明で用いられるタンパク質への翻訳を 阻害する化合物としては、本発明で用いられるタンパク質 Aをコードする mRN Aから本発明で用いられるタンパク質への翻訳を阻害するものであればよく特に 制限はないが、例えば、本発明で用いられるタンパク質 Aをコードする mRNA 力ら本発明で用いられるタンパク質への翻訳に関与する因子に結合し、翻訳を阻 害する化合物などが挙げられる。

このような化合物としては、前述の R a s P且害剤、 R a f 阻害剤、 MEKP且害 剤、 ERK阻害剤、 RSK阻害剤などが挙げられる。また、このような化合物は、 後述するスクリーニング方法によって得ることができる。

(c) R a sタンパク質、 R a f タンパク質、 MEKタンパク質、 ERKタンパ ク質または RSKタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対する s i RNA または s h RNA

本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対して RNA

i作用を有する二重鎖 RNA (例、本発明で用いられるタンパク質をコードする ポリヌクレオチドに対する s i RNAまたは s hRNAなど)は、低毒性であり 、本発明で用いられるタンパク質をコードする遺伝子の翻訳を抑制することがで き、本発明で用いられるタンパク質の発現を抑制することができるので、本発明 で用いられるタンパク質の発現を阻害する物質として好適に使用することができ る。このような、本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチド に対して RNA i作用を有する二重鎖 RNAとしては、本発明で用いられるタン パク質をコードする RN Aの一部を含有する二重鎖 RNA (例、本発明で用いら れるタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対する s i RNA (small (sho rt) interfering RNA) 、 s hRNA (small (short) hairpin RNA) など)など が挙げられる。

このような二重鎖 RNAは、公知の方法(例、 Nature, 411卷, 494頁, 2001年 ;特表 2002- 516062号公報;米国特許出願公開第 2002/086356号明細書; Nature G enetics, 24卷, 180- 183頁, 2000年; Genesis, 26卷, 240- 244頁, 2000年; Nat ure, 407卷, 319- 320頁, 2002年; Genes & Dev., 16卷, 948- 958頁, 2002年; Pro c. Natl. Acad. Sci. USA. , 99卷, 5515— 5520頁, 2002年; Science, 296卷, 55 0-553頁, 2002年; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99巻, 6047- 6052頁, 2002年; Nature Biotechnology, 20卷, 497 - 500頁, 2002年; Nature Biotechnology, 20 卷, 500- 505頁, 2002年; Nucleic Acids Res. , 30卷, e46, 2002年)に準じて、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。

本発明で用いられる RNA i作用を有する二重鎖 RNAの長さは、通常、 1 7 〜3 0塩基、好ましくは 1 9〜2 7塩基、より好ましくは 20〜22塩基である

(d) R a sタンパク質、 R a f タンパク貧、 MEKタンパク質、 ERKタンパ ク質または R S Kタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的 もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリ ヌクレオチド

本発明で用いられるタンパク質または部分べプチドをコードするポリヌクレオ チド (好ましくは DNA) (以下、アンチセンスポリヌクレオチドの説明におい

ては、これらの DNAを本発明で用いられる DNAと略記する場合がある)の塩 基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するァ ンチセンスポリヌクレオチドとしては、本発明で用いられる DN Aの塩基配列に 相捕的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、該 DNAの 発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスポリヌクレ ォチドであってもよいが、アンチセンス DNAが好ましい。

本発明で用いられる DNAに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明 で用いられる DN Aに相補的な塩基配列(すなわち、本発明で用いられる DN A の相補鎖)の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約 70%以上、好ましくは約 8 0 %以上、より好ましくは約 90 %以上、最も好ましくは約 95 %以上の相同性 を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明で用いられる DNAの相補鎖 の全塩基配列うち、(i) 翻訳阻害を指向したアンチセンスポリヌクレオチドの 場合は、本発明で用いられるタンパク質の N末端部位をコードする部分の塩基配 列 (例えば、開始コドン付近の塩基配列など)の相捕鎖と約 70%以上、好まし くは約 80 %以上、より好ましくは約 90 %以上、最も好ましくは約 95 %以上 の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが、 (ii) RNa s eHによる RNA分解を指向するアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、イントロンを含 む本発明で用いられる DNAの全塩基配列の相補鎖と約 70%以上、好ましくは 約 80 %以上、より好ましくは約 90 %以上、最も好ましくは約 95 %以上の相 同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドがそれぞれ好適である。

アンチセンスポリヌクレオチドは通常、 10〜40個程度、好ましくは 1 5〜 30個程度の塩基から構成される。

ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンス DN Aを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基(ホスフェート)は、例えば、ホスホ ロチォエート、メチルホスホネート、ホスホロジチォネートなどの化学修飾りん 酸残基に置換されていてもよい。また、各ヌクレオチドの糖(デォキシリボース ) は、 2' —O—メチルイヒなどの化学修飾糖構造に置換されていてもよいし、塩 基部分(ピリミジン、プリン)も化学修飾を受けたものであってもよく、配列番 号: 2で表わされる塩基配列を有する DNAにハイブリダィズするものであれば いずれのものでもよい。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、公知の DN A合成装置などを用いて製造することができる。

本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、変化せしめられたり、修飾された 糖、塩基、結合を含有していて良く、リボゾーム、ミクロスフエアのような特殊 な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与え られることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基 骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜と の相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質(例、ホスホリ ピド、コレステロールなど) などの疎水性のものが挙げられる。付加するに好ま しい脂質としては、コレステロールやその誘導体(例、コレステリルクロ口ホル メート、コール酸など)が挙げられる。こうしたものは、核酸の 3 ' 端または 5 ' 端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着 させることができうる。その他の基としては、核酸の 3 ' 端または 5 ' 端に特異 的に配置されたキャップ用の基で、ェキソヌクレアーゼ、 R N a s eなどのヌク レアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の 基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレンダリコールなどのグリコ ールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに 限定されるものではない。

ァンチセンスポリヌクレオチドの阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の 生体内や生体外の遺伝子発現系、または本発明で用いられるタンパク質の生体内 や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。

(e) R a sタンパク質、 R a f タンパク質、 ME Kタンパク質、 E R Kタンパ ク質または R S Kタンパク質(以下、「本発明で用いられるタンパク質」ともい う)に対する抗体

本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗 体は、本発明で用いられるタンパク質もしくは部分べプチドまたはその塩を認識 し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであって あよい。

本発,明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩(以下、抗 体の説明においては、これらを単に本発明で用いられるタンパク質と略記する場 合がある)に対する抗体は、本発明で用いられるタンパク質を抗原として用い、 自体公知の抗体または抗血清の製造法に従つて製造することができる。

〔モノクローナル抗体の作製〕

(i) モノクローナル抗体産生細胞の作製

本発明で用いられるタンパク質は、温血動物に対して投与により抗体産生が可 能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗 体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュ バントを投与してもよい。投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、計 2〜 10回程度 行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ゥサギ、ィヌ、モルモ ット、マウス、ラット、ヒッジ、ャギ、ニヮトリが挙げられるが、マウスおよび ラットが好ましく用いられる。

モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、 例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾臓 またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物 の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイプリドーマ を調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タ ンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定する ことにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミ ルスタインの方法 [Nature, 256、 495 (1975)] に従レ、実施することができる。 融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール(PEG) やセンダイゥ ィルスなどが挙げられるが、好ましくは PEGが用いられる。

骨髄腫細胞としては、例えば、 NS— 1、 P 3U1、 S P 2/0 AP— 1な どの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、 P 3U1が好ましく用いられる。用 いられる抗体産生細胞(脾臓細胞)数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 : 1 〜20 : 1程度であり、 PEG (好ましくは PEG 1000〜PEG6000) が 10〜 80%程度の濃度で添カ卩され、 20〜40°C、好ましくは 30〜37°C で 1〜10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。 モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使 用できるが、.例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固 相 (例、マイクロプレート)にハイプリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物 質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体(細胞融合に用いられる細胞がマ ウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる)またはプロテイン Aを 加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロプリン抗 体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清を添加し、放 射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナ ル抗体を検出する方法などが挙げられる。

モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行 なうことができる。通常 HA T (ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン) を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地として は、ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例 えば、 1〜 2 0 %、好ましくは 1 0〜 2 0 %の牛胎児血清を含む R P M I 1 6 4 0培地、 1〜1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地(和光純薬工業(株))あ るいはハイプリドーマ培養用無血清培地(S F M_ 1 0 1、日水製薬(株))な どを用いることができる。培養温度は、通常 2 0〜4 0 °C、好ましくは約 3 7 °C である。培養時間は、通常 5日〜 3週間、好ましくは 1週間〜 2週間である。培 養は、通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗 体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。

(ii) モノクローナル抗体の精製

モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリン の分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、ィ オン交換体(例、 D E A E) による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合 固相あるいはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸着剤により抗体の みを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことが できる。

〔ポリクローナル抗体の作製〕

本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従 つて製造することができる。例えば、免疫抗原(タンパク質抗原)自体、あるい はそれとキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体 の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明で用いられる

タンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより 製造することができる。

温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキヤリァータンパク質との複 合体に関し、キヤリァータンパク質の種類およびキヤリァ一とハプテンとの混合 比は、キヤリァ一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれ ば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ゥシ血清アル ブミンゃゥシサイログロブリン、へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1〜2 0、好ましくは約 1〜5の割合でカプルさせる方法が用いられる。 また、ハプテンとキャリアーの力プリングには、種々の縮合剤を用いることが できるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チ オール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。

縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは 担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全 フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投 与は、通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、計約 3〜 1 0回程度行なわれる。

ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。

抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と 同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナ ル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことがで さる。

(f) R a sタンパク質、 R a f タンパク質、 M E Kタンパク質、 E R Kタンパ ク質または R S Kタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対するリボザィム 本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対してリポザ ィム活性を有するポリヌクレオチドは、本発明で用いられるタンパク質の発現を 抑制することができるので、本発明で用いられるタンパク質の発現を阻害する物 質として好適に使用することができる。このようなリボザィムは、公知の方法( 例、 TRENDS in Molecular Medicine, 7卷, 221頁, 2001年; FEBS Lett. , 228卷, 228頁, 198.8年; FEBS Lett. , 239卷, 285頁, 1988年; Nucl. Acids. Res. , 17 卷, 7059頁, 1989年; Nature, 323卷, 349頁, 1986年; Nucl. Acids. Res. , 19 卷, 6751頁, 1991年; Protein Eng. 3巻, 733頁, 1990年; Nucl. Acids Res. , 1 9卷, 3875頁, 1991年; Nucl. Acids Res. , 19卷, 5125頁, 1991年; Biochem. Bi ophys. Res. Comraun. , 186卷, 1271頁, 1992年など参照)に準じて、本発明のポ リヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、本発明で 用いられるタンパク質をコードする R N Aの一部に公知のリボザィムを連結する ことによって製造することができる。本発明で用いられるタンパク質をコードす る R N Aの一部としては、公知のリボザィムによって切断され得る本発明の R N A上の切断部位に近接した部分(R N A断片)が挙げられる。上記リボザィムに は、グループ Iイントロン型や R N a s e Pに含まれる M l R N Aなどのラー ジリボザィム、ハンマーへッド型ゃヘアピン型などのスモールリボザィムなどが 含まれる(タンパク質核酸酵素, 35卷, 2191頁, 1990年)。ハンマーヘッド型 リボザィムについては、例えば、 FEBS Lett. , 228卷, 228頁, 1988年; FEBS Le tt. , 239卷, 285頁, 1988年;タンパク質核酸酵素, 35卷, 2191頁, 1990年; Nuc 1. Acids Res. , 17卷, 7059頁, 1989年などを参照することができる。また、へ ァピン型リボザィムについては、例えば、 Nature, 323卷, 349頁, 1986年; Nucl . Acids Res. , 19卷, 6751頁, 1991年;化学と生物, 30卷, 112頁, 1992年など を参照することができる。

(g) 本発明で用いられるタンパク質に対してドミナントネガティブに作用する 本発明で用いられるタンパク質の変異体もしくはそれをコードするポリヌクレオ チド

本発明で用いられるタンパク質に対してドミナントネガティブに作用する本発 明で用いられるタンパク質の変異体もしくはそれをコードするポリヌクレオチド は、本発明で用いられるタンパク質の活性を阻害することができるので、本発明 で用いられるタンパク質の活性を阻害する物質として好適に使用することができ る。本明細書において、「本発明で用いられるタンパク質に対してドミナントネ ガティブに作用するタンパク質の変異体」とは、それが発現することによって、 本発明で用いられるタンパク質の活性を阻害(消失もしくは低下)させる作用を 有するタンパク質を意味する(多比良和誠編,遺伝子の機能阻害実験法,羊土社

2 6— 3 2頁, 2 0 0 1年など参照)

(h) 本発明で用いられるタンパク質に対するァプタマ一

本発明で用いられるタンパク質に対するアブタマ一は、本発明で用いられるタ ンパク質の活性や機能を阻害することができるので、本発明で用いられるタンパ ク質の活性を阻害する物質として好適に使用することができる。アブタマ一は、 公知の方法、 {¾ - fiSELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) 法 (Annual Review of Medicine 56卷, 555 - 583頁, 2005年) を用 いて取得する。アブタマ一の構造は、公知の方法を用いて決定することができ、 その構造を基に公知の方法に従いアブタマ一を製造する。

( P—糖タンパク質発現抑制剤及ぴ抗癌剤耐性抑制剤)

( B C R P発現抑制剤及ぴ抗癌剤耐性抑制剤)

本発明においては、上記(a) 本発明で用いられるタンパク質に対する抗体、 (b) 本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列 に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセ ンスポリヌクレオチド、 (c) 本発明で用いられるタンパク質をコードするポリ ヌクレオチドに対する s i R N Aまたは s h R NA、 (d) 本発明で用いられる タンパク質をコードするポリヌクレオチドに対するリボザィム、 (e) 本発明で 用いられるタンパク質の活性を阻害する低分子化合物、(f) 本発明で用いられ るタンパク質の発現を阻害する低分子化合物などの活'|~生成分を常套手段に従って 、製剤化し、 P—糖タンパク質発現抑制剤または B C R P発現抑制剤として投与 することができる。 P—糖タンパク質発現抑制剤は、 P—糖タンパク質の発現を 抑制することによって、抗癌剤の細胞外への排出を抑制することができる。よつ て、 P—糖タンパク質発現抑制剤は、抗癌剤耐性抑制剤として用いることができ る。 B C R P発現抑制剤は、 B C R Pの発現を抑制することによって、抗癌剤の 細胞外への排出を抑制することができる。よって、 B C R P発現抑制剤は、抗癌 剤耐†生抑制剤として用いることができる。

例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的に は錠剤(糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む) 、丸剤、顆粒剤、散剤、カブ

セル剤(ソフトカプセル剤を含む)、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられ る。力かる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用 いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の 担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなど が用いられる。

非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、 注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節 内注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例 えば、上記活性成分を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解 、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば 、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な 溶解捕助剤、例えば、アルコール(例、エタノール)、ポリアルコール(例、プ ロピレンダリコール、ポリエチレングリコール)、非イオン界面活性剤〔例、ポ Vソノレべ一卜 8 0、 H C O— 5 0 (polyoxyethylene (50mol) adduct of hydrogen ated castor oil) 〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油 、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコ ールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填 される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記物質を通常の坐薬用基剤に混合する ことによって調製される。

なお前記した各組成物は、上記活性成分との配合により好ましくない相互作用 を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。

該活性成分の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートな どによっても異なるが、例えば、抗癌剤に対して耐性を獲得した肺癌の抗癌剤耐 性抑制の目的で本発明の活性成分を経口投与する場合、一般的に成人(体重 6 0 k gとして)においては、一日にっき該活性成分を、約 0 .:!〜 l O O m g、好 ましくは約 1 . 0〜5 0 m g、より好ましくは約 1 . 0〜2 O m g投与する。.非 経口的に投与する場合は、該活性成分の投与量は、対象疾患、投与対象、症状、 投与ルートなどによっても異なるが、例えば、抗癌剤に対して耐性を獲得した肺 癌の抗癌剤耐性抑制の目的で本発明の活性成分を注射剤の形で投与する場合、一 般的に成人 . (体重 6 0 k gとして)においては、一日につき該活性成分を、約 0 . 0 1〜 3 0 m g、好ましくは約 0 . l〜 2 0 m g、より好ましくは約 0 . 1〜

1 O m gを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重 6 0 k g当たりに換算した量を投与することができる。

より具体的には、(a) 上記本発明のタンパク質の活性を阻害する低分子化合 物またはその塩、(b) 上記本発明のタンパク質の発現を阻害する低分子化合物 またはその塩などは、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる 。例えば、経口投与のための製剤(医薬組成物)としては、固体または液体の剤 形、具体的には錠剤(糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む)、丸剤、顆粒剤 、散剤、カプセル剤(ソフトカプセル剤を含む)、シロップ剤、乳剤、懸濁剤な どがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野に おいて通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例え ば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグ ネシゥムなどが用いられる。非経口投与のための製剤としては、例えば、注射剤 、坐剤などが用いられる。注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉 注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自 体公知の方法に従って、例えば、上記活性成分を通常注射剤に用いられる無菌の 水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによつて調製することがで きる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助 薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール(例、 エタノール)、ポリアルコール(例、プロピレングリコール、ポリエチレングリ コール)、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート 8 0、 H C O— 5 0 (poly oxyethylene (50mol) adduct of hydrogenated castor oil) 〕なとと併用して ¾> よい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤と して安息香酸べンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された 注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、 上記物質を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。 . 上記アンチセンスポリヌクレオチドは、自体公知の方法に従って製剤化し、投 与することができる。また、例えば、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単 独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノウィルス ァソシエーテッドウィルスベクタ一などの適当なベクターに挿入した後、常套手

段に従って、ヒトまたは哺乳動物(例、ラット、ゥサギ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、 ネコ、ィヌ、サルなど)に対して経口的または非経口的に投与することができる 。該アンチセンスポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために 補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロ ゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。あるいは、エアロゾル 化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。さらに、体内動態の改 良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、前記のアンチセンス ポリヌクレオチドを単独またはリポゾームなどの担体とともに製剤(注射剤)化 し、静脈、皮下、関節腔内、癌病変部等に投与してもよい。上記二重鎖 R N A、 リボザィム、上記本発明で用いられるタンパク質に対してドミナントネガティブ に作用する本発明で用いられるタンパク質の変異体もしくはそれをコードするポ リヌクレオチドなどは、上記アンチセンスボリヌクレオチドと同様にして製剤化 し、投与することができる。

上記抗体、アブタマ一などは、それ自体または適当な医薬組成物として投与す ることができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と 薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かか る組成物は、経口または非経口投与(例、静脈注射)に適する剤形として提供さ れる。好ましくは吸入剤として提供される。

また、本発明の P—糖タンパク質発現抑制剤または B C R P発現抑制剤の対象 となる癌は、前記の抗癌剤の適用対象となる癌であれば特に制限されない。

(R a s、 R a f 、 ME K:、 E R Kまたは R S K阻害活性を指標として、 Ρ—糖 タンパク質発現抑制剤をスクリーニングする方法)

(R a s、 R a f 、 ME K:、 E R Kまたは R S K阻害活性を指標として、 B C R Ρ発現抑制剤をスクリ一二ングする方法)

次に、本発明は、 R a s、 R a f 、 ME K , E R Kまたは R S K阻害活性など の MA P K系シグナル伝達阻害活性を指標として、 Ρ—糖タンパク質発現抑制剤 または B C R Ρ発現抑制剤をスクリーニングする方法を提供する。

本発明のスクリーニング方法の好ましい態様は、試験化合物の MA P Κ系シグ ナル伝達阻害活性を評価し、 M A P K系シグナル伝達阻害活性を有する化合物を

選択することを含む方法である。 MA P K系シグナル伝達阻害活性とは、 MA P K系シグナル伝達に関与するタンパク質の発現阻害、活性化阻害、不安定化など により MA P K系シグナル伝達に関与するタンパク質を介したシグナル伝達を阻 害しうる活性を意味する。したがって、 MAPK系シグナル伝達阻害活性は、 M APK系シグナル伝達に対する阻害活性によって評価しうる他、 Ra sタンパク 質、 Ra f タンパク質、 MEKタンパク質、 ERKタンパク質、 RSKタンパク 質などの MA P K系シグナル伝達に関与するタンパク質の発現阻害活性、活性化 阻害活性、不安定ィヒ活性などにより評価することもできる。このようにして選択 された化合物は、 P—糖タンパク質または BCRPの発現を抑制する化合物であ り、抗癌剤耐性抑制剤のための候捕化合物となる。

MA P K系シグナル伝達に関与するタンパク質の発現阻害活性、活性化阻害活 性、不安定ィ匕活性などは公知の方法に従って測定することができる。具体的には、 例えば、 Ra S阻害活性、 Ra f 阻害活性、 ME K阻害活性、 ERK阻害活性、 R S K阻害活性などにより MA P K系シグナル伝達阻害活性を評価することが可 能である。ここで、 R a s阻害活性、 R a f 阻害活性、 ME K阻害性、 ERK 阻害活性または RSK阻害活性とは、 R a sタンパク質、 Ra f タンパク質、 M EKタンパク質、 ERKタンパク質または RSKタンパク質の発現阻害、活性化 阻害、不活性化などにより Ra sタンパク質、 Ra f タンパク質、 MEKタンパ ク質、 E R Kタンパク質または R S Kタンパク質を介したシグナル伝達を阻害し うる活性を意味する。

R a s阻害活性は、例えば、 J. Biol. Chem. 270: 26802 - 26806 (1995)、 Cane er Res. 56: 1727-1730 (1996)、 Cancer Res. 59: 4919-4926 (1999)に記載の方 法により測定することができる。 Ra f 阻害活性、例えば、 Chem. Biol. 6: 55 9-568 (1999)、 Int. J. Clin. Pharmacol. Ther. 40: 567 - 568 (2002)に記載の 方法により測定することができる。 ME K阻害活性は、例えば、 W099Z01 426、 J. Immunol. 160, 4175 (1998); J. Biol. Chem. 273, 18623 (1998); J. Biol. Chem. 274, 6168 (1999); J. Biol. Chem. 274, 6747 (1999); Bioorg. Med. Chem. Lett. 8, 2839 (1998)··等に記載の方法により測定することができ る。 ERK阻害活性は、例えば、特開 2005- 330265号公報に記載の方法により測 定することができる。 RSK阻害活性は、例えば、 Org. Lett. 7: 1097-1099 (2

005)、 Bioorg. Med. Chem. 14: 3974-3977 (2006)に記載の方法により測定する ことができる。

試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化 合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血 漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合 物であってもよい。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩とし ては、生理学的に許容される金属塩、アンモニゥム塩、有機塩基との塩、無機酸 との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。金 属塩の好適な例としては、例えばナトリゥム塩、力リゥム塩などのアルカリ金属 塩;カルシウム塩、マグネシウム塩、バリゥム塩などのアル力リ土類金属塩;ァ ルミニゥム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばト リメチルァミン、トリェチルァミン、ピリジン、ピコリン、 2 , 6ールチジン、 エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノーノレアミン、シクロへキシ ルァミン、ジシク口へキシルァミン、 N , N' —ジべンジルェチレンジァミンな どとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水 素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例と しては、例えばギ酸、酢酸、トリフルォロ酢酸、プロピオン酸、フタル酸、フマ ル酸、シユウ酸、酒石酸、マレイン酸、クェン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタン スルホン酸、安息香酸、ベンゼンスルホン酸、 p—トルエンスルホン酸などとの 塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、 リジン、オル-チンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例とし ては、例えばァスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。

より具体的には、例えば、(1 ) (i) 試験化合物を細胞に接触させた場合と、 (ii) 試験化合物を細胞に接触させない場合との、該細胞の R a s、 R a f 、 M E K:、 E R Kまたは R S Kを介したシグナル伝達などの MA P K系シグナル伝達 活性の比較を行うことを特徴とする Ρ—糖タンパク質発現抑制剤または B C R Ρ 発現抑制剤のスクリーニング方法を提供する。

本方法においては、まず、 ΜΑ Ρ Κ系シグナル伝達に関与するタンパク質を発 現する細胞に、試験ィヒ合物を接触させる。用いられる「細胞」の由来としては、 ヒト、マウス、ネコ、ィヌ、ゥシ、ヒッジ、トリなど、ペット、家畜等に由来す る細胞が挙げられるが、これら由来に制限されない。「MA P K系シグナル伝達 に関与するタンパク質を発現する細胞」としては、 MA P K系シグナル伝達に関 与するタンパク質を発現している細胞、または外因性の M A P K系シグナル伝達 に関与するタンパク質をコードする遺伝子が導入され、該遺伝子が発現している 細胞を利用することができる。外因性の MA P K系シグナル伝達に関与するタン パク質をコードする遺伝子が発現した細胞は、通常、それぞれ MA P K系シグナ ル伝達に関与するタンパク質をコードする遺伝子が挿入された発現べクターを宿 主細胞へ導入することにより作製することができる。該発現べクタ一は、一般的 な遺伝子工学技術によって作製することができる。

次に、 MA P K系シグナル伝達活性(例えば、リン酸化活性)を測定する。具 体的には、例えば、(i) と(ii) の場合において、上記細胞を培養し、その M A P K系シグナル伝達活性を測定する。 MA P K系シグナル伝達活性は、公知の 方法、例えば、 Raf、 MEK、 ERK、 RSK のリン酸化をそれらのタンパク質に対して 特異的に反応するリン酸化抗体を用いたウェスタンブロッテイング法あるいは E LISA法により、あるいはその下流に存在する転写因子(CREB、 c - Fosなど)のリ ン酸ィヒをそれらのタンパク質に対して特異的に反応するリン酸ィヒ抗体を用いたゥ エスタンプロッティング法あるいは ELISA法などにより測定することができる。 また、 MAPK系シグナル伝達に関与するタンパク質の下流に存在する転写因子の 転写活性化能の測定、例えば、その転写因子の標的遺伝子のプロモータ一領域を 常法に従って単離し、その下流に標識遺伝子(例えば、ルシフヱラーゼ、 GFP、 ガラクトシダーゼ等の発光、蛍光、発色遺伝子)をつなげ、その標識遺伝子の活 性を見ることにより、 MAPK系シグナル伝達活性を測定することもできる。試験 化合物としては、前記と同様のものが用いられる。

次いで、試験化合物を接触させない場合(コントロール)と比較して、 MA P K系シグナル伝達を抑制 (低下) させる化合物を選択する。例えば、上記 (i) の場合における MA P K系シグナル伝達活性を、上記 (ii) の場合に比べて、.約 2 0 %以上、好ましくは 3 0 %以上、より好ましくは約 5 0 %以上抑制する試験 化合物を、 MA P K系シグナル伝達を抑制(低下)させる化合物として選択する ことができる。このようにして選択された化合物は、 P—糖タンパク質または B C R Pの発現を抑制する化合物またはその塩であり、抗癌剤耐性抑制剤のための

候補化合物となる。

また、例えば(2) (i) 試験化合物を細胞に接触させた場合と、(ii) 試験 化合物を細胞に接触させない場合との、該細胞の R a sタンパク質、 Ra f タン ノク質、 MEKタンパク質、 ERKタンパク質、 RSKタンパク質などの MAP K系シグナル伝達に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルの比較 を行うことを特徴とする P—糖タンパク質発現抑制剤または B C R P発現抑制剤 のスクリ一二ング方法を提供する。

本方法においては、まず、 MAPK系シグナル伝達に関与するタンパク質をコ 一ドする遺伝子を発現する細胞に、前記と同様にして試験化合物を接触させる。 該細胞としては、 Ra sタンパグ質、 Ra f タンパク質、 MEKタンパク質、 E RKタンパク質、 R SKタンパク質などの MAPK系シグナル伝達に関与するタ ンパク質をコードする遺伝子を発現する細胞、例えば、ヒト外陰部がん細胞 A43 1、ヒト大腸がん細胞 HCT - 15、 SW620、ヒト乳がん細胞 MCF- 7、 MDA - MB- 231、ヒト 非小細胞肺がん細胞 A549、ヒト卵巣がん細胞 0VCAR-5 などが好ましく用いられ る。

次に、 MAPK系シグナル伝達に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発 現を測定する。具体的には、例えば、上記(i) と(ii) の場合において、上記 細胞を培養し、それらの MA P K系シグナル伝達に関与するタンパク質をコード する遺伝子の発現レベルを測定する。遺伝子の発現レベルの測定は、転写レベル または翻訳レベルの測定など、公知の方法によって行うことができる。例えば、 M A P K系シグナル伝達に関与するタンパク質をコードする遺伝子を発現する細 胞から niRN Aを常法に従って抽出し、この mRNAを鎳型としたノーザンハイ ブリダイゼーション法または R T— P C R法を実施することによつて該遺伝子の 転写レベルを測定することができる。あるいは、 MAPK系シグナル伝達に関与 するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域を常法に従って単離し、 その下流に標識遺伝子(例えば、ルシフェラーゼ、 GFP、ガラクトシダーゼ等 の発光、蛍光、発色などを指標に検出可能な遺伝子が挙げられるが、これらに限 定されない)をつなげ、その標識遺伝子の活性を見ることによっても該遺伝子の 転写レベルの測定を行うことができる。また、 MAPK系シグナル伝達に関与す るタンパク質をコードする遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回収し、

それぞれ MA P K系シグナル伝達に関与するタンパク質の発現を SDS-PAG E等の電気泳動法で検出することにより、該遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこ ともできる。さらに、 MAPK系シグナル伝達に関与するタンパク質に対する抗 体を用いて、ウェスタンプロッティング法を実施することにより該タンパク質の 発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。 MAPK系シグナル伝達に関与するタンパク質の検出に用いる抗体としては、検 出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、または ポリクローナル抗体のいずれも利用することができる。試験化合物としては、前 記と同様のものが用いられる。

次いで、試験化合物を接触させない場合(コントロール)と比較して、 MAP K系シグナル伝達に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを抑制 (低下)させる化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、 P—糖 タンパク質または BCRPの発現を抑制する化合物またはその塩であり、抗癌剤 耐性抑制剤のための候補化合物となる。

さらに、例えば、(3) (i) 試験化合物の存在下および(ii) 試験化合物の 非存在下における R a sタンパク質、 Ra f タンパク質、 ME Kタンパク質、 E R Kタンパク質、 R S Kタンパク質などの MA P K系シグナル伝達に関与するタ ンパク質の活性の比較を行うことを特徴とする P—糖タンパク質発現抑制剤また は BCRP発現抑制剤のスクリーニング方法も提供する。具体的には、例えば、 上記 (i) と(ii) の場合において R a sタンパク質、 Ra f タンパク質、 ME Kタンパク質、 ERKタンパク質、 RSKタンパク質などの MAPK系シグナル 伝達に関与するタンパク質の活性を測定する。次いで、試験化合物の非存在下の 場合 (コントロール)と比較して、 MAPK系シグナル伝達に関与するタンパク 質の活性を抑制(低下)させる化合物を選択する。 MAPK系シグナル伝達に関 与するタンパク質の活性は、公知の方法、例えば、 Raf、 MEK、 ERK、 RSK のリン 酸化をそれらのタンパク質に対して特異的に反応するリン酸化抗体を用いたゥェ スタンプ口ッティング法あるいは ELISA法により、あるいはその下流に存在する 転写因子(CREB、 c-Fos など)のリン酸化をそれらのタンパク質に対して特異的 に反応するリン酸化抗体を用いたウェスタンブロッティング法あるいは ELISA法 などにより測定することができる。また、 MAPK 系シグナル伝達に関与するタン

パク質の下流に存在する転写因子の転写活性化能の測定、例えば、その転写因子 の標的遺伝子のプロモーター領域を常法に従って単離し、その下流に標識遺伝子

(例えば、ルシフヱラーゼ、 GFP、ガラクトシダーゼ等の発光、蛍光、発色遺伝 子)をつなげ、その標識遺伝子の活性を見ることにより、 MAPK 系シグナル伝達 に関与するタンパク質の活性を測定することもできる。このようにして選択され た化合物は、 P—糖タンパク質または B C R Pの発現を抑制する化合物またはそ の塩であり、抗癌剤耐性抑制剤のための候補化合物となる。

また、例えば、(4 ) (i) 試験化合物の存在下および(i i) 試験化合物の非 存在下における R a sタンパク質、 R a f タンパク質、 M E Kタンパク質、 E R Kタンパク質、 R S Kタンパク質などの MA P K系シグナル伝達に関与するタン パク質の安定性の比較を行うことを特徴とする P—糖タンパク質発現抑制剤のス クリーニング方法なども提供する。具体的には、例えば、上記(i) と(i i) の 場合において MA P K系シグナル伝達に関与するタンパク質の安定性を測定する。

MA P K系シグナル伝達に関与するタンパク質の安定性は、公知の方法、例えば、 Cancer Res. 65: 596 - 604 (2005)に記載の方法(35S - labelled pulse chase法) などにより測定することができる。次いで、試験化合物の非存在下の場合 (コン トロール)と比較して、 MA P K系シグナル伝達に関与するタンパク質の安定性 を抑制(低下)させる化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、 Pー糖タンパク質の発現を抑制する化合物またはその塩であり、抗癌剤耐性抑制 剤のための候補化合物となる。

上記方法によって選択された化合物は、さらに P—糖タンパク質または B C R Pの発現を指標としてスクリーニングするのが好ましい。例えば、(1 ) (i) 試験化合物を細胞に接触させた場合と、(i i) 試験化合物を細胞に接触させない 場合との、該細胞の P—糖タンパク質または B C R Pの発現レベルの比較を行う ことによって P—糖タンパク質発現抑制剤または B C R P発現抑制剤をスタリー ニングするのが好ましい。

具体的には、例えば、上記(i) と(i i) の場合において、上記細胞を培養し、 それらの P—糖タンパク質または B C R Pをコードする遺伝子の発現レベルを測 定する。遺伝子の発現レベルの測定は、転写レベルまたは翻訳レベルの測定など、 公知の方法によって行うことができる。例えば、 P—糖タンパク質または B C R

Pをコードする遺伝子を発現する細胞から mRNAを常法に従って抽出し、この mRNAを鎢型としたノーザンハイプリダイゼーション法または RT—P CR法 を実施することによつて該遺伝子の転写レベルを測定することができる。あるい は、 P—糖タンパク質または BCRPをコードする遺伝子のプロモーター領域を 常法に従って単離し、その下流に標識遺伝子(例えば、ルシフニラーゼ、 GFP、 ガラクトシダーゼ等の発光、蛍光、発色などを指標に検出可能な遺伝子が挙げら れるが、これらに限定されない)をつなげ、その標識遺伝子の活性を見ることに よっても該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。また、 P—糖タンパ ク質または B C R Pをコードする遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回 収し、それぞれ P—糖タンパク質または BCRPの発現を SDS— PAGE等の 電気泳動法で検出することにより、該遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともで きる。さらに、 P—糖タンパク質または BCRPに対する抗体を用いて、ウェス タンプロッティング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出すること により、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。 P—糖タンパク質 または BCRPの検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制 限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体のいずれも 利用することができる。試験化合物としては、上記方法によって選択された化合 物が用いられる。

次いで、試験化合物を接触させない場合(コントロール)と比較して、 P—糖 タンパク質または BCRPをコードする遺伝子の発現レベルを抑制(低下)させ る化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、 P—糖タンパク質ま たは B CR Pの発現を抑制する化合物またはその塩であり、抗癌剤耐性抑制剤の ための候補化合物となる。

( P—糖タンパク質発現抑制剤を含有してなる耐性獲得が抑制された癌治療剤) (BCRP発現抑制剤を含有してなる耐性獲得が抑制された癌治療剤)

さらに、本発明は、 P—糖タンパク質発現抑制剤を含有してなる耐性獲得が抑 制された抗癌剤(以下、「耐性獲得抑制抗癌剤」という)を提供する。本発明の 耐性獲得抑制抗癌剤は、 P—糖タンパク質の発現を抑制する活性と共に抗癌活性 を有する 糖タンパク質発現抑制剤を含有する。したがって、本発明の耐性獲 得抑制抗癌剤は、癌細胞を選択的に死滅させ、癌細胞の増殖を抑制し、および/ または癌細胞のァポトーシスを誘導することができると共に、 P—糖タンパク質 の発現を抑制することによつて癌細胞の薬剤耐性獲得を抑制することができるの で、耐性獲得が抑制された抗癌剤として有用である。本発明の耐性獲得抑制抗癌 剤は、 P—糖タンパク質の発現を抑制する活性と共に抗癌活性を有する P—糖タ ンパク質発現抑制剤を単独で含有することができるし、さらに、これ以外の抗癌 剤を配合することもできる。

さらに、本発明は B C R P発現抑制剤含有してなる耐性獲得が抑制された抗癌 剤 (以下、「耐性獲得抑制抗癌剤」という)を提供する。本発明の耐性獲得抑制 抗癌剤は、 B C R Pの発現を抑制する活性と共に抗癌活性を有する B C R P発現 抑制剤を含有する。したがって、本発明の耐性獲得抑制抗癌剤は、癌細胞を選択 的に死滅させ、癌細胞の増殖を抑制し、およびノまたは癌細胞のアポトーシスを 誘導することができると共に、 B C R Pの発現を抑制することによつて癌細胞の 薬剤耐性獲得を抑制することができるので、耐性獲得が抑制された抗癌剤として 有用である。本発明の耐性獲得抑制抗癌剤は、 B C R Pの発現を抑する活性と 共に抗癌活性を有する B C R P発現抑制剤を単独で含有することができるし、さ らに、これ以外の抗癌剤を配合することもできる。

本発明の耐性獲得が抑制された抗癌剤に用いられる MA P K系シグナル伝達阻 害剤としては、上記した MA P K系シグナル伝達阻害剤を好ましく用いることが できるが、なかでも R a s阻害剤、 R a f 阻害剤、 ME K阻害剤、 E R K阻害剤 および R S K阻害剤が好ましい。

本発明で用いられる P—糖タンパク質発現抑制剤または B C R P発現抑制剤を 上述の剤として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。 例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的に は錠剤(糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む)、丸剤、顆粒剤、散剤、カブ セル剤(ソフトカプセル剤を含む)、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられ る。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用 いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の 担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなど が用いられる。

非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、 注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節 内注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例 えば、上記 P—糖タンパク質発現抑制剤を通常注射剤に用いられる無菌の水性も しくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性 液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液など が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール(例、エタノール)、ポリ アルコール (例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコーノレ) 、非イオン 界面活性剤〔例、ポリソルベート 8 0、 H C O— 5 0 (polyoxyethylene (50raol) adduct of hydrogenated castor oil) 〕などと併用してもよレ、。油个生液として は、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジ ル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適 当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記 P—糖タンパク 質発現抑制剤を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。

上記め経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するよう な投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形とし ては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤(アンプル)、坐剤などが例示され、そ れぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜 5 0 0 m g、とりわけ注射剤では 5〜 1 · 0 0 m g、その他の剤形では 1 0〜 2 5 0 m gの上記 P—糖タンパク質発現抑制剤 または B C R P発現抑制剤が含有されていることが好まし!/、。

なお前記した各組成物は、上記物質との配合により好ましくない相互作用を生 じない限り他の活性成分を含有してもよレ、。

このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは 温血動物(例えば、マウス、ラット、ゥサギ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、ゥマ、トリ.. 、ネコ、ィヌ、サル、チンパンジーなど)に対して経口的にまたは非経口的に投 与することができる。 . 上記 P—糖タンパク質発現抑制剤または B C R P発現抑制剤の投与量は、その 作用、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば 、肺癌の治療の目的で本発明で用いられる P—糖タンパク質発現抑制剤を経口投 与する場合、.一般的に成人(体重 6 0 k gとして)においては、一日につき該剤

を、それぞれ約 0. 1〜100mg、好ましくは約 1. 0〜50mg、より好ま しくは約 1. 0〜20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該剤の投与量 は、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、 肺癌の治療の目的で本発明で用いられる P—糖タンパク質発現抑制剤を注射剤の 形で投与する場合、一般的に成人(体重 60 k gとして)においては、一日につ き該剤を、それぞれ約 0. 01〜30mg、好ましくは約 0. l〜20mg、よ り好ましくは約 0. 1〜1 Omgを静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、体重 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。 また、本発明の P—糖タンパク質発現抑制剤または BCRP発現抑制剤は、ホ ルモン療法剤、抗癌剤(例、化学療法剤、免疫療法剤、チロシンキナーゼシダナ ル経路阻害剤(細胞増殖因子ならびにその受容体の作用を阻害する薬剤)など( 以下、併用薬物と略記する)と併用して使用することができる。

本発明の化合物は単剤として使用しても優れた抗癌作用を示すが、さらに前記 併用薬物の一つまたは幾つかと併用(多剤併用)することによって、その効果を より増強させることができる。

また、本発明の P—糖タンパク質発現抑制剤は、抗癌剤耐性抑制剤として用い ることができるので、 P—糖タンパク質発現抑制剤と抗癌剤(例、ホルモン療法 剤、化学療法剤、免疫療法剤、または細胞増殖因子ならびにその受容体の作用を 阻害する薬剤)とを組み合わせると、耐性を獲得した癌に対して癌治療剤として 極めて有効である。

より具体的には、本発明の(A) P—糖タンパク質発現抑制剤と(B) 前記の 癌細胞が耐性を獲得し得る抗癌剤とを併用すれば、耐性を獲得した癌に対する治 療効果が回復するので、これら成分(A) 及び(B) を含有する組成物又は併用 剤は新たな癌治療剤として有用である。

また、本発明の(A) P—糖タンパク質発現抑制剤と(B) 前記の癌細胞が耐 性を獲得し得る抗癌剤とを併用すれば、癌に対する耐性を獲得するのを抑制して 癌治療を行うことができるので、これら成分(A) 及び(B) を含有する組成物 又は併用剤は新たな癌治療剤として有用である。

また、本発明の BCRP発現抑制剤は、抗癌剤耐性抑制剤として用いることが できるので、. BCRP発現抑制剤と抗癌剤(例、ホルモン療法剤、化学療法剤、 免疫療法剤、または細胞増殖因子ならびにその受容体の作用を阻害する薬剤)と を組み合わせると、耐性を獲得した癌に対して癌治療剤として極めて有効である

より具体的には、本発明の(A) B C R P発現抑制剤と(B ) 前記の癌細胞が 耐性を獲得し得る抗癌剤とを併用すれば、耐性を獲得した癌に対する治療効果が 回復するので、これら成分(A) 及び(B ) を含有する組成物又は併用剤は新た な癌治療剤として有用である。

また、本発明の(A) B C R Pと(B ) 前記の癌細胞が耐性を獲得し得る抗癌 剤とを併用すれば、癌に対する耐性を獲得するのを抑制して癌治療を行うことが できるので、これら成分(A) 及び(B ) を含有する組成物又は併用剤は新たな 癌治療剤として有用である。

力かる癌細胞が耐性を獲得し得る抗癌剤としては、 P—糖タンパク質または B C R Pにより耐性を生じる抗癌剤であれば制限されないが、例えば、塩酸ドキソ ノレビシン、ダウノマイシン、塩酸ェピルビシン、ァドリアマイシン等のアンスラ サイタリン類;ピンクリスチン等のビン力アル力ロイド類;パクリタキセル、ド セタキセル等のタキサン類の他にも、ホルモン療法剤、化学療法剤、免疫療法剤、 または細胞増殖因子ならびにその受容体の作用を阻害する薬剤などが挙げられる。

「ホルモン療法剤」としては、例えば、ホスフェストローノレ、ジェチルスチノレ ベストロール、クロロトリア二セン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲ ストローノレ、酢酸クロノレマジノン、酢酸シプロテロン、ダナゾーノレ、ジエノゲス ト、ァソプリス二ノレ、ァリルエストレノール、ゲストリノン、ノメゲストローノレ 、タデナン、メパノレトリシン、ラロキシフェン、才ルメロキシフェン、レボルメ ロキシフェン、抗エストロゲン (例、タエン酸タモキシフェン、タエン酸トレミ フェン等)、 ERダウンレギュレーター (例、フルべストラント等) 、ヒト閉経ゴ ナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、ピル製剤、メピチォスタン、テスト口ラクト ン、ァミノグルテチイミド、 LH- RHァゴニスト (例、酢酸ゴセレリン、ブセレリ ン、リュープロレリン等)、ドロロキシフェン、ェピチォスタノ一ノレ、スノレホン 酸ェチェルエストラジオール、ァロマターゼ阻害薬(例、塩酸フアドロゾール、 アナストロゾーノレ、レトロゾーノレ、ェキセメスタン、ボロゾーノレ、フォノレメスタ ン等)、抗アンドロゲン (例、フルタミド、ビカルタミド、ニルタミド等)、 5 -レダクターゼ阻害薬 (例、フィナステリド、デュタステリド、ェプリステリ ド等)、副腎皮質ホルモン系薬剤(例、デキサメタゾン、プレドニゾロン、ベタ メタゾン、トリアムシノロン等) 、アンドロゲン合成阻害薬 (例、アビラテロン 等)、レチノイドおょぴレチノイドの代謝を遅らせる薬剤(例、リアロゾール等 ) などが挙げられる。 LH-RHァゴニスト(例、酢酸ゴセレリン、プセレリン、リ ユープロレリン等)が好ましい。

「化学療法剤」としては、例えばアルキル化剤、代謝拮抗剤、抗癌性抗生物質 、植物由来抗癌剤などが挙げられる。

「アルキル化剤」としては、例えば、ナイトロジェンマスタード、塩酸ナイト ロジェンマスタード- N-ォキシド、クロラムプチノレ、シク口フォスフアミド、ィ ホスフアミド、チォテパ、カノレボコン、トシノレ酸インプロスノレファン、ブスノレフ アン、塩酸二ムスチン、ミトブロニトー^/、メノレファラン、ダカノレバジン、ラニ ムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、トリエチレンメラミン、カルム スチン、口ムスチン、ストレプトゾシン、ピポブロマン、エトグノレシド、力/レポ ブラチン、シスプラチン、ミポプラチン、ネダプラチン、ォキサリブラチン、ァ ノレトレタミン、アンバムスチン、塩酸ジプロスビジゥム、フォテムスチン、プレ ドニムスチン、プミテパ、リボムスチン、テモゾ口ミド、トレォスノレファン、ト 口フォスフアミド、ジノスタチンスチマラマ一、ァドゼレシン、システムスチン 、ビゼレシンなどが挙げられる。

「代謝拮抗剤」としては、例えば、メルカブトプリン、 6 -メルカブトプリンリ ボシド、チォイノシン、メトトレキサート、エノシタビン、シタラビン、シタラ ビンォクフォスフアート、塩酸アンシタビン、 5-FU系薬剤(例、フルォロウラシ ル、テガフール、 UFT、ドキシフルリジン、カルモフール、ガロシタビン、エミ テフール等)、アミノプテリン、ロイコボリンカルシウム、タブロイド、ブトシ ン、フオリネィトカルシウム、レボフオリネィトカルシウム、クラドリビン、ェ ミテフール、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、ペントスタ チン、ピリトレキシム、イドキシゥリジン、ミトグァゾン、チアゾフリン、アン バムスチンなどが挙げられる。

「抗癌性抗生物質」としては、例えば、ァクチノマイシン!)、ァクチノマイシ ン。、マイト.マイシン C、クロモマイシン A3、塩酸ブレオマイシン、硫酸ブレオマ イシン、硫酸ぺプロマイシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸 アクラルビシン、塩酸ピラノレビシン、塩酸ェピルビシン、ネオカルチノスタチン 、ミスラマィシン、ザルコマイシン、カルチノフィリン、ミトタン、塩酸ゾルビ シン、塩酸ミトキサントロン、塩酸イダルビシンなどが挙げられる。

「植物由来抗癌剤」としては、例えば、エト'ポシド、リン酸エトポシド、硫酸 ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、テニポシド、パクリタ キセル、ドセタクセル、ピノレルビンなどが挙げられる。

「免疫療法剤(BRM) 」としては、例えば、ピシバニール、クレスチン、シゾ フイラン、レンチナン、ウベニメクス、インターフェロン、ィンターロイキン、 マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポイエチ ン、リンホトキシン、 BCGワクチン、コリネバクテリゥムパルブム、レバミゾー ノレ、ポリサッカライド K、プロコダゾールなどが挙げられる。

「細胞増殖因子ならびにその受容体の作用を阻害する薬剤」における「細胞増 殖因子」としては、細胞の増殖を促進する物質であればどのようなものでもよく 、通常、分子量が 20, 000以下のペプチドで、受容体との結合により低濃度で作用 が発揮される因子が用いられ、具体的には、(1) EGF (epidermal growth facto r) またはそれと実質的に同一の活性を有する物質〔例、 EGF、ハレダリン(HER2 リガンド)等〕、(2) インシュリンまたはそれと実質的に同一の活性を有する 物質 〔例、インシュリン、 IGF (insul in-l ike growth factor) -1 , IGF- 2等〕、 (3) FGF (fibroblast growth factor) またはそれと実質的に同一の活性を有す る物質〔例、酸性 FGF、塩基性 FGF、 KGF (keratinocyte growth factor) 、 FGF- 1 0等〕、 (4) その他の細胞増殖因子〔例、 CSF (colony stimulating factor) 、 EP0 erythropoietinリ、 IL-2 (interleukin-2) 、 NGF (nerve growth factor) 、 PDGF (platelet-derived growth factor) TGF β ( t ransforming growth fac tor β ) 、 HGF (hepatocyte growth f actor)、 VEGF (vascular endothelial gro wth factor)等〕などが挙げられる。

「細胞増殖因子の受容体」としては、前記の細胞増殖因子と結合能を有する受 容体であればいかなるものであってもよく、具体的には、 EGF受容体、ハレダリ ン受容体(HER2) 、インシュリン受容体、 IGF受容体、 FGF受容体- 1または F GF受 容体- 2などが挙げられる。

「細胞増殖因子の作用を阻害する薬剤」としては、トラスッズマブ(ハーセプ チン (商標); HER2抗体)、メシル酸ィマチニプ、 ZD1839またはセツキシマプ、 VEGFに対する抗体(例、べバシツマブ)、 VEGF受容体に対する抗体、ゲフイチ二 ブ、エル口チ-ブなどが挙げられる。

前記の薬剤の他に、 L-ァスパラギナーゼ、ァセグラトン、塩酸プロカルバジン 、プロトポルフィリン · コバルト錯塩、水銀へマトボルフィリン ·ナトリウム、 トポイソメラーゼ I阻害薬(例、イリノテカン、トポテカン等)、トポイソメラ ーゼ II阻害薬(例えば、ソプゾキサン等)、分化誘導剤(例、レチノイド、ビタ ミン D類等)、血管新生阻害薬(例、サリドマイド、 SU11248等)、ひ一ブロッ力 一 (例、塩酸タムスロシン、ナフトビジル、ゥラピジル、アルフゾシン、テラゾ シン、プラゾシン、シロドシン等)セリン .スレオニンキナーゼ阻害薬、エンド セリン受容体拮抗薬(例、アトラセンタン等)、プロテアゾーム阻害薬(例、ボ ルテゾミブ等)、 Hsp90阻害薬(例、 17- AAG、 DMAG (17- desmethoxy- 17- N, N- dime thylaminoethylamino-geldanamycin 等)、スピロノラタトン、ミノキシジノレ、 1 1ひーヒドロキシプロゲステロン、骨吸収阻害 ·転移抑制薬(例、ゾレドロン酸、 アレンドロン酸、パミドロン酸、ェチドロン酸、ィバンドロン酸、クロドロン酸

)なども用いることができる。

本発明の新たな抗癌剤、抗癌剤耐性抑制剤、癌治療剤は、これらの成分が従来 用いられている製剤をそのまま併用することにより投与してもよいが、これらの 成分を含む新たな製剤としてもよい。これらの製剤の形態としては、経口剤、注 射剤 (筋肉、皮下、静脈を含む)、坐剤、外用剤(パッチ剤、塗布剤)等が挙げ られる。

上記本発明の癌治療剤などの医薬は、本発明で用いられる P—糖タンパク質発 現抑制剤と、本発明で用いられる抗癌剤とが同時に作用を示すことができる形態 であればよい。例えば、本発明で用いられる P—糖タンパク質発現抑制剤と、本 発明で用いられる抗癌剤とを、一つの医薬組成物(例、錠剤(糖衣錠、フィルム コーティング錠を含む)、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤(ソフトカプセル剤 を含む)、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、注射剤、坐剤など)中に製剤化した配合 剤としてもよい。また、本発明の癌治療剤などの医薬は、本発明で用いられる P 一糖タンパク質発現抑制剤と、本発明で用いられる抗癌剤とからなるキットであ

つてもよい。この場合、本発明で用いられる P—糖タンパク質発現抑制剤と、本 発明で用いられる抗癌剤とは、本発明で用いられる P—糖タンパク質発現抑制剤 と抗癌剤とが同時に作用することができるかぎり時間差を置いて投与してもよい 力 同時に投与するのが好ましい。

本発明の癌治療剤などの医薬における P—糖タンパク質発現抑制剤と抗癌剤と の投与量の比率(または配合比)は、投与(または配合)される本発明で用いら れる P—糖タンパク質発現抑制剤および抗癌剤の種類および/または組み合わせ

、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、重 量比で、約 1 : 500〜 500 : 1、好ましくは約 1 : 100〜 100 : 1、よ り好ましくは 1 : 10〜: 10 : 1、特に好ましくは 1 : 5〜5 : 1である。また 、本発明の癌治療剤などの医薬における B C R P発現抑制剤と抗癌剤との投与量 の比率(または配合比)は、投与(または配合)される本発明で用いられる P— 糖タンパク質発現抑制剤およぴ抗癌剤の種類およぴ Zまたは組み合わせ、投与対 象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、重量比で、 約 1 : 500〜 500 : 1、好ましくは約 1 : 100〜 100 : 1、より好まし くは 1 : 10〜 10 : 1、特に好ましくは 1 : 5〜 5 : 1である。

本発明で用いられる P—糖タンパク質発現抑制剤と抗癌剤とを上述の剤として 使用する場合、例えば上述した方法など、常套手段に従って製剤化することがで きる。また、本発明で用いられる BCRP発現抑制剤と抗癌剤とを上述の剤とし て使用する場合、例えば上述した方法など、常套手段に従って製剤化することが できる。

例えば、経口投与のための糸且成物としては、固体または液体の剤形、具体的に は錠剤(糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む)、丸剤、顆粒剤、散剤、カブ セル剤(ソフトカプセル剤を含む)、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられ る。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用 いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の 担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなど が用いられる。

非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、 注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節 内注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例 えば、上記剤を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁 または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理 食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補 助剤、例えば、アルコール(例、エタノール)、ポリアルコール(例、プロピレ ングリコール、ポリエチレングリコール)、非イオン界面活性剤〔例、ポリソル ~卜 8 0、 Hし U——5 0 、polyoxyethy丄 ene (50mol) adduct of hydrogenated c astor oil) 〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆 油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールな どを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される 。直腸投与に用いられる坐剤は、上記剤を通常の坐薬用基剤に混合することによ つて調製される。

上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するよう な投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形とし ては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤(アンプル)、坐剤などが例示され、そ れぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜5 0 0 m g、とりわけ注射剤では 5〜 1 0 0 m g、その他の剤形では 1 0〜2 5 0 m gの上記 P—糖タンパク質発現抑制剤 と抗癌剤とが、それぞれ含有されていることが好ましい。

なお前記した各組成物は、上記物質との配合により好ましくない相互作用を生 じない限り他の活性成分を含有してもよい。

このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは 温血動物 (例えば、マウス、ラット、ゥサギ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、ゥマ、トリ 、ネコ、ィヌ、サル、チンパンジーなど)に対して経口的にまたは非経口的に投 与することができる。

上記剤の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどに よっても異なるが、例えば、肺癌の治療の目的で本発明で用いられる P—糖タン パク質発現抑制剤と抗癌剤とを経口投与する場合、一般的に成人(体重 6 0 k g として)においては、一日につき該剤を、それぞれ約 0 · 1〜: L 0 0 m g、好ま しくは約 1 . 0〜5 0 m g、より好ましくは約 1 . 0〜2 O m g投与する。非経 口的に投与する場合は、該剤の投与量は、対象疾患、投与対象、症状、投与ルー

トなどによっても異なるが、例えば、肺癌の治療の目的で本発明で用いられる P ー糖タンパク質発現抑制剤と抗癌剤とを注射剤の形で投与する場合、一般的に成 人 (体重 6 0 k gとして)においては、一日につき該剤を、それぞれ約 0 . 0 1 〜 3 0 m g、好ましくは約 0 . l〜2 0 m g、より好ましくは約 0 . 1〜: L 0 m gを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重 6 0 k g当たりに換算した量を投与することができる。

本明細書および配列表において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるレ、は当該 分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に 関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければ L体を示すものとする。

実施例

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら 限定されるものではない。

調製例 1 ( P—糖タンパク質高発現株の調製)

( 1 ) MDR1遺伝子

本発明でヒト野生型 MDR1 cDNAと呼ぶ遺伝子としては、ヒトの副腎の cDNAラ イブラリーより単離されたヒト野生型 MDR1 cDNAを用いた(Biochem Biophys Res Co讓 n 162: 224- 231 (1989)参照)。

( 2 ) MDR1発現プラスミド

野性型 MDR1発現レトロウィルスべクタープラスミド pHaMDRは、 Nature Biotechnology 12: 694- 698 (1994)に記載されたものを用いた。

( 3 ) MDR1 レトロウィルスの作成

本発明に用いた野性型 MDR1発現レト口ウィルス HaMDRのレトロウィルス液は. pHaMDRプフス;ドをマウスの amphotropic retrovirus packaging cell l ineで ある PA317細胞にリン酸カルシウム法を用いて導入したのちに 35ng/mlのビンク リスチンで選択し、さらに得られたビンクリスチン耐性細胞を限界希釈法でク口 一二ングすることによって得られたレトロウィルス産生細胞 3P26の培養上清を 用いた。 3P26細胞については、 Clin. Cancer Res. , 3: 947- 954 (1997)に記載され W 20

ている。

3P26細胞の培養上清を集めて、これを 0. 45マイクロメーターのフィルターで ろ過してレトロウイルス液とした。

( 4 ) MCF-7/MDR細胞及ぴ MM- MB-231/MDR細胞の調製

HaMDRレトロウィルス液をヒト乳癌細胞 MCF - 7の培養に加えることにより遺伝 子導入を行った。レトロウィルスを添カ卩した細胞を 6 ng/mlのピンクリスチンで 選択し、遺伝子導入細胞を得た。この細胞を MCF- 7/MDRと名付けた。また、 MDA-MB-231/MDR細胞を MCF- 7/MDR細胞と同様の方法で調製した。

( 5 ) SW620- 14細胞の調製

大腸がん細胞株 SW620細胞を限界希釈法で作製した。具体的には、 96- well plate (IWAKI社製)に 1個/ wellになるように大腸がん細胞株 SW620細胞をまき、 細胞が増えてきた wellの細胞のみ、 24- well plate (IWAKI社製)に移して培養 した。細胞が増えた後、さらに lOO mm-dish (IMKI社製)に移して培養した。 このようにして得た各クローンについて、 P-糖タンパク質を高発現しているクロ ーンを F A C Sで確認し、 P -糖タンパク質を高発現するクローン 14を得た。こ の細胞を SW620- 14細胞と名付けた。なお、 F A C Sの実施方法は、前述 1 5ぺ ージ 8行目から記載されている方法に準じて行つた。

実施例 1 (内因性 P—糖タンパク質発現抑制剤のスクリーニング)

P—糖タンパク質を高発現している大腸癌由来の HCT- 15細胞(Developmental iherapeutics Program^ National Cancer Institute^ National Institutes of Health , Bethesda、 MD、 USA より入手)、大腸癌由来の SW620 細胞

( Developmental Therapeutics Program、 National Cancer institute 、 National Institutes of Health, Bethesda, MD、 USA より入手)において、 P-糖タンパク質発現量を減少する薬剤のスクリーニングをウェスタンブロット法で 行った。 7 %ゥシ胎児血清を含む DME M培地に R a s阻害剤(フアルネシル転' 移酵素阻害剤) FTI- 277 (EMD Bioscience 社製)、 M E K阻害剤 U0126 (Cell Signaling Technology 社製)、 Hsp90 阻害剤 17-AAG ( 17- (allylamino) - 17-demethoxygeldanamycin; Almone labs より購入) P I 3 K阻害剤 LY294002 (2-(4— morpnol i.nyl) - 8— pheny丄- 1 (4H) - benzopyran - 4一 one ; Merck Calbiochem 社 製) 又は m T O R 阻害剤 rapamycin ( 23, 27- epoxy - 3H- pyrido [2, 1 -c] [1, 4] oxaazacyclohen-triacontine; Sigma社製) を添加して、 HCT— 15細胞又 は SW620 細胞を 1 2時間培養した。細胞の培養は、初期細胞数を、それぞれ HCT-15: 30万個 I 6 cmシャーレ、 SW620: 50万個 / 6 cmシャーレとし、炭酸 ガス濃度 '· 5 %、温度: 37°Cで培養した。 1 2時間培養した後に、各薬剤を添加 して培養した後の P—糖タンパク質発現量を抗 P—糖タンパク質抗体(Zymed社 製、商品名: Multidrug Resistance 1+3 (MDR, p - glycoprotein) (Host : Mouse, Clone : C219) ) を用いたウェスタンプロット法で調べた。薬剤を添加せず培養し たものをコント口ールとした(薬物未添加 7%ゥシ胎児血清を含む DMEM培地)。 各レーンには各々 10 / gのタンパク質を電気泳動した。結果は図 1に示す。なお、 タンパク質の定量は、ブラッドフォード法(Bio- Rad プロテインアツセィ染色 液)で行った。より具体的には、培養後の細胞をスクレーパーを用いて回収し、 遠心(5, OOOrpm x 3分)によりペレツトダウンした。細胞ペレツトに 0. 2% NP-40 を含む lysis buffer を加え、 5分おきにボルテックスをしながら、合計 30 分間氷上にて細胞膜および細胞質画分を可溶化した。そして遠心(15, OOOrpm X 15分)した上清をサンプルとし、蛋白の定量を行った。

R a s阻害剤(フアルネシル転移酵素阻害剤) FTI- 277 又は M E K阻害剤 U0126の存在下で、 HCT - 15細胞及び SW620細胞において P—糖タンパク質発現量 がコントロールの 20%以下に減少したが、 P I 3 K阻害剤 LY294002や m T O R 阻害剤 rapamycinの存在下では、 HCT- 15細胞及び SW620細胞ともに P—糖タン パク質発現は抑制されていなかった(図 1 ) 。

R a s阻害剤又は ME K阻害剤の添加によって、内因性に発現している P—糖 タンパク質の発現量が顕著に減少した。 R a s阻害剤及ぴ ME K阻害剤には、 P —糖タンパク質発現抑制効果があることがわかった。

実施例 2 (ME K阻害剤 U0126による経時的な P—糖タンパク質の発現抑制) . 調整例 1に記載の方法と同じ調整により得られた内因性 P—糖タンパク質を発 現している HCT - 15細胞、 SW620細胞、及び外因性 P—糖タンパク質を発現して いる MCF- 7/MDR細胞、 MDA- MB-231/MDR細胞の P—糖タンパク質発現量に及ぼす ME K阻害剤 U0126の抑制効果を、実施例 1と同様の方法で、経時的に試験した。

具体的には、 Ί %ゥシ胎児血清を含む DMEM培地に、最終濃度が 1 0 μ Μとな るように ME Κ阻害剤 U0126を添加して、 0〜 1 6時間培養した後、 P—糖タン パク質発現量をウェスタンプロット法で確認した。結果は図 2に示す。

ME K阻害剤 U0126存在下で、 HCT- 15細胞及び SW620細胞における P—糖タ ンパク質発現量は 4〜 8時間後にコントロールの 10〜20%に減少した。また、 同様に U0126存在下で MCF- 7/MDR細胞、 MDA-MB-231/MDR細胞における P—糖タ ンパク質発現量は 8〜1 2時間でコントロールの 10%以下に減少した。なお、 MD R 1 mRNAの発現量に変化は認められなかった。

ME K阻害剤 U0126を、内因性 P—糖タンパク質を発現している HCT- 15細胞 及ぴ SW620細胞に添加した結果、経時的に P—糖タンパク質の発現量が減少した。 4〜 8時間という短時間で、顕著に P—糖タンパク質の発現量が減少することが 判明した。また、 ME K阻害剤 U0126を、 P—糖タンパク質遺伝子である MD R 1遺伝子を導入し外因性の P—糖タンパク質を発現する MCF-7/MDR 細胞及び MDA- MB- 231/MDR細胞に添加した場合にも、 8〜 1 2時間後には、 P—糖タンパ ク質の発現量が顕著に減少した。

ME K阻害剤 U0126は、これまでに知られている P—糖タンパク質発現抑制剤 と比較して、最も短時間に P—糖タンパク質抑制効果を示した。

実施例 3 (M E K阻害剤 PD098059 による経時的な P—糖タンパク質の発現抑 制)

U0126 とは作用機作の異なる M E K阻害剤 PD098059 ( Cell Signaling Technology 社力、ら購入; English, J. et al. (1999) Exp. Cell Res. 253, 255 参照)を用いて、内因性 P—糖タンパク質を発現している HCT- 15 細胞、 SW620細胞、及び外因性 P—糖タンパク質を発現している MCF - 7/MDR細胞、 MDA-MB-231/MDR細胞の P—糖タンパク質発現量に及ぼす ME K阻害剤 PD098059の抑 制効果を、実施例 1と同様の方法で、経時的に試験した。 . 具体的には、 7 %ゥシ胎児血清を含む DMEM培地に、最終濃度が 5 0 Mとな るように ME K阻害剤 PD098059 を添加して、 8時間又は 1 2時間培養した後、 P—糖タンパク質発現量をウェスタンプロット法で確認した。結果は図 3に示す。 いずれの細胞においても、 ME K阻害剤 PD098059存在下で培養すると、 8又

は 1 2時間後の P -糖タンパク質発現量はコントロールの 10〜20%に減少した。 ME K阻害剤 U0126とは作用機作の異なる ME K阻害剤 PD098059によっても、 同程度の時間で P—糖タンパク質の発現量が減少することが判明した。従って、 これらの薬物は、強力な P—糖タンパク質発現抑制剤として有用である。これら の MA P Kシグナル系阻害剤は非常に短時間で P—糖タンパク質の発現を低下さ せ、 P—糖タンパク質による抗癌剤耐性を克服することが可能である。

実施例 4 (MA P Kシグナル伝達系遺伝子 siRNAによる P—糖タンパク質発現抑 制)

MA P Kシグナル伝達系遺伝子である M E K 1及び 2、 E R K 1及ぴ 2、 R S K 1及び 2及び 3の siRNAを用いて、 MA P Kシグナル伝達系遺伝子がノックダ ゥンすることによる P—糖タンパク質発現抑制効果をウェスタンブロット法で試 験した。細胞には、内因性 P—糖タンパク質を発現している HCT- 15細胞、 SW620 細胞、及び外因性 P—糖タンパク質を発現している MCF-7/MDR 細胞、 MDA-MB-231/MDR細胞を用いた。これらの細胞は、実施例 1または実施例 2と同様にして 入手した。

7 %ゥシ胎児血清を含む DMEM培地に、 HCT- 15細胞及び MCF- 7/MDR細胞は 20 万個 / 6 c mディッシュ (未コ一ティングの培養用デイツシュ、旭テクノグラス 社製)、 SW620細胞及び MDA-MB- 231/MDR細胞は 30万個 Z 6 c mディッシュとな るようにまいて、ー晚培養後(約 16時間)、 Control siRNA (QIAGEN;商品名: Control (non-silencing) siRNA、型番: 1022076 ) あるレ、は MEK1 siRNA

(QIAGEN;商品名: Hs— MAP2K1— 6— HP Validated siRNA, 型番: S100300699) 、 MEK2 siRNA ( QIAGEN ;商品名: Hs— MAP2K2— 5_HP Validated siRNA、型番: S102225090 ) 、 ERK1 siRNA ( Cell Signaling Technology ;商品名: SignalSilence p44 MAPK siRNA (Human Specific) , 型番: 6436) 、 ERK2 siRNA (Cell Signaling Technology;商品名: SignalSilence Pool p42 MAPK siRNA (Human Specific) 、型番: 6391 ) 、 RSK1 siRNA ( QIAGEN ;商品名: Hs— RPS6KA1— 10— HP Validated siRNA、型番: S102223067 ) 、 RSK2 siRNA (QIAGEN;商品名: Hs_RPS6KA2_9_HP Validated siRNA, 型番: S102224999) 、 RSK3 siRNA . ( QIAGEN ;商品名: Hs— RPS6KA3— 6— HP Validated siRNA、型番: S100288197) を、最終濃度が各々 25 n Mあるいは 50 n Mとなるように調製し、 遺伝子導入用カチオン性脂質(商品名「LiPofeCtaraine (登録商標) 2000 Reagentj 、 I nvitrogen社製)を製品添付書に記載の方法に従って混合し各細 胞に添加した。添加後、さらに 5 %炭酸ガス培養器で 3 7 °C、 4 8時間培養し、 P—糖タンパク質発現量をウェスタンプロットで調べた。結果は図 4に示す。図 4の各レーンに対応する細胞に対する siRNA添加量は、それぞれ次の通りである。 すなわち、左から 1 レーン目(Cont. ) は最終濃度 50nMの Control siRNAを添加、 2レーン目 (MEK左)は最終濃度 12. 5nM の MEK1 siRNAおよび最終濃度 12. 5nM の MEK2 siRNAを混合して(siRNAの最終濃度としては 25nM) 添加、 3レーン目 (MEK右)は最終濃度 2δηΜの MEK1 siRNAおよび最終濃度 25nMの MEK2 siRNAを 混合して(siRNAの最終濃度としては 50nM) 添加、 4レーン目(ERK左)は最終 濃度 12. 5nM の ERKl siRNAおよび最終濃度 12. 5ηΜ の ERK2 siRNA を混合して (siRNAの最終濃度としては 25nM) 添加、 5レーン目(ERK右)は最終濃度 25nM の ERKl siRNAおよび最終濃度 25nMの ERK2 siRNAを混合して(siRNAの最終濃 度としては δΟηΜ) 添加、 6レーン目(RSK左)は最終濃度 8. 3nM の RSK1 siRNA, 最終濃度 8. 3nMの RSK2 siRNAおよび最終濃度 8. 3nMの RSK3 siRNAを混合して (siRNA の最終濃度としては 25nM) 添加、 7レーン目(RSK右)は最終濃度 16. 7nMの RSK1 siRNA, 最終濃度 16. 7nMの RSK2 siRNAおよび最終濃度 16. 7nMの RSK3 siRNAを混合して(siRNAの最終濃度としては 25nM) 添加した。

EK1/2 siRNA を導入した細胞ではコントロールと比べていずれも P—糖タン パク質発現量はほとんど差がなかったが、 ERK1/2 siRNA を導入した細胞ではコ ントロールと比べて P—糖タンパク質発現量は用量依存的に約 50%前後に減少 した。また、 RSK1/2/3 siRNA を導入した細胞ではコントロールと比べて P—糖 タンパク質発現量が用量依存的に 10〜20%に減少した。 MA P Kシグナル伝達 系の siRNA、とくに RSK1 siRNAは、非常に効率よく P-糖タンパク質の発現を低 下させることが示された。

内因性 BCRPを発現しているヒト大腸癌 HT-29細胞及ぴ KM12細胞、ヒト非小細 胞肺がん NCI- H460細胞及び A549細胞、ヒト卵巣癌 0VACAR- 5細胞の BCRP発現量 に及ぼす ME K阻害剤 U0126の抑制効果を、経時的に試験した。

BCRP を高発現しているヒト大腸癌由来の HT- 29細胞及び腿 12細胞、(各々

Developmental Therapeutics Program, National Cancer Institute, National Institute of Health, Bethesda, MD, USA より入手)、ヒト非小細胞月市がん NCI-H460 細胞及ぴ A549 細胞(各々 Developmental Therapeutics Program, National Cancer Institute, National Institute of Health, Bethesda, MD, USA より入手)、ヒト卵巣癌 0VACAR- 5 細胞(Developmental Therapeutics Program, National し ancer Institute, National Institute of Health, Bethesda, MD, USAより入手)の BCRP発現量に及ぼす M E K阻害剤 U0126 の抑 制効果を、経時的に試験した。

具体的には、 7 %ゥシ胎児血清を含む D ME M培地に 10 )u MのM E K阻害剤 U0126 (Cell Signaling Technology社製)を添加して、各細胞を 8時間又は 1 2時間培養した。細胞の培養は、初期細胞数を、それぞれ HT- 29: 20 万個 / 6 cmシャーレ、 KM12: 20万個 / 6 cmシャーレ、 NCI- H460: 20万個 / 6 cmシャーレ A549: 20万個 I 6 cmシャーレとし、 OVACAR - 5: 20万個 / 6 cmシャーレ炭酸ガス 濃度: 5 %、温度: 37°Cで培養した。 8時間又は 1 2時間培養した後に、各薬剤 を添加して培養した後の B C R P発現量を抗 B C R P抗体(Chemicon International 社製、商品名: BXP- 21) を用いたウェスタンプロット法で調べた, 各レーンには各々 10 /_t gのタンパク質を電気泳動した。結果は図 5に示す。

なお、タンパク質の定量は、ブラッドフォード法(Bio- Rad プロテインアツセ ィ染色液)で行った。より具体的には、培養後の細胞をスクレーパーを用いて回 収し、遠心(5, OOOrpm x 3分)によりペレツトダウンしました。細胞ペレツト に 0. 2% NP- 40を含む lysis bufferを加え、 5分おきにボルテックスをしながら 合計 30 分間氷上にて細胞膜おょぴ細胞質画分を可溶化した。そして遠心 (15, OOOrpm x 15分)した上清をサンプルとし、蛋白の定量を行った。

また、 ME K阻害剤 U0126の効果を、 p 4 4 Ζ ρ 4 2 E R Kのリン酸化状態を 指標と して判定した。結果は図 5 に示す。なお、図 5では、 GAPDH (blyseraldehyde 3- phosphate dehydrogenase) の発重をも不し 7こ。

ΜΕ Κ阻害剤 U0126存在下、ヒト大腸癌細胞、ヒト非小細胞肺がん細胞及ぴヒ ト卵巣癌細胞において、 1 2時間後に BCRP発現量が減少した。

Μ Ε Κ阻害剤を用いて ΜΑ Ρ Κシグナル伝達系を阻害することによって、 BCRP が発現抑制されることが示された。

実施例 5 (パクリタキセルに対する感受性の増大)

内因性 P-糖タンパク質を発現している大腸がん細胞 HCT- 15 (1 X 105個 /60 腿-dish) 、調整例 1で得た SW620- 14 (2 X 105個 /60 匪- dish) 、外因性 P-糠タンパ ク質を発現させた乳がん細胞 MCF - 7/MDR ( 1 X 105個 /60 mm - dish) 、 MDA-MB-231/MDR (2 X 105個 /60 腿- dish) を 16 時間培養後、 10 μ mol/L U0126 (Cell Signaling Technology社製)を添加した。 24時間毎に U0126含有培地を交換し ながら、合計 72 時間培養した。これらの細胞のうち、特に記載のないものにつ いては、実施例 1または実施例 2と同様にして入手した。

各細胞において予めもとめたパクリタキセルに対する IC5。濃度(50%増殖阻害 濃度)、すなわち、 HCT-15 細胞には 100 nM、 SW620-14細胞には 5 nM、 MCF-7/MDR細胞には 4 nM、 MM- MB- 231/MDR細胞には 800 nMの濃度の 0倍、 1倍、 3 倍濃度のパクリタキセルを、 10 μ mol/L U0126 と共に添加し、さらに 24時間培 養した。コントロール群は、 U0126不含培地で同様に 72時間培養後、パクリタ キセルのみを 24時間処理した。パクリタキセルに対する IC5。濃度(50%増殖阻 害濃度)は、具体的には、細胞増殖阻害試験にて調べた。それぞれの細胞を 12 -well plate (IWAKI社製)に 5000個/ ml/ゥヱルでまき、続いてメディウムで各 濃度に希釈した薬剤を wellあたり 1ml加えた。このプレートを 5%炭酸ガス培養 器で 37°C、 5'日間で培養した。 5日後、リン酸緩衝バッファ一で細胞を洗浄後、 0. 5ml のトリプシン- EDTAで細胞をはがしメディゥム 1mlで懸濁し、 9mlのセル パック希釈液(東亞医用電子)をいれたビーカーに各ゥエルの細胞液をそれぞれ 加え、 Sysmex CM- 500 自動細胞数計測装置(東亞医用電子)にて細胞数を計測 した。その結果として、細胞数を 50%に減少させるパクリタキセル濃度(IC5。) を求めた。

細胞回収後、細胞膜およぴ細胞質画分を可溶化し、ウェスタンプロット法によ り P-糖タンパク質、 PARP (ポリ ADP リボースポリメラーゼ)の切断断片、 GAPDH の発現変化を確認した。ウェスタンブロット法において、それぞれのタンパク質 を検出するために使用した抗体は、 P -糖タンパク質について抗 Multidrug Resistance 1+3 モノクローナル抗体(C219) (Zymed社製)、 PARP について抗 PARP p85 fragment ポリクローナル抗体(Promega社製)、 GAPDH について抗

Glyceraldehyde— 3— phosphate dehydrogenase モノクローナノレ抗体 (Chemicon International社製)を使用した。

PARP は、アポトーシスの実行本体である Caspase - 3 の基質である。抗がん剤 などによりアポトーシスシグナルが活性化すると、 Caspase- 3 が活性化し、 PARP を切断する。本実験では、アポトーシスシグナル伝達の指標として、 PARP の切 断断片の発現を確認した。結果を図 6に示す。

図 6に示されるように、 M E K阻害剤により、がん細胞におけるパクリタキセ ルに対する感受性が増大することが確認された。

実施例 6 (P-糖タンパク質の蛍光基質 Rhodaminel23の取り込み量の増加)

HCT-15 ( 1 X 10V60 mm- dish) 、 SW620-14 ( 2 X 105/60 讓- dish) 、 MCF - 7/MDR (1 X 10V60 mm- dish) 、 MM-MB- 231/MDR (2 X 105/60 謹- dish) 細胞 (これらの 細胞は、実施例 5と同様にして入手した。を、実施例 5と同様に 10 μ πιοΙ/L U0126含有培地で 72時間培養した。コント口ール群は、腿 26不含培地で同様に 72時間培養した。細胞回収後、細胞数を測定し、 1 X 105個 /mLになるように細胞 懸濁液を培地で調製した。細胞懸濁液に、最終濃度が 300 nmol/L になるように Rhodaminel23 ( S i g m a社)を加えた。 Rhodaminel23 を取り込ませないコン トローノレは、培地のみとした。それらを 37°Cで 20分間培養して Rhodaminel23 を細胞内に取り込ませた後、遠心して細胞を回収し、氷冷した PBSで細胞を 2回 洗浄した。ァイソフローで細胞を再懸濁し、 FACS で測定した。 FACS では Rhodaminel23 の輝度を測定することにより、細胞内に取り込まれた Rhodaminel23を測定できる。結果を図 7に示す。

図 7に示されるように、 M E K阻害剤により、がん細胞における P-糖タンパ ク質の蛍光基質 Rhodaminel23の取り込み量が増加することが確認された。

産業上の利用可能个生

本発明によれば、 P—糖タンパク質発現抑制剤を提供できる。また、本発明に よれば、 B C R P発現抑制剤を提供できる。

上記(1 ) に記載の P—糖タンパク質発現抑制剤または B C R P発現抑制剤を 含有してなる耐性獲得が抑制された抗癌剤は、抗癌剤に対して耐性を獲得した癌

に対しても、抗癌剤の薬効回復が期待でき有効な癌化学療法が可能となる。また、 耐性を抑制できるため、抗癌剤の投薬量を減することができ副作用をも抑制した 癌化学療法が可能となる。さらに、先天的あるいは後天的に、 P—糖タンパク質 または B CR Pを過剰に発現していることにより抗癌剤による癌治療が有効でな い患者に対しても、癌化学療法が可能となる。

また、上記(1) に記載の P—糖タンパク質発現抑制剤または BCRP発現抑 制剤の有効量と抗癌剤の有効量とを投与することを特徴とする、抗癌剤に対する 耐性を抑制し癌治療効果を高める方法を提供する。

上記 (1) に記載の P—糖タンパク質発現抑制剤または BCRP発現抑制剤を 含有してなる抗癌剤耐性抑制剤は、抗癌剤に対して耐性を獲得した又は獲得しう る癌に対して投与することにより、抗癌剤の薬効回復し有効な癌化学療法が可能 となる。

上記 (1) に記載の P—糖タンパク質発現抑制剤または BCRP発現抑制剤を 含有してなる抗癌剤耐性抑制剤と抗癌剤を組み合わせてなる癌治療剤は、抗癌剤 に対して耐性を獲得した癌に対して投与すことにより、抗癌剤の薬効回復に有 効な癌化学療法が可能となる。また、耐性を抑制できるため、抗癌剤の投薬量を 減することができ副作用をも抑制した癌化学療法が可能となる。さらに、先天的 あるいは後天的に、 P—糖タンパク質または B C R Pを過剰に発現していること により抗癌剤による癌治療が有効でない患者に対しても、癌化学療法が可能とな る。

さらに、本発明によれば、上記(1) に記載の P—糖タンパク質発現抑制剤ま たは B C R P発現抑制剤を含有してなる抗癌剤の有効量を投与することによる、 抗癌剤耐性獲得を抑制し癌を治療する方法を提供できる。

本発明によれば、 Ra s、 Ra f 、 MEK、 E RKまたは R S K阻害活性を指 標として、 P—糖タンパク質発現抑制剤を得ることが可能となる。また、本発明 によれば、 Ra s、 Ra f 、 MEK:、 E R Kまたは R S K阻害活性を指標として、 BCRP発現抑制剤を得ることが可能となる。