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1. (WO2006043691) 創薬標的タンパク質及び標的遺伝子、並びにスクリーニング方法
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明細書

創薬標的タンパク質及ぴ標的遺伝子、並びにスクリーニング方法, 技術分野

本発明は、抗アレルギー薬、抗不整脈薬等の創薬の標的タンパク質および標 的遺伝子;抗アレルギー薬、抗不整脈薬等の薬物のスクリーニング方法および 該スクリーニング方法により得られる物質;アレルギー症状、不整脈等の薬理 作用の調節剤;薬物の誘導体および該誘導体の製造方法;ならびに薬物とその 標的タンパク質とを含む複合体および当該複合体の製造方法などに関する。

背景技術

ァステミゾールおよびテルフエナジンは、いずれも持続性があり、眠気を引 き起こしにくい抗ヒスタミン剤としてアレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎 (花粉症を含む)や気管支喘息などのアレルギー性疾患を対象に上巿された薬 である。しかし、共に、肝機能障害および薬物相互作用によって未変化体の血 漿中濃度が上昇すると心電図の Q T延長が認められ、重篤な不整脈の副作用が 発生することから市場から撤退した。

両薬剤の主な薬効メカニズムはヒスタミン HI受容体拮抗であるが、その持 続性の要因とされているケミカルメディエータ遊離抑制作用のメカニズムはい まだ明確にされていない。また、副作用の主な原因は h E R Gチャネル(電位 依存性 Kチャネル)阻害と考えられているが、そのすべてが解明されていると はいえない。さに、近年その社会的な問題となっているアレルギー疾患自体 のメカニズムち/不明な点が多く残されている。

—方、近年、世界的なレベルで様々な生物のゲソム配列の解明とその解析が 進められており、特にヒトのゲノムについては世界的な協力体制のもとでその 解析が進められて、 2 0 0 3年 4月に全配列解析の終了が宣言された。全ゲ ノム配列が解明されたことにより、全ての遺伝子の機能や制御、あるいは遺伝 子間、タンパク質間、細胞間さらには個体間における相互作用のネットワーク として複雑な生命現象を解析することが可能になりつつある。このようなゲノ ム情報は単に学術分野における重要性のみならず、医薬品開発等の各種産業に ' も大きな変革をもたらしている。

例えば、これまでに汎用されてきた医薬品の標的タンパク質は約 480種で あり、また、それら標的タンパク質は、膜受容体、酵素、イオンチャネル、あ るいは核內受容体等に限定されることが報告されている(J. Drews, Science, 297, 1960- 1964, 2000) 。これに対して、ゲノム情報に基づく標的タンパク 質探索が行われることによって、従来の標的タンパク質の範疇に属さない新規 タンパク質も含め、極めて多数の標的タンパク質が次々と見出され、その総数 は約 1, 500種類になるのではないかと予想されている(A. L. Hopk i ns & R. Groom, Nature Revi ews ; Drug Di scovery, 1 , 727-730, 2002) 。

し力し、ゲノム情報のような大量のデータに対応するためのインフラ整備と、 臨床開発費用の高騰等によって、製薬企業の研究開発费はますます増大してい るにも関わらず、新薬の承認数はむしろ減少する傾向にある(Nature Revi ew s ; Drug Di scovery, Feb, 2003) 。これは、上記のようなゲノム情報の活用 が実際には効率的に行われていないことを示している。

これらの状況を解決するための手段として、永島らは「医療および他の用途 に用いる化合物の発見おょぴ創製のための方法、システム、装置、および機 器」を発明し、特許出願した(特表 2 0 0 4— 5 0 9 4 0 6号公報)。

この出願では、化合物とタンパク質との相互作用を評価するために有用であ りかつ医療および他の分野における化合物の発見を目的とするそのような評価 の結果として生ずる情報を利用するために有用な方法、システム、データべ一 ス、ユーザーインターフェース、ソフトウェア、媒体、およびサービスが開示 されており、さらに創薬のための新規標的タンパク質の非常に大きなプール、 新規薬物を設計するための新規な方法および治療的な目的のための従前には思 いもよらなレ、仮想的に合成された低分子のプールを生成することをめざした。 詳細には、この出願には、以下の工程を含む、新規の創薬標的として適当で あるタンパク質または部分タンパク質を同定する方法:

( i ) 選択された標的化合物に対して所望の親和性および特異性をもつ複数の タンパク質または部分タンパク質を選択する工程; .

( i i ) 該タンパク質または該部分タンパク質の構造および機能を特定するェ 程;および

( i i i ) 所望の機能をもつ単一タンパク質または単一部分タンパク質を選択 する工程

であり、また、以下の段階を含む、薬物の発見方法:

( i ) 上記の方法を用いて選択された該標的化合物の化学構造を検討するェ 程;および

( i i ) 選択された該標的化合物の構造を化学的に修飾して、新規の薬物標的 として適当である該タンパク質または該部分タンパク質に対して、修飾された 化合物の親和性および特異性を最適化する工程

が開示されていた。

さらにここで開示された方法の特徴は、選択された該標的化合物が医療用と して承認されたものであることであった。

従来、使用されてきた医薬品には、その標的タンパク質が知られていないも の、あるいは標的タンパク質が知られていても、そのタンパク質を介したメカ -ズムでは、その医薬品の薬効や副作用のすべてを説明できないもの、が数多 く存在する。

代表的な例として、最も古くから使われてきた医薬品のひとつであるァスピ リンの例を挙げることができる。ァスピリンは 100年以上前にはじめて市販 された当時は、その抗炎症作用のメカニズムは不明であった。それから約 70 年を経て、アスピリンがシクロォキシゲナ一ゼ(C0X) 阻害作用を有すること が明らかになった。その後さちに 20年を経て、 C0Xには C0X - 1 と C0X- 2のサ ブタイプが存在し、アスピリンの主薬効は C0X- 2阻害によるものであり、 CO X - 1阻害作用が胃腸障害等の副作用の原因であることが解明された。しかし、 それでもまだ、ァスピリンの標的タンパク質の全てが明らかになったわけでは

ない。近年、アスピリンに制癌作用ゃ抗痴呆作用があることが臨床的に明らか になっているが、これらの薬効は C0X阻害では説明できない。一方、最近に なってァスピリンが IKK i3のような転写因子や PPAR- γのような核内受容体に 作用するとの報告が数多くなされているが、これらとアスピリンの種々の薬効 との関連は今のところ明確ではない。

このようなことから、従来使用されてきた医薬品の標的タンパク質を解明す ることは、新規の創薬標的タンパク質を発見するうえで、非常に有効な方法で あるとレヽ:る。

また、上記の公開特許の発明者の一人である平山らは、日本国内で市販され ている約 1 , 500種類の医薬品について、それらの構造と物性データを統合し たデータベースを作成し、既存の医薬品化合物に共通の構造的な特徴があるこ とを見出している (Chem-Bio Informat i c s Journal , 1 , 18 - 22, 2001 ) 0 従 来汎用されてきた医薬品は、その開発過程において、体内移行性や安全性の問 題をクリァしてきた優等生である。それら医薬品をプローブとして新規標的タ ンパグ質探索を行い、さらにそれら医薬品の構造を基に新規開発候補化合物を 考案することは、非常に合理的かつ効率的と考えられる。

次に、新規標的タンパク質を探索する過程において、どのようにゲノム情報 を活用していくかが問題となる。単にゲノム配列が決定されただけで、全ての 遺伝子の機能が明らかになり、創薬標的タンパク質が見出されるわけではない。 ヒトには約 3〜 4万種顇の遺伝子が存在すると推測されており、さらにオルタ ナティブスプライシングによるバリアントも考慮に入れると 1 0万種以上の m R N Aが存在すると言われている。そこで、ゲノム配列から明らかにされてく る膨大な量の新しい遺伝子のなかで、医薬品開発等の産業利用において有用な 機能を有するものを、効率的に選別同定していくことが重要となる。

真核生物のゲノム配列は多くの場合、一つの遺伝子がイントロンによって複 数のェキソンに分断されているため、遺伝子の配列情報だけからそれによつて コードされるタンパク質の構造を正確に予測することはできない。これに対し

て、イントロンが除かれた mRNAから作製される c DNAでは、タンパク質 ' のアミノ酸配列の情報が一つの連続した配列情報として得られるため、容易に その一次構造を明らかにすることが可能である。

特に完全長 c DNAを対象とした解析を行うことにより、その 5,末端配列 からゲノム配列上での mRNA転写開始点が特定できる上、その配列の中に含 ' まれる mRNAの安定性や翻訳段階での発現制御に関わる因子の解析が可能で ある。また、翻訳開始点である ATGコドンを 5' 側に含むことから、正しい フレームでタンパク質への翻訳を行うことができる。したがって、適当な遺伝 子発現系を適用することで、その c DNAがコードするタンパク質を大量に生 産したり、タンパク質を発現させてその生物学的活性を解析することも可能に なる。このように、全長 c DNAから発現されたタンパク質を用いた解析を行 うことにより、ゲノム配列解析のみでは得られない重要な情報が得られ、さら には従来の創薬標的タンパク質の範疇に属さないような新規標的タンパク質を 発見することが可能であると考えられる。

発明の開示

本発明は、創薬の標的タンパク質および標的遺伝子、並びにこれらを利用す る新規医薬を開発し得る種々の手段などを提供することを目的とする。

本発明者らは、ヒトタンパク質と医薬品として使用されてきた化合物の相互 作用を S E C/MS法で解析することにより、新規医薬の開発に有用であり得 る新規創薬標的タンパク質について鋭意探索したところ、 CARPが創薬、例 えば抗ァレルギ一薬、抗不整脈薬等の標的タンパク質の 1つであり得ることを 見出した。この知見より、本発明者らは、 CAR P遺伝子の発現または機能を 調節する物質が、薬物として有用であり得る物質であること、並びに薬物、例 えば抗アレルギー薬、抗不整脈薬を開発するためには、 CARP遺伝子の発現 または機能を調節する物質をスクリーニングすればよいこと、あるいは CAR P遺伝子の発現または機能を調節し得るように薬物を誘導体化すればよいこと を着想し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、下記の通りである:

〔 1〕下記式( I ) 〜( I I I ) で表されるいずれかの化合物である、 C A R Pに対する結合能を有する化合物、またはその塩:


〔式中、 は、水素原子またはヒドロキシであり、

R 2、 R 3は、各々独立して、ハロゲン、シァノ、ヒドロキシおよびァミノ からなる群より選ばれる 1〜3個の置換基で置換されていてもよい、フエニル または炭素数 7〜 1 1のフエニルアルキルであり、

Y!は、下記式:

— Ν Ν——


で表されるいずれかの基であり、

は、水素原子、あるいはハロゲン、シァノ、ヒドロキシ、カルボニル、 ァミノ、炭素数 1〜5のアルキル、炭素数 1〜 5のアルキルォキシおよび炭素 数 3〜 7のシクロアルキルからなる群より選ばれる 1〜3個の置換基、あるい は R 7で置換されていてもよい、炭素数 1〜7のアルキル、炭素数 2〜7のァ ルケニル、炭素数 1〜 7のアルキルォキシまたは炭素数 1〜 7のアルキルァミ ノである。 R 7は、炭素数 1〜 7のアルキル、炭素数 1〜 7のアルキルォキシ、 カルボン酸、炭素数 1〜 7のアルキルォキシカノレボニノレ、ハロゲン、シァノ、 ヒドロキシおよびァミノからなる群より選ばれる 1〜 3個の置換基で置換され ていてもよいフエニルである。〕;

(I I)


〔式中、 R 4は、水素原子、ヒドロキシ、または下記式


(式中、 R 6は、炭素数 1〜5のアルキル、炭素数 3〜 7のシクロアルキル、 フエニル、炭素数 7〜1 1のフエニルアルキルまたは複素環である。)で表さ れるいずれかの基であり、

R 5は、水素原子、あるいはハロゲン原子、シァノ、ヒドロキシおよびアミ ノからなる群より選ばれる 1または 2個の置換基で置換されていてもよい、炭 素数 1〜 5のアルキル、炭素数 3〜 7のシクロアルキル、フエニルまたは炭素 数 7〜1 1のフエニルアルキルであり、

Y 2は、下記式:

-Ν— A— (Αは、炭素数 1〜 3のアルキル基である)


で表されるいずれかの基であり

Ζ。は、 と同義である。〕

W


〔式中、 Z 3は、と同義である。〕。

〔2〕以下の式( I ) 〜( I I I ) からなる群より選ばれる化合物またはその 医薬として許容され得る塩を含む、アレルギー疾患の治療または予防薬:


〔式中、 は、水素原子またはヒドロキシであり、

R 2、 R 3は、各々独立して、ハロゲン、シァノ、ヒドロキシおよびァミノ からなる群より選ばれる 1〜 3個の置換基で置換されていてもよい、フエニル または炭素数 7〜 1 1のフエニルアルキルであり、

は、下記式:


で表されるいずれかの基であり、

は、水素原子、あるいはハロゲン、シァノ、ヒドロキシ、カルボニル、 ァミノ、炭素数 1〜5のアルキル、炭素数 1〜 5のアルキルォキシおよび炭素 数 3〜 7のシクロアルキルからなる群より選ばれる 1〜 5個の置換基で置換さ れていてもよい、炭素数 8〜2 0のアルキル、炭素数 8〜2 0のァルケニル、 炭素数 8〜 2 0のアルキルォキシまたは炭素数 8〜 2 0のアルキルァミノであ る。〕;

W


〔式中、 R 4は、水素原子、ヒドロキシ、または下記式:


(式中、 R 6は、炭素数 1〜5のアルキル、炭素数 3〜 7のシクロアルキル、 フエニル、炭素数 7〜 1 1のフエニルアルキルまたは複素環である。)で表さ れるいずれかの基であり、

R 5は、水素原子、あるいはハロゲン原子、シァノ、ヒドロキシおよびアミ ノからなる群より選ばれる 1または 2個の置換基で置換されていてもよい、炭 素数 1〜5のアルキル、炭素数 3〜 7のシクロアルキル、フエニルまたは炭素 数 7〜 1 1のフエニノレアノレキルであり、

Y 2は、下記式:

-Ν-Α— (Αは、炭素数 1〜 3のアルキル基である)


で表されるいずれかの基であり

Ζ は、 Ζ と同義である。〕

〔式中、 z 3は、水素原子、あるいはハロゲン、シァノ、ヒドロキシ、カルボ ニル、ァミノ、炭素数 1〜 5のアルキル、炭素数 1〜 5のアルキルォキシおよ び炭素数 3〜 7のシク口アルキルからなる群より選ばれる 1〜 5個の置換基、 あるいは R8で置換されていてもよい、炭素数 1〜7のアルキル、炭素数 2〜 7のァルケニル、炭素数 1〜 7のアルキルォキシまたは炭素数 1〜 7のアルキ ルァミノである。 R8は、炭素数 1〜 7のアルキル、炭素数 1〜 7のアルキル ォキシ、カルボン酸、ハロゲン、シァノ、ヒドロキシおよびァミノからなる群 より選ばれる 1〜 3個の置換基で置換されていてもよいフエニルである。〕。 〔3〕被験物質が CAR P遺伝子の発現または機能を調節し得るか否かを評価 することを含む、薬物のスクリーニング方法。

〔4〕薬物がアレルギー症状を調節し得る物質、化学伝達物質の遊離を調節し 得る物質または不整脈症状を調節し得る物質である、上記〔3〕の方法。 〔5〕以下の工程(a ) 〜(c ) を含む、上記〔3〕の方法:

(a) 被験物質を CAR Pまたはその変異タンパク質に接触させる工程;

(b) 被験物質の存在下における該タンパク質またはその変異タンパク質の機 能レベルを測定し、該機能レベルを被験物質の非存在下における該タンパク質 またはその変異タンパク質の機能レベルと比較する工程;

(c) 上記(b) の比較結果に基づいて、該タンパク質またはその変異タンパ ク質の機能レベルの変化をもたらす被験物質を選択する工程。

〔6〕下記の工程(a ) 、(b) 及び(c ) を含む、上記〔3〕の方法: (a ) 被験物質と CAR P遺伝子の発現を測定可能な細胞とを接触させるェ 程;

(b) 被験物質を接触させた細胞における CAR P遺伝子の発現量を測定し、 該発現量を被験物質を接触させない対照細胞における CAR P遺伝子の発現量 と比較する工程;

(c) 上記(b) の比較結果に基づいて、 CAR P遺伝子の発現量を調節する 被験物質を選択する工程。

〔7〕下記の工程(a ) 、(b) 及び(c ) を含む、上記〔3〕の方法: (a ) 被験物質を CAR Pまたはその変異タンパク質に接触させる工程; (b) 被験物質の該タンパク質に対する結合能を測定する工程;

(c ) 上記(b) の結果に基づいて、該タンパク質に結合能を有する被験物質 を選択する工程。

〔8〕下記の工程(a) 、(b) 及び(c ) を含む、上記〔3〕の方法: (a ) 被験物質、 CAR P結合性物質を CAR Pまたはその変異タンパク質に 接触させる工程;

( b ) 被験物質の存在下における該結合性物質の該タンパク質に対する結合量 を測定し、該結合量を被験物質の非存在下における該結合性物質の該タンパク 質に対する結合量と比較する工程;

(c) 上記(b) の比較結果に基づいて、該結合性物質の該タンパク質に対す る結合量の変化をもたらす被験物質を選択する工程。

〔9〕 CAR P結合性物質が、ァステミゾ一ルもしくはテルフエナジンまたは それらの代謝体、あるいは α, α—ジフエニル一 4—ピペリジノメタノール、 ヒドロキシジン、デスメチルァステミゾール、 2—アミノー 1—ベンジノレベン ズイミダゾーノレ、力ノレベンダジム、ォキシベンダゾーノレ、ァノレベンダゾーノレ、 ァノレベンダゾーノレスノレホキシド、ァノレベンダゾーノレスノレホン、 2—アミノー 5 —Ν—プロピノレスルホニルベンズイミダゾーノレ、メベンダゾール、ノコダゾー ノレ、ォキシフェンダゾーノレ、フェンベンダゾーノレスノレホン、 2—ァミノべンズ イミダゾーノレ、チアベンダゾー^/、ベンズイミダゾーノレ、ラサ口シド、あるい は CAR Pに結合能を有するそれらの誘導体である、上記〔8〕の方法。.

〔1 0〕被験物質が CAR Pまたはその変異タンパク質に対する CAR P標的 薬物の結合能を調節し得るか否かを評価することを含む、 CAR P遺伝子に関 連する機能を調節し得る物質のスクリーユング方法。

〔1 1〕 CAR P標的薬物が、ァステミゾールもしくはテルフエナジンまたは それらの代謝体、あるいは α, α—ジフエ二ルー 4—ピペリジノメタノール、 ヒドロキシジン、デスメチノレアステミゾーノレ、 2—ァミノ _ 1 _ベンジノレベン ズイミダゾーノレ、力ノレベンダジム、ォキシベンダゾーノレ、ァノレベンダゾーノレ、 ァノレベンダゾ一/レスノレホキシド、アルベンダゾーノレスノレホン、 2—アミノー 5 —Ν—プロピルスノレホニルベンズイミダゾーノレ、メベンダゾール、ノコダゾー ノレ、ォキシフェンダゾーノレ、フェンベンダゾーノレスノレホン、 2—ァミノべンズ イミダゾーノレ、チアベンダゾーノレ、ベンズイミダゾーノレ、ラサ口シド、あるい は CAR Ρに結合能を有するそれらの誘導体である、上記〔1 0〕の方法。 〔1 2〕以下の工程(a ) 〜(c ) を含む、上記〔1 0〕の方法:

(a) 被験物質、 CAR P標的薬物を CAR Pまたはその変異タンパク質に接 触させる工程;

(b) 被験物質の存在下における CAR P標的薬物の該タンパク質に対する結 合量を測定し、該結合量を被験物質の非存在下における CAR P標的薬物の該 タンパク質に対する結合量と比較する工程;

(c) 上記(b) の比較結果に基づいて、 CAR P標的薬物の該タンパク質に 対する結合量の変化をもたらす被験物質を選択する工程。

〔1 3〕上記〔3〕〜〔1 2〕のいずれかの方法により得られる物質。

〔1 4〕上記〔3〕〜〔1 2〕のいずれかの方法により得られる物質を含有し てなる、薬理作用の調節剤。

〔1 5〕 CAR P遺伝子の発現または機能を調節する物質を含有してなる、薬 理作用の調節剤。

〔1 6〕アレルギー症状の調節剤、化学伝達物質の遊離調節剤、不整脈症状の 調節剤、脱毛症状の調節剤である、上記〔1 5〕の剤。 ,

〔1 7〕 CAR P標的薬物に関連する作用の調節剤である、上記〔1 5〕の剤。

〔1 8〕 CAR P遺伝子の発現または機能を調節する物質が、以下( ί ) 、 ( i i ) のいずれかである CAR P遺伝子の発現または機能を抑制する物質で ある、上記〔1 5] の剤。

( i ) C AR Pアンチセンス核酸、 CAR Pリボザィム、 CAR Pデコイ核酸、 CAR P s i RNA、 C AR P抗体をコードする核酸、 CAR Pドミナントネ ガティブ変異体をコードする核酸からなる群より選ばれる核酸、または該核酸 を含む発現ベクター;あるいは

( i i ) CAR P抗体、 CAR P ドミナントネガティブ変異体からなる群より 選ばれる蛋白質。

〔1 9〕 C AR Pまたはその変異タンパク質、あるいは該タンパク質をコード する核酸を含む発現ベクターを含有してなる、薬理作用の調節剤。

〔2 0〕 CAR P標的薬物を含有してなる、 CAR P遺伝子に関連する機能の 調節剤。

〔2 1〕 CAR P標的薬物が、ァステミゾールもしくはテルフエナジンまたは それらの代謝体、あるレ、は α, α—ジフエ二ルー 4ーピペリジノメタノール、 ヒドロキシジン、デスメチルァステミゾール、 2—ァミノ一 1—ベンジルベン ズイミダゾーノレ、カルベンダジム、ォキシベンダゾ一ノレ、アルベンダゾール、 アルベンダゾーノレスノレホキシド、ァノレベンダゾーノレスノレホン、 2—アミノー 5 — Ν—プロピノレスノレホニルべンズィミダゾーノレ、メベンダゾーノレ、ノコダゾ一 ル、ォキシフェンダゾーノレ、フェンベンダゾーノレスノレホン、 2—ァミノべンズ イミダゾーノレ、チアベンダゾーノレ、ベンズイミダゾーノレ、ラサ口シド、あるい は CAR Ρに結合能を有するそれらの誘導体である、上記〔2 0〕の剤。

〔2 2〕 CAR P遺伝子の機能を調節し得るように薬物を誘導体化することを 含む、薬物誘導体の製造方法。

〔2 3〕薬物がアレルギー症状を調節し得る物質、化学伝達物質の遊離を調節 し得る物質、不整脈症状を調節し得る物質または脱毛症状を調節し得る物質で ある、上記〔2 2〕の方法。

〔 2 4〕薬物が、ァステミゾールもしくはテルフエナジンまたはそれらの代謝 体、あるいは α , α—ジフエニル一 4ーピペリジノメタノール、ヒドロキシジ ン、デスメチルァステミゾール、 2—アミノー 1一べンジルベンズイミダゾー ノレ、力ノレベンダジム、ォキシベンダゾーノレ、ァノレベンダゾ一ノレ、ァノレベンダゾ ーノレスノレホキシド、ァノレベンダゾーノレスノレホン、 2—アミノー 5— Ν—プロピ ノレスノレホニノレベンズイミダゾーノレ、メベンダゾーノレ、ノコダゾ一ノレ、ォキシフ ェンダゾーノレ、フェンベンダゾーノレスノレホン、 2—ァミノべンズイミダゾーノレ チアベンダゾール、ベンズイミダゾール、ラサ口シド、あるいは C A R Pに結 合能を有するそれらの誘導体である、上記〔2 2〕の方法。

〔2 5〕 C A R Pまたはその変異タンパク質に対する結合能を調節し得るよう に薬物を誘導体化することを含む、 C A R P遺伝子に関連する機能を調節し得 る物質の誘導体の製造方法。

〔2 6〕薬物が、ァステミゾールもしくはテルフエナジンまたはそれらの代謝 体、あるいは α, α—ジフエ二ルー 4—ピペリジノメタノール、ヒドロキシジ ン、デスメチノレアステミゾーノレ、 2—アミノー 1—ペンジノレベンズイミダゾー ル、力ノレベンダジム、ォキシベンダゾーノレ、ァノレベンダゾーノレ、ァノレベンダゾ —ノレスルホキシド、アルベンダゾールスノレホン、 2—アミノー 5—Ν—プロピ ノレスノレホニノレベンズイミダゾーノレ、メベンダゾーノレ、ノコダゾ一ノレ、ォキシフ ェンダゾーノレ、フェンベンダゾールスノレホン、 2—ァミノべンズイミダゾーノレ チアベンダゾール、ベンズイミダゾール、ラサ口シド、あるいは C A R Pに結 合能を有するそれらの誘導体である、上記〔2 5〕の方法。

〔2 7〕上記〔2 2:) 〜〔2 6〕のいずれかの方法により得られる物質。

〔2 8〕上記〔2 2〕〜〔2 6〕のいずれかの方法により得られる物質を含有 してなる、薬理作用の調節剤。

〔2 9〕薬物と CAR Pまたはその変異タンパク質とを含む複合体。

〔3 0〕薬物と CAR Pまたはその変異タンパク質とを接触させることを含む、 薬物と C A R Pまたはその変異タンパク質とを含む複合体の製造方法。

〔3 1〕以下( i ) 、( i i ) を含むキット:

( i ) 薬物またはその塩;

( i i ) CAR Pまたはその変異タンパク質、該タンパク質をコードする核酸、 該核酸を含む発現ベクター、 CAR P遺伝子の発現を測定可能な細胞、あるい は C A R P遺伝子の転写調節領域及び該領域に機能可能に連結されたレポータ 一遺伝子を含む発現ベクター。

図面の簡単な説明

図 1は、スピンカラムを用いた S E C相互作用スクリーユングシステムの 概略を示す。

図 2は、スピン力ラムを用いた S E C相互作用解析の概略を示す。

発明を実施するための最良の形態

1. CAR P及びその遺伝子

本発明は、 CAR Pおよび遺伝子を提供する。

CAR P ^caspase recruitment domain containing protein) は、ノポ 卜一ンスに関与する caspase recruitment domain (CARD) 様の部位、核 内レセプターとの結合モチーフ(NRボックス)様の部位、カルシウムとの結 合能を有する E Fハンド様の部位を有するタンパク質である(Liu B et al. , Biochem Biophys Res Commun. , 293(5), 1396-404 (2002)参照)。 CAR Pは、 C10orf97 (chromosome 10 open reading frame 97) 遺十によって コードされるタンノク質で、 brain my042 protein^ normal aorta protein MSTP126、 dermal papilla derived protein 5 (DERP5) の別名でも知られて いる。 CAR Pはまた、心臓、骨格筋、脳、肺、腎臓、肝臓、脾臓、大腸、小 腸、胎盤等で発現することが知られている。本明細書中、 CAR Pは、ヒト C AR Pに限定されず、異種動物のオルソログをも含む。なお、 CAR Pは、後 述の実施例に記載される FLJ13397クローン由来のタンパク質である。

本発明の CAR Pは、例えば、配列番号 2で表されるアミノ酸配列を有する タンパク質であり得る。なお、ヒト CAR Pは、 F L J番号(NEDO (新ェ ネルギー '産業技術総合開発機構)タンパク質 c DNA構造解析プロジェクト における登録番号): FLJ13397、 G e n B a n kァクセッション番号: AK023 459、 H-Invitationalデータベース(H— I n v D B) における H— I n v c DNA I D : HIT000006733、および H— I n v ローカス I D : HIX 0008676 として登録され(Nat. Genet. 36(1), 40-45 (2004) 参照)、また、 本発明者らにより、ァステミゾール、テルフエナジン等の薬物と相互作用する ことが見出された。 - また、本発明によれば、 CAR Pの変異タンパク質が提供される。該変異タ ンパク質は、例えば、配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 1又は複 数のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入されたアミノ酸配列からなり、且 つ薬物に対して相互作用を示すタンパク質であり得る。

置換、欠失、付加または挿入されるアミノ酸の数は、機能が保持される限り 限定されないが、例えば約 1〜3 0個、好ましくは約 1〜2 0個、より好まし くは約 1〜 1 0個、さらにより好ましくは約 1〜 5個、最も好ましくは 1また は 2個である。アミノ酸の置換、欠失、付加または挿入が施される部位は、機 能が保持される限り限定されないが、例えば、機能上重要なドメイン、例えば、 CARD様部位、 NRボックス様部位、 E Fハンド様部位以外の部位であり得 る。

さらに、本発明の変異タンパク質は、配列番号 2で表されるアミノ酸配列に おいて、例えば約 5 0 %以上、好ましくは約 7 0 %以上、より好ましくは約 8 0 %以上、さらにより好ましくは約 9 0%以上、最も好ましくは約 9 5%以上 の相同性(但し、 1 00%の相同性を除く)を有するアミノ酸配列からなり、 且つ薬物に対して相互作用を示すタンパク質であり得る。ここで、上記相同性

の数値は、配列解析ソフトウエアである DNAS I S (日立ソフトウエアェン ジニアリング)を用いて、例えば、マキシマムマッチング法のコマンドを実行 することにより算出される。その際のパラメータは、デフォルトの設定(初期 設定)とする。

本発明のタンパク質が相互作用を示す薬物は CAR P標的薬物である。 CA R P標的薬物とは、 CAR Pを介して薬効または副作用を示す薬物であり、こ のような薬物としては、例えば、 CAR P標的薬物に関連する作用を調節し得 る物質(例えば、アレルギー症状を調節し得る物質、化学伝達物質の遊離を調 節し得る物質)、 CAR P遺伝子に関連する機能を調節し得る物質などが挙げ られる。なお、薬物とは、医薬および試薬を含むものとする。

本発明の CAR Pまたはその変異タンパク質を使用する場合、該タンパク質 は標識されていても未標識であってもよく、また、標識タンパク質と未標識タ ンパク質を所定の割合で含む混合物も使用できる。標識用物質としては、例え ば、 F I TC、 FAM等の蛍光物質、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン 等の発光物質、 3H、 14C、 32 P、 35 S、 123 I等の放射性同位体、ビォチ ン、ストレプトアビジン等の親和性物質などが挙げられる。

本発明の CAR P遺伝子は、本発明の CAR Pをコードするものである限り 限定されない。例えば、本発明の CAR P遺伝子は、上記アミノ酸配列からな るタンパク質に対応するものであり得る。好ましくは、本発明の CAR P遺伝 子は、配列番号 1で表されるヌクレオチド配列からなる。なお、本発明の C A R P遺伝子は、上記のヒト遺伝子に限定されず、異種動物のオルソログをも含 む。

また、本発明によれば、配列番号 1で表されるヌクレオチド配列と相補的な 配列に対してストリンジェント条件下でハイブリダィズするヌクレオチド配列 からなり、且つ薬物に対して相互作用を示すタンパク質に対応する遺伝子も提 供される。ここで、ストリンジェント条件下でハイブリダィズするとは、例え ば、 6 X S S C、 0. 5 %SD S、 5 0 %ホルムアミドの溶液中で 4 2 °Cにて 加温した後、 0. 1 X S SC、 0. 5%SD Sの溶液中で 68°Cにて洗浄する 条件でも依然として陽性のハイブリダィゼーションシグナルが観察される,こと を意味する。

本発明の CAR Pおよびその遺伝子は、種々の疾患、例えば、 CARP標的 薬物に関連する疾患(例えば、アレルギー疾患、化学伝達物質の遊離の調節が 所望ざれる疾患、不整脈症状)、 CAR P遺伝子に関連する疾患に対する医薬 の開発、あるいは該疾患に対する研究用試薬の開発などに有用である。以下、 それぞれの疾患について詳述する。

(I . CARP標的薬物に関連する疾患)

「CAR P標的薬物に関連する疾患」とは、 CAR P標的薬物が適用される 疾患または該薬物の副作用に相当する疾患を意味する。 CAR P標的薬物に関 連する疾患は、 CARP標的薬物により改善または增悪され得る。 CARP標 的薬物に関連する疾患としては、例えば、アレルギー疾患、化学伝達物質に関 連する疾患、不整脈症状、その他の疾患が挙げられる。

「CAR P標的薬物に関連する作用」とは、 CAR P標的薬物が実際に示す 作用 (薬理作用、副作用を含む)と同種の作用または反対の作用を意味する。 換言すれば、 CARP標的薬物に関連する作用は、. 「CARP標的薬物に関連 する疾患」の改善または增悪を引き起こし得る作用である。即ち、 CARP標 的薬物に関連する疾患がアレルギー疾患である場合、 CAR P標的薬物に関連 する作用は、起アレルギー作用、抗アレルギー作用である。なお、「CAR P 標的薬物に関連する作用」は、「CARP標的薬物に関連する疾患」の説明に より自ずと明らかになるであろう。

( I (a) . ァレルギ一疾患)

アレルギー疾患は特に限定されるものではないが、 I型ァレルギ一に分類さ れるものが好ましい。このようなアレルギー疾患としては、例えば気管支喘息、 アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、花粉症、アトピー性皮膚炎、奪麻疹、 食物ァレルギ一などが挙げられる。ァステミゾールおよびテルフエナジンは抗

アレルギー薬として知られている。従って、ァステミゾールおよびテルフエナ ジンは、 CAR Pに結合し、 CAR Pと連動するシグナル伝達系の活性化また は阻害を引き起こしてその薬効を奏し得ると考えられるので、 CAR P遺伝子 の発現または機能を調節し得る物質は、起アレルギー作用、抗アレルギー作用 を有し得る。

( I (b) . 化学伝達物質の遊離の調節が所望される疾患)

化学伝達物質(chemical mediator) とは、生体内の任意の細胞から分泌さ れる、生理活性を有する生体物質を意味する。化学伝達物質としては、例えば、 アセチルコリン等の 4級アンモニア類、ヒスタミン、セロトニン,ノルェピ ネフリン、ドパミン等のアミン類、グルタミン、 GABA、グリシン等のアミノ 酸類、サブスタンス P、ソマトスタチン、エンケフアリン、 β -エンドルフィ ン等のペプチド、インターロイキン、 GM—C S F等のサイトカイン、へパリ ン等の多糖類、 PAF、プロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエ ン等の生理活性脂質等が挙げられる。ァステミゾールおよびテルフエナジンは 化学伝達物質の遊離を調節することによりその薬効を奏することが知られてい る。従って、 CAR Pの発現または機能を調節し得る物質は、化学伝達物質の 遊離を調節し得ると考えられる。化学伝達物質の遊離の調節は、化学伝達物質 の遊離の促進又は抑制であり得る。

化学伝達物質の遊離の調節が所望される疾患は、上述した化学伝達物質の作 用に関連する疾患であり、例えば上述したアレルギー疾患を含む免疫系疾患、 中枢神経系および末梢神経系疾患、ならびに内分泌系疾患などが挙げられる。 ( I (c) . 不整脈症状)

不整脈症状は特に限定されるものではなく、例えば QT間隔延長、トルサ一 ド - ド 'ポワント(心室頻脈)、期外収縮(心房性期外収縮、心室性期外収 縮)、徐脈性不整脈(洞不全症候群、房室ブロック)、頻脈性不整脈(心房頻 拍、心房粗細動、発作性上室性頻脈(WPW症候群を含む)、心室頻拍、心室 細動などが挙げられるが、なかでも QT間隔延長、トルサード · ド *ポワント (心室頻脈)が好ましい。ァステミゾールおよびテルフエナジンは心血管系障 害を引き起こし得ることが知られている。従って、 C A R P遺伝子の発現また は機能を調節し得る物質は、不整脈症状を誘発又は予防 ·治療し得ると考えら れる。

( 1 ( d ) . その他の疾患)

C A R P標的薬物に関連する疾患は、ァステミゾールまたはテルフエナジン に関連する疾患であり得る。

ァステミゾールに関連する疾患とは、ァステミゾールが適用される疾患また はァステミゾールの副作用に相当する疾患を意味する。ァステミゾールは、抗 アレルギー薬などとして知られている。ァステミゾールが適用される疾患とし ては、気管支喘息、蓴麻疹、湿疹 ·皮膚炎、皮膚そう痒症、アレルギー性鼻炎 等が例示される。一方、ァステミゾールの副作用としては、死亡、失神、心

〔拍〕停止、 QT間隔延長、トルサード ' ド 'ポワント(心室頻脈)、早発心 室攣縮、心室不整脈、嗜眠、頭痛、疲労、眩暈、眠け、鈍麻、うつ、感覚異常、 精神運動障害痙攣、口の渴き、吐き気、腹痛、膨満、下痢心臓血管系障害 [ Q T延長,心室性不整脈 (torsades de po intesを含む),心停止(死亡を含 む)等] 、汎血球減少症等が例示される。なお、ァステミゾールの標的として は、ヒスタミン H I受容体が知られている。

テルフエナジンに関連する疾患とは、テルフエナジンが適用される疾患また はテルフ-ナジンの副作用に相当する疾患を意味する。テルフエナジンは、抗 アレルギー薬などとして知られている。テルフエナジンが適用される疾患とし ては、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、湿疹、ジンマシン、皮膚炎、皮膚搔痒 症等が例示される。一方、テルフエナジンの副作用としては、血小板減少、心 室細動,死亡,心停止,低血圧,動悸,失神、 Q T間隔延長、頻脈、トルサ 一ド ' ド ' ポワント(心室頻脈)等が例示される。なお、テルフエナジンの標 的としては、ヒスタミン HI受容体が知られている。

さらに、 C A R Pタンパク質標的薬物に関連する疾患は、 C A R P結合化合 物に関連する疾患であり得る。 C A R P結合化合物とは、例えば、 a,—ジ フエニル一 4 -ピペリジノメタノール、ヒドロキシジン、デスメチルァステミ ゾール、 2—ァミノー 1一べンジノレベンズィミダゾーノレ、カルベンダジム、ォ キシベンダゾール、ァノレベンダゾール、アルベンダゾーノレスノレホキシド、ァノレ ベンダゾールスルホン、 2—アミノ一 5—N—プロピルスルホニルベンズィミ ダゾーノレ、メベンダゾーノレ、ノコダゾーノレ、ォキシフェンダゾーノレ、フェンべ ンダゾ一ルスノレホン、 2—ァミノべンズイミダゾーノレ、チアベンダゾール、ベ ンズイミダゾール、ラサ口シドを例示できる。

アルベンダゾールに関連する疾患とは、アルベンダゾールが適用される疾患 またはアルベンダゾールの副作用に相当する疾患を意味する。アルベンダゾー ノレは、駆虫剤などとして知られている。アルベンダゾールが適用される疾患と しては、包虫症等が例示される。一方、アルベンダゾールの副作用としては、 肝臓 *胆管系障害(肝機能障害、 AST (GOT)上昇、 ALT (GPT)上昇)、汎血球減 少症等が例示される。

メベンダゾールに関連する疾患とは、メベンダゾールが適用される疾患また はメベ ダゾールの副作用に相当する疾患を意味する。メベンダゾールは、駆 虫剤などとして知られている。メベンダゾールが適用される疾患としては、鞭 虫症等が例示される。一方、メベンダゾールの副作用としては、肝障害、発疹 等が例示される。

カルベンダジムに関連する疾患とは、カルベンダジムが適用される疾患また はカルベンダジムの副作用に相当する疾患を意味する。カルベンダジムは、殺 菌剤、殺虫剤、防カビ剤などとして知られている。また、カルベンダジムの作 用としては微細管の機能低下等が例示される。

チアベンダゾールに関連する疾患とは、チアベンダゾールが適用される疾患 またはチアベンダゾールの副作用に相当する疾患を意味する。チアベンダゾー

ルは、殺菌剤、殺虫剤、防カビ剤などとして知られている。また、チアンダ ゾールの作用としては微細管の機能低下等が例示される。

ノコダゾールに関連する疾患とは、ノコダゾールが適用される疾患またはノ コダゾールの副作用に相当する疾患を意味する。また、ノコダゾールの作用と しては微細管の形成阻害あるいは紡錘体形成阻害等が例示される。

ラサロシドに関連する疾患とは、ラサロシドが適用される疾患またはラサ口 シドの副作用に相当する疾患を意味する。ラサロシドは、ポリエーテル系のィ オノフォア抗生物質で、殺菌剤、抗原虫剤などとして知られている。また、ラ サロシドの作用としてはアポトーシスの促進あるいは阻害等が例示される。

( I I . C AR P遺伝子に関連する疾患)

「CAR P遺伝子に関連する疾患」とは、 CAR P遺伝子の機能または発現 量、あるいは CAR P遺伝子が関与するシグナル伝達系において CAR P遺伝 子の下流に位置付けられる遺伝子(下流遺伝子)の機能または発現量の変化に 伴い引き起こされ得る疾患をいう。 CAR P遣伝子またはその下流遺伝子の機 能の変化は、例えば、該遺伝子の変異(例えば、多型)によりもたらされ得る。 該変異としては、例えば、コーディング領域におけるその機能を促進または抑 制させる変異、非コーディング領域におけるその発現を促進または抑制させる 変異などが挙げられる。発現量の変化としては、発現量の增加または低下が挙 げられる。 C AR P遺伝子に関連する疾患は、 CAR Pにより改善または増悪 され得る。

「CAR P遺伝子に関連する機能」とは、 CAR Pが実際に示す機能と同種 の機能または反対の機能を意味する。換言すれば、「CAR P遺伝子に関連す る機能」は、「CAR P遺伝子に関連する疾患」の改善または増悪を引き起こ し得る機能である。 CAR P遺伝子に関連する機能としては、例えば、カスバ ーゼに関連する機能(例えば、アポトーシスの惹起、促進または抑制機能、 I L - 1ひ、 IL-lj3 , TNF-ひ、 IL-6等のサイト力イン類の産生誘導、促進または 抑制機能)、核内受容体の活性化または抑制機能(例えば、遺伝子発現調節機 能、脂質代謝調節機能、細胞分化調節機能、細胞増殖調節機能、免疫反応調節 機能)などが挙げられる。

C AR P遺伝子に関連する疾患としては、 CAR P遺伝子が生体内で種々の 生理学的機能を担っていると考えられることを考慮すれば、実に様々な疾患が 想定されるが、例えば、各種の癌、免疫疾患、炎症性疾患、代謝性疾患、神経 系疾患、呼吸器系疾患、循環器系疾患、骨疾患、皮膚疾患、脱毛症などが挙げ られる。また、 CAR P遺伝子が関連する可能性のあるその他の疾患としては、 不整脈惹起性右心室形成異常(家族性) 6 (OMIM ID :604401) 、ハンセン病 (OMIM ID: 246300) が挙げられる。

( I I I . C AR P標的薬物)

本発明の式( I ) 〜( I I I ) の化合物について説明する。

本発明者らは、式( I ) 〜( I I I ) の化合物が CAR Pに対する結合能を 有し、かつ抗アレルギー剤等の医薬(上記参照)、あるいは CAR Pに対する 結合プローブ、ァフィ二ティー樹脂、標識剤、 CAR P機能の調節剤(上記参 照)などとして使用し得ることを見出した。

式( I ) 〜( I I I ) で表される化合物は、基本骨格あるいは置換基の種類 に基づく特徴を利用し、種々の公知の合成方法を適用して製造することができ る。例えばアルキル化、ァシル化、アミノ化、イミノ化、ハロゲン化、還元、 酸化、縮合、環化等が挙げられ、通常当分野で用いられる反応または方法が利 用できる。

なお、式( I ) 〜( I I I ) の化合物は、式 x_zと標記することができる。 詳細には、式( I ) の化合物は X — (218または211;) と、式( I I ) の化合物は X2— Z2 (Z 2 aまたは Z2 b) と、式( I I I ) の化合物は X3— z3 (z3 aまたは z3 b) と標記することができる。

Xi〜X3は、下記の通りであり得る:

i :


〔式中、!^ェは、水素原子またはヒドロキシであり、

R 2、 R 3は、各々独立して、ハロゲン、シァノ、ヒドロキシおよびァミノ からなる群より選ばれる 1〜3個の置換基で置換されていてもよい、フエニル または炭素数 7〜 1 1のフエニルアルキルであり、

Y!は、下記式:


で表されるいずれかの基である。〕

X


〔式中、 R 4は、水素原子、ヒドロキシ、または下記式

R6

(式中、 R 6は、炭素数 1〜5のアルキル、炭素数 3〜 7のシクロアルキル、 フエニル、炭素数 7〜1 1のフエニルアルキルまたは複素環である。)で表さ れるいずれかの基であり、

R 5は、水素原子、あるいはハロゲン原子、シァノ、ヒドロキシおよびアミ ノからなる群より選ばれる 1または 2個の置換基で置換されていてもよい、炭 素数 1 ~ 5のアルキル、炭素数 3〜 7のシクロアルキル、フエニルまたは炭素 数 7〜 1 1のフエニルアルキルであり、

Y 2は、下記式:

—— A— (Αは、炭素数 1〜 3のアルキル基である)


で表されるいずれかの基である„〕

X


z l a〜z 3 aは、各々独立して、水素原子、あるいはハロゲン、シァノ、ヒ ドロキシ、カルボニル、ァミノ、炭素数 1〜5のアルキル、炭素数 1〜5のァ ルキルォキシおよび炭素数 3〜 7のシク口アルキルからなる群より選ばれる 1 〜3個の置換基、あるいは R 7で置換されていてもよい、炭素数 1〜7のアル キル、炭素数 2〜 7のァルケニル、炭素数 1〜 7のアルキルォキシまたは炭素 数 1〜7のアルキルァミノであり得る。 R 7としては、例えば、炭素数 1〜7 のァレキル、炭素数 1〜 7のアルキルォキシ、カルボン酸、炭素数 1〜7のァ ルキルォキシカルボニル、ハロゲン、シァノ、ヒドロキシおよびァミノからな る群より選ばれる 1〜 3個の置換基で置換されていてもよいフエニルが挙げら

れる。

一方、 Z l b、 Z 2 bは、各々独立して、水素原子、あるいはハロゲン、,シァ ノ、ヒドロキシ、カルボニル、ァミノ、炭素数 1〜 5のアルキル、炭素数 1〜 5のアルキルォキシおよび炭素数 3〜 7のシクロアルキルからなる群より選ば れる 1〜5個(例えば、 1〜3個)の置換基で置換されていてもよい、炭素数 8〜 2 0のァノレキノレ、炭素数 8〜 2 0のァノレケニノレ、炭素数 8〜 2 0のァノレキ ルォキシまたは炭素数 8〜 2 0のアルキルァミノであり得る。 Z 3 bは、例え ば、水素原子、あるいはハロゲン、シァノ、ヒドロキシ、カルボニル、ァミノ、 炭素数 1〜 5のアルキル、炭素数 1〜 5のアルキルォキシおよび炭素数 3〜 7 のシクロアルキルからなる群より選ばれる 1〜5個(例えば、 1〜3個)の置 換基、あるいは R 8で置換されていてもよい、炭素数 1〜7のアルキル、炭素 数 2〜 7のァルケニル、炭素数 1〜 7のアルキルォキシまたは炭素数 1〜 7の アルキルァミノであり得る。 R 8としては、例えば、炭素数 1〜 7のアルキル、 炭素数 1〜 7のアルキルォキシ、カルボン酸、ハロゲン、シァノ、ヒドロキシ およびアミノからなる群より選ばれる 1〜3個の置換基で置換されていてもよ いフエ二ノレが挙げられる。

「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であ る。

「炭素数 7〜1 1のフエニルアルキル基」は、例えば、ベンジル、フエネチ ノレ、フエ二ノレプロピル、フエ二ノレイソプロピノレ、フエニルプチノレ等が挙げられ る。

「炭素数 1〜7のアルキル」は、直鎖または分岐鎖であり得、例えば、メチ ノレ、ェチル、プロピル、イソプロピル、プチル、イソプチノレ、 s e c—プチノレ、 t e r t _プチノレ、ペンチノレ、イソペンチノレ、ネオペンチノレ、 s e c —ペンチ ノレ、 t e r t —ペンチノレ、へキシノレ、イソへキシノレ、 2—ェチノレブチノレ、ヘプ チル等が挙げられる。

「炭素数 1〜5のアルキル」は、直鎖または分岐鎖であり得、例えば、上述

したアルキルのうち、炭素数 1〜 5のものが挙げられる。

「炭素数 8〜 2 0のアルキル」は、直鎖または分岐鎖であり得、例え、ォ クチル、ノニル、デカニル、ゥンデ力ニル、ドデカニル、トリデカニル、ィコ サニル等が挙げられる。

「炭素数 1〜7のアルキルォキシ」は、例えば、メトキシ、エトキシ、プロ ピルォキシ、イソプロピルォキシ、ブチルォキシ、イソプチルォキシ、 s e c ーブチノレオキシ、 t e r t—プチ/レオキシ、ペンチノレオキシ、イソペンチノレオ キシ、ネオペンチノレオキシ、 s e c一ペンチノレオキシ、 t e r t一ペンチノレオ キシ等が挙げられる。

「炭素数 1〜 5のアルキルォキシ」としては、.例えば、上述したアルキルォ キシのうち、炭素数 1〜5のものが挙げられる。

「炭素数 8〜2 0のアルキルォキシ」は、例えば、ォクチルォキシ、ノニル ォキシ、デカニルォキシ、ゥンデ力ニルォキシ、ドデカニルォキシ、トリデカ

-ルォキシ、ィコサニルォキシ等が挙げられる。

「炭素数 3〜 7のシクロアルキル」としては、例えば、シクロプロピル、シ クロブチル、シクロペンチル、シクロへキシル、シクロへプチルが挙げられる, 「炭素数 2〜 7のァルケニル」は、例えば、直鎖または分岐鎖であり得、例 えば、例えば、ェテュル、 1一プロぺニノレ、 2—プロぺニノレ、 2—メチノレ一 1 一プロぺニノレ、 1—ブテュル、 2—ブテニノレ、 3—ブテニノレ、 3—メチノレ一 2 一ブテニノレ、 1—ペンテ二ノレ、 2—ペンテ二ノレ、 3 _ペンテ二/レ、 4一ペンテ ニル、へキセニル、ヘプテニル等が挙げられる。

「炭素数 8〜2 0のアルケニル」は、直鎖または分岐鎖であり得、例えば、 ォクテニル、ノネニル、デセニル、ゥンデセニル、ドデセニル、トリデセニル ィコセニル等が挙げられる。

「炭素数 1〜7のアルキルァミノ」は、炭素数 1〜 7の直鎖または分岐鎖の アルキルでモノ置換されたァミノ、または炭素数 1〜 6の直鎖または分岐鎖の アルキルでジ置換されたァミノであり得る。炭素数 1〜 7の直鎖または分岐鎖

のアルキルでモノ置換されたァミノとしては、例えば、 N—メチルァミノ、 N ーェチルァミノ、 N—プロピルァミノ、 N—イソプロピルァミノ、 N—ブチル ァミノ、 N—ィソブチノレアミノ、 N— s e c—プチルァミノ、 N— t e r t — プチルァミノ、 N—ペンチルァミノ、 N—イソペンチルァミノ.、 N—ネオペン チルァミノ、 N— s e c —ペンチルァミノ、 N— t e r t—ペンチノレアミノ、 N—へキシルァミノ、 N—イソへキシノレアミノ、 N— 2—ェチ^/プチノレアミノ N—ヘプチルァミノ等が挙げられる。炭素数 1〜6の直鎖または分岐鎖のアル キルでジ置換されたァミノとしては、例えば、 N , N—ジメチルァミノ、 N , N—ジェチルァミノ、 N , N—ジプロピノレアミノ、 N , N—ジイソプロピルァ ミノ、 N—ェチル一N—メチルァミノ、 N—プロピノレ一 N—メチノレアミノ、 N 一イソプロピノレ一 N—メチノレアミノ、 N—ブチノレ一 N—メチノレアミノ、 N—ィ ソプチノレー N—メチノレアミノ、 N— s e c _ブチル一 N—メチノレアミノ、 N— t e r t—ブチノレ一 N—メチルァミノ、 N—ペンチノレ一 N—メチノレアミノ、 N —ィソペンチノレ一 N—メチルァミノ、 N—ネオペンチル一N—メチノレアミノ、 N - s e c—ペンチノレ一 N—メチノレアミノ、 Ν— t e r t—ペンチノレ一 N—メ チルァミノ、 N—へキシノレ一N—メチノレアミノ、 N—イソへキシル一N—メチ ルァミノ等が挙げられる。

「炭素数 8〜 2 0のアルキルァミノ」は、炭素数 8〜 2 0の直鎖または分岐 鎖のアルキルでモノ置換されたァミノ、または炭素数 1〜7の直鎖または分岐 鎖のアルキルでジ置換されたァミノであり得る。炭素数 8〜2 0の直鎖または 分岐鎖のアルキルでモノ置換されたァミノとしては、例えば、 N—ォクチルァ ミノ、 N—ノニルァミノ、 N—デカニルァミノ、 N—ゥンデ力ニルァミノ、 N 一ドデカニルァミノ、 N—トリデカニルァミノ、 N—ィコサニルァミノ等が挙 げられる。炭素数 1〜 7の直鎖または分岐鎖のアルキルでジ置換されたァミノ としては、例えば、 N—ヘプチル一 N—メチルァミノ、 N—ォクチルー N—メ チルァミノ、 N— ( 1 , 1, 3 , 3—テトラメチルプチル)一N—メチルアミ ノ、 N—ノニル一N—メチルァミノ、 N—デカニル一 N—メチルァミノ、 N—

ゥンデ力二ルー N—メチルァミノ、 N—ドデカニル一 N—メチルァミノ、』 N— トリデカニル一 N—メチルァミノ等が挙げられる。

「炭素数 1〜 7のアルキルォキシカルボニル」は、上述した炭素数 1〜7の アルキルォキシで置換されたカルボニルであり得、例えば、メ.トキシカルボ二 ル、エトキシカルボニル、プロピルォキシカルボニル、イソプロピルォキシ力 ノレボニノレ、ブチノレオキシカノレボニノレ、イソブチノレオキシカノレボニノレ、 s e c— プチルォキシカノレポ二ノレ、 t e r t一ブチルォキシカノレボニル、ペンチルォキ シカルボ二ノレ、ィソペンチノレォキシカノレボニル、ネオペンチルォキシカルボ二 ノレ、 s e c —ペンチノレォキシカノレポ二ノレ、 t e r t—ペンチノレォキシカノレボニ ル等が挙げられる。

「複素環」は、環構成原子として炭素原子以外に酸素原子、硫黄原子および 窒素原子から選ばれるヘテロ原子を 1〜 4個(好ましくは 1〜3個、より好ま しくは 1または 2個)含有する、 4〜7員(好ましくは 5または 6員)の単環 式芳香族または非芳香族複素環、あるいは 4〜1 3員の縮合芳香族または非芳 香族複素環であり得る。このような単環式芳香族複素環としては、例えば、フ リル、チェニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、ピロ リル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ォキサゾリ ル、イソォキサゾリル等が挙げられる。このような単環式非芳香族複素環とし ては、例えば、ピロリジニル、ピベリジニル、モルホリエル、チオモルホリニ ノレ、ピペラジニル、へキサメチレンイミニル、ォキサゾリジニル、チアゾリジ ニル、イミダゾリジニル、ジォキソリル、ジォキソラニル、テトラヒドロビラ ニル、テトラヒドロチォピラエル等が挙げられる。また、このような縮合芳香 族複素環としては、例えば、キノリル、イソキノリル、キナゾリル、キノキサ リル、フタラジュル、ベンゾフリル、ベンゾチェニル、ベンゾォキサゾリル、 ベンゾチアゾリル、ベンズイミダゾリル、インドリル、インダゾリル等が挙げ られる。このような縮合非芳香族複素環としては、例えば、ジヒドロキノリニ ノレ、テトラヒドロキノリニル、ジヒドロイソキノリニル、テトラヒドロイソキ ノリニル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾジォキシュル、テラヒ ドロベンゾフラニル、ジヒドロインドリル等が挙げられる。

好ましくは、式( I ) に含まれる X は、下記式で表されるいずれかの基で あり得る。


より好ましくは、式( I ) に含まれるは、下記式で表される基であり得 る。


好ましくは、式( I I ) に含まれる下記式


で表される基は、下記式で表されるいずれかの基であり得る。

また、 z l a〜z 3 aの好ましい例としては、以下の式で表される化合物が挙 げられる。

の具体例としては、以下の式で表される基が挙げられ

Z j b〜z 3 bのなかでも z 3 bの好ましい例としては、以下の式で表される化 合物が挙げられる。

X3— B-R8 (ここで、 Bは、炭素数 1〜 3のアルキルである) このような z3の具体例としては、以下の式で表される基が挙げられる。

X i — Z i aで表される化合物の具体例としては、テルフエナ iジン (Terfenadine) 、 a , α—ジフエ二ノレ一 4ーピペリジノメタノーノレ(Alpha, alpha - Dipheny丄- 4 - piperidinometnanol ) 、ヒドロキシシン (Hydroxizine) 力 s挙げられる。

X 2 — Z 2 aで表される化合物の具体例としては、ァステミゾール (Astemizole 、デスメチノレアステミゾーノレ (Desmethyl— astemizole) 、 2 — ァミノ一 1 —ペンジノレベンズィミダゾール( 2-Amino- 1_ Benzylbenziraidazole) 、力ノレべングジム (Carbendazira) 、ォキシベンダゾ 一ノレ(Oxibendazole) 、ァノレベンダゾーノレ(Albendazole) 、ァノレベンタ'、ゾ 一ルスルホキシド(Albendazole Sulfoxide) 、アルベンダゾールスノレホン (Albendazole Sulfone) 、 2—アミノー 5 _ N—プロピノレスノレホニノレベンズ Ί ^ グン—ノレ (2-Amino-5-N-propylsul phony lbenz imidazole) 、メべンタゾ 一ノレ (Mebendazole) 、ノコタ、'ゾーノレ (Nocodazole) 、才キシフェンタ、、ゾーノレ (Oxfendazole) 、フェンベンタ、'ゝノーノレスノレホン (Fenbendazole Sulfone) 2—ァミノべンズイミダゾーノレ(2— Aminobenzimidazole) 、チアベンダゾー ノレ(Thiabendazole) 、ベンズイミタ'ゾーノレ(Benzimidazole) 力挙【ずられる, X 3— Z 3 aで表される化合物の具体例としては、ラサロシドナトリウム (Lasalocid sodium) 力 S挙げられ。

2. スクリーニング方法、および該方法により得られる成果物

本発明は、被験物質が CAR P遺伝子の発現または機能を調節し得るか否か を評価することを含む、薬物のスクリーニング方法を提供する。本発明のスク リーニング方法は、スクリーニングされる薬物の種類の観点から、 CAR P標 的薬物に関連する作用(例えば、アレルギー症状、化学伝達物質の遊離)を調 節し得る物質、および CAR P遺伝子に関連する機能を調節し得る物質をスク リーユングする方法に大別できる。本発明のスクリーニング方法はまた、イン ビトロ、インビボまたはインシリコで行うことができる。なお、本発明のスク リーユング方法により得られる CAR P遺伝子の発現を調節し得る物質は、 C

AR Pの量を調節し得る物質と同義であり、所定の組織または細胞における C AR Pの存在量、あるいは所定の細胞内位置における CAR Pの存在量を変化 させ得る物質であり得る。従って、 CAR P遺伝子の発現を調節し得る物質と しては、例えば、 C AR P遺伝子からの CAR Pの生合成を調節し得る物質の みならず、 CAR Pの細胞内局在を調節し得る物質、 CAR P遺伝子の代謝 (例えば、代謝による分解)を調節し得る物質もまた含まれる。

以下、それぞれのスクリーニング方法を詳述する。

2. 1. CAR P標的薬物に関連する作用を調節し得る物質のスクリーニング 方法 (スクリーニング方法 I )

本発明は、被験物質が CAR P遺伝子の発現または機能を調節し得るか否か を評価することを含む、 CAR P標的薬物に関連する作用を調節し得る物質の スクリーニング方法を提供する。

本スクリーニング方法を、必要に応じて「スクリーニング方法 I」と省略す る。

スクリーニング方法 Iは、被験物質が CAR P遺伝子の発現または機能を調 節し得るか否かを評価し、 CAR P遺伝子の発現または機能を調節し得る被験 物質を選択することを含む、 CAR P標的薬物に関連する作用を調節し得る物 質のスクリーニング方法(スクリーニング方法 I a ) 、並びに被験物質が C A R P遺伝子の発現または機能を調節し得るか否かを評価し、 CAR P遺伝子の 発現または機能を調節し得ない被験物質を選択することを含む、 CAR P標的 薬物に関連する作用(なかでも、既知標的分子に関連する作用)を調節し得る 物質のスクリーニング方法(スクリーニング方法 I b) に大別できる。スクリ —ニング方法 I aは、 CAR P標的薬物に関連する疾患または状態の調節薬の 開発などに有用であり得る。また、スクリーニング方法 I bは、既知標的分子 に関連する作用の調節能を有し、且つ CAR P標的薬物が示す副作用が低減し た医薬の開発などに有用であり得る。

2. 1. 1. CARP遺伝子の発現または機能を調節し得る被験物質を選択す ることを含む、 CAR P標的薬物に関連する作用を調節し得る物質のスクリー ユング方法(スクリーニング方法 I a)

スクリーユング方法に供される被験物質は、いかなる公知化^^物及び新規化 合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、タンパク質、ペプチド、有 機低分子化合物、コンビナトリァルケミストリー技術を用いて作製された化合 物ライブラリー、固相合成やファ一ジディスプレイ法により作製されたランダ ムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成 分等が挙げられる。被験物質は、標識されていても未標識であってもよく、ま た、標識体と未標識体を所定の割合で含む混合物も被験物質として使用できる。 標識用物質は、上述したものと同様である。

一実施形態では、スクリーニング方法 I aは、下記の工程(a) 、(b) 及 び ( c ) を含む:

(a ) 被験物質を CAR Pまたはその変異タンパク質に接触させる工程;

(b) 被験物質の存在下における CAR Pまたはその変異タンパク質の機能レ ベルを測定し、該機能レベルを被験物質の非存在下における CAR Pの機能レ ベルと比較する工程;

(c) 上記(b) の比較結果に基づいて、 CAR Pまたはその変異タンパク質 の機能レベルの変化をもたらす被験物質を選択する工程。

上記(a) 〜(c) の工程を含む方法論を、必要に応じて「方法論 I」と省 略する。

方法論 Iの工程(a) では、被験物質が CARPまたはその変異タンパク質 (以下、必要に応じて CARPと省略)と接触条件下におかれる。被験物質の 該タンパク質に対する接触は、溶液中での単離された CAR Pと被験物質との 接触、あるいは CARPを発現可能な細胞又は組織と被験物質との接触により 行われ得る。

CAR Pは自体公知の方法により調製できる。例えば、上述した発現組織か ら CAR Pを単離 .精製できる。しかしながら、迅速、容易かつ大量に AR Pを調製し、また、ヒト CARPを調製するためには、遺伝子組換え技術によ り組換えタンパク質を調製するのが好ましい。組換えタンパク質は、細胞系、 無細胞系のいずれで調製したものでもよい。

CARPを発現可能な細胞は、 CAR Pを発現するものである限り特に限定 されず、 C AR Pの発現組織由来の細胞、 CARP発現ベクターで形質転換さ れた細胞などであり得る。該細胞は、当業者であれば容易に同定又は調製でき、 初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セル バンクより入手可能な細胞株などを使用できる。 CAR Pを発現可能な組織は、 上述した発現組織を使用できる。

方法論 Iの工程(b) では、被験物質の存在下における CAR Pの機能レべ ルが測定される。機能レベルの測定は、上述した CAR Pの機能を測定可能な 自体公知の方法により行われ得る。

また、機能レベルは、 CAR Pの総機能レベルに基づいて測定するのではな く、 CAR Pの個々のァイソフォーム(例えば、スプライシングバリアント) に対する機能レベルあるいはァイソフォーム間の機能レベル比に基づいて測定 してもよレ、。

次いで、被験物質の存在下における CAR Pの機能レベルが、被験物質の非 存在下における CAR Pの機能レベルと比較される。機能レベルの比較は、好 ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質の非存在下における C AR Pの機能レベルは、被験物質の存在下における CAR Pの機能レベルの 測定に対し、事前に測定した機能レベルであっても、同時に測定した機能レべ ルであってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した機能レべ ルであることが好ましい。

方法論 Iの工程(c) では、該タンパク質の機能レベルの変化をもたらす被 験物質が選択される。該タンパク質の変化をもたらす被験物質は、 CARPの 機能を促進または抑制し得る。このように選択された被験物質は、 CARP標 的薬物に関連する疾患または状態の調節に有用であり得る。

別の実施形態では、スクリーニング方法 I aは、下記の工程(a) 、 (b) 及び ( c ) を含む:

(a) 被験物質と CAR P遺伝子の発現を測定可能な細胞とを接触させるェ 程;

(b) 被験物質を接触させた細胞における CAR P遺伝子の発現量を測定し、 該発現量を被験物質を接触させない対照細胞における CAR P遺伝子の発現量 と比較する工程;

(c) 上記(b) の比較結果に基づいて、 C AR P遺伝子の発現量を調節する 被験物質を選択する工程。

上記(a) 〜(c) の工程を含む方法論を、必要に応じて「方法論 I I J と 省略する。

方法論 I Iの工程(a) では、被験物質が CARP遺伝子の発現を測定可能 な細胞と接触条件下におかれる。 CAR P遺伝子の発現を測定可能な細胞に対 する被験物質の接触は、培養培地中で行われ得る。

「C A R P遺伝子の発現を測定可能な細胞」とは、 CARP遺伝子の産物、 例えば、転写産物、翻訳産物の発現レベルを直接的又は間接的に評価可能な細 胞をいう。 C AR P遺伝子の産物の発現レベルを直接的に評価可能な細胞は、 CAR P遺伝子を天然で発現可能な細胞であり得、一方、 CARP遺伝子の産 物の発現レベルを間接的に評価可能な細胞は、 C AR P遺伝子転写調節領域に ついてレポーターアツセィを可能とする細胞であり得る。

CAR P遺伝子を天然で発現可能な細胞は、 C AR P遺伝子を潜在的に発現 するものである限り特に限定されず、 CAR P遺伝子を恒常的に発現している 細胞、 CAR P遺伝子を誘導条件下(例えば、薬物での処理)で発現する細胞 などであり得る。該細胞は、当業者であれば容易に同定でき、初代培養細胞、 当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手 可能な細胞株などを使用できる。 CAR Pが発現している細胞株としては、例 えば、 HL 60、 He 1 a S 3、 K— 56 2、 MOLT— 4、 R a j i、 S w 480、 A549、 G- 36 1等が挙げられる。なお、 CARPは、心臓、骨 格筋、脳、肺、腎臓、肝臓、脾臓、大腸、小腸、胎盤等の組織で発現している ことが知られているので、これらの組織由来の細胞または細胞株を使用しても よい。

CAR P遺伝子転写調節領域についてレポーターアツセィを可能とする細胞 は、 CAR P遺伝子転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポータ 一遺伝子を含む細胞である。 CARP遺伝子転写調節領域、レポーター遺伝子 は、発現ベクター中に挿入されている。

CAR P遺伝子転写調節領域は、 CAR P遺伝子の発現を制御し得る領域で ある限り特に限定されないが、例えば、転写開始点から上流約 2 k b pまでの 領域、あるいは該領域の塩基配列において 1以上の塩基が欠失、置換若しくは 付加された塩基配列からなり、且つ CAR P遺伝子の転写を制御する能力を有 する領域などを挙げることができる。

レポーター遺伝子は、検出可能なタンパク又は酵素をコードする遺伝子であ ればよく、例えば GF P (緑色蛍光タンパク質)遺伝子、 GUS (0—グノレク 口ニダ一ゼ)遺伝子、 LUS (ルシフェラーゼ)遺伝子、 CAT (クロラムフ ェニコルァセチルトランスフェラーゼ)遺伝子等が挙げられる。

CARP遺伝子転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター 遺伝子が導入される細胞は、 CAR P遺伝子転写調節機能を評価できる限り、 即ち、該レポーター遺伝子の発現量が定量的に解析可能である限り特に限定さ れない。しかしながら、 CAR P遺伝子に対する生理的な転写調節因子を発現 し、 CAR P遺伝子の発現調節の評価により適切であると考えられることから、 該導入される細胞としては、 CAR P遺伝子を天然で発現可能な細胞が好まし レ、。

被験物質と C A R P遺伝子の発現を測定可能な細胞とが接触される培養培地 は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、約〜 2 0%のゥシ胎仔血清を含む最少必須培地(MEM) 、ダルベッコ改変最少必須 培地 (DMEM) 、 R PM I 1 6 40培地、 1 9 9培地などである。培養条件 もまた、用いられる細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地 の p Hは約 6〜約 8であり、培養温度は通常約 3 0〜約 40°Cであり、培養時 間は約 1 2〜約 7 2時間である。

方法論 I Iの工程(b) では、先ず、被験物質を接触させた細胞における C AR P遺伝子の発現量が測定される。発現量の測定は、用いた細胞の種類など を考慮し、自体公知の方法により行われ得る。

例えば、 CAR P遺伝子の発現を測定可能な細胞として、 CAR P遺伝子を 天然で発現可能な細胞を用いた場合、発現量は、 CAR P遺伝子の産物、例え ば、転写産物又は翻訳産物を対象として自体公知の方法により測定できる。例 えば、転写産物の発現量は、細胞から total RNAを調製し、 RT— P CR、 ノザンブロッテイング等により測定され得る。また、翻訳産物の発現量は、細 胞から抽出液を調製し、免疫学的手法により測定され得る。免疫学的手法とし ては、放射性同位元素免疫測定法(R I A法)、 E L I SA法(Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980)) 、蛍光抗体法などが使用できる。

一方、 C AR P遺伝子の発現を測定可能な細胞として、 CAR P遺伝子転写 調節領域についてレポーターアツセィを可能とする細胞を用いた場合、発現量 は、レポーターのシグナル強度に基づき測定され得る。

また、発現量は、 CAR P遺伝子の総発現量に基づいて測定するのではなく、 C AR P遺伝子の個々のァイソフォーム(例えば、スプライシングバリアン ト)に対する発現量あるいはアイソフォーム間の発現比に基づいて測定しても よい。

さらには、発現量は、所定の細胞内器官への局在に基づいて測定することも できる。細胞に局在する CAR Pの量は、自体公知の方法により測定できる。 例えば、 G F P遺伝子等の蛍光タンパク質をコードする遺伝子と融合させた C AR Pを適切な細胞に導入し、培養培地において被験物質の存在下で培養する。 次いで、共焦点顕微鏡により所定の細胞内器官における蛍光シグナルを観察し、 被験物質の非存在下での該器官における蛍光シグナルと比較すればよい。また、 CAR Pに対する抗体を用いる免疫染色によっても、所定の細胞内器官に局在 する CAR Pの量を測定できる。

次いで、被験物質を接触させた細胞における C AR P遺伝子の発現量が、被 験物質を接触させない対照細胞における C AR P遺伝子の発現量と比較される。 発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質 を接触させない対照細胞における CAR P遺伝子の発現量は、被験物質を接触 させた細胞における CAR P遺伝子の発現量の測定に対し、事前に測定した発 現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現 性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。

方法論 I Iの工程(c ) では、 C A R P遺伝子の発現量を調節する被験物質 が選択される。 C AR P遺伝子の発現量の調節は、発現量の促進または抑制で あり得る。このように選択された被験物質は、 CAR P標的薬物に関連する作 用の調節に有用であり得る。

別の実施形態では、スクリーニング方法 l aは、下記の工程(a ) 、 ( b ) 及び ( c ) を含む:

( a ) 被験物質を C AR Pまたはその変異タンパク質に接触させる工程;

( b ) 被験物質の該タンパク質に対する結合能を測定する工程;

( c ) 上記(b ) の結果に基づいて、該タンパグ質に結合能を有する被験物質 を選択する工程。

上記(a ) 〜(c ) の工程を含む方法論を、必要に応じて「方法論 I I I J と省略する。

方法論 I I Iの工程(a ) では、被験物質が CAR Pまたはその変異タンパ ク質と接触条件下におかれる。被験物質の該タンパク質に対する接触は、,溶液 中での被験物質と該タンパク質との混合により行われ得る。

CAR Pは自体公知の方法により調製できる。例えば、上述した CAR Pの 発現組織から CAR Pを単離 ·精製できる。しかしながら、迅速、容易かつ大 量に CAR Pを調製し、また、ヒト CAR Pを調製するためには、遺伝子組換 え技術により組換えタンパク質を調製するのが好ましい。組換えタンパク質は、 細胞系、無細胞系のいずれで調製したものでもよい。 CAR P標的薬物に結合 能を有する変異タンパク質もまた、当業者であれば、自体公知の方法により容 易に調製できる。変異タンパク質は上述の通りである。

方法論 I I Iの工程(b) では、該タンパク質に対する被験物質の結合能が 測定される。結合能の測定は、自体公知の方法により行われ得る。また、結合 能の他、結合強度、該タンパク質に対する結合における被験物質の濃度依存性 などがさらに測定できる。結合強度、濃度依存性は、測定手段を適宜選択する ことで測定できる。

結合能の測定は、例えば、 S E CZMS (サイズ排除クロマトグラフィー Z 質量分析)法により行われ得る(Moy, F. J. et al. , Anal. Chem. , 2001, 73, 571- 581参照)。 S EC^MS法では、(1 ) 精製したタンパク質に混合 した多重化化合物標品を添加した後、遊離の化合物とタンパク質とを S E Cで 分離する工程と、(2) タンパク質分画に含まれる結合化合物を MSによって 同定する解析工程とから構成される。 S E C/MS法は、タンパク質、被験物 質の双方とも非修飾、非固定の状態で結合能を解析できる点で優れている。 S ECノ MS法では、被験物質のタンパク質に対する結合能のみならず、タンパ ク質に対する結合における被験物質の濃度依存性などについても同時に測定で きる。

結合能の測定はまた、表面プラズモン共鳴を利用した測定手段、例えば、 B i a c o r eにより行われ得る。 B i a c o r eでは、チップ上に固定したタ ンパク質において、被験物質のタンパク質に対する結合及び解離を測定 lt、被 験物質を含有しない溶液をチップ上にロードした場合と比較する。そして、結 合及び解離の速度あるいは結合量についての結果に基づいて、タンパク質に結 合能を有する被験物質が選択される。 B i a c o r eでは、被験物質のタンパ ク質に対する結合能のみならず、結合強度(例えば、 Kd値)などについても 同時に測定できる。

結合能を測定し得る他の方法としては、例えば、水晶振動子マイクロバラン ス (Quartz Crystal icrobalance: QCM) 法、二面偏波式干渉計 (Dual Pol arisation Interferometer: DPI) 法、 Couplea Waveguide Plasmon Resona nce法等の SPRあるいは光学的な手法、免疫沈降法、等温滴定および示差走査 カロリメトリー、キヤピラリー電気泳動法、エナジートランスファー、蛍光相 関分析等の蛍光分析法、さらには X線結晶構造解析、 Nuclear Magnetic Reso nance (删 R)等の構造解析法が挙げられる。

また、結合能の測定に際しては、 CAR P結合性物質をコントロールとして 用いることもできる。

「CAR P結合性物質」とは、 CAR Pまたはその変異タンパク質と直接的 に相互作用可能な化合物であり、例えば、タンパク質、核酸、糖質、脂質、低 分子有機化合物であり得る。好ましくは、 CAR P結合性物質は、 CAR P標 的薬物、例えばァステミゾールもしくはテルフエナジンまたはそれらの代謝体、 あるいは α , α—ジフエニル一 4—ピペリジノメタノール、ヒドロキシジン、 デスメチルァステミゾール、 2—ァミノ一 1一べンジルベンズィミダゾール、 カルベンダジム、ォキシベンダゾーノレ、ァノレベンダゾーノレ、ァノレベンダゾーノレ スノレホキシド、アルベンダゾーノレスノレホン、 2—ァミノ一 5—Ν—プロピノレス ノレホニノレベンズイミダゾーノレ、メベンダゾーノレ、ノコダゾーノレ、ォキシフェン ダゾール、フェンベンダゾーノレスルホン、 2—ァミノべンズイミダゾーノレ、チ ァベンダゾール、ベンズイミダゾール、ラサ口シド、あるいは CAR Pに結合 能を有するそれらの誘導体(後述)、あるいはそれらの塩であり得る。

ァステミゾールおよびテルフエナジンは、その未代謝体が有害事象(不整 脈)を引き起こす主要因であることが既に判明しており、その代謝体の方が安 全性に優れることが知られている。ァステミゾールの代謝体としては、例えば、 デスメチルァステミゾール、 4- {2- [4- (1H-ベンゾィミダゾール- 2-ィルァミ ノ) -ピペリジン- 1-ィル] -ェチル} -フエノール、 1- (4-フルォロ-ベンジノレ) - 2-{1-[2- (4-メトキシ-フエ二ル)-ェチル]-ピペリジン- 4-ィルァミノ}- 1H-ベン ゾイミダゾール- 5-オール、 3-(4-フルォ口-ベンジル) -2- {1 - [2-(4-メトキ シ-フエ二ノレ) -ェチル]-ピペリジン- 4-ィルアミノ}- 3H-ベンゾィミダゾ一ル-5-オール、卜(4-フルォ口-ベンジル) - 2-{1- [2- (4-ヒドロキシ -フエ二ル)-ェ チル] -ピペリジン- 4-ィルァミノ卜 1H-ベンゾイミダゾール -5-オール、 3-(4-フルォ口-ベンジル) - 2-{1- [2-(4-ヒドロキシ-フエニル) -ェチル] -ピペリジ ン -4-ィルアミノ卜 3H-ベンゾィミダゾール -5-オール、 4-{2- [4- (1H-ベンゾ ィミダゾール- 2-ィルァミノ)-ピペリジン-卜ィノレ]-ェチル } -フエノール、 [1-(4-フルォ口-ベンジル) -1H-ベンゾィミダゾール- 2-ィル] -ピペリジン- 4-ィ ノレ-ァミンが挙げられる。テルフエナジンの代謝体としては、例えば、 1_[4_ (2-ヒドロキシ- 1, 1-ジメチル-ェチル) -フエニル] -4-[4- (ヒドロキシ -ジフエ 二ル-メチル) -ピペリジン- 1-ィル] -ブタン- 1-ォーノレ、 2-(4- {1-ヒドロキシ-4-[4- (ヒドロキシ-ジフエ二ノレ-メチノレ) -ピペリジン- 1-ィノレ] -プチノレ }-フエ二 ル)- 2-メチル -プロピオン酸、ジフエ二ル-ピペリジン - 4-ィル-メタノールが 挙げられる。

塩としては、特に限定されないが、医薬上許容され得る塩が好ましく、例え ば無機塩基(例えば、ナトリゥム、力リゥムなどのアルカリ金属;カルシウム、 マグネシウムなどのアルカリ土類金属;アルミニウム、アンモニゥム)、有機 塩基 (例えば、トリメチルァミン、トリェチルァミン、ピリジン、ピコリン、 エタノールァミン、ジエタノールァミン、トリエタノールァミン、ジシクロへ キシルァミン、 N, N—ジベンジルエチレンジァミン)、無機酸(例えば、塩 酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸)、有機酸(例えば、ギ酸、酢酸、トリ

フルォロ酢酸、フマル酸、シユウ酸、酒石酸、マレイン酸、クェン酸、 ^ハク 酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスノレホン酸、 p—トルエンノレホ ン酸)、塩基性アミノ酸(例えば、アルギニン、リジン、オル二チン)または 酸性アミノ酸(例えば、ァスパラギン酸、グルタミン酸)との塩などが挙げら れる。

さらに、結合能は、 C AR Pの総結合能に基づいて測定するのではなく、 C AR Pの個々のァイソフォーム(例えば、スプライシングバリアント)に対す る結合能あるいはァイソフォーム間の結合能比に基づいて測定してもよい。 また、結合能の測定は、インシリコで行うこともできる。例えば、結合能の 測定は、 S BDD (Structure-Based Drug Design: SBDD) 、 C ADD (Com puter-Aided Drug Design) 【こ基づレヽて行われ得る。このようなスクリー二 ングの例としては、バーチャルスクリーニング、 de novoデザイン、ファーマ コフォー分析、 Q d A R (Quantitative Structure Activity Relationshi p) などが挙げられる。このようなスクリーニングの際にタンパク質自体、あ るいはタンパク質の標的部位の立体構造の情報が必要とされる場合、 NMR、 X線結晶解析、放射光解析等の構造解析法により立体構造が判明しているなら ばその情報が使用され、立体構造が判明していないならば homology法、 Thre ading法等の構造予測法により得られる情報などが使用される。また、パーチ ャルスクリーニングでは、自体公知のプログラムを用いることができ、このよ うなプログラムとしては、例えば、 D o c k (Kuntz, I. D. et al. , Scien ce, 1992, 257, 1078) 、 G o 1 d (Jones, G. et al. , J. Mol. Biol. , 1 995, 245, 43) 、 F 1 e x X (Rarey, M. et al. , J. Mol. Biol. , 1996, 261, 470) 、 Au t o D o c k (Morris, G. M. et al. , J. Comput. Che m. , 1998, 19, 1639) 、 I CM (Abagyan, R. A. et al. , J. Comput. Che m., 1994, 15, 488) などが挙げられる。

方法論 I I Iの工程(c) では、 CAR Pまたはその変異タンパク質に結合 能を有する被験物質が選択される。該タンパク質に結合能を有する被験物質は、

CAR Pの機能を促進または抑制し得る。このように選択された被験物質は、 CAR P標的薬物に関連する疾患の調節に有用であり得る。

さらに別の実施形態では、スクリーニング方法 I aは、下記の工程(a) 、 (b) 及び(c) を含む:

(a) 被験物質、 CARP結合性物質を、 CARPまたはその変異タンパク質 に接触させる工程;

(b) 被験物質の存在下における CAR P結合性物質の該タンパク質に対する 結合量を測定し、該結合量を被験物質の非存在下における CAR P結合性物質 の該タンパク質に対する結合量と比較する工程;

(c) 上記(b) の比較結果に基づいて、 CAR P結合性物質の該タンパク質 に対する結合量の変化をもたらす被験物質を選択する工程。

上記(a ) 〜(c) の工程を含む方法論を、必要に応じて「方法論 I V」と 省略する。

方法論 I Vの工程(a) では、被験物質、 CAR P結合性物質のいずれもが CAR Pまたはその変異タンパク質と接触条件下におかれる。被験物質、 CA RP結合性物質の該タンパク質に対する接触は、溶液中での被験物質、 CAR P結合性物質、該タンパク質の混合により行われ得る。また、該タンパク質に 対して被験物質、 CAR P結合性物質を接触させる順番は特に限定されず、い ずれかを先に該タンパク質に接触させても、同時に接触させてもよい。

CARPおよびその変異タンパク質は自体公知の方法により調製できる。例 えば、該タンパク質の調製は、方法論 I I Iで上述した方法により行われ得る。

CARP結合性物質は、標識されていても未標識であってもよく。また、標 識体と未標識体を所定の割合で含む混合物も C A R P結合性物質として使用で きる。標識用物質は上述の通りである。

方法論 I Vの工程(b) では、先ず、被験物質の存在下、 CAR P結合性物 質の該タンパク質に対する結合量が測定される。結合量の測定は、用いた CA RP結合性物質の種類、標識の有無などを考慮し、自体公知の方法により行わ

れ得る。また、結合量の他、結合強度(例えば、 Kd値)、該タンパク質に対 する結合における被験物質の濃度依存性などがさらに測定できる。結合強度、 濃度依存性は、測定手段を適宜選択することで測定できる。

結合量の測定は、例えば、標識された CARP結合性物質を用いて行われ得 る。該タンパク質に結合した CAR P結合性物質と未結合の CAR P結合性物 質は、結合量の測定前に分離され得る。より詳細には、このような測定は、方 法論 I I I と同様に行われ得る。

また、結合能は、 CAR Pの総結合量に基づいて測定するのではなく、 CA R Pの個々のァイソフォーム(例えば、スプライシングバリアント)に対する 結合能あるいはアイソフォーム間の結合能比に基づいて測定してもよい。

次いで、被験物質の存在下における CAR P結合性物質の該タンパク質に対 する結合量が、被験物質の非存在下における CAR P結合性物質の該タンパク 質に対する結合量と比較される。結合量の比較は、好ましくは、有意差の有無 に基づいて行われる。被験物質の非存在下における CAR P結合性物質の該タ ンパク質に対する結合量は、被験物質の存在下における CAR P結合性物質の 該タンパク質に対する結合量の測定に対し、事前に測定した結合量であっても、 同時に測定した結合量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時 に測定した結合量であることが好ましい。

方法論 I Vの工程(c) では、 C AR P結合性物質の該タンパク質に対する 結合量の変化をもたらす被験物質が選択される。結合量の変化は、例えば、結 合量の低下または増加であり得るが、結合量の低下が好ましい。このように選 択された被験物質は、 CARP標的薬物に関連する作用の調節に有用であり得 る。

スクリーニング方法 I aは、(d) ( i ) 選択された被験物質が CAR P標 的薬物に関連する作用を調節、例えば促進または抑制し得ることを確認するェ 程 (確認工程)、または( i i ) 選択された被験物質が有する作用の種類を同 定する工程(同定工程)をさらに含むことができる。確認工程または同定工程 は、例えば、正常な動物に対し、あるいは「CAR P標的薬物に関連する疾 患」の動物またはモデル動物に対し、選択された被験物質を投与することで行 なわれ得る。あるいは、これらの工程は、被験物質を細胞に接触させ、接触後 の細胞の表現型の変化を評価することで行うこともできる。また、かかる同定 工程によれば、選択された被験物質が有する「CAR P標的薬物に関連する作 用」の種類を決定でき、選択された被験物質が医薬または研究用試薬のいずれ 力、あるいはその両方として使用可能であるか否かを、および該被験物質が使 用可能な医薬または研究用試薬の種類を確認できる。

スクリーニング方法 I aはまた、動物を用いて行うこともできる。この場合、 CAR P遺伝子の発現量のみならず、 CAR Pの発現量(例えば、被験物質が 投与された動物の所定の組織または細胞における CAR Pの存在量、所定の細 胞内器官局在)もまた測定され得る。該動物としては、例えば、マウス、ラッ ト、ハムスター、モルモット、ゥサギ、ィヌ、サル等の哺乳動物、ニヮトリ等 の鳥類が挙げられる。動物を用いて本発明のスクリーニング方法が行われる場 合、例えば、 CAR P遺伝子の発現量を調節する被験物質が選択され得る。 スクリーニング方法 I aは、 CAR P標的薬物に関連する作用を調節し得る 物質のスクリーニングを可能とする。従って、スクリーニング方法 I aは、 C A R P標的薬物に関連する疾患(例えば、アレルギー疾患、化学伝達物質の遊 離の調節が所望される疾患)の予防 ·治療剤、並びに該疾患の研究用試薬の開 発などに有用である。

2. 1. 2. CAR P遺伝子の発現または機能を調節し得ない被験物質を選択 することを含む、 CAR P標的薬物に関連する作用を調節し得る物質のスクリ 一ユング方法(スクリーニング方法 I b)

本発明は、被験物質が C A R P遺伝子の発現または機能を調節し得るか否か を評価し、 CAR P遺伝子の発現または機能を調節し得ない被験物質を選択す ることを含む、 CAR P標的薬物に関連する作用(なかでも、既知標的分子に 関連する作用およびまたは CAR P標的薬物が実際に示す薬理作用)を調節

し得る物質(例え'ば、 CARP標的薬物が実際に示す薬理作用を有する、; C A

RP標的薬物と同様の医薬用途に用いられ得る物質であって、 CAR P標的薬 物が実際に示す副作用を有しないまたは該副作用が低減された物質)のスクリ —ユング方法を提供する。

スクリーニング方法 I bは、上述した方法論 I〜 I Vの工程(c) において 変化をもたらさない、あるいは結合能又は調節能を有しない被験物質を選択す ること以外は、方法論 I〜 I Vと同様に行われ得る。

スクリーニング方法 I bでは、用いられる被験物質は、既知の標的分子の発 現または機能を調節し得るもの、あるいは被験物質が CAR P標的薬物に関連 する作用(なかでも、 CARP標的薬物が実際に示す薬理作用)を有するもの であり得る。従って、スクリーニング方法 I bは、被験物質が既知の標的分子 の発現または機能を調節し得るか否かを評価することを含む、既知の標的分子 に関連する作用を調節し得る物質のスクリ一二ング方法と組合せて用いること ができる。既知の標的分子に関連する作用を調節し得る物質のスクリーユング 方法は、上述したスクリーニング方法 I aと同様に行われ得る。あるいは、ス クリーニング方法 I bは、被験物質が CARP標的薬物に関連する作用(なか でも、 CARP標的薬物が実際に示す薬理作用)を調節し得るか否かを評価す ることを含む、 CAR P標的薬物に関連する作用を調節し得る物質のスクリー ユング方法と組合せて用いることができる。このようなスクリ一ユング方法は、 動物または細胞を用いて、上述したスクリーニング方法 I aの工程(d) と同 様に行われ得る。

スクリーニング方法 I bは、既知標的分子に関連する作用の調節能およびノ または CAR P標的薬物が実際に示す薬理作用を有し、且つ CAR P標的薬物 が示す副作用が低減した医薬の開発を可能とする。従って、スクリーニング方 法 I bは、既知標的分子に関連する作用の調節能を有する既存医薬の改良など に有用である。

2. 2. CARP遺伝子に関連する機能を調節し得る物質のスクリーニ^グ方 法 (スクリ一二ング方法 I I )

本発明は、被験物質が CAR Pまたはその変異タンパク質に対する CAR P 標的薬物の結合能を調節し得るか否かを評価することを含む、 .CAR P遺伝子 に関連する機能を調節し得る物質のスクリーニング方法を提供する。

本スクリーニング方法を、必要に応じて「スクリーニング方法 I I」と省略 する。

一実施形態では、スクリーニング方法 I Iは、下記の工程(a) 、(b) 及 び ( c ) を含む:

(a) 被験物質、 CAR P標的薬物を、 C AR Pまたは CAR P標的薬物に結 合能を有するその変異タンパク質に接触させる工程;

(b) 被験物質の存在下における CAR P標的薬物の該タンパク質に対する結 合量を測定し、該結合量を被験物質の非存在下における C A R P標的薬物の該 タンパク質に対する結合量と比較する工程;

(c) 上記(b) の比較結果に基づいて、 CARP標的薬物の該タンパク質に 対する結合量の変化をもたらす被験物質を選択する工程。

上記の工程(a) 〜(c) を含む方法論は、「CARP結合性物質」の代わ りに 「CARP標的薬物」を用いること以外は、方法論 I Vと同様である。 スクリーニング方法 1 Iは、例えば、 C AR P遺伝子に関連する機能を調節 し得る物質、あるいは CAR Pに対するプローブのスクリーニングなどを可能 とする。従って、スクリーニング方法 I Iは、 CAR P遺伝子に関連する疾患 の予防 ·治療剤、並びに該疾患の研究用試薬のスクリ一二ングなどに有用であ る。

2. 3. スクリーニング方法により得られる成果物

本発明は、上記スクリーニング方法、例えばスクリーニング方法 I、 I Iに より得られる成果物を提供する。

本発明のスクリ一二ング方法により提供される成果物は、本発明のスクリ一 ユング方法により得られる物質、および該スクリ一ユング方法により得られる 物質を含有してなる、薬理作用の調節剤であり得る。

本発明のスクリーニング方法により提供される成果物は、例えば、 CAR P 標的薬物に関連する疾患、あるいは CAR P遺伝子に関連する疾患の予防,治 療に、あるいは該疾患の研究用試薬などとして有用である。

3. 調節剤

本発明は、 C AR P遺伝子の発現または機能を調節する物質を含有してなる、 薬理作用の調節剤を提供する。本発明の調節剤は、調節される薬理作用の観点 から、 CAR P標的薬物に関連する作用(例えば、アレルギー症状、化学伝達 物質の遊離)の調節剤、および CAR P遺伝子に関連する機能の調節剤に大別 できる。以下、それぞれの調節剤を詳述する。

3. 1. CAR P標的薬物に関連する作用の調節剤(調節剤 I )

本発明は、 CAR P遺伝子の発現又は機能を調節する物質を含有してなる、 CAR P標的薬物に関連する作用の調節剤を提供する。

本調節剤を、必要に応じて「調節剤 I」と省略する。

C AR P遺伝子の発現又は機能を調節する物質は、例えば、 CAR P遺伝子 の発現を抑制する物質であり得る。発現とは、 CAR P遺伝子翻訳産物が産生 され且つ機能的な状態でその作用部位に局在することをいう。従って、発現を 抑制する物質は、遺伝子の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾、局在化及び タンパク質フォールディング等の、いかなる段階で作用するものであってもよ レ、。

詳細には、 CAR P遺伝子の発現を抑制する物質としては、転写抑制因子、 RNAポリメラーゼ阻害剤、 RNA分解酵素、タンパク質合成阻害剤、核内移 行阻害剤、タンパク質分解酵素、タンパク質変性剤等が例示されるが、細胞内 で発現する他の遺伝子 ·タンパク質に及ぼす悪影響を最小限にするためには、 標的分子に特異的に作用し得る物質であることが重要である。

CAR P遺伝子の発現を抑制する物質の例は、 C AR P遺伝子の転写産物、 詳細には mRNAもしくは初期転写産物に対するアンチセンス核酸である。

「アンチセンス核酸」とは、標的 mRNA (初期転写産物)を発現する細胞の 生理的条件下で該標的 mRNA (初期転写産物)とハイプリダイズし得る塩基 配列からなり、且つハイブリダィズした状態で該標的 mRNA (初期転写産 物)にコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得る核酸をいう。アンチセン ス核酸の種類は DN Aであっても RN Aであってもよいし、あるいは DNAZ RNAキメラであってもよい。また、天然型のアンチセンス核酸は、細胞中に 存在する核酸分解酵素によってそのリン酸ジエステル結合が容易に分解される ので、本発明のアンチセンス核酸は、分解酵素に安定なチォリン酸型(リン酸 結合の P = Oを P = Sに置換)や 2 ' -0-メチル型等の修飾ヌクレオチドを 用いて合成もできる。アンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶 性及び細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリボソームやマ イクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服できる。

アンチセンス核酸の長さは、 C AR P遺伝子の転写産物と特異的にハイプリ ダイズし得る限り特に制限はなく、短いもので約 1 5塩基程度、長いもので m RNA (初期転写産物)の全配列に相補的な配列を含むような配列であっても よい。合成の容易さや抗原性の問題等から、例えば約 1 5塩基以上、好ましく は約 1 5〜約 3 0塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。

アンチセンス核酸の標的配列は、アンチセンス核酸がハイブリダィズするこ とにより、 CAR P遺伝.子もしくはその機能的断片の翻訳が阻害される配列で あれば特に制限はなく、 m R N Aの全配列であっても部分配列であってもよい し、あるいは初期転写産物のイントロン部分であってもよいが、アンチセンス 核酸としてオリゴヌクレオチドを使用する場合は、標的配列は CAR P遺伝子 の mRNAの 5 ' 末端からコード領域の C末端までに位置することが望ましい。 さらに、アンチセンス核酸は、 CAR P遺伝子の転写産物とハイブリダィズ して翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖 DN A形態の CAR P遺伝子と結合し て三重鎖(トリプレックス)を形成し、 mRNAへの転写を阻害し得るもので あってもよレヽ。 ,

C AR P遺伝子の発現を抑制する物質の別の例は、 C AR P遺伝子転写産物、 詳細には mRNAもしくは初期転写産物を、コード領域の内部(初期転写産物 の場合はイントロン部分を含む)で特異的に切断し得るリボザィムである。

「リボザィム」とは核酸を切断する酵素活性を有する RN Aをいうが、最近で は当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴ DN Aも同様に核酸切断活性を 有することが明らかになっているので、本発明では配列特異的な核酸切断活性

5

を有する限り DN Aをも包含する概念と - 1して用いるものとする。リボザィムと して最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウィルソイド等の感染性 R NAに見られるセルフスプライシング RN Aがあり、ハンマーへッド型ゃヘア ピン型等が知られている。また、リボザィムを、それをコードする DNAを含 む発現ベクターの形態で使用する場合には、細胞質への移行を促進するために、 t RNAを改変した配列をさらに連結したハイプリッドリボザィムとすること もできる [Nucleic Acids Res. , 29(13) : 2780-2788 (2001)] 。

CAR P遺伝子の発現を抑制する物質のさらに別の例は、デコイ核酸である。 デコイ核酸とは、転写調節因子が結合する領域を模倣する核酸分子をいい、 C A R P遺伝子の発現を抑制する物質としてのデコイ核酸は、 C AR P遺伝子に 対する転写活性化因子が結合する領域を模倣する核酸分子であり得る。 .

デコイ核酸としては、例えば、リン酸ジエステル結合部分の酸素原子を硫黄 原子で置換したチォリン酸ジエステル結合を有するオリゴヌクレオチド(S— オリゴ)、又はリン酸ジエステル結合を電荷を持たないメチルホスフェート基 で置換したオリゴヌクレオチドなど、生体內でオリゴヌクレオチドが分解を受 けにくくするために改変したオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。デコイ核 酸は転写活性化因子が結合する領域と完全に一致していてもよいが、 CAR P 遺伝子に対する転写活性化因子が結合し得る程度の同一性を保持していればよ い。デコイ核酸の長さは転写活性化因子が結合する限り特に制限されなレれ。ま た、デコイ核酸は、同一領域を反復して含んでいてもよい。 .

C AR P遺伝子の発現を抑制する物質のさらに別の例は、 CAR P遺伝子転 写産物、詳細には mRNAもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列 (初期転写産物の場合はイントロン部分を含む)に相補的な二本鎖オリゴ RN A、いわゆる s i RNAである。短い二本鎖 RNAを細胞内に導入するとその RNAに相補的な mRNAが分解される、いわゆる RNA干渉(RNA i ) と 呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、最近、この 現象が動物細胞でも起こることが確認されたことから [Nature, 411 (6836): 494-498 (2001)] 、リボザィムの代替技術として注目されている。 s i RN Aとしては、後述の通り自ら合成したものを使用できるが、市販のものを用い てもよい。

アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザィムは、 CAR P遺伝子の c D NA配列もしくはゲノミック DNA配列に基づいて CAR P遺伝子転写産物、 詳細には mRNAもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販の DNA, RNA自動合成機 (アプライド 'バイオシステムズ社、ベックマン社等)を用 いて、これに相補的な配列を合成することにより調製できる。デコイ核酸、 s i RNAは、センス鎖及びアンチセンス鎖を DNA/RNA自動合成機でそれ ぞれ合成し、適当なァニーリング緩衝液中、約 9 0〜約 9 5 °Cで約 1分程度変 性させた後、約 3 0〜約 7 0°Cで約 1〜約 8時間アニーリングさせることによ り調製できる。また、相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップ するように合成して、これらをァニーリングさせた後リガーゼでライグーショ ンすることにより、より長い二本鎖ポリヌクレオチドを調製できる。

CAR P遺伝子の発現を抑制する物質の別の例は、 CAR Pに対する抗体で ある。該抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであって もよく、周知の免疫学的手法により作製できる。また、該抗体は、抗体のフラ グメント(例えば、 Fab、 F(ab' )2) 、組換え抗体(例えば、単鎖抗体)であ つてもよい。さらに、該抗体をコードする核酸(プロモータ一活性を有する核 酸に機能可能に連結されたもの)もまた、 C A R P遺伝子の発現を抑制する物 質として好ましい。

例えば、ポリクローナル抗体は、 C A R Pあるいはそのフラグメント(必要 に応じて、ゥシ血清アルブミン、 K L H (Keyho l e Limpet Hemocyanin) 等 のキャリアタンパク質に架橋した複合体とすることもできる)を抗原として、 市販のアジュバント(例えば、完全または不完全フロイントアジュバント)と ともに、動物の皮下あるいは腹腔内に 2〜 3週間おきに 2〜4回程度投与し (部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を 確認しておく)、最終免疫から約 3〜約 1 0日後に全血を採取して抗血清を精 製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、 ゥサギ、ャギ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。

また、モノクローナル抗体は、細胞融合法(例えば、渡邊武、細胞融合法の 原理とモノクローナル抗体の作成、谷内昭、高橋利忠編、「モノクローナル抗 体とがん一基礎と臨床一」、第 2- 14頁、サイエンスフォーラム出版、 1985 年) により作成することができる。例えば、マウスに該因子を市販のアジュバ ントと共に 2〜4回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の約 3 日後に脾臓 あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞(例 えば、 NS- 1, P3X63Ag8など)を細胞融合して該因子に対するモノクローナル 抗体を産生するハイプリドーマを得る。細胞融合は P E G法 [J. Immuno l . M ethods, 81 (2): 223-228 ( 1985) ] でも電圧パルス法 [Hybri doma, 7 (6): 62 7-633 ( 1988) ] であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイ プリドーマは、周知の E I Aまたは R I A法等を用いて抗原と特異的に結合す る抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗 体を産生するハイプリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラ ット、このましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれ ぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得できる。

しかしながら、ヒトにおける治療効果と安全性を考慮すると、本発明抗体 は、キメラ抗体、ヒト化又はヒト型抗体であってもよい。キメラ抗体は、,例え ば 「実験医学(臨時増刊号), Vol.6, No.10, 1988」、特公平 3- 73280号公 報等を、ヒト化抗体は、例えば特表平 4- 506458号公報、特開昭 62- 296890号 公報等を、ヒト抗体は、例えば「Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 19 97」、「 Nature Genetics, Vol.7, p.13- 21, 1994J 、特表平 4- 504365号 公報、国際出願公開 W094/25585号公報、「経サイエンス、 6月号、第 4 0 〜第 50頁、 1 9 9 5年」、「Nature, Vol.368, p.856-859, 1994」、特表 平 6-500233号公報等を参考にそれぞれ作製することができる。

CAR P遺伝子の発現又は機能を調節する物質はまた、 CAR P遺伝子の機 能を抑制する物質であり得る。

CAR P遺伝子の機能を抑制する物質としては、 C AR P遺伝子の作用を妨 げ得る物質である限り特に限定されないが、他の遺伝子 · タンパク質に及ぼす 悪影響を最小限にするためには、標的分子に特異的に作用し得る物質であるこ とが重要である。 CAR P遺伝子の機能を特異的に抑制する物質としては、 C AR Pのドミナントネガティブ変異体、該変異体をコードする核酸(プロモー ター活性を有する核酸に機能可能に連結されたもの)が例示される。

CAR Pのドミナントネガティブ変異体とは、 CAR Pに対する変異の導入 によりその活性が低減したものをいう。該ドミナントネガティブ変異体は、天 然の CAR Pと競合することで間接的にその活性を阻害することができる。該 ドミナントネガティブ変異体は、 CAR P遺伝子をコードする核酸に変異を導 入することによって作製することができる。変異としては、例えば、機能性部 位 (例えば、 CARD様の部位、 NRボックス様の部位、 E Fハンド様の部 位)における、当該部位が担う機能の低下をもたらすようなアミノ酸の変異 (例えば、 1以上のアミノ酸の欠失、置換、付加)が挙げられる。該変異は、 P CRや公知のキットを用いる自体公知の方法により導入できる。

C A R P遺伝子の発現を抑制する物質が、核酸分子である場合、本発明の調 節剤は、該核酸分子をコードする発現ベクターを有効成分とすることもできる。 当該発現ベクターは、上記の核酸分子をコードするオリゴヌクレオチドもしく はポリヌクレオチドが、投与対象である哺乳動物の細胞内でプロモーター活性 を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されていなければならない。使用さ れるプロモーターは、投与対象である哺乳動物で機能し得るものであれば特に 制限はないが、例えば、 S V 4 0由来初期プロモーター、サイトメガロウィル ス L T R、ラウス肉腫ウィルス L T R、 1^ 0 ]^1 ^1し由来し丁1¾、アデノウィ ルス由来初期プロモーター等のウィルスプロモータ—、並びに ]3—ァクチン遺 伝子プロモーター、 P G K遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロ モーター等の哺乳動物の構成タンパク質遺伝子プロモーターなどが挙げられる。 発現ベクターは、好ましくは核酸分子をコードするオリゴ(ポリ)ヌクレオ チドの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネータ一領域を含有する。さ らに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子(テトラサイクリン、ァ ンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤 に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等)をさ らに含有することもできる。

発現ベクターとして使用される基本骨格のベクターは特に制限されないが、 ヒト等の哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、レトロウイルス、アデ ノウイノレス、アデノ随伴ウイノレス、へノレぺスゥイノレス、ワクシニアゥイノレス、 ボックスゥイノレス、ポリオウイノレス、シンドビスゥイノレス、センダイウイノレス 等のウィルスベクターが挙げられる。アデノウイルスは、遺伝子導入効率が極 めて高く、非分裂細胞にも導入可能である等の利点を有する。伹し、導入遺伝 子の宿主染色体への組込みは極めて稀であるので、遺伝子発現は一過性で通常 約 4週間程度しか持続しない。治療効果の持続性を考慮すれば、比較的遺伝子 導入効率が高く、非分裂細胞にも導入可能で、且つ逆位末端繰り返し配列( I

T R ) を介して染色体に組み込まれ得るアデノ随伴ウィルスの使用もまた好ま しい。

C A R Pの発現又は機能を調節する物質はまた、 C A R P標的薬物、例えば ァステミゾールもしくはテルフエナジンまたはそれらの代謝体、あるいは α , α—ジフエ二ノレ一 4—ピペリジノメタノール、ヒドロキシジン、デスメチルァ ステミゾーノレ、 2—アミノー 1一べンジノレベンズイミダゾーノレ、力ノレベンダジ ム、ォキシベンダゾール、アルベンダゾ一ル、アルベンダゾールスルホキシド、 アルベンダゾールスルホン、 2—アミノー 5— Ν—プロピルスルホニノレベンズ イミダゾーノレ、メベンダゾーノレ、ノコダゾーノレ、ォキシフェンダゾーノレ、フエ ンベンダゾーノレスノレホン、 2—ァミノべンズイミダゾーノレ、チアベンダゾーノレ、 ベンズイミダゾール、ラサ口シド、あるいは C A R Ρに結合能を有するそれら の誘導体(後述)、あるいはそれらの塩であり得る。

調節剤 Iは、 C A R P遺伝子の発現又は機能を調節する物質に加え、任意の 担体、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。

医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、 ソノレビット、乳糖、グノレコース、セノレロース、タノレク、リン酸カルシウム、炭 酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピ ルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリェチ レンダリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチル セノレロース、ヒドロキシプロピノレスターチ、ナトリウムーグリコーノレ一スター チ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クェン酸カルシウム等の崩壊剤、 ステアリン酸マグネシウム、エア口ジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等 の滑剤、クェン酸、メントール、グリシルリシン ' アンモニゥム塩、グリシン、 オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチル パラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クェン酸、クェン酸ナトリウム、酢 酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビュルピロリドン、ステアリン酸アル ミニゥム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュ

ース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースヮッ クスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。 .

経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈 液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や頼立として含んで いるカプセル剤、サッシュ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸 濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散さ せ乳化させた乳剤等である。

非経口的な投与(例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与な ど)に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、 これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、 水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、 増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルや バイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することが できる。また、有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直 前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することも できる。

調節剤 Iの投与量は、有効成分の活性や種類、病気の重篤度、投与対象とな る動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えな いが、通常、成人 1 日あたり有効成分量として約 0. 00 1〜約 500mgZ k gである。

調節剤 Iは、 CARP標的薬物に関連する作用の調節、例えば抑制又は促進 を可能とする。従って、調節剤 Iは、 CARP標的薬物に関連する疾患(例え ば、アレルギー疾患、化学伝達物質の遊離が所望される疾患)の予防,治療に、 並びに該疾患の研究用試薬などに有用である。

3. 2. CARP遺伝子に関連する機能の調節剤(調節剤 I I )

本発明は、 CAR P標的薬物を含有してなる CAR P遺伝子に関連する機能 の調節剤を提供する。

本調節剤を、必要に応じて「調節剤 I I」と省略する。

CAR P標的薬物は、上述の通りであり得るが、例えばァステミゾールもし くはテルフエナジンまたはそれらの代謝体、あるいは α , α—ジフエ二ルー 4 —ピペリジノメタノール、ヒドロキシジン、デスメチルァステミゾール、 2— ァミノ一 1一べンジノレベンズィミダゾール、力ノレベンダジム、ォキシベンダゾ —ル、アルベンダゾール、アルベンダゾールスルホキシド、アルベンダゾーノレ スノレホン、 2—アミノー 5—Ν—プロピノレスノレホニルベンズイミダゾーノレ、メ ベンダゾーノレ、ノコダゾーノレ、ォキシフェンダゾーノレ、フェンベンダゾーノレス ルホン、 2—アミノベンズィミダゾール、チアベンダゾーノレ、ベンズィミダゾ —ル、ラサ口シド、あるいは CAR Ρに結合能を有するそれらの誘導体(後 述)、あるいはそれらの塩であり得る。

調節剤 I Iは、 CAR P標的薬物に加え、任意の担体、例えば、医薬上許容 され得る担体を含むことができる。調節剤 I Iの投与量は、調節剤 I と同様で ある。

調節剤 I Iは、 CAR P遺伝子に関連する機能の調節、例えば抑制又は促進 を可能とする。従って、調節剤 I Iは、 C AR P遺伝子に関連する疾患の予 防 ·治療に、並びに該疾患の研究用試薬などに有用である。

4. 誘導体の製造方法、および該方法により得られる成果物

本発明は、 CAR P遺伝子の発現または機能を調節し得るように薬物を誘導 体化することを含む、薬物誘導体の製造方法、及びその成果物を提供する。本 発明の製造方法は、得られる誘導体の作用または機能の種類の観点から、 CA R P標的薬物に関連する作用(例えば、アレルギー症状、化学伝達物質の遊 離)を調節し得る薬物誘導体、および CAR P遺伝子に関連する機能を調節し 得る薬物誘導体の製造方法に大別できる。以下、それぞれの製造方法を詳述す る。

4. 1. CAR P標的薬物に関連する作用を調節し得る薬物誘導体の製造方法 造方 i去 I )_

本発明は、 CARP遺伝子の発現または機能を調節し得るように薬物を誘導 体化することを含む、 CARP標的薬物に関連する作用を調節し得る薬物誘導 体の製造方法を提供する。

本製造方法を、必要に応じて「製造方法 I」と省略する。

誘導体化とは、リード化合物中の特定の原子または基を、他の原子または基 で置換することにより得られる化合物、あるいはリード化合物に対する付加反 応により得られる化合物を仮想的に、または実際に合成することを意味する。 例えば、リード化合物は、 CAR P標的薬物であり得る。 CARP標的薬物は 上述の通りであり得るが、例えばァステミゾールもしくはテルフエナジンまた はそれらの代謝体、あるいは α, α—ジフエニル _ 4—ピペリジノメタノール、 ヒドロキシジン、デスメチノレアステミゾー Λ 2—ァミノ _ 1 _ベンジノレベン ズイミダゾーノレ、カルベンダジム、ォキシベンダゾーノレ、ァノレベンダゾーノレ、 アルベンダゾールスルホキシド、アルベンダゾールスルホン、 2—ァミノ _ 5 — Ν—プロピルスルホニルべンズィミダゾール、メベンダゾール、ノコダゾ一 ノレ、ォキシフェンダゾール、フェンベンダゾ一/レスノレホン、 2—ァミノべンズ イミダゾーノレ、チアベンダゾー^^、ベンズイミダゾーノレ、ラサ口シド、あるい は CAR Ρに結合能を有するそれらの誘導体(後述)、あるいはそれらの塩で あり得る。

C AR P標的薬物の誘導体化は、 C AR P遺伝子の発現または機能の調節能 を保持するように、必要に応じて、得られる誘導体の水溶性 Z脂溶性、安定性、 体内動態、バイオアベイラビリティ一、毒性等のその他の性質についても考慮 するように行われ得る。 CAR P標的薬物の誘導体化は、例えば、 CARP遺 伝子の発現または機能の調節能を向上し得るように誘導体化され得る。 CAR P標的薬物の誘導体化はまた、 CARP遺伝子に関連する機能を調節し得るよ うに誘導体化され得る。

CAR P遺伝子の発現または機能の調節能を保持するような CAR P標的薬 物の誘導体化は、例えば、 SBDD (Structure-Based Drug Design) 、 C

ADD (Computer-Aided Drug Design) に基づいて行われ得る。このよ Jうな ' 設計の例としては、バーチャルスクリーニング、 de novoデザイン、ファーマ コフォー分析、 Q SAR (Quantitative Structure Activity Relationshi p) などが挙げられる。このような設計の際にタンパク質自体、. あるいはタン パク質の標的部位の立体構造の情報が必要とされる場合、 NMR、 X線結晶解 析、放射光解析等の構造解析法により立体構造が判明しているならばその情報 が使用され、立体構造が判明していないならば homology法、 Threading法等 の構造予測法により得られる情報などが使用される。また、バーチャルスクリ 一ユングでは、自体公知のプログラムを用いることができ、このようなプログ ラムとしては、例えば、 DOCK (Kuntz, I. D. et al., Science, 1992, 257, 1078) 、 G o 1 d (Jones, G. et al., J. Mol. Biol., 1995, 245, 43) 、 F 1 e x X (Rarey, . et al., J. Mol. Biol., 1996, 261, 470) 、 Au t o D o c k (Morris, G. M. et al. , J. Comput. Chem. , 1998, 19, 1639) 、 I CM (Abagyan, R. A. et al. , J. Comput. Chem. , 1994, 15, 488) などが挙げられる。

CAR P遺伝子の発現または機能の調節能を保持するような CAR P標的薬 物の誘導体化はまた、例えば、生物学的検証に基づいて行われ得る。この場合、 例えば、上述の方法論 I〜 I Vが用いられ得る。さらに、上述した S BDD、 C ADD等の方法と生物学的検証とを併用してもよい。

誘導体の製造のため置換される CAR P標的薬物中の特定の原子は、リード 化合物中に存在する原子である限り限定されず、例えば、水素原子、ハロゲン 原子 (例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子)、酸素原子、 硫黄原子、窒素原子、炭素原子などが挙げられる。

誘導体の製造のため置換される CAR P標的薬物中の特定の基は、 CAR P 標的薬物中に存在する基である限り限定されず、例えば分子量 1〜5 00、好 ましくは分子量 1〜3 00、より好ましくは分子量 1〜2 0 0、最も好ましく は分子量 1〜1 0 0の基であり得る。該特定の基としては、例えば、置換され

ていてもよい C ~C8炭化水素基、置換されていてもよい C 〜C8ァル 基、置換されていてもよい芳香族または非芳香族の C3〜C 14炭化水素環基、 あるいは置換されていてもよい芳香族または非芳香族の C3〜C14複素環基、 アミノ基、炭素数 1〜 4のアルキル基あるいは炭素数 2〜 8のァシル基でモノ あるいはジ置換されたァミノ基、アミジノ基、力ルバモイル基、炭素数 1〜4 のアルキル基でモノあるいはジ置換された力ルバモイル基、スノレファモイル基、 炭素数 1〜4のアルキル基でモノあるいはジ置換されたスルファモイル基、力 ルボキシル基、炭素数 2〜8のアルコキシカルボニル基、ヒドロキシ基、 1〜 3個のハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数 1〜6のアルコキシ基、 1 〜3個のハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数 2〜 5のァルケ二ルォキ シ基、炭素数 3〜 7のシクロアルキルォキシ基、炭素数 7 ~ 9のァラルキルォ キシ基、炭素数 6〜 1 4のァリールォキシ基、チオール基、 1〜 3個のハロゲ ン原子で置換されていてもよい炭素数 1〜 6のアルキルチオ基、炭素数 7〜9 のァラルキルチオ基、炭素数 6〜 1 4のァリールチオ基、スルホ基、シァノ基、 アジド基、ニトロ基、ニトロソ基などが挙げられる。

置換されていてもよい C 〜c8炭化水素基は、例えば、置換されていても よい 〜C8アルキル基、置換されていてもよい C2 〜C8アルケニル基、 置換されていてもよい C 2 〜C8アルキニル基であり得る。

置換されていてもよい Ci〜C8アルキル基の〜C8アルキル基としては、 直鎖または分岐鎖のいずれでもよく、好ましくは炭素数 1〜6であり、例えば、 メチル、ェチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、 s e c—ブ チル、 t e r t—ブチル等が挙げられる。

置換されていてもよい C2 〜C8アルケニル基の C2 〜C8アルケニル基と しては、直鎖または分岐鎖のいずれでもよく、好ましくは炭素数 2〜 6であり、 例えば、ェテュル、 1—プロぺニル、 2—プロぺニル、 2—メチル一 1—プロ ぺニル、 1—ブテニル、 2—プテュル、 3—ブテュル等が挙げられる。

置換されていてもよい C2 〜C8アルキニル基の C2 〜C8アルキニル基と しては、直鎖または分岐鎖のいずれでもよく、好ましくは炭素数 2〜 6であり、 例えば、ェチュル、 1 _プロビュル、 2 _プロビュル、 1—ブチュル、 2—ブ チュル、 3 _プチニル等が挙げられる。

置換されていてもよい C 〜C8ァシル基の〜C8ァシル基としては、 直鎖または分岐鎖のいずれでもよく、好ましくは炭素数 2〜6であり、例えば、 ホルミノレ、ァセチル、プロピノィノレ、ブタノィノレ、 2—メチノレプロピノイノレ等 が挙げられる。

置換されていてもよい芳香族 C3〜C 14炭化水素環基の芳香族 C3〜C14炭 化水素環基としては、単環式、二環式または三環式のいずれでもよく、好まし くは炭素数 3〜 1 2であり、例えば、フエニル、ナフチルが挙げられる。

置換されていてもよい非芳香族 C3〜C14炭化水素環基の非芳香族 C3〜C 14炭化水素環基としては、飽和または不飽和の単環式、二環式または三環式 のいずれでもよく、好ましくは炭素数 3〜 1 2であり、例えば、シクロアルキ ル基 (例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロへキ シル、シクロへプチル、シクロォクチル)、シクロアルケニル基(例えば、 2 —シクロペンテン一 1—ィノレ、 3—シクロペンテン _ 1—ィノレ、 2—シクロへ キセン一 1—ィノレ、 3—シクロへキセン一 1—ィノレ)、シクロアノレカジエ二ノレ 基 (例えば、 2, 4—シクロペンタジェン _ 1—ィル、 2, 4—シクロへキサ ジェン一 1一ィル、 2, 5—シクロへキサジェン一 1 _ィル)等が挙げられる。 置換されていてもよい芳香族 C3〜C 14複素環基の芳香族 C3〜C14複素環 基としては、環構成原子として炭素原子以外に酸素原子、硫黄原子および窒素 原子から選ばれるヘテロ原子を 1〜 5個含有する単環式、二環式または三環式 の芳香族複素環基であり、好ましくは炭素数 3〜 1 2である。単環式芳香族 C 3〜C 14複素環基の例としては、フリル、チェニル、ピロリル、ォキサゾリル、 イソォキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、イミダゾリル、ビラゾリノレ、 ォキサジァゾリル、フラザニル、チアジアゾリル、トリァゾリル、テトラゾリ

ノレ、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジュル、トリアジニルなど が挙げられる。また、 2環式または 3環式の芳香族複素環基の例としては、ベ ンゾフラニノレ、イソベンゾフラ二ノレ、ベンゾ [b] チェ二ノレ、インドリノレ、ィ ソインドリル、 1 H—インダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾォキサゾリ ノレ、ベンゾチアゾリル、 1 H—ベンゾトリアゾリル、キノリル、イソキノリル シンノリル、キナゾリル、キノキサリニル、フタラジュル、ナフチリジニル、 プリニル、プテリジニル、カルバゾリル、 α—カルボ二リル、 ]3—カルボユリ ノレ、 γ—力/レポ二リル、アタリジニノレ、フエノキサジニノレ、フエノチアジ二ノレ フエナジ二ノレ、フエノキサチイ二ノレ、チアントレ二 ^、インドリジニノレ、ピロ 口 [ 1, 2 _ b] ピリダジニル、ピラゾ口 [ 1 , 5— a] ピリジル、イミダゾ [ 1 , 2— a ] ピリジル、イミダゾ [ 1, 5— a ] ピリジル、ィミダゾ [ 1 , 2— b ] ピリダジニル、イミダゾ [ 1, 2 _ a ] ピリミジニル、 1 , 2, 4— トリァゾロ [ 4 , 3 - a ] ピリジル、 1 , 2, 4—トリァゾロ [4, 3— b] ピリダジニルなどが挙げられる。

置換されていてもよい非芳香族 C3〜C14複素環基の非芳香族 C3〜C 14複 素環基としては、環構成原子として炭素原子以外に酸素原子、硫黄原子および 窒素原子から選ばれるヘテロ原子を 1〜 5個含有する単環式、二環式または三 環式の飽和又は不飽和の複素環基であり、好ましくは炭素数 3〜 1 2であり、 例えば、ォキシラニル、ァゼチジュル、ォキセタニル、チェタニル、ピロリジ ニル、テトラヒドロフリノレ、テトラヒドロビラ二ノレ、モルホリニル、チオモル ホリニノレ、ピペラジニノレ、ピロリジニノレ、ピペリジノ、モノレホリノ、チォモノレ ホリノなどが挙げられる。

置換されていてもよい任意の基における置換基の種類は、誘導体の製造のた め置換される CAR P標的薬中の特定の基(上述)と同様であり得る。

誘導体の製造のため置換される CAR P標的薬物中の特定の原子または基の 数は、製造される誘導体が、 CAR P遺伝子の発現または機能の調節能を有し 得る限り、例えば CAR Pに結合能を有する限り特に限定されないが、例えば

1〜1 0個、好ましくは 1〜5個、より好ましくは 1〜3個、さらにより好ま しくは 1〜2個、最も好ましくは 1個であり得る。 , 置換に使用される特定の原子または基(即ち、置換部位に導入される原子ま たは基)の種類は、誘導体の製造のため置換される CARP標的薬物中の特定 の原子または基と同様であり得る。

誘導体の製造のため CARP標的薬物に付加される原子または基(即ち、付 加反応に使用される原子または基)は、誘導体の製造のため置換される CAR P標的薬物中の特定の原子または基(上述)のうち、付加反応が可能なもの、 例えば、水素原子、ハロゲン原子等の原子、求核試薬または求電子試薬として 作用し得る基である。

誘導体の製造のため CAR P標的薬物に付加される原子または基の数は、製 造される誘導体が、 CAR P遺伝子の発現または機能の調節^を有し得る限り、 例えば CAR Pに結合能を有する限り特に限定されないが、例えば 6個未満、 好ましくは 4個未満、より好ましくは 2個未満であり得る。

製造方法 Iは、例えば、 CAR P標的薬物に関連する疾患(例えば、アレル ギー疾患、化学伝達物質の遊離の調節が所望される疾患)の予防 ·治療剤、あ るいは該疾患の研究用試薬の開発などに有用である。

4. 2. CARP遺伝子に関連する機能を調節し得る薬物誘導体の製造方法 (製造方法 I I )

本発明は、 CARPまたはその変異タンパク質に対する結合能を調節し得る ように薬物を誘導体化することを含む、 CAR P遺伝子に関連する機能を調節 し得る薬物誘導体の製造方法を提供する。

本製造方法を、必要に応じて「製造方法 I I」と省略する。

薬物の誘導体化は、 CARPまたはその変異タンパク質に対する結合能を保 持するように、必要に応じて、得られる誘導体の水溶性 Z脂溶性、安定性、体 内動態、バイオアベイラビリティ一、毒性等のその他の性質についても考慮す るように行われ得る。薬物の誘導体化は、例えば、該結合能を向上し得るよう に行われ得る。

該結合能を保持するような薬物の誘導体化は、例えば、 S BDD、 CADD に基づいて行われ得る。

該結合能を保持するような薬物の誘導体化はまた、例えば、生物学的検証に 基づいて行われ得る。この場合、例えば、上述の方法論 I Vと同様に行われ得 る。さらに、上述した S BDD、 CADD等の方法と生物学的検証とを併用し てもよい。

誘導体の製造のため置換されるリード化合物中の特定の原子および基、並び にそれらの数は、上述と同様であり得る。置換に使用される特定の原子または 基 (即ち、置換部位に導入される原子または基)、誘導体の製造のため薬物に 付加される原子または基(即ち、付加反応に使用される原子または基)、それ らの数についても、上述と同様である。

製造方法 I Iは、 C AR P遺伝子に関連する疾患の予防■治療剤、あるいは 該疾患の研究用試薬の開発などに有用である。

4. 3. 誘導体の製造方法により得られる成果物

本発明は、上記製造方法 I、 I Iにより得られる成果物を提供する。

上記製造方法により提供される成果物は、本発明の製造方法により得られる

CARP標的薬物の誘導体、および該誘導体を含有してなる、薬理作用の調節 剤 (上述)であり得る。

上記製造方法により提供される成果物は、例えば、 CAR P標的薬物に関連 する疾患、あるいは CAR P遺伝子に関連する疾患の予防 ·治療に、あるいは 該疾患の研究用試薬などとして有用である。

5. 複合体、及びその製造方法

本発明は、薬物と CARPまたはその変異体とを含む複合体を提供する。 薬物は上述した CARP標的薬物であり得るが、例えばァステミゾールもし くはテルフエナジンまたはそれらの代謝体、あるいは α,ひージフエ二ル一 4 —ピペリジノメタノール、ヒドロキシジン、デスメチルァステミゾール 2— ァミノ一 1—ベンジノレベンズィミダゾーノレ、力ノレベンダジム、ォキシベダゾ ール、アルベンダゾール、アルベンダゾーノレスルホキシド、アルベンダゾール スノレホン、 2—ァミノ一 5—N—プロピノレスノレホニノレベンズイミダゾール、メ ベンダゾーノレ、ノコダゾ一ノレ、ォキシフェンダゾーノレ、フェンベンダゾーノレス ノレホン、 2—ァミノべンズイミダゾーノレ、チアベンダゾーノレ、ベンズイミダゾ ール、ラサ口シド、あるいは C A R Pに結合能を有するそれらの誘導体(後 述)、あるいはそれらの塩が挙げられる。

本発明はまた、薬物と C A R Pまたはその変異体とを接触させることを含む、 薬物と C A R Pまたはその変異体とを含む複合体の製造方法を提供する。該接 触は、例えば、溶液中での薬物、タンパク質の混合により行われ得る。

本発明の複合体、及び当該複合体の製造方法は、例えば、本発明のスクリー ニング方法、本発明の誘導体の製造方法を行う際に、あるいは、複合体の構造 解析を行い、薬物とタンパク質との相互作用の様式を精査する場合などに有用 であり得る。

6 . キット

本発明は、薬物またはその塩を含むキットを提供する。

一実施形態では、本発明のキットは、以下( i ) 、 ( i i ) を含む:

( i ) 薬物またはその塩;

( i i ) C A R Pまたはその変異タンパク質、該タンパク質をコードする核酸、 該核酸を含む発現ベクター、 C A R P遺伝子の発現を測定可能な細胞、あるい は C A R P遺伝子の転写調節領域及び該領域に機能可能に連結されたレポータ 一遺伝子を含む発現ベクター。

本発明のキットがタンパク貧を含む場合、タンパク質は薬物と複合体を形成 していない状態にある。

発現ベクター、 C A R P遺伝子の ¾現を測定可能な細胞、 C A R P遺伝子の 転写調節領域及ぴ該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子は、上述と

同様である(例えば、「2. スクリーニング方法、及び該方法により得られる 成果物」を参照)。

本発明の上記キットは、例えば、本発明のスクリーニング方法、本発明の誘 導体の製造方法、並びに本発明の複合体の製造方法を行う際な.どに有用であり 得る。

7. 疾患の発症または発症リスクの判定方法および判定用キット

本発明は、所定の疾患の発症または発症リスクの判定方法 '判定用キットを 提供する。本発明の判定方法 ·判定用キットは、測定される対象の観点から、 発現量および多型の測定に基づく判定方法 ·判定用キットに大別でき、さらに、 発症または発症リスクの判定が所望される疾患の観点から、 CAR P標的薬物 に関連する疾患(例えば、アレルギー疾患、化学伝達物質の遊離の調節が所望 される疾患)、ならびに CAR P遺伝子に関連する疾患の発症または発症リス クの判定方法 ·判定用キットに分類できる。以下、それぞれの判定方法 ·判定 用キットを詳述する。

7. 1. C AR P遺伝子の発現量の測定に基づく、疾患の発症または発症リス クの判定方法および判定用キット

7. 1. 1. CAR P遺伝子の発現量の測定に基づく、 CAR P標的薬物に関 連する疾患の発症または発症リスクの判定方法(判定方法 I )

本発明は、 CAR P遺伝子の発現量を測定することを含む、 CAR P標的薬 物に関連する疾患の発症または発症リスクの判定方法を提供する。

本判定方法を、必要に応じて「判定方法 I」と省略する。

一実施形態では、判定方法 Iは、以下の工程(a ) 、 (b) を含む:

(a ) 動物から採取した生体試料において C A R P遺伝子の発現量を測定する 工程;

(b) CAR P遺伝子の発現量に基づき CAR P標的薬物に関連する疾患の発 症または発症可能性を評価する工程。

上記(a) 〜(b) の工程を含む方法論を、必要に応じて「方法論 V」i と省 略する。

方法論 Vの工程(a) では、動物から採取した生体試料において CAR P遺 伝子の発現量が測定される。動物は特に限定されないが、例えば、マウス、ラ ット、ハムスター、モルモット、ゥサギ等の実験動物、ブタ、ゥシ、ャギ、ゥ マ、ヒッジ等の家畜、ィヌ、ネコ等のペット、サル、オランウータン、チンパ ンジ一、ヒト等の霊長類などの哺乳動物が挙げられる。

生体試料は、 C A R P遺伝子の発現組織を含む試料である限り特に限定され ない。 CAR P遺伝子の発現組織は、上述の通りである。

CAR P遺伝子の発現量は、 CARP遺伝子の産物、例えば転写産物又は翻 訳産物を対象として自体公知の方法により測定できる。

方法論 Vの工程(b) では、 C AR P遺伝子の発現量に基づき、動物が CA R P標的薬物に関連する疾患に罹患しているか否かが評価される。詳細には、 先ず、測定された CAR P遺伝子の発現量が、 CAR P標的薬物に関連する疾 患に罹患していない動物(例えば、正常な動物)における CAR P遺伝子の発 現量と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行 われる。 C AR P標的薬物に関連する疾患に罹患していない動物における C A RP遺伝子の発現量は、自体公知の方法により決定できる。

次いで、 CAR P遺伝子の発現量の比較結果より、動物が CARP標的薬物 に関連する疾患に罹患している可能性があるか否か、あるいは将来的に罹患す る可能性が高いか低いかが判断される。特定の疾患を発症した動物では、当該 疾患に関連する遺伝子の発現の変化がしばしば観察されることが知られている。 また、特定の疾患の発症前に、特定の遺伝子の発現の変化がしばしば観察され ることが知られている。従って、 CAR P遺伝子の発現量の解析より、 CAR P標的薬物に関連する疾患の発症あるいは発症可能性を判断することが可能で ある。

判定方法 Iは、 CAR P標的薬物に関連する疾患(例えば、アレルギ^ "疾患、 化学伝達物質の遊離の調節が所望される疾患)の有無、あるいは該疾患に罹患 する可能性の判定を可能とする。従って、判定方法 Iは、例えば、該疾患の容 易且つ早期の発見などに有用である。

7. 1. 2. CAR P遺伝子の発現量の測定に基づく、 CAR P標的薬物に関 連する疾患の発症または発症リスクの判定用キット(判定用キット I )

本発明は、判定方法 Iを容易に行うことを可能とする判定用キットを提供す る。

本判定用キットを、必要に応じて「判定用キット I」と省略する。

一実施形態では、判定用キット Iは、以下( i ) 、( i i ) を含む:

( i ) CAR P遺伝子の発現量を測定し得る手段;

( i i ) C AR P標的薬物に関連する疾患と CAR P遺伝子の発現量との関係 を記録した媒体。

CAR P遺伝子の発現量を測定し得る手段は、 C AR P遺伝子の発現量を定 量可能である限り特に限定されず、例えば CAR Pを定量可能な手段(例えば、 抗体、 CAR P標的薬物)、 CAR P遺伝子転写産物を定量可能な手段(例え ば、核酸プローブ、プライマー対)に大別される。該手段は、標識用物質で標 識されていてもよい。また、該手段が標識用物質で標識されていない場合、本 発明の判定用キットは、該標識用物質をさらに含むこともできる。標識用物質 は上述の通りである。

判定用キット I は、 C AR P標的薬物に関連する疾患(例えば、アレルギー 疾患、化学伝達物質の遊離の調節が所望される疾患)の有無、あるいは該疾患 に罹患する可能性の判定を可能とする。従って、判定用キット Iは、例えば、 該疾患の容易且つ早期の発見などに有用である。

7. 2. C AR P遺伝子の多型の測定に基づく、疾患の発症リスクの判定方法 および判定用キット

7. 2. 1. C AR P遺伝子の多型の測定に基づく、 CAR P標的薬物は関連 ' する疾患の発症リスクの判定方法(判定方法 I I ) , 本発明は、 CAR P遺伝子の多型を測定することを含む、 CAR P標的薬物 に関連する疾患の発症リスクの判定方法を提供する。

本判定方法を、必要に応じて「判定方法 I I」と省略する。

一実施形態では、判定方法 I Iは、以下の工程(a ) 、 (b) を含む:

(a ) 動物から採取した生体試料において CAR P遺伝子の多型を測定するェ 程;

(b) 多型のタイプに基づき CAR P標的薬物に関連する疾患の発症可能性を 評価する工程。

上記(a ) 〜(b) の工程を含む方法論を、必要に応じて「方法論 V I J と 省略する。

方法論 V Iの工程(a ) では、動物から採取された生体試料において CAR P遺伝子の多型のタイプが測定される。動物は上述の通りである。

生体試料は、方法論 Vで上述したものを使用できるが、本方法論 V Iによれ ば、生体試料として毛髪、爪、皮膚、粘膜等のゲノム DN Aを含む任意の組織 も使用できる。入手の容易性、人体への負担等を考慮すれば、生体試料は、毛 髪、爪、皮膚、粘膜、血液、血漿、血清、唾液などが好ましい。

CAR P遺伝子の多型とは、ある母集団において、 CAR P遺伝子を含むゲ ノム DN Aに一定頻度で見出されるヌクレオチド配列の変異を意味し、 CAR P遺伝子を含むゲノム DNAにおける 1以上の DNAの置換、欠失、付加(例 えば、 SN P、ハプロタイプ)、並びに該ゲノム DNAの反復、逆位、転座な どであり得る。 CAR P遺伝子の多型は、例えば、 H— I n v D B等の公知 のデータベースに登録されている。本判定方法に用いられる CAR P遺伝子の 多型のタイプは、 CAR P遺伝子における全てのタイプの多型のうち、 CAR P標的薬物に関連する疾患に罹患した動物と罹患していない動物との間で頻度 が異なるヌクレオチド配列の変異であり、例えば、 C AR P遺伝子の発現の変

ィ匕、または CAR P遺伝子に関連する機能(例えば、 CAR P標的薬物は対す る CAR Pの結合能)の変化をもたらすものであり得る。このような多型のタ イブは、連鎖解析等の自体公知の方法により決定できる。

多型のタイプの測定は、自体公知の方法により行われ得る。例えば、 RF L P (制限酵素切断断片長多型)法、 P CR— S S C P (—本鎖 DN A高次構造 多型解析)法、 A SO (Allele Specific Oligonucleotide) ハイブリダィ ゼーシヨン法、 T a qMa n P CR法、インベーダー法などが使用できる。 方法論 V Iの工程(b) では、多型のタイプに基づき、動物が CAR P標的 薬物に関連する疾患に罹患する可能性が高いか低いかが評価される。特定の疾 患を発症しやすい動物では、当該疾患に関連する遺伝子に特定のタイプの多型 をしばしば有することが知られている。従って、多型の解析より、 CAR P標 的薬物に関連する疾患の発症可能性を判断することが可能である。

判定方 ¾ I Iは、 CAR P標的薬物に関連する疾患(例えば、アレルギー疾 患、化学伝達物質の遊離の調節が所望される疾患)に罹患する可能性の判定を 可能とする。従って、判定方法 I Iは、該疾患の予防を目的とする生活習慣改 善の契機などを提供するため有用である。

7. 2. 2. CAR P遺伝子の多型の測定に基づく、 CAR P標的薬物に関連 する疾患の発症リスクの判定用キット(判定用キット I I )

本発明はまた、判定方法 I Iを容易に行うことを可能とする判定用キットを 提供する。

本判定用キットを、必要に応じて「判定用キット I I」と省略する。

—実施形態では、判定用キット I Iは、以下( i ) 、 ( i i ) を含む: ( i ) CAR P遺伝子の多型を測定し得る手段(例えば、核酸プローブ、ブラ イマ一対);

( i i ) C AR P標的薬物に関連する疾患と CAR P遺伝子の多型との関係を 記録した媒体。 ^

判定用キット I Iは、 CAR P標的薬物に関連する疾患(例えば、ァ 1 ルギ 一疾患、化学伝達物質の遊離の調節が所望される疾患)に罹患する可能性の判 定を可能とする。従って、判定用キット I Iは、該疾患の予防を目的とする生 活習慣改善の契機などを提供するため有用である。

7. 2. 3. CAR P遺伝子の多型の測定に基づく、 CAR P遺伝子に関連す る疾患の発症リスクの判定方法(判定方法 I I I )

本発明は、 CAR P遺伝子の多型を測定することを含む、 CAR P遺伝子に 関連する疾患の発症リスクの判定方法を提供する。

本判定方法を、必要に応じて「判定方法 I I I」と省略する。

—実施形態では、判定方法 I I Iは、下記の工程(a ) 、 (b) を含む:

( a ) 動物から採取した生体試料において CAR P遺伝子の多型のタイプを測 定する工程;

(b ) 多型のタイプに基づき CAR P遺伝子に関連する疾患の発症可能性を評 価する工程。

判定方法 I I Iでは、発症リスクの判定に使用される多型のタイプは、 CA R Pの CAR P標的薬物に対する結合性を変化させるものである。このような 多型のタイプは、バインディングアツセィ等の自体公知の方法により決定でき る。

判定方法 I I Iにおける上記(a ) 、 ( b ) の工程を含む方法論は、測定さ れるべき CAR P遺伝子の多型のタイプを除き、方法論 V I と同様である。 判定方法 I I Iは、 C AR P遺伝子に関連する疾患に罹患する可能性の判定 を可能とする。従って、判定方法 I I Iは、該疾患の予防を目的とする生活習 慣改善の契機などを提供するため有用である。

7. 2. 4. CAR P遺伝子の多型の測定に基づく、 CAR P遺伝子に関連す る疾患の発症リスクの判定用キット(判定用キット I I I )

本発明はまた、判定方法 I I Iを容易に行うことを可能とする判定用キット を提供する。

本判定用キットを、必要に応じて「判定用キット I I I」と省略する J 一実施形態では、判定用キット I I Iは、以下( i ) 、( i i ) を含む: ( i ) CAR P遺伝子の多型を測定し得る手段;

( i i ) C AR P遺伝子に関連する疾患と CAR P遺伝子の多型との関係を記 録した媒体。

判定用キット I I Iでは、発症リスクの判定に使用される多型のタイプは、 CAR Pの CAR P標的薬物に対する結合性を変化させるものである。このよ うな多型のタイプは、バインディングアツセィ等の自体公知の方法により決定 できる。

判定用キット I I Iの構成要素は、測定されるべき CAR P遺伝子の多型の タイプを除き、判定用キット I I と同様である。

判定用キット I I Iは、 CAR P遺伝子に関連する疾患に罹患する可能性の 判定を可能とする。従って、判定用キット I I Iは、該疾患の予防を目的とす る生活習慣改善の契機などを提供するため有用である。

8. 薬物に対する感受性の判定方法および判定用キット

本発明は、薬物に対する感受性の判定方法 ·判定用キットを提供する。本発 明の判定方法,判定用キットは、発現量の測定、および多型の測定に基づく判 定方法 ·判定用キットに大別でき、さらに、感受性の判定が所望される疾患の 観点から、 CAR P標的薬物に関連する疾患(例えば、アレルギー疾患、化学 伝達物質の遊離の調節が所望される疾患)、ならびに CAR P遺伝子に関連す る疾患における判定方法,判定用キットに分類できる。以下、それぞれの判定 方法 ·判定用キットを詳述する。

8. 1. C AR P遺伝子の発現量の測定に基づく、薬物に対する感受性の判定 方法および判定用キット

8. 1. 1. CAR P遺伝子の発現量の測定に基づく、 CAR P標的薬物に関 連する疾患における CAR P標的薬物に対する感受性の判定方法(判定方法 I V)

本発明は、 CAR P遺伝子の発現量を測定することを含む、 CARP標的薬 物に関連する疾患における CAR P標的薬物に対する感受性の判定方法提供 する。

本判定方法を、必要に応じて「判定方法 I V」と省略する。 .

一実施形態では、判定方法 I Vは、以下の工程(a) 、 (b) を含む:

(a) 動物から採取した生体試料において CAR P遺伝子の発現量を測定する 工程;

( b ) C A R P遺伝子の発現量に基づき C A R P標的薬物の効果を予測するェ 程。

上記(a) 〜(b) の工程を含む方法論を、必要に応じて「方法論 V I I」 と省略する。

方法論 V I Iの工程(a) は、方法論 Vの工程(a) と同様である。

方法論 V I Iの工程(b) では、 C AR P遺伝子の発現量に基づき、 CAR P標的薬物の動物に及ぼし得る効果が評価ざれる。詳細には、先ず、測定され た CAR P遺伝子の発現量が、 C AR P遺伝子の発現量と CAR P標的薬物に 対する感受性との相関性に関するデータと照合される。 CARP遺伝子の発現 量と CAR P標的薬物に対する感受性との相関性は、自体公知の方法により決 定できる。

次いで、照合結果より、 CAR P標的薬物に対する感受性が推定される。 C AR P遺伝子を高発現している動物では、薬物に対する感受性が高い(または 低い)と考えられ、低発現する動物は、感受性が低い(または高い)と考えら れる。従って、 C AR P遺伝子の発現量の解析より、 CAR P標的薬物に対す る感受性を判断することが可能である。例えば、 CARP標的薬物が薬物であ る場合、薬物の効き易さまたは効き難さ、あるいは薬物の副作用が発現する確 率を判断することが可能である。

判定方法 I Vは、 CAR P標的薬物に対する感受性の判定を可能とする。従 つて、判定方法 I Vは、例えば、特定の動物に対する CAR P標的薬物の作用 の評価などに有用である。

8. 1. 2. CAR P遺伝子の発現量の測定に基づく、 CAR.P標的薬物に関 連する疾患における CAR P標的薬物に対する感受性の判定用キット(判定用 キット I V)

本発明は、判定方法 I Vを容易に行うことを可能とする判定用キットを提供 する。

本判定用キットを、必要に応じて「判定用キット I V」と省略する。

一実施形態では、判定用キット I Vは、以下( i ) 、( i i ) を含む: ( i ) CAR P遺伝子の発現量を測定し得る手段;

( i i ) CAR P標的薬物の効果と CAR P遺伝子の発現量との関係を記録し た媒体。

判定用キット I Vの構成要素は、( i i ) の媒体以外は、判定用キット I と 同様である。

判定用キット I Vは、 CAR P標的薬物に対する感受性の容易な判定を可能 とする。従って、判定方法 I Vは、例えば、特定の動物に対する CAR P標的 薬物の作用の評価などに有用である。

8. 2. C AR P遺伝子の多型の測定に基づく、 C AR P標的薬物に対する感 受性の判定方法および判定用キット

8. 2. 1. CAR P遺伝子の多型の測定に基づく、 CAR P標的薬物に関連 する疾患における C A R P標的薬物に対する感受性の判定方法(判定方法 V ) 本発明は、 CAR P遺伝子の多型を測定することを含む、 CAR P標的薬物 に関連する疾患における CAR P標的薬物に対する感受性の判定方法を提供す る。

本判定方法を、必要に応じて「判定方法 V」と省略する。

一実施形態では、判定方法 Vは、以下の工程(a ) 、 (b) を含む:

(a ) 動物から採取した生体試料において CAR P遺伝子の多型を測定するェ ' 程;

(b) 多型の特定のタイプの有無に基づき CARP遺伝子に関連する疾患にお ける CAR P標的薬物の効果を予測する工程。

上記(a) 〜(b) の工程を含む方法論を、必要に応じて「方法論 V I I I」と省略する。

方法論 V I I Iの工程(a) は、方法論 V I Iの工程(a) と同様である。 方法論 V I I Iの工程(b) では、 C AR P遺伝子の多型のタイプに基づき、 CAR P標的薬物に関連する疾患における CAR P標的薬物の効果が評価され る。詳細には、先ず、測定された CAR P遺伝子の多型のタイプが、 CAR P 遺伝子の多型のタイプと、 CAR P標的薬物に関連する疾患における CAR P 標的薬物に対する感受性との相関性に関するデータと照合される。該相関性は、 自体公知の方法により決定できる。

次いで、照合結果より、 CAR P標的薬物に関連する疾患における CAR P 標的薬物に対する感受性が予想される。薬物に対する感受性が高い動物では、 該 CAR P遺伝子に特定のタイプの多型をしばしば有することが知られている。 従って、多型の解析より、 CAR P標的薬物に対する感受性を判断することが 可能である。例えば、 CAR P標的薬物が薬物である場合、薬物の効き易さま たは効き難さ、あるいは薬物の副作用が発現する確率を判断することが可能で ある。

判定方法 Vは、 CAR P槔的薬物に関連する疾患(例えば、アレルギー疾患、 化学伝達物質の遊離の調節が所望される疾患)における CARP標的薬物に対 する感受性の容易な判定を可能とする。従って、判定方法 Vは、例えば、 CA R P標的薬物に関連する疾患における CAR P標的薬物の作用の評価などに有 用である。

8. 2. 2. C AR P遺伝子の多型の測定に基づく、 CAR P標的薬物に関連 する疾患における CAR P標的薬物に対する感受性の判定用キット(判定用キ ット V)

本発明はまた、判定方法 Vを容易に行うことを可能とする判定用キットを提 供する。

本判定用キットを、必要に応じて「判定用キット V」と省略する。

—実施形態では、判定用キット Vは、以下( i ) 、( i i ) を含む:

( i ) CAR P遺伝子の多型を測定し得る手段;

( i i ) C AR P標的薬物の効果と CAR P遺伝子の多型との関係を記録した 媒体。

判定用キット Vの構成要素は、( i i ) の媒体以外は、判定用キット I I と 同様である。

判定用キット Vは、 C AR P標的薬物に関連する疾患(例えば、アレルギー 疾患、化学伝達物質の遊離の調節が所望される疾患)における CARP標的薬 物に対する感受性の判定を可能とする。従って、判定用キット Vは、例えば、 CAR P標的薬物に関連する疾患における CAR P標的薬物の作用の評価など に有用である。

8. 2. 3. CARP遺伝子の多型の測定に基づく、 CAR P遺伝子に関連す る疾患における CAR P標的薬物に対する感受性の判定方法(判定方法 V I ) 本発明は、 CAR P遺伝子の多型を測定することを含む、 CAR P遺伝子に 関連する疾患における CAR P標的薬物に対する感受性の判定方法を提供する。 本判定方法を、必要に応じて「判定方法 V I」と省略する。

一実施形態では、判定方法 V Iは、下記の工程(a ) 、 (b) を含む:

(a) 動物から採取した生体試料において CAR P遺伝子の多型のタイプを測 定する工程;

(b) 多型の特定のタイプの有無に基づき CAR P遺伝子に関連する疾患にお ける CAR P標的薬物の効果を予測する工程。

本判定方法では、感受性の判定に使用される多型のタイプは、 CARPの C A RP標的薬物に対する結合性を変化させるものである。このような多型のタ ィプは、バインディングアツセィ等の自体公知の方法により決定できる。薬物 に対する結合能が増強または低下するような多型のタイプを含む標的遺伝子を 有する動物では、薬物に対する感受性が高い(または低い)と考えられ、該結 合能が低下するような多型のタイプを含む標的遺伝子を有する動物は、感受性 が低い(または高い)と考えられる。従って、このような多型のタイプの解析 より、 CAR P標的薬物に対する感受性を判断することが可能である。

判定方法 V Iにおける上記(a) 、 (b) の工程を含む方法論は、測定され るべき CAR P遺伝子の多型のタイプを除き、方法論 V I I I と同様である。 判定方法 V Iは、 CAR P標的薬物に関連する疾患における CAR P標的薬 物に対する感受性の容易な判定を可能とする。従って、判定方法 V Iは、例え ば、 CARP標的薬物に関連する疾患における C A R P標的薬物の作用の評価 などに有用である。

8. 2. 4. C AR P遺伝子の多型の測定に基づく、 CAR P遺伝子に関連す る疾患における CAR P標的薬物に対する感受性の判定用キット(判定用キッ ト V I )

本発明はまた、判定方法 V Iを容易に行うことを可能とする判定用キットを 提供する。

本判定用キットを、必要に応じて「判定用キット V I」と省略する。

一実施形態では、判定用キット V Iは、以下( i ) 、 ( i i ) を含む: ( i ) C AR P遺伝子の多型を測定し得る手段;

( i i ) CARP遺伝子に関連する疾患と CARP遺伝子の多型との関係を記 録した媒体。

判定用キット V Iでは、発症リスクの判定に使用される多型のタイプは、 C AR Pの CAR P標的薬物に対する結合性を変化させるものである。このよう

な多型のタイプは、バインディングァッセィ等の自体公知の方法により決定で さる。

判定用キット V Iの構成要素は、測定されるべき CAR P遺伝子の多型のタ イブを除き、判定用キット Vと同様である。

判定用キット V Iは、 CAR P標的薬物に関連する疾患における CAR P標 的薬物に対する感受性の判定を可能とする。従って、判定用キット V Iは、例 えば、 CAR P標的薬物に関連する疾患における CAR P標的薬物の作用の評 価などに有用である。

本明細書中で挙げられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記 載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に 本明細書に組み込まれるものである。

実施例

以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例 等に何ら制約されるものではない。

参考例 1 ;ヒト完全長 cDNAクローンからのタンパク質発現方法

Invitrogenの Gatewayシステムの PCRクローニング法によってヒト完全長 cDNAクローンをクローニングベクター GatewaypD0NR201 と BP反応させてェン トリーク口一ンを得た。このェントリークローンを Gatewayシステムのデス ティネーションベクター pDEST17 と LRクロナーゼにより 25°C60分間 LR反 応させて発現プラスミドを作製した。この発現プラスミドによって大腸菌コン ピテントセル BL21star(DE3)pLysSを形質転換し、発現ベクターが導入された クローンを選択して FrozenStockを作製した。形質転換体を L B培地に植菌 して前培養後、 S B培地中に移して本培養を行い I P TG発現誘導をかけた菌 体を凍結保存した。

参考例 2 ;ヒト完全長 cDNAクローンの発現タンパク質精製方法

ヒト完全長 cDNAクローンを N末 H i sタグ付きのタンパク質として発現さ せ、 BioRobot8000 (Qiagen) あるレヽ ACTA Crystal (Amersham) を用レヽて 実施した。 BioRobot8000による精製では、参考例 1の発現誘導をかけた凍結 保存菌体を解凍してリゾチームで溶菌後、 Ni- NTA Superflow 96 BioRobpt K it (Qiagen) を用いてァフィ二ティー精製した。 ACTA Crystalによる精製で は、 HisTrap HPカラムによるァフィ二ティー精製後に. Gel Filtration Column HiLoad 16/60 または 10/30 Superdex 75 prep gradeカラムによる ゲルろ過精製を実施した。精製分画の SDS-PAGEを実施して推定分子量と純度 を検定してから相互作用解析に使用した。

参考例 3 ;サイズ排除ク口マトグラフィ一法を用いたヒトタンパク質-医薬 品相互作用

解析方法

汎用医薬品とヒト全長 cDNAクローンから発現したタンパク質との相互作用 をタンパク質と化合物の双方とも非修飾 ·非固定の状態で解析するために、サ ィズ排除クロマトグラフィー(S EC) と質量分析を組み合わせた手法を用い た (図 1, 2) 。具体的な手順は次の通りである。

ステップ 1.

単一の医薬品溶液、あるいは、複数の医薬品(8、 1 6、 24種など)を混 合した多重化化合物溶液を参考例 2で精製したタンパク質に添加した。

ステップ 2.

ステップ 1で調製した化合物とタンパク質の混合物の S E Cカラムによるク 口マトグラフィーを実施し、化合物とタンパク質とを S E Cで分離し、タンパ ク質分画に含まれる結合化合物あるいはタンパク質と相互作用した化合物を質 量分析計によつて解析した。

精製タンパク質標品は、限外ろ過法による濃縮と緩衝液置換を行い、最終的 に 10mM ADA (N- (2-Acetamido) iminodiacetic acid) Buffer Η6.5) -300m M NaCl-ΙΟΟ Μ mineral ion cocktail, Ca(0Ac)2、 Zn(0Ac)2 - 2H20、 Cu(0A c)2 · H20、 Co(0Ac)2 · 4H20、 n(0Ac)2 · 4H20、 Mg (OAc) 2 · 4H20、 FeCl3■ 6H20水 溶液中で 25μΜ以上の濃度になるまで濃縮した。タンパク質濃度は BCA Prot ' ein Assay (PIERCE) を用いて測定し、 SDS- PAGE で算定した純度を考慮した。

医薬品化合物は、 1.25mM濃度の単一化合物の DMSO (Dimethyl sulfoxid e) 溶液あるいは複数(8あるいは 1 6種)の化合物を混合した多重化化合物 の DMS0溶液を調製して相互作用解析に用いた。また、再現性を確認する試験 あるいは濃度依存性を調べる試験では、各種濃度の単一化合物の DMSO (Dimet hyl sulfoxide) 溶液を用いた。

質量分析は、 E S Iプローブを装着した LCQ DECA XP (Thermoelectron) あるレ、は Q- TOF micro (Micromass) を用いて行った。また、 LCポンプは Agi lentllOO (Yokoga a Analytical Systems) 、ォー卜サンプラーはクージン ダスタッカーを搭載した HTC-PAL (CTC Analytics) を使用した。

384穴スピンカラムを用いた S E C法では、ュニフィルター 100 (Whatma n) に乾燥容量 10/iLの Bio- Gel P6 (BI0-RAD) を充填し milliQ水で膨潤さ せたものを S E Cカラムとして使用した。タンパク質を含まないリファレンス 標品および 25 iM濃度のタンパク質標品 13. 3/iLと各 25//Μ濃度の医薬品化 合物の多重化液(5% DMS0水溶液) 0.7/xLとを混合し、そのを S E Cス ピンカラムに分注した。ァセトニトリルを分注した 384穴 U底プレート上に S ECスピンカラムを上乗せして遠心し、タンパク質分画である S ECスピン カラムのろ液を 50%ァセトニトリル中に回収した。ァセトニトリルによって 生じたタンパク質沈殿を遠心およびフィルターろ過で除去して除タンパク質操 作を行い、そのろ液を遠心濃縮後に 10/ Lの 50%Methanolで再溶解して質量 分析サンプルとした。質量分析計への移動相は、 Positive ionモードの場合 には 0.1%
溶液、 Negative ionモードの場合には 0.1% アンモニア Z50%methanol溶液を 40/iLZminの流速で用いた。ォートサン ブラーを用いて質量分析サンプル 2 / Lずつを 2分間間隔でインジエタション して化合物の質量スペクトル強度を測定し、 S ECスピンカラムのろ液(S E Cからのタンパク質溶出分画)に含まれる医薬品化合物のスぺクトル強度を得

た。タンパク質標品を添加した S E Cサンプルから得られた質量分析サプル 中の化合物のスペクトル強度が、タンパク質が添加されていないリファンス の S E C標品の質量分析サンプル中のその化合物のスぺクトル強度よりも大き い場合に相互作用ありと判定した。また、濃度依存性を調べる試験においては S E Cサンプルの化合物濃度あるいは Zおよびタンパク質濃度が増加させた時 に、 S E Cスピンカラムのろ液(S E Cからのタンパク質溶出分画)に含まれ る医薬品化合物のスぺクトル強度が増大する場合に、濃度依存性の相互作用と 判定した。

実施例 1; FLJ13397由来タンパク質とァステミゾールまたはテルフエナジン との相互作用解析

参考例 1および参考例 2の方法に従って FLJ13397クローンに由来するタン パク質 (C A R P ) の発現精製を行い、参考例 3の方法に従って FLJ13397か ら発現精製したタンパク質とァステミゾールまたはテルフエナジンとの相互作 用を解析した。その結果(抽出 Mass Range におけるスぺクトル強度)を表 1 2に示す。各低分子化合物と FLJ13397発現タンパク質の両者の用量に依存し て、 S E Cスピンカラムのろ液(S E Cからのタンパク質溶出分画)に含まれ る医薬品化合物のスぺクトル強度が増大し、濃度依存性の相互作用と判定した 〔表 1〕


〔表 2〕

FLJ13397 -ァス亍ミゾ一ル 化合物(《M)

(Astemizole) 0 1 10 100 250

0 33202385 12239048 13557249 210085727 710392964 タンパク質 M) 23.75 16126281 16006165 1 18520633 1213216132 10273531 72

47.5 12920683 18099237 36678174 2237504347 2019252410 従って、 FLJ13397由来タンパク質は、抗アレルギー薬として開発され化 ' 合物であるァステミゾール、テルフエナジンの標的タンパク質の 1つであるこ とが判明した。このことより、 FLJ13397由来タンパク質とスクリーニング候 補物質とを作用させることで、新規抗アレルギー薬のスクリー.ユングを行うこ とができる。すなわち、 FLJ13397 由来タンパク質と候補物質との相互作用を、 例えば実施例 1の方法で検出するような系を構築することによって、新規抗ァ レルギ一薬のスクリ一ユングを行うことができる。

実施例 2 : FLJ13397クローン由来タンパク質と各種化合物との相互作用解析

8

参考例 1および参考例 2の方法に従っ 3て FLJ13397クローンに由来するタン パク質の発現精製を行い、参考例 3の方法に従って FLJ13397から発現精製し たタンパク質と、各種化合物との相互作用を解析した。その結果を表 3〜2 0 に示した。各種化合物と FLJ13397発現タンパク質の両者の用量に依存して、 S E Cスピンカラムのろ液(S E Cからのタンパク質溶出分画)に含まれる医 薬品化合物のスぺクトル強度が増大しており、濃度依存性の相互作用と判定し た。

〔表 3〕



〔表 4〕


〔表 5〕



〔表 6〕

¾¾ ass Ran e :m/z=444.8-445.8


〔表 7〕

測定 Mass Range: m/z=223.7-224.7


〔表 8〕- 測 Mass Ran e :m/z=191.7-192.7


〔表 9〕

測 Mass Ranpe:m/z=249.7-250.7_

FLJ 13397 -ォキシベンダゾール 化合物(/ Μ)

(Oxibendazole) 0 1 10 100 250

0 921022 570160 525337 1292692 2449247 タンパク質 23.75 485333 595458 3533115 7303166 20401030

47.5 330688 529117 9671167 8921904 13559202 〔表 1 0〕



〔表 1 1〕

Mass Ran e:m/z=281.7-282


〔表 1 2〕

Mass Ran e:m/z=297.9-298.9


〔表 1 3〕

測定 Mass Ran e:m/z=239.8-240,8


〔表 14〕

測 Mass Range :m/z=296.0-297.0

FLJ 13397 -メベンダゾ一ル 化合物( M)

(Mebendazole) 0 1 10 100 250

0 621163 495347 525296 482901 444136 タンパク質 M) 23.75 344961 480780 777305 15054045 32097734

47.5 437886 495499 725295 9517765 43484997 〔表 1 5〕



〔表 1 6〕



〔表 1 7〕



〔表 1 8〕

Mass Ran e:m/z=133.8-134.8


〔表 1 9〕


〔表 20〕



従って、 FLJ13397由来タンパク質は、これらの各種化合物の標的タンパク 質の 1つであることが判明した。このことより、 FLJ13397由来タンパク質と スクリーニング候補物質とを作用させることで、新規医薬のスクリーユングを 行うことができる。すなわち、 FLJ13397由来タンパク質と候補物質との相互 作用を、例えば実施例 1の方法で検出するような系を構築することによって、 新規医薬のスクリーニングを行うことができる。

産業上の利用可能性

本発明の C A R Pおよび遺伝子は、抗ァレルギ一疾患薬等の創薬などを可能 とする。本発明のスクリーニング方法および本発明の誘導体の製造方法は、ァ レルギ一疾患等の疾患の予防■治療剤、並びに該疾患の研究用試薬の開発など を可能とする。本発明の調節剤および誘導体は、アレルギー疾患等の疾患の予 防,治療に、並びに該疾患の研究用試薬などに使用できる。本発明の複合体お よびキットは、本発明のスクリーニング方法などに使用できる。本発明の判定 方法および判定用キットは、動物における疾患の発症または発症可能性の評価、 並びに薬物に対する感受性の評価などを可能とする。

本出願は、日本で出願された特願 2 004— 30 3 4 3 2 (出願日: 2 0 0 4年 1 0月 1 8日)、および特願 200 5 - 0 8 9 6 0 9 (出願 : 2 0 0 5 年 3月 2 5 S) を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるもの である。