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1. (MXMX/a/2007/002999) TELOMELYSIN-GFP GENE-CONTAINING RECOMBINANT VIRUS
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VIRUS RECOMBINANTE QUE CONTIENE EL GEN DE TELOMELISIN- PROTEINA VERDE FLUORESCENTE

CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un reactivo para detectar células cancerosas o diagnosticar cánceres, y un agente inductor de la muerte de célula.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La actividad de telomerasa por lo general se intensifica en células malignamente transformadas o cepas de células inmortalizadas, mientras la actividad de telomerasa se detecta difícilmente en células somáticas normales excluyendo células de la línea germinal, células de linaje sanguíneo y células epiteliales. Por consiguiente, se han hecho intentos por detectar cáncer utilizando la actividad de telomerasa como un indicador (Shay JW, Zou Y, Hiya a E, Wright WE . Telomerasa and Cáncer. Hum. Mol Genet 10 (7) : 677-85 2001) .
Por el otro lado, la detección de tejidos cancerosos y nodos linfoides metastáticos in vivo ha sido estudiada ávidamente en el campo de la formación de imágenes diagnósticas. Por ejemplo, se ha reportado que la diagnosis biológica con PET y el análisis de imágenes completamente utilizan la red neural. Además, se han reportado las

Ref. 180061 investigaciones en la actividad anti-tumor, y la seguridad de virus selectivo de replicación (DeWeese TL, van der Piel H, Li S, Mikhak B, Drew R, Goemann M, Hamper U, DeJong R, Detorie N, Rodríguez R, Haulk T, De Marzo AM, Piantadosi S, Yu DC, Chen Y, Henderson DR, Carducci MA, Nelson WG, Simona JW. A phase I trial of CV705, "A replication-competent , PSA selective Oncolytic adenovirus, for the treatment of locally recurrent prostate cáncer following radiation therapy", Cáncer Res 61 (20) : 7464-72 , 2001). Los presentes inventores también han encontrado que la infección de células cancerosas con un virus que tiene un promotor de telomerasa y la habilidad de replicación pueden aniquilar las células cancerosas a través de replicación viral (Kawashima T, Kagawa S, Kobayashi N, Shirakiya Y, Umeoka T, Teraishi F, Taki M, Kyo S, Tanaka N, y Fujiwara T. , Related Articles, Links Abstract "Telomerase-specific replication-selective virotherapy for human cáncer", clin Cáncer Res 10(1) :285-92, 2004) .
Sin embargo, el sistema de detección de cáncer in si tu durante operación quirúrgica aún no ha sido desarrollado debido a la dificultad al tratar específicamente células cancerosas. Además, a la fecha no se sabe de ninguna investigación en la cual el cuerpo viviente se infecte con un virus y los cinéticos virales dentro de las células cancerosas actualmente se aplican a la visualización de los tejidos de cáncer.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Co o se describió anteriormente, se desea el desarrollo de un reactivo para detectar células cancerosas o para diagnosticar cánceres, y un agente inductor de muerte celular, cada agente capaz de visualizar células cancerosas aún in vivo .
Como un resultado de las intensivas y extensivas investigaciones hacia la solución de los problemas anteriores, los presentes inventores han encontrado que es posible detectar células cancerosas con extremadamente alta sensibilidad y aún in vivo, a través de la integración de un gen que codifica una proteína de marcación de fluorescencia en la región E3 de un genoma viral e integrar un cásete de replicación que comprende un promotor de telomerasa humana, un gen ElA, una secuencia IRES y un gen ElB en este orden en la región El, y después expresar ambos casetes. De esta forma, se ha logrado la presente invención.
La presente invención se refiere a lo siguiente.
(1) Un reactivo para la detección de célula cancerosa, que comprende un virus recombinante en donde un cásete de replicación comprende un promotor de telomerasa humana, un gen ElA, una secuencia IRES y un gen ElB en este orden se integran en la región El del genoma viral y un c sete de marcación que comprende un gen que codifica una proteína de marcación, y promotor capaz de regular la expresión del gen que codifica la proteína de marcación se integra a la región E3 del genoma viral .
(2) Un reactivo para el diagnóstico de cáncer, que comprende un virus recombinante en donde un cásete de replicación comprende, un promotor de telomerasa humana, un gen ElA, una secuencia IRES y un gen ElB en este orden se integra a la región El del genoma viral y un cásete de marcación que comprende un gen que codifica proteínas de marcación y un promotor capaz de regular la expresión del gen que codifica la proteína de marcación se integra en la región E3 del genoma viral .
En (1) y (2) anteriores, estos reactivos se pueden utilizar en la detección in vivo, diagnóstico o cirugía de navegación. Como un ejemplo específico del promotor de telomerasa humana, se puede dar el promotor hTERT. Como un ejemplo específico de la proteína de marcación, se puede dar GFP. Como el promotor capaz de regular la expresión del gen que codifica esta proteína de marcación, se puede utilizar el promotor de citomegalovirus o el promotor hTERT, por ejemplo. Como el virus se puede utilizar un adenovirus, por ejemplo.
(3) Un agente inductor de la muerte de célula, comprende un virus recombinante en donde el cásete de replicación comprende un promotor de telomerasa humana, un agente ElA, una secuencia IRES y un gen ElB en este orden se integran en la región El del genoma viral y un cásete inductor de la muerte de célula que comprende un gen que codifica una proteína asociada con la inducción de la muerte celular y un promotor capaz de regular la expresión del gen que codifica la proteína asociada con la inducción de la muerte celular se integra a la región E3 del genoma viral.
En este agente inductor de muerte celular, el promotor de telomerasa humana puede ser el promotor hTERT. Ejemplos de proteínas asociadas con la inducción de la muerte celular incluyen proteínas asociadas con inmunidad, proteínas que inducen la apoptosis y proteínas asociadas con telomerasa. Más específicamente se puede dar PA28 como una proteína asociada con inmunidad; se puede dar TRAIL como una proteína que induce la apoptosis; y se puede dar AU5 como una proteína asociada con telomerasa. El promotor capaz de regular la expresión de una proteína asociada con la inducción de la muerte celular puede ser un promotor de citomegalovirus o promotor hTERT; y el virus puede ser un adenovirus. Como una célula de la presente invención, se puede utilizar una célula cancerosa.
(4) Un método para detectar células cancerosas, que comprende infectar células cancerosas con el reactivo de (1) anterior y detectar la fluorescencia emitida por las células cancerosas .
(5) Un método para el diagnóstico del cáncer, que comprende infectar células cancerosas con el reactivo de (2) anterior y detectar la fluorescencia emitida por las células cancerosas .
(6) Un método para inducir la muerte celular en la célula objetivo, que comprende infectar la célula objetivo con el agente inductor de la muerte celular de (3) anterior.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 es un diagrama que muestra la estructura de Telomelisin-GFP.
La Figura 2 es un diagrama que muestra la replicación del virus no de replicación.
La Figura 3 es un diagrama que muestra los resultados de la detección de las células cancerosas a través de la co-infección in vi tro con Ad-GFP.
La Figura 4 es un diagrama que muestra los resultados de la detección de tejidos cancerosos humanos a través de co-infección in vivo con Ad-GFP.
La Figura 5 es un diagrama que muestra los cambios morfológicos en células cancerosas humanas de pulmón infectadas con Telomelisin-GFP.
La Figura 6 es un diagrama que muestra la emisión de la fluorescencia GFP en células cancerosas humanas de pulmón infectadas con Telomelisin-GFP.
La Figura 7 es un diagrama que muestra la replicación de Telomelisin-GFP determinada a través de PCR en tiempo real cuantitativo.
La Figura 8 es un diagrama que muestra la emisión de fluorescencia GFP en células cancerosas humanas de colon grueso infectadas con Telomelisin-GFP.
La Figura 9 es un diagrama que muestra la replicación de Telomelisin-GFP determinada a través de PCR en tiempo real cuantitativo.
La Figura 10 es un diagrama que muestra los cambios morfológicos en células humanas normales de fibroblasto de pulmón (NHLF, por sus siglas en inglés) infectadas con Telomelisin-GFP.
La Figura 11 es un diagrama que muestra la emisión de fluorescencia GFP en células humanas de fibroblasto normales de pulmón (NHLF) infectadas con Telomelisin-GFP.
La Figura 12 es un diagrama que muestra la comparación de replicaciones de Telomelisin-GFP determinadas a través de PCR en tiempo real cuantitativo.
La Figura 13 es un diagrama que muestra la proliferación/replicación intertumoral de Telomelis Ln-GFP observada a través de formación de imágenes de fluorescencia.
La Figura 14 es un diagrama que muestra la proliferación/replicación intratumoral de Telomelis.Ln-GFP observada a través de formación de imágenes fluorescentes.
La Figura 15 es un diagrama que muestra la proliferación/replicación intratumoral de Telomelisin-GFP en un modelo de metástasis de nodo linfoide observado a través de formación de imágenes de fluorescencia.
La Figura 16 es un diagrama que muestra el análisis histológico en un modelo de cáncer rectal ortotópico utilizando ratones desnudos y células cancerosas humanas de colon grueso HT29.
La Figura 17 es un diagrama que muestra hallazgos en ventrotomía en un modelo de cáncer rectal ortotópico utilizando ratones desnudos y células cancerosas humanas de colon grueso.
La Figura 17 es un diagrama que muestra hallazgos en ventrotomia en un modelo de cáncer rectal ortotópico utilizando ratones desnudos y células cancerosas humanas de colon grueso HT29.
La Figura 18 es un diagrama que muestra la proliferación/replicación intratumoral de Telomelisin-GFP en tumor rectal HT29 y nodos linfoides para-aórticos observados a través de formación de imágenes de fluorescencia.
La Figura 19 es un diagrama que muestra la proliferación/replicación intratumoral de Telomelisin-GFP en nodos linfoides para-aórticos observados a través de formación de imágenes de fluorescencia.
La Figura 20 es un diagrama que muestra la proliferación/replicación intratumoral de Telomelisin-GFP en nodos linfoides para-aórticos observados a través de formación de imágenes de fluorescencia.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
A continuación, se describirá la presente invención con detalle.
Las referencias citadas en la presente especificación se incorporan aquí por referencia en su totalidad.
1. Reactivo para Detección de Células Cancerosas y Método de Detección
La presente invención se r.efiere a un reactivo para detectar células cancerosas, que comprende un virus recombinante en donde un cásete de replicación comprende un promotor de telomerasa humana, un gen ElA, una secuencia

IRES, y un gen ElB en este orden se integran en la región El del genoma viral y un cásete de marcación que comprende un gen que codifica una proteína de marcación y un promotor capaz de regular la expresión del gen que codifica la proteína de marcación se integran en la región E3 del genoma viral. Además, la presente invención se refiere a un método para detectar células cancerosas, que comprende infectar células cancerosas con el reactivo y detectar la fluorescencia emitida por las células cancerosas. En la presente invención, el término "virus recombinante" significa un virus en el cual el cásete de replicación y el cásete de marcación descritos anteriormente se integran en el genoma. El virus utilizado en la presente invención no está particularmente limitado, pero es preferible un adenovirus desde el punto de vista de seguridad. Entre las especies de adenovirus, el adenovirus de tipo 5 es especialmente preferible principalmente porque es fácil de manejar.
El virus recombinante utilizado en la presente invención tiene un cásete de replicación integrado en una región correspondiente a la región El del genoma de adenovirus y un cásete de marcación integrado en una región correspondiente a la región E3 del genoma de adenovirus. El cásete de replicación comprende un promotor de telomerasa humana, un gen ElA, una secuencia IRES, y un gen ElB en este orden. El gen ElA, la secuencia IRES y el gen ElB se conducen a través del promotor de telomerasa humana, lo cual da como resultado la proliferación/replicación de células específicas de cáncer y específicas de telomerasa del virus. El cásete de marcación comprende un promotor y un gen que codifica una proteína de marcación. Por ejemplo, el gen que codifica la proteína de marcación se conduce a través de un promotor CMV

(citomegalovirus) o promotor hTERT (Figura 1) .
El "promotor de telomerasa" determina el sitio de iniciación de la trascripción para telomerasa y directamente regula la frecuencia de la trascripción. La telomerasa es una enzima que mantiene la longitud de los telómeros, que dan soporte contra el acortamiento de los telómeros en el tiempo de la replicación de los cromosomas eucarióticos. El tipo de dicho promotor de telomerasa no está particularmente limitado, y cualquier promotor de telomerasa adecuado compatible con el virus a ser utilizado para la expresión del gen de interés puede utilizarse. Por ejemplo, el promotor para la transcriptasa inversa de telomerasa humana (hTERT, por sus siglas en inglés) es preferible. Se confirma un número de secuencias de enlace del factor de trascripción en una región de 1.4 kbp en corriente ascendente del extremo 5' del gen hTERT. Se cree que de esta región va a ser el promotor hTERT. En particular, una secuencia de 181 bp localizada en corriente ascendente para el sitio de iniciación de traducción es una región núcleo importante para la expresión del gen en corriente descendente. En la presente invención, cualquier secuencia que comprende esta región núcleo se puede utilizar. Preferiblemente, una secuencia en corriente ascendente de aproximadamente 378 bp conteniendo la región núcleo completa se utiliza como el promotor hTERT. Se ha confirmado que esta secuencia de aproximadamente 378 bp es equivalente a la región núcleo de 181 bp sola en la eficacia de la expresión del gen. La secuencia de nucleótido de un promotor hTERT de 455 bp se muestra en SEC ID NO : 1
La secuencia de nucleótido del promotor hTERT no está limitado a la secuencia como se muestra en SEC ID NO : 1. Las secuencias de nucleótidos que hibridizan bajo condiciones estrictas a un ADN consisten en una secuencia de nucleótido complementaria al ADN que consiste de SEC ID NO : 1 y que tiene la actividad promotora hTERT también se pueden incluir como una secuencia del promotor hTERT. Dichos nucleótidos se pueden obtener de colecciones de ADNc o colecciones genómicas a través de métodos de hibridación conocidos tales como hibridación de colonias, hibridación de placas, Southern blotting, etc., utilizando el polinucleótido que consiste de la secuencia del nucleótido de SEC ID NO : 1 o una parte del mismo como una sonda. Las colecciones de ADNc se pueden preparar de acuerdo con el método descrito en Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a. ed. (Cold Spring Harbor Press (1989)). Alternativamente, las colecciones de ADNc o colecciones genómicas se pueden utilizar.
En la hibridación anterior, los ejemplos de las condiciones estrictas incluyen lxSSC para 2xSSC de 0.1% a 0.5% de SDS y 422C a 682C. Más específicamente, se puede dar un ejemplo en donde se prefiere la prehibridación a 60-68aC durante más de 30 minutos, y después se lleva a cabo un lavado en 2xSSC, 0.1% de SDS a temperatura ambiente durante 5-15 minutos de 4 a 6 veces.
Para los procedimientos detallados de hibridación, ver, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2o. ed. (Cold Spring Harbor Press (1989)), en particular la Sección 9.47.58.
La razón por la que un gen ElA, una secuencia de IRES y un gen ElB se localizan en este orden en la presente invención es que la inserción de la secuencia IRES entre el gen ElA y el gen ElB dará como resultado la habilidad de una replicación mayor del virus cuando una célula huésped ha sido infectada con éste. El gen ElA y el gen ElB son genes incluidos en el gen El. Este es uno de los genes anteriores de virus, que tienen genes (E) anteriores y genes (L) posteriores involucrados en su replicación ADN, y codifica una proteína involucrada en la regulación de la trascripción del genoma viral. La proteína ElA codificada a través del gen ElA activa la trascripción de un grupo de genes (ElB, E2 , E4 , etc.) necesarios para la producción del virus infeccioso. La proteína ElB codificada por el gen ElB ayuda en la acumulación del ARNm del gen anterior (gen L) en el citoplasma de la células huésped infectada para por lo tanto inhibir la síntesis de la proteína en la célula huésped. De esta forma, la proteína ElB promueve la replicación viral. Las secuencias del nucleótido del gen ElA y el gen F.1B se muestran en SEC ID ΝO : 2 y SEC ID ΝO : 3 , respectivamente.
ElA y ElB pueden tener, otras secuencias de nucleótidos diferentes de aquellas mostradas en SEC ID ΝO : 2 y SEC ID ΝO:3, respectivamente, secuencias de nucleótido que hibridizan bajo condiciones estrictas a un ADΝ que consiste en una secuencia de nucleótido complementaria al ADΝ que consiste de SEC ID ΝO : 2 o SEC ID ΝO : 3 y que codifica una proteína que tiene actividad ElA o ElB. Dichas secuencias de nucleótido se pueden obtener de colecciones de ADNc o colecciones genómicas a través de métodos de hibridación conocidos tales como hibridación de colonia, hibridación placa, Southern Blotting, etc., utilizando el polinucleótido, o una parte del mismo, que consiste de las secuencias de nucleótido SEC ID NO : 2 o SEC ID NO : 3 como una sonda. Las colecciones de ADNc se pueden preparar de acuerdo con el método descrito en Molecular Cloning A Laboratory Manual 2a. ed. (Cold Spring Harbor Pres. (1989). Alternativamente, se pueden utilizar las colecciones de ADNc o colecciones genómicas. En la hibridación anterior, los ejemplos de condiciones estrictas incluyen lxSSC a 2xSSC, 0.1% a 0.5% de SDS y 422C a 68 SC. Más específicamente, se puede dar un ejemplo en donde se prefiere la prehibridación a 60-689C durante más de 30 minutos, y después se lleva a cabo un lavado en 2xSSC, 0.1% de SDS a temperatura ambiente durante 5-15 minutos de 4 a 6 veces. Para los procedimientos detallados de hibridación, ver, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a. ed. (Cold Spring Harbor Press (1989)), en particular la Sección 9.47.58.
Sitio de Entrada del Ribosoma Interno, (IRES, por sus siglas en inglés) es una señal de iniciación de síntesis de proteína específica para picornavirus. Se cree que este sitio sirve como un sitio de enlace de ribosoma debido a su secuencia complementaria en la secuencia terminal 3 ' del ARN ribosómico de 18S. Se cree que el ARNm derivado del virus que pertenece a picornaviridae se produce a través de esta secuencia. La eficacia de la traducción de la secuencia IRES es alta. Aún a partir de la parte media del ARNm, la síntesis de proteína se lleva a cabo en una forma no dependiente de la estructura tope. Por consiguiente, el virus de la presente invención, tanto el gen ElA como el gen ElB (que se localizan en corriente descendente de la secuencia IRES) se traducen independientemente a través de un promotor de telomerasa humana. Al utilizar IRES, el control de la expresión a través de un promotor de telomerasa se ejerce sobre el gen ElA y el gen ElB independientemente. Por lo tanto, comparado con los casos en donde el gen ElA o el gen ElB están controlados por un promotor de telomerasa, la replicación viral puede estar más estrictamente limitada a aquellas células que tienen actividad de telomerasa. Una secuencia IRES se muestra en SEC ID ΝO: 4.
IRES puede tener, aparte de la secuencia del nucleótido como se muestra en SEC ID ΝO : 4, secuencias de nucleótido que hibridizan bajo condiciones estrictas a un ADΝ que consisten en una secuencia de nucleótido complementaria al ADΝ que consiste de SEC ID ΝO : 4 y que codifica una proteína que tiene actividad IRES. Dichas secuencias de nucleótido se pueden obtener de colecciones de ADΝc o colecciones genómicas a través de métodos de hibridación conocidos tales como hibridación de colonia, hibridación de placa, Southern blotting, etc., utilizando el polinucleótido, o una parte del mismo, que consiste de la secuencia de nucleótido de SEC ID NO : 4 como una sonda. Las colecciones de ADNc se pueden preparar de acuerdo con el método descrito en Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a. ed. (Cold Spring Harbor Press (1989)). Alternativamente, se pueden utilizar las colecciones de ADNc o colecciones genómicas comerciales. En la hibridación anterior, los ejemplos de las condiciones estrictas incluyen de lzSSC a 2xSSC, 0.1% a 0.5% de SDS y 42 SC a 68 SC. Más específicamente, se puede dar un ejemplo en donde se prefiere la prehibridación a 60-682C durante más de 30 minutos, y después se lleva a cabo un lavado en 2xSSC, 0.1% de SDS a temperatura ambiente durante 5-15 minutos de 4 a 6 veces. Para los procedimientos detallados de hibridación, ver, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a. ed. (Cold Spring Harbor Press (1989)), en particular la Sección 9.47.58.
En la presente invención, un promotor de telomerasa humana se localiza en dirección 5' del gen El porque dicho promotor es capaz de promover la replicación en las células que tienen la actividad de telomerasa.
Los genes contenidos en el cásete de replicación de la presente invención se pueden obtener a través de técnicas 7

de ingeniería genética convencionales. Por ejemplo, como una técnica de ingeniería, se puede utilizar un método de síntesis de ácido nucleico con un sintetizador de ADN comúnmente utilizado. Alternativamente, después de que se sintetiza o aisla una secuencia genética que se va a utilizar como plantilla, se pueden diseñar iniciadores específicos para cada gen y la secuencia genética se puede amplificar con un aparato PCR (método PCR; Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987), Sección 6.1-6.4); o se puede utilizar un método de amplificación de gen utilizando un vector de clonación. Un experto en la técnica puede fácilmente llevar a cabo los métodos anteriores de acuerdo con por ejemplo, Molecular Cloning 2a. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). La purificación de los productos PCR resultantes se puede llevar a cabo a través de métodos conocidos tales como un método que utiliza bromuro de etidio, un método que utiliza SYBR Green I (Sondas Moleculares), un método con GENECLEAN (Funakoshi), QIAGEN (QIAGEN), etc., utilizando gel de agarosa, un método utilizando un filtro de celulosa DEAE, un método de congelar y exprimir, o un método utilizando un tubo de diálisis. Cuando se utiliza el gel de agarosa, los productos PCT se someten a electroforesis sobre gel de agarosa y los fragmentos de ADN resultantes se separan del gel y se purifican. Si es necesario, es posible confirmar a través de métodos de secuenciación convencionales que un gen esperado se ha obtenido. Por ejemplo, se puede utilizar el método de terminación de cadena de didesoxinucleótido (Sanger y otros (1977) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74:5463) o similar para este propósito. Alternativamente, es posible analizar la secuencia con un secuenciador de ADN apropiado (por ejemplo, ABI PRISM; Applied Biosystems) .
Subsecuentemente, los genes individuales así obtenidos se ligan en un orden específico. En primer lugar, los genes anteriores se digieren con enzimas de restricción conocidas, y los fragmentos de ADN resultantes se insertan en un vector conocido de acuerdo con un método conocido para ligación. Los ejemplos específicos de vectores conocidos incluyen el vector pIRES que comprende el IRES (sitio de entrada del ribosoma interno en ARNm) del virus de encefalomiocarditis (ECMV, por sus siglas en inglés) , que es capaz de traducir dos marcos de lectura abiertos (ORE, por sus siglas en inglés) de un ARNm; plásmidos derivados de Escherichia coli (tales como pCR4 , pCR2 , pCR2.1, pBR322, pBR325, pUC12 y pUC13); plásmidos derivados de Bacillus -subtillis (tales como pUBllO, pTP5 y pC194); plásmidos derivados de levadura (tales como pSH19 y pSHl5) ; bacteriófagos tales el fago λ; virus de animal tales como retrovirus, virus de vacuna, y baculovirus; pAl-11, pXTl , pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo, etc. En la presente invención, el uso del vector pIRES es preferido. Con este vector, es posible preparar un cásete de replicación que contiene "un promotor de telomerasa humana, un en ElA, una secuencia IRES, y un gen ElB" en este orden a través de la inserción de los genes necesario en el sitio de multi-clonación en este orden. La ligasa ADN se puede utilizar para ligación de los ADN. A continuación, se describirá específicamente un ejemplo en donde se utiliza hTERT como telomerasa humana en la presente invención.
El gen ElA y el gen ElB se pueden amplificar en células de expresión del gen El, tales como 293 células, llevando a cabo RT-PCR y/o DNA-PCR utilizando iniciadores tales como E1A-S, ElA-AS, E1B-S y EIB-AS . Si es necesario, sus secuencias se confirman utilizando un método conocido tal como la clonación TA. Después, los fragmentos ADN de ElA y ElB pueden separase utilizando una enzima de restricción conocida .
Subsecuentemente, el cásete de replicación que consiste de hTERT-ElA-IRES-ElB a ser utilizado en la presente invención se puede preparar, a través de la inserción de genes individuales en un sitio de multi-clonación o similar de un vector conocido (tal como el vector pIRES) para dar el siguiente orden: "secuencia de promotor hTERT-ElA-IRES-ElB" . Alternativamente, si es necesario, también es posible remover un promotor de citomegalovirus (CMV) de un vector conocido tal como pShuttle con enzimas de restricción conocidas, e insertar en ese sitio una secuencia separada de phTERT-ElA-IRES-E1B con las enzimas de restricción apropiadas. El adenovirus en el cual solamente el cásete de replicación que consiste de hTERT-ElA-IRES-ElB a ser utilizado en la presente invención ha sido integrado se designa "Telomelisin" . Para la expresión del gen El necesario para la proliferación de adenovirus bajo el control del promotor hTERT, es posible proliferar el virus en una forma específica de célula cancerosa .
En el virus recombinante utilizado como reactivo de la presente invención, también se incluye un cásete de marcación junto con el cásete de replicación. El "cásete de marcación" se integra en la región E3 del genoma viral .
Aquí, se debe observar que la función principa], del vector del virus utilizado en la presente invención es citotoxicidad a través de replicación viral. Por consiguiente, con el fin de utilizar el reactivo de la presente invención para el propósito de diagnosticar tejidos de cáncer la ocurrencia de la citotoxicidad es preferible tan lejana como sea posible. Esto es debido a que la emisión de la fluorescencia causada por la replicación del virus recombinante de la presente invención desaparece cuando las células se destruyen, y se hace difícil identificar el sitio del tejido micrócanceroso .
Por el otro lado, E3A y E3B existen en la región E3 del adenovirus, y el ADP de 11.6 kDa (proteína de muerte de adenovirus) en la región E3A y en una función de promover la citotoxicidad y la dispersión viral.
Por consiguiente, en el virus recombinante utilizando en la presente invención, las regiones genómicas virales codifican proteínas con una función para promover la citotoxicidad y la dispersión viral (tal como la región E3 que codifica ADP) se eliminan para por lo tanto retrasar el momento de la muerte de la célula y facilita la identificación de las células cancerosas a través de la emisión de fluorescencia GFP o similares.
La proteína de marcación que constituye el c sete de marcación es una proteína que emite luz en aquellas células en donde el virus anteriormente descrito ha replicado, y, se visualiza. Preferiblemente, se utiliza una sustancia que emite fluorescencia. Ejemplos de dichas sustancias incluyen, pero no se limitan a, la proteína verde fluorescente (GFP, por sus siglas en inglés) derivada de medusa luminiscente tal como Aequones victoria, GFP humanizado mejorado (EGFP) , o GFP de cambio rojo (rsGFP) , que son variantes modificadas de GFP (variantes GFP) . También es posible utilizar la proteína amarilla fluorescente (YFP, por sus siglas en inglés) , proteína fluorescente cian (CFP, por sus siglas en inglés) , proteína fluorescente azul (BFP, por sus siglas en inglés), o GFP derivada de Renilla reniformis.

Un gen que codifica cualquiera de estas proteínas puede utilizarse en la presente invención.
Un promotor capaz de regular la expresión del gen anteriormente descrito puede ser cualquier promotor en cuanto sea compatible con el virus que se va a utilizar para la expresión del gen anterior de interés. Los ejemplos específicos de dichos promotores incluyen, pero no se limitan a, el promotor de citomegalovirus (CMV) , el promotor hTERT, el promotor anterior SV40, el promotor MMTV LTR, el promotor RSV LTR, y el promotor SRα. Preferiblemente, se pueden utilizar el promotor CMV o el promotor hTERT.
El gen recombinante contenido en el cásete de marcación de la presente invención se puede obtener a través de técnicas de ingeniería genética convencionales. Por ejemplo, como una técnica de ingeniería genética, se puede utilizar un método de síntesis de ácido nucleico con un sintetizador de ADN comúnmente utilizado. Alternativamente, después de que se aisla o se sintetiza una secuencia genética que se va a utilizar como plantilla, los iniciadores específicos para cada gen pueden designarse y la secuencia genética se puede amplificar con un aparato PCR (método PCR; Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley Sons (1987), Sección 6.1-6.4); o se puede utilizar un método de amplificación de gen utilizando un vector de clonación. Un experto en la técnica puede fácilmente llevar a cabo los métodos anteriores de acuerdo con, por ejemplo, Molecular Cloning 2a. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). La purificación del producto PCR resultante se puede llevar a cabo a través de métodos conocidos tales como el método que utiliza bromuro de etidio, un método que utiliza Verde I SYBR (Molecular Probes), un método con GENECLEAN (Funakoshi), QIAGEN (QIAGEN), etc., utilizando gel de agarosa, un método utilizando el filtro de celulosa DEAE, el método de congelar y exprimir o un método utilizando un tubo de diálisis. Cuando se utiliza el gel de agarosa, la producción PCT se somete a electroforesis sobre gel de agarosa y los fragmentos de ADN resultantes se separan del gel y se purifican. Si es necesario, es posible confirmar a través de métodos de secuenciación convencionales que un gen esperado ha sido obtenido. Por ejemplo, se puede utilizar el método de determinación de cadena de didesoxinucleótido (Sanger y otros (1977) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74:5463) o similar para este propósito. Alternativamente, es posible analizar la secuencia con un secuenciador de ADN apropiado (por ejemplo, ABI PRISM; Applied Biosystems) . Subsecuentemente, el gen de esta forma obtenido se digiere con enzimas de restricción conocidas. El gen recombinante es así diseñado de tal forma que el fragmento de ADN digerido, resultante (codificación de la proteína de marcación) se localiza en corriente descendente de un fragmento de gen que codifica el promotor anteriormente descrito. Aquí, se puede utilizar un plásmido transportador pHMll o similar como un plásmido. Los dos genes (para la proteína marcadora y el promotor) se ligan con ligasa de ADN y se insertan en un vector para por lo tanto preparar un gen recombinante para el cásete de marcación.
Como un vector conocido, se pueden utilizar el vector pShuttle, el plásmido derivado de Escherichia coli (tal como pCR4 , pCR2 , pCR2.1, pBR322, pBR325, pUC12 y pUC13); plásmido derivado de Bacillus subtillis (tal como pUBUO, pTP5 y pC194) ; plásmido derivado de levadura (tal como pSHl9 y pSH15); bacteriófago tal como el fago λ; virus de animal tales como retrovirus, virus de vacuna, o baculovirus; pAl-11, pXTl, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo o similar.
Subsecuentemente, se separa un gen recombinante que comprende el cásete de replicación anteriormente descrito y el c sete de marcación con las enzimas de restricción apropiadas y se inserta en un vector de expresión de virus apropiado, para por lo tanto preparar un virus recombinante. Ejemplos de vectores de expresión de virus incluyen adenovirus, retrovirus, virus de vacuna y baculovirus. Como se describió anteriormente, el adenovirus (en particular, el adenovirus de tipo 5) se utiliza preferiblemente. Para la integración del cásete en virus, los métodos tales como electroporación, el método de liposoma, el método de esferoblasto, o el método de acetato de litio se pueden utilizar.
En la presente invención, específicamente, el gen recombinante se puede preparar a través de la inserción de CMV-EGFP-SV40P (A) de pEGFP-Nl (CLONTECH) en el plásmido transportador pHMll, e insertar el fragmento Csp451 de este plásmido en el sitio CLAI del vector pShuttle en el cual se ha integrado phTERT-ElA-IRES-ElB.
En la presente invención, específicamente, una secuencia de una región necesaria se puede separar de las enzimas de restricción del gen recombinante como se preparó anteriormente, e insertarse en un ADN viral tal como el ADN viral Adeno-X utilizando un kit comercial tal como el Sistema de Expresión Adeno-X (CLONTECH) (el producto resultante se designa como "AdenoX-hAIB" )
Este AdenoX-hAIB se lineariza con la enzima de restricción conocida y después se transfiere a células cultivadas, tales como 293 células, para por lo tanto preparar un virus recombinante infeccioso.
Las células cancerosas objetivo a detectarse en la presente invención no están limitadas, se pueden utilizar cualquier clase de células cancerosas. Por ejemplo, se puede utilizar cáncer sólido en cabeza y cuello, estómago, colon grueso, pulmón, hígado, próstata, páncreas, esófago, vejiga, vesícula biliar/ducto biliar, pecho, útero, tiroides, ovario, etc.; o leucemia, linfoma sarcoma, tumor mesenquimal, o similares. La mayor parte de las células cancerosas derivadas de tejidos humanos muestran un aumento en la actividad de telomerasa. La presente invención es capaz de detectar aquellas células cancerosas en general en donde se ha activado la proliferación a través de actividad de telomerasa.
Dicha expresión de telomerasa es extremadamente alta en células cancerosas comparadas con células normales, hTERT se expresa en células cancerosas que contienen telomerasa, y las funciones del cásete de replicación ahí. Como resultado, el virus replica, el cual a su vez aumenta la replicación de la proteína de marcación. De esta forma, la proteína de marcación se expresa y se visualiza.
Por consiguiente, cuando el reactivo de la presente invención no emite fluorescencia en células normales, emite fluorescencia en células cancerosas. De esta forma, es posible observar las células cancerosas visualmente.
Para infectar células con un virus recombinante, se puede utilizar el siguiente método, por ejemplo. Primero, las células tales como células cancerosas humanas de colon grueso SW620, las células cancerosas de pulmón A549 y H1299 se colocan en placas de cultivo, conteniendo un caldo de cultivo apropiado y se cultivan en la presencia de gas C0 a 37 SC. Como el caldo de cultivo, uno que se usa convencionalmente para cultivar células animales se puede utilizar, por ejemplo, DMEM, MEM, o RPMI-1640. Si es necesario, se puede agregar suero, antibióticos, vitaminas o similares al mismo. Al inocular una cantidad específica (0.1-10 MOI (multiplicidad de la infección) , preferiblemente 1 MOI) del virus recombinante de la presente invención, las células cultivadas se infectan. MOI significa una relación entre la cantidad viral (unidad infecciosa) y el número de células cuando una cantidad específica de células cultivadas se infectan con una cantidad específica de partículas virales. MOI se utiliza como un indicador cuando las células se infectan con virus .
Con el fin de confirmar la replicación viral, las células infectadas con el virus se recuperan y el ADN se extrae de ahí. Después, el ADN se somete a PCR en tiempo real utilizando iniciadores dirigidos a un gen apropiado contenido por el virus de la presente invención. De esta forma, es posible el análisis cuantitativo.
Con respecto a la detección de las células marcadas, las células cancerosas se pueden visualizar porque las células en donde se observa la replicación viral emiten una fluorescencia específica (por ejemplo, "fluorescencia verde cuando se utiliza GFP) a través de la exposición a la excitación por luz. Por ejemplo, cuando las células infectadas con virus se observan bajo microscopio de fluorescencia, la emisión de la fluorescencia GFP en las células se puede observar. Para la observación de células infectadas con el paso del tiempo, se puede observar la emisión de la fluorescencia GRP con una cámara CCD.
Para la marcación y detección en tiempo real de células de interés in vivo, el virus recombinante de la presente invención se puede administrar en el cuerpo viviente .
El reactivo de la presente invención se puede aplicar al sitio de la infección tal como es. Alternativamente, el reactivo de la presente invención se puede introducir en el cuerpo viviente (célula u órgano objetivo) a través de cualquier método conocido, por ejemplo, inyección intravenosa, intramuscular, intra-abdominal o subcutánea; inhalación a través de la cavidad nasal, cavidad oral o pulmón; administración oral; administración intravascular utilizando un catéter o similar. Los niveles de dosis se seleccionan apropiadamente dependiendo de la clase de ingrediente activo, la ruta de administración, el objetivo de la administración y la edad, peso del cuerpo, sexo y síntomas y otras condiciones del paciente. Usualmente, los niveles de dosis se pueden seleccionar de tal forma que el virus de la presente invención (ingrediente activo) se administra a una dosis diaria de aproximadamente 106-10u PFU (unidades formadoras de placa) , preferiblemente alrededor de 109-101:L PFU. Esta cantidad se puede administrar una vez al día, o se puede dividir en varias porciones y administrarse varias veces al día.
El reactivo de la presente invención hace posible observar la marca in vivo en tiempo real. De esta forma, el reactivo de la presente invención es ventajoso para uso como un agente de diagnóstico in vivo . Esto es útil en la así llamada cirugía de navegación.
Si se lleva a cabo una extirpación a una amplia escala incluyendo el órgano enfermo en una operación quirúrgica, el paciente que sobrevive esta operación quirúrgica puede gozar de una larga supervivencia. Sin embargo, la tasa de ocurrencia de complicaciones causadas por la operación quirúrgica misma es bastante alta. Además, la pérdida de la función del órgano extirpado inevitablemente tiene influencia en la vida diaria después de la operación quirúrgica. Es importante en el tratamiento del cáncer introducir un tratamiento invasivo bajo para reducir la carga de pacientes mientras se mantiene el resultado remoto de larga supervivencia.
Cuando se busca una operación invasiva baja a través de la minimización del área de extirpación una de las piezas de información requeridas es la presencia o ausencia de nodos linfoides metastáticos. Como un método para obtener esa información, el nodo centinela (SN, por sus siglas en inglés) es de especial atención. SN es el nodo linfoide que primero recibe el flujo linfoide de los tumores, y existe una hipótesis de que la primera micro-metástasis ocurre en el nodo linfoide. Esta hipótesis se denomina la teoría SN. Aunque ya se han iniciado las pruebas clínicas a gran escala en cáncer de pecho principalmente en Europa y en Estados Unidos, ya sea que esta teoría sea o no aplicable a otros tumores sólidos es aún desconocida. El examen apenas ha empezado .
Los sistemas de diagnóstico de cáncer in vivo que utilizan el reactivo de la presente invención son capaces de establecer la tecnología que permite la expresión directa de una proteína fluorescente en células cancerosas e identificar los tejidos de tumor o nodos linfoides positivos a metástasis a través de un sistema de detección de fluorescencia altamente sensible, durante la operación quirúrgica. En otras palabras, la tecnología de "cirugía de navegación" se puede establecer como un método que es más efectivo que SN. El virus recombinante de la presente invención replica en un gran número de células cancerosas que tienen actividad de telomerasa, ya que esas células pueden emitir, por ejemplo, una fuerte fluorescencia verde de GFP.
Para el análisis de los sitios de metástasis del nodo mono-linfoide, se salta alrededor del 10% de metástasis, es decir, se ha reportado que se salta la metástasis incipiente para el segundo grupo o nodos linfoides más remotos sobre el primer grupo de nodos linfoides. Con bise en este reporte, existe un gran número de investigadores que han apuntado hacia el peligro de la navegación SN. Sin embargo, los sistemas de diagnóstico de cáncer in vivo que utilizan el reactivo de la presente invención identifican los tejidos de tumor o nodos linfoides positivos a la metástasis directamente durante la operación quirúrgica en tiempo real y el intervalo de la extirpación se navega. Este sistema es original y hacedor de épocas, y además es extremadamente práctico para un suave avance de la operación quirúrgica. Específicamente, el reactivo de la presente invención se inyecta endoscópicamente en el sitio del tumor (por ejemplo, la mucosa gástrica o del colon grueso, alrededor del cáncer gástrico o cáncer de colon grueso; región interna de los tumores tales como cáncer gástrico, cáncer de colon grueso, cáncer de pulmón, cáncer pancreático) varios días antes de la operación quirúrgica con la misma técnica manual utilizada en la navegación SN. Después, se provee suficiente tiempo de tal forma que el virus se distribuye en los tejidos infiltrados de tumor, los tejidos de tumor metastático y los nodos linfoides que atienden para replicar en sitios de tumor o sitios positivos a metástasis.
Según el tiempo de la cirugía, la luz por excitación para la fluorescencia GFP se proyecta deεde la fuente de luz en el campo quirúrgico después de la ventrotomía, y las imágenes de una cámara 3CCD especial se proyectan en una cara de la pantalla de montaje. A través de la utilización de lentes transmisibles, el campo visual del campo quirúrgico actual también se puede asegurar, y es posible detectar nodos linfoides positivos a la metástasis de imágenes GFP traslapadas. Además, al montar un filtro especial, se hace posible reconocer la fluorescencia con los ojos sin el uso de la cámara.
2. Reactivo para Diagnóstico ex vivo
El reactivo de la presente invención también se aplica a un agente de diagnóstico ex vivo para los propósitos de clasificación. Actualmente, la determinación cuantitativa de marcadores de tumor es el método más común para conocer la presencia del cáncer que no se puede detectar con los ojos o no se puede identificar su foco principal. Sin embargo, los marcadores de tumor no son necesariamente satisfactorios en su especificidad de cáncer. Además, es extremadamente difícil detectar cada especie de cáncer con un solo marcador.
Se ha confirmado que la actividad de telomerasa se incrementa en 85% o más en los tumores malignos humanos, y de esta forma su especificidad de cáncer se cree que es extremadamente alta.
Los diagnósticos de cáncer ex vivo que utilizan el reactivo de la presente invención se puede llevar a cabo, por ejemplo, como se describe a continuación.

Los eritrocitos se remueven de una muestra de sangre completa tomada de un sujeto. Se agrega el reactivo de la presente invención al líquido de suspensión de células restante a una proporción específica (0.1-10 MOI, preferiblemente 1 MOI) y se mezcla en un tubo de ensayo. La mezcla se deja durante un periodo específico de tiempo (por ejemplo 12-48 horas) para promover la infección de las células cancerosas con el virus y la replicación viral resultante. Después, la expresión GFP en la fracción celular se analiza cuantitativamente a través de citometría de flujo. Con el uso de este sistema, se hace posible detectar células sin cáncer presentes en la sangre periférica con alta sensibilidad. Este método se puede utilizar para detectar células sin cáncer presentes en la sangre periférica solamente en una cantidad extremadamente pequeña.
3. Agente para la Inducción de la Muerte Celular y Método para Inducir la Muerte Celular
La presente invención provee un agente inductor de muerte celular, que comprende un virus recombinante en donde un cásete de replicación comprende un promotor de telomerasa humana, un gen ElA, una secuencia IRES, y un gen ElB en este orden se integran en la región El del genoma viral y el cásete de inducción de marcación celular comprende un gen que codifica una proteína asociada con la inducción de la muerte celular y un promotor capaz de regular la expresión del gen que codifica la proteína se integra a región E3 del genoma viral. Preferiblemente, el agente inductor de la muerte celular de la presente invención se utiliza en la terapia de gen para cánceres como un agente para inducir la muerte celular en células cancerosas, y también se puede utilizar para la prevención de la recurrencia, inhibición y/o prevención de metástasis después de la operación quirúrgica de cánceres.
En el cásete inductor de muerte celular del virus recombinante contenido en el agente inductor- de muerte celular de la presente invención, se integra un gen que se opera a través del promotor y codifica una proteína capaz de inducir la muerte celular.
En este cásete inductor de muerte celular utilizado en el virus recombinante, está contenido un gen que codifica una proteína asociada con la inducción de la muerte celular y un promotor capaz de regular la expresión del gen. Por consiguiente, cuando se introduce el agente inductor de la muerte celular de la presente invención en células cancerosas, el virus replica específicamente en las células cancerosas. Como resultado, el nivel de expresión intracelular de la proteína inductora de la muerte celular se incrementa, habilitando la inducción de la muerte celular solamente en las células cancerosas sin dañar las células normales.

Un gen que codifica una proteína asociada con la inducción de la muerte celular se refiere a un gen que codifica una proteína asociada con la inducción de la muerte celular en una célula específica.
Ejemplos específicos de proteínas asociadas con la inducción de la muerte celular incluyen las siguientes proteínas, pero no se limitan a éstas. En la presente invención, un gen que codifica cualquiera de estas proteínas se puede integrar.
Como un ejemplo específico de proteína asociada con inmunidad, se puede dar PA28. PA28 es una proteína que activa las proteasomas intracelulares. Cuando se sobre expresa, esta proteína causa las reacciones inmunológicas y al mismo tiempo inducen la muerte celular. Como un ejemplo específico de proteína que induce apoptosis, se puede dar TRAIL. TRAIL es una molécula que induce la muerte celular apoptótica a través del enlace del receptor en la superficie de la célula. Como un ejemplo específico de proteína asociada con telomerasa, se puede dar AU5. AU5 tiene una secuencia capaz de inducir la muerte celular en las células que tienen actividad de telomerasa .
Los genes para estas proteínas asociados con la inducción de la muerte celular se pueden obtener a través de técnicas de ingería genética convencionales. Por ejemplo, como una técnica de ingeniería genética, se puede utilizar un método de síntesis de ácido nucleico con un sintetizador de ADN comúnmente utilizado. Alternativamente, después de que se aisla o se sintetiza una secuencia genética que se va utilizar como plantilla, los iniciadores específicos para cada gen se pueden designar y la secuencia genética se puede amplificar como un aparato PCR (método PCR; Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987), Sección 6.1-6.4); o se puede utilizar un método de amplificación de gen utilizando un vector de clonación. Un experto en la técnica puede fácilmente llevar a cabo los métodos anteriores de acuerdo con por ejemplo, Molecular Cloning 2a. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) . La purificación de los productos PCR resultantes se puede llevar a cabo a través de métodos conocidos tales como un método que utiliza bromuro de etidio, un método que utiliza SYBR Green I (Sondas

Moleculares) , un método con GENECLEAN (Funakoshi) , QIAGEN

(QIAGEN), etc., utilizando gel de agarosa, un método utilizando un filtro de celulosa DEAE, un método de congelar y exprimir, o un método utilizando un tubo de diá Lisis. Cuando se utiliza el gel de agarosa, los productos PCT se someten a electroforesis sobre gel de agarosa y los fragmentos de ADN resultantes se separan del gel y se purifican. Si es necesario, es posible confirmar a través de métodos de secuenciación convencionales que un gen esperado se ha obtenido. Por ejemplo, se puede utilizar el método de terminación de cadena de didesoxinucleótido (Sanger y otros (1977) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74:5463) o similar para este propósito. Alternativamente, es posible analizar la secuencia con un secuenciador de ADN apropiado (por ejemplo, ABI PRISM; Applied Biosystems) .
Los antioncogenes también se pueden incluir en las sustancias inductoras de la muerte celular para células cancerosas, porque los antioncogenes tienen una función de inhibir la replicación de las células cancerosas. Para este propósito, se pueden enumerar los siguientes antioncogenes utilizados en terapia de gen convencional.
p53 (SEC ID NO: 11; No. de Acceso M14694): varias clases de cánceres.
pl5 (SEC ID NO: 12; No. de Acceso L36844): varias clases de cánceres.
pl6 (SEC ID NO: 13; No. de Acceso L27211): varias clases de cánceres.
APC (SEC ID NO: 14; No. de Acceso M74088) : cáncer de colon grueso, cáncer gástrico, y cáncer pancreático.
BRCA-1 (SEC ID NO: 15; No. de Acceso U14680): cáncer ovárico, cáncer de pecho.
DPC-4 (SEC ID NO: 16; No. de Acceso U44378): cáncer de colon grueso, cáncer pancreático.
FHIT (SEC ID NO: 17; No . de Acceso U44378): cáncer gástrico, cáncer de pulmón, cáncer de útero.

p73 (SEC ID NO: 18; No. de Acceso Y11416) : neuroblastoma .
PATCHED (SEC ID NO: 19; No. de Acceso U59464) : carcinoma de célula basal.
Rbp 110 (SEC ID NO: 20; No. de Acceso M15400): cáncer de pulmón, osteosarcoma.
DCC (SEC ID NO: 21; No. de Acceso X76132): cáncer de colon grueso.
NF1 (SEC ID NO: 22, No. de Acceso NM 000267) neurofibromatosis de tipo 1.
NF2 (SEC ID NO: 23; No. de Acceso L11353): neurofibromatosis de tipo 2.
WT-1 (SEC ID NO: 24; No. de Acceso NM 000378) : tumor de Wilms.
Estos antioncogenes se pueden obtener a través de técnicas de ingeniería genética convencionales. Por ejemplo, como una técnica de ingeniería genética, se puede utilizar un método de síntesis de ácido nucleico con un sintetizador de

ADN comúnmente utilizado. Alternativamente, después que se aisla o se sintetiza una secuencia genética a utilizarse como plantilla, se pueden designar los iniciadores específicos para cada gen y la secuencia genética se puede amplificar con un aparato PCR (método PCR) ; o se puede utilizar un método de amplificación de gen utilizando un vector de clonación. Si es necesario, es posible confirmar a través de métodos de secuenciación convencional que se ha obtenido un gen esperado .
Como un promotor capaz de regular la expresión del gen anterior, se puede utilizar cualquier promotor mientras sea. un promotor apropiado compatible con el virus a utilizarse para la expresión del gen de interés. Preferiblemente, se puede utilizar un promotor CMV o promotor hTERT. Sin embargo, también se pueden utilizar otros promotores tales como el promotor anterior SV40, el promotor MMTV LTR, el promotor RSV LTR y el promotor SRα.
El agente para la inducción de la muerte celular de la presente invención se puede aplicar al sitio enfermo como tal. Alternativamente, el agente de la presente invención se puede introducir en un cuerpo viviente (célula u órgano objetivo) a través de cualquier método conocido, por ejemplo, inyección intravenosa, intramuscular, intra-abdominal, o subcutánea; inhalación a través de la cavidad nasal, cavidad oral o pulmón; administración oral; administración intravascular utilizando un catéter o similar.
El agente inductor de la muerte de celular de la presente invención se puede tratar, por ejemplo, a través de un método tal como congelamiento para habilitar el fácil manejo y después utilizarse solo, o prepararse en composiciones farmacéuticas mezclado con portadores farmacéuticamente aceptables tales como excipientes, llenadores, aglutinantes, lubricantes; o aditivos conocidos (incluyendo reguladores de pH, agentes isotónicos, agentes de quelatación, agentes de coloración, conservadores, fragancias, agentes saborizantes, y agentes edulcorantes).
El agente inductor de la muerte celular de la presente invención se puede administrar oralmente o parenteralmente dependiendo de la forma del agente, por ejemplo, agentes de administración orales tales como tabletas, cápsulas, polvos, granulos, pildoras, líquidos, jarabes, etc., y agentes de administración parenteral tales como inyecciones, medicinas externas, supositorios, gotas para los ojos, etc. Preferiblemente, se pueden enumerar la inyección local en el músculo o cavidad abdominal, o la inyección intravenosa.
Los niveles de dosis se seleccionan apropiadamente dependiendo de la clase de ingrediente activo, la ruta de administración, el objetivo de la administración, y la edad, peso corporal, sexo y síntomas y otras condiciones del paciente. Usualmente, los niveles de dosis se pueden seleccionar de tal forma que el virus de la presente invención (ingrediente activo) se administra a una dosis diaria de aproximadamente 106-1011 PFU (unidades formadoras de placa) , preferiblemente alrededor de 109-10u PFU. Esta cantidad se puede administrar una vez al día, o se puede dividir en varias porciones y administrarse varias veces al día.
Cuando el virus de la presente invención se administra, también es posible utilizar un inmunosupresor conocido o similar para suprimir la inmunidad del cuerpo
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viviente para por lo tanto hacer la infección viraL más fácil .
Además, el virus de la presente invención se puede utilizar conjuntamente por lo menos con un agente anticáncer, seleccionado del grupo que consiste de agentes anti-cáncer y radiación. Los ejemplos específicos de agentes anticáncer incluyen, pero no se limitan a, los siguientes agentes .
(1) Agentes de alquilación: Estos agentes tienen un efecto de causar citotoxicidad a través de la introducción de grupos alquilo en el ácido nucleico/proteína de las células cancerosas. Los ejemplos incluyen carbocuona, busulfan (fármacos de mostaza) y nimustina (nitrosoureas) .
(2) Agentes antimetabólicos : Estos agentes tienen un efecto de inhibir la síntesis celular a través de de enzimas antagonizantes en procedimientos metabólicos. Los ejemplos incluyen metotorexato (folatos) , mercaptopurina (purina), citarabina (pirimidina), fluorouracilo, tegafur y carmofur.
(3) Antibióticos: Estos agentes tienen un efecto anti-cáncer. Los ejemplos incluyen actinomicina D, bleomicina, adriamicina y mitomicina C.
(4) Agentes antimicrotúbulo : Estos agentes actúan sobre los microtúbulos y exhiben un efecto anti-cáncer. Los ejemplos incluyen docetaxel, paclitaxel (taxanos) y vinorelbina, vincristina, vinblastina (alcaloides) .
(5) Preparaciones de platino: Estas preparaciones tienen un efecto de inhibir la síntesis de ADN a través de la formación de entrelazamientos de estructura de cadena intra-o inter-ADN o entrelazamientos de proteína ADN. Ejemplos incluyen cisplatina, carboplatina y nedaplatina.
(6) Inhibidores de topoisomerasa: se pueden enumerar Irinotecan (el inhibidor de topoisomerasa I) , derivados de podofilotoxina (el inhibidor de topoisomerasa II) y similares. La topoisomerasa es una enzima que cataliza una reacción de cambiar el número de enlace del ADN a t.ravés del corte temporal de una o ambas estructuras de cadena de ADN.
Se cree que existe una extremadamente baja posibilidad de que el agente inductor de la muerte celular de la presente invención produzca efectos secundarios por las razones descritas a continuación. De esta forma, el oigente inductor de la muerte celular de la presente invención puede ser una preparación muy segura.
(1) Existe muy poca actividad de telomerasa en células somáticas normales, y aún el virus de la presente invención es difícil que sea infeccioso en células de suspensión tales como células hematopoyéticas .
(2) Ya que el virus de la presente invención tiene la habilidad de replicación, es posible utilizar este virus a una concentración más baja que aquella del virus competente no de replicación convencional utilizado en terapia de gen convencional .
(3) Aún cuando el virus de la presente invención ha sido administrado en exceso, la acción antiviral trabaja a través de la reacción inmune normal en el cuerpo viviente.
Es posible inducir la muerte celular en una célula objetivo infectando la célula objetivo con el virus recombinante de la presente invención. Las clases de células objetivo no están particularmente limitadas. Por ejemplo, se pueden utilizar células de tumor, células con replicación activa, células cuya actividad de telomerasa se ha incrementado, o similares.
La expresión "infectar células con virus recombinante" significa lo que se describió anteriormente. Con el fin de confirmar si la muerte celular ha sido inducida o no, se puede llevar la cabo la observación morfológica como se describe a continuación. En resumen, las células que se adhieren a la parte inferior del plato de cultivo se infectan con el virus recombinante de la presente invención. Después de un periodo de tiempo específico, la forma de las células se hace circular y se suspenden en el caldo del cultivo como células brillantes desprendidas de la parte inferior. En este punto, el mecanismo que mantiene la vida en estas células ha sido interrumpido, y se puede medir que la muerte celular ha sido inducida. Alternativamente, también es posible confirmar la muerte celular con un kit de ensayo de célula comercialmente disponible utilizando sales de tetrazonio (por ejemplo, MTT, XTT) .
A continuación, se describirá la presente invención con mayor detalle con referencia a los siguientes ejemplos, sin embargo, la presente invención no está limitada a estos Ejemplos .

EJEMPLO 1
Visualización de Células Cancerosas a través de Coinfección in vi tro
Este Ejemplo preliminarmente examina si se emitirá o no la fluorescencia in vi tro cuando las células cancerosas están co-infectadas con el virus de Telomelisin que comprende el cásete de replicación y el virus Ad-GFP no de replicación que comprende el cásete de marcación.
La célula cancerosa de colon grueso humano SW620 y las células cancerosas humanas de pulmón A549 y H1299 se infectaron con 0.1 MOI (multiplicidad de infección) de Ad-GFP (FIG. 2) .

Como resultado, fue altamente reconocida la tendencia al color verde cuando las células cancerosas en colon grueso humana SW620 y H1299 fueron infectadas con 0.1 MOI de Ad-GFP. Sin embargo, cuando solamente se utilizó conjuntamente 1 MOI de TRAD, la fluorescencia podría solamente detectarse en células cancerosas, y no se detectaría fluorescencia en células normales tales como células de fibroblasto W138 y NHLF y célula endotelial vascular umbilical humana (HUVEC) (FIG. 3) .

EJEMPLO 2
Visualización de Tejidos Cancerosos mediante Co-Infección in vivo con Telomelisin y Ad-GF

Este Ejemplo preliminarmente examinó si. la fluorescencia será emitida o no in vivo cuando los tejidos cancerosos son co-infectados con el virus que comprende el cásete de replicación y el virus no de replicación Ad-GFP que comprende el cásete de marcación.
Se administraron intratumoralmente Ad-GFP (8x'L05 de PFU) y TRAD (8xl06 de PFU) a tumores de cáncer de colon grueso humano SW5620 y cáncer de pulmón humano A549 trasplantados subcutáneamente en la espina dorsal de ratones desnudos .

Después se observó la fluorescencia con el paso del tiempo.

EJEMPLO 3
Detección de Células cancerosas con Telomelisin-GFP

1. La preparación del Virus Competente de

Replicación, que Expresa GFP (Telomelisin-GFP) que comprende el Cásete de Replicación con el Promotor de Telomerasa y el

Gen El y el Cásete de Marcación que comprende el Gen que codifica GFP en un solo Virus.
La descripción de Telomelisin-GFP se muestra en la FIG. 1. Telomelisin-GFP prolifera/replica la célula cancerosa específicamente y telomerasa específicamente porque ElA/ IRES /ElB se opera a través del promotor hTERT. Además, Telomelisin-GFP también tiene un gen GFP derivado de Aequorea victoria integrado en su región E3 que se opera por un promotor. Por consiguiente, las células en donde se observó la replicación viral emiten fluorescencia verde cuando se aplica luz de excitación, lo que habilita la visualización de células cancerosas.
Tal virus incompetente en cuanto a replicación se preparó como se describe a continuación.
2. Preparación del Virus Recombinante
Un gen ElA gene de 897 bp se amplificó a partir de

ARN extraído de 293 células a través de RT-PCR utilizando los siguientes iniciadores específicos (ElA-S y ElA-AS) y las condiciones PCR descritas a continuación.
ElA-S: 5 ' -ACÁ CCG GGA CTG AAA ATG AG-3' (SEC ID NO: 5)
ElA-AS: 5' -CAC AGG TTT ACÁ CCT TAT GGC-3'(SEC ID NO : 6 ) .
Composición de la solución PCR:
lx regulador de pH PCR
0.2 mM de cada dNTP
5 mM de MgCl2
2.5 U DE AmpliTaq Gold
0.2 μM de cada Iniciador
Condiciones de la Reacción:
95°C. , 1 min:
95 °C , 1 min ; 56°C , 1 min ; 72 °C , 1 . 5 min) x32
ciclos
72 °C . , 7 min
4 °C . , 5 min
A partir de AND extraído de 293 células, se amplificó el ElB gene de 1822 bp a través de ADN-PCR utilizando los siguientes iniciadores ElB-S y ElB-AS.
ElB-S: 5 ' -CTG ACC TCA TGG AGG CTT GG-3 ' (SEC IDNO : 7 )
ElB-AS: 5' -GCC CAC ACÁ TTT CAG TAC CTC-3'(SEC ID NO: 8)
La composición de la solución y las condiciones de reacción utilizadas fueron iguales a las utilizadas para la amplificación del gen ElA.

Cada producto de PCR se sometió a clonación TA (kit de Clonación TA de Promotor Doble; Invitrogen) para por lo tanto confirmar sus secuencias. Después se eliminaron los fragmentos de ADN de 911 bp (ElA) y 1836 bp (ElB) , respectivamente, con la enzima de restricción EcoRI .
Se insertaron ElA y ElB en el sitio Mlul y el sitio Salí, respectivamente, del vector pIRES (CLONTECH) en la orientación normal (E1A-IRES-E1B) .
Se insertó una secuencia del promotor hTERT de 455 bp que había sido eliminado con la enzima de restricción Mlul y Bglll en el sitio Xhol localizado en corriente ascendente del ElA de E1A-IRES-E1B en la orientación normal (phTERT-ElA- IRES-E1B) .
El promotor de citomegalovirus (CMV) contenido en vector pShuttle se removió a través del tratamiento con las enzimas de restricción Mfel y Nhel. Después se insertó una secuencia de 3828 bp eliminada de phTERT-ElA-IRES-ElB utilizando las enzimas de restricción Nhel y Notl en ese sitio (pSh-hAIB) .
Se disolvió pEGFP-Nl (CLONTECH) con Agel/Nhel, de extremo romo, con el fragmento Klenow y se auto-ligó (pGFP-N2) .
Esta pEGFP-N2 se disolvió con Nsil/AflII y se hizo roma en el extremo con polimerasa de ADN T4 , seguido por preparación de un sitio Bglll utilizando el enlazador Bglll.

Este fragmento Bglll se insertó en el sitio BamHl de pHMll (pHMll-EGFP-N2) .
Además, el fragmento Csp45I de pHMll-EGFP-N2 se insertó en el sitio Clal del vector pShuttle en donde se había integrado (pSh-hAIB) .
Se eliminó una secuencia de 4381 bp de gen recombinante recién preparado (pSh-hAIB) utilizando las enzimas de restricción I-Ceul y Pl-Scel, y se insertó en el ADN viral Adeno-X Viral ADN del Sistema de Expresión Adeno-X (CLONTECH) (AdenoX-hAIB) . Este AdenoX-hAIB se trató con enzima de restricción Pacd para la linearización y después se transfectó en 293 células para por lo tanto preparar un adenovirus recombinante infeccioso (de aquí en adelante, referido como "Telomelisin-GFP").

EJEMPLO 4
Prueba de Detección en Células Cancerosas Humanas de Pulmón.
1. Cambios Morfológicos en Células Cancerosas Humanas de Pulmón Causados por Infección con Telomelisin-GFP

Se infectaron células H1299 derivadas de cáncer de pulmón no pequeñas humanas cultivadas in vi tro con

Telomelisin-GFP a 1 MOI o 10 MOI. Específicamente, las células H1299 se colocaron en placas en places de 24 cavidades a 5xlOμ células/cavidad. Después de 24 horas, las células se contaron y el virus se agregó al caldo del cultivo para dar una concentración de 1 MOI o 10 MOI. Subsecuentemente, se observó la morfología de las células bajo microscopio inverso con el paso del tiempo para examinar la actividad citotóxica del virus.
Como resultado, se indujo la muerte celular mediante replicación viral en una forma dependiente de la concentración y también dependiente del tiempo. Después de 120 horas después de la infección con 10 MOI, la mayor parte de las células se hizo circular y se suspendieron bajo microscopio invertido (FIG. 5).
2. Expresión de Fluorescencia GFP en Células Cancerosas Humanas de Pulmón Causada por Infección con Telomelisin-GFP
Las imágenes de microscopio invertidas mostradas en la FIG. 6 se observaron bajo microscopio fluorescente. La fluorescencia verde de GFP indicó la replicación viral en una forma dependiente de la concentración y también dependiente del tiempo (FIG. 6). Después de 72 -horas de la infección con 10 MOI, se observó la expresión GFP en el número de células máximo. Después, el número de células positivas a GFP disminuyó según se indujo la muerte celular (FIG. 6).
3. Verificación de la Replicación Telomelisin-GFP a través de PCT en Tiempo Real Cuantitativa.
La célula humana de cáncer de pulmón H1299 se infectó con Telomelisin-GFP a 10 MOI. Las muestras celulares se cosecharon a 2, 26, 50 y 74 horas después de la infección y el ADN se extrajo de ahí Se realizó PCR en tiempo real utilizando los siguientes iniciadores enfocados hacia el gen ElA de Telomelisin-GFP, para por lo tanto analizar cuantitativamente la proliferación/replicación viral. Los iniciadores y condiciones PCR utilizadas se describen a continuación .
ElA-S: 5' -CCT GTG TCT AGA GAA TGC AA-3 ' (SEC ID NO : 9 ) ElA-AS: 5 ' -ACÁ GCT CAA GTC CAA AGG TT-3'(SEC ID

NO: 10)
Composición de la Solución PCR:
lxLC de Verde I SYBR de AND principal
FastStart
3 mM de MgCl2
0.5 μM de cada Iniciador
Condiciones de Reacción:
95°C. , 10 min
95°C, 10 sec; 60°C, 15 sec; 72°C, 8
sec)x 40 ciclos
70°C. , 15 sec
40° C. , 30 sec
Los resultados revelaron que Telomelisin-GFP ya había replicado 1,000,000 veces a las horas después de la infección (FIG. 7) . A continuación, la replicación alcanzó el límite , pero la f luorescencia GFP también se mej oró gradualmente en forma ligera después de la replicación (FIG. 7) .

EJEMPLO 5
Prueba de Detección en Células Humanas Cancerosas de Intestino Grueso.
1. Emisión de fluorescencia GFP en Células Cancerosas Humanas en el Intestino Grueso Causada por la Infección con Telomelisin-GFP.
Se infectaron células SW620 derivadas de cáncer de colon grueso humano con Telomelisin-GFP a 10 MOI. Los cambios en las células se observaron con el paso del tiempo bajo microscopio invertido y microscopio fluorescente.
Como resultado se reconoció, la fluorescencia verde GFP indicando la replicación viral en una forma dependiente del tiempo como en el caso de células H1299 (FIGURA 8) .
2. Verificación de Replicación de Telomelisin-GFP a través de PCR en tiempo real Cuantitativa.
Se infectaron células de colon grueso humanas SW620 con Telomelisin-GFP en la misma forma que para las células H1299. Las muestras celulares se cosecharon a 2, 26, 50, 74 y 98 horas después de la infección y se extrajo el ADN de ahí. Se realizó PCR en tiempo real, utilizando iniciadores enfocando el gen ElA de Telomelisin-GFP, para por lo tanto analizar cuantitativamente la replicación viral. Las condiciones de PCR en tiempo real (composición de la solución de reacción, ciclo, período de tiempo, etc.) fueron iguales que en las células H1299.
Los resultados revelaron que Telomelisin-GFP ya había replicado 1,000,000 veces a las 26 horas después de la infección y casi alcanzó el límite a las 98 horas después de la infección (FIG. 9) .

EJEMPLO 6
1. Cambio Morfológico en Células Humanas de

Fibroblasto de Pulmón (NHLF) Causado por Infección con Telomelisin-GFP
Se infectaron células humanas de fibroblasto de pulmón (NHF) in vi tro con Telomelisin-GFP a 1 MOI o 10 MOI. Los cambios se observaron bajo microscopio invertido hasta las 120 horas después de la infección.
Como resultado, no se observó ningún cambio morfológico, y la muerte celular no se indujo (FIG. 10) .
2. Expresión de Fluorescencia GFP en Células Humanas de Fibroblasto de Pulmón Normales Causada por la Infección con Telomelisin-GFP
Cuando se observaron las imágenes de microscopio invertido mostradas en la FIG. 10 bajo microscopio fluorescente, se observó la expresión de la fluorescencia GFP en algunas células. Sin embargo, considerando la densidad celular, la expresión fue extremadamente rara comparada con aquellas de las células cancerosas. Por consiguiente, se cree que Telomelisin-GFP difícilmente prolifera/replica en células normales (FIG. 11) .
3. Verificación de la Replicación de Telomelisin- GFP a través de PCR en Tiempo Real Cuantitativa.
Se infectaron la célula humana H1299 de cáncer de pulmón, la célula humana de cáncer de colon grueso SW620 y la célula humana de fibroblasto de pulmón (NHLF) con Telomelisin-GFP a 10 MOI como se describió anteriormente. Las muestras de célula se cosecharon con el paso del tiempo, y el ADN se extrajo de las mismas. Después se analizó cuantitativamente la replicación a través de PCR en tiempo real .
Los resultados revelaron que Telomelisin-GFP ya había replicado alrededor de 1,000,000 veces en células cancerosas a las 24 horas después de la infección, y emitido una fluorescencia GFP notable a las 72 horas después de la infección (FIG. 12) . Por otro lado, la replicación fue solamente de aproximadamente 1000 veces en células NHFL aún a las 72 horas después de la infección, se pudo detectar muy poca fluorescencia GFP (FIG. 12).

EJEMPLO 7
Detección de Proliferación/Replicación Intratumoral de Telomelisin-GFP a través de Formación de Imágenes de Fluorescencia.
1. Se administró Telomelisin-GFP (107 PFU) en el tumor de cáncer de pulmón humano H1299 trasplantado en ratones desnudos. Después, se observó la fluorescencia GFP con una cámara CCD con el paso del tiempo.
Los resultados revelaron que la emisión de la fluorescencia GFP empezó a reconocerse dentro de las 24 horas después de la infección, y que la escala y la luminancia mejoraron gradualmente a los 3 días y 5 días después de la infección (FIG. 13) .
2. Se administró Telomelisin-GFP (107 PFU) en la misma forma descrita anteriormente en el tumo de cáncer de pulmón humano H1299 trasplantado en ratones desnudos. Una y tres semanas antes de la infección, se removió el tumor subcutáneo. La emisión de fluorescencia GFP se observó en el tumor completo y en una superficie de corte utilizando una cámara CCD.
Como resultado, aún cuando la emisión de fluorescencia fue débil en la superficie del tumor removido, la replicación de Telomelisin-GFP pudo confirmarse en una amplia escala de la superficie del corte (FIG. 14). En los tejidos se reconoció tres semanas después de la infección en casi todos sobre el tumor (FIG. 14) .
3. En la misma forma descrita anteriormente, la 5

célula humana de cáncer de colon grueso HT29 se trasplantó en la pared rectal de ratones desnudos como un modelo ortotópico, y se administró Telomelisin-GFP (107 PFU) en el momento en que se formó el tumor grave. La emisión de la fluorescencia GFP causada por la replicación de Telomelisin-GFP empezó a reconocerse una semana después de la infección con una cámara CCD (FIG. 15). The fluorescence expression was maintained even three weeks after the infection (FIG. 15) .

EJEMPLO 8
1. Análisis Histológico del Modelo de Cáncer Rectal Ortotópico Utilizando Ratones Desnudos y Célula Humana de Cáncer de Intestino Grueso
Se trasplantaron células humanas de cáncer de colon grueso HT29 en la pared rectal de ratones desnudos. Cuando se formó el tumor severo, el tumor se removió y se analizó después de la tinción con hematoxilina-eosina (HE) .
Como resultado, se formó el tumor alrededor del recto, y la masa celular del tumor pudo confirmarse en vasos linfoides en la pared rectal (FIG. 16) .
2. Hallazgos de Ventrotomía en el Modelo de Cáncer Rectal Ortotópico Utilizando Ratones Desnudos y Célula Humana de Cáncer en el Intestino Grueso
Se trasplantaron células humanas de colon grueso HT29 en la pared rectal, y se realizó la ventrotomía cuando se formó el tumor severo. Como resultado, se reconoció una hinchazón en tres nodos linfoides (LN) alrededor de la aorta (FIG. 17)
3. Detección de la Proliferación/Replicación Intratumoral de Telomelisin-GFP Tumor Rectal HT29 y Nodos

Linfoides Para-Aórticos a través de Formación de Imágenes de Fluorescencia .
La emisión de fluorescencia GFP se reconoció a través de formación de imágenes de fluorescencia con una cámara CCD, en el tumor rectal HT29 trasplantado y uno de los tres nodos linfoides para-aórticos (FIG. 18).
4. Detección de Proliferación/Replicación Intratumoral de Telomelisin-GFP en Nodos Linfoides Para-Aórticos a través de Formación de Imágenes de Fluorescencia.
La emisión de fluorescencia GFP se reconoció a través de formación de imágenes de fluorescencia con una cámara CCD, en solamente uno de los tres nodos liníoides para-aórticos (FIG. 19).
5. Detección de Proliferación/Replicación Intratumoral de Telomelisin-GFP en Nodos Linfoides Para-Aórticos mediante Formación de Imágenes de Fluorescencia.
El análisis histológico de nodos linfoides para-aórticos detectó el tejido de tumor metastático en solamente un nido linfoide que se encontró como positivo para fluorescencia GFP a través de formación de imágenes de fluorescencia. De esta forma, se confirmó que la Telomelisin-GFP replica solamente en nodos linfoides positivos a metástasis (FIG. 20) .

REFERENCIAS
Reid T, Galanis E, Abbruzzese J, Sze D, Wein L M,

Andrews J, Randlev B, Heise C, Uprichard M, Hatfield M, Rome

L, Rubin J, Kirn D. Hepatic arterial infusión of a replication-selective oncolytic adenovirus (dll520): phase II viral, immunologic, y clinical endpoints. Cáncer Res 62 (21): 6070-9, 2002.

TEXTO LIBRE DE LISTADO DE SECUENCIAS

SEC ID NO: 5: Iniciador
SEC ID NO: 6: Iniciador
SEC ID NO: 7: Iniciador
SEC ID NO: 8: Iniciador
SEC ID NO: 9: Iniciador
SEC ID NO: 10: Iniciador
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.