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1. (KR1020010012802) TRITERPENE SAPONIN ANALOGS HAVING ADJUVANT AND IMMUNOSTIMULATORY ACTIVITY
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명 세 서
면역보강성 및 면역자극 활성을 갖는 트리테르펜 사포닌 유사체 {TRITERPENE SAPONIN ANALOGS HAVING ADJUVANT AND IMMUNOSTIMULATORY ACTIVITY}
기 술 분 야
본 발명은 면역보강제과 면역자극제 분야에 속한다. 보다 구체적으로 본 발명은 신규한 트리테르펜 사포닌-친유기 복합체에 관한 것이다.
발명이 속하는 기술 및 그 분야의 종래기술
사포닌은 2차 대사물질로서 생성되는 글리코시드 화합물이다. 그것들은 고등 식물 및 극피동물문의 몇몇 해양 무척추동물 중에 널리 분포되어 있다 (압시몬(ApSimon) 등, Stud. Org. Chem. 17:273-286 (1984)). 그것들의 항미생물 활성 때문에, 식물성 사포닌은 미생물, 특히 균류에 대해 효과적인 화학 방어제이다(Price 등, CRC Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 26:27-135(1987)). 사포닌은 많은 해양 무척추동물의 독성의 원인이다. 사포닌 화학 구조는 소정의 강력하고 효율적인 면역학적 활성을 포함하여, 광범위한 약리학적, 생물학적 활성을 부여한다. 또한, 이런 종류의 화합물군에 속하는 것들은 기포성(확인할 수 있는 특성), 계면활성(이로 인해 용혈 활성을 나타냄), 콜레스테롤 결합, 진균 독성, 연체동물 박멸, 피임, 성장 지체, 거담, 항염증, 진통, 항바이러스, 심혈관, 효소 억제 및 항암 활성을 갖는다(Hostettmann, K. 등, Methods Plant Biochem. 7:435-471(1991); Lacaille-Dubois, M.A. & Wagner, H., Phytomedicine 2:363-386(1996); Price, K.R. 등, CRC Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 26:27-135(1987)).
구조적으로, 사포닌은 하나 이상의 당 사슬(sugar chain)에 부착된 임의의 아글리콘(사포게닌)으로 구성된다. 어떤 경우에, 사포닌은 그 구조의 일부로서 아세트산, 말론산, 안젤산 등의 유기산으로 아실화될 수 있다(Massiot, G.& Lavaud, C., Stud. Nat. Prod. Chem. 15:187-224(1995)). 이 복합 구조체는 600 내지 2,000 달톤 이상 범위의 분자량을 갖는다. 그것들의 소수성(아글리콘)부와 친수성(당(sugar))부의 비대칭 분포는 이 화합물들에게 세제 유사성의 원인이 되는 양친매성을 제공한다. 결과적으로, 사포닌은 동물 세포막의 콜레스테롤 성분과 상호작용하여 구멍을 형성함으로써 혈액 세포의 용혈과 같은 막 파열 및 세포 사멸을 초래한다.
트리테르펜 글리코시드
올레노산
스테로이드 글리코시드
사포게놀
알칼로이드 글리코시드
토마티딘
상기에 나타낸 바와 같이 그들의 아글리콘 조성에 따라 사포닌을 분류할 수 있다:
1. 트리테르펜 글리코시드
2. 스테로이드 글리코시드
3. 스테로이드 알칼로이드 글리코시드.
스테로이드 알칼로이드 글리코시드 또는 글리코알칼로이드는 스테로이드 글리코시드와 물리적, 생물학적 특성을 많이 공유하지만, 일반적으로 알칼로이드 글리코시드는 그 스테로이드 구조가 질소를 포함하기 때문에 분리해서 생각한다. 종종, 아글리콘은 히드록시메틸, 알데히드 또는 카르복실기로 산화될 수 있는 메틸 치환체를 가지며, 이 부분은 사포닌의 소정의 생물학적 활성을 나타내는 역할을 할 수 있다. 사포닌의 광범위한 연구로부터, 트리테르펜 사포닌이 자연에서 가장 탁월한 것일뿐만 아니라 가장 흥미로운 생물학적 및 약리학적 특성를 갖는 것이라는 것이 명백하다.
사포닌은 글리코시드 에테르 또는 에스테르 결합을 통해 아글리콘에 부착된 하나 이상의 선형 또는 분지된 당 사슬을 갖는다. 몇몇 사포닌에서, 아실화된 당의 존재도 검출되었다. 아글리콘에 부착된 당 사슬의 수에 따라, 사포닌은 모노데스모시딕 사포닌(monodesmosidic saponin)(단일 당 사슬을 보유함), 또는 바이데스모시딕 사포닌(bidesmosidic saponin)(두개의 당 사슬)일 수 있다. 모노데스모시딕 사포닌에서, 통상적으로 당 사슬은 아글리콘의 C-3에서 글리코시드 에테르 결합에 의해 부착된다. C-3 결합된 당 사슬뿐만 아니라, 바이데스모시딕 사포닌은 에스테르 결합에 의해서 C-28(트리테르펜 사포닌) 또는 C-26(스테로이드 사포닌)에 결합된 2차 당 사슬을 갖는다. 일반적으로 에스테르의 불안정성 때문에, 바이데스모시딕 사포닌은 통상 가수분해에 의해 모노데스모시딕 형태로 전환되기 쉽다(Hostettmann, K. 등, Methods Plant Biochem. 7:435-471 (1991))(도 2). 모노데스모시딕 사포닌이 그것의 바이데스모시딕 형태보다 식물중에서 훨씬 더 생물학적 활성이 있다는 것이 명백하다. 예를 들어, 헤데라 헬릭스에서 바이데스모시딕 헤데라사포닌 C의 그것의 모노데스모시딕 형태(α-헤데린)로의 효소적 전환은 높은 항생 활성을 가진 생성물을 형성한다(Wagner, H.& Horhammer, L., Pharmacognosy and Phytochemistry, Spring-Verlag, Berlin(1971)). 또한, 일반적으로 모노데스모시딕 사포닌은 바이데스모시딕 사포닌 보다 용혈성이 더 큰 경향이 있다. 이 성질은 그것의 항진균 활성과 깊은 관련이 있는 것으로 보인다. 진균의 막과 결합된 스테롤과 상호작용함으로써 사포닌은 세포막의 침투성을 변화시켜 유기체를 죽게 만든다고 생각된다(Price, K.R. 등, CRC Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 26:27-135(1987)). 결과적으로 식물의 병인성 진균의 숙주 범위는 숙주 유기체의 사포닌을 효소적으로 해독시키는 능력에 의해 기능적으로 결정되는 것 같다(Bowyer, P. 등, Science 267:371-374 (1995)). 하지만, 아실화된 퀼라야 사포닌은 그것의 모노데스모시딕 형태가 그것들의 아실화된 바이데스모시딕 형태와 비아실화된 바이데스모시딕 형태보다 상당히 효과가 낮은 용혈제이기 때문에 예외적인 것 같다(Pillion, D.J. 등, J.Pharm.Sci.,84:1276-1279(1996)). 바이데스모시딕 사포닌은 생물학적으로 활성이 있는 모노데스모시딕 형태가 식물의 방어에 필요할 때까지 대부분 이 화합물들의 저장 및/또는 전달에 유용한 형태로 작용한다(Hostettmann, K. 등, Methods Plant Biochem. 7:435-471(1991); Osbourn, A.E. 등, Adv. Exp. Med. Biol., 404:547-555 (1996)). 반대로, 동물에서 바이데스모시딕 사포닌은 식물 생리학의 어떤 측면과도 완전히 무관한 강력한 생물학적 약리학적 활성을 가질 수 있다.
퀼라야 사포나리아 몰리나 나무(퀼라야사포닌)의 바크(bark)에서 유래한 사포닌 면역보강제는 화학적으로 그리고 면역학적으로 특성이 잘 규명된 생성물이다 (Dalsgaard, K. Arch. Gesamte Virusforsch. 44:243 (1974); Dalsgaard, K. Acta Vet. Scand. 19 (Suppl. 69):1 (1978); Higuchi, R. 등, Phytochemistry 26:229 (1987); ibid. 26:2357 (1987); ibid. 27:1168 (1988); Kensil, C. 등, J. Immunol 146:431 (1991); Kensil 등, 미국 특허 제5,057,540호 (1990); Kensil 등, Vaccines 92:35 (1992); Bomford, R. 등, Vaccine 10:572 (1992); 및 Kensil, C 등, 미국 특허 제5,273,965 (1993)).
사포닌 면역보강제는 밀접하게 관련된 O-아실화된 트리테르펜 글리코시드 구조의 부류이다. 그것들은 3번 및 23번 위치에 부착된 분지된 당 사슬을 갖고 23번 위치에 알데히드기를 갖는 아글리콘 트리테르펜(퀼라산)을 갖는다. 퀼라야사포닌의 독특한 특성은 퀼라산의 28번 위치에 에스테르 결합으로 결합된 푸코피라노스의 C-3 히드록시기에 연결된 아실로일 아실부의 존재에 있다. 이 아실부는 3,5-디히드록시-6-메틸옥타노산, 3,5-디히드록시-6-메틸옥타노산 5-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노푸라노시드 및 5-O-α-L-아라비노푸라노시드로 확인되었다.
Higuchi, R. 등( Phytochemistry 26:229 (1987); ibid. 27:1168 (1988) 및 Kensil, C. 등(미국 특허 제5,057,540호, ibid., Vacccine 92:35 (1992) 및 미국 특허 제5,273,965호 (1993))의 문헌에는 푸코실 잔기와 아실로일 아실 잔기 사이의 3-O-글리코시드 결합이 약알칼리성 가수분해에 의해 끊어져서 디스아실사포닌 (desacylsaponin)을 생성시킬 수 있다는 것이 예시되어 있다. 이들 퀼라야사포닌으로부터의 디스아실사포닌은 원래의 사포닌보다 더 친수성이다. 항체 생성 및 CTI 반응성으로 측정된 바와 같이, 퀼라야사포닌의 탈아실화는 면역보강성을 상당히 손실시키는 것이 명백하다(Kensi 등, 미국 특허 제5,057,540호, 칼럼 22, 35행 내지 49행; Kensil 등, Vaccines 92:35(1992); 및 Kensil 등, 미국 특허 제5,273,965호, 칼럼 7, 62행).
퀼라야사포닌은 그것들 사이에 약간의 차이를 갖는 구조적으로 매우 밀접하게 관련된 약 20개의 트리테르페노이드 글리코시드의 혼합물로서 밝혀졌으며, 이 때문에 그것들을 분리시키기 어렵다.(Huguchi, R. 등, Phytochemistry 26:229 (1987)); ibid., 26:2357(1987); ibid., 27:1169 (1988); Kensil 등, 미국 특허 제5,057,540호 (1991); Kensil 등, Vaccines 92:35 (1992)). 그것들의 트리테르페노이드기는 T-세포 면역성을 유도하는 알데히드기를 보유하는 한편, 일부 폴리사카라이드와 유사한 방식으로 그것들의 탄수화물 부분이 체액 면역성을 증진시키는 것 같다(림프구 수용체와 상호작용에 의한 것으로 보임)(Bohn J. 및 J. Bemiller, Carbohydrate Polymers 28:3(1995). 사실상, PCT 공개 공보 WO90/03184호에는 알콜로 환원된 그것의 트리테르페노이드 알데히드를 갖는 사포닌이 여전히 항체 반응을 유도할 수 있다는 사실이 기재되어 있다. 퀼라야사포닌의 또다른 성분인 아실로일-아실기도 면역보강성에 유사한 역할을 하는 것 같다. 또한, 몇몇의 정제된 퀼라야사포닌에서 관찰된 소정의 독성이 노르모테르펜 카르복실산에 의해 형성된 그것의 아실로일 아실부 때문이라고 생각되는 이유가 있다(Kensi, C. 등, J. Immunol. 146: 431 (1991)). 따라서, 보다 정제하기 쉽고, 잠재적으로 독성이 낮으며, 화학적으로 보다 안정하고, 원 사포닌과 같거나 더 우수한 면역보강성을 갖는 변형된 퀼라야사포닌을 개발하는데 상업적인 관심이 있어 왔다.
면역 시스템은 특이적 면역성과 비특이적 면역성을 둘다 나타낸다(Klein, J. 등, Immunology(2판), Blackwell Science Inc., 보스톤 (1997)). 일반적으로, 주어진 항원에 대해 그것의 세포 표면상에서 특이적 수용체를 나타내는 B와 T 림프구는 특이적 면역성을 형성한다. 면역 시스템은 두가지 방법으로 상이한 항원에 대해 반응할 수 있다: 1) B 세포 자극과 항체 또는 면역글로블린의 생성을 포함하는, 체액을 매개로 한 면역성[예를 들어, 항원 제공 세포(APC; 대식 세포 포함) 및 헬퍼 T 세포(Th1 및 Th2)와 같은 다른 세포도 항체 반응의 발생에 관련되어 있다] 및 2) 다른 세포도 CTL 반응의 발생에 관련될 수 있지만(예를 들어, Th1 및/또는 Th2 세포와 APC), 일반적으로 세포독성 T 림프구(CTL)을 포함하는 T 세포와 관련된, 세포를 매개로 한 면역성(CM1).
비특이적 면역성에는 대식 세포 또는 과립구에 의한 식균 작용(외부 입자 또는 항원을 삼킴), 및 자연 살상(natural killer, NK) 세포 활성 등과 같은 각종 세포와 메카니즘이 포함된다. 비특이적 면역성은 덜 진화된 메카니즘(예를 들어, 중요한 균주의 방어 메카니즘인 식균 작용)에 좌우되며, 후천적으로 특이성과 기억성, 특이적 면역 반응의 보증성을 나타내지 않는다. 비특이적인 면역성은 척추동물계에서 보다 본질적인 특성이다. 또한, 비특이적 면역성과 관련된 세포는 주요 경로에서 B 및 T 세포와 상호작용하여 면역 반응을 생기게 한다. 특이적 면역성과 비특이적 면역성 사이의 주된 차이점은 B와 T 세포 특이성을 기초로 한다. 이 세포들은 주로 특이적 항원으로 활성화된 후에 그것의 반응성을 획득하며 그 특이적 항원에 앞으로 노출될 경우에 기억성을 나타내는 메카니즘을 갖는다. 결과적으로, 백신화(특이성과 메모리 관련)는 유해한 병인에 대한 보호를 위한 효과적인 방법이다.
하부단위 백신을 포함하여 불활성화된 백신의 중요한 성분은 면역보강제이다. 면역보강제는 항원과 함께 투여될 때(항원의 투여에 앞서 또는 그 항원과 혼합하여) 그 특정 항원에 대한 면역 반응을 변형시키거나 증가시키는 비면역원적 화합물이다. 따라서, 항원을 면역보강제와 함께 투여하는 경우에는 체액 및/또는 세포를 매개로 한 면역 반응이 보다 효과적이다. 더욱이, 면역보강제는 생성되는 면역글로블린(사람 IgG로는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4; 마우스 IgG로는 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3)의 하부그룹(이소타입)에 영향을 미쳐 면역 반응의 질 뿐만 아니라 그 친화성을 변화시킬 수 있다. 마우스에서 Th1 세포에 의해 조절되는 반응은 IgG1, IgG2a, IgG2b와 적은 범위로 IgG3를 유도하며, 또한 항원에 대한 CMI 반응을 선호한다. 항원에 대한 IgG 반응이 Th2형 세포에 의해 조절되면, 그것은 주로 IgG1과 IgA의 생성을 증가시킨다.
면역 반응을 증가시키는데 사용되는 면역보강제에는 알루미늄 화합물(통상 "알룸"으로 총칭함), 수중유 에멀젼(종종 다른 화합물 포함), 완전 프로인트 보조액(CFA, 건조, 열사 미코박테리움 투베르쿨로시스 유기체를 포함하는 수중유 에멀젼) 및 백일해 면역보강제(죽인 보르다텔라 백일해 유기체의 식염 현탁액)가 포함된다. 일반적으로 이 면역보강제는 항원을 저장시키고 면역 시스템에 대해 항원을 느리게 방출시키며 그들의 관찰된 활성을 나타내게 하는 것으로 생각되는 비특이적 염증을 생기게 함으로써 그 작용 메카니즘을 갖는 것으로 생각된다(Cox, J.C. 등, Vaccine 15:248-256 (1997)). 어떤 사포닌은 면역보강 활성을 포함하여, 다른 유형의 면역 자극 활성을 보여주었다. 이 활성은 이전에도 검토된 바 있다(Shibata, S., New Nat. Prod. Plant Pharmacol. Biol. Ther. Act., Proc. Int. Congr. 1st, 177-198 (1977); Price, K.R., 등, CRC Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 26:27-135 (1987); Schopke, Th., & Hiller, K., Pharmazie 45:313-342 (1990); Lacaille-Ducaille-Dubois, M.A., 등, Phytomedicine 2:363-386 (1996)).
PCT 공개 공보 WO93/05789호에는 3-O-글루쿠론산의 카르복실기를 통해 정제되고 아실화된 퀼라야 사포닌 부분에 공유 결합된 약한 면역원성 단백질의 결합체가 기재되어 있다. 이 결합체에 유리된 퀼라야사포닌을 첨가시키면 보다 높은 면역 반응을 유발시키는데, 이는 (i) 공유 결합된 퀼라야사포닌이 부가 사포닌 분자의 결합 부위로서 작용하고, (ii) 면역보강 효과가 단백질 항원과 연합된 사포닌의 수에 좌우된다는 것을 암시한다.
PCT 공개 공보 WO90/03184호에는 하나 이상의 지질과 하나 이상의 사포닌을 포함하는, 그리고 선택적으로 사포닌과 함께 면역 보강제를 포함하는 면역자극성 복합체(ISCOM)가 기재되어 있다. 이 매트릭스는 면역조절제 및 백신으로서 유용한 것으로 생각된다. 지질과 사포닌은 서로 공유결합적으로 결합되기 보다는 물리적으로 결합된다. 퀼 A( 퀼라야 사포닌 추출물)는 바람직한 사포닌이다. 또한, 이 문헌에는 ISCOM 매트릭스에 면역보강제(퀼라 A 뿐만 아니라)를 첨가하는 것이 유익하다고 개시되어 있다. 이 문헌에는 적합한 소수성 특성이 부족한 면역보강제를 ISCOM 매트릭스내로 혼입시키기 위한 소수성 도메인을 포함하도록 변형시킬 수 있다고 개시되어 있다.
Bomford, R 등, Vaccine 10:572-577 (1992)에는 지질과 각종 사포닌을 혼합시켜 ISCOM을 형성할 수 있다고 개시되어 있다. 이 문헌에는 퀼라야 사포닌, 집소필라 사포닌 및 사포나리아 사포닌만이 면역보강 활성을 갖는 테스트된 사포닌이었다는 것이 개시되어 있다.
면역보강성 및 저독성을 갖는 면역보강제의 필요성은 존재하고 있다.
발명의 상세한 설명
발명의 개요
본 발명은 본 명세서에서 사포닌-친유기 결합체로 명명된, (2) 지방산, 지방 아민, 인지질, 테르펜, 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 친유성 도메인을 갖는 화합물에; (1) 3-O-글루쿠론산 잔기를 갖는 비아실화되거나 또는 탈아실화된 트리테르펜 사포닌이 공유 결합된 신규한 화학적 화합물에 관한 것으로, 상기에서 (1)은 트리테르펜 사포닌의 3-O-글루쿠론산 잔기에 존재하는 카르복실 탄소 원자를 통해 (2)에 결합된다.
또한 본 발명은 하나 이상의 사포닌-친유기 결합체 및 하나 이상의 약학적 허용 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 및 수의적 조성물에 관한 것이다. 이 조성물은 동물과 인간의 면역강화제로서 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 하나 이상의 항원과 사포닌-친유기 결합체를 포함하는 백신에 관한 것이다.
또한 본 발명은 포유류의 면역 반응의 강화를 증진시키는 것에 관한 것으로서, 유효량의 하나 이상의 항원에 대한 포유류의 면역 반응을 증진시키는 사포닌-친유기 결합체를 투여하는 단계를 포함한다.
또한 본 발명은 백신화 방법에 관한 것으로서, 하나 이상의 항원과 사포닌-친유기 결합체를 투여하는 단계를 포함한다.
바람직한 구체예의 상세한 설명
본 발명은 본 명세서에서 사포닌-친유기 결합체로 명명된, 예컨대, 하나 이상의 지방산, 지방 아민, 지방족 아민, 지방족 알콜, 지방족 메르캅탄, 테르펜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 친유부(2)에 공유 결합된 3-O-글루쿠론산 잔기를 갖는 비아실화되거나 또는 탈아실화된 트리테르펜 사포닌(1)을 포함하는 신규한 화학적 화합물에 관한 것으로, 상기 (2)는 트리테르펜 사포닌의 3-O-글루쿠론산 잔기에 존재하는 카르복실 탄소 원자에 의해, 직접 또는 적절한 연결기를 통해 (1)에 결합된다.
퀼라야 디스아실사포닌, 실렌 예니센시스 윌드의 디스아실사포닌, 루시오시드 P 및 집소필라사포나리아아칸토필룸 스쿠아로섬 사포닌과 같은 사포닌의 3-O-글루쿠론산에 친유부를 결합시키면 체액 및 세포를 매개로 하는 면역성에 있어 면역보강 효과를 증진시킨다. 또한, 비아실화되거나 또는 탈아실화된 사포닌의 3-O-글루쿠론산 잔기에 친유부를 결합시키면 정제가 쉽고, 저독성이며, 화학적으로 보다 안정하고, 원 사포닌과 같거나 보다 우수한 면역보강성을 갖는 사포닌 유사체를 얻게 된다.
가장 광범위한 구체예로서, 본 발명은 하나 이상의 변형된 사포닌에 관한 것으로, 상기 변형된 사포닌은 (a) 3번과 28번 위치에 결합된 분지된 당 사슬을 갖는 트리테르펜 아글리콘 코어 구조와 4번 위치에 연결되거나 결합된 알데히드기를 가지며; (b) 원래 비아실화되어 있거나 또는 트리테르펜 아글리콘의 28번 위치에서 사카라이드와 결합된 아실 또는 아실로일 기를 제거시킬 필요가 있고; (c) 트리테르펜 아글리콘의 3번 위치에서 글루쿠론산의 카르복실산에 직접 또는 연결부를 통해 공유결합된 친유부를 갖는다.
본 명세서에서 사용된 "친유부" 및 "친유성 분자의 잔기"라는 용어는 비극성이거나 비극성 도메인을 갖는 하나 이상의 화합물의 적합한 작용기와 사포닌의 3-O-glcA 잔기의 공유결합적 상호작용에 의해 결합되는 부분을 말한다. 친유부는 양친매성 화합물의 일부일 수도 있다. 양친매성 화합물은 그 분자가 극성 및 비극성 도메인을 모두 포함하는 화합물이다. 계면활성제는 양친매성 화합물의 구체적인 예이다. 통상적으로 계면활성제는 종종 알킬, 아릴 또는 테르펜 구조인 비극성부를 포함한다. 또한, 계면활성제는 극성부를 포함하는데, 음이온성, 양이온성, 양쪽성 또는 비이온성일 수 있다. 음이온성 기의 구체적인 예로는 카르복실레이트, 포스페이트, 술포네이트 및 설페이트를 들 수 있다. 양이온성 도메인의 구체적인 예로는 아민염과 사가암모늄염을 들 수 있다. 양쪽성 계면활성제는 음이온성 도메인과 양이온성 도메인을 둘다 포함한다. 통상적으로 비이온성 도메인은 지방산 카르복시기의 유도체이며 사카라이드와 폴리옥시에틸렌 유도체가 포함된다.
또한 친유부는 비극성 도메인을 지니는 둘 이상의 화합물을 포함할 수 있는데, 이때 각 화합물은 연결기와 완전히 결합되며, 연결기는 3-0-글루쿠론산과 공유결합된다.
지방족 아민 및 알콜, 지방산, 폴리에틸렌 글리콜 및 테르펜과 같은 몇몇 친유부를 포함하는 화합물을 디아실사포닌의 3-O-glcA 잔기 및 비아실화된 사포닌의 3-O-glcA 잔기에 첨가할 수 있다. 친유부는 포화 또는 불포화될 수 있는 지방족 또는 고리 구조일 수 있다. 예를 들어, 지방산, 테르페노이드, 지방족 아민, 지방족 알콜, 지방족 메르캅탄, 글리코실-지방산, 당지질, 인지질 및 모노-아실글리세롤 및 디-아실글리세롤을 비아실화된 사포닌 또는 디스아실사포닌에 공유결합시킬 수 있다. 3-글루쿠론산 부분의 산 부분 또는 이 위치에서의 활성화된 산 작용기와 공유결합적으로 반응하는 친유부상의 작용기를 통해 결합시킬 수 있다. 또한, 사포닌의 3-O-glcA 잔기에 친유부를 결합시키기 위해 2 작용기성 연결기를 사용할 수도 있다.
유용한 지방산으로는 C 6-C 24 지방산, 바람직하게는 C 7-C 18 지방산이 포함된다. 유용한 지방산의 구체적인 예로는 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산, 베헨산 및 리그노세르산과 같은 포화 지방산; 및 팔미톨레산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산 및 아라키돈산과 같은 불포화지방산을 들 수 있다.
유용한 지방족 아민, 지방족 알콜 및 지방족 메르캅탄에는 약 6 내지 24개의 탄소 원자, 바람직하게는 6 내지 20개의 탄소 원자, 더욱 바람직하게는 6 내지 16개의 탄소 원자, 그리고 가장 바람직하게는 8 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄, 포화 또는 불포화 지방족기를 갖는 아민, 알콜 및 메르캅탄(RSH)이 포함된다. 유용한 지방족 아민의 구체적인 예에는 옥틸아민, 노닐아민, 데실아민, 도데실아민, 헥사데실아민, 스핀고신 및 피토스핀고신이 포함된다. 유용한 지방족 알콜의 예에는 옥탄올, 노난올, 데칸올, 도데칸올, 헥사데카놀, 키밀 알콜 및 셀라킬 알콜이 포함된다.
유용한 테르페노이드에는 레티놀, 레티날, 비사볼올, 시트랄, 시트로넬랄, 시트로넬롤 및 리날룰이 포함된다.
유용한 모노-아실글리세롤 및 디-아실글리세롤에는 모노-에스테르화 글리세롤 및 디-아실글리세롤이 포함되며, 이때 아실기는 8 내지 20개의 탄소 원자, 바람직하게는 8 내지 16 탄소 원자를 포함한다.
유용한 폴리에틸렌 글리콜은 구조식 H-(O-CH 2-CH 2) nOH를 갖는데, 이때 에틸렌 옥사이드 단위체의 수 n은 4 내지 14이다. 유용한 폴리에틸렌 글리콜의 예에는 PEG 200 (n=4), PEG 400 (n=8-9) 및 PEG 600 (n=12-14)이 포함된다.
유용한 폴리에틸렌 글리콜 지방 알콜 에테르에서 에틸렌 옥사이드 단위체(n)는 1 내지 8개이고, 알킬기는 C 6 내지 C 18 이다.
양친매성, 즉, 친수성기와 소수성기의 비대칭 분포를 갖는 측쇄는 (a) 항원과의 결합 뿐만 아니라 마이셀(micell)의 형성, 및 (b) 세포 수용체에 대한 트리테르펜 알데히드의 접근성을 용이하게 한다. 또한 그런 측쇄 중에 음성 전하를 띤 카르복실기의 존재는 트리테르펜기의 척력에 기여하여, 그것들이 더 큰 회전 자유도를 갖게 할 수 있다. 이 마지막 요인은 이민을 형성하는 카르보닐기에 대한 세포 수용체의 접근성을 증가시킨다.
디스아실사포닌과 비아실 사포닌은 친유부에 직접 결합되거나 연결기를 통해 결합될 수 있다. "연결기"라는 용어는 친유성 분자에 디스아실사포닌, 비아실화된 사포닌 또는 그 혼합물을 공유 결합시키는데 사용할 수 있는 하나 이상의 2 작용기성 분자를 말한다. 이 연결기는 트리테르펜 코어 구조상의 3-0-글루쿠론산 부분의 카르복실산기와 친유성 분자상에 존재하는 적합한 작용기에 공유결합된다.
사포닌과 친유성분자를 결합하는데 사용할 수 있는 연결기의 예로는 n이 2 내지 12인 알킬렌 디아민 (NH 2-(CH 2) n-NH 2); r이 2 내지 12인 아미노알콜 (HO-(CH 2) r-NH 2) 및 선택적으로 카르복시가 보호된 아미노산; 에틸렌과 폴리에틸렌 글리콜 (H-(O-CH 2-CH 2) n-OH, n은 1-4임) 아미노메르캅탄과 메르캅토카르복실산을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 것을 근거로 전술된 구조적 요구조건을 만족시키는 임의의 사포닌을 사용할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "비아실화된 사포닌" 또는 "비아실 사포닌"이라는 용어는 트리테르펜의 28번 위치에 결합된 올리고사카라이드 잔기에 결합된 아실 또는 아실로일 기가 결여된 사포닌을 말한다.
본 명세서에 사용된 "디스아실사포닌" 또는 "탈아실화된 사포닌"이라는 용어는 트리테르펜의 28번 위치에 결합된 올리고사카라이드의 아실 또는 아실로일 기를 제거시켜 변형시킨 사포닌을 말한다.
퀼라야, 집소필라사포나리아는 유용한 사포닌으로, 모두 4번 위치에 결합되거나 연결된 알데히드기 28번 위치에서 에스테르 결합에 의해 결합된 분지쇄 올리고사카라이드를 갖는 트리테르펜 아글리콘을 가지며, 퀼라야와 집소필라에서는 분지쇄 올리고사카라이드에 결합된 3-0-글루쿠론산(3-O-glcA)을 가진다. Q. 사포나리아S. 예니센시스로부터 유래한 사포닌은 아실부를 포함하는데, 집소필라, 사포나리아 아칸토필룸에서 유래한 사포닌은 아실부를 포함하지 않는다. 비아실화되거나 또는 탈아실화된 사포닌은 각각 본 발명에 유용하다.
또한 다른 트리테르펜 사포닌은 본 출원의 대상인 지질 결합체의 제조에 적합하다. 이 신규한 사포닌은 퀼라야 사포나리아 몰리나, 집소필라종 또는 사포나리아 오피시날리스에서 유래한 사포닌과 유사한 구조적 특성을 갖는데 즉, 그것의 아글리콘에 결합된 글루코뉴르산 잔기와 알데히드를 갖는다. 이 부가적인 사포닌은 아칸토필룸 스쿠아로섬에서 분리된 바이데스모시딕 사포닌, 스쿠아로시드 A, 사포닌 루시오시드 P 및 실렌 예니센시스 윌드에서 분리된 2개의 아실화된 사포닌이 있다. 다음은 이 화합물들의 간단한 설명이다.
스쿠아로시드 A는 그것의 아글리콘 집소제닌의 C-3 및 C-28에 결합된 2개의 올리고사카라이드 사슬을 포함하는 바이데스모시딕 사포닌이다. 집소필라 사포닌과 유사하게, 아글리콘의 C-4에 결합된 알데히드기와 C-3에 글루쿠론산 잔기를 갖는다. 또한, 그것은 C-28에 아세틸화된 푸코스 잔기를 포함한다. 스쿠아로시드 A는 시험관내 림프구증식성 테스트로 측정된 바와 같이 면역조절 활성을 갖는 것으로 보인다. 이 명백하게 비특이적인 면역조절 효과는 투여량에 좌우되었는데, ㎍ 범위의 농도에서 억제 효과와 pg 범위에서 자극제 효과가 있었다.
루시오시드 P는 그것의 아글리콘 퀼라산의 C-3 및 C-28에 결합된 탄수화물 잔기와 C-4에 알데히드기를 갖는 바이데스모시딕 사포닌이다. 루시오시드 P는 C-3에 글루쿠론산 잔기를 갖는다.
두개의 아실화된 사포닌은 카리오필라시아 실렌 예니센시스에서 분리된 것이다. 이 사포닌은 아글리콘 퀼라산의 C-3 및 C-28에 결합된 탄수화물을 갖는다. C-3 및 C-28에 결합된 탄수화물은 각각 글루쿠론산과 푸코스이다. 푸코스 잔기는 p-메톡시신나모일기로 아실화되어 트랜스- 및 시스- p-메톡시신나모일 트리테르펜 글리코시드를 생성한다. 이 사포닌은 알데히드기를 가짐에도 불구하고, 시험관내의 화학발광 과립구 분석에 의해 검출된 바와 같이 뚜렷한 면역자극 활성을 갖지 않는다. 하지만, p-메톡시신나모일 부분이 화학발광성을 나타내는데 필요한 반응성 산소의 활성을 방해할 수도 있다.
전술된 사포닌은 모두 순수하게 분리된 것이다. 하지만, 실렌 예니센시스에서 유래된 아실화된 사포닌은 시스- 및 트랜스-이성질체 형태의 혼합물로서만 얻어진다. Q. 사포나리아 사포닌과 유사하게, 실렌 예니센시스에서 유래된 이 아실화된 사포닌은 실온에서 1시간동안 ~0.2 N KOH로 약알칼리 가수분해에 의해 쉽게 탈아실화된다. 그리고 나서 탈아실화된 사포닌을 본 명세서에서 전술한 공정 중 하나를 사용하여 변형시켜 면역자극 및 면역보강 활성을 갖는 유사체를 생성한다.
본 발명에 사용하기 위한 화합물의 바람직한 종류는 3-0-글루쿠론산의 카르복실기와 화학반응시켜 친유부와 결합된 탈아실화된 퀼라야사포닌류이다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구체예는 하기 화학식 2의 화합물 또는 그 약학적 허용 염에 관한 것이다:
화학식 2
상기 식에서,
R 1는 글루코스 또는 수소이고, R 2는 아피오스 또는 크실로스이며, 바람직하게는 아피오스이고, X는 S, O, NH 또는 연결기이며, R 3은 친유성 분자의 잔기이다.
바람직한 X는 O와 NH를 포함한다. 또한, 많은 2 작용기성 연결기가 바람직하다. 유용한 구체적 예로는 -NH-CH 2-CH 2-NH-, -NH-CH(COOH)-CH 2-NH-, -NH-CH 2-CH(COOH)-NH-, -NH-CH 2-CH 2-CH 2-NH-, -O-(CH 2) r-NH-, -S-(CH 2) r-NH-, -S-(CH 2) r-C(O)-, -NH-CH 2-C(O)-, -O-CH 2-CH 2-O-CH 2-CH 2-O-, -NH-NH-C(O)-CH 2-, -NH-C(CH 3) 2-C(O)- 및 -NH-NH-C(0)-(CH 2) r-C(O)-NH-N=이 포함되며, 각 경우에 r은 2-5 이다.
바람직한 R 3 군에는 지방산, 테르페노이드, 지방족 아민, 지방족 알콜, 지방족 메르캅탄, 폴리에틸렌 글리콜, 글리코실-지방산, 지방산과 지방 알콜의 모노-C 2-C 4 알킬렌옥시 유도체 및 폴리-C 2-C 4 알킬렌옥시 유도체, 당지질, 인지질 및 3-O-glcA 카르보닐기 또는 2 작용기성 연결기상의 적합한 작용기에 공유결합될 수 있는 디- 및 트리-아실글리세롤이 포함된다.
R 3 잔기의 유용한 구체적 예에는 아라키돈산, 카프릴산, 레티날, 데카날, 카프릴알데히드, 노닐아민, 노난올, 도데실아민, 도데카놀, 옥틸 글루코피라노사이드, 라우르산, 라우릴 메르캅탄, 스핀고신, 디히드로스핀고신, 4-옥틸벤즈알데히드, 비타민 A, 및 글루코스아민-리시놀레산 결합체가 포함된다.
유사하게, 집소필라, 사포나리아, 및 아칸토필룸 사포닌의 3-글루쿠론산, 사포닌 루시오시드 P 및 S. 예니센시스에서 유래된 탈아실화된 사포닌의 카르복실산 부분은 변형되어 결합체를 형성할 수 있는데, 본 명세서에 보다 자세히 기재된 것과 같이, 여기서 산은 적절한 반응물과 반응하여 직접 또는 적합한 연결기를 통해 친유부에의 아미드 또는 에스테르 결합을 형성한다. 따라서, 글루쿠론산은 -C(O)-X-R 3로 전환되며, 이때 X와 R 3은 상기에서 정의된 바와 같다.
집소필라사포나리아 사포닌과 반응하여 형성된 사포닌-친유기 결합체는 각각 하기 화학식 3과 4로 대표되며:
화학식 3
화학식 4
상기 식에서, X와 R 3은 상기에서 정의된 바와 같다.
퀼라야사포닌 혼합물을 약알칼리성 가수분해시키면 28-0-에스테르 결합이 끊어지고 사포닌이 탈아실화되어, 단일 글루코피라노실 잔기가 다른 두개의 주된, 매우 밀접하게 관련된 생성물을 생성한다 (Higuchi, R. 등, Phytochemistry 26:229 (1987); ibid. 26:2357 (1987); ibid. 27:1169 (1988); Kensil 등, 미국 특허 제5,057,540호 (1991); Kensil 등, Vaccines 92:35 (1992)). 크로마토그래피 방법으로 분리시킬 수 있는, 이 두개의 주된 디스아실사포닌은 모(母) 사포닌보다 친수성이 더 크고 면역보강성은 적다. 하지만, 20개 이상의 퀼라야 사포닌 종류를 단 2개의 화합물로 감소시키는 것은 반(半)합성 면역보강제를 개발하고 생성하기 위한 출발 물질의 실용적인 원료를 제공한다.
바람직한 출발 물질에는 하기 화학식 1로 대표되는 탈아실화된 퀼라야사포닌이 포함된다.
화학식 1
상기 식에서, R 1는 글루코스 또는 수소이고, R 2는 아피오스 또는 크실로스이다. 바람직한 구체예에서, 본 명세서에 기재된 분리 공정을 사용하여, 두개의 탈아실화된 퀼라야사포닌, DS-1 및 DS-2를 분리할 수 있으며, 단독으로 또는 혼합물로 사용할 수 있다. DS-1은 R 1이 수소이고, R 2가 아피오스 또는 크실로스인 화학식 1의 화합물이며, DS-2는 R 1이 글루코스이고, R 2가 아피오스 또는 크실로스인 화학식 1의 화합물에 관한 것이다.
DS-2 분획물로 표시되는, 총 탈아실화된 퀼라야사포닌의 60% - 70% 는 R 1에 글루코스 잔기를 갖는다. DS-1로 표시되는, 탈아실화된 퀼라야사포닌의 나머지 30% - 40%(QS-21에서 유도된 생성물이 지배적임)는 그것의 탄수화물 부분에 어떠한 글루코스 잔기도 갖지 않는다. 여분의 글루코스 잔기는 DS-2에 보다 높은 친수성을 제공하며, 역상 HPLC에서 DS-1보다 빨리 용리된다. 아피오스 대신에 크실로스를 갖는 QS-21의 일부를 제외하고는 대부분의 퀼라야 사포닌은 R 2 위치에서 아피오스를 갖는다. 크실로스 치환체는 DS-1 분획물에서 주로 발견된다. DS-1과 DS-2의 총 혼합물을 사용하여 결합체를 제조하는 것이 바람직하다.
퀼라야사포닌에 있는 3-O-glcA 잔기는 면역보강성을 변화시키지 않으면서 변형될 수 있기 때문에, 이 카르복실기는 디스아실사포닌을 화학적으로 변형시킬 수 있는 유일한 위치를 제공한다. 이론에 구애되지 않기를 바라면서, 3-O-glcA에 친유성 또는 양친매성 사슬을 혼입시켜 알칼리성 가수분해에 의해 퀼라야사포닌으로부터 제거된 28-O-아실기를 작용기적으로 치환시킨다. 이 변형으로 원 퀼라야사포닌에 필적하거나 보다 우수한 면역보강성을 갖고 다른 물리화학적 성질을 갖는 신(neo)사포닌을 얻는다. 또한 집소필라 sp., 사포나리아오피시날리스에서 유래된 비아실화된 사포닌 및 사포닌 스쿠아로시드와 루시오시드 P를 이용하여 이렇게 변형시킴으로서 일차 면역반응성에 면역보강 효과를 향상시킬 수 있다.
글루쿠론산의 활성 에스테르를 제조하고, 연결기 또는 친유성 분자상의 친핵성 작용기와 그 활성 에스테르를 반응시켜 디스아실사포닌과 비아실화된 사포닌을 친유성 또는 양친매성 분자에 결합시킬 수 있다. 본 발명을 실시하는데 사용할 수 있는 활성 에스테르의 예에는 N-히드록시숙신이미드, 설포-N-히드록시숙신이미드, 히드록시벤조트리아졸 및 p-니트로페놀의 글루쿠론산염이 포함된다. 디시클로헥실카르보디이미드(DCC), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 (EDC) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 메티오디드(EDCI)와 같은 탈수제의 존재하에서 사포닌의 카르복시기를 알콜과 반응시켜 활성 에스테르를 제조할 수 있다. 그 후 연결기 또는 친유성/양친매성 분자를 수용액 중의 활성화된 에스테르와 혼합시켜 결합체를 생성시킨다.
사포닌과 친유성 또는 양친매성 분자 사이의 연결기가 바람직한 경우, 글루쿠론산 사포닌의 활성 에스테르를 전술된 바와 같이 제조하고, 예를 들어, 2-아미노에탄올, 알킬렌 디아민, 글리신과 같은 아미노산 또는 글리신 t-부틸 에스테르와 같은 카르복시 보호된 아미노산과 같은 연결기와 반응시킨다. 연결기가 보호된 카르복시기를 포함하는 경우, 보호기를 제거하고 연결기의 활성 에스테르를 제조한다(전술된 바와 같음). 그 후 활성 에스테르를 친유성 분자와 반응시켜 결합체를 생성한다. 또한, 숙신산 무수물로 친유성 분자를 유도체화시켜, 연결기상에 유리(遊離) 아미노 또는 히드록시 기를 갖는 사포닌-연결기 유도체로 EDC 또는 EDCI의 존재하에 축합될 수 있는 친유기-숙신산염 결합체를 생성할 수 있다.
또한 유리 아미노기(알킬렌 디아민에서 유래된)를 갖는 연결기를 포함하는 사포닌-연결기 결합체를 제조하고, 친유성 티올 화합물의 유리 설프히드릴기와 반응하는 설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도시클로헥산)-1-카르복실레이트와 같은 이종(異種) 2 작용기성 가교제로 유리 아미노기를 가교시킬 수 있다. 그런 연결기의 예에는 2-아미노에탄올와 같은 아미노 알콜 및 에틸렌디아민, 1,2-프로필렌디아민, 1,5-펜탄디아민, 1,6-헥산디아민 등과 같은 디아민등이 포함된다. 그 다음 먼저 숙신산 무수물로 숙신화된 유도체를 형성시키고 DCC, EDC, EDCI 등과 사포닌-연결기 결합체를 축합시켜 친유성 분자를 연결기에 결합시킬 수 있다.
본 발명의 또다른 측면은 집소필라사포나리아 사포닌과 같은 탈아실화된 사포닌 또는 비아실화된 사포닌의 3-O-glcA에 비오티닐기가 첨가된 사포닌 유사체에 관한 것이다. 비오티닐기를 혼입시키면 방사성, 형광성, 상자성 또는 다른 유형의 택(tag) 또는 검출기와 같은 검출가능한 표지로 표지화되는 아비딘 또는 스트렙트아비딘을 결합시킬 수 있다. 이 화합물들을 표지화시키면 진단을 목적으로 하는 생체내 또는 시험관내 검출이 가능하게 된다. 예를 들어, 사포닌 유사체에 대한 세포-표면 -수용체를 갖는 T-세포를 검출 및 결정하기 위해 FACS 시스템을 이용할 수 있다. 이 수용체의 존재는 세포가 이민-형성기에 의해 자극되어 잠재적으로 면역 반응을 형성할 수 있음을 나타낸다. 비오티닐화된 사포닌 유사체를 세포-표면 수용체에 결합시키기 전 또는 후에 표지된 아비딘 또는 스트렙트아비딘을 결합시킬 수 있다.
하기 절차에 따라 본 발명의 결합체 뿐만 아니라 유용한 출발 물질을 제조할 수 있다. 참조 반응식은 발명의 상세한 설명 맨 뒤, 특허 청구 범위 앞에 제시되었다.
출발 물질의 제조
약알칼리 가수분해에 기초하여 퀼라야 디스아실사포닌을 제조하는 2가지 공정이 있다. Huguchi, R 등 ( Phytochemistry 26:229 (1987), 참고로 본원에 통합됨)의 문헌에 기재된 제1공정은 퀼라야 수피에 의한 알콜성 추출물을 출발 물질로 하여 크로마토그래피법(반응식 1 참조)으로 2개의 디스아실사포닌(1 및 2)을 분리시킨다. 이 방법으로는 생성물 둘다 회수율이 낮다.
Kensil 등(본 명세서에 참고로 인용된 미국 특허 제5,057,540호)의 문헌에 기재된, 제 2공정은 한외여과 또는 겔 크로마토그래피(Dalsgaard, Arch, Gesamte Virusforsch 44:243 (1974); Acta Vet. Scand. 19 (Suppl. 69):1 (1978))에 의해 부분 정제된 퀼라야사포닌을 출발 물질로 한다. 디스아실사포닌 1(DS-1) 및 2 (DS-2)을 크로마토그래피법으로 분리시킨다. 이 공정으로는 생성물을 둘다 잘 회수할 수 있다.
디스아실사포닌 1과 2를 제조 및 분리하는 또다른 반응식은 반응식 2에 나타나있다.
그 화학적 변형에 앞서 디스아실사포닌 1과 2를 분리시킨다. 어떤 경우에는, 독성, 재현성, 효율 및 조절 가능성 여부에 따라, 1과 2의 변형된 혼합물을 면역보강제로 사용할 수 있다.
또한 염기성 가수분해로 S. 예니센시스 사포닌으로부터 탈아실화된 사포닌을 형성시킬 수 있다. 반응식 3 참조. 가수분해 반응으로 트랜스-p-메톡시신나모일기를 제거시킨다.
지방산-디스아실사포닌 결합체
지방산은 디스아실사포닌의 3-O-glcA 잔기를 변형시키는데 적합하다. 아라키돈산과 같은 일부 불포화 지방산은 일련의 이중결합을 가지기 때문에 테르페노이드와 유사한 견고한 구조를 갖게 하는데 이는 바람직하다. 바람직한 지방산의 다른 예에는 카프릴산, 카프로산, 카프르산, 리놀레산, 팔미트산, 리시놀레산, 올레산, 팔미톨레산, 펠라르곤산, 라우르산 및 에이코사펜타노산이 포함된다.
카르보디이미드 또는 혼합 무수물 공정을 사용하여, 아미드 결합에 의해 디아민을 단일 모노카르복실산에 결합시켜 유리 아미노기를 갖는 생성물을 생성시킬 수 있다. 그 후 카르보디이미드법을 사용하여 이 -NH 2기를 디스아실사포닌의 3-O-glcA의 -COOH에 결합시킨다. 이 최종 생성물은 3-O-glcA 잔기에 지방산이 부가된 디스아실사포닌이다.
본 발명의 지방산-디스아실사포닌 결합체를 형성하는 일반적인 절차는 다음과 같다.
i) 지방산-디아민 생성물의 형성: 에탄올, 디메틸포름아미드(DMF)와 같은 알콜 또는 다른 편리한 유기 용매 중의 디시클로헥실카르보디이미드(DCC) 및 NHS와 반응시켜 카프릴산 또는 아라키돈산과 같은 지방산을 그것의 N-히드로숙신이미드(NHS) 에스테르로 활성화시킬 수 있다. 지방산 각 1몰에 대해 DCC 약 1몰과 NHS 1.5 내지 2.0몰로 0 내지 4℃의 어두운 곳에서 혼합시켜 반응을 수행한다. 반응 4-6 시간 후에, 여과시켜 침전된 디시클로헥실우레아를 제거하고, 지방산에 비해 5 내지 10몰배로 디아민을 과량 포함하는 유기 용매에 여과액을 첨가한다. 디아민은 에틸렌디아민 또는 프로필렌디아민이 바람직하다. 0 내지 4℃의 어두운 곳에서 약 8시간동안 혼합시켜 반응을 진행시킨다. 선택적인 추출, 침전, 및/또는 크로마토그래피에 의해 다른 반응물로부터 생성물, 즉 안정한 아미드 결합에 의해 단일 지방산 잔기에 결합된 디아민을 분리할 수 있다.
지방산-디아민을 제조하기 위한 또다른 공정은 혼합 무수물법이다. 산 1몰에 대해 아민 약 2몰을 사용하여 아라키돈산과 트리-n-부틸아민을 디옥산에 용해시킨다. 냉각된 용액에 이소부틸클로로카르보네이트(지방산 1몰당 1몰)를 혼합시켜 첨가하고 0.5 내지 1 시간동안 반응시킨다. 이 혼합물을 8 내지 10몰배로 과량의 디아민을 포함하는 디옥산에 한 분획으로 첨가하고 교반시키면서 냉각시켜 4 시간동안 반응시킨다. 침전 및/또는 크로마토그래피로 지방산-디아민을 추출하고 분리시킬 수 있다. 변형된 지방산은 디스아실사포닌에 첨가하는데 사용한다.
ii) 디스아실사포닌에 지방산-디아민 생성물의 첨가: 전술된 바와 같이 카르보디이미드법에 의해 디스아실사포닌의 3-O-glcA 잔기의 카르복실을 활성화시킨다. 디스아실사포닌 1몰에 대해 DCC 약 1몰과 NHS 1.5 내지 2.0몰을 DMF, 디옥산 또는 다른 극성 용매 중에서 반응시킨다. 0 내지 4℃의 어두운 곳에서 4-6 시간동안 이 반응을 수행하고 여과시켜 침전된 디시클로헥실우레아를 제거한다. 디스아실사포닌과 거의 같은 몰량으로 지방산-디아민 생성물을 함유하는 DMF 또는 디옥산 용액에 여과물을 첨가하고 25℃에서 약 8시간동안 반응시킨다. 생성물, 즉 3-O-glcA 잔기에 지방산 잔기가 부가된 디스아실사포닌으로 구성된 결합체를 분별 추출, 침전 및/또는 크로마토그래피로 분리시킨다. 이 분리된 결합체를 물에 용해시켜 동결건조시킨다.
테르페노이드-디스아실사포닌 결합체
테르펜은 퀼라야사포닌에서 유래된 아실로일 아실기와 다소 유사한 구조적 특성을 갖는다. 따라서, 테르펜류와 테르펜에서 유래된 화합물은 디스아실사포닌 3-O-glcA 잔기와의 결합체에 적합한 친유성 분자이다. 유용한 테르페노이드는 디스아실사포닌 또는 2 작용기성 연결기와 반응할 수 있는 작용기가 포함된다. 테르페노이드에서 발견되는 이 성질을 갖는 통상적인 작용기에는 알콜, 알데히드 및 케톤 작용기가 포함된다. 면역에 중요한 역할을 하는 비타민 A 알데히드인 레티날은 그런 화합물의 구체적인 예이다. 단일 디아민 분자는 레티날에 결합되어 유리 아미노기를 갖는 레티날을 형성한다. 카르보디이미드법을 사용하여 탈아실화된 사포닌에 이 생성물을 첨가한다.
i) 레티날-디아민 생성물의 형성: 레티날과 10몰배의 에틸렌디아민을 함유하는 메탄올 용액에 메탄올 중에 용해된 나트륨 시아노보로하이드라이드를 첨가한다. 8 시간동안 반응시켜 안정한 아킬아민 결합으로 가역성 쉬프(Schiff) 염기를 환원시킨다. 필요한 경우 아세트산 또는 트리플루오로아세트산과 같은 유기산으로 pH를 조절한다. 선택적 용매 추출, 침전 및/또는 결정화로 레티날-디아민 생성물을 회수한다.
ii) 디스아실사포닌에 레티날-디아민 생성물의 첨가: 전술된 카르보디이미드 공정에 의해 디스아실사포닌의 3-O-glcA 잔기의 카르복실을 활성화시킨다. 디스아실사포닌 1몰에 대해 DCC 약 1몰과 NHS 1.5 내지 2.0몰을 DMF, 디옥산 또는 다른 적합한 용매 중에서 반응시킨다. 0 내지 4℃의 어두운 곳에서 4-6 시간동안 이 반응을 수행한 후 여과시켜 침전된 디시클로헥실우레아를 제거한다. 디스아실사포닌과 거의 같은 몰량으로 레티날-디아민 생성물을 함유하는 DMF 또는 디옥산 용액에 여과물을 첨가하고 25℃에서 약 8시간동안 반응시킨다. 생성물, 즉 3-O-glcA 잔기에 부가된 레티날을 갖는 디스아실사포닌을 용매 추출, 침전 및/또는 크로마토그래피로 분리시킨다. 이 분리된 신(neo)-사포닌을 물에 용해시켜 동결건조시킨다.
지방족 아민-디스아실사포닌 결합체
3-O-glcA 잔기의 -COOH에 아미노기를 결합시켜 아미드 결합을 형성하여 퀼라야 디스아실사포닌에 아민으로부터의 지방족기를 첨가할 수 있다. 전술된 카르보디이미드법에 의해 디스아실사포닌의 3-O-glcA 잔기의 카르복실을 활성화시킨다. 디스아실사포닌 1몰에 대해 DCC 약 1몰과 NHS 1.5 내지 2.0몰을 DMF, 디옥산 또는 다른 용매 중에서 반응시킨다. 0 내지 4℃의 어두운 곳에서 4-6 시간동안 이 반응을 수행한 후 여과시켜 침전된 디시클로헥실우레아를 제거한다. 디스아실사포닌과 거의 같은 몰량으로 지방족 아민을 함유하는 DMF 또는 디옥산 용액에 여과물을 첨가하고 25℃에서 약 8시간동안 반응시킨다. 생성물, 즉 디스아실사포닌의 3-O-glcA 잔기를 통해 지방족 사슬에 결합된 디스아실사포닌을 분별 추출, 침전 및/또는 크로마토그래피로 분리시킨다. 이 분리된 결합체를 물에 용해시키고 동결건조시킨다.
글리코실-지방산:디스아실사포닌 결합체
퀼라야 사포닌의 아실로일 아실부 중 하나를 디사카라이드에 결합시켜 [5-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노푸라노실-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노일]구조체를 형성한다. 이 구조체는 에스테르 결합에 의해 푸코피라노실 잔기의 C3-히드록시기에 결합된다(도 1). 따라서, 또다른 화학적 변형체는 디스아실사포닌의 3-O-glcA 잔기에 부가된 글리코실화된 친유부를 갖는 결합체이다.
i) 글리코실화된 지방산의 제조: 무수 아세톤에 용해된, 불포화 리시놀레산과 같은, 알콜기를 함유하는 지방산을 아세톤 중에 용해된 염화 토실과 혼합시킨다. 반응 혼합물을 교반시키면서, 피리딘 또는 트리에틸아민을 첨가하여 유리된 HCl을 중화시킨다. 염화 토실은 히드록실기를 활성 설포네이트로 전환시킨다. 추출 또는 다른 적절한 공정에 의해 다른 반응물로부터 설포네이트를 분리시킨다. 활성 설포네이트를 DMF, 또는 다른 적절한 용매 중에서 pH 9.5 하에 글루코스아민과 혼합시킨다. 설포네이트는 글루코스아민의 아미노기와 반응시킨 후, 아민과 초기 -OH기 보유 탄소 사이의 안정한 결합을 형성할 수 있는 좋은 이탈기이다. 당해 기술 분야에 공지된 다른 좋은 이탈기로 설포네이트를 대체할 수 있다. 추출, 침전 또는 다른 공정에 의해 글루코스아민-리시놀레산 생성물을 회수한다. 지방산-디아민 생성물을 형성하기 위해 전술된 것과 동일한 방식으로 카르보디이미드법에 의해 이 생성물을 활성화시키고 디아민과 반응시킨다.
ii) 디스아실사포닌에 글루코스아민-리시놀레산의 생성물의 첨가: 디스아실사포닌에 지방산-디아민 생성물을 첨가하기 위해 전술된 바와 같이, 카르보디이미드법을 사용하여 디아민과 반응시켜 도입된, 유리 아민기를 갖는 글루코스아민-리시놀레산 결합체를 다시 카르보디이미드 반응을 사용하거나 혼합된 무수물법을 사용하여 디스아실사포닌과 반응시킨다. 추출, 침전 및/또는 크로마토그래피를 이용하여 생성된 결합체를 회수한다. 이 결합체를 물에 용해시키고 동결건조시킨다. 이 결합체는 디스아실사포닌의 3-O-glcA 잔기에 공유 결합된 글루코스아민-리시놀레산으로 구성된다.
소수성/친수성 측쇄를 갖는 퀼라야사포닌 유사체의 합성
양친매성, 즉, 친수성기와 소수성기의 비대칭 분포를 갖는 측쇄는 (a) 항원과의 결합 뿐만 아니라 마이셀의 형성 및 (b) 세포 수용체에 대한 트리테르펜 알데히드의 접근성을 용이하게 한다. 또한 그런 측쇄 중에 음전하를 띠는 카르복실기의 존재는 트리테르펜기의 척력에 기여하여, 그것들이 더 큰 회전 자유도를 갖게 할 수 있다. 이 마지막 요인은 이민을 형성하는 카르보닐기에 대한 세포 수용체의 접근성을 증가시킨다.
전하를 띠는 소수성-친수성 측면 암(arm)을 갖는 사포닌 유사체의 합성
i) N-옥틸-모노옥시에틸렌과 에피클로로히드린의 반응: 디메틸포름아미드 (DMF) 50ml 중에 용해된 N-옥틸-모노옥시에틸렌 0.05몰(9.9ml)에 펜탄으로 세정된 NaH 1 당량(0.05몰)을 교반시키면서 첨가하여 알콕사이드를 형성한다. 35ml의 DMF와 0.2몰(15.6ml)의 에피클로로히드린에 교반시키면서 알콕사이드 용액을 첨가한다. 60℃ 이하에서 반응시킨 다음, TLC로 반응을 체크한다. 물 250ml를 첨가하여 반응을 중단시킨다. 활성화된 N-옥틸-모노옥시에틸렌을 분배시키기 위해 매회 90ml의 염화 메틸렌으로 수용액을 3번 추출한다. 황산 마그네슘하에서 수집된 유기 용매를 건조시키고, 회전 증발기에서 용매를 제거시킨다. 이 시럽 형태의 잔류물은 활성화된 생성물(11)이다. TLC로 순도를 체크하고, 필요한 경우에는 실리카겔상에서 크로마토그래피에 의해 정제한다(반응식 4 참조)
ii) n-옥틸-모노옥시에틸렌에 2-아미노-3-메르캅토프로피온산(시스테인)의 첨가:
pH 7.8-8.4인, 50% DMF 중의 0.2M 인산 칼륨 완충액 30ml에 시럽 형태의 잔류물(11)(<0.05몰)을 용해시켜 에폭시화된 n-옥틸-모노옥시에틸렌 용액을 새로 준비한다. pH 7.8 - 8.4인, 50% DMF 중의 0.2 M 인산 칼륨 완충액 60ml에 새로 용해시킨 L-시스테인 0.10몰(12.10 mg)에 (11)을 교반시키면서 소량씩 첨가한다. 필요한 경우, 1M KOH 또는 1M 인산으로 시스테인 용액 pH를 pH 7.8-8.4로 조절한다. 질소 대기하에 적당히 교반시키면서 35 - 40℃에서 밤새 반응시킨다. 회전 증발기로 농축시키고 톨루엔 또는 가용성인 경우 클로로포름으로 n-옥틸-모노옥시에틸렌 시스테이닐 유도체(12)(몰 중량 351.34)를 추출한다. 과량의 시스테인과 다른 염은 수상에 잔존하거나 유기 용매 중에 침전된다. 유기상을 여과시키고, 물로 2번 추출하여 임의의 인산 칼륨을 제거한다. 황산 마그네슘하에서 유기상을 건조시킨다. 과잉 시스테인을 제거하기 위해 또는 용매를 바꾸기 위해(예를 들어, 톨루엔에서 클로로포름으로) 필요한 경우, 실리카겔상의 크로마토그래피를 이용한다. 회전 증발기로 용매를 제거하면, 생성물(12)는 시럽 형태의 잔류물로 존재한다. (11)과 시스테인에 대해서는 실리카겔 상에서의 TLC 또는 HPLC 로 순도를 체크한다(반응식 4 참조).
iii) 퀼라야 사포닌 글루쿠론산의 활성화
DMF/피리딘(60:40, v/v) 10ml 중에 용해된 탈아실화된 퀼라야사포닌 0.4g(약 240몰)에 디시클로헥실카르보디이미드(DCC) 480㎛ol(100mg)과 N-히드록시숙신이미드(NHS) 480㎛ol(56mg)을 첨가한다. 실온에서 밤새 혼합시키면서 반응을 진행시킨다(습기로부터 보호). NHS 28mg과 DCC 50mg을 추가로 첨가하고, 추가로 1 시간동안 반응을 계속시킨다. 반응물을 0-4℃로 1 시간동안 냉각시키고 매우 미세한 유리 여과기를 통해 여과시켜 불용성 DCC 부산물 디시클로헥실우레아를 제거시킨다. 회전 증발기에서 피리딘을 제거하고 냉각된 에틸 아세테이트(EtOAc) 40ml를 첨가하여 DS-사포닌:NHS 유도체(13)을 침전시킨다. 동결기에서 1-2 시간 후, 미세 유리 여과지상에서 여과시켜 침전 유도체를 수집하고 추가 EtOAc로 여과지상에서 ppt를 세척한다. 생성물(13)은 강 데시캔트(dessicant), 진공하에 저장할 수 있다.
iv) 소수성/친수성 측쇄에 활성 DS-사포닌의 결합:
DS-사포닌:NHS 유도체(13)(수득율 100%로 가정하면 약 240㎛ol)를 약 5ml의 DMF/피리딘(60:40, v/v)에 용해시킨다. 5ml의 피리딘에 용해된 유도체(12) 0.2g(약 0.5몰)을 용액 (13)에 첨가하여 (13)보다 약 2몰배 과량을 얻는다. 수분으로부터 보호하고 실온에서 8-12시간동안 반응시켜 n-옥틸-모노옥시에틸렌 시스테이닐 측쇄(14)를 갖는 사포닌 유사체를 얻는다. 용매로서 3:2:1의 n-부탄올-피리딘-물과 요오드를 사용하거나 검출을 위해 태워서 TLC로 반응 정도를 체크한다. 회전 증발기에서 반응 혼합물로부터 피리딘을 제거하고, 약 30ml의 냉 EtOAc를 첨가한 다음 3-5시간동안 동결기에 저장하여 침전(14)시킨다. 미세한 유리 여과지에서 여과시켜 침전(14)를 수집하고, EtOAc로 침전물을 세척하여 EtOAc에 가용성인 잔기(12)를 제거한다. 필요한 경우 실리카겔상에서 크로마토그래피로 정제(14)한다. 물에 사포닌유사체를 용해시키고 동결시킨다. HPLC로 분석(14)하고 질량 분석기로 확인한다(반응식 6 참조).
전하를 띠지 않는 소수성-친수성 측쇄를 갖는 사포닌 유사체의 합성
전하를 띠지 않는 측쇄를 갖는 퀼라야사포닌의 합성은 전술된 합성과 공통된 단계(1) 및 (3)을 갖는다. 단계(2)와 단계(4)도 상당히 유사한데 본원에서 설명한다.
n-옥틸-모노옥시에틸렌에 에틸렌디아민의 첨가
시럽 상태의 잔류물(11, 상기 단계 i에 따라 제조)(>0.05 mole)을 30ml의 아세토니트릴 0.2N 탄산 칼륨에 용해시킨다. 0.2M 피페라진-0.2N 탄산 칼륨 60ml 중에 용해된 에틸렌디아민 0.4몰(26.7ml)에 교반시키면서 (11)을 소량씩 첨가한다. 실온에서 교반시키면서 밤새 반응시킨다. HCl로 중화시키고 회전 증발기로 농축시킨 다음 N-옥틸-모노옥시에틸렌 에틸렌디아민 유도체(15)(분자량 332.30)를 바람직하게는 클로로포름에, 아니면 톨루엔에 용해시킨다(에틸렌디아민·HCl은 유기 용매에 용해되지 않을 수 있는데, 수화된 것이면 특히 그러하다). 에틸렌디아민·HCl이 유기 용매에 녹지 않으면, 미세 유리 여과지를 통해 여과시키고, 물로 유기상을 추출하여 잔류 에틸렌디아민을 제거한다. 무수 황산 마그네슘을 첨가하여 유기상을 건조시킨다. 에틸렌디아민이 용매 추출로 제거되지 않는 경우에 또는 용매를 바꿀 필요가 있는 경우(톨루엔에서 클로로포름으로)에는 실리카겔 상에서 크로마토그래피를 이용한다. 회전 증발기에서 용매를 제거한다. 생성물은 시럽 형태의 잔류물이되어야 한다. TLC 또는 HPLC로 (11)과 에틸렌디아민에 대한 순도를 체크한다(반응식 6).
소수성/친수성 측쇄에 활성화된 DS-사포닌의 결합
DS-사포닌:NHS 유도체(13, 상기 단계 ⅲ에 따라 제조)(100% 수득율 가정할 때 약 240 ㎛ol)를 DMF/피리딘(60:40, v/v) 약 5ml에 용해시킨다. 5ml 피리딘에 용해된 유도체(15) 0.33g(1mmol)을 (13)에 첨가하여 (13)의 약 4몰배 이상이 되도록 만든다. 실온에서(수분으로부터 보호) 8-12 시간동안 반응시켜 N-옥틸-모노옥시에틸렌 에틸렌디아민 측쇄(16)을 갖는 사포닌 유사체를 얻는다. TLC 또는 HPLC로 반응의 진행정도를 체크한다. 회전 증발기에서 반응 혼합물로부터 피리딘을 제거하고, 냉 EtOAc 약 30ml를 첨가한 다음 3-5 시간동안 동결기에 보관하여 침전(16)시킨다. 미세 유리 여과지에서 여과시켜 침전(16)을 수집하고, EtOAc로 침전물을 세척하여 EtOAc에 가용성인 잔류물(15)를 제거한다. 필요한 경우, 실리카겔 상에서 크로마토그래피로 (16)을 정제한다. 물에 사포닌 유사체를 용해시키고, 동결건조시킨다. HPLC로 (16)을 분석하고 질량 분석기로 확인한다(반응식 7).
일반적 사항
감압(bp 760 110.6℃)하에 회전 증발기에 의해 톨루엔을 제거할 수 있다. 감압(bp 39 76℃, bp 3.7 25℃)하에 회전 증발기에 의해 DMF를 제거할 수 있다.
2,3-디아미노프로피온산의 N-옥틸-모노옥시에틸렌 유도체와 에틸렌디아민은 알콜, 케톤 및 방향족 용매와 같은 몇몇 유기 용매에 가용성이지만, 에테르 유제에는 불용성이다. 물로 유기상을 추출하는 동안, N-옥틸-모노에틸렌 유도체의 세제성 때문에 에멀션을 형성할 수 있다. 현탁액을 가온하거나 원심분리시켜 이 에멀션을 파괴할 수 있다.
사포닌 유사체는 에탄올과 이소프로판올 같은 EtOAc 및 아세톤에 불용성이다.
관련 트리테르펜 사포닌에 친유성기의 첨가
앞서 지적한 바와 같이, 집소필라사포나리아에서 유도된 비아실화된 트리테르페노이드 사포닌은 이차 면역반응성에 상당한 면역보강 효과를 갖는다. 하지만, 퀼라야사포닌과 달리, 일차 면역반응에 대한 효과는 적다. 이 사포닌에 지방산 부분을 첨가시키면 초기 일차 면역반응동안 그 면역보강성을 향상시킬 수 있다고 생각된다. 퀼라야사포닌의 독특한 면역보강성에서 지방산기의 가정된 역할에 대한 강력한 정황 증거는 이 사포닌 중의 하나인 QS-7에 의해 제공된다(Kensil, C. 등, J. Immunol. 146:431 (1991); Kensil 등, 미국 특허 제5,057,540 (1991)). 매우 친수성인 사포닌은 (a) 탈아실화된 퀼라야 사포닌의 보유 시간에 비할 수 있는 보유 시간을 갖지만, (b) 퀼라야사포닌의 아실로일 아실부와 연결된 글리코실 잔기인 아라비노스가 부족하다. 이 특성은 QS-7이 비아실화되었음을 강력하게 암시한다. 또한 이 사포닌은 아실화된 퀼라야 사포닌과 다른 활성을 가지며: QS-7은 탈아실화된 퀼라야사포닌의 행동과 유사하게, 비독성, 비용혈성이다. QS-7이 체액성 면역을 증진시키는 동안, 항체 이소타입 프로필에 대한 그 효과는 QS-21에서 관찰된 것과 다르다. 이 특성은 아실로일부가 독특한 면역보강성 뿐만 아니라, 다른 퀼라야사포닌에서 관찰된 독성을 나타내게 한다는 것을 암시한다. 따라서, 비아실화된 면역보강성 사포닌에 적절한 친유부를 첨가하면 체액 및 세포를 매개로 하는 면역성에 대한 그 면역 보강 효과를 증진시킬 뿐만 아니라, 퀼라야 사포닌에서 관찰된 독성을 제한시킬 것으로 예상된다. 독성 제한은 소아과 백신에 이 면역보강제를 성공적으로 적용하기 위한 결정적인 필요사항이다.
몇몇 사포닌의 면역보강성 및 면역자극성은 어떤 구조적 필요조건을 갖는데, 여기에는 (a) 4번 위치에 결합 또는 연결된 알데히드기를 갖는 트리테르펜 아글리콘 및 (b) 아글리콘의 3번 및/또는 28번 위치에서의 분지된 당 사슬이 포함된다. 트리테르펜기의 역할은 알데히드기의 어떤 연속적인 관련과 함께, 세포막 중의 콜레스테롤에 대한 결합을 용이하게 할 수 있다는 것이다. 산화 과요오드산염에 의해 변형된 퀼라야사포닌의 면역보강성 부족에 의해 나타난 바와 같이, 분지된 당 사슬은 체액성 면역의 자극에 중요한 것 같다.
퀼라야사포닌의 면역보강성은 사포닌:항원의 밀접한 결합을 필요로 하며, 그것의 아실기가 그것의 소수성을 증진시켜 이 결합을 용이하게 한다고 가정된다. 또한 단백질에 결합된 사포닌과 연관된 퀼라야사포닌 분자의 수를 증가시키면 면역보강성을 증진시킨다는 것이 알려졌다. 마이셀 유사 구조를 형성하는 그 아실부 사이의 소수성 상호작용에 의해 퀼라야사포닌 분자를 함께 유지시킨다는 것은 명백하다. 집소필라 올드하미아나 및 사포나리아오피시날리스에서 유래된 비아실화된 사포닌과 퀼라야사포닌의 면역보강성을 비교하면 다소 유사한 활성을 나타낸다. 하지만, 퀼라야사포닌이 더 높은 일차 면역반응을 유도한다(Bomford, R. 등, Vaccine 10:572 (1992)). 이 발견은 퀼라야사포닌 소수성 아실부가 그 디스아실사포닌의 고유한 면역보강성을 증진시킨다는 것을 암시한다.
퀼라야, 집소필라사포나리아에서 유래된 사포닌의 구조를 비교하면 몇가지 유사점을 나타낸다(도 1). 그것들은 모두 23번 위치에 알데히드기, 28번 위치에 에스테르 결합으로 결합된 분지쇄 올리고사카라이드 및 3-O-글루쿠론산(3-O-glcA)(퀼라야와 집소필라에서는 분지쇄 올리고사카라이드에 결합됨)을 갖는 트리테르펜 아글리콘을 가진다. 하지만, 퀼라야사포닌이 아실로일 아실부를 갖는 유일한 것이다. 퀼라야사포닌의 구조/작용 연구는 23-알데히드기의 존재, 올리고사카라이드 사슬의 통합 및 28-O-아실기의 존재가 완전한 면역보강성에 중요하다는 것을 나타낸다. 면역보강성의 손실없이 3-O-glcA 잔기를 변형시킬 수 있다는 것이 명백하다. 실제로, 퀼라야사포닌과 항원을 결합시키는데 3-O-glcA 글리코시드 잔기를 사용한다 (Kensil, C. 등, Vaccines 92:35 (1992)). 이 사포닌의 면역보강 활성을 비교하면, 퀼라야사포닌이 훨씬 우수한 일차 면역반응을 유도하지만, 이들 모두가 강한 이차 면역반응을 유도한다는 것을 보여준다(표 1). 이 상이한 효과는 일차 면역반응에서 퀼라야사포닌의 아실로일 아실 잔기가 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. 퀼라야의 디스아실사포닌에 의해서는 그것의 아실화된 사포닌에 의해 유도된 것과 비교하여 훨씬 낮은 일차 면역반응이 유도되는데, 이것은 상기에서 제시된 역할을 뒷받침한다.
표 1
* 푸코스에 결합된 28-0-아실로일-아실부를 갖는 퀼라야 사포닌.
퀼라야 디스아실사포닌에 대해 전술한 것과 유사한 방식으로, 사포닌에 신규 부분을 첨가하기 위한 위치로서 3-O-glcA 잔기의 카르복실을 사용하여 집소필라사포나리아 사포닌을 변형시킬 수 있다. 그 구조에 신규한 친유부를 갖는 신사포닌은 원 사포닌보다 우수한 면역보강성을 갖는다.
또한, 스쿠아로시드 A, 루시오시드 P 및 S.예니센시스 탈아실화 사포닌과 같은 기타 비아실화된 트리테르펜 사포닌도 면역보강성 및 면역자극성에 필요한 구조를 갖는다. 예를 들어, 사포닌 스쿠아로시드 A(도 2)는 시험관내 림프구증식성 테스트에 의해 측정된 바와 같이, 면역자극 활성을 갖는 것으로 나타났다. 따라서, 3-O-글루쿠론산 잔기에 친유성 사슬을 첨가시켜 이 사포닌을 변형시킴으로서 향상된 면역보강성을 갖는 신사포닌을 생성할 수 있다.
면역 보강제는 개체에 투여하거나 시험관내에서 시험했을 때, 항원이 투여되는 피검체의 항원에 대한 면역 반응을 증가시키거나 면역 시스템으로부터의 세포의 특정 활성을 증진시키는 화합물이다. 어떤 항원은 단독으로 투여될 경우 면역원성이 약하거나, 또는 피검체에 유용한 면역 반응을 일으키는 농도에서 피검체에 독성이 있다. 면역 보강제는 면역원성에 있어 항원을 더욱 강하게 만들어서 항원에 대한 피검체의 면역 반응을 증진시킬 수 있다. 또한 면역보강 효과는 피검체에서 유용한 면역 반응을 이루기위해 항원을 낮은 투여량으로 투여할 수 있게 한다.
면역 보강제는 면역 반응을 상향 조절하는 사이토킨 네트워크를 변형시키거나 "면역조절"시킬 수 있다. 또한 이 면역보강성과 함께 이 면역 반응을 높이는 T-세포, Th1 또는 Th2의 선택성이 있다. Th1 반응은 항체를 고정하는 보체를 유발하여 IL-2, IL-12 및 γ-인터페론과 연관된 강한 지연형 과민성 반응을 일으킨다. CTL 반응의 유도는 Th1반응과 연관된 것 같다. Th2 반응은 높은 수준의 IgE와 시토킨 IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10과 연관이 있다. 알데히드를 함유하는 사포닌은 강한 Th1 반응을 유도한다. 하지만, 그것의 어떤 유사체는 Th2 반응을 유도한다.
많은 공지된 방법에 의해 본 발명의 조성물 및 화합물의 면역원적 유도 활성을 결정할 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여에 있어서 특정 항원에 대한 항체의 역가의 증가는 면역원성 활성을 측정하는데 사용할 수 있다.(Dalsgaard, K. Acta Veterinia Scandinavica 69:1-40 (1978)). 한 방법은 CD-1 마우스에 하나 이상의 외인성 항원을 포함하는 테스트 조성물을 피내 주사할 필요가 있다. 마우스에서 혈청을 채취한 2주 후에 안티-면역원 항체에 대해 ELISA로 테스트한다.
본 발명의 조성물은 피검체에서 항원에 대한 활성 면역성을 유도하는 백신으로서 유용하다. 본 발명 조성물의 유익한 효과를 경험하는 임의의 동물이 치료될 수 있는 피검체의 범위에 속한다. 피검체는 포유류가 바람직하고 사람이 더욱 바람직하다.
본 발명의 사포닌-친유기 결합체를 단독 면역보강제로 사용할 수 있으며, 또 다르게는 비사포닌 면역보강제와 함께 투여할 수 있다. 본 발명과 함께 사용할 수 있는 비사포닌 면역보강제에는 오일 보강제(예를 들어, 프로인트 완전 및 불완전), 리포좀, 무기염(예를 들어, AlK(SO 4) 2, AlNa(SO 4) 2, AlNH 4(SO 4), 실리카, 알룸, Al(OH) 3, Ca 3(PO 4) 2, 카올린 및 탄소), 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 폴리 IC 및 폴리 AU 산), 중합체(예를 들어, 비이온 블록 중합체, 폴리포스파진, 시아노아크릴산염, 폴리머라제-(DL-락티드-코-글리코시드)) 등과 소정의 천연 물질(예를 들어, 지질 A 및 그 유도체, 미코박테리아 투베르쿨로시스에 유래한 왁스 D, 및 코리네박테리아 파르븀, 보르데텔라 퍼튜시스, 및 브루셀라 속에 속하는 구성원), 소과 혈청 알부민, 디프테리아 독소, 테타누스 독소, 에데스틴, 케이홀-림페트 헤모시아닌, 슈도모날 독소 A, 콜레라게노이드, 콜레라 독소, 퍼튜시스 독소, 바이러스성 단백질, 및 인터페론, 인터류킨과 같은 진핵 단백질 또는 종양 괴사 인자가 포함된다. 그런 단백질들은 당업자에게 공지된 방법에 따라 천연 또는 재조합 원료에서 얻을 수 있다. 재조합 원료에서 얻어지는 경우, 비사포닌 면역보강제는 분자의 적어도 면역자극 부분을 포함하는 단백질 단편을 포함할 수 있다. 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 다른 공지된 면역자극 거대분자에는 폴리사카라이드, tRNA, 폴리비닐아민, 폴리메타크릴산, 폴리비닐피롤리돈, 4',4-디아미노디페닐-메탄-3,3'-디카르복실산과 4-니트로-2-아미노벤조산의 혼합된 축합중합체(비교적 고분자량을 갖는)와 같은 비(非)대사성 합성 중합체(Sela, M., Science 166:1365-1374(1969)) 또는 당지질, 지질 또는 탄수화물이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 화학적 변형 사포닌은 투여되는 하나 이상의 특정 항원에 대해 광범위한 비율로 광범위한 투여량에 걸쳐 투여되었을 때 면역보강 효과를 나타낸다.
개별적으로 또는 다른 실질적으로 순수한 보강제와 함께 혼합하여 화학적 변형 사포닌을 투여하여 항원에 대한 면역 반응성을 증진시킬 수 있다. 화학적 변형 사포닌은 실질적으로 순수한 변형 사포닌 또는 화학적 변형 사포닌의 혼합물 형태일 수 있다.
본 발명의 사포닌 친유기 결합체를 하나 이상의 항원에 대한 면역 반응을 증진시키는데 사용할 수 있다. 면역-반응을 유발하는 본 발명의 조성물에 적합한 통상적인 항원은 인플루엔자, 고양이과 류케미아 바이러스, 고양이과 면역결핍 바이러스, HIV-1, HIV-2, 광견병, 홍역, B형 간염 또는 수족구병과 같은 것의 바이러스; 탄저병, 디프테리아, 라임관절병 또는 결핵과 같은 박테리아; 또는 바베오시스 보비스 또는 플라스모디움과 같은 원생 동물 중에서 유래된 항원이 포함된다. 항원은 단백질, 펩티드, 폴리사카라이드 또는 그 혼합체일 수 있다. 천연 원료로부터 단백질과 펩티드를 정제할 수 있으며, 고체상 합성에 의해 합성하거나 재조합 유전자에 의해 얻을 수 있다. 항원은 분자의 하나 이상의 면역원성 부위를 포함하는 단백질 단편을 포함할 수 있다.
DNA 백신을 이용하여 생성한 항원에 대한 면역 반응을 증가시키는데 본 발명의 사포닌 결합체를 이용할 수 있다. 항원을 암호하는 이 백신 중의 DNA 서열은 "그대로(naked)"이거나 또는 리포좀과 같은 전달 시스템에 포함시킬 수 있다. 이 접근법을 사용하는 통상적인 백신은 인플루엔자, 헤르페스, 시토메갈로바이러스, HIV-1, HTLV-1, FIV과 같은 바이러스성 백신, 종양 백신 및 기생충 백신이 있다. 사포닌 결합체를 DNA와 함께 또는 DNA 투여 전 및/또는 후에 투여할 수 있다.
종종 종양 세포는 표면상에 절단된 상피 성장 인자, 엽산염 결합 단백질, 상피 뮤신, 멜라노페린, 발암배 항원, 전립선 특이적 막 항원, HER2-neu와 같은 특징적인 항원을 갖는데, 이것들은 암 치료 백신에 사용할 수 있다. 종양 항원은 정상적이거나 신체의 정상적인 성분과 관련되어 있기 때문에, 종종 면역 시스템은 그 항원에 대해 효율적인 면역 반응을 높여서 종양 세포를 파괴하는데 실패한다. 그런 반응을 수행하기 위해, 퀼라야사포닌과 사포닌-친유기 결합체를 사용할 수 있다. 알데히드를 함유하는 트리테르페노이드 사포닌 면역보강제는 특정 T-세포에 존재하는 수용체 단백질(들)의 아미노기와 반응하고 쉬프 염기를 형성함으로써 작용한다. 이 반응 결과, 외인성 단백질은 외인성 항원을 처리하기 위한 경로에 진입하여, 세포 붕괴 또는 세포 독성 T 세포(CTL)의 생성을 유도할 수 있다. 이 독특한 면역보강 효과는 면역화에 사용되는 종양 항원을 그 표면상에서 보유하는 종양 세포를 찾고 파괴하는 항원 특이적 CTL의 생성을 유도한다. 또한, 강글리오시드, 톰센-프리덴레이크(T) 항원 등과 같은 탄수화물 종양 항원과 함께 본 발명의 사포닌 결합체를 사용할 수 있다.
또한 만성 감염성 질환, 특히 면역 손상 환자의 치료를 위해 면역 시스템을 강화하는데 단독으로 본 발명의 사포닌 결합체를 투여할 수 있다. 치료 또는 예방에 본 발명의 결합체를 사용할 수 있는 면역성 질환의 예는 미국 특허 제5,508,310호에 기재되어 있다. 또한 사포닌 결합체에 의한 면역 시스템의 강화는 병원성 및/또는 수술 후 감염의 위험을 제한하는 예방적 수단으로서 유용할 수 있다.
본 발명의 방법에 유용한 화합물을 경구, 피내, 근내, 피하, 비강 또는 다른 적절한 방법으로 투여할 수 있다. 투여량은 나이, 체중, 수반되는 치료의 종류, 어떤 경우에는 투여되는 항원의 성질에 좌우된다. 일반적으로, 투여되는 항원에 대한 광범위한 비율 및 광범위한 투여량으로 사포닌/항원 결합체를 투여할 수 있다. 초기 투여량에 이어 면역원성 반응을 증강시키기 위해 약 4주 후에 효능증강제 (booster)의 투여가 따를 수 있다. 또한 추가적인 두번째 효능증강제를 투여할 수 있다.
본 발명의 사포닌-친유기 결합체는 캡슐, 액체 용액, 에멀션, 현탁액 또는 경구 투여를 위한 엘릭서(elixir)와 같은 형태로 또는 용액, 에멀션 또는 현탁액과 같은 멸균액 형태로 사용할 수 있다. 식염수, 또는 인산염 완충 식염수와 같은 임의의 불활성 담체를 사용하는 것이 바람직하며, 또는 본 발명의 방법에 사용되는 화합물의 임의의 그런 담체는 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 가용성을 갖는다.
본 발명의 사포닌-친유기 결합체를 리포좀과 결합하여 사용할 수 있는데, 이때 사포닌은 리포좀 제제 중에서 지질 물질과 느슨하게 결합된, 리포좀의 2중층의 한층 또는 두층 모두에 있을 수 있으며(결합체가 이중층내에 존재하지 않는 경우 아니면, 지질과 결합된 경우), 어떤 경우에는, 리포좀의 이중층내에 포획되어 있을 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,235,877호, Fullerton을 참조.
또한 본 발명은 제 1용기가 본 발명의 사포닌-친유기 결합체를 포함하는, 하나 이상의 용기를 내부의 폐쇄 한정된 곳에서 받아들이기 위해 구획화된 담체를 포함하는, 개체의 면역화를 위한 키트를 제공한다. 또한 이 키트는 본 명세서에 기재된 바와 같은 사포닌 면역보강제 또는 다른 면역보강제를 포함하는 하나 이상의 다른 용기를 포함할 수 있다.
관련 트리테르펜 사포닌에 비오티닐기의 첨가
앞서 지적된 바와 같이, 비오티닐 사포닌 유사체는 면역 시스템의 세포가 이민 형성 사포닌과 반응할 수 있는 수용체를 갖는지를 확인하고 결정하는데 유용한 시약이다. 이 사포닌(퀼라야, 집소필라, 및 사포나리아에서 유래된 것과 같은)이 APC상에서 발현되고 T-세포상의 CD28 수용체와 반응하는 동시자극(co-stimulatory) 리간드 B7.1을 대체한다. B7.1 또는 이민 형성 사포닌 면역보강제로 동시자극할 때, T-세포는 활성화되어 항원-특이적 CTL을 형성한다. 이 표지(tag)된 사포닌 유사체를 사용하면 탈아실화되거나 비아실화된 사포닌과 결합할 수 있는 세포 표면 수용체를 갖는 T-세포의 존재를 정성적으로 또는 정량적으로 측정함으로써 면역 반응 과정의 진행을 결정할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 조성물 및 방법의 예시이지만, 이에 제한되지는 않는다. 일반적으로 마주칠 수 있고 당업자에게 자명한 각종 조건과 변수의 다른 적절한 변형 및 조절은 본 발명의 사상과 범위에 속한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 퀼라야, 집소필라사포나리아에서 유래된 사포닌의 대표적인 화학 구조를 나타낸다.
도 2는 아칸토필룸 스쿠아로섬에서 유래한 사포닌(a) 및 (b) 루시오시드 P의 대표적인 화학 구조를 나타낸다.
도 3은 OVA 단독, 알룸, 퀼라야 사포닌, 다양한 투여량의 탈아실화된 퀼라야 사포닌 및 본 발명의 실시예 3의 퀼라야 사포닌-친유기 결합체(GPI-0100)에 의해 유도된 안티-OVA IgG 일차 면역 반응의 비교를 나타낸다.
도 4는 프로인트 완전 보조액, 퀼라야 사포닌, 본 발명의 퀼라야 사포닌-친유기 결합체, 알룸, 및 단독 OVA의 존재하에 OVA 항원으로 면역화하기 위한 전형적인 최종점의 역가를 나타낸다. 항원 특이적 항체 결합으로 인한 흡광도를 혈청 희석도의 로그 함수로서 도시했다.
도 5는 OVA 단독, 알룸, 퀼라야 사포닌 및 다양한 투여량의 퀼라야 사포닌-친유기 결합체(GPI-0100)의 존재에 의해 유도된 안티-OVA IgG 2차 면역 반응에 대한 최종점 역가의 로그값의 비교를 나타낸 것이다.
도 6은 IgG 이소타입의 생성에 있어서의, 알룸, 퀼라야 사포닌 및 다양한 투여량의 본 발명의 퀼라야 사포닌-친유기 결합체의 영향을 나타낸다. 각 이소타입에 대한 특이적 항체를 사용하여 최종 역가의 로그값을 결정했다.
도 7은 OVA 단독, 또는 알룸, 퀼라야 사포닌, 여러 투여량의 탈아실화된 퀼라야 사포닌, 및 본 발명의 퀼라야 사포닌-친유기 결합체(GPI-0100)로 2번 면역화된 마우스에서 분리한 T-림프구에서 유도된 시험관내 증식 반응의 비교를 나타낸 것이다. 2㎍ 또는 10㎍의 OVA로 비장구를 자극하고 3H-티미딘 혼입에서의 증가 변화(△ 3H-TdR 혼입, c.p.m.)를 측정하여 프라이밍의 정도를 결정했다.
실 시 예
실시예 1
퀼라야 디스아실사포닌(4)의 제조
퀼라야 사포나리아 몰리나 사포닌의 시판용 제제에서 필요한 트리테르펜 사포닌 출발 물질을 얻을 수 있는데, 이것은 아실화되어 있다. 예를 들어, 두가지 종류의 시판용 제제를 사용할 수 있다:
(a) 약 25%(중량/중량)의 사포닌과 75%(중량/중량)의 수용성 불순물, 즉, 올리고사카라이드, 탄닌 등을 함유하는 퀼라야 사포닌(피셔 사이언티픽에서 시판되는 실용 등급) 및
(b) 메탄올 불용성 불순물을 가지며 사포닌이 80%(중량/중량) 이상인 투석화된 퀼라야 사포닌 또는 퀼 A (아큐레이트 케미칼 또는 시그마 케미칼 코오포레이션에서 시판).
실용 등급 퀼라야 사포닌은 하기에 따라 추가로 정제할 수 있다:
A. 실용 등급 사포닌 제제(1)을 20-25%(중량/부피)의 농도로 물에 용해시키고, 1N 아세트산으로 pH를 약 4로 조절하여 불투명한 용액을 만든다. 이 불투명 용액을 표준 투석 주머니에 쏟아 붓고 24 시간동안 25-50 부피의 물을 3-4회 바꾸면서 투석시킨다. 물은 투석시 4-8시간마다 바꾼다. 그 다음 투석물을 동결건조시켜 백색 제제를 얻는다. 투석 후에, 사포닌 제제(2)는 메탄올에 불용성인 불순물(안료 또는 탄닌으로 예상)을 함유한다. 수득율: 실용 등급의 사포닌 제제의 초기 중량의 ±25%인데, 원 사포닌의 약 95%(중량/중량)을 나타낸다.
B. 건조 사포닌 제제(2) 1g을 60℃에서 20-25분동안 50ml의 메탄올로 추출한다. 현탁액을 여과시키고 용해되지 않은 물질을 60℃에서 20-25분동안 30ml의 메탄올로 재추출시킨다. 투명한 메탄올성 여과물을 모으고 회전 증발기로 건조시킨다. 메탄올로 추출된 사포닌 제제(3)은 메탄올-불용성 불순물이 제거된 것이다. 수득율은 제제(2)의 70% 이하이다.
퀼라야 사포닌의 아실기를 약알칼리 가수분해시켜 제거하고 4가지 다른 디스아실사포닌(두개의 이성질체)과 3,5-디히드록시-6-메틸옥타노산, 및 3,5-디히드록시-6-메틸옥타노산 5-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노푸라노시드를 얻었다. 예로써, 하기 알칼리성 가수분해법은 이 탈아실화된 사포닌(4)를 제조하는데 유용하다.
(i) 메탄올로 추출된 사포닌(3)(60mg/ml)을 50% 메탄올 중의 6% Na 2CO 3로 1시간동안 끓이고, 반응 혼합물을 다우엑스 50W-X8H +(설폰화된 폴리스티렌-디비닐벤젠 수지인 합성, 강산 양이온 교환기)로 중화시킨 다음 여과한다. 이 여과물을 회전 증발기로 농축시키고 에틸 아세테이트와 물 사이에 분배시킨다. 수상은 대부분의 디스아실사포닌을 포함하며, 한편 유기 EtOAc상은 대부분의 옥타노산을 포함한다. 질소가스를 통과시키거나 회전 증발기를 사용하여 수성상으로부터 EtOAc를 제거하고 수성 디스아실사포닌 용액(4)를 동결건조시킨다.
(ii) 메탄올로 추출된 사포닌(3, 0.1g)을 3ml의 90% n-프로판올에 재현탁시킨다. 이 현탁액/용액을 5N NaOH 저장액을 첨가하여 0.5N NaOH로 조절하고 실온에서(20-25℃) 2시간동안 혼합시킨다. 이 현탁액을 50 x g 에서 5분간 원심분리시켜 옅은 색을 띤 상등액과 갈색 침전물을 얻는데, 이때 상등액은 버린다. 3ml의 90% n-프로판올로 침전물을 재현탁시키고 50 x g 에서 원심분리시켜 3회 세척한다. 디스아실사포닌(4)의 생성된 펠릿은 3ml 물에 용해시켜 동결건조시킨다.
또한, 메탄올로 추출한 사포닌(3)을 물에 용해시켜 20mg/ml 사포닌을 갖는 용액을 형성하고 이 용액을 최종 농도 0.15M 트리에틸아민, pH 12가 되도록 조절한다. 40-50℃에서 한 시간 후에, pH 7.0이 되도록 아세트산을 첨가하여 알칼리성 가수분해를 종결시킨다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하여 트리에틸아민과 소정의 가수분해 생성물을 제거한다. 디스아실사포닌(4)는 수상에 잔존한다. 다른 방법으로는, 농축된 암모니아에 (3)을 용해(10mg/ml)시켜, 실온에서 5시간동안 용액을 교반시키고 질소를 흘려보내면서 암모니아를 제거하는 것이다. 80ml의 에틸아세테이트로 수상 용액을 추출하고 유기상을 버린다. 디스아실사포닌을 함유하는 수상을 동결건조시킨다.
실시예 2
집소필라 종으로부터 사포닌의 정제
4℃에서 10mM 아세트산 20 부피에 대해 분자량 약 2000 달톤까지 차단하는 투석 주머니에서 10mM 아세트산 중의 미정제 집소필라 사포닌 5% 용액을 투석시킨다. 아세트산은 4시간 후에 2번 교체한다. (이 단계에서는 폴리사카라이드와 소정의 저분자량 불순물이 제거된다.) 투석 용액을 회전 증발기에서 농축시키고 동결건조시킨다. 투석된 집소필라 사포닌 1g을 실온에서 24시간마다 순수한 메탄올 50ml로 두번 추출하고 여과한다. 용해되지 않은 물질이 있으면, 실온에서 50ml의 MeOH:물(40/60)로 한번 추출하고 여과시켜 불용성 물질을 제거한다. 여과물을 수집해서 회전 증발기내에서 약 40℃에서 농축시켜 시럽 상태의 사포닌 추출물(I)을 얻는다. 물에 이 추출물을 용해시켜 5% 사포닌 용액을 수득하고 에틸 아세테이트 0.5 부피로 이 용액을 두번 추출한다. 수상은 0.05M Na 2CO 3 을 포함하는 물 중의 MeOH 0% 부터 50%(부피/부피)의 구배로 용리시키면서, 프락토겔 TSK HW-40F 상에서 크로마토그래피 처리한다. 용매로 n-부탄올:아세트산:물(4/1/5)를 사용하여 샘플을 실리카겔 상에서 TLC로 분석했고 리베르만:버차드 반응으로 사포닌을 가시화시켰다. 또한, 에틸 아세테이트 5 부피를 첨가하여 (I)로부터의 사포닌을 침전시키고, 용매로서 클로로포름:MeOH:물(64:40:8)을 사용하여 실리카겔 크로마토그래피로 분리시킬 수 있다. 탈아실화된 퀼라야 사포닌을 위해 전개시킨 것과 동일한 공정을 사용하여 집소필라 사포닌의 유사체를 제조할 수 있다.
실시예 3
글루쿠론산의 카르복실기를 통한 지방족 아민의 첨가
디스아실사포닌(4)의 글루쿠론산 잔기의 카르복실에 C 6-C 20 지방족 아민, 바람직하게는 C 9 또는 C 12 지방족 아민을 첨가하여 카르보디이미드법을 사용하여 결합된 디스아실사포닌(5)을 얻을 수 있다. DCC(디시클로헥실카르보디이미드) 또는 수용성 EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드를 NHS(N-히드록시-숙신이미드) 또는 수용성 설포-NHS와 함께 또는 없이 사용할 수 있다. 디옥산, DMF(디메틸포름아미드), THF(테트라히드로퓨란), DMSO(디메틸설폭사이드), 알콜 및 피리딘과 같은 유기 용매 중에서 단독으로 또는 무수 혼합물 또는 물과 함께 반응시킨다. 물의 존재는 퀼라야 디스아실사포닌의 가용성에 의해 지배되는데, 50% 메탄올, 50% n-프로판올, 수성 DMSO 및 DMF 뿐만 아니라 무수 THF 또는 디옥산 및 유사한 성질을 갖는 다른 용매에 가용성이다.
(i) 1단계 방법
(a) 1ml의 50% n-프로판올에 용해된 디스아실사포닌(4) 100mg(60㎛ol)에 50% n-프로판올 중의 0.6M 도데실아민 용액(600㎛ol) 1ml를 첨가한다. 그 후 3N 인산으로 pH를 5와 7사이로 조절한다. 600㎛ol의 무수 EDC(95mg)를 생성된 용액내에서 교반시키고 6-8시간동안 혼합한다(0℃ 내지 10℃). 300㎛ol(47mg) EDC를 추가로 첨가하고 0℃ 내지 10℃에서 밤새 반응시킨다. 다우엑스 50형 수지로 유리 알킬아민을 제거하여 반응을 중단시킬 수 있다.(또한 수지는 EDC로부터 아실 우레아를 제거할 수 있다.) 여과시켜 수지를 제거한다. 결합된 디스아실사포닌(5)를 포함하는 여과물을 5부피의 n-프로판올과 혼합하여 침전물(5)를 침전시킨다. 침전물을 수집하여 물에 용해시키고 투석시킨 후 동결건조시킨다.
(b) 디스아실사포닌이 무수 피리딘에 단독으로 또는 무수 THF와 함께 용해되는 경우, DCC와 함께 반응시킬 수 있다. 1ml 이상 5ml 이하를 사용하여 100mg의 (4)(600㎛ol)를 피리딘 및/또는 THF에 용해시킨 다음 피리딘 및/또는 THF 중의 0.3M 도데실아민 용액(300 ㎛ol) 1ml를 반응 혼합물에 첨가하고 무수 300 DCC 300㎛ol을 첨가한다. 0℃ 내지 10℃에서 밤새 혼합시키면서 혼합물을 반응시킨다. 반응 동안, 불용성 디시클로헥실우레아가 형성되는데 이것을 원심분리시켜 제거한다. 결합된 디스아실사포닌(5)를 포함하는 상청액을 10부피의 EtOAc로 희석시켜 침전(5)시킨다. 유리 알킬 아민, 잔류 DCC 및 피리딘 및/또는 THF를 포함하는 EtOAc를 버린다. EtOAc로 침전물을 세척하고 물에 용해시킨 다음 EtOAc를 제거하고 동결건조시키기 전에 EtOAc로 재추출한다.
(ii)두단계 방법
(a) 1ml의 50% n-프로판올에 용해된 디스아실사포닌(4) 100mg(60㎛ol)에 50% n-프로판올 중의 0.6M 도데실아민 용액 0.2ml(120㎛ol)를 첨가한다. 그 후 3N 인산(카르복실산은 사용하지 않는다)으로 pH를 5와 7사이로 조절한다. 120㎛ol의 무수 EDC(10mg)와 120㎛ol의 설포-NHS(26mg)를 반응 혼합물에 교반시키면서 첨가하고 0℃ 내지 10℃에서 밤새 반응시킨다. 5 부피의 n-프로판올을 첨가하여 결합된 디스아실사포닌(5)를 침전시킨다. 침전물을 수집하여 물에 용해시키고 투석시킨 후 동결건조시킨다.
(b) 디스아실사포닌이 무수 피리딘만에 또는 무수 THF와 혼합된 피리딘에 용해되는 경우, DCC와 함께 반응시킬 수 있다. 1ml 이상 5ml 이하의 용매를 사용하여, 100mg의 (4)(60㎛ol)을 피리딘 및/또는 THF에 용해시킨다. 피리딘 및/또는 THF 중의 0.3M 도데실아민 용액(120㎛ol) 0.4ml를 디스아실사포닌 용액에 첨가하고, 무수 DCC 120㎛ol과 무수 NHS 120㎛ol을 첨가한다. 0℃ 내지 10℃에서 밤새 혼합시키면서 혼합물을 반응시킨다. 불용성 디시클로헥실우레아가 형성되는데 이것을 원심분리시켜 제거한다. 결합된 디스아실사포닌(5)를 포함하는 상청액을 10부피의 EtOAc로 희석시켜 침전(5)시키고, 유리 알킬 아민, 잔류 DCC 및 NHS를 제거한다. 회전 증발기로 농축시키고 동결건조시키기 전에 침전물을 물에 용해시키고 EtOAc로 추출한다. 질량 분석기로 변형을 확인한다.
본 발명의 또다른 바람직한 구체예는 탈아실화되거나 비아실화된 사포닌의 3-0-글루쿠론산 잔기의 카르복실기에 2 이상의 소수성 사슬이 도입된 것이다. 여러 화학적 접근법을 사용하여 다중 친유성 사슬을 첨가시킬 수 있는데, 이하에서 설명되는 것들이 포함된다. 2 또는 3개의 친유성 측쇄를 포함하는 분자는 직접 또는 2 작용기성 연결기를 통해 3-0-글루쿠론산에 공유 결합된다.
실시예 4
디스아실사포닌에 포스파티딜에탄올아민 디팔미토일의 첨가
무수 DMF/피리딘(60:40, 부피/부피) 3ml에 용해된 디스아실사포닌(4) 0.35g(210 mmol)에 DMF/피리딘 중의 포스파티딜에탄올아민 지방산 유도체(디팔미토일, 디스테아로일 등) 280 mmol을 실온에서 첨가한다. 이 반응 혼합물에 무수 DCC(0.08-0.125g) 400-600mmol 및 무수 NHS 400mmol(0.05g)을 혼합시키면서 첨가하고 실온에서 12-16 시간동안 혼합시키면서 반응시킨다. 반응 혼합물을 한시간동안 4℃까지 냉각시키고 여과시켜 불용성 디시클로헥실우레아, DCC 부산물을 제거한다. 결합된 디스아실사포닌을 함유하는 여과물에 10 부피의 냉에탄올을 첨가하여 결합된 디스아실사포닌을 침전시키고 잔류 DCC, NHS 및 유리 포스파티딜에탄올아민 지방산 유도체를 제거한다. 0-4℃에서 2-4시간 후에, 침전된 사포닌 결합체를 여과시켜 수집한다. 침전물을 여과지상에서 에틸 아세테이트 10-20ml로 세척한다. 그 후 침전된 사포닌 결합체를 10ml의 물에 용해시키고 이 용액을 에틸 아세테이트 1 부피로 추출한다. 회전 증발기를 사용하여 수용액으로부터 에틸 아세테이트를 제거하고, 샘플을 동결건조시킨다.
실시예 5
디스아실사포닌에 L-2,4-디아미노부티르산 디미리스토일의 첨가
아세토니트릴 25ml에 용해된 염화 미리스토일 0.63g(2.5 mmol)에 2,4-디아미노부티르 디히드로클로라이드 2.10g(11mmol)과 탄산 칼륨 2.00g을 첨가한다. 이 혼합물을 65℃에서 12-16 시간동안 교반시키면서 반응시킨다. 그 후 반응 혼합물을 감압하에서 건조시키고 잔류물을 에틸아세테이트에 용해시킨 다음, 물로 추출하고 황산 마그네슘으로 포화된 물로 다시 추출한다. 무수 황산 마그네슘하에서 유기상을 건조시킨다. 여과시켜 황산 마그네슘을 제거한다. 여과물을 감압하에서 용해시키고 실리카겔 TLC로 화합물의 순도를 체크한다. 필요한 경우, 실리카겔 크로마토그래피로 디미리스토일 유도체를 정제한다.
무수 DMF/피리딘(60:40, 부피/부피) 5ml에 용해된 디스아실사포닌(4) 0.40g(240mmol)에 0.23g의 디미리스토일 유도체를 함유하고 있는 DMF/피리딘 2ml를 실온에서 첨가한다. 그 후, 무수 DCC(0.10-0.15g) 480-720mmol 및 무수 NHS 480mmol(약 0.06g) 을 혼합시키면서 첨가하고 실온에서 12-16 시간동안 혼합시키면서 반응시킨다. 반응 혼합물을 한시간동안 4℃까지 냉각시키고 여과시켜 불용성 디시클로헥실우레아, DCC 부산물을 제거한다. 결합된 디스아실사포닌을 함유하는 여과물에 10 부피의 냉에탄올을 첨가하여 결합된 디스아실사포닌을 침전시키고 잔류 DCC, NHS 및 유리 디미리스토일 유도체를 제거한다. 0-4℃에서 2-4시간 후에, 침전된 사포닌 결합체를 여과시켜 수집한다. 침전물을 여과지상에서 에틸 아세테이트 20-30ml로 세척한다. 침전된 사포닌 결합체를 20ml의 물에 용해시키고 이 용액을 에틸 아세테이트 1 부피로 추출한다. 회전 증발기를 사용하여 수용액으로부터 에틸 아세테이트를 제거하고, 동결건조시킨다. 실리카겔 TLC로 샘플 순도를 체크한다. 필요한 경우, 실리카겔 상의 크로마토그래피로 결합된 디스아실사포닌을 정제할 수 있다.
실시예 6
디스아실사포닌에 시트르산-트리팔미토일의 첨가
아세토니트릴 또는 피리딘 20ml에 용해된 시트르산 0.50g(2.5 mmol)에 1-헥사데실아민 3.60g(15mmol)을 혼합시키면서 첨가한다. 이 용액에 무수 DCC(7.20g) 35mmol 및 NHS 35mmol(4.00g)을 첨가하고 실온에서 밤새 반응시킨다. 반응 혼합물을 한시간동안 4℃까지 냉각시키고 여과시켜 불용성 디시클로헥실우레아를 제거한다. 회전 증발기에서 감압하에 용매를 제거한다. 건조된 잔류물을 알콜에 용해시키고 강산성 수지(다우엑스 50)으로 잔류 알킬아민을 제거한다. 실리카겔 TLC로 생성물의 순도를 체크한다. 필요한 경우, 실리카겔 상의 크로마토그래피로 정제한다. 시트르산-트리팔미토일 유도체(1.87g, 2mmol)을 아세토니트릴 20ml에 용해시키고 1,1'-카르보닐디이미디졸(CDI)(0.40g) 2.5mmol을 첨가한 다음 그 혼합물을 무수 조건하에 실온에서 4시간동안 반응시킨다. 그 후 5배 이상의 에틸렌 디아민(10mmol 내지 0.65ml)을 반응 혼합물에 첨가하고 실온에서 2-3 시간 추가로 반응 시킨다. 그 후, 10% 물을 첨가하여 잔류 CDI를 붕괴시키고 감압하에 용매를 제거한다. 예를 들어, 메탄올 또는 클로로포름과 같은 적합한 용매에 반응 생성물을 용해시키고 실리카겔 크로마토그래피로 정제시킨다. 아민화된 시트르산-트리팔미토일 유도체(분자량 약 1019.7)를 함유하는 분획물을 수집하고, 감압하에 용매를 제거한다.
전술된 DCC/NHS 법을 사용하여 아민화된 시트르산-트리팔미토일 유도체 1.5몰과 디스아실사포닌 1몰을 피리딘/DMF (40:60, 부피/부피) 중에서 반응시켜 탈아실화된 사포닌 결합체를 제조한다. 여과시켜 불용성 디시클로헥실우레아를 제거하고, 에틸 아세테이트 몇 부피로 결합된 사포닌을 침전시킨 다음, 물에 용해시키고 동결건조시킨다.
실시예 7
스테로이드 또는 트리테르페노이드 부분을 갖는 사포닌 유사체의 제조
개시된 발명의 친유부는 선형 소수성 사슬에 제한되지 않는다. 또한 트리테르페노이드 및 스테로이드와 같은 비(非)방향족 및 방향족 시클릭 및 헤테로시클릭 화합물도 친유부로 사용할 수 있다. 예를 들어, 스테로이드 유도체의 제조법을 이하에 기재한다. 10ml 피리딘 중의 2mmol 디옥시콜산(0.79g)에 에틸렌디아민 10mmol(0.67ml)를 혼합시키면서 첨가한 다음, 무수 DCC 4mmol(0.82g)과 NHS 4mmol (0.50g)을 첨가한다. 이 혼합물을 25℃에서 밤새 반응시킨다. 그 후 반응을 냉각시키고 불용성 DCC 부산물을 여과시킨 다음 감압하에서 용매를 제거한다. 그 생성물을 적은 부피의 클로로포름-메탄올(3:2, 부피/부피) 또는 유사한 용매에 용해시키고, 실리카겔 상의 크로마토그래피로 에틸렌디아민으로부터 아민화된 생성물을 분리시킨다. 감압하에서 용매를 제거한다.
전술된 DCC/NHS 법을 사용하여 아민화된 디옥시콜산 유도체 2몰과 디스아실사포닌 1몰을 반응시켜 탈아실화된 사포닌 결합체를 제조한다. 결합된 사포닌을 알콜로 침전시키고, 물에 재용해시킨 후 동결건조시킨다.
실시예 8
항원으로 오브알부민(OVA)을 사용한 면역보강 효과에 대한 테스트
면역화 조성물에서의 잠재적인 면역보강제의 첨가로 인한 항원-특이적 항체 역가에서의 증가에 의해 면역보강 효과를 평가할 수 있다. 증가된 항체 농도 및/또는 증가된 항원/항체 친화도로 인해 역가가 증가된다. 먼저 기니아 피그에서의 발 및 구강 질환 백신에 대한 항체 중화의 역가의 증가에 의해(Dalsgaard, K., Archiv. fur die gesamte Virusforschung 44:243-254 (1974)), BSA/사포닌 혼합물로 백신화된 기니아 피그에서의 BSA(방사상 면역확산법으로 측정된 바와 같이)에 대한 항체 침전의 역가의 증가에 의해 (Dalsgaard, K., Acta Veterinaria Scandinavica 69:1-40 (1978)) 그리고 KLH/사포닌으로 면역화된 마우스에서의 안티-키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 항체(ELISA에 의해 측정)의 역가의 증가에 의해(Scott 등. Int. Archs. Allerty appl. Immun 77:409-412 (1985)) 사포닌의 면역증강 효과를 측정했다.
OVA/사포닌, OVA/탈아실화된 사포닌 또는 OVA/사포닌 유사체로 면역화시킨 안티-OVA 항체에서의 증가를 사포닌없이 OVA로 면역화시킨 것과 비교하여 면역보강 효과의 정도를 결정할 수 있다. 사포닌 결합체 분획물에서의 면역보강 활성을 다음과 같이 측정한다: CD2F1 마우스(8-10주된)에 다음 조성물을 피내주사하여 면역화시킨다: 20㎍ OVA(시그마) 및 본 발명의 면역보강제 또는 퀼라야사포닌(10-2500㎍ 범위의 투여량으로) 또는 200㎕ PBS 중의 퀼라야사포닌(10㎍의 투여량으로)을 2주 간격으로 두번 면역화시킨다. PBS 또는 OVA를 갖는 PBS를 200㎍의 수산화 알루미늄과 함께 대조 마우스에 주사한다. 면역화 2주 후에 혈청을 채취한다. ELISA로 안티-OVA 항체를 결정한다: 4℃에서 밤새 OVA 용액 100㎕로 이뮬론 II 플레이트를 A, C, E 및 G 의 순서로 피복했다. PBS로 플레이트를 두번 세척한다. 모든 웰에서 웰 당 100㎕ 희석액(PBS 중의 2% 카세인산 가수분해물(옥소이드, 중량/부피))으로 37℃에서 1.5 시간동안 배양시켜 비특이적 결합을 방지한다. 증류수 중의 0.05% 트윈 20 계면활성제로 플레이트를 4번 세척한다. 1:20, 1:100, 1:500, 1:2500, 1:12,500, 1:62,500, 1:312,500 및 1:1,562,500 희석 혈청을 A+B, C+D, E+F 및 G+H의 순서로 실온에서 1 시간동안 각각 (100㎕/웰) 배양시킨다. 전술된 바와 같이 플레이트를 세척한다. 뵈링거-만하임 호스 래디쉬 퍼옥시다제 결합체 고우트 안티-마우스 항체(희석액 중의 5% OVA의 1/5000)를 실온에서(모든 웰에서, 웰당 100㎕) 30분동안 배양한다. 전술된 바와 같이 플레이트를 세척한다. 2,2'-아지도-비스(3-에틸벤즈티아졸린)-6-설포네이트(실온에서 30분간 반응, 450nm에서 흡광도 측정) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(10분)과 반응시켜 퍼옥시다제 반응 정도를 결정한다. 각 혈청 희석액에 대한 항원-양성 웰의 흡광도로부터 항원-음성 웰의 흡광도를 빼서 전체 항체 결합에 대한 비특이적 항체 결합의 반응을 제거한다. 1:20 혈청 희석액의 교정 곡선(calibration curve)에서 얻어진 흡광도를 외삽법을 이용하여 일차 면역 반응동안 생성된 IgG를 결정한다. 면역 혈청 샘플과 함께 동시에 처리되는 안티-OVA IgG 모노클로날 항체의 공지된 양을 사용하여 교정 곡선을 만들 수 있다. 다음과 같이 최종점 역가로부터 이차 안티-OVA IgG 면역 반응을 결정한다: 항원 특이적 결합으로 인한 흡광도를 혈청 희석도의 로그 함수로 도시하며, 0.25의 흡광도를 나타내는 혈청 희석액에서 최종점을 산출한다. 면역보강제 없는 면역화에서 얻어진 혈청으로 3.6 이하의 최종점 역가를 얻는데, 여러 면역보강제가 있는 경우 최종점 역가는 5.0 근방 또는 그 이상이다. 10㎍의 면역보강제 투여량에서 투석된 퀼라야 사포나리아 몰리나 사포닌은 PBS 중의 OVA에 비해 거의 2 오더(order) 크기로 역가가 증가한다. OVA와 탈아실화된 퀼라야사포닌으로의 면역화로부터의 일차 면역 반응은 PBS 중의 OVA에 의해 유도된 것보다 IgG 수준을 낮춘다.
10, 50 및 250㎍의 투여량에서 면역보강성에 대해 실시예 3에서 제조된 결합체를 테스트했다. 결합체는 일차 및 이차 면역 반응(도 3, 4, 5, 6) 동안 안티-OVA IgG의 생성에 대해 투여량에 좌우되는 우수한 면역보강 효과를 나타냈다. 이 결합체는 퀼라야 사포닌에 의해 유도된 것에 접근하는 최종점 역가, 즉, 4.70 내지 5.85를 갖는다. 퀼라야사포닌과 반대로, 이 결합체는 IgG1의 생성을 우선적으로 자극한다. 테스트된 투여량 범위에서 이 결합체의 부작용은 관찰되지 않았다:10 내지 250㎍.
실시예 9
항원으로서 OVA를 사용한 T-세포 면역성에 대한 면역보강 효과의 테스트
암 백신에서와 같이, 많은 바이러스 백신에서, 단백질 항원과 사용된 면역보강제는 매우 특이적인 세포를 매개로 한 면역성(CMI) 또는 세포독성 T 림프구(CTL)를 생성하는 T-세포 면역 반응을 유도한다. 현재, 퀼라야사포닌이 T-세포 면역성을 유도할 수 있는 유일한 면역보강제이다(뉴만 등, J. Immuno. 148:2357 (1992)). 뮤라밀 디펩티드, 글루칸, IL-2와 같은 면역 조절자 등을 포함하여, 다른 면역보강제는 외인성 단백질에 대한 체액성 면역 반응만을 자극할 수 있으며(Cod, J.C., 및 Coulter, A.R., Vaccine 15:248(1997)), 암 및 몇몇 바이러스성 백신의 경우에는 거의 가치가 없다. 항체 생성(Kensil 등, Vaccine 92:35 (1992)) 및 CTL 반응(Kensil 등, in Saponins Used in Traditional and Modern Medicine; Kamasaki, K., Waller, G.R., Eds. Phenum, N.Y., in press)으로 측정된 바와 같이 퀼라야사포닌의 탈아실화는 면역보강성은 없지만, 비독성 생성물을 형성한다. 무시할 만한 독성 뿐만 아니라 체액성 및 T-세포 면역성의 자극때문에, 본 발명의 반(半)합성 유사체 또는 사포닌-친유기 결합체는 바이러스성 또는 암 백신의 제조에 적합하다. (i) 항원에 대한 민감화된 T 세포의 증식 반응을 측정하는 아세포 (blast) 전환 또는 (ii) 단백질 항원에 대한 CTL 프라이밍의 증강성을 측정하여 시험관내에서 이 면역보강제에 의해 유도된 T-세포 면역성을 분석할 수 있다.
다음 절차에 따라 세포 증식 분석에 의해 T-세포 면역성에 대한 면역보강 효과를 측정할 수 있다. 6주 내지 8주된 암컷 C57BL/6 마우스에 다음 조성물을 2번 피하주사하여 면역화시킨다: 200㎕ PBS 중의 20㎍ OVA(시그마) 및 본 발명의 면역보강제 또는 탈아실화된 퀼라야사포닌(10-250㎍의 범위의 투여량으로). 2주 간격으로 두번 면역화시킨다. 대조 마우스에 수산화 알루미늄 200㎍과 함께 PBS 또는 OVA를 갖는 PBS를 주사한다. 2차 면역화 2주 후에, 비장을 제거하고 나일론 메쉬를 통과시켜 분쇄한다. 세포를 세척하고 10% 열불활성화된 송아지 태아 혈청, 100㎍/㎕ 스트렙토마이신, 100㎍/㎕ 페니실린, 10㎍/ml 젠타마이신, 2mM L-글루타민, 및 2 x 10-5 M 2-메르캅토에탄올과 함께 RPMI 1640 배지에 재현탁시킨다. 2 x 10 5 비장 세포를 미소적정(microtiter) 플레이트 웰 내에 100㎕ 부피로 분배시키고, 배지 단독(백그라운드로 사용하기 위함), 3㎍/ml 콘카발린 A, OVA 2㎍/ml 또는 OVA 10㎍/ml 중 하나에서 세벌로 배양시킨다. 배양 72시간 후에, 삼중수소로 처리된 티미딘( 3H-티미딘, 아머샴 인터내셔날)1μCi로 세포를 16시간동안 진동시키고, 스카트론(스털링, VA) 반자동화 채취기를 사용하여 채취한다. 액체 섬광 계수로 세포성 DNA에 혼입된 표지 양을 결정한다. 세포 증식은 시험관내에서 OVA 2 또는 10㎍으로 자극된 비장구 사이에 혼입된 3H-티미딘의 차이(△cpm)으로 표현된다. OVA의 존재하에서의 3H-티미딘 혼입으로부터 결정된 바와 같이, OVA와 퀼라야사포닌으로 면역화된 마우스로부터의 T-림프구는 알룸으로 관찰된 것 보다 훨씬 높은 증식 반응을 나타낸다. OVA와 여러가지 투여량의 탈아실화된 퀼라야사포닌으로 면역화된 T-세포는 알룸으로 관찰된 것보다 낮은 증식 반응을 나타냈다. OVA 와 50 또는 250㎍의 사포닌 결합체로 면역화된 마우스로부터의 T-림프구는 퀼라야사포닌으로 관찰된 것과 유사하거나 그 보다 훨씬 높은 시험관내에서의 증식 반응(△c.p.m.)을 나타내었다(도 7).
실시예 10
글루쿠론산의 카르복실기에 비오틴의 첨가
실시예 2에 기재된 카르보디이미드법을 이용하여 집소필라, 사포나리아의 사포닌 또는 탈아실화된 퀼라야사포닌의 글루쿠론산 잔기의 카르복실기에 C 2-C 6 지방족 디아민을 첨가한다. 사포닌의 C 2-C 6 지방족 디아민 유도체의 유리 아미노기에 비오틴(Pierce)의 활성 에스테르 유도체(S-NHS)를 결합시켜 비오틴기를 첨가한다.
실시예 11
T-세포와 비오티닐화된 사포닌 결합에 대한 테스트
림프구, 백혈구 세포 또는 배양된 세포를 비오티닐화된 사포닌과 함께, Na 시아노보로히드라이드의 존재 또는 부재하에 37℃의 PBS 에서 배양시킨다. 배양 후에, BSA를 포함하는 PBS로 세포를 세척하고 원심분리시켜 수집한다. 세척되고 재현탁된 세포에 FITC-결합된 아비딘 또는 스트렙아비딘(xx mg/ml)을 첨가하고 xx℃에서 xx분동안 혼합물을 배양시킨다. 10% 송아지 태아 혈청을 포함하는 PBS로 세포를 세척하고 형광 현미경 또는 유동 세포분석법으로 샘플을 분석한다. 시아노보로히드라이드가 없는 비오티닐화된 사포닌으로 배양된 세포를 백그라운드 값을 제공하기 위해 사용한다. 시아노보로히드라이드의 존재하에 배양된 세포는 이민을 형성하는 사포닌(비닐티오닐화된 것 포함)을 결합시킬 수 있는 CD28 세포-표면-수용체를 갖는 T-세포의 측정값을 제공한다. 이 세포들은 B7.1에 의해 동시자극되어 활성화되기 쉽다.
이제까지 본 발명을 전부 기재했으나, 본 발명 또는 그 임의의 구체예의 범위를 해치지 않는 광범위한 등가 범위의 조건, 조성 및 기타 변수내에서 동일한 것을 수행할 수 있다는 것이 당업자에게 이해될 수 있을 것이다. 본 명세서에 기재된 모든 특허와 간행물은 본 명세서에서 완전히 참고로 인용된다.
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