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1. (CN102822337) Novel allene oxide synthase derived from lemna paucicostata
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来自于稀脉萍的新的丙二烯氧化物合酶


技术领域
本发明涉及来自于稀脉萍的新的丙二烯氧化物合酶基因、该丙二烯氧 化物合酶基因的表达产物、以及使用该丙二烯氧化物合酶基因的丙二烯氧 化物合酶的制造方法。
背景技术
丙二烯氧化物合酶是具有将氢过氧化的脂肪酸转换为丙二烯氧化物的 活性的酶。该丙二烯氧化物不稳定,因此非酶性转换为酮醇体。已知丙二 烯氧化物合酶存在于植物、动物及酵母中。在植物的情况下,认为存在于 全部被子植物中,例如,在大麦、小麦、玉米、棉花、茄子、亚麻(种等)、 莴苣、燕麦、菠菜、向日葵等中确认了其存在。通常已知在植物中,丙二 烯氧化物合酶有助于由于害虫和/或伤害引起的胁迫应答中的茉莉酸生物 合成途径,将13-羟基过氧化亚麻酸转换为12,13-环氧亚麻酸(小泽理香,蛋 白質核酸酵素(蛋白质核酸酶),48(13):1786-17922003)。
本发明者们发现具有花芽形成促进作用、植物激活作用及包含它们的 植物生长调节作用的具有以下的结构的α-酮醇不饱和脂肪酸(以下,称为 KODA)(日本特开平9-295908号公报),
KODA按照以下的路线在植物体内生成或酶生成。
即,使9位生成物特异性脂加氧酶(LOX)与α-亚麻酸反应得到9-氢过 氧化亚麻酸,接着使丙二烯氧化物合酶(AOS)与该9-氢过氧化亚麻酸反应, 由此将9位的氢过氧基脱水形成环氧基,通过将该环氧化合物非酶地转换 为酮醇体,从而KODA生成(日本特开平11-29410号公报、日本特开 2001-131006号公报及日本特开2009-17829号公报)。
已知KODA存在于各种植物种中,并已知受到胁迫的稀脉萍( Lemna   paucicostata )与其他植物相比释放出极高水平(数百倍)的KODA(日本特开 平11-29410号公报)。因此,推测在稀脉萍中,存在与其他植物的丙二烯 氧化物合酶相比在活性方面优异的丙二烯氧化物合酶。但是,尚未从稀脉 萍中分离出丙二烯氧化物合酶的cDNA,序列也未知。
将α-亚麻酸和/或亚油酸等作为起始原料通过酶合成制造KODA时, 丙二烯氧化物合酶是必需的。但是,丙二烯氧化物合酶通常具有自杀底物 的性质,因此提高底物的浓度的情况下,反而导致KODA生成量的减少, 难以通过酶法大量生产KODA。因此,期望特定高活性型的丙二烯氧化物 合酶。
发明内容
发明要解决的课题
本发明要解决的课题是,鉴别对KODA的生成有用的丙二烯氧化物合 酶,并分离cDNA;提供整合有该cDNA的载体;提供导入有该载体的转 化体;以及使用该转化体提供丙二烯氧化物合酶基因的表达产物;进而提 供使用该丙二烯氧化物合酶来酶法制造KODA和/或茉莉酸等化合物的方 法。
用于解决课题的方法
本发明者们为了解决上述课题而进行了深入研究,在由释放出其他植 物的数百倍的KODA的稀脉萍中分离新的丙二烯氧化物合酶cDNA时, 为了得到活性更高的丙二烯氧化物合酶cDNA,将稀脉萍株对于KODA生 产能进行了筛选。具体地说,进行了62种稀脉萍株的筛选,结果令人惊讶 地发现,稀脉萍SH株具有其他稀脉萍株的平均12倍以上的KODA生产 能(图1)。
本发明者们由稀脉萍SH株分离丙二烯氧化物合酶cDNA,并整合到 载体中,将该载体导入大肠杆菌并进行丙二烯氧化物合酶的蛋白质的表达, 试验了该丙二烯氧化物合酶蛋白质的活性。明确了来自于稀脉萍SH株的 丙二烯氧化物合酶具有高于现有使用的拟南芥的丙二烯氧化物合酶的活性 (图4)。
因此,本发明者们提供来自于稀脉萍SH株的新的丙二烯氧化物合酶 基因以及由该基因编码的蛋白质。具体地说,本发明提供包含序列号1所 示的碱基序列的DNA的基因、包含与该DNA实际上相同的DNA的基因、 以及由这些基因编码的蛋白质。进而,本发明者们提供使上述DNA与载 体片段结合而成的表达载体。进而,本发明还涉及由该表达载体转化而得 的微生物、动物细胞或昆虫细胞等转化体。本发明的丙二烯氧化物合酶如 下获得:培养上述转化体,回收该转化体,由该转化体提取丙二烯氧化物 合酶,并进行纯化。
发明的效果
本发明的来自于稀脉萍SH株的丙二烯氧化物合酶显示与现有使用的 丙二烯氧化物合酶相比活性较高(图3)。认为该高的活性是由于其没有通常 已知的丙二烯氧化物合酶所具有的自杀底物的性质。因此,通过使用本发 明的丙二烯氧化物合酶,可以在以α-亚麻酸和/或亚油酸等作为起始原料的 酶法合成法中,高效地制造以KODA为代表的α-酮醇不饱和脂肪酸。另 外,丙二烯氧化物合酶有助于茉莉酸生物合成途径,因此可以高效地制造 茉莉酸。
附图说明
图1是显示62种稀脉萍株中的KODA生产量的图。
图2A是显示稀脉萍SH株的丙二烯氧化物合酶基因的核酸序列和氨基 酸序列的图。
图2B是显示图2A的序列的继续的图。
图2C是显示图2B的序列的继续的图。
图3A是显示使用拟南芥AOS的KODA生成的HPLC色谱图的图。
图3B是显示使用SHLpAOS的KODA生成的HPLC色谱图的图。
图4是显示在大肠杆菌中表达的来自于SH株的丙二烯氧化物合酶 (SHLpAOS)和作为对照使用的拟南芥的丙二烯氧化物合酶(AtAOS)的丙二 烯氧化物合酶活性的比较图。
具体实施方式
以下,对于本发明的实施方式进行说明。本发明涉及来自于稀脉萍SH 株的新的丙二烯氧化物合酶基因及由该基因编码的蛋白质。具体地说,本 发明涉及包含序列号1所示的碱基序列的DNA、和与该DNA实际上相同 的DNA的基因。进而,本发明涉及包含以下DNA的基因:编码包含序列 号2所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA、编码包含与该氨基酸序列实际上 相同的氨基酸序列的蛋白质的DNA。进而,本发明涉及作为上述DNA的 片段的、编码具有丙二烯氧化物合酶活性的蛋白质的DNA片段。
所谓“实际上相同的DNA”,是指与参考基准的DNA在碱基序列中 具有至少70%的同一性的DNA。该同一性优选为至少80%、至少90%、 至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或至少99.9%。 进而,“实际上相同的DNA”还是指与包含参考基准的DNA的互补碱基 序列的DNA在高严格条件下杂交的DNA。这些“实际上相同的DNA”在 被转录、翻译的情况下,具有与由参考基准的DNA编码的蛋白质相同的 酶活性、即丙二烯氧化物合酶活性。
杂交可按照公知的方法或依据该公知的方法的方法、例如J.Sambrook 等,Molecular Cloning 2nd,Cold Spring Harbor Lab.Press,1989中记载的 方法来进行,另外所谓高严格的杂交条件,是指例如NaCl浓度为约10~ 40mM、优选为约20mM,温度为约50~70℃,优选为约60~65℃的条件。
本发明进一步涉及包含序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质、以及包 含与该氨基酸序列实际上相同的氨基酸序列的蛋白质。进而,本发明还涉 及由序列号1所示的碱基序列的DNA、或与该DNA实际上相同的DNA 编码、且具有丙二烯氧化物合酶活性的蛋白质。进而,本发明还涉及作为 上述蛋白质的片段的、具有丙二烯氧化物合酶活性的蛋白质片段。
所谓“包含实际上相同的氨基酸序列的蛋白质”,是指包含在参考基 准的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1或数个氨基酸的氨基酸序列,而 且具有包含参考基准的氨基酸序列的蛋白质的活性、即丙二烯氧化物合酶 活性的蛋白质。进而,所谓“包含实际上相同的氨基酸序列的蛋白质”, 是指包含与参考基准的氨基酸序列具有至少70%的同一性的序列,而且具 有丙二烯氧化物合酶活性的蛋白质。同一性优选为至少80%、至少90%、 至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或至少99.9%。
在本说明书中,序列号1表示来自于稀脉萍SH株的丙二烯氧化物合 酶的碱基序列,序列号2表示该丙二烯氧化物合酶的氨基酸序列。将它们 的具体序列示于图2A~C。
所谓丙二烯氧化物合酶活性,是指将被氢过氧化的脂肪酸转换为丙二 烯氧化物的酶活性。
本发明中所谓丙二烯氧化物合酶或具有丙二烯氧化物合酶活性的蛋白 质,是指例如通过后述的活性测定法确认了具有显著的丙二烯氧化物合酶 活性的蛋白质。包含例如,与具有序列号2所示的氨基酸序列的丙二烯氧 化物合酶的活性进行比较,具有例如至少10%、至少50%、至少70%、 至少80%、至少90%、更优选为至少95%的活性的蛋白质,以及具有100 %以上、例如110%以上、120%以上、150%以上、200%以上的活性的蛋 白质。
本发明的基因(cDNA),例如可通过以下的步骤来得到。根据来自于植 物的丙二烯氧化物合酶的共有氨基酸序列来设计引物,进行RT-PCR等, 得到cDNA片段。根据需要将该片段用32P或地高辛等标记,使用它们并 使用5’-RACE、3’-RACE或制作的cDNA文库通过常规方法进行筛选, 可得到丙二烯氧化物合酶基因(cDNA)全长。碱基序列的确定可通过桑格法 (Sanger’s method)或化学降解法(Maxam-Gilbert method)等通常的方法进 行。
作为其他方法,将来自于稀脉萍的丙二烯氧化物合酶使用硫酸铵分级 和/或各种色谱等的方法来纯化,通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离, 并电转印于PVDF膜等,切下用考马斯亮蓝等的色素检测出的带,然后通 过蛋白质测序仪,确定N末端氨基酸序列,以该序列为基础设计引物,按 照上述的方法通过进行PCR可得到丙二烯氧化物合酶基因(cDNA)全长。
分离的基因(cDNA)例如通过公知的方法插入质粒、病毒等来制备表达 载体,将其导入宿主细胞例如微生物、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞等 培养细胞中使其表达,从而可大量制备该蛋白质。进而,作为蛋白质表达 系统,还有时使用例如使用小麦胚芽提取物的无细胞蛋白质表达系统。
作为载体,可使用:来自于大肠杆菌(Escherichia coli)的质粒,例如 pBR322、pBR325、pUC18、pUC119;来自于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 的质粒,例如pUB110、pTP5、pC194;来自于酵母的质粒,例如pSH19、 pSH15;λ噬菌体等噬菌体;逆转录病毒、牛痘病毒、杆状病毒等动物病 毒;以及pA1-11、pXT1、pRC/CMV、pRC/RSV、pcDNAI/Neo等,但并 不限定于这些。在本发明中可使用市售的载体pET41a(Novagen)。
含有本发明的基因的表达载体可以通过在适当的载体的启动子的下游 介由适当的限制性位点以公知的方法连接本发明的基因来制造。作为本发 明中使用的启动子,只要是与基因的表达中使用的宿主相对应的适当的启 动子则没有特别限制。例如,在使用动物细胞作为宿主的情况下,可举出 SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV启动子、HSV-TK启动 子、β-肌动蛋白启动子等。宿主为大肠杆菌等埃希氏菌属的细菌的情况下, 优选使用trp启动子、lac启动子、recA启动子、λPL启动子、lpp启动子、 T7启动子等,宿主为杆菌属菌的情况下,优选使用SPO1启动子、SPO2 启动子、pen启动子,宿主为酵母的情况下,优选使用PHO5启动子、PGK 启动子、GAP启动子、ADH启动子等。宿主为昆虫的情况下,优选为多 角体蛋白启动子、P10启动子等。根据需要,在表达载体中可进一步包含 增强子、剪接信号、多聚A添加信号、选择标志物、SV40复制起点等。
宿主细胞可以是作为用于产生重组蛋白的宿主一直以来被利用的原核 或真核细胞的任一种,例如没有限定地为哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物 细胞或真菌细胞,并且优选为细菌或真菌等的微生物。“真菌”的用语表 示包含丝状菌及酵母的含义。适当的细菌的例子可举出埃希氏菌属 ( Escherichia )例如大肠杆菌、杆菌属例如枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis )、 链霉菌属( Streptomyces )例如变铅青链霉菌( S.lividans )等革兰氏阳性菌;假 单胞菌属( Pseudomonas )例如洋葱假单胞菌( P.cepacia )等革兰氏阴性菌。另 外,该细胞可为真菌、即酵母或丝状菌的细胞。酵母例如可以是酵母属 ( Saccharomyces )的细胞,例如酿酒酵母( S.cerevisiae )。丝状菌宿主生物例 如可以是曲霉属( Aspergillus )种的株,例如黑曲菌( A.niger )。作为昆虫细 胞,可举出例如Sf细胞、MG1细胞、BmN细胞等。作为动物细胞,可举 出例如猴细胞COS-7细胞、Vero细胞、中国仓鼠细胞CHO等。在本发明 中特别优选利用大肠杆菌细胞。
宿主细胞的转化可利用公知的方法,例如氯化钙法、磷酸钙共沉淀法、 DEAE葡聚糖法、脂质体转染法、原生质体聚乙二醇融合法、电穿孔法等, 根据利用的宿主细胞来选择适当的方法即可。
用适当的培养基培养得到的重组宿主细胞,由培养液以惯用的步骤回 收目标蛋白质,所述惯用的步骤例如,没有限定地通过离心或过滤由培养 液分离细胞,根据需要破碎细胞,通过硫酸铵等盐使上清液或滤液的蛋白 质性成分沉淀,接着进行各种色谱步骤,例如进行离子交换色谱、亲和色 谱等。为了实现目标蛋白质的回收,可使用包含标签序列的载体。作为标 签,可举出His标签、GST标签、c-Myc标签、HA标签等。
如果在编码本发明的蛋白质的DNA的上游连接用于分泌的微生物用 或动物用的适当的信号序列,则可使该蛋白质分泌表达到培养基中。改变 为这样的分泌型的DNA,在容易纯化分泌于培养基中的该蛋白质的方面是 有用的。作为该信号序列的例子,可举出大肠杆菌的情况下的pelB信号 (S.P.Lei等,J.Bacteriology,169:4379-4383,1987)、酵母的情况下的α因 子信号(A.J.Brake,Yeast Genetic Engineering,p269Butterworth,1989)、 动物细胞的情况下的免疫球蛋白的信号SG-1(H.Maeda等、Hum.Antibod. Hybridomas,2:124-134,1991)、C25的信号(WO94/20632)等。
丙二烯氧化物合酶活性的测定可以如下进行:使9位生成物特异性脂 加氧酶作用于α-亚麻酸,接着在作为酶生成物的9-羟基过氧化亚麻酸 (9-HPOT)中加入一定量的丙二烯氧化物合酶,由此生成KODA,通过 HPLC定量地分析所生成的KODA。
本发明的蛋白质,例如作为用于在各种的亚油酸、亚麻酸衍生物等的 合成中利用的试剂可以是有用的。具体地说,本发明的蛋白质作为由亚油 酸和/或亚麻酸酶法合成作为植物生长调节剂有用的α-酮醇不饱和脂肪酸、 特别是KODA时使用的酶是有用的。另外,考虑通过将本发明的基因导入 植物体中,可控制通过存在于植物体内的亚油酸和/或亚麻酸的丙二烯氧化 物合酶进行的代谢。
以下,通过实施例更具体地说明本发明。但是,本发明的技术的范围 不受这些实施例等限定。
实施例
实施例1:KODA高生产稀脉萍株的筛选
准备从各种场所采集的62种稀脉萍,在稀释为1/2倍的Hunter培养 基中,在来自于24~25℃的日光色荧光灯的连续的光照射的下进行传代培 养。稀释为1/2倍的Hunter培养基含有以下的成分:
使用KOH(50%)调整至pH值6.2~6.5。
将增殖的稀脉萍在滤纸上展开,放置2小时后,在水中浸渍1小时。 将该水用高速液相色谱(HPLC;柱:TYPE UG1205μm SIZE 4.6mm I.D× 250mm;保护过滤器:INERTSTL 4.6mm×50mm;洗脱液:50%乙腈+0.1% 三氟乙酸;条件:吸光度的波长210λ(nm),流速1.ml/分钟,柱温度40℃) 分析KODA的浓度。全部的稀脉萍株的KODA生产量平均为4.97μM。 其中,稀脉萍SH株生产60.2μM的KODA,多达全部株的平均KODA 生产量的约12倍,实现了极高的生产量(图1)。
实施例2:来自于稀脉萍株的丙二烯氧化物合酶的克隆化及其活性测
由稀脉萍SH株( Lemna paucicostata,SH )使用RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)提取总RNA后,由1.8μg的总RNA使用LongRange 2Step RT-PCR Kit(Qiagen)通过RT-PCR法来合成cDNA。将合成的cDNA使 用以下所示的来自于拟南芥( Arabidopsis thaliana )的引物,将PCR的退火 温度较低地设定为45℃,得到来自于SH株的丙二烯氧化物合酶 (SHLpAOS)的一部分序列信息。
AOS-正向5’-GGA ACT AAC CGG AGG CTA CCG-3’(序列号3)
AOS-反向5’-CCG TCT CCG GTC CAT TCG ACC ACA A-3’(序列 号4)
以该序列信息为基础,通过3’或5’RACE法(cDNA末端快速扩增, Rapid Amplification of cDNA end)确定全长序列。
3’-RACE用引物
SH-3’-TP:5’-TCTGGGCAGACTCTTCTTTGGAG-3’(序列号5)
5’-RACE用引物
SH-5’-TP:5’-CCGGCTTGCGCTATATATCTGAGAATT-3’(序列号 6)
3’-RACE
以上述实验中所得到的SH株的总RNA2μg作为模板,使用 CapFishingTM target full-length cDNA cloning Kit(Seegene)合成cDNA。将 该cDNA制成模板溶液,试剂盒内接头引物(3’-RACE引物)和SH-3’-TP 分别进行PCR。
5’-RACE
以上述实验中得到的SH株的总RNA 2μg作为模板,使用 CapFishingTM target full-length cDNA cloning Kit(Seegene)合成cDNA。将 该cDNA制成模板溶液,试剂盒内接头引物(5’-RACE引物)和SH-5’-TP 分别进行PCR。
确定PCR产物的序列,使用以下所示的引物和上述的cDNA进行 PCR,将cDNA的全序列亚克隆到pTAC-2载体(BioDynamics)中。另外, 为了插入表达载体中,在5’侧添加NcoI位点,在3’侧添加XhoI位点。
SHAOS-F:5’-CCGCGCCA TGGAGAAGAGAA TGTC TG TCTCGC -3’(序列号7)
SHAOS-R:5’-CCGCGCTCGAGGTTGAATAAGCACGAGTGT-3’ (序列号8)
其结果由SH株得到1个序列的新的AOS同系物(核酸序列1443bp、 氨基酸序列480aa、推定分子量53.3KDa)(图2A-C)。将通过该稀脉萍SH 株得到的丙二烯氧化物合酶命名为SHLpAOS。
通过上述的方法整合到pTAC-2载体中,分别用NcoI、XhoI切断 SHLpAOS序列后,导入市售的蛋白质表达用载体pET41a(Novagen)中, 得到稀脉萍丙二烯氧化物合酶表达用质粒pET41A/SHLpAOS。将该质粒 转化大肠杆菌BL21(DE3)株(Novagen)。接着,在含有30mg/L的卡那霉素 的LB培养基3ml中接菌,在37℃以250转/分钟进行一夜振荡培养。对含 有同浓度的卡那霉素和1%葡萄糖的LB培养基10ml添加100μl该培养液, 在37℃以250转/分钟进行3~4小时振荡培养。由该培养液25ml用离心 分离回收菌体,移至含有0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(和光纯 药)、30mg/L的卡那霉素的TB培养基50ml中,在25℃以250转/分钟进 行一夜振荡培养,从而进行丙二烯氧化物合酶的诱导。培养结束后进行离 心分离,对菌体湿重1g,添加5ml的BugBusterTM(Novagen)溶解菌体。 其后进行离心分离(9000转/分钟、5分钟、4℃),回收上清,制成酶液。使 用该酶液进行KODA制造中的活性试验。
KODA制造中的活性试验,制成5mM亚麻酸溶液(溶解于0.1% Tween80溶液),在pH值7的条件下,与由稻的胚芽提取的脂加氧酶在室 温下反应10分钟,合成9-羟基过氧化亚麻酸(9-HPOT)溶液。对该9-HPOT 反应溶液20μl,添加SHLpAOS蛋白质或来自于拟南芥的AOS(AtAOS) 蛋白质0.32ng,在室温下反应10分钟。反应后,在50℃通过3分钟的加 热处理终止反应。用HPLC分析10μl的该溶液。HPLC分析在如下条件 下进行:柱:カプセルパツク(CAPCELL PAK)C-18UG120(4.6×250mm, 资生堂),柱温度:40℃,移动相:50%乙腈溶液(0.02%TFA),流速:1ml/ 分钟,检测波长:210nm。将该HPLC的结果示于图3(A、B)。如HPLC 图所示,确认了KODA的峰,显示来自于稀脉萍SH株的丙二烯氧化物合 酶可用于KODA制造。另外,SHLpAOS蛋白质比AtAOS蛋白质活性强 至近7倍(图4)。
进行由稀脉萍SH株得到的SHLpAOS的动力学分析。使用40mMM 磷酸缓冲液(pH值7.5)、1%EtOH的反应液,在反应温度为25℃下进行。 作为底物的9-HPOT以5~53μM的底物浓度进行试验。另外,成为底物 的9-HOPT作为EtOH溶液添加,调制成EtOH终浓度为1%。将反应液 100μl加入比色杯中,使用SmartSpec PLUS分光光度计(Bio-Rad),对 234nm的吸光度的减少,以2秒的间隔经时地进行1分钟扫描。由测定的 A 234 算出反应产物的量(E=25000)。动力学参数使用Hanes-Woolf作图 ([S]/V Versus[S]作图)来确定。其结果如表1所示,在SHLpLOX中,K m 值大幅低于AtAOS,与9-HPOT的亲和性高至约5倍。另外,V max 为AtAOS 的约2.8倍,非常高。K cat 值也是SHLpAOS高至AtAOS的约2.8倍,反 应周转非常有效地发生。K cat /K m 值,SHLpAOS为AtAOS的约14倍。认 为SHLpAOS与AtAOS相比,是在实用的KODA制造中非常有用的AOS。 由以上可明确,由稀脉萍SH株克隆化的SHLpAOS,是目前为止尚未报 告的、具有非常高的活性的AOS。
表1SHLpAOS和AtAOS的动力学参数