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1. CN101874042 - Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in cdr

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[ ZH ]
利用CDR的氨基酸取代来改变抗体等电点的方法


技术领域
本发明涉及利用CDR的氨基酸取代,在保持抗体的抗原结合活性的同时改变其等电点的方法;控制抗体的血浆中药物动力学(血中动力学)的方法;含有等电点已被改变的抗体作为有效成分的医药组合物及其制造方法。
本发明还涉及通过修饰暴露于抗IL-6受体抗体、抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体和抗IL-31受体抗体的CDR区表面的氨基酸残基,来控制该抗IL-6受体抗体、抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体和抗IL-31受体抗体的血浆中半衰期的方法;利用氨基酸残基的修饰使血浆中半衰期得到控制的抗体(抗IL-6受体抗体、抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体和抗IL-31受体抗体);含有该抗体作为有效成分的医药组合物;以及这些医药组合物的制造方法。
本发明还涉及含有抗IL-6受体抗体作为有效成分的医药组合物及其制造方法。
背景技术
抗体在血浆中的半衰期长、副作用也少,因此作为药品而受到关注。其中,有多种IgG型抗体药物已上市,目前还有多种抗体药物正在开发中(非专利文献1、非专利文献2)。现在上市的抗体药物基本是嵌合抗体、人源化抗体、人抗体,将通过将人源化抗体或人抗体改良,改善其药效、便利性、成本,从而具有更优异的特性的多种抗体药物现在正在开发中。作为能够适用于这些抗体药物的技术,人们开发了各种技术,有人报道了提高效应子功能、抗原结合能力、药物动力学、稳定性的技术或降低免疫原性风险的技术等。作为增强药效或者减少给药量的方法,有人报道了通过取代IgG抗体Fc区的氨基酸来增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC活性)或补体依赖性细胞毒性(CDC活性)的技术(非专利文献3、4)。另外,作为提高抗原结合能力、抗原中和能力的技术,有人报道了亲和力成熟技术(非专利文献5),通过向可变区的CDR区等的氨基酸中导入突变,可以提高抗原结合活性。
目前的抗体药物所面临的问题有:蛋白给予量非常多所导致的高制造成本。关于给药方式,当为慢性自身免疫疾病时,优选皮下给药制剂,但通常皮下给药制剂必需是高浓度制剂,当为IgG型抗体制剂时,从稳定性等方面考虑,通常认为100mg/mL左右的制剂是极限(非专利文献6)。为了能够发挥持续的治疗效果而延长抗体的血浆中半衰期,从而可以减少蛋白给予量,以较长的给药间隔进行皮下给药,可以提供成本低且便利性高的具有优异特性的抗体药物。
抗体的血浆中半衰期长与FcRn密切相关,关于抗体同种型间的血浆中半衰期的不同,已知IgG1和IgG2的血浆中半衰期最长,而IgG3和IgG4的血浆中半衰期比IgG1和IgG2的短(非专利文献7)。作为进一步延长血浆中半衰期优异的IgG1和IgG2抗体的血浆中半衰期的方法,有人报道了:增强与FcRn结合的恒定区的氨基酸取代(非专利文献8、9、10)。但是,从免疫原性的角度考虑,向恒定区中导入人工氨基酸突变会存在问题。相对于此,最近有人报道了:通过向抗体可变区的氨基酸中导入突变来提高抗体的药物动力学的方法(专利文献1)。
根据专利文献1的报道,通过改变等电点可以控制IgG的药物动力学;而通过向抗体可变区的构架中导入氨基酸取代,可以在不降低抗体的抗原结合活性的情况下降低抗体的等电点、延长抗体的血浆中半衰期。具体而言,例如通过向Kabat编号的H10、H12、H23、H39、H43、H105中导入氨基酸取代,可以在不降低抗体的抗原结合活性的情况下降低抗体的等电点。并且,对于其他构架序列,也可以在不降低结合活性的情况下导入氨基酸突变,但有人认为:仅凭向构架序列中导入氨基酸取代,并不足以大幅降低等电点。其原因在于:氨基酸取代后的构架序列通常使用人抗体序列以降低免疫原性,而人抗体构架序列被高度保留、多样性少,所以氨基酸取代的自由度小。因此,在仅凭向构架中导入氨基酸取代而不能充分降低抗体等电点的情况下,难以进一步降低等电点。
另一方面,CDR序列由于体细胞突变而具有广泛的多样性,且具有用于获得与抗原结合的多样性,所以与构架相比,氨基酸取代的自由度明显大。但是,已知CDR序列对于发挥强抗原结合活性是最重要的因素,通常CDR序列的氨基酸取代会影响抗体的抗原结合活性。因此,难以利用CDR序列的氨基酸取代在不大幅降低抗体的抗原结合活性的情况下降低抗体的等电点。此外,由于CDR序列根据抗原种类而相差甚大,因此,认为在不依赖于抗体种类、不大幅降低抗体的抗原结合活性的情况下,对抗体的CDR序列的氨基酸进行取代极为困难。实际上,这种情况从以下所示的多个发现中不难推测出来。
将非人动物种的抗体人源化时,通常采用将非人动物种的CDR序列移植到人构架序列中的CDR嫁接。当通过CDR嫁接得到的人源化抗体与嵌合抗体不具有同等的结合活性时,通过将决定CDR结构的构架序列的一部分氨基酸取代为该抗体来源的非人动物种的抗体的构架序列,可以恢复结合活性(非专利文献11)。如上所述,CDR的序列和结构对该抗体所具有的抗原结合活性和特异性极为重要。众所周知,利用由抗体CDR中的天冬氨酸残基的异构化反应、天冬酰胺残基的脱酰胺化反应、甲硫氨酸残基的氧化反应引起的抗体CDR残基的变化,使抗体的抗原结合活性减弱(非专利文献12),这也表明:CDR序列对抗体的抗原结合活性极为重要。并且,有报道称:向抗体H链CDR2序列中导入氨基酸取代时,往往会使抗原结合活性大幅降低,而且抗体的表达量也减少(非专利文献13~15)。已经明确:特别是向H51中导入氨基酸取代时,抗体的表达量明显减少(非专利文献16)。此外,向抗体H链CDR3序列中导入突变时,往往会使抗原结合活性大幅减弱(非专利文献17、18)。进行抗体CDR序列的丙氨酸扫描时,通过将存在于CDR中的氨基酸取代成丙氨酸,往往会使该抗体的抗原结合活性大幅减弱(非专利文献19~23)。认为在取代成丙氨酸时,对抗原结合活性的影响根据抗体种类而不同。即,通常认为通过取代抗体CDR序列的氨基酸,其抗原结合活性会减弱,迄今为止,关于不依赖于抗体种类、不使抗体的抗原结合活性大幅降低的氨基酸取代位点未见报道。
在用于研制具有更优异的特性的抗体分子的抗体工程学中,导入抗体CDR序列中的氨基酸取代几乎都瞄准亲和力成熟。亲和力成熟通常是指:对于某亲抗体分子的CDR序列,将具有随机化CDR序列的抗体文库在噬菌体或核糖体上展示,通过淘选抗原,取得抗原结合活性进一步提高的抗体的方法。利用该方法可以发现提高抗原结合活性的抗体CDR序列中的氨基酸取代(非专利文献5、24~26)。但是,通过该方法得到的、抗原结合活性提高的氨基酸取代根据抗体的种类而不同,所以迄今为止关于不依赖于抗体种类、使抗原结合活性提高的CDR序列中的氨基酸取代位点未见报道。有人报道了:除利用亲和力成熟以外,通过取代特定位点的CDR序列的氨基酸来提高抗体在哺乳类细胞中的表达量的方法(专利文献2)。根据专利文献2,通过将特定位点的CDR序列的氨基酸取代成特定的序列,可以不依赖于抗体种类而提高抗体在哺乳类细胞中的表达量。还有人报道了:为了降低抗体的免疫原性而进行避免存在于抗体CDR序列中的T细胞表位的去免疫化作用(de-immunization),但迄今为止在不依赖于抗体种类、不降低抗体的结合活性的情况下,除去存在于CDR序列中的T细胞表位的氨基酸取代方法未见报道(非专利文献27、28)。
如上所述,由于抗体的CDR序列与抗原结合活性密切相关,所以通常CDR序列的氨基酸取代会降低结合活性,CDR序列的氨基酸取代对抗原结合活性的影响根据抗体种类而不同。专利文献1中给出了利用CDR中的氨基酸取代来控制等电点的例子,但却认为根据抗体的种类,有可能会降低抗原结合活性。此外,有人报道了:不依赖于抗体种类、利用共通的氨基酸取代来提高抗体表达的方法,但迄今为止尚无提高抗体的抗原结合活性的报道,也未见在不大幅降低抗体的抗原结合活性的情况下除去T细胞表位的方法的报道。而且,有关在不依赖于抗体种类、不会大幅降低抗体的抗原结合活性的情况下可以进行氨基酸取代的抗体的CDR序列完全未见报道。
需要说明的是,本发明的在先技术文献如下。
非专利文献1:Monoclonal antibody successes in the clinic,Janice MReichert,Clark J Rosensweig,Laura B Faden & Matthew C Dewitz.Nature Biotechnology 23:1073-1078(2005).
非专利文献2:Pavlou AK,Belsey MJ.The therapeutic antibodiesmarket to 2008.Eur J Pharm Biopharm.2005 Apr;59(3):389-96.
非专利文献3:Presta LG.Engineering of therapeutic antibodies tominimize immunogenicity and optimize function.Adv Drug Deliv Rev.2006 Aug 7;58(5-6):640-56.
非专利文献4:Kim SJ,Park Y,Hong HJ.Antibody engineering forthe development of therapeutic antibodies.Mol Cells.2005 Aug 31;20(1):17-29 Review.
非专利文献5:Fujii I.Antibody affinity maturation by randommutagenesis.Methods Mol Biol.2004;248:345-59.
非专利文献6:Shire SJ,Shahrokh Z,Liu J.Challenges in thedevelopment of high protein concentration formulations.J Pharm Sci.2004 Jun;93(6):1390-402.
非专利文献7:Salfeld JG.Isotype selection in antibody engineering.Nat Biotechnol.2007Dec;25(12):1369-72.
非专利文献8:Hinton PR,Johlfs MG,Xiong JM,Hanestad K,OngKC,Bullock C,Keller S,Tang MT,Tso JY,Vasquez M,Tsurushita N. Engineered human IgG antibodies with longer serum half-lives in primates.J Biol Chem.2004Feb 20;279(8):6213-6.
非专利文献9:Hinton PR,Xiong JM,Johlfs MG,Tang MT,Keller S,Tsurushita N.An engineered human IgG1 antibody with longer serumhalf-life.J Immunol.2006 Jan 1;176(1):346-56.
非专利文献10:Ghetie V,Popov S,Borvak J,Radu C,Matesoi D,Medesan C,Ober RJ,Ward ES.Increasing the serum persistence of anIgG fragment by random mutagenesis.Nat Biotechnol.1997 Jul;15(7):637-40.
非专利文献11:Almagro JC,Fransson J.Humanization of antibodies.Front Biosci.2008 Jan 1;13:1619-33.
非专利文献12:Liu H,Gaza-Bulseco G,Faldu D,Chumsae C,Sun J.Heterogeneity of monoclonal antibodies.J Pharm Sci.2008 Jul;97(7):2426-47.
非专利文献13:Chen C,Roberts VA,Rittenberg MB.Generationand analysis of random point mutations in an antibody CDR2 sequence:many mutated antibodies lose their ability to bind antigen.J Exp Med.1992 Sep 1;176(3):855-66.
非专利文献14:Chen C,Martin TM,Stevens S,Rittenberg MB.Defective secretion of an immunoglobulin caused by mutations in theheavy chain complementarity determining region 2.J Exp Med.1994 Aug1;180(2):577-86.
非专利文献15:Wiens GD,Heldwein KA,Stenzel-Poore MP,Rittenberg MB.Somatic mutation in VH complementarity-determiningregion 2 and framework region 2:differential effects on antigen bindingand Ig secretion.J Immunol.1997 Aug 1;159(3):1293-302.
非专利文献16:Wiens GD,Lekkerkerker A,Veltman I,RittenbergMB.Mutation of a single conserved residue in VH complementarity-determining region 2 results in a severe Ig secretiondefect.J Immunol.2001 Aug 15;167(4):2179-86.
非专利文献17:Zwick MB,Komori HK,Stanfield RL,Church S,Wang M,Parren PW,Kunert R,Katinger H,Wilson IA,Burton DR.Thelong third complementarity-determining region of the heavy chain isimportant in the activity of the broadly neutralizing anti-humanimmunodeficiency virus type 1 antibody 2F5.J Virol.2004 Mar;78(6):3155-61.
非专利文献18:Komissarov AA,Marchbank MT,Calcutt MJ,QuinnTP,Deutscher SL.Site-specific mutagenesis of a recombinantanti-single-stranded DNA Fab.Role of heavy chaincomplementarity-determining region 3 residues in antigen interaction.JBiol Chem.1997 Oct 24;272(43):26864-70.
非专利文献19:Gerstner RB,Carter P,Lowman HB.Sequenceplasticity in the antigen-binding site of a therapeutic anti-HER2 antibody.J Mol Biol.2002 Aug 30;321(5):851-62.
非专利文献20:Vajdos FF,Adams CW,Breece TN,Presta LG,deVos AM,Sidhu SS.Comprehensive functional maps of theantigen-binding site of an anti-ErbB2 antibody obtained with shotgunscanning mutagenesis.J Mol Biol.2002 Jul 5;320(2):415-28.
非专利文献21:Pons J,Rajpal A,Kirsch JF.Energetic analysis of anantigen/antibody interface:alanine scanning mutagenesis and doublemutant cycles on the HyHEL-10/lysozyme interaction.Potein Sci.1999May;8(5):958-68.
非专利文献22:Leong SR,DeForge L,Presta L,Gonzalez T,Fan A,Reichert M,Chuntharapai A,Kim KJ,Tumas DB,Lee WP,Gribling P,Snedecor B,Chen H,Hsei V,Schoenhoff M,Hale V,Deveney J,Koumenis I,Shahrokh Z,McKay P,Galan W,Wagner B,Narindray D, Hebert C,Zapata G.Adapting pharmacokinetic properties of a humanizedanti-interleukin-8 antibody for therapeutic applications using site-specificpegylation.Cytokine.2001 Nov 7;16(3):106-19.
非专利文献23:Xiang J,Srivamadan M,Rajala R,Jia Z.Study ofB72.3 combining sites by molecular modeling and site-directedmutagenesis.Protein Eng.2000 May;13(5):339-44.
非专利文献24:Rothe A,Hosse RJ,Power BE.Ribosome display forimproved biotherapeutic molecules.Expert Opin Biol Ther.2006 Feb;6(2):177-87.
非专利文献25:Schmitz U,Versmold A,Kaufmann P,Frank HG.Phage display:a molecular tool for the generation of antibodies--a review.Placenta.2000 Mar-Apr;21 Suppl A:S106-12.
非专利文献26:Rajpal A,Beyaz N,Haber L,Cappuccilli G,Yee H,Bhatt RR,Takeuchi T,Lerner RA,Crea R.A general method for greatlyimproving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries.ProcNatl Acad Sci U S A.2005 Jun 14;102(24):8466-71.
非专利文献27:De Groot AS,Knopp PM,Martin W.De-immunization of therapeutic proteins by T-cell epitope modification.Dev Biol(Basel).(2005)122:171-94.
非专利文献28:
http://www.algonomics.com/proteinengineering/tripole_applications.php.
专利文献1:WO/2007/114319
专利文献2:US/2006/0019342
发明内容
发明所要解决的课题
本发明鉴于上述状况而设,其目的在于提供:在保持多肽的抗原结合活性的同时改变其等电点的方法,所述多肽包含抗体可变区;控制抗体的血浆中半衰期的方法;含有血浆中半衰期得到控制的抗体作为有效成分的医药组合物;以及该抗体和含有该抗体作为有效成分的医药组合物的制造方法。
本发明的目的还在于提供:通过修饰暴露于抗IL-6受体抗体、抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体和抗IL-31受体抗体的CDR区表面的氨基酸残基,来控制上述抗体的血浆中半衰期的方法;通过修饰氨基酸残基使血浆中半衰期得到控制的抗IL-6受体抗体、抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体和抗IL-31受体抗体;上述抗体的制造方法;以及含有上述抗体作为有效成分的医药组合物。
并且,本发明的目的还在于提供:包含优于TOCILIZUMAB的第2代分子的医药组合物、以及上述医药组合物的制造方法,所述优于TOCILIZUMAB的第2代分子是指通过修饰人源化抗IL-6受体IgG1抗体、即TOCILIZUMAB的可变区和恒定区的氨基酸序列,使抗原中和能力增强、同时提高血浆中滞留性,从而减少了给药频率、持续发挥治疗效果,并且使免疫原性、安全性、理化性质得到改善。
解决课题的方法
本发明人等在包含抗体可变区的多肽中,对在保持该可变区的抗原结合活性的同时改变该多肽的等电点的方法进行了深入研究。其结果,本发明人等在构成抗体可变区的互补性决定区(CDR)的氨基酸残基中发现了在保持该可变区的抗原结合活性的同时可以改变其等电点的CDR氨基酸序列上的特定位置。本发明人等还发现:通过控制包含抗体可变区的多肽的等电点,可以控制该多肽的血浆中半衰期;以及通过利用等电点之差,可以高效率地制造由异源多聚体构成的、包含抗体可变区的多肽。具体而言,本发明人等在构成抗体可变区的氨基酸序列中的氨基酸残基中,确定了在不影响抗体可变区的抗原结合活性等抗体所具有的功能及其结构的情况下,能够调节抗体分子表面电荷的特定的CDR氨基酸序列上的位置。并且,本发明人等确认:通过调节该抗体表面电荷,可以改变等电点、控制包含抗体可变区的多肽的血浆中半衰期,如此操作使血浆中半衰期得到控制的抗体实际上保持着抗原结合活性。并且,本发明人等确认:通过控制抗体的血浆中半衰期,以抗体为代表的、发挥细胞毒性的抗体所具有的对癌细胞的肿瘤增殖抑制效果增大,从而完成了本发明。此外,本发明人等确认:通过调节CDR的电荷,可以改变等电点,分离、纯化包含与两种以上不同的抗原结合的抗体的异源二聚体。
并且,本发明人等为了研制优于TOCILIZUMAB的第2代分子进行了深入研究,所述优于TOCILIZUMAB的第2代分子是指通过修饰第1代人源化抗IL-6受体IgG1抗体、即TOCILIZUMAB的可变区和恒定区的氨基酸序列,使药效增强、同时提高血浆中滞留性,从而减少给药频率、持续发挥治疗效果,并且使免疫原性、安全性、理化性质(稳定性和均匀性)得到改善。其结果,本发明人等在TOCILIZUMAB的可变区中发现了多个使抗原结合能力(亲和性)提高的CDR突变,利用这些突变的组合成功地大幅提高了亲和性。另外,本发明人等通过导入降低可变区序列的等电点的改变,成功地提高了血浆中滞留性。此外,本发明人等通过使残留在TOCILIZUMAB构架中的、来自小鼠的序列和可变区中在计算机芯片上预测的T细胞表位肽的数目降低,成功地降低了免疫原性风险。同时,还成功地提高了高浓度中的稳定性。并且,本发明人等在TOCILIZUMAB的恒定区中成功地发现了新的恒定区序列,所述新的恒定区序列使新的T细胞表位肽的出现达到最低限度,同时不与Fcγ受体结合,使酸性条件下的稳定性、来自铰链区二硫键的异质性、来自H链C末端的异质性、高浓度制剂中的稳定性得到改善。通过组合上述CDR区氨基酸序列的修饰、可变区氨基酸序列的修饰、恒定区氨基酸序列的修饰,成功地研制出优于TOCILIZUMAB的第2代分子。
更具体而言,本发明提供下述[1]~[44]。
[1]改变多肽的等电点的方法,该方法是指在包含抗体可变区的多肽中,在保持该可变区的抗原结合活性的同时改变多肽的等电点,该方法包括:改变能够暴露于该多肽的互补性决定区(CDR)表面的至少1个氨基酸残基的电荷;
[2][1]所述的方法,其中上述包含抗体可变区的多肽进一步包含FcRn结合区;
[3][1]所述的方法,其中上述包含抗体可变区的多肽为IgG抗体;
[4][1]所述的方法,其中上述包含抗体可变区的多肽为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体;
[5][1]所述的方法,其中上述包含抗体可变区的多肽是与至少两种抗原结合的多特异性多肽;
[6][1]所述的方法,其中上述氨基酸残基的电荷的改变是指氨基酸取代;
[7][1]所述的方法,其中上述氨基酸残基的电荷的改变是指使理论等电点变化1.0以上的改变;
[8][1]所述的方法,其中能够暴露于CDR区表面的氨基酸残基为选自重链可变区中Kabat编号第31位、第61位、第62位、第64位和第65位的氨基酸残基或轻链可变区中Kabat编号第24位、第27位、第53位、第54位和第55位的氨基酸残基的至少1个氨基酸残基;
[9]多肽,该多肽包含通过[1]~[8]中任一项所述的方法得到的、等电点已被改变的抗体可变区;
[10]控制多肽的血浆中药物动力学的方法,该方法包括通过[1]~[8]中任一项所述的方法改变包含抗体可变区的该多肽的等电点;
[11][10]所述的方法,其中上述药物动力学的控制是指血浆中清除率(CL)、浓度曲线下面积(AUC)、平均血浆中滞留时间、血浆中半衰期(t1/2)中任一个参数的增大或减小;
[12]多肽,该多肽包含通过[10]所述的方法得到的、血浆中药物动力学得到控制的抗体的可变区;
[13]多肽的制造方法,所述多肽包含等电点已被改变的抗体可变区,该制造方法包括:
(a)修饰编码包含氨基酸残基的多肽的核酸,以改变能够暴露于该多肽的CDR区表面的至少1个该氨基酸残基的电荷;
(b)培养宿主细胞,以表达该核酸;
(c)从宿主细胞培养物中回收包含抗体可变区的多肽;
[14][13]所述的方法,其中上述包含抗体可变区的多肽进一步包含FcRn结合区;
[15][13]所述的方法,其中上述包含抗体可变区的多肽为IgG抗体;
[16][13]所述的方法,其中上述包含抗体可变区的多肽为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体;
[17][13]所述的方法,其中上述包含抗体可变区的多肽是与至少两种抗原结合的多特异性多肽;
[18][13]所述的方法,其中上述氨基酸残基的电荷的改变是指氨基酸取代;
[19][13]所述的方法,其中上述氨基酸残基的电荷的改变是指使理论等电点变化1.0以上的改变;
[20][13]所述的方法,其中能够暴露于CDR区表面的氨基酸残基为选自重链可变区中Kabat编号第31位、第61位、第62位、第64位和第65位的氨基酸残基或轻链可变区中Kabat编号第24位、第27位、第53位、第54位和第55位的氨基酸残基中的至少1个氨基酸残基;
[21]多肽,该多肽是通过[13]~[20]中任一项所述的方法得到的、包含等电点已被改变的抗体的可变区的多肽;
[22]多肽的制造方法,所述多肽包含血浆中药物动力学得到控制的抗体可变区,该制造方法包括:通过[13]~[20]中任一项所述的方法改变包含抗体可变区的多肽的等电点;
[23][22]所述的方法,其中上述药物动力学的控制是指血浆中清除率(CL)、浓度曲线下面积(AUC)、平均血浆中滞留时间、血浆中半衰期(t1/2)中任一个参数的增大或减小;
[24]多肽,该多肽包含通过[22]所述的方法制造的、血浆中药物动力学得到控制的抗体的可变区;
[25]多特异性多肽的制造方法,所述多特异性多肽包含具有抗体可变区的第1多肽和第2多肽,该制造方法包括:
(a)修饰编码包含氨基酸残基的多肽的核酸,以改变能够暴露于该多肽的CDR区表面的至少1个该氨基酸残基的电荷;该核酸的修饰是指修饰编码第1多肽的氨基酸残基的核酸和/或编码第2多肽的氨基酸残基的核酸,使与修饰前相比第1多肽与第2多肽的等电点之差增大;
(b)培养宿主细胞,以表达该核酸;
(c)从宿主细胞培养物中回收多特异性抗体;
[26][25]所述的方法,其中,从宿主细胞培养物中回收包含第1多肽和第2多肽的多特异性多肽的步骤按照标准层析法来进行;
[27][25]所述的方法,其中,在上述核酸的修饰中,按照使第1多肽的同源多聚体、第2多肽的同源多聚体、以及第1多肽与第2多肽的异源多聚体在标准层析分析中得到的峰与修饰之前相比成为更分离的峰的方式修饰核酸;
[28][25]所述的方法,其中上述多特异性多肽为多特异性抗体;
[29]多特异性抗体,该多特异性抗体是按照[27]所述的方法制造的;
[30][29]所述的多特异性抗体,上述多特异性抗体为双特异性抗体;
[31]抗体,该抗体包含选自来源于人的CDR、来源于人以外的动物的CDR和合成CDR的CDR、来源于人的构架区(FR)和人恒定区,其中,能够暴露于CDR表面的至少1个氨基酸残基是与野生型CDR 所对应的位置的氨基酸残基带有不同电荷的氨基酸残基,并且与修饰前的抗体相比,该抗体在保持抗原结合活性的同时等电点被改变;
[32][31]所述的抗体,其中上述人恒定区包含人Fc区;
[33][31]所述的抗体,该抗体通过等电点的改变使血浆中药物动力学得到控制;
[34]IgG抗体,该IgG抗体的选自重链可变区中的Kabat编号第31位、第61位、第62位、第64位和第65位的氨基酸残基或轻链可变区中的Kabat编号第24位、第27位、第53位、第54位和第55位的氨基酸残基的至少1个氨基酸残基的电荷被改变,与修饰该氨基酸残基之前相比等电点被改变;
[35][34]所述的抗体,其中上述被修饰的氨基酸残基选自下述(a)或(b)中任一组所含的氨基酸残基:
(a)谷氨酸(E)、天冬氨酸(D);
(b)赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H);
[36]多特异性抗体,该多特异性抗体包含第1多肽和第2多肽,其中,选自第1多肽的重链可变区中Kabat编号第31位、第61位、第62位、第64位和第65位的氨基酸残基或轻链可变区中Kabat编号第24位、第27位、第53位、第54位和第55位的氨基酸残基的至少1个氨基酸残基带有电荷,并且第1多肽与第2多肽的等电点互不相同;
[37][36]所述的抗体,其中,选自第2多肽的重链可变区中Kabat编号第31位、第61位、第62位、第64位和第65位的氨基酸残基或轻链可变区中Kabat编号第24位、第27位、第53位、第54位和第55位的氨基酸残基的至少1个氨基酸残基的电荷与在上述第1多肽中选择的氨基酸残基所带有的电荷相反、或者不带电荷;
[38][36]所述的抗体,其中,上述带有电荷的氨基酸残基和与该氨基酸残基带有相反电荷的氨基酸残基的组合分别选自下述(a)或(b)中任一组所含的氨基酸残基:
(a)谷氨酸(E)、天冬氨酸(D);
(b)赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H);
[39][36]所述的抗体,该抗体是包含上述第1多肽和第2多肽的多特异性抗体,其中第1多肽的同源多聚体和第2多肽的同源多聚体在标准层析分析中形成分离的峰;
[40]组合物,该组合物包含[31]~[39]中任一项所述的抗体和医药上可接受的载体;
[41]核酸,该核酸编码构成[31]~[39]中任一项所述的抗体的多肽;
[42]宿主细胞,该宿主细胞具有[41]所述的核酸;
[43][31]~[39]中任一项所述的抗体的制造方法,该制造方法包括:培养[42]所述的宿主细胞的步骤、从细胞培养物中回收多肽的步骤;
[44]取代氨基酸残基的方法,该方法是指在包含抗体可变区的多肽中,在保持该多肽的抗原结合活性的同时取代能够暴露于该多肽的互补性决定区(CDR)表面的氨基酸残基,在该方法中至少对选自重链可变区中Kabat编号第31位、第61位、第62位、第64位和第65位的氨基酸残基或轻链可变区中Kabat编号第24位、第27位、第53位、第54位和第55位的氨基酸残基的至少1个氨基酸残基进行取代。
本发明还提供下述[1]~[38]。
[1]血中动力学得到控制的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的制造方法,该方法包括下述步骤:
(a)修饰编码至少1个氨基酸残基的核酸,以改变能够暴露于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体表面的至少1个该氨基酸残基的电荷;
(b)培养保有该核酸的宿主细胞,使该核酸表达;
(c)从该宿主细胞的培养物中回收磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体;
[2][1]所述的方法,其中上述血中动力学的控制是指血中半衰期、平均血中滞留时间、血中清除率中任一个参数的增大或减小;
[3][1]所述的方法,其中步骤(a)中的氨基酸残基的电荷的改变通过氨基酸取代来进行;
[4][1]所述的方法,其中上述能够暴露于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体表面的氨基酸残基位于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体中的FcRn结合区以外的区;
[5][4]所述的方法,其中上述FcRn结合区包含Fc区;
[6][1]所述的方法,其中磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为IgG抗体;
[7][6]所述的方法,其中电荷被改变的氨基酸残基为IgG抗体的重链可变区或轻链可变区的氨基酸残基;
[8][7]所述的方法,其特征在于:上述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为包含互补性决定区(CDR)、来源于人的构架区(FR)和人恒定区的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体;步骤(a)中氨基酸残基的电荷的改变是指由用于修饰的抗体的CDR或FR中能够暴露于抗体表面的至少1个氨基酸残基修饰成与该氨基酸残基带有不同电荷的氨基酸残基;
[9][8]所述的方法,其中上述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是与其Fc区结合的岩藻糖含量降低的抗体;
[10]磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体,该抗体是按照[1]~[9]中任一项所述的方法制造的;
[11]磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的稳定化方法,其特征在于:修饰构成包含互补性决定区(CDR)、来源于人的构架区(FR)和人恒定区的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的至少1个氨基酸残基,以增大该抗体的Tm值;所述稳定化方法包括:
(a)修饰编码至少1个氨基酸残基的核酸,以增大用于修饰的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的Tm值;
(b)培养保有该核酸的宿主细胞,使该核酸表达;
(c)从该宿主细胞的培养物中回收抗体;
[12][11]所述的方法,其特征在于:步骤(a)中的氨基酸残基存在于其H链或L链的FR1区和/或FR2区;
[13][12]所述的方法,其特征在于:将[12]所述的H链FR2区的氨基酸残基取代成VH4亚纲的FR2区的氨基酸残基;
[14][12]所述的方法,其特征在于:将[12]所述的L链FR2区的氨基酸残基取代成VK3亚纲的FR2区的氨基酸残基;
[15]控制抗体的细胞毒性的方法,该方法包括下述步骤:
(a)修饰编码至少1个氨基酸残基的核酸,以改变能够暴露于具有细胞毒性的抗体表面的至少1个该氨基酸残基的电荷;
(b)培养保有该核酸的宿主细胞,使该核酸表达;
(c)从该宿主细胞的培养物中回收抗体;
[16][15]所述的方法,其中上述血中动力学的控制是指血中半衰期、平均血中滞留时间、血中清除率中任一个参数的控制;
[17][15]所述的方法,其中步骤(a)中的氨基酸残基的电荷的改变通过氨基酸取代来进行;
[18][15]所述的方法,其中上述能够暴露于抗体表面的氨基酸残基位于抗体中的FcRn结合区以外的区;
[19][18]所述的方法,其中上述FcRn结合区包含Fc区;
[20][15]所述的方法,其中磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为IgG抗体;
[21][20]所述的方法,其中电荷被改变的氨基酸残基为IgG抗体的重链可变区或轻链可变区的氨基酸残基;
[22][21]所述的方法,其特征在于:上述抗体是包含来源于人以外的动物的互补性决定区(CDR)、来源于人的构架区(FR)和人恒定区的抗体;步骤(a)中的氨基酸残基的电荷的改变是指由用于修饰的抗体的CDR或FR中能够暴露于抗体表面的至少1个氨基酸残基修饰成与该氨基酸残基具有不同电荷的氨基酸残基;
[23][22]所述的方法,其中上述抗体为与其Fc区结合的岩藻糖含量降低的抗体;
[24]抗体,该抗体按照[15]~[23]中任一项所述的方法进行制造;
[25][24]所述的抗体,其中抗体为磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体;
[26]抗体,该抗体包含H链V区和L链V区,在所述H链V区中,对构成SEQ ID NO:195所示的H链V区的氨基酸残基进行下述任一项或其以上的取代:
(a)将第19位的氨基酸残基K取代成T;
(b)将第43位的氨基酸残基Q取代成E;
(c)将第63位的氨基酸残基K取代成S;
(d)将第65位的氨基酸残基K取代成Q;
(e)将第66位的氨基酸残基G取代成D;
在所述L链V区中,对构成SEQ ID NO:201所示的L链V区的氨基酸残基进行下述任一项或其以上的取代:
(f)将第27位的氨基酸残基Q取代成E;
(g)将第79位的氨基酸残基K取代成T;
(h)将第82位的氨基酸残基R取代成S;
[27][26]所述的抗体,该抗体包含SEQ ID NO:197所示的H链和SEQ ID NO:203所示的L链;
[28][26]所述的抗体,该抗体包含SEQ ID NO:198所示的H链和SEQ ID NO:204所示的L链;
[29]抗体,该抗体包含H链V区和L链V区,在所述H链V区中,对构成SEQ ID NO:195所示的H链V区的氨基酸残基进行下述任一项或其以上的取代:
(a)将第43位的氨基酸残基Q取代成K;
(b)将第52位的氨基酸残基D取代成N;
(c)将第107位的氨基酸残基Q取代成R;
在所述L链V区中,对构成SEQ ID NO:201所示的L链V区的氨基酸残基进行下述任一项或其以上的取代:
(d)将第17位的氨基酸残基E取代成Q;
(e)将第27位的氨基酸残基Q取代成R;
(f)将第105位的氨基酸残基Q取代成R;
[30][29]所述的抗体,该抗体包含SEQ ID NO:198所示的H链可变区和SEQ ID NO:204所示的L链可变区;
[31][29]所述的抗体,该抗体包含SEQ ID NO:199所示的H链可变区和SEQ ID NO:205所示的L链可变区;
[32][26]~[31]中任一项所述的抗体,该抗体包含人抗体的C区;
[33]组合物,该组合物包含[32]所述的抗体和医药上可接受的载体;
[34]癌症治疗药,其中包含[32]所述的抗体作为有效成分;
[35][34]所述的癌症治疗药,其中癌症为肝癌;
[36]核酸,该核酸编码构成[26]~[31]中任一项所述的抗体的多肽;
[37]宿主细胞,该宿主细胞保有[36]所述的核酸;
[38][26]~[31]中任一项所述的抗体的制造方法,该方法包括:培养[37]所述的宿主细胞的步骤、以及从细胞培养物中回收多肽的步骤。
本发明还提供下述[1]~[41]。
[1]下述(a)~(y)中任一项所述的抗IL-6受体抗体:
(a)抗体,该抗体包含具有CDR1的重链可变区,所述CDR1在SEQ ID NO:1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成其他氨基酸;
(b)抗体,该抗体包含具有CDR1的重链可变区,所述CDR1在SEQ ID NO:1记载的氨基酸序列中第5位的Trp被取代成其他氨基酸;
(c)抗体,该抗体包含具有CDR2的重链可变区,所述CDR2在SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列中第1位的Tyr被取代成其他氨基酸;
(d)抗体,该抗体包含具有CDR2的重链可变区,所述CDR2在SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列中第8位的Thr被取代成其他氨基酸;
(e)抗体,该抗体包含具有CDR2的重链可变区,所述CDR2在 SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列中第9位的Thr被取代成其他氨基酸;
(f)抗体,该抗体包含具有CDR3的重链可变区,所述CDR3在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成其他氨基酸;
(g)抗体,该抗体包含具有CDR3的重链可变区,所述CDR3在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列中第2位的Leu被取代成其他氨基酸;
(h)抗体,该抗体包含具有CDR3的重链可变区,所述CDR3在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列中第5位的Thr被取代成其他氨基酸;
(i)抗体,该抗体包含具有CDR3的重链可变区,所述CDR3在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列中第7位的Ala被取代成其他氨基酸;
(j)抗体,该抗体包含具有CDR3的重链可变区,所述CDR3在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列中第8位的Met被取代成其他氨基酸;
(k)抗体,该抗体包含具有CDR3的重链可变区,所述CDR3在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列中第1位的Ser和第5位的Thr被取代成其他氨基酸;
(l)抗体,该抗体包含具有CDR3的重链可变区,所述CDR3在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列中第2位的Leu、第7位的Ala和第8位的Met被取代成其他氨基酸;
(m)抗体,该抗体包含具有CDR1的轻链可变区,所述CDR1在SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列中第1位的Arg被取代成其他氨基酸;
(n)抗体,该抗体包含具有CDR1的轻链可变区,所述CDR1在SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列中第4位的Gln被取代成其他氨基酸;
(o)抗体,该抗体包含具有CDR1的轻链可变区,所述CDR1在SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列中第9位的Tyr被取代成其他氨基酸;
(p)抗体,该抗体包含具有CDR1的轻链可变区,所述CDR1在SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列中第11位的Asn被取代成其他氨基酸;
(q)抗体,该抗体包含具有CDR2的轻链可变区,所述CDR2在SEQ ID NO:5记载的氨基酸序列中第2位的Thr被取代成其他氨基酸;
(r)抗体,该抗体包含具有CDR3的轻链可变区,所述CDR3在SEQ ID NO:6记载的氨基酸序列中第1位的Gln被取代成其他氨基酸;
(s)抗体,该抗体包含具有CDR3的轻链可变区,所述CDR3在SEQ ID NO:6记载的氨基酸序列中第3位的Gly被取代成其他氨基酸;
(t)抗体,该抗体包含具有CDR1和CDR3的轻链可变区,所述CDR1在SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列中第9位的Tyr被取代成其他氨基酸,所述CDR3在SEQ ID NO:6记载的氨基酸序列中第3位的Gly被取代成其他氨基酸;
(u)抗体,该抗体包含具有CDR3的轻链可变区,所述CDR3在SEQ ID NO:6记载的氨基酸序列中第5位的Thr被取代成其他氨基酸;
(v)抗体,该抗体包含具有CDR3的轻链可变区,所述CDR3在SEQ ID NO:6记载的氨基酸序列中第1位的Gln和第5位的Thr被取代成其他氨基酸;
(w)抗体,该抗体包含具有CDR2和CDR3的重链可变区,所述CDR2在SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列中第9位的Thr被取代成其他氨基酸,所述CDR3在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列中第1位的Ser和第5位的Thr被取代成其他氨基酸;
(x)抗体,该抗体包含(k)所述的重链可变区和(v)所述的轻链可变区;或
(y)(x)所述的抗体,该抗体进一步包含(e)所述的CDR2。
[2]抗IL-6受体抗体,该抗体包含具有CDR2的轻链可变区,所述CDR2在SEQ ID NO:5记载的氨基酸序列中第2位的Thr被取代成其他氨基酸。
[3]下述(a)~(y)中任一项所述的抗IL-6受体抗体:
(a)抗体,该抗体包含具有FR1的重链可变区,所述FR1在SEQID NO:7记载的氨基酸序列中第13位的Arg被取代成其他氨基酸;
(b)抗体,该抗体包含具有FR1的重链可变区,所述FR1在SEQID NO:7记载的氨基酸序列中第16位的Gln被取代成其他氨基酸;
(c)抗体,该抗体包含具有FR1的重链可变区,所述FR1在SEQID NO:7记载的氨基酸序列中第23位的Thr被取代成其他氨基酸;
(d)抗体,该抗体包含具有FR1的重链可变区,所述FR1在SEQID NO:7记载的氨基酸序列中第30位的Thr被取代成其他氨基酸;
(e)抗体,该抗体包含具有FR1的重链可变区,所述FR1在SEQID NO:7记载的氨基酸序列中第13位的Arg、第16位的Gln、第23位的Thr和第30位的Thr被取代成其他氨基酸;
(f)抗体,该抗体包含具有FR2的重链可变区,所述FR2在SEQID NO:8记载的氨基酸序列中第8位的Arg被取代成其他氨基酸;
(g)抗体,该抗体包含具有FR3的重链可变区,所述FR3在SEQID NO:9记载的氨基酸序列中第4位的Met被取代成其他氨基酸;
(h)抗体,该抗体包含具有FR3的重链可变区,所述FR3在SEQID NO:9记载的氨基酸序列中第5位的Leu被取代成其他氨基酸;
(i)抗体,该抗体包含具有FR3的重链可变区,所述FR3在SEQID NO:9记载的氨基酸序列中第16位的Arg被取代成其他氨基酸;
(j)抗体,该抗体包含具有FR3的重链可变区,所述FR3在SEQ ID NO:9记载的氨基酸序列中第27位的Val被取代成其他氨基酸;
(k)抗体,该抗体包含具有FR3的重链可变区,所述FR3在SEQID NO:9记载的氨基酸序列中第4位的Met、第5位的Leu、第16位的Arg和第27位的Val被取代成其他氨基酸;
(l)抗体,该抗体包含具有FR4的重链可变区,所述FR4在SEQID NO:10记载的氨基酸序列中第3位的Gln被取代成其他氨基酸;
(m)抗体,该抗体包含具有FR1的轻链可变区,所述FR1在SEQID NO:11记载的氨基酸序列中第18位的Arg被取代成其他氨基酸;
(n)抗体,该抗体包含具有FR2的轻链可变区,所述FR2在SEQID NO:12记载的氨基酸序列中第11位的Lys被取代成其他氨基酸;
(o)抗体,该抗体包含具有FR3的轻链可变区,所述FR3在SEQID NO:13记载的氨基酸序列中第23位的Gln被取代成其他氨基酸;
(p)抗体,该抗体包含具有FR3的轻链可变区,所述FR3在SEQID NO:13记载的氨基酸序列中第24位的Pro被取代成其他氨基酸;
(q)抗体,该抗体包含具有FR3的轻链可变区,所述FR3在SEQID NO:13记载的氨基酸序列中第27位的Ile被取代成其他氨基酸;
(r)抗体,该抗体包含具有FR3的轻链可变区,所述FR3在SEQID NO:13记载的氨基酸序列中第23位的Gln、第24位的Pro和第27位的Ile被取代成其他氨基酸;
(s)抗体,该抗体包含具有FR4的轻链可变区,所述FR4在SEQID NO:14记载的氨基酸序列中第10位的Lys被取代成其他氨基酸;
(t)抗体,该抗体包含具有FR4的重链可变区,所述FR4在SEQID NO:10记载的氨基酸序列中第5位的Ser被取代成其他氨基酸;
(u)抗体,该抗体包含具有FR4的重链可变区,所述FR4在SEQID NO:10记载的氨基酸序列中第3位的Gln和第5位的Ser被取代成其他氨基酸;
(v)抗体,该抗体包含具有FR3的重链可变区,所述FR3具有SEQID NO:184记载的氨基酸序列;
(w)抗体,该抗体包含重链可变区,所述重链可变区包含(e)所述的FR1、(f)所述的FR2、(k)所述的FR3、和(l)或(u)所述的FR4;
(x)抗体,该抗体包含轻链可变区,所述轻链可变区包含(m)所述的FR1、(n)所述的FR2、(r)所述的FR3和(s)所述的FR4;或
(y)抗体,该抗体包含(w)所述的重链可变区和(x)所述的轻链可变区。
[4]下述(a)~(l)中任一项所述的抗IL-6受体抗体:
(a)抗体,该抗体包含具有CDR1的重链可变区,所述CDR1在SEQ ID NO:1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成其他氨基酸;
(b)抗体,该抗体包含具有CDR2的重链可变区,所述CDR2在SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列中第9位的Thr被取代成其他氨基酸;
(c)抗体,该抗体包含具有CDR2的重链可变区,所述CDR2在SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列中第16位的Ser被取代成其他氨基酸;
(d)抗体,该抗体包含具有CDR2的重链可变区,所述CDR2在SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列中第9位的Thr和第16位的Ser被取代成其他氨基酸;
(e)抗体,该抗体包含具有CDR1的轻链可变区,所述CDR1在SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列中第1位的Arg被取代成其他氨基酸;
(f)抗体,该抗体包含具有CDR2的轻链可变区,所述CDR2在SEQ ID NO:5记载的氨基酸序列中第2位的Thr被取代成其他氨基酸;
(g)抗体,该抗体包含具有CDR2的轻链可变区,所述CDR2在SEQ ID NO:5记载的氨基酸序列中第4位的Arg被取代成其他氨基酸;
(h)抗体,该抗体包含具有CDR2的轻链可变区,所述CDR2在 SEQ ID NO:5记载的氨基酸序列中第2位的Thr和第4位的Arg被取代成其他氨基酸;
(i)抗体,该抗体包含具有CDR3的轻链可变区,所述CDR3在SEQ ID NO:6记载的氨基酸序列中第5位的Thr被取代成其他氨基酸;
(j)抗体,该抗体包含重链可变区,所述重链可变区包含(a)所述的CDR1、(d)所述的CDR2和具有SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列的CDR3;
(k)抗体,该抗体包含轻链可变区,所述轻链可变区包含(e)所述的CDR1、(h)所述的CDR2和(i)所述的CDR3;或
(l)抗体,该抗体包含(j)所述的重链可变区和(k)所述的轻链可变区。
[5]下述(a)~(f)中任一项所述的抗IL-6受体抗体:
(a)抗体,该抗体包含具有CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区,所述CDR1在SEQ ID NO:1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成其他氨基酸,所述CDR2在SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列中第9位的Thr和第16位的Ser被取代成其他氨基酸,所述CDR3在SEQ IDNO:3记载的氨基酸序列中第1位的Ser和第5位的Thr被取代成其他氨基酸;
(b)抗体,该抗体包含具有CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区,所述CDR1在SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列中第1位的Arg被取代成其他氨基酸,所述CDR2在SEQ ID NO:5记载的氨基酸序列中第2位的Thr和第4位的Arg被取代成其他氨基酸,所述CDR3在SEQID NO:6记载的氨基酸序列中第1位的Gln和第5位的Thr被取代成其他氨基酸;
(c)抗体,该抗体包含重链可变区,所述重链可变区具有SEQ IDNO:22记载的氨基酸序列;
(d)抗体,该抗体包含轻链可变区,所述轻链可变区具有SEQ ID NO:23记载的氨基酸序列;
(e)抗体,该抗体包含(a)所述的重链可变区和(b)所述的轻链可变区;或
(f)抗体,该抗体包含(c)所述的重链可变区和(d)所述的轻链可变区。
[6]下述(a)~(c)中任一项所述的人抗体恒定区:
(a)人抗体恒定区,其特征在于:在SEQ ID NO:19记载的氨基酸序列中,第329位(EU编号第446位)的Gly和第330位(EU编号第447位)的Lys均缺失;
(b)人抗体恒定区,其特征在于:在SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列中,第325位(EU编号第446位)的Gly和第326位(EU编号第447位)的Lys均缺失;
(c)人抗体恒定区,其特征在于:在SEQ ID NO:21记载的氨基酸序列中,第326位(EU编号第446位)的Gly和第327位(EU编号第447位)的Lys均缺失。
[7]IgG2恒定区,其中,在SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列中,第209位(EU编号第330位)、第210位(EU编号第331位)和第218位(EU编号第339位)的氨基酸被取代成其他氨基酸。
[8]IgG2恒定区,其中,在SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列中,第276位(EU编号第397位)的氨基酸被取代成其他氨基酸。
[9]IgG2恒定区,其中,在SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列中,第14位(EU编号第131位)、第102位(EU编号第219位)和/或第16位(EU编号第133位)的氨基酸被取代成其他氨基酸。
[10][9]所述的IgG2恒定区,其特征在于:在SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列中,第20位(EU编号第137位)和第21位(EU编号第138位)的氨基酸进一步被取代成其他氨基酸。
[11]IgG2恒定区,其中,在SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列中,第147位(EU编号第268位)的His、第234位(EU编号第355位)的 Arg和/或第298位(EU编号第419位)的Gln被取代成其他氨基酸;
[12]IgG2恒定区,该IgG2恒定区具有下述氨基酸序列:在SEQ IDNO:20记载的氨基酸序列中,第209位(EU编号第330位)、第210位(EU编号第331位)、第218位(EU编号第339位)、第276位(EU编号第397位)、第14位(EU编号第131位)、第16位(EU编号第133位)、第102位(EU编号第219位)、第20位(EU编号第137位)和第21位(EU编号第138位)的氨基酸被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。
[13]IgG2恒定区,该IgG2恒定区具有下述氨基酸序列:在[12]所述的IgG2恒定区中,进一步具有第325位(EU编号第446位)的Gly和第326位(EU编号第447位)的Lys均缺失的氨基酸序列。
[14]IgG2恒定区,该IgG2恒定区具有下述氨基酸序列:在SEQ IDNO:20记载的氨基酸序列中,第276位(EU编号第397位)、第14位(EU编号第131位)、第16位(EU编号第133位)、第102位(EU编号第219位)、第20位(EU编号第137位)和第21位(EU编号第138位)的氨基酸被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。
[15]IgG2恒定区,该IgG2恒定区具有下述氨基酸序列:在[14]所述的IgG2恒定区中,进一步具有第325位(EU编号第446位)的Gly和第326位(EU编号第447位)的Lys均缺失的氨基酸序列。
[16]IgG2恒定区,该IgG2恒定区具有下述氨基酸序列:在SEQ IDNO:20记载的氨基酸序列中,第14位(EU编号第131位)的Cys、第16位(EU编号第133位)的Arg、第102位(EU编号第219位)的Cys、第20位(EU编号第137位)的Glu、第21位(EU编号第138位)的Ser、第147位(EU编号第268位)的His、第234位(EU编号第355位)的Arg和第298位(EU编号第419位)的Gln被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。
[17]IgG2恒定区,该IgG2恒定区具有下述氨基酸序列:在[16]所述的IgG2恒定区中,进一步具有第325位(EU编号第446位)的Gly和第326位(EU编号第447位)的Lys均缺失的氨基酸序列。
[18]IgG2恒定区,该IgG2恒定区具有下述氨基酸序列:在SEQ IDNO:20记载的氨基酸序列中,第14位(EU编号第131位)的Cys、第16位(EU编号第133位)的Arg、第102位(EU编号第219位)的Cys、第20位(EU编号第137位)的Glu、第21位(EU编号第138位)的Ser、第147位(EU编号第268位)的His、第234位(EU编号第355位)的Arg、第298位(EU编号第419位)的Gln和第313位(EU编号第434位)的Asn被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。
[19]IgG2恒定区,该IgG2恒定区具有下述氨基酸序列:在[18]所述的IgG2恒定区中,进一步具有第325位(EU编号第446位)的Gly和第326位(EU编号第447位)的Lys均缺失的氨基酸序列。
[20]IgG4恒定区,其特征在于:在SEQ ID NO:21记载的氨基酸序列中,第289位(EU编号第409位)的氨基酸被取代成其他氨基酸。
[21]IgG4恒定区,该IgG4恒定区具有下述氨基酸序列:在SEQ IDNO:21记载的氨基酸序列中,第289位(EU编号第409位)、第14、16、20、21、97、100、102、103、104和105位(分别为EU编号第131、133、137、138、214、217、219、220、221、222位)、第113、114、115位(分别为EU编号第233、234、235位)的氨基酸被取代成其他氨基酸、且第116位(EU编号第236位)的氨基酸缺失的氨基酸序列。
[22]IgG4恒定区,其中,在[21]所述的IgG4恒定区中,进一步缺失第326位(EU编号第446位)的Gly和第327位(EU编号第447位)的Lys。
[23]IgG2恒定区,该IgG2恒定区具有下述氨基酸序列:在SEQ IDNO:20记载的氨基酸序列中,第209位(EU编号第330位)的Ala、第210位(EU编号第331位)的Pro、第218位(EU编号第339位)的Thr、第14位(EU编号第131位)的Cys、第16位(EU编号第133位)的Arg、第102位(EU编号第219位)的Cys、第20位(EU编号第137位)的Glu、第21位(EU编号第138位)的Ser被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。
[24]IgG2恒定区,该IgG2恒定区具有下述氨基酸序列:在[23]所述的IgG2恒定区中,进一步具有第325位(EU编号第446位)的Gly和第326位(EU编号第447位)的Lys均缺失的氨基酸序列。
[25]IgG2恒定区,该IgG2恒定区具有下述氨基酸序列:在SEQ IDNO:20记载的氨基酸序列中,第14位(EU编号第131位)的Cys、第16位(EU编号第133位)的Arg、第102位(EU编号第219位)的Cys、第20位(EU编号第137位)的Glu、第21位(EU编号第138位)的Ser被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。
[26]IgG2恒定区,该IgG2恒定区具有下述氨基酸序列:在[25]所述的IgG2恒定区中,进一步具有第325位(EU编号第446位)的Gly和第326位(EU编号第447位)的Lys均缺失的氨基酸序列。
[27]恒定区,该恒定区具有SEQ ID NO:24记载的氨基酸序列。
[28]恒定区,该恒定区具有SEQ ID NO:118记载的氨基酸序列。
[29]恒定区,该恒定区具有SEQ ID NO:25记载的氨基酸序列。
[30]恒定区,该恒定区具有SEQ ID NO:151记载的氨基酸序列。
[31]恒定区,该恒定区具有SEQ ID NO:152记载的氨基酸序列。
[32]恒定区,该恒定区具有SEQ ID NO:153记载的氨基酸序列。
[33]恒定区,该恒定区具有SEQ ID NO:164记载的氨基酸序列。
[34]人抗体恒定区,该恒定区具有SEQ ID NO:194(M40ΔGK)记载的氨基酸序列。
[35]人抗体恒定区,该恒定区具有SEQ ID NO:192(M86ΔGK)记载的氨基酸序列。
[36]抗体,该抗体具有[6]~[35]中任一项所述的恒定区。
[37][36]所述的抗体,其特征在于:与IL-6受体结合。
[38]抗人IL-6受体抗体,该抗体与IL-6受体的结合活性为1nM以下。
[39]抗人IL-6受体抗体,其全长抗体的实测等电点为7.0以下、或者可变区的理论等电点为5.0以下。
[40]抗IL-6受体抗体,其特征在于:在20mM组氨酸-HCl、150mM NaCl、pH6.5~7.0的缓冲液中、在抗体浓度为100mg/mL的条件下,于25℃下经过1个月后抗体的聚集物比率的增加为0.3%以下。
[41]医药组合物,其中含有[36]~[40]中任一项所述的抗体。附图说明
图1是显示WT和RD_6的BaF/gp130中和活性的曲线图。
图2是显示rhIL-s6R(R&D Systems)与WT的相互作用的传感图(センサ一グラフ)的曲线图。
图3是显示rhIL-s6R(R&D Systems)与RD_6的相互作用的传感图的曲线图。
图4-1是显示亲和性、中和活性较WT有所提高的CDR突变的列表的图。
图4-2是图4-1的续图。
图5是显示通过组合使亲和性、中和活性提高的CDR突变的列表的图。
图6是显示WT和RDC23的BaF/gp130中和活性的曲线图。
图7是显示rhIL-s6R(R&D Systems)与RDC23的相互作用的传感图的曲线图。
图8是显示rhsIL-6R与WT的相互作用的传感图的曲线图。
图9是显示rhsIL-6R与RDC23的相互作用的传感图的曲线图。
图10是显示SR344与WT的相互作用的传感图的曲线图。
图11是显示SR344与RDC23的相互作用的传感图的曲线图。
图12是显示WT和H53L28的BaF/gp130中和活性的曲线图。
图13是显示SR344与H53/L28的相互作用的传感图的曲线图。
图14是显示将WT、H53/L28对小鼠进行静脉内给药后血浆中浓度变化的曲线图。
图15是显示将WT、H53/L28对小鼠进行皮下给药后血浆中浓度变化的曲线图。
图16是显示WT和PF1的BaF/gp130中和活性的曲线图。
图17是显示SR344与PF1的相互作用的传感图的曲线图。
图18是显示WT、PF1的高浓度稳定性试验结果的曲线图。
图19是显示将WT、PF1对人IL-6受体转基因小鼠进行静脉内给药后血浆中浓度变化的曲线图。
图20是显示将WT、PF1对人IL-6受体转基因小鼠进行静脉内给药后非结合型的人可溶型IL-6受体浓度变化的曲线图。
图21是显示利用凝胶过滤层析分析经盐酸洗脱法纯化的WT-IgG 1、WT-IgG2、WT-IgG4、IgG2-M397V、IgG4-R409K的聚集物含量的结果的图。
图22是显示WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4的阳离子交换层析(IEC)分析结果的图。
图23是显示WT-IgG2的铰链区的推定二硫键构象(結合樣式)的图。
图24是显示WT-IgG2-SKSC的铰链区的推定二硫键构象的图。
图25是显示WT-IgG2和IgG2-SKSC的阳离子交换层析(IEC)分析结果的图。
图26是显示人源化PM-1抗体、H链C末端ΔK抗体和H链C末端ΔGK抗体的阳离子交换层析(IEC)分析结果的图。
图27是显示比较WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK与FcγRI的结合量的图。
图28是显示比较WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK与FcγRIIa的结合量的曲线图。
图29是显示比较WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK与FcγRIIb的结合量的曲线图。
图30是显示比较WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK与FcγRIIIa(Val)的结合量的曲线图。
图31是显示在WT-IgG1、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK的高浓度稳定性试验中聚集物增加量的图。
图32是显示在WT-IgG1、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK的高浓度稳定性试验中Fab片段增加量的图。
图33是显示WT-IgG2、WT-M14ΔGK、WT-M31ΔGK的阳离子交换层析(IEC)分析结果的图。
图34是显示WT和F2H/L39-IgG1的BaF/gp130中和活性的曲线图。
图35是显示将WT、PF1、F2H/L39-IgG1以1.0mg/kg对食蟹猴进行皮下给药后血浆中抗体浓度变化的曲线图。
图36是显示食蟹猴的WT和F2H/L39-IgG1给药组的CRP浓度变化的曲线图。
图37是显示食蟹猴的WT和F2H/L39-IgG1给药组的非结合型食蟹猴IL-6受体浓度变化的曲线图。
图38是显示将WT-IgG1和WT-M14对人FcRn转基因小鼠进行静脉内给药后血浆中浓度变化的曲线图。
图39是显示将WT-IgG1、WT-M14和WT-M58对人FcRn转基因小鼠进行静脉内给药后血浆中浓度变化的曲线图。
图40是显示将WT-IgG1、WT-M44、WT-M58、WT-M73对人FcRn转基因小鼠进行静脉内给药后血浆中浓度变化的曲线图。
图41是通过阳离子交换层析评价抗IL-6受体抗体WT、抗IL-6受体抗体F2H/L39、抗-IL-31受体抗体H0L0、抗RANKL抗体DNS的恒定区对异质性的影响的图。
图42是通过阳离子交换层析评价抗IL-6受体抗体WT、抗IL-6受体抗体F2H/L39的CH1结构域的半胱氨酸对异质性的影响的图。
图43是利用DSC评价抗IL-6受体抗体WT的CH1结构域的半胱氨酸对变性峰的影响的图。
图44是显示TOCILIZUMAB、对照和Fv5-M83对BaF/g130的中和活性的曲线图。
图45是显示TOCILIZUMAB、Fv3-M73和Fv4-M73对BaF/gp130的中和活性的曲线图。
图46是显示将TOCILIZUMAB、对照、Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83对食蟹猴进行静脉内给药后血浆中浓度变化的曲线图。
图47是显示将TOCILIZUMAB、对照、Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83对食蟹猴进行静脉内给药后CRP浓度变化的曲线图。
图48是显示将TOCILIZUMAB、对照、Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83对食蟹猴进行静脉内给药后可溶型IL-6受体的中和率变化的曲线图。
图49是由Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗体的DSC(差示扫描量热计)测定得到的图。
图50是H0L0抗体和Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗体在高pI等电点电泳中的电泳图。
图51是H0L0抗体和Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)抗体在低pI等电点电泳中的电泳图。
图52是显示通过竞争ELISA测定的H15L4抗体和H0L0抗体与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(抗原)的结合活性的图。
图53是显示通过竞争ELISA测定的Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗体和H0L0抗体与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(抗原)的结合活性的图。
图54是显示通过竞争ELISA测定的Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)抗体和H0L0抗体与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(抗原)的结合活性的图。
图55显示H0L0抗体、Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗体和Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)抗体在人肝癌移植小鼠模型中的抗肿瘤效果。
图56显示H0L0抗体、Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗体和Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)抗体在人肝癌移植小鼠模型中的血浆中抗体浓度。
图57显示各受检抗体对人肝癌细胞株Hep G2细胞的ADCC活性。
图58是显示6R_b_H1L1、6R_b_H2L2、6R_b_H2L3、6R_b_H2L4在BaF/6R中的IL-6受体中和活性的图。
图59是显示通过竞争ELISA测定的GPC_H1L1抗体和GPC_H2L2抗体与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(抗原)的结合活性的图。
图60是显示通过竞争ELISA测定的GPC_H2L2抗体和GPC_H3L3抗体与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(抗原)的结合活性的图。
图61是显示通过阳离子交换层析测定的6R_a_H1H3L3、GPC3_H2H3L3和31R_H1aH2aL2的A链-B链异源多聚体、A链同源多聚体和B链同源多聚体的峰分离的图。
具体实施方式
本发明提供:在包含抗体可变区的多肽中,在保持该可变区的抗原结合活性的同时改变多肽的等电点的方法,该方法包括:改变能够暴露于该多肽的互补性决定区(CDR)表面的至少1个氨基酸残基的电荷。本发明还提供包含通过该方法得到的等电点被改变的抗体可变区的多肽(例如抗体,该抗体包含选自来源于人的CDR、来源于人以外的动物的CDR和合成CDR的CDR、来源于人的构架区(FR)和人恒定区,其中,能够暴露于CDR表面的至少1个氨基酸残基是与野生型CDR所对应的位置的氨基酸残基带有不同电荷的氨基酸残基,与修饰前的抗体相比,该抗体在保持抗原结合活性的同时等电点被改变)
本发明的方法的优选方式为:包括改变能够暴露于抗体表面的至少1个氨基酸残基的电荷的方法。即,通过改变抗体的氨基酸残基的电荷,使抗体的等电点(pI)发生变化,从而可以控制该抗体的血浆中药物动力学(血中动力学)。其结果,与血浆中药物动力学未得到控制的抗体相比,血浆中药物动力学得到控制的抗体例如对癌细胞可以发挥更优异的抗肿瘤效果。
在本发明的方法中,“保持抗原结合活性”是指与修饰前的肽的结合活性相比,具有至少80%以上、优选85%以上、特别优选90%以上的活性。另外,抗体与抗原结合时,只要保持该抗体所具有的功能得以维持的程度的活性即可,例如在生理条件下、于37℃测定的亲和性为100nM以下即可,优选50nM以下,更优选10nM以下,进一步优选为1nM以下。通过本发明的方法得到的、等电点被改变的包含抗体可变区的多肽是否保持抗原结合活性,这可以通过公知的方法、例如BIACORE(分子间相互作用分析)、细胞增殖分析、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、EIA(酶免疫测定法)、RIA(放射免疫测定法)或荧光免疫法等来测定。
本发明的“包含抗体可变区的多肽”的例子有:抗体、小分子抗体、支架蛋白等,但并不限于这些。
在本发明中,支架蛋白只要是能够与至少1个抗原结合的、立体结构稳定的肽,即可使用。作为这样的肽,例如有抗体可变区片段、纤连蛋白、蛋白A结构域、LDL受体A结构域、脂笼蛋白等,此外还有Nygren等人(Current Opinion in Structural Biology,(1997)7:463-469;Journal of Immunol Mothods,290:3-28(2004))、Binz等人(Nature Biotech.23:1257-1266(2005))、Hosse等人(Protein Science 15:14-27(2006))记载的分子。
在本发明中,“抗体”一词取其最广泛的意义,只要显示所期望的生物学活性即可,包括单克隆抗体、多克隆抗体、抗体突变体(嵌合抗体、人源化抗体、小分子抗体(还包括抗体片段)、多特异性抗体等)。本发明中,在取得(制成)上述抗体时,可以优选采用本发明的抗体修饰方法。
本发明的“抗体”包括:对按照上述方式改变了氨基酸残基的电荷的抗体进一步通过氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等,使其氨基酸序列被修饰的抗体。还包括对通过氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入、或嵌合化及人源化等使氨基酸序列被修饰的抗体进一步改变其氨基酸残基的电荷的抗体。即,可以在将小鼠抗体人源化的同时进行修饰、或者可以进一步修饰人源化抗体。
氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入、以及人源化、嵌合化等氨基酸序列的修饰可以按照本领域技术人员所公知的方法进行。同样,当制作本发明中的抗体作为重组抗体时,所用抗体的可变区和恒定区也可以通过氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入、或嵌合化及人源化等来修饰其氨基酸序列。
本发明中的抗体可以是小鼠抗体、人抗体、大鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、骆驼抗体等来自任何动物的抗体。并且,例如可以是嵌合抗体、其中的人源化抗体等对氨基酸序列进行取代的修饰抗体。还可以是结合有各种分子的抗体修饰物、抗体片段、小分子抗体等任何抗体。
“嵌合抗体”是指将来自不同动物的序列组合起来制作的抗体。可以例示:例如由小鼠抗体的重链、轻链可变(V)区和人抗体的重链、轻链恒定(C)区构成的抗体。嵌合抗体的制作是公知的,例如连接编码抗体V区的DNA和编码人抗体C区的DNA,将其整合到表达载体中,之后再导入宿主中产生嵌合抗体,从而得到嵌合抗体。
另外,本发明中的小分子抗体只要具有抗原结合能力即可,对其结构、制造方法等没有限定。小分子抗体中还存在具有较全长抗体的活性高的抗体(Orita等人,Blood,(2005)105:562-566)。在本说明书中,“小分子抗体”只要是全长抗体(例如全长IgG等)的一部分即可,没有特别限定,但优选包含重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)。优选的抗体片段的例子有:例如Fab、F(ab’) 2 、Fab’、Fv等。抗体片段中的VH或VL的氨基酸序列可以通过取代、缺失、添加和/或插入来修饰。并且,只要保持抗原结合能力即可,VH和VL的一部分可以缺失。例如,在上述抗体片段中,“Fv”是包含完全抗原识别位点和结合位点的最小的抗体片段。“Fv”是1个VH和1个VL通过非共价键进行强力结合的二聚物(VH-VL二聚物)。通过各可变区的3个互补性决定区 (CDR)在VH-VL二聚物的表面形成抗原结合位点。6个CDR赋予抗原与抗体的结合位点。但是,即使是1个可变区(或仅包含3个抗原特异性CDR的Fv的一半),虽然其亲和性较全结合位点低,但却具有识别、结合抗原的能力。因此,这样的比Fv小的分子也包括在本发明的小分子抗体中。可以对小分子抗体的可变区进行嵌合化或人源化。
小分子抗体优选包括VH和VL两者。小分子抗体的例子有:Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv等抗体片段、以及能够使用抗体片段来制作的scFv(单链Fv)(Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85:5879-83;Pluckthun“The Pharmacology of Monoclonal Antibodies”第113卷,Resenburg和Moore(编),Springer Verlag,New York,第269-315页,(1994))、Diabody(双抗体)(Holliger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:6444-8;EP 404097;WO93/11161号;Johnson等人,Method inEnzymology(1991)203:88-98;Holliger等人,Protein Engineering(1996)9:299-305;Perisic等人,Structure(1994)2:1217-26;John等人,ProteinEngineering(1999)12(7):597-604;Atwell等人,Mol.Immunol.(1996)33:1301-12)、sc(Fv)2(Hudson等人,J Immunol.Methods(1999)231:177-89;Orita等人,Blood(2005)105:562-566)、Triabodies(Journal ofImmunological Methods(1999)231:177-89)和Tandem Diabody(串联双抗体)(Cancer Research(2000)60:4336-41)等。
抗体片段可以利用酶、例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白酶处理抗体而得到(参照Morimoto等人,J.Biochem.Biophys.Methods(1992)24:107-17;Brennan等人,Science(1985)229:81)。此外,还可以根据该抗体片段的氨基酸序列,通过基因重组来制造。
具有已修饰抗体片段的结构的小分子抗体,可以利用通过酶处理或基因重组得到的抗体片段来构建。或者,构建编码整个小分子抗体的基因,将其导入表达载体中,之后使之在适当的宿主细胞中表达(例如参照Co等人,J.Immunol.(1994)152:2968-76;Better和Horwitz,Methods Enzymol.(1989)178:476-96;Pluckthun和Skerra,Methods Enzymol.(1989)178:497-515;Lamoyi,Methods Enzymol.(1986)121:652-63;Rousseaux等人,Methods Enzymol.(1986)121:663-9;Bird和Walker,Trends Biotechnol.(1991)9:132-7)。
上述“scFV”是将2个可变区根据需要经由接头等连接而成的单链多肽。scFv中所含的2个可变区通常是1个VH和1个VL,但也可以是2个VH或2个VL。通常,scFv多肽在VH和VL结构域之间包含接头,通过该接头形成与抗原结合所必需的VH和VL的成对部分。通常,为了在相同分子内、在VH和VL之间形成成对部分,通常连接VH和VL的接头是10个氨基酸以上的长度的肽接头。但本发明中scFv的接头只要不妨碍scFv的形成即可,并不限于这样的肽接头。作为scFv的综述,可以参照Pluckthun“The Pharmacology ofMonoclonal Antibody(单克隆抗体的药理学)”,第113卷(Rosenburg和Moore编,Springer Verlag,NY,第269-315页(1994))。
“双抗体(Db)”是指利用基因融合构建的二价抗体片段(P.Holliger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993);EP 404,097号;WO93/11161号等)。双抗体是由两根多肽链构成的二聚体,各多肽链在同一链中轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)通过短至无法相互结合的、例如约5残基的接头进行结合。编码在同一多肽链上的VL和VH由于两者之间的接头短,无法形成单链V区片段,而形成二聚体,所以双抗体具有2个抗原结合位点。此时,若对应于两个不同表位(a、b)的VL和VH以通过约5残基的接头连接的VLa-VHb和VLb-VHa的组合的形式同时表达,则以双特异性Db的形式分泌。
双抗体包含2分子的scFv,所以包含4个可变区,其结果,具有2个抗原结合位点。与未形成二聚体的scFv的情形不同,在为了形成双抗体的情况下,通常连接各scFv分子内的VH和VL间的接头在使用肽接头时,为约5个氨基酸的肽接头。但是,形成双抗体的scFv的接头只要不妨碍scFv的表达、不妨碍双抗体的形成即可,并不限于这样的肽接头。
在抗体的多个同种型中,IgG抗体由于其分子量足够大,所以其主要代谢路径并不是肾排泄。已知具有Fc区作为其分子的一部分的IgG抗体通过在血管等的内皮细胞中表达的胎儿性Fc受体(FcRn)的补救路径进行再循环,从而具有较长的体内半衰期。认为IgG抗体主要通过内皮细胞中的代谢路径进行代谢(He XY,Xu Z,Melrose J,Mullowney A,Vasquez M,Queen C,Vexler V,Klingbeil C,Co MS,BergEL.Humanization and pharmacokinetics of a monoclonal antibody withspecificity for both E-and P-selectin(E和P选择蛋白特异性单克隆抗体的人源化和药物动力学).J Immunol.(1998)160(2):1029-35)。即,认为非特异性进入内皮细胞中的IgG抗体通过与FcRn结合而被再循环,另一方面,未能结合的IgG抗体被代谢。以降低与FcRn的结合活性的方式修饰其Fc部分的IgG抗体的血浆中半衰期缩短。反之,为了提高与FcRn的结合活性通过修饰构成IgG抗体Fc区的氨基酸残基,可以延长IgG抗体的血浆中半衰期(He XY,Xu Z,Melrose J,Mullowney A,Vasquez M,Queen C,Vexler V,Klingbeil C,Co MS,BergEL.Humanization and pharmacokinetics of a monoclonal antibody withspecificity for both E-and P-selectin(E-、P-选择蛋白特异性单克隆抗体的人源化和药物动力学).J Immunol.(1998)160(2):1029-35)。如上所述,现有的IgG抗体的血浆中药物动力学的控制方法如下进行:通过修饰构成Fc区的氨基酸残基来改变与FcRn的结合活性。但是,如下述的实施例所示,在本发明中已经明确:抗体的血浆中半衰期与pI高度相关。即,本发明的研究显示:不修饰构成Fc区的氨基酸序列,也可以控制抗体的血浆中半衰期,而所述修饰有可能获得免疫原性。
虽然并不想拘泥于特定的理论,但本发明人等现阶段思考如下。认为IgG抗体非特异性地进入内皮细胞中的速度依赖于带有负电荷的细胞表面与IgG抗体的理化库伦相互作用(Coulomb interaction)。因此,通过降低(提高)IgG的pI,使库伦相互作用减小(增大),抗体非特异性地进入内皮细胞中的量减少(增加),其结果,通过减少(增加)抗体在内皮细胞中的代谢,可以控制抗体的血浆中药物动力学。内皮细胞与细胞表面负电荷的库伦相互作用属于物理化学相互作用,所以认为该相互作用根本不依赖于构成抗体的氨基酸序列本身。因此,本发明中发现的控制血浆中药物动力学的方法并不是只适用于特定的抗体,可以广泛适用于包含抗体可变区的任意的多肽。作为这样的肽,优选分子量为5万以上的肽,更优选分子量为10万以上的肽,进一步优选分子量为14万以上的肽。若是这样的肽,则其主要代谢路径不是肾排泄,可以充分得到本发明的血浆中药物动力学控制效果。需要说明的是,本发明中的库伦相互作用的减小(增大)是指以排斥力表示的库伦力的增大(减小)。
本发明中的包含FcRn结合区的多肽并不限于IgG抗体,只要是能够与Fc受体(FcRn)结合(具有结合活性或亲和性)的蛋白即可。对本发明中的包含FcRn结合区的多肽没有特别限定,但优选为包含抗体的Fc区或Fc样区的蛋白质。Fc区还可以使用已被修饰的Fc区,例如可以使用上述J Immunol.(1998)160(2):1029-35的已被修饰的Fc区。本发明中的包含FcRn结合区的多肽例如有:IgG抗体。另外,即使是这些抗体(蛋白)的修饰体,只要其是能够与FcRn结合的蛋白,即包括在本发明的包含FcRn结合区的多肽中。本发明中,包含FcRn结合区的多肽的最优选的例子为:IgG抗体。
当使用IgG抗体作为本发明的抗体时,只要是IgG型抗体分子即可,可以是任何亚型,也可以是多特异性(例如双特异性)的IgG抗体。该双特异性抗体是对两种不同表位具有特异性的抗体,除了包括识别不同抗原的抗体,还包括识别同一抗原上的不同表位的抗体。另外,即使是抗体分子,当其为scFv或Fab这样的以肾排泄为主要代谢路径的小分子抗体时,如上所述,通过控制pI还不能控制血浆中药物动力学,但只要是不以肾排泄作为主要代谢路径的、包含抗体可变区的多肽,则无论任何形式的抗体分子本发明均可适用,这样的多肽例如有:scFv-Fc、dAb-Fc、Fc融合蛋白等。由于这些分子不以肾排泄作为主要代谢路径,所以通过利用本发明中发现的方法改变pI,可以控制血浆中药物动力学。本发明能够适用的抗体分子可以是抗体样分子。“抗体样分子”是指通过与靶分子结合来发挥功能的分子(Binz HK,Amstutz P,Pluckthun A.Engineering novel binding proteins fromnonimmunoglobulin domains(由非免疫球蛋白结构域构建新型结合蛋白).Nat Biotechnol.2005 Oct;23(10):1257-68),例如包括DARPins、Affibodies、Avimers等。
需要说明的是,当本发明的抗体例如为双特异性的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体时,该抗体还可以和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3以及磷脂酰肌醇蛋白聚糖3以外的抗原表位进行特异性结合,作为磷脂酰肌醇蛋白聚糖3以外的抗原,例如,为了募集NK细胞、细胞毒性T细胞、LAK细胞等,可以优选使用与这些细胞进行特异性结合的表面抗原。研究显示:使用由识别腺癌相关抗原MUC1的抗体MUSE11和识别LAK细胞表面抗原的抗体OKT3制作的双特异性抗体,对胆管癌发挥由LAK细胞产生的细胞毒性(Katayose Y,Kudo T,Suzuki M,ShinodaM,Saijyo S,Sakurai N,Saeki H,Fukuhara K,Imai K,Matsuno S.MUC1-specific targeting immunotherapy with bispecific antibodies:inhibition of xenografted human bile duct carcinoma growth(利用双特异性抗体进行MUC1特异性靶免疫治疗:抑制异种嫁接的人胆管癌增殖).Cancer Res.(1996)56(18):4205-12)。可以优选使用本发明提供的、血浆中药物动力学得到改善的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体代替上述识别MUC1的抗体MUSE11。作为本发明提供的双特异性磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体,还可以优选使用识别磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的不同表位的抗体。
需要说明的是,上述“双特异性抗体”例如可以是重链可变区和轻链可变区以单链形式进行连接的结构的抗体(例如sc(Fv)2)。还可以是将重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)连接的scFv(或sc(Fv)2)、与Fc区(缺失了CH1结构域的恒定区)结合得到的抗体样分子(例如 scFv-Fc)。由scFv-Fc形成的多特异性抗体具有(scFv)2-Fc型结构,其中第1多肽为VH1-接头-VL1-Fc,第2多肽为VH2-接头-VL2-Fc。或者可以是使单结构域抗体与Fc区结合得到的抗体样分子(Curr.Opin.Drug Discov.Devel.(2006)9(2):184-93)。
本发明中,氨基酸残基的电荷的改变可以通过氨基酸取代来进行。氨基酸取代可以按照后述的方法进行。
需要说明的是,本发明中作为取代对象的、能够暴露于CDR区表面的氨基酸残基,从保持抗原结合活性的角度考虑,优选为选自重链可变区中Kabat编号第31位、第61位、第62位、第64位和第65位的氨基酸残基或轻链可变区中Kabat编号第24位、第27位、第53位、第54位和第55位的氨基酸残基的至少1个氨基酸残基。这些氨基酸残基的取代在保持氨基酸残基取代前包含抗体可变区的多肽所具有的功能(抗原结合活性等)方面、以及该取代不依赖于抗体种类方面有用。
本发明还提供:通过改变包含抗体可变区的多肽的等电点,来控制该多肽的药物动力学的方法。并且,通过该方法得到的、药物动力学得到控制的包含抗体可变区的多肽也包括在本发明中。
本发明中,“血浆中药物动力学得到控制”是指比较构成抗体的氨基酸在修饰前与修饰后的抗体的血浆中药物动力学,血浆中药物动力学向所期望的方向变化。即,当希望延长抗体的药物(血浆中)半衰期时,“血浆中药物动力学的控制”是指延长抗体的血浆中半衰期。当希望缩短抗体的血浆中半衰期时,“血浆中药物动力学的控制”是指缩短抗体的血浆中半衰期。
本发明中,抗体的血浆中药物动力学是否向所期望的方向变化、即血浆中药物动力学是否如期望的那样得到控制,这可以通过使用例如小鼠、大鼠、兔、狗、猴等进行动力学试验来适当评价。更具体而言,本发明中的“血浆中半衰期的延长”或“血浆中半衰期的缩短”除了使用血浆中半衰期(t1/2)这一参数进行评价外,还可以通过平均血浆中滞留时间、血浆中清除率(CL)、浓度曲线下面积(AUC)等任一个参数来把握(“Pharmacokinetics演习による理解”(南山堂))。例如,按照体内动力学分析软件WinNonlin(Pharsight)中附带的操作规程进行非房室模型分析(Noncompartmental analysis),从而可以使用这些参数来适当评价本发明提供的“血浆中动力学的控制”。
通过控制血浆中药物动力学,可以持续发挥抗体的功能。例如,将本发明的方法应用于具有细胞毒性的抗体时,可以使其功能持续,可以调节细胞毒性效果、拮抗活性、激动活性等修饰前多肽所具有的功能的持续时间。
本发明中,“能够暴露于表面的氨基酸残基”通常是指位于构成抗体的多肽表面的氨基酸残基。“位于多肽表面的氨基酸残基”是指侧链能够与溶剂分子(通常多为水分子)接触的氨基酸残基,未必要求其所有侧链均与溶剂分子接触,即使在其一部分侧链与溶剂分子接触的情况下,其氨基酸残基也定义为“位于表面的氨基酸”。通过使用市售软件的同源建模法(homology modeling)等,本领域技术人员可以制作多肽或抗体的同源建模。根据该同源建模,能够适当选择位于构成适当的抗体的多肽表面的氨基酸残基作为“位于多肽表面的氨基酸残基”。
本发明中,对“能够暴露于表面的氨基酸残基”没有特别限定,但优选为位于抗体中的FcRn结合区外的氨基酸残基。作为该FcRn结合区,例如可以优选列举Fc区。
在本发明的抗体中,应改变电荷的氨基酸残基优选为构成抗体的重链可变区或轻链可变区的氨基酸残基。作为该可变区,具体可以优选列举:互补性决定区(CDR)、构架区(FR)。
至于抗体可变区中的表面氨基酸残基,本领域技术人员可以利用通过同源建模法等制作的同源建模适当选择。即,可以从H链可变区的根据Kabat编号的氨基酸残基H1、H3、H5、H8、H10、H12、H13、H15、H16、H19、H23、H25、H26、H31、H39、H42、H43、H44、H46、H61、H62、H64、H65、H68、H71、H72、H73、H75、H76、 H81、H82b、H83、H85、H86、H105、H108、H110、H112中适当选择抗体可变区中的表面氨基酸残基。例如,在SEQ ID NO:195所示的人源化磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的H链FR区,表面氨基酸可以例示第1、3、5、8、10、12、13、15、16、19、23、25、26、39、42、43、44、46、69、72、73、74、76、77、82、85、87、89、90、107、110、112、114位的氨基酸残基,但本发明并不限于这些。另外,H链CDR中的表面氨基酸残基可以根据同样的同源建模来选择。即,根据Kabat编号的氨基酸残基H97几乎暴露于所有抗体的表面。例如,SEQ ID NO:195所示的人源化磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的H链CDR中第101位的丝氨酸相当于该氨基酸残基。作为SEQ ID NO:195所示的人源化磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的H链CDR中的其他氨基酸残基,可以优选列举:第52、54、62、63、65、66位的氨基酸残基。
在L链可变区中,可以从根据Kabat编号的氨基酸残基L1、L3、L7、L8、L9、L11、L12、L16、L17、L18、L20、L22、L24、L27、L38、L39、L41、L42、L43、L45、L46、L49、L53、L54、L55、L57、L60、L63、L65、L66、L68、L69、L70、L74、L76、L77、L79、L80、L81、L85、L100、L103、L105、L106、L107中适当选择抗体可变区中的表面氨基酸残基。例如,可以例示SEQ ID NO:195所示的人源化磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的1、3、7、8、9、11、12、16、17、18、20、22、43、44、45、46、48、49、50、54、62、65、68、70、71、73、74、75、79、81、82、84、85、86、90、105、108、110、111、112作为表面氨基酸,但本发明并不限于这些。由此,至于L链CDR中的表面氨基酸残基,可以根据与决定H链CDR中的表面氨基酸残基的同源建模相同的同源建模来选择。作为SEQ ID NO:201所示的人源化磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的L链CDR中的氨基酸残基,可以优选列举:第24、27、33、55、59位的氨基酸残基。
在本发明提供的方法中,氨基酸残基的“修饰”具体是指将原始氨基酸残基取代成其他氨基酸残基、使原始氨基酸残基缺失、添加新的氨基酸残基等,但优选是指将原始氨基酸残基取代成其他氨基酸残基。即,本发明中“氨基酸残基的电荷的改变”优选氨基酸取代。
本发明提供的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体,为了进行上述“氨基酸残基的电荷的改变”,例如优选改变选自SEQ ID NO:195所示的、构成人源化磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的H链可变区中第19、43、52、54、62、63、65、66、107位的氨基酸残基的至少1个氨基酸残基的电荷。例如,优选改变选自SEQ ID NO:201所示的、构成人源化磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的L链可变区中第17、24、27、33、55、59、79、82、105位氨基酸残基的至少1个氨基酸残基的电荷。上述氨基酸残基中,有关该电荷已被改变的氨基酸残基以外的氨基酸残基,只要能够取得血浆中药物动力学的目标控制效果,则不必对其进行修饰,但也可以对其进行适当的修饰,使其与被适当修饰的氨基酸残基带有同种电荷、或者不带电荷。
在本发明提供的抗人IL-6受体抗体(6R_a_H1L1)的CDR中,为了在保持抗原结合活性的同时进行上述“氨基酸残基的电荷的改变”,例如优选改变选自SEQ ID NO:221所示的、构成抗人IL-6受体抗体的H链可变区中Kabat编号第31、64、65位氨基酸残基的至少1个氨基酸残基的电荷。另外,例如优选改变选自SEQ ID NO:224所示的、构成抗人IL-6受体抗体的L链可变区中Kabat编号第24、27、53、55位氨基酸残基的至少1个氨基酸残基的电荷。上述氨基酸残基中,有关该电荷已被改变的氨基酸残基以外的氨基酸残基,只要能够取得血浆中药物动力学的目标控制效果,则不必对其进行修饰,但也可以对其进行适当的修饰,使其与被适当修饰的氨基酸残基带有同种电荷、或者不带电荷。
在本发明提供的抗人IL-6受体抗体(6R_b_H1L1)的CDR中,为了在保持抗原结合活性的同时进行上述“氨基酸残基的电荷的改变”,例如优选改变选自SEQ ID NO:227所示的、构成抗人IL-6受体抗体的H链可变区中Kabat编号第31位氨基酸残基的至少1个氨基酸残基的电荷。另外,例如优选改变选自SEQ ID NO:229所示的、构成抗人IL-6受体抗体的L链可变区中Kabat编号第24、53、54、55位氨基酸残基的至少1个氨基酸残基的电荷。上述氨基酸残基中,有关该电荷已被改变的氨基酸残基以外的氨基酸残基,只要能够取得血浆中药物动力学的目标控制效果,则不必对其进行修饰,但也可以对其进行适当的修饰,使其与被适当修饰的氨基酸残基带有同种电荷、或者不带电荷。
在本发明提供的抗人GPC3抗体的CDR中,为了在保持抗原结合活性的同时进行上述“氨基酸残基的电荷的改变”,例如优选改变选自SEQ ID NO:233所示的、构成抗人GPC3抗体的H链可变区中Kabat编号第61、62、64、65位氨基酸残基的至少1个氨基酸残基的电荷。另外,例如优选改变选自SEQ ID NO:236所示的、构成抗人GPC3抗体的L链可变区中Kabat编号第24、27位氨基酸残基的至少1个氨基酸残基的电荷。上述氨基酸残基中,有关该电荷已被改变的氨基酸残基以外的氨基酸残基,只要能够取得血浆中药物动力学的目标控制效果,则不必对其进行修饰,但也可以对其进行适当的修饰,使其与被适当修饰的氨基酸残基带有同种电荷、或者不带电荷。
在本发明提供的抗人IL-31受体抗体的CDR中,为了在保持抗原结合活性的同时进行上述“氨基酸残基的电荷的改变”,例如优选改变选自SEQ ID NO:239所示的、构成抗人IL-31受体抗体的H链可变区中Kabat编号第61、62、64、65位氨基酸残基的至少1个氨基酸残基的电荷。另外,例如优选改变选自SEQ ID NO:242所示的、构成抗人IL-31受体抗体的L链可变区中Kabat编号第24、54位氨基酸残基的至少1个氨基酸残基的电荷。上述氨基酸残基中,有关该电荷已被改变的氨基酸残基以外的氨基酸残基,只要能够取得血浆中药物动力学的目标控制效果,则不必对其进行修饰,但也可以对其进行适当的修饰,使其与被适当修饰的氨基酸残基带有同种电荷、或者不带电荷。
已知氨基酸中存在带有电荷的氨基酸。通常,作为带正电荷的氨基酸(正电荷氨基酸),已知有赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)。作为带负电荷的氨基酸(负电荷氨基酸),已知有天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)等。除此以外的氨基酸作为不带电的氨基酸而已知。
作为上述“被修饰的氨基酸残基”,优选从下述(a)或(b)任一组所含的氨基酸残基中选择,但并不特别限于这些氨基酸。
(a)谷氨酸(E)、天冬氨酸(D);
(b)赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)
需要说明的是,当原始(修饰前的)氨基酸残基已经带有电荷时,可以对其进行修饰,使其成为不带电荷的氨基酸残基,这也是本发明的优选方式之一。即,本发明中的修饰包括:(1)将带有电荷的氨基酸取代成不带电荷的氨基酸;(2)将带有电荷的氨基酸取代成与该氨基酸带有相反电荷的氨基酸;(3)将不带电荷的氨基酸取代成带有电荷的氨基酸。
在本发明中,优选修饰构成抗体的氨基酸残基,以改变抗体的等电点(pI)。当存在多个要被修饰的氨基酸残基时,用于修饰的氨基酸残基中可以包括少数不带电荷的氨基酸残基。
本发明提供的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体中,“氨基酸残基的电荷的改变”的优选例子列举如下。作为增大pI值的修饰,例如可以对SEQID NO:195所示的、构成人源化磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的H链可变区中的Q43K、D52N、Q107R的至少1个进行取代,特别优选修饰成SEQ ID NO:198所示的氨基酸序列。另外,例如可以对SEQ ID NO:201所示的、构成人源化磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的L链可变区中的E17Q、Q27R、Q105R的至少1个进行取代,特别优选修饰成SEQID NO:204所示的氨基酸序列。另一方面,作为减小pI值的修饰,可以对SEQ ID NO:195所示的、构成人源化磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的H链可变区中的K19T、Q43E、K63S、K65Q、G66D的至少1个进行取代,特别优选修饰成SEQ ID NO:197所示的氨基酸序列。另外,例如可以对SEQ ID NO:201所示的、构成人源化磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3抗体的L链可变区中的Q27E、K79T、R82S的至少1个进行取代,特别优选修饰成SEQ ID NO:203所示的氨基酸序列。
本发明提供的抗人IL-6受体抗体(6R_a_H1L1)中,“氨基酸残基的电荷的改变”的优选例子有:表20记载的氨基酸取代中的至少1个氨基酸取代。
本发明提供的抗人IL-6受体抗体(6R_b_H1L1)中,“氨基酸残基的电荷的改变”的优选例子有:表22记载的氨基酸取代中的至少1个氨基酸取代。
本发明提供的抗人GPC3抗体中,“氨基酸残基的电荷的改变”的优选例子有:表24记载的氨基酸取代中的至少1个氨基酸取代。
本发明提供的抗人IL-31受体抗体中,“氨基酸残基的电荷的改变”的优选例子有:表27记载的氨基酸取代中的至少1个氨基酸取代。
本发明中,对供于修饰的氨基酸残基数没有特别限定,但是例如在修饰抗体可变区时,为了不降低其与抗原的结合活性、以及不增加免疫原性,优选修饰用于达到目标控制的血浆中药物动力学所必需的最低限度的氨基酸残基。还优选将可增大抗原结合活性的氨基酸残基的修饰与可降低免疫原性的氨基酸残基的修饰适当组合。
抗体与抗原的结合活性的测定可以采用公知的方法。例如可以采用:ELISA(酶联免疫吸附测定法)、EIA(酶免疫测定法)、RIA(放射免疫测定法)或荧光免疫法等。在一般的教科书“Antibodies ALaboratory Manual.Ed Harlow,David Lane,Cold Spring HarborLaboratory,1988”中记载有上述方法。
作为测定抗体与细胞的结合活性的方法,例如有Antibodies ALaboratory Manual.(Ed Harlow,David Lane,Cold Spring HarborLaboratory,1988)中第359~420页上记载的方法。即,可以按照以细胞作为抗原的BIACORE、细胞增殖分析、ELISA或FACS(荧光激活细胞分类术)的原理来评价活性。在ELISA法中,抗体与细胞的结合活性通过比较由酶反应生成的信号水平来定量评价。即,向固定有各强制表达细胞的ELISA板上加入受检抗体,利用识别受检抗体的酶标记抗体检测与细胞结合的抗体。或者,在FACS中,制成受检抗体的稀释系列,通过确定抗体与各强制表达细胞的结合效价,可以比较抗体与细胞的结合活性。
至于不与ELISA板等载体结合、而在悬浮于缓冲液等中的细胞表面上表达的抗原与抗该抗原的抗体的结合,可以利用FACS法进行测定。作为上述测定中使用的流式细胞仪,例如有:FACSCantoTM II、FACSAriaTM、FACSArrayTM、FACSVantageTM SE、FACSCaliburTM(以上来自BD Biosciences);以及EPICS ALTRA HyPerSort、Cytomics FC500、EPICS XL-MCL ADC、EPICS XL ADC、Cell Lab Quanta/Cell LabQuanta SC(以上来自Beckman Coulter)等。
作为抗体与抗原的结合活性的优选测定方法的一个例子,可以列举下述方法:使表达抗原的细胞与受检抗体反应,用识别受检抗体的、FITC标记的二次抗体将细胞染色,之后利用FACSCalibur(BD)进行测定,使用CELL QUEST软件(BD)分析该荧光强度的方法。根据本方法,将细胞用特异性识别与表达抗原的细胞表面上的抗原结合的受检抗体的、FITC标记的二次抗体染色,之后利用FACSCalibur进行测定时,使用CELL QUEST软件分析其荧光强度,将由该方法得到的几何平均值(受检Geo-Mean值)与使用对照抗体得到的对照Geo-Mean值进行比较,从而可以判断。计算Geo-Mean值(几何平均值)的算式记载在CELL QUEST软件用户指南(BD Biosciences社)中。
为了不增加要给予抗体的人的体内免疫原性,优选修饰后的氨基酸序列为人序列(来源于人的天然抗体中可见的序列),但本发明并不限于此。并且,为了在修饰后将多个FR(FR1、FR2、FR3、FR4)分别转变成人序列,为了改变等电点可以优选向已导入了修饰的位点以外的位点导入突变。如此操作将各FR替换成人序列的方法报道在非专利文献(Ono K,Ohtomo T,Yoshida K,Yoshimura Y,Kawai S,Koishihara Y,Ozaki S,Kosaka M,Tsuchiya M.The humanized anti-HM1.24 antibody effectively kills multiple myeloma cells by humaneffector cell-mediated cytotoxicity(人源化抗HM1.24抗体利用人效应细胞介导的细胞毒性有效杀伤多骨髓瘤细胞).Mol.Immunol.(1999)36(6):387-395)中。另外,为了改变抗体的等电点,可以将各FR修饰成其他人FR以使其电荷发生变化(例如可以将FR3与其他人FR交换以降低抗体的等电点)。这样的人源化方法报道在非专利文献(Dall’Acqua WF,Damschroder MM,Zhang J,Woods RM,Widjaja L,YuJ,Wu H.Antibody humanization by framework shuffling.Methods.(2005)36(1):43-60)中。
另外,当仅通过微小的表面电荷的改变而无法达到被控制的目标血浆中药物动力学时,通过反复进行表面电荷的改变和血浆中药物动力学的评价,可以优选获得所期望的、具有被控制的目标血浆中药物动力学的抗体。
在非专利文献(He XY,Xu Z,Melrose J,Mullowney A,Vasquez M,Queen C,Vexler V,Klingbeil C,Co MS,Berg EL.Humanization andpharmacokinetics of a monoclonal antibody with specificity for both E-and P-selectin(E-、P-选择蛋白特异性单克隆抗体的人源化和药物动力学).J Immunol.(1998)160(2):1029-35)中,将抗E,P-选择蛋白抗体的嵌合抗体(IgG4)、即嵌合EP5C7.g4与人源化抗体(IgG4)、即HuEP5C7.g4在猕猴体内的血浆中药物动力学进行了比较,结果显示:两者的血浆中药物动力学同等。在非专利文献(Gobburu JV,Tenhoor C,Rogge MC,Frazier DE Jr,Thomas D,Benjamin C,Hess DM,Jusko WJ.Pharmacokinetics/dynamics of 5c8,a monoclonal antibody to CD154(CD40 ligand)suppression of an immune response in monkeys.JPharmacol Exp Ther.(1998)286(2):925-30)中,将抗CD154抗体的嵌合型抗体ch5d8与人源化抗体Hu5c8在食蟹猴体内的血浆中药物动力学进行了比较,结果显示:两者的血浆中药物动力学同等。在非专利文献(Kashmiri SV,Shu L,Padlan EA,Milenic DE,Schlom J,Hand PH., Generation,characterization,and in vivo studies of humanizedanticarcinoma antibody CC49(人源化抗癌抗体CC49的增殖、特征和体内研究).Hybridoma.(1995)14(5):461-73)中显示:嵌合抗体cCC49与人源化抗体HuCC49在小鼠体内的血浆中药物动力学同等。在非专利文献(Graves SS,Goshorn SC,Stone DM,Axworthy DB,Reno JM,Bottino B,Searle S,Henry A,Pedersen J,Rees AR,Libby RT.Molecularmodeling and preclinical evaluation of the humanized NR-LU-13 antibody.Clin Cancer Res.(1999)5(4):899-908)和非专利文献(Couto JR,BlankEW,Peterson JA,Ceriani RL.Anti-BA46 monoclonal antibody Mc3:humanization using a novel positional consensus and in vivo and in vitrocharacterization.Cancer Res.(1995)55(8):1717-22)中显示:在对小鼠进行的评价中,小鼠抗体与人源化抗体的血浆中药物动力学和分布同等。认为由于小鼠Fc和人Fc均与小鼠FcRn交叉,所以同一嵌合抗体和同一人源化抗体的血浆中药物动力学和分布同等。如这些例子所示,在具有相同CDR的嵌合抗体和人源化抗体之间血浆中药物动力学同等。即,按照非专利文献(Ghetie V,Popov S,Borvak J,Radu C,Matesoi D,Medesan C,Ober RJ,Ward ES.Increasing the serumpersistence of an IgG fragment by random mutagenesis(利用随机诱变提高IgG片段的血清中滞留性).Nat Biotechnol.(1997)15(7):637-40)等所示的公知方法进行人源化时,与嵌合抗体相比血浆中药物动力学同等,按照公知的方法无法制作血浆中药物动力学得到控制的人源化抗体。
相对于此,采用本发明中发现的方法将嵌合抗体人源化时,通过对能够暴露于嵌合抗体表面的氨基酸残基进行修饰以改变抗体的pI,可以制作与嵌合抗体相比血浆中药物动力学得到控制(即,其血浆中半衰期延长或缩短)的人源化抗体。用于控制血浆中药物动力学的、能够暴露于人源化抗体表面的氨基酸的修饰可以和抗体的人源化同时进行,或者使用人源化抗体作为起始原料,修饰能够暴露于其表面的氨基酸残基,从而可以进一步改变人源化抗体的pI。
本发明中等电点的值可以通过本领域技术人员公知的等电点电泳来测定。理论等电点的值可以使用基因和氨基酸序列分析软件(Genetyx等)进行计算。在本发明中,例如为了充分控制血浆中药物动力学等而必需大幅改变等电点时,上述测定有用。特别优选以理论等电点的值计算必需使等电点的值变化1.0以上的情形,更优选必需使等电点的值变化3.0以上的情形。
在非专利文献(Adams CW,Allison DE,Flagella K,Presta L,ClarkeJ,Dybdal N,McKeever K,Sliwkowski MX.Humanization of arecombinant monoclonal antibody to produce a therapeutic HERdimerization inhibitor(重组单克隆抗体人源化以产生治疗用HER二聚化抑制剂),pertuzumab.Cancer Immunol Immunother.(2006)55(6):717-27)中记载着:使用相同人抗体的FR序列进行人源化的3种人源化抗体曲妥单抗、贝伐单抗、帕妥珠单抗的血浆中药物动力学几乎同等。即,使用相同的FR序列进行人源化时,抗体的血浆中药物动力学几乎同等。根据本发明中发现的方法,除了进行上述人源化步骤外,还对能够暴露于抗体表面的氨基酸残基进行修饰以改变抗体的pI,从而可以控制药物(血浆中)浓度。
本发明的方法还可适用于人抗体。通过对能够暴露于由人抗体文库或产生人抗体的小鼠等制作的人抗体表面的氨基酸残基进行改变,使人抗体的pI发生变化,可以制作与最初制作的人抗体的血浆中药物动力学相比其血浆中药物动力学得到控制(即其血浆中半衰期延长或缩短)的人抗体。
通过减小抗体所具有的pI值,抗体的血浆中半衰期延长。反之,已知通过增大抗体的pI值,抗体的血浆中半衰期缩短,抗体的组织移动性提高(Vaisitti T,Deaglio S,Malavasi F.Cationization of monoclonalantibodies:another step towards the“magic bullet”?,J Biol RegulHomeostAgents.(2005)19(3-4):105-12;Pardridge WM,Buciak J,Yang J,Wu D.Enhanced endocytosis in cultured human breast carcinoma cellsand in vivo biodistribution in rats of a humanized monoclonal antibodyafter cationization of the protein.(1998)286(1):548-54)。但由于该抗体的免疫原性增加、细胞内的内化活性也增大,所以为了适用于通过ADCC和CDC活性等细胞内的内化活性成为抑制其活性发挥的要因的细胞毒性等机理发挥癌症治疗效果的抗体,需要进一步改良。即,关于通过ADCC和CDC活性等细胞内的内化活性成为抑制其活性发挥的要因的细胞毒性等机理发挥癌症治疗效果的抗体,pI值的增大或减小是否会增强肿瘤抑制效果尚不明确。在本发明中,制作pI值减少的人源化抗体的修饰抗体和pI值增大的人源化抗体的修饰抗体,比较研究两者的抗肿瘤效果,从而验证其中任一种修饰是否带来强肿瘤抑制效果。结果惊奇地发现:pI值减少的人源化抗体对肝癌发挥更优异的效果。
本发明中的“抗体”包括:使用如上所述改变了氨基酸残基的电荷的抗体作为起始原料,通过对构成该抗体的氨基酸残基的取代、缺失、添加和/或插入等,进一步修饰其氨基酸序列的抗体。本发明中的“抗体”还包括:使用通过氨基酸残基的取代、缺失、添加和/或插入、或嵌合化及人源化等使氨基酸序列被修饰的抗体作为起始原料,进一步改变构成该抗体的氨基酸残基的电荷而得到的抗体。
作为以提高本发明所提供的抗体的特性为目的的修饰的例示,优选列举:以提高抗体稳定性为目的的修饰(以下记作“稳定性的修饰”)。水溶液中的抗体在天然状态和惰性变性状态之间达到平衡。如热力学第二定律(ΔG=ΔH-TΔS)所示,天然状态的稳定性取决于系统吉布斯自由能的变化ΔG和作为其详细分类的焓的变化ΔH(起因于多肽链中的疏水性相互作用及氢键等的变化)与熵的变化ΔS(起因于溶剂和立体结构的自由度的变化)的平衡。正数值的ΔG表示蛋白的天然状态较蛋白的变性状态稳定,ΔG的正数值越大,蛋白的天然状态的稳定性越高。为了使蛋白发生变性,必需破坏有助于其稳定化的力。例如,通过将蛋白溶液暴露于高温,其立体结构的自由度增大,有助于蛋白稳定的因子减弱,从而引起蛋白的热变性,但此时-TΔS项决定变性。至于由蛋白的热变性引起的伸展的ΔH,如本说明书所记载的实施例中具体描述的那样,使用差示扫描量热法(DSC)可以直接测定。蛋白热变性过程中的DSC曲线在称作变性中点(Tm)的、受检蛋白所固有的温度形成吸热峰。将该峰积分,从而得到变性焓的变化。通常Tm值是热稳定性的一个指标。通过DSC还可以测定蛋白发生热变性时的热容量变化(ΔCp)。伴随着热变性而产生的热容量变化主要起因于:蛋白以天然状态存在时未暴露于分子表面的氨基酸残基随着蛋白变性而暴露于溶剂分子中,结果发生了水合作用。
如上所述,本发明提供的方法中,氨基酸残基的“修饰”具体是指将原始氨基酸残基取代成其他氨基酸残基、使原始氨基酸残基缺失、添加新的氨基酸残基等,但优选将原始氨基酸残基取代成其他氨基酸残基。即,为了本发明中的抗体的稳定性的修饰,优选通过氨基酸取代来进行修饰。对构成抗体的氨基酸残基进行稳定性的修饰,结果抗体的上述Tm值增大。即,作为进行了抗体稳定性修饰的指标,优选使用上述Tm值。
为了对本发明提供的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体进行上述“稳定性的修饰”,例如优选修饰选自SEQ ID NO:195所示的、构成人源化磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的H链可变区中第37、40、48、51位氨基酸残基中的至少1个氨基酸残基。另外,例如优选修饰选自SEQ IDNO:201所示的、构成人源化磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的L链可变区中第2、25、42、48、50、83、84位氨基酸残基中的至少1个氨基酸残基。上述氨基酸残基中,有关已实施该稳定性修饰的氨基酸残基以外的氨基酸残基,只要能够得到所期望的Tm值,则不必对其进行修饰,但也可以对其进行适当的修饰,使其与供于修饰的人源化磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体具有同等程度的Tm值或其以上的Tm值。
稳定性的修饰可以通过随机修饰构成供于修饰的人源化抗体的各氨基酸残基来实施。此外,稳定性的修饰还可以通过将构成供于修饰的人源化抗体的一部分氨基酸序列取代成构成现有的Tm值高的抗体、且从抗体的立体结构相关的角度考虑与供于该修饰的人源化抗体的一部分氨基酸序列对应的氨基酸序列来实施。对将要被取代的氨基酸残基的位置没有特别限定,但可以优选修饰FR区中的氨基酸残基。另外,即使是CDR区中的氨基酸残基,只要不伴有抗原结合活性的减弱,也可以对其进行适当修饰。对将要被修饰的氨基酸残基的数目没有特别限定,还可以通过将FR区的特定区段取代成所期望的区段来实施。可以修饰FR区中FR1、FR2、FR3、FR4的所有区段,还可以通过1个或1个以上各区段的修饰的组合来实施。
修饰FR区的区段时,优选的例子有:H链或L链的FR2区。优选的具体例子有:例如将SEQ ID NO:195所示的、具有VH1b亚纲的人源化磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的H链FR2修饰成VH4亚纲的氨基酸残基的修饰,即、将第37位的缬氨酸取代成异亮氨酸的V37I;同样还有A40P、M48I、L51I的修饰。优选的具体例子还有:例如将SEQ ID NO:201所示的、具有VK2亚纲的人源化磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的L链FR2区修饰成VK3亚纲的修饰,即L42Q、S48A、Q50R的修饰、以及相当于修饰成FR1的生殖细胞序列的V2I的修饰。
构成抗体的氨基酸残基的取代、缺失、添加和/或插入、以及人源化、嵌合化等氨基酸序列的修饰均可优选利用本领域技术人员所公知的方法来进行。同样,制作本发明提供的抗体作为重组抗体时,也优选进行构成抗体可变区和恒定区的氨基酸残基的取代、缺失、添加和/或插入。
本发明中的抗体优选使用小鼠抗体、人抗体、大鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、骆驼抗体等来自任何动物的抗体。并且,还可以优选使用嵌合抗体、特别是其中的人源化抗体等其氨基酸序列被取代的修饰抗体。还可以优选使用结合有各种分子的抗体修饰物。
“嵌合抗体”是将来自不同动物的序列组合而制作的抗体。例如可以优选例示:由小鼠抗体的H链、L链的可变(V)区和人抗体的H链、L链的恒定(C)区构成的抗体。嵌合抗体的制作方法是公知的。例如,将编码抗体V区的DNA和编码人抗体C区的DNA进行符合读框的融合,将所得的重组DNA整合到通常使用的表达载体中。通过培养导入有该载体的宿主细胞,从其培养液中可以适当取得或分离嵌合抗体。
“人源化抗体”又称重构人抗体,是将从人以外的哺乳动物、例如小鼠等中分离的抗体的互补性决定区(CDR)与人抗体的构架区(FR)连接而成的抗体。编码人源化抗体的DNA序列可以通过使用多个寡核苷酸作为模板的重叠PCR反应来合成。重叠PCR反应的原料、其实施方法记载在WO98/13388等中。编码本发明的人源化抗体可变区的DNA由制作成具有相互重叠的核苷酸序列的多个寡核苷酸通过重叠PCR反应而得到,再将其与编码人抗体恒定区的DNA以符合读框的形式连接,使形成密码子序列。按照上述方式连接的DNA接下来以使该DNA能够表达的形式被插入表达载体中,之后导入宿主中。
用于鉴定CDR的方法是公知的(Kabat等人,Sequence of Proteinsof Immunological Interest(目标免疫蛋白序列)(1987),National Instituteof Health,Bethesda,Md.;Chothia等人;Nature(1989)342:877)。其一般的基因重组方法也是公知的(参照欧洲专利申请公开号EP 125023号公报;WO96/02576号公报)。通过使用上述公知的方法,确定例如由小鼠抗体等非人动物取得的抗体的CDR,之后构建编码连接有该CDR和人抗体FR的重组抗体的DNA。选择经由CDR连接的人抗体的FR,使CDR形成良好的抗原结合位点。根据需要,可以适当修饰抗体可变区中FR的氨基酸残基,使重构人抗体的CDR形成适当的抗原结合位点(Sato,K.等人,Cancer Res.(1993)53:851-856)。作为供于修饰的FR中的氨基酸残基,包括经由非共价键与抗原直接结合的残基(Amit等人,Science(1986)233:747-53)、对CDR结构产生影响或发挥作用的残基(Chothia等人,J.Mol.Biol.(1987)196:901-17)和与VH-VL 相互作用有关的残基(EP 239400号专利公报)。
关于通过插入有该DNA的通常使用的表达载体转化或转导的宿主细胞所产生的、编码该DNA的人源化抗体,通过培养该宿主细胞,从该培养液中分离即得。
当本发明提供的抗体为抗体、人源化抗体或人抗体时,作为该抗体的C区,优选使用来自人抗体的C区。例如,作为H链C区,优选使用Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4;作为L链C区,优选使用Cκ、Cλ。为了改善抗体或其生产的稳定性,可以适当修饰人抗体C区。本发明提供的嵌合抗体优选由从人以外的哺乳动物取得的抗体的V区和人抗体的C区构成。另一方面,人源化抗体优选由从人以外的哺乳动物取得的抗体的CDR和人抗体的FR以及C区构成。另外,人抗体优选由从人取得的抗体的CDR和人抗体的FR以及C区构成。人抗体的C区由IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA、IgD和IgE等同种型所对应的固有氨基酸序列构成。作为本发明提供的人源化抗体的C区,优选使用属于任一种同种型的抗体的C区。优选使用人IgG的C区,但并不限于此。对用作人源化抗体或人抗体的FR的人抗体的FR也没有特别限定,优选使用属于任一种同种型的抗体的FR。
为了降低免疫原性,还可以通过使用非专利文献(Ono K,OhtomoT,Yoshida K,Yoshimura Y,Kawai S,Koishihara Y,Ozaki S,Kosaka M,Tsuchiya M.The humanized anti-HM1.24 antibody effectively killsmultiple myeloma cells by human effector cell-mediated cytotoxicity(人源化抗HM1.24抗体利用人效应细胞介导的细胞毒性有效杀伤多骨髓瘤细胞).Mol.Immunol.(1999)36(6):387-395)中所述的方法和类似方法,将构成FR区的所有氨基酸残基或其中的一部分取代成生殖细胞系列的序列。基于生殖细胞系列序列的免疫原性低的合理预测,通过将构成人源化抗体FR区的氨基酸序列与生殖细胞系列的氨基酸序列进行序列对比来加以比较(Abhinandan K.R.and Martin C.R.,J.Mol.Biol.(2007)369:852-862)。在不失去抗原结合活性的范围内,在该比较中,可以将构成不同的人源化抗体FR区的氨基酸残基取代成生殖细胞系列的序列中的氨基酸残基。具体例子有:在SEQ ID NO:195所示的构成H链可变区的氨基酸残基中,将第70位的L取代成I、第87位的T取代成R、第97位的T取代成A的修饰等。此外,还可以列举:在SEQ ID NO:201所示的构成L链可变区的氨基酸残基中,将第25位的S取代成A的修饰等。
本发明提供的、已被修饰的嵌合抗体、人源化抗体和人抗体的可变区和恒定区只要显示出抗原结合特异性即可,可以对构成供于修饰的抗体可变区和恒定区的1个或1个以上氨基酸优选进行缺失、取代、插入和/或添加等。
由于利用了来源于人的序列的嵌合抗体、人源化抗体和人抗体在人体内的免疫原性降低,所以认为它们在出于治疗目的等用作给予人的治疗用抗体时有用。
在本发明的方法中,作为编码导入突变前的抗体H链或L链的基因序列,可以使用已知的序列,此外,按照本领域技术人员公知的方法可以获得抗体基因的新序列。该基因例如可以优选从抗体文库中获得。并且,该基因还可以通过采用以产生单克隆抗体的杂交瘤的mRNA为模板的RT-PCR法等公知的方法进行克隆而获得。
关于抗体文库,已经有许多抗体文库是公知的。另外,抗体文库的制作方法也是公知的,所以本领域技术人员可以适当获得或制作抗体文库。例如,作为优选的抗体文库,可以例示:由Clackson等人,Nature(1991)352:624-8;Marks等人,J.Mol.Biol.(1991)222:581-97;Waterhouses等人,Nucleic Acids Res.(1993)21:2265-6;Griffiths等人,EMBO J.(1994)13:3245-60;Vaughan等人,Nature Biotechnology(1996)14:309-14以及日本特表平20-504970号公报等文献公开的抗体噬菌体文库。此外,优选使用在真核细胞中制作文库的方法(WO95/15393号小册子)或核糖体展示法等公知方法。并且,使用人抗体文库作为起始原料,通过筛选获得人抗体的技术也为本领域技术人员所公知。即,将人抗体的H链和L链的可变区进行符合读框的融合,通过噬菌体展示法使所得的单链抗体(scFv)在噬菌体表面表达。通过选择与抗原结合的噬菌体,将编码与抗原结合的scFv的基因从该噬菌体上分离。通过鉴定该基因的序列,可以确定编码与抗原结合的抗体H链和L链的可变区的DNA序列。将具有该序列的抗体基因插入适当的表达载体中,使其在后述适当的宿主细胞中表达,从而适当取得人抗体。这些方法已众所周知,可以例示WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388中公开的方法。
由产生单克隆抗体的杂交瘤取得编码抗体的基因的方法,基本上可以采用公知技术。以下对其进行详述,简而言之,优选通过下述方法获得抗体基因:按照通常的免疫方法,通过所期望的致敏抗原使动物免疫,之后利用通常的细胞融合方法将由该免疫动物得到的免疫细胞与公知的亲细胞进行细胞融合;按照通常的筛选方法选择产生单克隆抗体的细胞(杂交瘤),使用由所选择的杂交瘤获得的mRNA作为模板,通过逆转录酶合成抗体可变区(V区)的cDNA;通过将该cDNA与编码所期望的抗体恒定区(C区)的DNA进行符合读框的融合。
更具体而言,优选例示如下,但本发明并不限于这些例子。用于得到本发明提供的抗体的致敏抗原可以是具有免疫原性的完全抗原,也可以是包含不显示免疫原性的半抗原等不完全抗原。例如,可以优选使用全长蛋白或其部分多肽或肽等。其优选的具体例子有:SEQ IDNO:207所示的可溶型GPC3核心多肽。此外,已知由多糖类、核酸、脂质等构成的物质也发挥抗原的作用,本发明的抗体所结合的抗原并不特别限于上述物质形态。抗原的制备优选利用本领域技术人员所公知的方法来进行,例如可以优选采用使用了杆状病毒的方法(例如WO98/46777等)等。当抗原的免疫原性低时,可以优选通过结合在白蛋白等具有免疫原性的大分子上的该抗原使动物获得免疫。当致敏抗原为跨膜分子时,根据需要优选使用该分子的胞外区的多肽片段作为致敏抗原。或者,可以优选使用在细胞表面上表达该分子的细胞作为致敏抗原。并且,当致敏抗原为不溶性分子时,通过将该分子与其他水溶性分子结合来增溶,该已增溶的结合分子优选用作致敏抗原。
产生抗体的细胞优选通过使用上述适当的致敏抗原对动物进行免疫而获得。或者,通过在体外对能够产生抗体的淋巴细胞进行免疫,可以获得产生抗体的细胞。作为将被免疫的动物,可以使用各种脊椎动物、哺乳动物。特别是啮齿类、兔形目、灵长目的动物通常被用作被免疫的动物。可以例示:小鼠、大鼠、仓鼠等啮齿类;兔等兔形目;食蟹猴、猕猴、狒狒、黑猩猩等猴等灵长目的动物。此外,还已知在基因组上保有人抗体基因所有组成成分(レパ一トリ一,repertoire)的转基因动物,通过使用这样的动物,可以优选获得人抗体(参照WO96/34096;Mendez等人,Nat.Genet.(1997)15:146-56)。除了使用这样的转基因动物外,例如,在体外用所期望的抗原或表达所期望的抗原的细胞致敏人淋巴细胞,之后使其与人骨髓瘤细胞、例如U266进行细胞融合,从而优选获得具有该抗原结合活性的所期望的人抗体(参照日本特公平1-59878号公报)。另外,通过用所期望的抗原使基因组上保有人抗体基因的全部组成成分的转基因动物获得免疫(参照WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602、WO96/34096、WO96/33735),可以优选获得所期望的人抗体。
动物的免疫可如下进行:将致敏抗原用磷酸缓冲盐(PBS)或生理盐水等适当稀释、悬浮,根据需要与佐剂混合而将其乳化,之后将该致敏抗原对动物进行腹腔内或皮下注射。由此来实施免疫。之后,优选将与弗氏不完全佐剂混合的致敏抗原每4~21天给药数次。确认免疫后的动物中产生抗致敏抗原的抗体时,可以按照惯用方法、例如酶联免疫吸附分析(ELISA)、流式细胞术(FACS)等公知的分析方法测定该动物血清中抗致敏抗原的抗体效价来进行确认。
杂交瘤可以如下制作:使用通常用于细胞融合的融合剂(例如聚乙二醇),将由用所期望的致敏抗原免疫的动物或淋巴细胞得到的、产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合来制作(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,1986,59-103)。杂交瘤的制作可以优选按照例如Milstein等人的方法(G.Kohler和C.Milstein,MethodsEnzymol.(1981)73:3-46)等来进行。通过培养、增殖利用上述方法制作的杂交瘤细胞,获得与由该杂交瘤产生的抗原蛋白特异性结合的单克隆抗体。该单克隆抗体与该抗原蛋白的结合特异性可以通过免疫沉淀、放射免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、流式细胞术(FACS)等公知的分析方法适当测定。之后,根据需要,将已测定所期望的特异性、结合活性或活性的产生抗体的杂交瘤通过有限稀释等方法适当亚克隆,能够分离出由该杂交瘤产生的单克隆抗体。
接着,关于编码所选择的抗体的基因,可以使用能够与该基因特异性结合的探针(例如与编码抗体恒定区的序列互补的寡核苷酸等),由上述杂交瘤或产生抗体的细胞(致敏淋巴细胞等)克隆该基因。此外,还可以通过使用由杂交瘤或产生抗体的细胞(致敏淋巴细胞等)取得的mRNA作为模板的RT-PCR法克隆该基因。免疫球蛋白根据其结构和功能的不同而分为5种不同的纲:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。各纲又进一步分为若干同种型(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4;IgA1和IgA2等)。由本发明提供的抗体可以来源于属于其中任一纲和亚纲的抗体,对任一纲和亚纲没有特别限定,但特别优选属于IgG纲的抗体。
编码构成抗体H链和L链的氨基酸序列的基因可以利用基因工程学方法进行适当修饰。例如,通过修饰编码构成小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、仓鼠抗体、绵羊抗体、骆驼抗体等抗体的氨基酸序列的核酸残基,可以适当制作基因重组抗体、例如嵌合抗体、人源化抗体等,所述基因重组抗体被实施了人工修饰,以降低其对人的异种抗原性等。嵌合抗体是由来自人以外的哺乳动物、例如小鼠的抗体的H链、L链可变区和人抗体的H链、L链恒定区构成的抗体,例如将编码来自小鼠的抗体可变区的DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接起来,将其整合到表达载体中,将所得重组载体导入宿主中后进行表达,由此可以得到嵌合抗体。人源化抗体又称重构(reshaped)人抗体,是将从人以外的哺乳动物、例如小鼠等中分离的抗体的互补性决定区(CDR;complementary determining region)与人抗体的构架区进行符合读框的连接使形成密码子序列的抗体。编码该人源化抗体的DNA序列可以通过使用了多个寡核苷酸作为模板的重叠PCR反应来合成。重叠PCR反应的材料、其实施方法记载在WO98/13388等中。
编码本发明的基因重组抗体可变区的DNA可以由制作成具有互相重叠的核苷酸序列的多个寡核苷酸,通过重叠PCR反应而得到,之后将其与编码人抗体恒定区的DNA进行符合读框的连接,使形成密码子序列。按照上述方式连接的DNA随后被插入表达载体中使该DNA表达,再将该载体导入宿主中。通过培养该宿主,使由该DNA编码的抗体表达。通过适当纯化该宿主的培养液等可以得到已表达的抗体(参照EP239400;WO96/02576)。经由CDR连接的人源化抗体的FR选择互补性决定区与抗原形成良好的抗原结合位点的FR。根据需要,可以对构成所选择的抗体可变区的FR的氨基酸残基进行适当取代而对其进行修饰,使重构人抗体的互补性决定区与抗原形成适当的抗原结合位点(K.Sato等人,Cancer Res.(1993)53,851-856)。
除上述人源化所涉及的修饰以外,例如可以实施用于改善抗体与其识别的抗原的结合活性等抗体的生物学特性的修饰。本发明中的修饰可以优选通过位点特异性突变(例如参照Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488)、PCR诱变、盒式诱变等方法来进行。通常构成生物学特性得到改善的修饰抗体的氨基酸序列与构成用于修饰的抗体(即、作为修饰抗体的原抗体)的氨基酸序列具有70%以上、更优选80%以上、进一步优选90%以上(例如95%以上、97%、98%、99%等)的同源性和/或相似性。在本说明书中,序列的同源性和/或相似性是指根据需要将序列整列化和导入缺口(gap)使序列同源性取最大值,之后与构成作为修饰抗体的原抗体的氨基酸残基相同(相同的残基)或类似(根据普通氨基酸的侧链特性分为同一组的氨基酸残基)的氨基酸残基的比例。通常,天然氨基酸残基根据其侧链的性质,可以分为以下各组:(1)疏水性:丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸;(2)中性亲水性:天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、苏氨酸和丝氨酸;(3)酸性:天冬氨酸和谷氨酸;(4)碱性:精氨酸、组氨酸和赖氨酸;(5)影响链的取向的残基:甘氨酸和脯氨酸;以及(6)芳族性:酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。
作为以增强抗体功能为目的的修饰,一种具体方式例如为:提高以人源化抗体为代表的抗体所发挥的细胞毒性。作为细胞毒性,优选的例子有:例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒(antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity:ADCC)活性、补体依赖性细胞毒(complement-dependent cytotoxicity:CDC)活性等。在本发明中,CDC活性是指由补体系统产生的细胞毒性。而ADCC活性是指在靶细胞的细胞表面抗原上附着特异性抗体时,保有Fcγ受体的细胞(免疫细胞等)经由Fcγ受体与其Fc部分结合,对靶细胞带来伤害的活性。受检抗体是否具有ADCC活性、或者是否具有CDC活性,这可以按照公知的方法进行测定(例如Current protocols in Immunology,Chapter7.Immunologic studies in humans,Editor,John E,Coligan等人,John Wiley& Sons,Inc.,(1993)等)。
具体而言,首先进行效应细胞、补体溶液、靶细胞的制备。
(1)效应细胞的制备
从CBA/N小鼠等的体内取出脾脏,在RPMI1640培养基(Invitrogen)中分离脾脏细胞。用含有10%胎牛血清(FBS、HyClone)的相同培养基清洗,之后将细胞浓度调整成5×106细胞/mL,从而可以制备效应细胞。
(2)补体溶液的制备
将Baby Rabbit Complement(CEDARLANE)用含有10%FBS的培养基(Invitrogen)稀释10倍,制成补体溶液。
(3)靶细胞的制备
将表达受检抗体所结合的抗原蛋白的细胞在含有0.2mCi 51 Cr-铬酸钠(GE Healthcare Bioscience)和10%FBS的DMEM培养基中、于37℃下培养1小时,从而可以对该靶细胞进行放射性标记。作为表达受检抗体所结合的抗原蛋白的细胞,可以使用:用编码受检抗体所结合的抗原蛋白的基因转化的细胞、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫癌、肝癌、肺癌、胰脏癌、胃癌、膀胱癌和大肠癌细胞等。放射性标记后,将该细胞用含有10%FBS的RPMI1640培养基清洗3次,将细胞浓度调整成2×105细胞/mL,制成该靶细胞。
ADCC活性或CDC活性可以按照下述方法进行测定。测定ADCC活性时,向96孔圆底板(Becton Dickinson)中分别加入50μL靶细胞和50μL受检抗体,在冰上反应15分钟。之后,将添加有100μL效应细胞的反应混合液在CO 2 培养箱内培养4小时。受检抗体的终浓度可以在0~10μg/mL的范围内适当使用。培养后,回收100μL上清,使用γ计数器(COBRAII AUTO-GAMMA、MODEL D5005、PackardInstrument Company)测定该上清所具有的放射活性。细胞毒性(%)可以使用得到的放射活性值,根据算式(A-C)/(B-C)×100来计算。A表示使用各受检抗体试样时的放射活性(cpm),B表示使用添加有1%NP-40(nacalai tesque)的试样时的放射活性(cpm),C表示使用只含有靶细胞的试样时的放射活性(cpm)。
另一方面,测定CDC活性时,向96孔平底板(Becton Dickinson)中分别加入50μL靶细胞和50μL受检抗体,在冰上反应15分钟。之后,将添加有100μL补体溶液的反应混合液在CO 2 培养箱内培养4小时。受检抗体的终浓度可以在0~3μg/mL的范围内适当使用。培养后,回收100μL上清,用γ计数器测定该上清所具有的放射活性。进行与ADCC活性的测定相同的操作,可以算出细胞毒性。
而在测定由抗体缀合物产生的细胞毒性时,向96孔平底板(BectonDickinson)中分别加入50μL靶细胞和50μL受检抗体缀合物,在冰上反应15分钟。将该板在CO 2 培养箱内培养1~4小时。抗体的终浓度可以在0~3μg/mL的范围内适当使用。培养后,回收100μL上清,用γ计数器测定该上清所具有的放射活性。进行与ADCC活性的测定相同的操作,可以算出细胞毒性。
如上所述,抗体H链和L链的可变区通常由3个CDR和4个FR构成。在本发明的优选方式中,作为供于“修饰”的氨基酸残基,例如可以从构成CDR或FR的氨基酸残基中适当选择。
本领域技术人员可以利用Kabat等的公共数据库等,优选获得构成抗体可变区的FR的氨基酸序列、即人或小鼠等生物中实际存在的序列。
在本发明的优选方式中,提供通过本发明的方法使血浆中药物动力学得到控制的人源化抗体。该人源化抗体例如是包含来源于人以外的动物的互补性决定区(CDR)、来源于人的构架区(FR)和人C区的人源化抗体,其中,在CDR或FR中能够暴露于抗体表面的至少1个氨基酸残基是与原始抗体的CDR或FR所对应的位置的氨基酸残基具有不同电荷的氨基酸残基,与具有相同C区的嵌合抗体相比,该人源化抗体的血浆中药物动力学得到控制。
并且,在本发明的优选方式中,提供通过本发明的方法使血浆中药物动力学得到控制的人抗体。该人抗体例如是包含来源于人的互补性决定区(CDR)、来源于人的构架区(FR)和人C区的人抗体,其中,在CDR或FR中能够暴露于抗体表面的至少1个氨基酸残基是与原始抗体的CDR或FR所对应的位置的氨基酸残基具有不同电荷的氨基酸残基,与具有相同C区的嵌合抗体相比,该人抗体的血浆中药物动力学得到控制。
上述人恒定区是指优选为包含野生型人Fc区的区,还可以优选使用已修饰的Fc。作为上述的“已修饰的Fc”,可以包含构成该Fc的氨基酸残基已被修饰的Fc,还可以包含对该Fc部分进行的修饰已被改变的Fc。作为改变上述修饰的具体例子,优选列举:改变该Fc部分中所添加的糖链修饰的样式。在本说明书中,优选的具体例子有:作为参考实施例而具体公开的“与抗体的Fc区结合的岩藻糖含量降低的抗体”。
“与抗体Fc区结合的岩藻糖含量降低的抗体”是指与作为对照的抗体相比时结合的岩藻糖量明显少、优选检测不到岩藻糖的抗体。通常,岩藻糖附加在存在于构成1分子抗体的2分子H链Fc区的2处糖基化位点所结合的N-糖苷键糖链上。在本发明中,“与抗体Fc区结合的岩藻糖含量降低的抗体”是指以这种普通抗体作为对照进行比较时,具有对照抗体所具有的总糖链含量的50%以下、优选25%以下、进一步优选10%以下、特别优选0%以下的岩藻糖含量的抗体。岩藻糖含量可以采用下述作为参考实施例而具体例示的分析方法来测定。有关该岩藻糖含量降低的抗体的制作方法,除了以本发明的参考实施例的形式进行描述以外,还可以优选例示:例如利用缺失岩藻糖基转移酶的动物细胞进行制作的方法(Biotechnol Bioeng.(2004),87(5),614-22)、利用复合分枝糖链修饰已改变的动物细胞进行制作的方法(Biotechnol Bioeng.(2006)93(5),851-61)等。以动物细胞以外的细胞作为宿主细胞进行制作的方法还可以优选列举:利用植物细胞进行制作的方法(Nature Biotechnology(2006)24,1591-7)或利用酵母细胞进行制作的方法(Nature Biotechnology(2006)24,210-5)等。
本发明的制造方法的优选方式为:等电点被改变的包含抗体可变区的多肽的制造方法,该方法包括:
(a)修饰编码包含氨基酸残基的多肽的核酸,以变换能够暴露于该多肽的CDR区表面的至少1个该氨基酸残基的电荷;
(b)培养宿主细胞,使该核酸表达;
(c)从宿主细胞培养物中回收包含抗体可变区的多肽。
本发明的制造方法的优选方式为:血浆中药物动力学得到控制的包含抗体可变区的多肽的制造方法,该方法包括:
(a)修饰编码包含氨基酸残基的多肽的核酸,以变换能够暴露于该多肽的CDR区表面的至少1个该氨基酸残基的电荷;
(b)培养宿主细胞,使该核酸表达;
(c)从宿主细胞培养物中回收包含抗体可变区的多肽。
并且,按照该方法制造的血浆中药物动力学得到控制的、包含抗体可变区的多肽也包括在本发明中。
本发明还提供多特异性多肽的制造方法,所述多特异性多肽包含具有抗体可变区的第1多肽和第2多肽。本发明进一步提供按照该方法制造的多特异性多肽。作为本发明的制造方法的优选方式,该方法包括修饰编码第1多肽的氨基酸残基的核酸和/或编码第2多肽的氨基酸残基的核酸,使第1多肽与第2多肽的等电点之差增大。即,通过改变第1多肽和第2多肽的氨基酸残基的电荷,使多肽等电点(pI)的差异增大,利用该等电点的差异可以制造多特异性抗体。详细而言,该制造方法包括下述步骤(a)~(c)。
(a)包括修饰编码含有氨基酸残基的多肽的核酸,以改变能够暴露于第1多肽和第2多肽的CDR区表面的至少1个该氨基酸残基的电荷,该核酸的修饰是指修饰编码第1多肽的氨基酸残基的核酸和/或编码第2多肽的氨基酸残基的核酸,使与修饰前相比,第1多肽与第2多肽的等电点之差增大;
(b)培养宿主细胞,使该核酸表达;
(c)从宿主细胞培养物中回收多特异性抗体。
本发明中的多肽通常是指具有约10个氨基酸以上长度的肽和蛋白。通常为来源于生物的多肽,但没有特别限定,例如可以是包含人工序列的多肽。还可以是天然多肽或合成多肽、重组多肽等任一种多肽。并且,上述多肽的片段也包括在本发明的多肽中。
本发明中,“包含具有抗体可变区的第1多肽和第2多肽的多特异性多肽”是指包含与至少2种以上不同抗原或同一抗原内的不同表位结合的抗体可变区的多肽,如上所述,包含抗体可变区的多肽例如包括:抗体、小分子抗体、支架蛋白等。
本发明中,“多肽的等电点之差增大”是指在2种以上的多肽中,通过进行表面氨基酸电荷的改变,使彼此的等电点不相等、或者使2种以上的多肽间的等电点之差变得更大。等电点之差例如可以通过采用等电点电泳等方法来观察。在本发明中,优选在保持该多肽的结构和功能(活性)的同时控制等电点。
即,本发明提供多特异性抗体的制造方法,所述多特异性多肽包含具有抗体可变区的第1多肽和第2多肽,该制造方法包括:
(a)修饰编码第1多肽的氨基酸残基的核酸和/或编码第2多肽的氨基酸残基的核酸,以改变能够暴露于CDR区表面的至少1个氨基酸残基的电荷,使第1多肽与第2多肽的等电点之差为1.0以上、优选为1.2以上、进一步优选为1.5以上;
(b)培养宿主细胞,使该核酸表达;
(c)从宿主细胞培养物中回收多特异性抗体。
本发明还提供多特异性多肽的修饰方法,该修饰方法用于纯化包含具有抗体可变区的第1多肽和第2多肽的多特异性多肽。作为本发明的纯化方法的优选方式,包括修饰编码第1多肽的氨基酸残基的核酸和/或编码第2多肽的氨基酸残基的核酸,使第1多肽与第2多肽的等电点之差增大。即,通过改变第1多肽与第2多肽的氨基酸残基的电荷,向多肽中导入等电点(pI)的差异,利用该等电点的差异可以纯化多特异性抗体。详细而言,该纯化方法包括下述步骤(a)~(c)。
(a)包括修饰编码含有氨基酸残基的多肽的核酸,以改变能够暴露于第1多肽和第2多肽的CDR区表面的至少1个该氨基酸残基的电荷,该核酸的修饰是指修饰编码第1多肽的氨基酸残基的核酸和/或编码第2多肽的氨基酸残基的核酸,使与修饰前相比,第1多肽与第2多肽的等电点之差增大;
(b)培养宿主细胞,使该核酸表达;
(c)利用标准层析法从宿主细胞培养物中纯化该多特异性抗体。
需要说明的是,包括利用上述纯化方法进行纯化的步骤的多特异性抗体的制造方法也包括在本发明中。
在本发明的上述方法中,“修饰核酸”是指修饰核酸序列,使形成对应于通过本发明中的“修饰”而导入的氨基酸残基的密码子。更具体而言,“修饰核酸”是指修饰构成供于修饰的密码子的核酸,使相当于修饰前的氨基酸残基的密码子成为通过修饰而导入的氨基酸残基的密码子。通常是指进行取代构成密码子的核酸的至少1个碱基等基因操作或突变处理,使成为编码目的氨基酸残基的密码子。即,编码供于修饰的氨基酸残基的密码子被编码通过修饰而导入的氨基酸残基的密码子取代。关于这样的核酸修饰,本领域技术人员可以采用公知技术、例如位点特异性诱变法、PCR突变导入法等适当进行。
通常将本发明的核酸克隆(插入)在适当的载体上,并导入宿主细胞中。对该载体没有特别限定,只要稳定保持插入的核酸即可,例如使用大肠杆菌作为宿主时,作为克隆用载体,优选pBluescript载体(Stratagene)等,但也可以使用各种市售载体。为了生产本发明的多肽而使用载体时,表达载体特别实用。对表达载体没有特别限定,只要是在试管内、大肠杆菌内、培养细胞内、生物个体内表达多肽的载体即可,例如,在试管内表达多肽时,优选pBEST载体(Promega);在大肠杆菌内表达多肽时,优选pET载体(Invitrogen);在培养细胞内表达多肽时,优选pME18S-FL3载体(GenBank Accession No.AB009864);在生物个体内表达多肽时,优选pME18S载体(Mol CellBiol.(1988)8,466-472)等。向载体中插入本发明的DNA,可以优选利用常规方法、例如使用限制酶位点的连接酶反应来进行(Currentprotocols in Molecular Biology edit.Ausubel等人.(1987)出版.JohnWiley & Sons.Section 11.4-11.11)。
对上述宿主细胞没有特别限定,根据目的可以使用各种宿主细胞。作为用于表达多肽的细胞,例如有:细菌细胞(例如:链球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、大肠杆菌(E.coli)、链霉菌(Streptomyces)、枯草杆菌(Bacillus subtilis))、真菌细胞(例如:酵母(Yeast)、曲霉(Aspergillus));昆虫细胞(例如:果蝇S2(Drosophila S2)、草地贪夜蛾SF9(Spodoptera SF9))、动物细胞(例如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes黑色素瘤细胞)和植物细胞。向宿主细胞中导入载体,例如可以通过磷酸钙沉淀法、电脉冲穿孔法(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel等人.(1987)Publish.John Wiley & Sons.Section 9.1-9.9)、脂质转染法、显微注射法等公知方法来进行。
可以优选将适当的分泌信号整合到目标抗体中,以使宿主细胞中表达的多肽(抗体)分泌到内质网的内腔、周质间隙或胞外环境中。上述信号可以优选使用目标多肽(抗体)所特有的内源性信号或异源信号。
上述制造方法中多肽的(抗体)回收,若本发明的多肽(抗体)分泌到培养基中,则回收培养基。若本发明的抗体在细胞内产生,则首先溶解该细胞,之后再回收抗体。
为了纯化自重组细胞培养物中回收的本发明的抗体,可以优选使用以下公知方法:硫酸铵或乙醇沉淀法、酸提取法、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水性相互作用层析、亲合层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。
本发明中,修饰核酸的多肽优选为第1多肽的同源多聚体、第2多肽的同源多聚体、以及第1多肽与第2多肽的异源多聚体。作为第1多肽的同源多聚体、第2多肽的同源多聚体、以及第1多肽与第2多肽的异源多聚体,可以列举实施例中记载的多聚体,但并不限于这些。
作为本发明中的标准层析法,包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水层析、羟基磷灰石层析、疏水电荷相互作用层析、层析聚焦等,但并不限于这些。
在本发明的上述方法中,第1多肽和第2多肽优选包含重链可变区(VH)。该可变区中可以包含例如互补性决定区(CDR)、构架区(FR)。
并且,在本发明的上述方法中,多特异性多肽的可变区优选包含轻链可变区。
并且,在本发明的上述方法中,第1多肽和第2多肽优选包含重链恒定区。作为重链恒定区,更优选在第1多肽和第2多肽中产生pI差的重链恒定区。这样的重链恒定区有:存在pI差的抗体的重链恒定区。既可以使用原来存在pI差的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的重链恒定区向第1多肽和第2多肽中导入pI差,也可以通过只修饰第1多肽和第2多肽的重链恒定区中导致这些亚纲间的等电点不同的氨基酸、或者同时修饰不影响它们的等电点的相邻氨基酸,来制作非野生型人恒定区,并向2个恒定区中导入pI差。作为用于向恒定区中导入pI差的修饰位点,例如有H链恒定区中EU编号第137位、第196位、第203位、第214位、第217位、第233位、第268位、第274位、第276位、第297位、第355位、第392位、第419位、第435位。
另外,通过除去重链恒定区的糖链会产生pI差,所以用于导入pI链的修饰位点还有:糖基化位点的第297位。
本发明中,对于上述第1多肽和第2多肽包含重链恒定区的方法也包括:将上述第1多肽和第2多肽包含重链可变区的方法和/或上述多特异性抗体包含含有轻链可变区的第3多肽、且上述第1多肽和上述第2多肽分别与该第3多肽形成多聚体的方法组合的方法。
并且,通过上述方法制造的多特异性多肽也包括在本发明中。
并且,当由本发明提供的多特异性抗体中第1多肽包含重链可变区时,为了实现上述“等电点之差增大”,例如可以列举下述方式:使选自该重链可变区中Kabat编号第31位、第61位、第62位、第64位和第65位的氨基酸残基的至少1个氨基酸残基带有电荷。当上述第1多肽包含轻链可变区时,为了实现上述“等电点之差增大”,例如可以列举下述方式:使选自该轻链可变区中Kabat编号第24位、第27位、第53位、第54位和第55位的氨基酸残基的至少1个氨基酸残基带有电荷。上述编号所示的第1多肽的氨基酸残基中,该带有电荷的氨基酸残基以外的氨基酸残基只要使第1多肽与第2多肽的等电点存在差异即可,可以是与该带有电荷的氨基酸残基为相同的电荷,也可以不带电荷,还可以是相反的电荷。
本发明的上述多特异性抗体的特征在于:优选第2多肽与第1多肽的带有电荷的氨基酸残基带有相反的电荷、或者不带电荷。详细而言,上述多特异性抗体为:第2多肽包含重链可变区、且选自该重链可变区中Kabat编号第31位、第61位、第62位、第64位和第65位的氨基酸残基的至少1个氨基酸残基与在上述第1多肽所含的可变区中选择的、带有电荷的氨基酸残基带有相反的电荷、或者不带电荷的多特异性抗体。当包含轻链可变区时,上述多特异性抗体为:选自该轻链可变区中Kabat编号第24位、第27位、第53位、第54位和第55位的氨基酸残基的至少1个氨基酸残基与在上述第1多肽所含的可变区中选择的、带有电荷的氨基酸残基带有相反的电荷、或者不带电荷的多特异性抗体。上述编号所示的第2多肽的氨基酸残基中,该带有电荷的氨基酸残基以外的氨基酸残基只要使第1多肽与第2多肽的等电点存在差异即可,可以是与该带有电荷的氨基酸残基为相同的电荷,也可以不带电荷,还可以是相反的电荷。
并且,当多特异性抗体包含抗体恒定区时,为了降低其等电点,例如优选:第137位适用IgG2或IgG4的序列、第196位适用IgG1或IgG2或IgG4的序列、第203位适用IgG2或IgG4的序列、第214位适用IgG2的序列、第217位适用IgG1或IgG3或IgG4的序列、第233位适用IgG1或IgG3或IgG4的序列、第268位适用IgG4的序列、第274位适用IgG2或IgG3或IgG4的序列、第276位适用IgG1或IgG2或IgG4的序列、第355位适用IgG4的序列、第392位适用IgG3的序列、第419位适用IgG4的序列、第435位适用IgG1或IgG2或IgG4的序列。为了提高等电点,例如优选:第137位适用IgG1或IgG3的序列、第196位适用IgG3的序列、第203位适用IgG1或IgG3的序列、第214位适用IgG1或IgG3或IgG4的序列、第217位适用IgG2的序列、第233位适用IgG2的序列、第268位适用IgG1或IgG2或 IgG3的序列、第274位适用IgG1的序列、第276位适用IgG3的序列、第355位适用IgG1或IgG2或IgG3的序列、第392位适用IgG1或IgG2或IgG4的序列、第419位适用IgG1或IgG2或IgG3的序列、第435位适用IgG3的序列。
这些序列的适用只要赋予两个H链足够的等电点之差即可,未必使用全部序列。
上述抗体中,“带有同种电荷”是指例如重链可变区中上述Kabat编号的氨基酸残基、或重链恒定区中上述EU编号的氨基酸残基均具有下述(a)或(b)中任一组所含的氨基酸残基。
(a)谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)
(b)赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)
“带有相反电荷”是指,例如在具有重链可变区和/或重链恒定区的第2多肽中,上述Kabat编号或上述EU编号的氨基酸残基中的至少1个氨基酸残基为第1多肽所含的重链可变区和/或重链恒定区中对应位置的氨基酸残基,当具有上述(a)或(b)中任一组所含的氨基酸残基时,剩余的氨基酸残基为具有不同组所含的氨基酸残基。
即,本发明提供多特异性抗体,其中上述带有同种电荷的氨基酸残基选自上述(a)或(b)中任一组所含的氨基酸残基。
需要说明的是,当原始(修饰前的)氨基酸残基已经带有电荷时,将其修饰成不带电荷的氨基酸残基,这也是本发明的优选方式之一。
在本发明中,优选对氨基酸残基进行修饰,使第1多肽与第2多肽的等电点(pI)之差增大。当存在多个通过修饰而导入的氨基酸残基时,这些氨基酸残基中可以包括少数不带电荷的氨基酸残基。
本发明还涉及组合物(药剂),该组合物包含通过本发明的方法使血浆中药物动力学得到控制的多肽(例如IgG抗体等抗体)和医药上可接受的载体。
在本发明中,医药组合物通常是指用于疾患的治疗或预防或者检查、诊断的药剂。
本发明的医药组合物可以优选按照本领域技术人员所公知的方法制成制剂。例如,可以和水或除水以外的药学上可接受的液体制成无菌溶液或悬浮液等注射剂的形式,进行胃肠外给药。例如,优选将其与药理学上可接受的载体或介质、具体有灭菌水或生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、媒介物、防腐剂、粘合剂等适当组合,按照通常认可的制药规则(製薬実施)所要求的单位用量形式进行混合,制成制剂。这些制剂中的有效成分量设定成得到所指示的范围的适当用量。
注射用无菌组合物可以优选使用注射用蒸馏水这样的媒介物,按照通常的制剂规则制成处方。
作为注射用水溶液,例如有生理盐水、含有葡萄糖或其他辅剂(例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠)的等渗溶液。上述注射用水溶液可以和适当的助溶剂、例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非离子性表面活性剂(聚山梨酯80(TM)、HCO-50等)适当结合使用。
油性液体包括芝麻油、大豆油。上述油性液体可以和作为助溶剂的苯甲酸苄酯和/或苯甲醇适当结合使用。还可以和缓冲剂(例如磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液)、镇痛剂(例如盐酸普鲁卡因)、稳定剂(例如苯甲醇和苯酚)、抗氧剂适当混合。按照上述方式制备的注射液通常填充在适当的安瓿中。
本发明的医药组合物可以优选通过胃肠外进行给药。例如,可以以注射剂型、经鼻给药剂型、经肺给药剂型、经皮给药剂型的组合物的形式适当制备。例如,可以通过静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等进行全身或局部适当给药。
给药方法可以根据患者的年龄、症状而适当选择。含有抗体或编码抗体的多核苷酸的医药组合物的给药量例如可以适当设定成每次0.0001mg~1000mg/kg体重的范围。或者,例如可以设定或制备成每名患者0.001~100000mg的给药量,但本发明并不限于上述数值。给药量和给药方法可以根据患者的体重、年龄、症状等而变动,但本领域技术人员可以考虑这些条件,设定适当的给药量和给药方法。
本发明还提供核酸,该核酸编码按照本发明的方法使血浆中药物动力学得到控制的抗体(例如人源化磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体等)。并且,担载该核酸的载体也包括在本发明中。
本发明还提供包含上述核酸的宿主细胞。对该宿主细胞的种类没有特别限定,例如有大肠杆菌等细菌细胞和各种动物细胞等。该宿主细胞可以优选用作用于制造和表达本发明的抗体的产生系统。即,本发明提供用于制造使用该宿主细胞的抗体的产生系统。作为该产生系统,可以优选使用体外和体内产生系统。作为在体外产生系统中使用的宿主细胞,优选使用真核细胞和原核细胞。
用作宿主细胞的真核细胞例如有:动物细胞、植物细胞、真菌细胞。动物细胞优选例举:哺乳动物细胞、例如CHO(J.Exp.Med.(1995)108,945)、COS、HEK293、3T3、骨髓瘤细胞、BHK(幼仓鼠肾)、HeLa、Vero等;两栖动物细胞、例如非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus laevis oocytes)(Valle等人,Nature(1981)291:338-340);以及昆虫细胞、例如Sf9、Sf21、Tn5。在本发明的抗体表达中优选使用CHO-DG44、CHO-DX11B、COS7细胞、HEK293细胞、BHK细胞。为了利用动物细胞进行大量表达时,特别优选CHO细胞作为宿主细胞。关于向宿主细胞内导入重组载体等,例如优选通过以下方法来进行:磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法、使用正离子脂质体DOTAP(Boehringer Mannheim)的方法、电穿孔法、脂质转染法等方法。
作为植物细胞,例如有来源于烟草的细胞和浮萍(Lemna minor),其作为蛋白质生产系统而已知,利用对该细胞进行愈伤组织培养的方法可以产生本发明的抗体。使用真菌细胞的蛋白质表达系统是公知的,这些真菌细胞可以用作产生本发明抗体的宿主细胞,上述真菌细胞例如有:酵母,例如酵母菌(Saccharomyces)属的细胞(啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharmyces pombe) 等);以及丝状菌,例如曲霉(Aspergiillus)属的细胞(黑曲霉(Aspergillusniger)等)。
使用原核细胞时,优选使用利用细菌细胞的产生系统。作为细菌细胞,除上述大肠杆菌(E.coli)外,还已知使用枯草杆菌(B.subtilis)的产生系统,这些细菌细胞均可优选用于产生本发明的抗体。
为了使用本发明的宿主细胞来产生抗体,培养经表达载体转化的宿主细胞,上述表达载体含有编码本发明抗体的多核苷酸。在该培养中使编码抗体的多核苷酸表达。培养优选按照公知方法进行。例如,以动物细胞作为宿主时,例如可以优选使用DMEM、MEM、RPMI 1640、IMDM作为培养液。此时,优选结合使用FBS、胎牛血清(FCS)等血清补充液。也可以通过无血清培养来培养细胞。虽然培养条件取决于宿主细胞,但培养时可以优选在pH约6~8的条件下培养。通常是在约30~40℃下培养约15~200小时,根据需要可以交换培养基或进行通气、搅拌。
另一方面,作为在体内产生本发明抗体的系统,例如可以优选使用:使用动物的产生系统或使用植物的产生系统。即,向这些动物或植物中导入编码本发明抗体的多核苷酸,使在动物或植物体内产生磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体并回收。本发明的“宿主”包括上述动物、植物。
使用动物作为宿主时,可以利用使用哺乳类动物、昆虫的产生系统。作为哺乳类动物,优选使用山羊、猪、绵羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser,SPECTRUM Biotechnology Applications(1993))。使用哺乳类动物时,可以使用转基因动物。
例如,可以将编码本发明抗体的多核苷酸与编码乳汁中特异性产生的多肽的基因(例如,山羊β-酪素)制成融合基因。然后,将包含该融合基因的多核苷酸片段注入到山羊胚胎中,将该胚胎移植到雌山羊体内。接受了胚胎的山羊生出转基因山羊,从该转基因山羊或其后代产生的乳汁中可以得到目标抗体。为了使由该转基因山羊产生的含有抗体的乳汁量增加,可以优选给予该转基因山羊适当的激素(Ebert等人,Bio/Technology(1994)12,699-702)。
产生本发明抗体的昆虫例如可以使用蚕。使用蚕时,在蚕的感染中使用病毒基因组上插入有编码目标抗体的多核苷酸的杆状病毒,从该被感染的蚕的体液中得到目标磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体(Susumu等人,Nature(1985)315,592-4)。
并且,在本发明抗体的产生中使用植物时,植物例如可以使用烟草。使用烟草时,将编码目标抗体的多核苷酸插入植物表达用载体、例如pMON 530中,再将得到的重组载体导入象根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)这样的细菌中。用该细菌感染烟草、例如烟草(Nicotiana tabacum)(Ma等人,Eur.J.Immunol.(1994)24,131-8),从被感染的烟草的叶中得到所期望的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。用同样的细菌感染浮萍,从形成克隆的感染浮萍的细胞中得到所期望的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体(Cox KM等人.Nat.Biotechnol.(2006)24(12),1591-7)。
如此操作而得到的本发明抗体,可以将其从宿主细胞内或细胞外(培养基、乳汁等)分离,并纯化成实质上纯粹且均匀的抗体。抗体的分离、纯化可以优选使用通常多肽的纯化中所使用的分离、纯化方法,但并不限于这些方法。例如,可以适当选择或组合层析柱、过滤器、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳法、透析、重结晶等来分离和纯化抗体。
层析例如有:亲合层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析、反相层析、吸附层析等(Strategies for Protein Purification andCharacterization(蛋白质纯化与鉴定实验指南):A Laboratory CourseManual.Ed Daniel R.Marshark等人(1996)Cold Spring HarborLaboratory Press)。上述层析可以使用液相层析、例如HPLC、FPLC等液相层析来进行。用于亲合层析的柱例如有:蛋白A柱、蛋白G柱。使用蛋白A的柱例如有:Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(Pharmacia制)等。
如上所述,血浆中药物动力学得到控制的本发明抗体的制造方法也是本发明的优选方式之一,该制造方法包括:培养本发明的宿主细胞,从该细胞培养物中回收磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的步骤。
本发明提供包含优于TOCILIZUMAB的第2代分子的药物组合物、以及上述药物组合物的制造方法,所述优于TOCILIZUMAB的第2代分子是指通过修饰人源化抗IL-6受体IgG1抗体、即TOCILIZUMAB的可变区和恒定区的氨基酸序列,使药效增强、同时提高了血浆中滞留性,从而减少给药频率、持续发挥治疗效果,并且使免疫原性、安全性、理化性质得到改善。本发明还提供适合用作药物的抗体恒定区。
本发明涉及具有优异的抗原结合活性、中和活性、血浆中滞留性、稳定性和/或均匀性、且免疫原性风险有所降低的抗IL-6受体抗体。
优选抗IL-6受体抗体为人源化PM-1抗体(TOCILIZUMAB)。更具体而言,本发明通过氨基酸取代,提供抗原结合活性增强的人源化PM-1抗体、中和活性增强的人源化PM-1抗体、血浆中滞留性提高的人源化PM-1抗体、免疫原性风险降低的人源化PM-1抗体、稳定性提高的人源化PM-1抗体、以及均匀性提高的人源化PM-1抗体。
人源化PM-1抗体与人IL-6受体结合,抑制人IL-6与人IL-6受体的结合。在本说明书中,人源化PM-1抗体的氨基酸序列与序列表的SEQ ID NO的对应关系如下:
重链氨基酸序列 SEQ ID NO:15
轻链氨基酸序列 SEQ ID NO:16
重链可变区的氨基酸序列 SEQ ID NO:17
轻链可变区的氨基酸序列 SEQ ID NO:18
重链CDR1(HCDR1)的氨基酸序列 SEQ ID NO:1
重链CDR2(HCDR2)的氨基酸序列 SEQ ID NO:2
重链CDR3(HCDR3)的氨基酸序列 SEQ ID NO:3
重链FR1(HFR1)的氨基酸序列 SEQ ID NO:7
重链FR2(HFR2)的氨基酸序列 SEQ ID NO:8
重链FR3(HFR3)的氨基酸序列 SEQ ID NO:9
重链FR4(HFR4)的氨基酸序列 SEQ ID NO:10
轻链CDR1(LCDR1)的氨基酸序列 SEQ ID NO:4
轻链CDR2(LCDR2)的氨基酸序列 SEQ ID NO:5
轻链CDR3(LCDR3)的氨基酸序列 SEQ ID NO:6
轻链FR1(LFR1)的氨基酸序列 SEQ ID NO:11
轻链FR2(LFR2)的氨基酸序列 SEQ ID NO:12
轻链FR3(LFR3)的氨基酸序列 SEQ ID NO:13
轻链FR4(LFR4)的氨基酸序列 SEQ ID NO:14
<亲和性、中和活性增强的抗体>
本发明提供对人IL-6受体的结合活性和/或中和活性高的抗人IL-6受体抗体。更具体而言,本发明提供下述(a)~(y)所述的抗体、以及该抗体的制造方法。
(a)抗人IL-6受体抗体,该抗体具有重链CDR1,所述重链CDR1在SEQ ID NO:1记载的氨基酸序列(HCDR1)中第1位的Ser被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Trp(RD_68)、Thr(RD_37)、Asp(RD_8)、Asn(RD_11)、Arg(RD_31)、Val(RD_32)、Phe(RD_33)、Ala(RD_34)、Gln(RD_35)、Tyr(RD_36)、Leu(RD_38)、His(RD_42)、Glu(RD_45)或Cys(RD_46)。
在SEQ ID NO:1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Trp的序列见SEQ ID NO:26。
在SEQ ID NO:1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Thr的序列见SEQ ID NO:27。
在SEQ ID NO:1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Asp的序列见SEQ ID NO:28。
在SEQ ID NO:1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Asn的序列见SEQ ID NO:29。
在SEQ ID NO:1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Arg的序列见SEQ ID NO:30。
在SEQ ID NO:1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Val的序列见SEQ ID NO:31。
在SEQ ID NO:1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Phe的序列见SEQ ID NO:32。
在SEQ ID NO:1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Ala的序列见SEQ ID NO:33。
在SEQ ID NO:1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Gln的序列见SEQ ID NO:34。
在SEQ ID NO:1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Tyr的序列见SEQ ID NO:35。
在SEQ ID NO:1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Leu的序列见SEQ ID NO:36。
在SEQ ID NO:1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成His的序列见SEQ ID NO:37。
在SEQ ID NO:1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Glu的序列见SEQ ID NO:38。
在SEQ ID NO:1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Cys的序列见SEQ ID NO:39。
(b)抗人IL-6受体抗体,该抗体具有重链CDR1,所述重链CDR1在SEQ ID NO:1记载的氨基酸序列(HCDR1)中第5位的Trp被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Ile(RD_9)或Val(RD_30)。
在SEQ ID NO:1记载的氨基酸序列中第5位的Trp被取代成Ile 的序列见SEQ ID NO:40。
在SEQ ID NO:1记载的氨基酸序列中第5位的Trp被取代成Val的序列见SEQ ID NO:41。
(c)抗人IL-6受体抗体,该抗体具有重链CDR2,所述重链CDR2在SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列(HCDR2)中第1位的Tyr被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Phe(RD_82)。
在SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列中第1位的Tyr被取代成Phe的序列见SEQ ID NO:42。
(d)抗人IL-6受体抗体,该抗体具有重链CDR2,所述重链CDR2在SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列(HCDR2)中第8位的Thr被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Arg(RD_79)。
在SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列中第8位的Thr被取代成Arg的序列见SEQ ID NO:43。
(e)抗人IL-6受体抗体,该抗体具有重链CDR2,所述重链CDR2在SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列(HCDR2)中第9位的Thr被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Ser(RD_12)或Asn(RD_61)。
在SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列中第9位的Thr被取代成Ser的序列见SEQ ID NO:44。
在SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列中第9位的Thr被取代成Asn的序列见SEQ ID NO:45。
(f)抗人IL-6受体抗体,该抗体具有重链CDR3,所述重链CDR3在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第1位的Ser被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Ile(RD_2)、Val (RD_4)、Thr(RD_80)或Leu(RD_5)。
在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Ile的序列见SEQ ID NO:46。
在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Val的序列见SEQ ID NO:47。
在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Thr的序列见SEQ ID NO:48。
在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Leu的序列见SEQ ID NO:49。
(g)抗人IL-6受体抗体,该抗体具有重链CDR3,所述重链CDR3在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第2位的Leu被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Thr(RD_84)。
在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列中第2位的Leu被取代成Thr的序列见SEQ ID NO:50。
(h)抗人IL-6受体抗体,该抗体具有重链CDR3,所述重链CDR3在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第5位的Thr被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Ala(RD_3)或Ile(RD_83)。其他优选的取代有:第5位的Thr被取代成Ser(RDC_14H)。
在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列中第5位的Thr被取代成Ala的序列见SEQ ID NO:51。
在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列中第5位的Thr被取代成Ile的序列见SEQ ID NO:52。
在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列中第5位的Thr被取代成Ser的序列见SEQ ID NO:53。
(i)抗人IL-6受体抗体,该抗体具有重链CDR3,所述重链CDR3在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第7位的Ala被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定,但优选取代成Ser(RD_81)或Val(PF_3H)。
在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列中第7位的Ala被取代成Ser的序列见SEQ ID NO:54。
在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列中第7位的Ala被取代成Val的序列见SEQ ID NO:55。
(j)抗人IL-6受体抗体,该抗体具有重链CDR3,所述重链CDR3在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第8位的Met被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定,但优选取代成Leu(PF_4H)。
在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列中第8位的Met被取代成Leu的序列见SEQ ID NO:56。
(k)抗人IL-6受体抗体,该抗体具有重链CDR3,所述重链CDR3在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第1位的Ser和第5位的Thr被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选将第1位的Ser取代成Leu、将第5位的Thr取代成Ala(RD_6)。其他优选的取代有:第1位的Ser取代成Val、第5位的Thr取代成Ala(RDC_2H);第1位的Ser取代成Ile、第5位的Thr取代成Ala(RDC_3H);第1位的Ser取代成Thr、第5位的Thr取代成Ala(RDC_4H);第1位的Ser取代成Val、第5位的Thr取代成Ile(RDC_5H);第1位的Ser取代成Ile、第5位的Thr取代成Ile(RDC_6H);第1位的Ser取代成Thr、第5位的Thr取代成Ile(RDC_7H);以及第1位的Ser取代成Leu、第5位的Thr取代成Ile(RDC_8H)。
在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列中第1位的Ser取代成Leu、第5位的Thr取代成Ala的序列见SEQ ID NO:57。
在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列中第1位的Ser取代成Val、第5位的Thr取代成Ala的序列见SEQ ID NO:58。
在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列中第1位的Ser取代成Ile、第5位的Thr取代成Ala的序列见SEQ ID NO:59。
在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列中第1位的Ser取代成Thr、第5位的Thr取代成Ala的序列见SEQ ID NO:60。
在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列中第1位的Ser取代成Val、第5位的Thr取代成Ile的序列见SEQ ID NO:61。
在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列中第1位的Ser取代成Ile、第5位的Thr取代成Ile的序列见SEQ ID NO:62。
在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列中第1位的Ser取代成Thr、第5位的Thr取代成Ile的序列见SEQ ID NO:63。
在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列中第1位的Ser取代成Leu、第5位的Thr取代成Ile的序列见SEQ ID NO:64。
(l)抗人IL-6受体抗体,该抗体具有重链CDR3,所述重链CDR3在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第2位的Leu、第7位的Ala和第8位的Met被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选第2位的Leu取代成Thr、第7位的Ala取代成Val、第8位的Met取代成Leu(RD_78)。
在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列中第2位的Leu取代成Thr、第7位的Ala取代成Val、第8位的Met取代成Leu的序列见SEQ IDNO:65。
(m)抗人IL-6受体抗体,该抗体具有轻链CDR1,所述轻链CDR1在SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列(LCDR1)中第1位的Arg被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定,但优选取代成Phe(RD_18)。
在SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列中第1位的Arg被取代成Phe 的序列见SEQ ID NO:66。
(n)抗人IL-6受体抗体,该抗体具有轻链CDR1,所述轻链CDR1在SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列(LCDR1)中第4位的Gln被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定,但优选取代成Arg(RD_26)或Thr(RD_20)。
在SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列中第4位的Gln被取代成Arg的序列见SEQ ID NO:67。
在SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列中第4位的Gln被取代成Thr的序列见SEQ ID NO:68。
(o)抗人IL-6受体抗体,该抗体具有轻链CDR1,所述轻链CDR1在SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列(LCDR1)中第9位的Tyr被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Phe(RD_73)。
在SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列中第9位的Tyr被取代成Phe的序列见SEQ ID NO:69。
(p)抗人IL-6受体抗体,该抗体具有轻链CDR1,所述轻链CDR1在SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列(LCDR1)中第11位的Asn被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定,但优选取代成Ser(RD_27)。
在SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列中第11位的Asn被取代成Ser的序列见SEQ ID NO:70。
(q)抗人IL-6受体抗体,该抗体具有轻链CDR2,所述轻链CDR2在SEQ ID NO:5记载的氨基酸序列(LCDR2)中第2位的Thr被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定,但优选取代成Gly。
在SEQ ID NO:5记载的氨基酸序列中第2位的Thr被取代成Gly 的序列见SEQ ID NO:71。
(r)抗人IL-6受体抗体,该抗体具有轻链CDR3,所述轻链CDR3在SEQ ID NO:6记载的氨基酸序列(LCDR3)中第1位的Gln被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定,但优选取代成Gly(RD_28)、Asn(RD_29)或Ser(RDC_15L)。
在SEQ ID NO:6记载的氨基酸序列中第1位的Gln被取代成Gly的序列见SEQ ID NO:72。
在SEQ ID NO:6记载的氨基酸序列中第1位的Gln被取代成Asn的序列见SEQ ID NO:73。
在SEQ ID NO:6记载的氨基酸序列中第1位的Gln被取代成Ser的序列见SEQ ID NO:74。
(s)抗人IL-6受体抗体,该抗体具有轻链CDR3,所述轻链CDR3在SEQ ID NO:6记载的氨基酸序列中第3位的Gly被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定,但优选取代成Ser。
在SEQ ID NO:6记载的氨基酸序列中第3位的Gly被取代成Ser的序列见SEQ ID NO:75。
(t)抗人IL-6受体抗体,该抗体具有轻链CDR1和轻链CDR3,所述轻链CDR1在SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列(LCDR1)中第9位的Tyr被取代成其他氨基酸,所述轻链CDR3在SEQ ID NO:6记载的氨基酸序列(LCDR3)中第3位的Gly被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选在SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列(LCDR1)中第9位的Tyr被取代成Phe,优选在SEQ ID NO:6记载的氨基酸序列(LCDR3)中第3位的Gly被取代成Ser(RD_72)。
(u)抗人IL-6受体抗体,该抗体具有轻链CDR3,所述轻链CDR3在SEQ ID NO:6记载的氨基酸序列(LCDR3)中第5位的Thr被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Arg(RD_23)或Ser。
在SEQ ID NO:6记载的氨基酸序列中第5位的Thr被取代成Arg的序列见SEQ ID NO:76。
在SEQ ID NO:6记载的氨基酸序列中第5位的Thr被取代成Ser的序列见SEQ ID NO:77。
(v)抗IL-6受体抗体,该抗体具有轻链CDR3,所述轻链CDR3在SEQ ID NO:6记载的氨基酸序列(LCDR3)中第1位的Gln和第5位的Thr被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选第1位的Gln取代成Gly、第5位的Thr取代成Ser(RD_22)。其他优选的取代有:第1位的Gln取代成Gly、第5位的Thr取代成Arg(RDC_11L)。
在SEQ ID NO:6记载的氨基酸序列中第1位的Gln取代成Gly、第5位的Thr取代成Ser的序列见SEQ ID NO:78。
在SEQ ID NO:6记载的氨基酸序列中第1位的Gln取代成Gly、第5位的Thr取代成Arg的序列见SEQ ID NO:79。
(w)抗IL-6受体抗体,该抗体包含重链CDR2和重链CDR3,所述重链CDR2在SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列(HCDR2)中第9位的Thr被取代成其他氨基酸,所述重链CDR3在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第1位的Ser和第5位的Thr被取代成其他氨基酸。
优选在SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列(HCDR2)中第9位的Thr被取代成Asn。在SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列(HCDR3)中,第1位的Ser和第5位的Thr取代后的氨基酸优选的组合有:Leu和Ala(RDC_27H);Val和Ala(RDC_28H);Ile和Ala(RDC_30H);Thr和Ala(RDC_4H);Val和Ile(RDC_29H);Ile和Ile(RDC_32H);Thr和Ile(RDC_7H);Leu和Ile(RDC_8H)。
(x)抗体,该抗体包含两个可变区,其中一个可变区具有(k)所述的重链CDR3,另一个可变区具有(v)所述的轻链CDR3。
(y)(x)所述的抗体,该抗体进一步包含(e)所述的重链CDR2。
本发明提供抗体及该抗体的制造方法,所述抗体至少包含上述(a)~(y)中任一项所述的氨基酸取代。因此,在本发明的抗体中还包括:除了包含上述(a)~(y)中任一项所述的氨基酸取代之外、还包含上述(a)~(y)所述的氨基酸取代以外的氨基酸取代的抗体。本发明的抗体中,还包括组合有多个上述(a)~(y)中任一项所述的氨基酸取代的抗体。作为上述(a)~(y)所述的氨基酸取代,有上述CDR氨基酸序列取代成其他氨基酸。作为除上述(a)~(y)所述的氨基酸取代以外的氨基酸取代,例如有:其他CDR部分的氨基酸序列的取代、缺失、添加和/或插入等。此外,还有FR的氨基酸序列的取代、缺失、添加和/或插入等。还有恒定区的氨基酸序列的取代、缺失、添加和/或插入等。
在本发明的抗体中,还包括将本发明中发现的高亲和性CDR移植到除人源化PM-1抗体以外的任何构架中而得到的抗体。本发明的抗体中包括下述抗体:对于将本发明中发现的高亲和性CDR移植到除人源化PM-1抗体以外的任何构架中结果亲和性下降的抗体,为了获得具原始亲和性的抗体而向构架部分导入突变(例如参照Curr.Opin.Biotechnol.1994Aug;5(4):428-33))的抗体;以及为了获得具原始亲和性的抗体而向CDR部分导入突变(例如参照US2006/0122377)的抗体。
在本发明中,优选对人源化PM-1抗体进行上述(a)~(y)中任一项所述的氨基酸取代。在人源化PM-1抗体中,进行了上述(a)~(y)中任一项所述的氨基酸取代的抗体对IL-6受体具有高的中和活性。在人源化PM-1抗体中,进行了上述(a)~(y)中任一项所述的氨基酸取代的抗体,其作为与IL-6有关的类风湿性关节炎等炎症性疾病等的治疗药有效。
需要说明的是,包含上述(a)~(y)中任一项所述的氨基酸取代的抗体例如还可以以下述(1)或(2)的形式进行描述。此处虽然是以(a)的抗体为例进行描述,但对于(b)~(y)的抗体也可以同样来描述。
(1)抗体,该抗体包含具有CDR1的重链可变区,所述CDR1具有在SEQ ID NO:1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。
(2)抗体,该抗体包含具有CDR1的H链,所述CDR1具有在SEQID NO:1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。
<结合活性增强的抗体>
本发明还提供与IL-6受体的结合活性高的抗IL-6受体抗体。本发明中,“与IL-6受体的结合活性高的抗IL-6受体抗体”是指通常在生理条件下、于37℃下测定的亲和性为1nM以下的抗体,优选亲和性为0.1nM以下的抗体,进一步优选亲和性为0.04nM以下的抗体。认为这样的与IL-6受体的结合活性高的抗IL-6受体抗体,其中和抗原的生物作用的能力提高。
对本发明的与IL-6受体的结合活性高的抗IL-6受体抗体中所导入的氨基酸取代没有特别限定,例如有上述氨基酸取代。
对IL-6受体没有特别限定,但优选人IL-6受体。
结合活性的测定可以利用本领域技术人员所公知的方法来进行,例如可以利用使用了SPR的Biacore(BIACORE)等进行测定。
本发明还提供免疫原性降低的抗IL-6受体抗体、特别是人源化PM-1抗体。认为若抗体序列中存在与HLA结合的T细胞表位,则抗体的免疫原性升高。因此,对抗体的序列进行取代以除去抗体序列中存在的T细胞表位,从而可以降低抗体的免疫原性风险。
本发明通过将抗体的氨基酸序列、特别是CDR序列中的氨基酸取代成其他氨基酸,提供除去了T细胞表位、免疫原性降低的人源化抗人IL-6受体抗体、特别是人源化PM-1轻链可变区。本发明还提供包含该轻链可变区的抗体。
更具体而言,本发明提供在SEQ ID NO:5记载的氨基酸序列(LCDR2)中第2位的Thr被取代成其他氨基酸的轻链CDR2。本发明还提供包含该轻链CDR2的轻链可变区。本发明还提供包含该轻链可变区的抗IL-6受体抗体。对取代后的氨基酸序列没有特别限定,但优选取代成Gly。在SEQ ID NO:5记载的氨基酸序列中第2位的Thr被取代成Gly的序列见SEQ ID NO:71。该氨基酸取代优选在人源化PM-1抗体的轻链可变区中进行。
本发明还提供血浆中药物动力学、稳定性和/或免疫原性得到改善的抗人IL-6受体抗体。关于IgG,发现具有同一的Fc区的IgG在血浆中的半衰期与pI以高的相关系数相关。因此,本发明人等尝试着改变抗不同抗原的2种抗体的可变区的pI时,成功地在不修饰与抗原种类无关的Fc区的情况下控制了血浆中半衰期。认为抗体非特异性地进入内皮细胞中的速度依赖于带有负电荷的细胞表面与IgG的理化库伦相互作用(Coulomb interaction)。通过降低IgG的pI,使库伦相互作用降低,抗体非特异性地进入内皮细胞中的量减少,其结果,通过减少抗体在内皮细胞中的代谢,可以增加抗体的血浆中滞留性。
即,本发明通过对抗IL-6受体抗体、特别是人源化PM-1抗体的氨基酸序列进行取代,提供等电点降低、血浆中滞留性增加的抗人IL-6受体抗体。具体而言,在Kabat编号(Kabat EA等人,1991 Sequences ofProteins of Immunological Interest(目标免疫蛋白的1991序列).NIH)中,将人源化PM-1的H13(SEQ ID NO:7的第13位的氨基酸)、H16(SEQ ID NO:7的第16位的氨基酸)、H43(SEQ ID NO:8的第8位的氨基酸)、H81(SEQ ID NO:9的第16位的氨基酸)、H105(SEQ ID NO:10的第3位的氨基酸)、L18(SEQ ID NO:11的第18位的氨基酸)、L45 (SEQ ID NO:12的第11位的氨基酸)、L79(SEQ ID NO:13的第23位的氨基酸)、L107(SEQ ID NO:14的第10位的氨基酸)、H31(SEQ IDNO:1的第1位的氨基酸)、L24(SEQ ID NO:4的第1位的氨基酸)和/或L53(SEQ ID NO:5的第4位的氨基酸)取代成等电点降低的其他氨基酸。由此可以在不影响人源化PM-1的结合活性和稳定性的情况下使等电点降低。另外,在人源化PM-1抗体中,将小鼠序列人源化时,为了保持结合活性而在小鼠序列中残留几个氨基酸残基。具体而言,在上述Kabat编号中,人源化PM-1抗体中的H27(SEQ ID NO:7的第27位的氨基酸)、H28(SEQ ID NO:7的第28位的氨基酸)、H29(SEQID NO:7的第29位的氨基酸)、H30(SEQ ID NO:7的第30位的氨基酸)和H71直接利用小鼠序列。关于HFR1,认为通过取代H13、H16、H23和H30,可以将HFR1转换成人序列,可以制作免疫原性风险较人源化PM-1抗体进一步降低的抗体。而且,由于人源化PM-1抗体是通过CDR嫁接而被人源化的抗体,所以认为在稳定性方面存在改善的空间。例如,认为在抗体可变区中,通过将暴露于表面的氨基酸残基取代成亲水性的氨基酸,可以使抗体稳定。并且,通过将CDR序列转化成共有序列,也可以使抗体稳定。关于人源化PM-1抗体,通过将上述Kabat编号中的H69(SEQ ID NO:9的第4位的氨基酸)的Met取代成Ile(疏水核结构的稳定化)、H70(SEQ ID NO:9的第5位的氨基酸)的Leu取代成Ser(暴露表面的残基的亲水化)、H58(SEQ IDNO:2的第9位的氨基酸)的Thr取代成Asn(将重链CDR2转化成共有序列)、H65(SEQ ID NO:2的第16位的氨基酸)的Ser取代成Gly(将β-转角部分取代成Gly、将重链CDR2转化成共有序列)、或L93(SEQID NO:6的第5位的氨基酸)的Thr取代成Ser(暴露表面的残基的亲水化),可以使抗体稳定。通过将上述LCDR2(SEQ ID NO:5)的第2位、即L51的Thr取代成Gly,可以在不影响结合活性和稳定性的情况下除去在计算机芯片上预测的T细胞表位,从而可以降低免疫原性风险。将上述氨基酸取代组合起来,可以获得抗体的血浆中药物动力学、免疫原性、稳定性均得到改善的抗IL-6受体抗体。
这样的抗体的例子有:下述(1)~(37)中任一项所述的抗体。
(1)抗体,该抗体包含具有FR1的重链可变区,所述FR1在SEQID NO:7记载的氨基酸序列中第13位的Arg被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定,但优选取代成Lys。
在SEQ ID NO:7记载的氨基酸序列中第13位的Arg取代成Lys的序列见SEQ ID NO:80。
(2)抗体,该抗体包含具有FR1的重链可变区,所述FR1在SEQID NO:7记载的氨基酸序列中第16位的Gln被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定,但优选取代成Glu。
在SEQ ID NO:7记载的氨基酸序列中第16位的Gln取代成Glu的序列见SEQ ID NO:81。
(3)抗体,该抗体包含具有FR1的重链可变区,所述FR1在SEQID NO:7记载的氨基酸序列中第23位的Thr被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定,但优选取代成Ala。
在SEQ ID NO:7记载的氨基酸序列中第23位的Thr取代成Ala的序列见SEQ ID NO:82。
(4)抗体,该抗体包含具有FR1的重链可变区,所述FR1在SEQID NO:7记载的氨基酸序列中第30位的Thr被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定,但优选取代成Ser。
在SEQ ID NO:7记载的氨基酸序列中第30位的Thr取代成Ser的序列见SEQ ID NO:83。
(5)抗体,该抗体包含具有FR1的重链可变区,所述FR1在SEQID NO:7记载的氨基酸序列中第13位的Arg、第16位的Gln、第23位的Thr和第30位的Thr被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选第13位的Arg取代成Lys、第16位的Gln取代成Glu、第23位的Thr取代成Ala、第30位的Thr取代成Ser。
在SEQ ID NO:7记载的氨基酸序列中第13位的Arg取代成Lys、第16位的Gln取代成Glu、第23位的Thr取代成Ala、第30位的Thr取代成Ser的序列见SEQ ID NO:84。
(6)抗体,该抗体包含具有FR2的重链可变区,所述FR2在SEQID NO:8记载的氨基酸序列中第8位的Arg被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Glu。
在SEQ ID NO:8记载的氨基酸序列中第8位的Arg取代成Glu的序列见SEQ ID NO:85。
(7)抗体,该抗体包含具有FR3的重链可变区,所述FR3在SEQID NO:9记载的氨基酸序列中第4位的Met被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Ile。
在SEQ ID NO:9记载的氨基酸序列中第4位的Met被取代成Ile的序列见SEQ ID NO:86。
(8)抗体,该抗体包含具有FR3的重链可变区,所述FR3在SEQID NO:9记载的氨基酸序列中第5位的Leu被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定,但优选取代成Ser。
在SEQ ID NO:9记载的氨基酸序列中第5位的Leu取代成Ser的序列见SEQ ID NO:87。
(9)抗体,该抗体包含具有FR3的重链可变区,所述FR3在SEQID NO:9记载的氨基酸序列中第16位的Arg被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Lys。
在SEQ ID NO:9记载的氨基酸序列中第16位的Arg取代成Lys的序列见SEQ ID NO:88。
(10)抗体,该抗体包含具有FR3的重链可变区,所述FR3在SEQID NO:9记载的氨基酸序列中第27位的Val被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定,但优选取代成Ala。
在SEQ ID NO:9记载的氨基酸序列中第27位的Val取代成Ala的序列见SEQ ID NO:89。
(11)抗体,该抗体包含具有FR3的重链可变区,所述FR3在SEQID NO:9记载的氨基酸序列(HFR3)中第4位的Met、第5位的Leu、第16位的Arg和第27位的Val被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选第4位的Met取代成Ile、第5位的Leu取代成Ser、第16位的Arg取代成Lys、第27位的Val取代成Ala。
在SEQ ID NO:9记载的氨基酸序列中第4位的Met取代成Ile、第5位的Leu取代成Ser、第16位的Arg取代成Lys、第27位的Val取代成Ala的序列见SEQ ID NO:90。
(12)抗体,该抗体包含具有FR4的重链可变区,所述FR4在SEQID NO:10记载的氨基酸序列(HFR4)中第3位的Gln被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Glu。
在SEQ ID NO:10记载的氨基酸序列中第3位的Gln取代成Glu的序列见SEQ ID NO:91。
(13)抗体,该抗体包含具有FR1的轻链可变区,所述FR1在SEQID NO:11记载的氨基酸序列(LFR1)中第18位的Arg被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Ser。
在SEQ ID NO:11记载的氨基酸序列中第18位的Arg取代成Ser的序列见SEQ ID NO:92。
(14)抗体,该抗体包含具有FR2的轻链可变区,所述FR2在SEQID NO:12记载的氨基酸序列(LFR2)中第11位的Lys被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Glu。
在SEQ ID NO:12记载的氨基酸序列中第11位的Lys取代成Glu的序列见SEQ ID NO:93。
(15)抗体,该抗体包含具有FR3的轻链可变区,所述FR3在SEQ ID NO:13记载的氨基酸序列中第23位的Gln被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Glu。
在SEQ ID NO:13记载的氨基酸序列中第23位的Gln取代成Glu的序列见SEQ ID NO:94。
(16)抗体,该抗体包含具有FR3的轻链可变区,所述FR3在SEQID NO:13记载的氨基酸序列中第24位的Pro被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定,但优选取代成Ala。
在SEQ ID NO:13记载的氨基酸序列中第24位的Pro取代成Ala的序列见SEQ ID NO:95。
(17)抗体,该抗体包含具有FR3的轻链可变区,所述FR3在SEQID NO:13记载的氨基酸序列中第27位的Ile被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定,但优选取代成Ala。
在SEQ ID NO:13记载的氨基酸序列中第27位的Ile取代成Ala的序列见SEQ ID NO:96。
(18)抗体,该抗体包含具有FR3的轻链可变区,所述FR3在SEQID NO:13记载的氨基酸序列(LFR3)中第23位的Gln、第24位的Pro和第27位的Ile被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选第23位的Gln取代成Glu、第24位的Pro取代成Ala、第27位的Ile取代成Ala。
在SEQ ID NO:13记载的氨基酸序列中第23位的Gln取代成Glu、第24位的Pro取代成Ala、第27位的Ile取代成Ala的序列见SEQ IDNO:97。
(19)抗体,该抗体包含具有FR4的轻链可变区,所述FR4在SEQID NO:14记载的氨基酸序列(LFR4)中第10位的Lys被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Glu。
在SEQ ID NO:14记载的氨基酸序列中第10位的Lys取代成Glu的序列见SEQ ID NO:98。
(20)抗体,该抗体包含具有FR4的重链可变区,所述FR4在SEQID NO:10记载的氨基酸序列(HFR4)中第5位的Ser被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Thr。
在SEQ ID NO:10记载的氨基酸序列中第5位的Ser取代成Thr的序列见SEQ ID NO:132。
(21)抗体,该抗体包含具有FR4的重链可变区,所述FR4在SEQID NO:10记载的氨基酸序列(HFR4)中第3位的Gln和第5位的Ser被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选第3位的Gln取代成Glu、第5位的Ser取代成Thr。
在SEQ ID NO:10记载的氨基酸序列中第3位的Gln取代成Glu、第5位的Ser取代成Thr的序列见SEQ ID NO:133。
(22)抗体,该抗体包含(5)、(6)、(11)和(21)所述的进行了氨基酸取代的人源化PM-1重链可变区。
(23)抗体,该抗体包含(13)、(14)、(18)和(19)所述的进行了氨基酸取代的人源化PM-1轻链可变区。
(24)抗体,该抗体包含(22)所述的重链可变区和(23)所述的轻链可变区。
(25)抗体,该抗体包含具有CDR1的重链可变区,所述CDR1在SEQ ID NO:1记载的氨基酸序列(HCDR1)中第1位的Ser被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Asp。
在SEQ ID NO:1记载的氨基酸序列中第1位的Ser取代成Asp的序列见SEQ ID NO:28。
(26)抗体,该抗体包含具有CDR2的重链可变区,所述CDR2在SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列中第16位的Ser被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Gly。
在SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列中第16位的Ser取代成Gly的序列见SEQ ID NO:99。
(27)抗体,该抗体包含具有CDR2的重链可变区,所述CDR2在SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列(HCDR2)中第9位的Thr和第16位的Ser被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选第9位的Thr取代成Asn、第16位的Ser取代成Gly。
在SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列中第9位的Thr取代成Asn、第16位的Ser取代成Gly的序列见SEQ ID NO:100。
(28)抗体,该抗体包含具有CDR1的轻链可变区,所述CDR1在SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列(LCDR1)中第1位的Arg被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Gln。
在SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列中第1位的Arg取代成Gln的序列见SEQ ID NO:101。
(29)抗体,该抗体包含具有CDR2的轻链可变区,所述CDR2在SEQ ID NO:5记载的氨基酸序列中第4位的Arg被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Glu。
在SEQ ID NO:5记载的氨基酸序列中第4位的Arg取代成Glu的序列见SEQ ID NO:102。
(30)抗体,该抗体包含具有CDR2的轻链可变区,所述CDR2在SEQ ID NO:5记载的氨基酸序列(LCDR2)中第2位的Thr和第4位的Arg被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选第2位的Thr取代成Gly、第4位的Arg取代成Glu。
在SEQ ID NO:5记载的氨基酸序列中第2位的Thr取代成Gly、第4位的Arg取代成Glu的序列见SEQ ID NO:103。
(31)抗体,该抗体包含具有CDR3的轻链可变区,所述CDR3在SEQ ID NO:6记载的氨基酸序列(LCDR3)中第5位的Thr被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Ser。
在SEQ ID NO:6记载的氨基酸序列中第5位的Thr取代成Ser的序列见SEQ ID NO:77。
(32)抗体,该抗体包含(25)和(27)所述的进行了氨基酸取代的重链可变区。
(33)抗体,该抗体包含(28)、(30)和(31)所述的进行了氨基酸取代的轻链可变区。
(34)抗体,该抗体包含(32)所述的重链可变区和(33)所述的轻链可变区。
(35)抗体,该抗体包含重链可变区,所述重链可变区具有SEQ IDNO:104记载的氨基酸序列(H53/L28的VH)。
(36)抗体,该抗体包含轻链可变区,所述轻链可变区具有SEQ IDNO:105记载的氨基酸序列(H53/L28的VL)。
(37)抗体,该抗体具有(35)所述的重链可变区和(36)所述的轻链可变区。
优选对人源化PM-1抗体进行上述(1)~(37)中任一项所述的氨基酸取代。本发明提供至少包含上述(1)~(37)中任一项所述的氨基酸取代的抗体、以及该抗体的制造方法。因此,本发明的抗体中也包括:除包含上述(1)~(37)中任一项所述的氨基酸取代之外、还包含上述(1)~(37)所述的氨基酸取代以外的氨基酸取代的抗体。在本发明的抗体中,还包括组合有多个上述(1)~(37)中任一项所述的氨基酸取代的抗体。作为上述(1)~(37)所述的氨基酸取代,例如有上述FR和CDR的氨基酸序列的取代。作为除上述(1)~(37)所述的氨基酸取代以外的氨基酸取代,有除上述以外的FR和CDR序列的取代、缺失、添加和/或插入等。此外,还有恒定区的氨基酸序列的取代、缺失、添加和/或插入等。
并且,作为除上述氨基酸修饰以外的、在不降低抗IL-6受体抗体活性的情况下降低等电点的修饰,例如有:在SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列中将第15位的Lys和/或第16位的Ser取代成其他氨基酸的修饰。对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选第15位的Lys取代成Gln、第16位的Ser取代成Asp。在SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列中第15位的Lys取代成Gln、第16位的Ser取代成Asp的序列见SEQ ID NO:121。另外,可以对SEQ ID NO:100记载的氨基酸序列进行上述氨基酸取代。在SEQ ID NO:100记载的氨基酸序列中第15位的Lys取代成Gln、第16位的Gly取代成Asp的序列见SEQ ID NO:122。因此,本发明提供包含具有CDR2的重链可变区的抗体,所述CDR2在SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:100记载的氨基酸序列中第15位的Lys和/或第16位的Ser被取代成其他氨基酸。
作为降低等电点的其他修饰,还有在SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列中将第4位的Gln取代成其他氨基酸的修饰。对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Glu。在SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列中第4位的Gln取代成Glu的氨基酸序列见SEQ ID NO:123。可以对SEQ ID NO:101的氨基酸序列进行上述氨基酸取代。在SEQ ID NO:101记载的氨基酸序列中第4位的Gln取代成Glu的氨基酸序列见SEQID NO:124。因此,本发明提供包含具有CDR1的轻链可变区的抗体,所述CDR1在SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:101记载的氨基酸序列中第4位的Gln被取代成其他氨基酸。
并且,作为降低等电点的其他修饰,其例子有:在SEQ ID NO:5记载的氨基酸序列中将第6位的His取代成其他氨基酸的修饰。对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Glu。在SEQ ID NO:5记载的氨基酸序列中第6位的His取代成Glu的氨基酸序列见SEQ IDNO:125。另外,可以对SEQ ID NO:103的氨基酸序列进行上述氨基酸取代。在SEQ ID NO:103记载的氨基酸序列中第6位的His取代成 Glu的氨基酸序列见SEQ ID NO:126。因此,本发明提供包含具有CDR2的轻链可变区的抗体,所述CDR2在SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:103的氨基酸序列中第6位的His被取代成其他氨基酸。
并且,在SEQ ID NO:90记载的重链FR3的氨基酸序列中,作为降低免疫原性风险的修饰,其例子有:将第27位(Kabat编号H89)的Ala取代成Val的修饰。在SEQ ID NO:90记载的氨基酸序列中第27位的Ala取代成Val的氨基酸序列见SEQ ID NO:127。因此,本发明提供包含具有FR3的重链可变区的抗体,所述FR3在SEQ ID NO:90的氨基酸序列中第27位的Ala取代成Val。
在SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:90记载的重链FR3的氨基酸序列中唯一残留的小鼠序列、即第6位(Kabat编号H71)的Arg,认为通过使用H71位保有Arg的人VH1亚纲(SEQ ID NO:128)或人VH3亚纲(SEQ ID NO:129)的人序列作为FR3序列,可以制作构架完全是人序列的抗人IL-6受体抗体。因此,本发明提供包含重链可变区的抗体,所述重链可变区具有SEQ ID NO:128或SEQ ID NO:129记载的FR3。
并且,在SEQ ID NO:10记载的重链FR4的氨基酸序列中,作为提高稳定性的修饰,其例子有:将第5位(Kabat编号H107)的Ser取代成Ile的修饰。在SEQ ID NO:10记载的氨基酸序列中,第5位的Ser取代成Ile的氨基酸序列见SEQ ID NO:130。另外,也可以将该氨基酸导入到SEQ ID NO:91记载的氨基酸序列中。在SEQ ID NO:91记载的氨基酸序列中第5位的Ser取代成Ile的氨基酸序列见SEQ IDNO:131。因此,本发明提供包含具有FR4的重链可变区的抗体,所述FR4在SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:91记载的氨基酸序列中第5位的Ser被取代成Ile。
优选对人源化PM-1抗体、H53/L28(包含SEQ ID NO:104的重链可变区和SEQ ID NO:105的轻链可变区的抗体)或PF1抗体(包含SEQID NO:22的重链可变区和SEQ ID NO:23的轻链可变区的抗体)进行上述氨基酸取代。本发明提供至少包含上述氨基酸取代的抗体及该抗体的制造方法。因此,本发明的抗体中也包括:除了包含上述氨基酸取代之外、还包含上述(1)~(37)所述的氨基酸取代和/或上述(1)~(37)以外的氨基酸取代的抗体。作为上述(1)~(37)所述的氨基酸取代以外的氨基酸取代,其例子有:上述以外的FR和CDR序列的取代、缺失、添加和/或插入等。此外,还有恒定区的氨基酸序列的取代、缺失、添加和/或插入等。
<低等电点的抗人il-6受体抗体>
本发明还提供低等电点的抗IL-6受体抗体。本发明的低等电点的抗体包括:全长抗体的实测等电点低的抗体和可变区(VH/VL)的理论等电点低的抗体。
在本发明中,全长抗体的实测等电点低的抗IL-6受体抗体通常是指实测等电点为7.5以下的抗体,优选实测等电点为7.0以下的抗体,进一步优选实测等电点为6.0以下的抗体。实测等电点可以按照本领域技术人员所公知的方法进行测定,例如可以采用非变性凝胶等电点电泳或毛细管等电点电泳等方法进行测定。
在本发明中,可变区的理论等电点低的抗IL-6受体抗体通常是指理论等电点为5.5以下的抗体,优选理论等电点为5.0以下的抗体,进一步优选理论等电点为4.0以下的抗体。理论等电点可以通过本领域技术人员所公知的方法算出,例如通过使用GENETYX(GENETYXCORPORATION)等软件,可以算出可变区VH和VL的理论等电点。
在本发明的低等电点的抗IL-6受体抗体中,对所导入的氨基酸取代没有特别限定,例如有上述氨基酸取代。认为这样的低等电点的抗IL-6受体抗体,其在血浆中的滞留性有所提高。
对IL-6受体没有特别限定,但优选人IL-6受体。
<在高浓度下稳定的抗人il-6受体抗体>
本发明还提供在高浓度下稳定的抗IL-6受体抗体。
本发明中,“在高浓度下稳定”是指在适于皮下给药的pH6.5~7.0的范围内适当选择的缓冲液条件(例如20mM组氨酸-HCl、150mMNaCl)下,100mg/mL抗IL-6受体抗体的高浓度抗体溶液在25℃下经过1个月聚集物比率(凝胶过滤层析中聚集物峰面积/总峰面积×100)的增加为0.3%以下,优选0.2%以下,进一步优选为0.1%以下。需要说明的是,抗IL-6受体抗体的浓度只要是100mg/mL以上即可,例如可以是200mg/mL或300mg/mL等。
对本发明的在高浓度下稳定的抗IL-6受体抗体没有特别限定,例如可以利用上述氨基酸取代等来制作该抗体。
对IL-6受体没有特别限定,但优选人IL-6受体。
本发明还提供对上述(1)~(37)中任一项所述的进行了氨基酸取代的人源化PM-1抗体进一步进行上述(a)~(y)中任一项所述的、提高结合活性和/或中和活性的氨基酸取代的抗体。作为这样的抗体的一个方式,其例子有:具有重链可变区和轻链可变区的抗体(PF1),所述重链可变区具有SEQ ID NO:22记载的氨基酸序列(PF1_H),所述轻链可变区具有SEQ ID NO:23记载的氨基酸序列(PF1_L),但并不限于此。
本发明还提供下述抗体的(A)~(I)中任一项所述的抗IL-6受体抗体:
(A)重链可变区,该重链可变区具有CDR1、CDR2、CDR3,所述CDR1具有SEQ ID NO:165记载的氨基酸序列(VH5-M83的CDR1),所述CDR2具有SEQ ID NO:166记载的氨基酸序列(VH5-M83的CDR2),所述CDR3具有SEQ ID NO:167记载的氨基酸序列(VH5-M83的CDR3);
(B)轻链可变区,该轻链可变区具有CDR1、CDR2、CDR3,所述CDR1具有SEQ ID NO:101记载的氨基酸序列(VL5的CDR1),所述CDR2具有SEQ ID NO:168记载的氨基酸序列(VL5的CDR2),所述CDR3具有SEQ ID NO:79记载的氨基酸序列(VL5的CDR3);
(C)抗体,该抗体包含(A)的重链可变区和(B)的轻链可变区;
(D)重链可变区,该重链可变区具有CDR1、CDR2、CDR3,所述CDR1具有SEQ ID NO:169记载的氨基酸序列(VH3-M73的CDR1),所述CDR2具有SEQ ID NO:170记载的氨基酸序列(VH3-M73的CDR2),所述CDR3具有SEQ ID NO:171记载的氨基酸序列(VH3-M73的CDR3);
(E)轻链可变区,该轻链可变区具有CDR1、CDR2、CDR3,所述CDR1具有SEQ ID NO:172记载的氨基酸序列(VL3的CDR1),所述CDR2具有SEQ ID NO:173记载的氨基酸序列(VL3的CDR2),所述CDR3具有SEQ ID NO:79记载的氨基酸序列(VL3的CDR3);
(F)抗体,该抗体包含(D)所述的重链可变区和(E)所述的轻链可变区;
(G)重链可变区,该重链可变区具有CDR1、CDR2、CDR3,所述CDR1具有SEQ ID NO:169记载的氨基酸序列(VH4-M73的CDR1),所述CDR2具有SEQ ID NO:174记载的氨基酸序列(VH4-M73的CDR2),所述CDR3具有SEQ ID NO:171记载的氨基酸序列(VH4-M73的CDR3);
(H)轻链可变区,该轻链可变区具有CDR1、CDR2、CDR3,所述CDR1具有SEQ ID NO:175记载的氨基酸序列(VL1的CDR1),所述CDR2具有SEQ ID NO:173记载的氨基酸序列(VL1的CDR2),所述CDR3具有SEQ ID NO:79记载的氨基酸序列(VL1的CDR3);
(I)抗体,该抗体包含(G)所述的重链可变区和(H)所述的轻链可变区。
本发明还提供下述(a)~(q)中任一项所述的抗IL-6受体抗体:
(a)抗体,该抗体包含重链可变区,所述重链可变区具有SEQ IDNO:159记载的氨基酸序列(H96-IgG1可变区);
(b)抗体,该抗体包含重链可变区,所述重链可变区具有下述氨基酸序列:在SEQ ID NO:159记载的氨基酸序列(H96-IgG1可变区)中第35位的Trp、第51位的Tyr、第63位的Ser、第65位的Lys、第66位的Gly、第99位的Val、第103位的Ile、第108位的Tyr、第111位的Glu、第113位的Thr中的至少1个氨基酸被取代成其他氨基酸的氨基酸序列;
(c)抗体,该抗体包含重链可变区,所述重链可变区具有下述氨基酸序列:在SEQ ID NO:159记载的氨基酸序列(H96-IgG1可变区)中第65位的Lys、第66位的Gly、第99位的Val、第103位的Ile、第111位的Glu、第113位的Thr被取代成其他氨基酸的氨基酸序列;
(d)抗体,该抗体包含重链可变区,所述重链可变区具有下述氨基酸序列:在SEQ ID NO:159记载的氨基酸序列(H96-IgG1可变区)中第35位的Trp、第51位的Tyr、第63位的Ser、第65位的Lys、第66位的Gly、第99位的Val、第103位的Ile、第108位的Tyr被取代成其他氨基酸的氨基酸序列;
(e)抗体,该抗体包含重链可变区,所述重链可变区具有SEQ IDNO:160记载的氨基酸序列(F2H-IgG1可变区);
(f)抗体,该抗体包含重链可变区,所述重链可变区具有SEQ IDNO:161记载的氨基酸序列(VH5-M83可变区);
(g)抗体,该抗体具有轻链可变区,所述轻链可变区具有下述氨基酸序列:在SEQ ID NO:23记载的氨基酸序列(PF1L)中第27位的Gln和/或第55位的His被取代成其他氨基酸的氨基酸序列;
(h)抗体,该抗体包含轻链可变区,所述轻链可变区具有SEQ IDNO:162记载的氨基酸序列(L39可变区);
(i)抗体,该抗体包含轻链可变区,所述轻链可变区具有SEQ IDNO:163记载的氨基酸序列(VL5-κ可变区);
(j)抗体,该抗体包含重链可变区,所述重链可变区具有SEQ IDNO:176记载的氨基酸序列(VH3-M73可变区);
(k)抗体,该抗体包含重链可变区,所述重链可变区具有SEQ IDNO:178记载的氨基酸序列(VH4-M73可变区);
(l)抗体,该抗体包含轻链可变区,所述轻链可变区具有SEQ ID NO:177记载的氨基酸序列(VL3-κ可变区);
(m)抗体,该抗体包含轻链可变区,所述轻链可变区具有SEQ IDNO:179记载的氨基酸序列(VL1-κ可变区);
(n)抗体,该抗体包含(e)的重链可变区和(h)的轻链可变区;
(o)抗体,该抗体包含(f)的重链可变区和(i)的轻链可变区(FV5-M83的可变区组合);
(p)抗体,该抗体包含(j)的重链可变区和(l)的轻链可变区(FV4-M73的可变区组合);
(q)抗体,该抗体包含(k)的重链可变区和(m)的轻链可变区(FV3-M73的可变区组合)。
在上述(a)~(d)的重链可变区的氨基酸取代中,对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选第35位的Trp取代成Val、第51位的Tyr取代成Phe、第63位的Ser取代成Thr、第65位的Lys取代成Gln、第66位的Gly取代成Asp、第99位的Val取代成Leu、第103位的Ile取代成Ala、第108位的Tyr取代成Val、第111位的Glu取代成Gln、第113位的Thr取代成Ile。在上述(g)的轻链可变区的氨基酸取代中,对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选第27位的Gln取代成Glu、第55位的His取代成Glu。此外,可以进行上述氨基酸取代以外的氨基酸的取代、缺失、插入和/或添加等。
对本发明的抗体恒定区没有特别限定,可以使用任何恒定区。例如可以使用具有IgG1、IgG2、IgG4等天然序列的恒定区、或通过对具有天然序列的恒定区中的氨基酸进行取代、缺失、添加和/或插入等而制作的修饰型恒定区等。修饰型恒定区的例子有后述的恒定区。
作为使用了上述本发明的可变区的抗体,其例子有下述抗体:
(1)抗体,该抗体包含具有SEQ ID NO:134记载的氨基酸序列(H96-IgG1)的重链;
(2)抗体,该抗体包含具有SEQ ID NO:135记载的氨基酸序列(F2H-IgG1)的重链;
(3)抗体,该抗体包含具有SEQ ID NO:137记载的氨基酸序列(VH5-IgG1)的重链;
(4)抗体,该抗体包含具有SEQ ID NO:139记载的氨基酸序列(VH5-M83)的重链;
(5)抗体,该抗体包含具有SEQ ID NO:136记载的氨基酸序列(L39)的轻链;
(6)抗体,该抗体包含具有SEQ ID NO:138记载的氨基酸序列(VL5-κ)的轻链;
(7)抗体,该抗体包含具有SEQ ID NO:180记载的氨基酸序列(VH3-M73)的重链;
(8)抗体,该抗体包含具有SEQ ID NO:182记载的氨基酸序列(VH4-M73)的重链;
(9)抗体,该抗体包含具有SEQ ID NO:181记载的氨基酸序列(VL3-κ)的轻链;
(10)抗体,该抗体包含具有SEQ ID NO:183记载的氨基酸序列(VL1-κ)的轻链;
(11)抗体,该抗体包含(2)的重链和(5)的轻链;
(12)抗体,该抗体包含(3)的重链和(6)的轻链;
(13)抗体,该抗体包含(4)的重链和(6)的轻链(FV5-M83);
(14)抗体,该抗体包含(7)的重链和(9)的轻链(FV4-M73);
(15)抗体,该抗体包含(8)的重链和(10)的轻链(FV3-M73);
(16)抗体,该抗体与(1)~(15)中任一项所述的抗体具有同等的活性。
其中,“具有同等的活性”是指与抗原的结合活性和/或中和活性是同等的。本发明中,同等的活性未必是指相同的活性,而是指具有例如50%以上的活性、优选70%以上的活性、进一步优选90%以上的活性。
本发明还提供下述(i)~(xxii)中任一项所述的CDR或FR。
(i)重链FR1,其中具有SEQ ID NO:84记载的氨基酸序列(VH5的重链FR1);
(ii)重链FR1,其中具有SEQ ID NO:186记载的氨基酸序列(VH3、VH4的重链FR1);
(iii)重链FR2,其中具有SEQ ID NO:85记载的氨基酸序列(VH3、VH4、VH5的重链FR2);
(iv)重链FR3,其中具有SEQ ID NO:184记载的氨基酸序列(VH3、VH4、VH5的重链FR3);
(v)重链FR4,其中具有SEQ ID NO:133记载的氨基酸序列(VH3、VH4、VH5的重链FR4);
(vi)轻链FR1,其中具有SEQ ID NO:92记载的氨基酸序列(VL1、VL3、VL5的轻链FR1);
(vii)轻链FR2,其中具有SEQ ID NO:93记载的氨基酸序列(VL1、VL3、VL5的轻链FR2);
(viii)轻链FR3,其中具有SEQ ID NO:97记载的氨基酸序列(VL1、VL3、VL5的轻链FR3);
(ix)轻链FR4,其中具有SEQ ID NO:98记载的氨基酸序列(VL1、VL3、VL5的轻链FR4);
(x)重链CDR1,其中具有SEQ ID NO:169记载的氨基酸序列(VH3、VH4的重链CDR1);
(xi)重链CDR1,其中具有SEQ ID NO:165记载的氨基酸序列(VH5的重链CDR1);
(xii)重链CDR2,其中具有SEQ ID NO:170记载的氨基酸序列(VH3的重链CDR2);
(xiii)重链CDR2,其中具有SEQ ID NO:174记载的氨基酸序列(VH4的重链CDR2);
(xiv)重链CDR2,其中具有SEQ ID NO:166记载的氨基酸序列(VH5的重链CDR2);
(xv)重链CDR3,其中具有SEQ ID NO:171记载的氨基酸序列(VH3、VH4的重链CDR3);
(xvi)重链CDR3,其中具有SEQ ID NO:167记载的氨基酸序列(VH5的重链CDR3);
(xvii)轻链CDR1,其中具有SEQ ID NO:175记载的氨基酸序列(VL1的轻链CDR1);
(xviii)轻链CDR1,其中具有SEQ ID NO:172记载的氨基酸序列(VL3的轻链CDR1);
(xix)轻链CDR1,其中具有SEQ ID NO:101记载的氨基酸序列(VL5的轻链CDR1);
(xx)轻链CDR2,其中具有SEQ ID NO:173记载的氨基酸序列(VL1、VL3的轻链CDR2);
(xxi)轻链CDR2,其中具有SEQ ID NO:168记载的氨基酸序列(VL5的轻链CDR2);
(xxii)轻链CDR3,其中具有SEQ ID NO:79记载的氨基酸序列(VL1、VL3、VL5的轻链CDR3)。
在本发明的抗体中,还包括含有上述任一项所述的氨基酸取代的抗体的片段或其修饰物。作为抗体片段,例如有Fab、F(ab’)2、Fv或将H链和L链的Fv经适当的接头连接而成的单链Fv(scFv)、H链单独结构域或L链单独结构域(例如Nat.Biotechnol.2005 Sep;23(9):1126-36),Unibody(WO2007059782 A1)、SMIP(WO2007014278 A2)。对抗体的来源没有特别限定,可以是人抗体、小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体等。本发明的抗体还可以是嵌合抗体、人源化抗体、完全人源化抗体等。
具体而言,可以用酶、例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶处理抗体,生成抗体片段;或者,构建编码上述抗体片段的基因,将其导入表达载体中,之后使之在适当的宿主细胞中表达(例如参照Co,M.S.等人,J.Immunol.(1994)152,2968-2976;Better,M.& Horwitz,A.H.Methods in Enzymology(1989)178,476-496;Pluckthun,A.& Skerra,A.Methodsin Enzymology(1989)178,497-515;Lamoyi,E.,Methods inEnzymology(1989)121,652-663;Rousseaux,J.等人,Methods inEnzymology(1989)121,663-66;Bird,R.E.等人,TIBTECH(1991)9,132-137)。
scFv是通过连接抗体H链V区和L链V区而得到的。在该scFv中,H链V区与L链V区经由接头、优选肽接头进行连接(Huston,J.S.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85,5879-5883)。scFv中的H链V区和L链V区可以来自上述任一种抗体。作为连接V区的肽接头,例如可以使用由12~19个氨基酸残基构成的任意的单链肽。
<抗体恒定区>
本发明还提供下述(i)~(xxi)中任一项所述的、通过氨基酸取代而改良的抗体恒定区。恒定区是指IgG1、IgG2、IgG4型恒定区。人IgG1恒定区、人IgG2恒定区和人IgG4恒定区的氨基酸序列是公知的(人IgG1恒定区见SEQ ID NO:19;人IgG2恒定区见SEQ ID NO:20;人IgG4恒定区见SEQ ID NO:21)。需要说明的是,人IgG4恒定区是指导入了用于改善铰链部分的稳定性的修饰(Mol.Immunol.1993Jan;30(1):105-8)的序列。本发明还提供包含该氨基酸被取代的抗体恒定区的抗体。抗体恒定区优选为人抗体恒定区。
需要说明的是,本发明的氨基酸被取代的抗体恒定区只要包含下述(i)~(xxi)中任一项所述的氨基酸取代即可,可以包含其他氨基酸取代或修饰。因此,在本发明中,对在SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列中已经有1个或多个氨基酸被取代和/或修饰的IgG2恒定区进行本发明的氨基酸取代时、或者在进行本发明的氨基酸取代后对1个或多个氨基酸进行取代和/或修饰时,具有SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区对应于本发明的进行了氨基酸取代的IgG2恒定区。具有SEQ ID NO:19记载的氨基酸序列的IgG1恒定区、具有SEQ ID NO: 21记载的氨基酸序列的IgG4恒定区的情况亦同。
EU编号(参照Sequences of proteins of immunological interest(目标免疫蛋白序列),NIH Publication No.91-3242)第297位的糖链可以是任何糖链结构,也可以不结合糖链(例如大肠杆菌等、在未添加有糖链的宿主细胞中产生的恒定区等)。
(i)改善IgG2恒定区在酸性条件下的稳定性
本发明的氨基酸被取代的IgG2恒定区的一个方式为:在具有SEQID NO:20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区中,第276位(EU编号第397位)的Met被取代成其他氨基酸的IgG2恒定区。对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Val。通过将SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列中第276位(EU编号第397位)的Met取代成其他氨基酸,可以提高抗体在酸性条件下的稳定性。
(ii)改善IgG2恒定区的异质性
本发明的氨基酸被取代的IgG2恒定区的一个方式为:在具有SEQID NO:20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区中,第14位(EU编号第131位)的Cys、第16位(EU编号第133位)的Arg、以及第102位(EU编号第219位)的Cys被取代成其他氨基酸的IgG2恒定区。对取代后的氨基酸没有特别限定,但第14位(EU编号第131位)的Cys优选取代成Ser,第16位(EU编号第133位)的Arg优选取代成Lys,第102位(EU编号第219位)的Cys优选取代成Ser(IgG2-SKSC)。
通过进行上述取代,可以降低来自IgG2的铰链区的异质性。在本发明的氨基酸被取代的IgG2恒定区中,包含上述3种氨基酸取代中的至少一种氨基酸被取代的IgG2恒定区。但优选第14位的Cys和第102位的Cys被取代成其他氨基酸、或者上述3种氨基酸均被取代。(iii)降低IgG2恒定区与FcγR的结合
本发明的氨基酸被取代的IgG2恒定区的一种方式为:提供在具有SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区中,第209位(EU330)的Ala取代成Ser、第210位(EU331)的Pro取代成Ser、和/ 或第218位(EU339)的Thr取代成Ala的IgG2恒定区。已有报道称:通过第209位(EU330)的Ala、第210位(EU331)的Pro的取代,可以降低IgG2恒定区与Fcγ受体的结合(Eur.J.Immunol.1999 Aug;29(8):2613-24),但是在该修饰中出现了能够形成T细胞表位的、来自非人的肽,所以从免疫原性风险的角度考虑并不优选。因此,通过同时将第218位(EU339)的Thr取代成Ala,可以在只使用来源于人的肽作为能够形成T细胞表位的9-12个氨基酸的情况下减少IgG2与Fcγ受体的结合。
本发明的氨基酸被取代的IgG2恒定区,只要上述3处氨基酸取代中的至少1处氨基酸被取代即可,但优选上述3处氨基酸均被取代。因此,本发明的氨基酸被取代的IgG2恒定区的优选方式为:在具有SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区中,第209位(EU330)的Ala取代成Ser、第210位(EU331)的Pro取代成Ser、且第218位(EU339)的Thr取代成Ala的IgG2恒定区。
(iv)改善IgG2恒定区的C末端异质性
本发明提供在具有SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区中第325位(EU编号第446位)的Gly和第326位(EU编号第447位)的Lys均缺失的IgG2恒定区。通过使上述两种氨基酸均缺失,首次可以降低来自抗体H链C末端的异质性。
(v)通过修饰IgG2恒定区来提高血浆中滞留性
本发明的氨基酸被取代的IgG2恒定区的一种方式为:在具有SEQID NO:20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区中,第147位(EU编号第268位)的His、第234位(EU编号第355位)的Arg、第298位(EU编号第419位)的Gln被取代成其他氨基酸的IgG2恒定区。通过这些氨基酸取代,可以提高抗体的血浆中滞留性。对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选第147位(EU编号第268位)的His取代成Gln、第234位(EU编号第355位)的Arg取代成Gln、第298位(EU编号第419位)的Gln取代成Glu。在本发明的氨基酸被取代的IgG2恒定区中,包含上述3种氨基酸取代中至少1种氨基酸被取代的IgG2恒定区,但优选上述3种氨基酸均被取代。
(vi)改善IgG4恒定区在酸性条件下的稳定性
本发明提供在具有SEQ ID NO:21记载的氨基酸序列的IgG4恒定区中第289位(EU编号第409位)的Arg被取代成其他氨基酸的IgG4恒定。对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Lys。通过将SEQ ID NO:21记载的氨基酸序列中第289位(EU编号第409位)的Arg取代成其他氨基酸,可以提高抗体在酸性条件下的稳定性。
(vii)改善IgG4恒定区的C末端异质性
本发明提供在具有SEQ ID NO:21记载的氨基酸序列的IgG4恒定区中第326位(EU编号第446位)的Gly和第327位(EU编号第447位)的Lys均缺失的IgG4恒定区。通过缺失上述两种氨基酸,首次可以降低来自抗体H链C末端的异质性。
(viii)改善IgG1恒定区的C末端异质性
本发明提供在具有SEQ ID NO:19记载的氨基酸序列的IgG1恒定区中第329位(EU编号第446位)的Gly和第330位的(EU编号第447位)的Lys均缺失的IgG1恒定区。通过缺失上述两种氨基酸,首次可以降低来自抗体H链C末端的异质性。
(ix)
本发明提供具有下述氨基酸序列的IgG1恒定区:在具有SEQ IDNO:19记载的氨基酸序列的IgG1恒定区中,第317位(EU编号第434位)的Asn被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Ala。
(x)
本发明提供具有下述氨基酸序列的IgG2恒定区:在SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列中第209位(EU编号第330位)的Ala、第210位(EU编号第331位)的Pro、第218位(EU编号第339位)的Thr、第276位(EU编号第397位)的Met、第14位(EU编号第131位)的Cys、第 16位(EU编号第133位)的Arg、第102位(EU编号第219位)的Cys、第20位(EU编号第137位)的Glu和第21位(EU编号第138位)的Ser被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选第209位的Ala取代成Ser、第210位的Pro取代成Ser、第218位的Thr取代成Ala、第276位的Met取代成Val、第14位的Cys取代成Ser、第16位的Arg取代成Lys、第102位的Cys取代成Ser、第20位的Glu取代成Gly、第21位的Ser取代成Gly。
(xi)
本发明提供具有下述氨基酸序列的IgG2恒定区:在SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列中第209位(EU编号第330位)的Ala、第210位(EU编号第331位)的Pro、第218位(EU编号第339位)的Thr、第276位(EU编号第397位)的Met、第14位(EU编号第131位)的Cys、第16位(EU编号第133位)的Arg、第102位(EU编号第219位)的Cys、第20位(EU编号第137位)的Glu和第21位(EU编号第138位)的Ser被取代成其他氨基酸、且第325位(EU编号第446位)的Gly和第326位(EU编号第447位)的Lys均缺失的氨基酸序列。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选第209位的Ala取代成Ser、第210位的Pro取代成Ser、第218位的Thr取代成Ala、第276位的Met取代成Val、第14位的Cys取代成Ser、第16位的Arg取代成Lys、第102位的Cys取代成Ser、第20位的Glu取代成Gly、第21位的Ser取代成Gly。
(xii)
本发明提供具有下述氨基酸序列的IgG2恒定区:在SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列中第276位(EU编号第397位)的Met、第14位(EU编号第131位)的Cys、第16位(EU编号第133位)的Arg、第102位(EU编号第219位)的Cys、第20位(EU编号第137位)的Glu、第21位(EU编号第138位)的Ser被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选第276位的Met取代成Val、第14位的Cys取代成Ser、第16位的Arg取代成Lys、第102位的Cys取代成Ser、第20位的Glu取代成Gly、第21位的Ser取代成Gly。
(xiii)
本发明提供具有下述氨基酸序列的IgG2恒定区:在SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列中第276位(EU编号第397位)的Met、第14位(EU编号第131位)的Cys、第16位(EU编号第133位)的Arg、第102位(EU编号第219位)的Cys、第20位(EU编号第137位)的Glu和第21位(EU编号第138位)的Ser被取代成其他氨基酸、且第325位(EU编号第446位)的Gly和第326位(EU编号第447位)的Lys均缺失的氨基酸序列。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选第276位的Met取代成Val、第14位的Cys取代成Ser、第16位的Arg取代成Lys、第102位的Cys取代成Ser、第20位的Glu取代成Gly、第21位的Ser取代成Gly。
(xiv)
本发明提供具有下述氨基酸序列的IgG2恒定区:在SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列中第14位(EU编号第131位)的Cys、第16位(EU编号第133位)的Arg、第102位(EU编号219第位)的Cys、第20位(EU编号第137位)的Glu、第21位(EU编号第138位)的Ser、第147位(EU编号第268位)的His、第234位(EU编号第355位)的Arg和第298位(EU编号第419位)的Gln被取代成其他氨基酸、且第325位(EU编号第446位)的Gly和第326位(EU编号第447位)的Lys均缺失的氨基酸序列。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选第14位的Cys取代成Ser、第16位的Arg取代成Lys、第102位的Cys取代成Ser、第20位的Glu取代成Gly、第21位的Ser取代成Gly、第147位的His取代成Gln、第234位的Arg取代成Gln、第298位的Gln取代成Glu。
(xv)
本发明提供具有下述氨基酸序列的IgG2恒定区:在SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列中第14位(EU编号第131位)的Cys、第16位(EU编号第133位)的Arg、第102位(EU编号第219位)的Cys、第20位(EU编号第137位)的Glu、第21位(EU编号第138位)的Ser、第147位(EU编号第268位)的His、第234位(EU编号第355位)的Arg、第298位(EU编号第419位)的Gln和第313位(EU编号第434位)的Asn被取代成其他氨基酸、且第325位(EU编号第446位)的Gly和第326位(EU编号第447位)的Lys均缺失的氨基酸序列。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选第14位的Cys取代成Ser、第16位的Arg取代成Lys、第102位的Cys取代成Ser、第20位的Glu取代成Gly、第21位的Ser取代成Gly、第147位的His取代成Gln、第234位的Arg取代成Gln、第298位的Gln取代成Glu、第313位的Asn取代成Ala。
(xvi)
本发明提供具有下述氨基酸序列的IgG4恒定区:在SEQ ID NO:21记载的氨基酸序列中第289位(EU编号第409位)的Arg、第14位的Cys、第16位的Arg、第20位的Glu、第21位的Ser、第97位的Arg、第100位的Ser、第102位的Tyr、第103位的Gly、第104位的Pro和第105位的Pro(分别为EU编号第131、133、137、138、214、217、219、220、221、222位)、第113位的Glu、第114位的Phe和第115位的Leu(分别为EU编号第233、234、235位)被取代成其他氨基酸、且第116位(EU编号第236位)的Gly缺失的氨基酸序列。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选第14位(EU编号第131位)的Cys取代成Ser、第16位(EU编号第133位)的Arg取代成Lys、第20位(EU编号第137位)的Glu取代成Gly、第21位(EU编号第138位)的Ser取代成Gly、第97位(EU编号第214位)的Arg取代成Thr、第100位(EU编号第217位)的Ser取代成Arg、第102位(EU编号第219位)的Tyr取代成Ser、第103位(EU编号第220位)的Gly取代成Cys、第104位(EU编号第221位)的Pro取代成Val、第105位(EU编号第222位)的Pro取代成Glu、第113位(EU编号第233位)的Glu取代成Pro、第114位(EU编号第234位)的Phe取代成Val、第115位(EU编号第235位)的Leu取代成Ala、第289位(EU编号第409位)的Arg取代成Lys。
(xvii)
本发明提供具有下述氨基酸序列的IgG4恒定区:在SEQ ID NO:21记载的氨基酸序列中第289位(EU编号第409位)的Arg、第14位的Cys、第16位的Arg、第20位的Glu、第21位的Ser、第97位的Arg、第100位的Ser、第102位的Tyr、第103位的Gly、第104位的Pro和第105位的Pro(分别为EU编号第131、133、137、138、214、217、219、220、221、222位)、第113位的Glu、第114位的Phe和第115位的Leu(分别为EU编号第233、234、235位)被取代成其他氨基酸、且第116位(EU编号第236位)的Gly、第326位(EU编号第446位)的Gly和第327位(EU编号第447位)的Lys缺失的氨基酸序列。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选第14位(EU编号第131位)的Cys取代成Ser、第16位(EU编号第133位)的Arg取代成Lys、第20位(EU编号第137位)的Glu取代成Gly、第21位(EU编号第138位)的Ser取代成Gly、第97位(EU编号第214位)的Arg取代成Thr、第100位(EU编号第217位)的Ser取代成Arg、第102位(EU编号第219位)的Tyr取代成Ser、第103位(EU编号第220位)的Gly取代成Cys、第104位(EU编号第221位)的Pro取代成Val、第105位(EU编号第222位)的Pro取代成Glu、第113位(EU编号第233位)的Glu取代成Pro、第114位(EU编号第234位)的Phe取代成Val、第115位(EU编号第235位)的Leu取代成Ala、第289位(EU编号第409位)的Arg取代成Lys。
(xviii)
本发明提供具有下述氨基酸序列的IgG1恒定区:在具有SEQ IDNO:19记载的氨基酸序列的IgG1恒定区中第317位(EU编号第434位)的Asn被取代成其他氨基酸、且第329位(EU编号第446位)的Gly和第330位(EU编号第447位)的Lys均缺失的氨基酸序列。
对第317位(EU编号第434位)的Asn的取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Ala。
(xix)
本发明中,作为铰链区的异质性得到改善和/或与Fcγ受体的结合活性下降的IgG2的优选方式,有下述IgG2。
抗体,该抗体在具有包含SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列的恒定区的IgG2中,第209位的Ala、第210位的Pro、第218位的Thr、第14位的Cys、第16位的Arg、第102位的Cys、第20位的Glu和第21位的Ser被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选第209位(EU编号第330位)的Ala取代成Ser、第210位(EU编号第331位)的Pro取代成Ser、第218位(EU编号第339位)的Thr取代成Ala、第14位(EU编号第131位)的Cys取代成Ser、第16位(EU编号第133位)的Arg取代成Lys、第102位(EU编号第219位)的Cys取代成Ser、第20位(EU编号第137位)的Glu取代成Gly、第21位(EU编号第138位)的Ser取代成Gly。
这样的IgG2恒定区的例子有:具有SEQ ID NO:191(M86)的氨基酸序列的IgG2恒定区。
本发明的IgG2恒定区的另一优选方式为:在上述IgG2恒定区中,进一步缺失第325位的Gly和第326位的Lys以降低C末端的异质性的IgG2恒定区。这样的抗体的例子有:具有包含SEQ ID NO:192(M86ΔGK)的氨基酸序列的恒定区的IgG2。
(xx)
本发明中,作为铰链区的异质性得到改善的IgG2恒定区的优选方式,还可以列举下述IgG2恒定区。
在具有SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区中,第14位的Cys、第16位的Arg、第102位的Cys、第20位的Glu、第21位的Ser被取代成其他氨基酸的IgG2恒定区。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选第14位(EU编号第131位)的Cys取代成Ser、第16位(EU编号第133位)的Arg取代成Lys、第102位(EU编号第219位)的Cys取代成Ser、第20位(EU编号第137位)的Glu取代成Gly、第21位(EU编号第138位)的Ser取代成Gly。
这样的IgG2恒定区的例子有:具有SEQ ID NO:193(M40)的氨基酸序列的IgG2恒定区。
作为本发明的IgG2恒定区的另一优选方式,可以列举:在上述IgG2恒定区中进一步缺失第325位的Gly和第326位的Lys的IgG2恒定区。这样的抗体的例子有:具有SEQ ID NO:194(M40ΔGK)的氨基酸序列的IgG2恒定区。
(xxi)M14ΔGK、M17ΔGK、M11ΔGK、M31ΔGK、M58、M73、M83、M86ΔGK、M40ΔGK
本发明还提供具有SEQ ID NO:24记载的氨基酸序列的抗体恒定区(M14ΔGK)。本发明还提供具有SEQ ID NO:116记载的氨基酸序列的抗体恒定区(M17ΔGK)。本发明还提供具有SEQ ID NO:25记载的氨基酸序列的抗体恒定区(M11ΔGK)。本发明还提供具有SEQ ID NO:118记载的氨基酸序列的抗体恒定区(M31ΔGK)。本发明还提供具有SEQ ID NO:151记载的氨基酸序列的抗体恒定区(M58)。本发明还提供具有SEQ ID NO:153记载的氨基酸序列的抗体恒定区(M73)。本发明还提供具有SEQ ID NO:164记载的氨基酸序列的抗体恒定区(M83)。本发明还提供具有SEQ ID NO:192记载的氨基酸序列的抗体恒定区(M86ΔGK)。本发明还提供具有SEQ ID NO:194记载的氨基酸序列的抗体恒定区(M40ΔGK)。上述抗体恒定区具有与Fcγ受体的结合活性降低、免疫原性风险降低、酸性条件下的稳定性提高、异质性降低、血浆中滞留性提高和/或与IgG1恒定区相比在制剂中的稳定性高的性质,是最优化的抗体恒定区。
本发明提供包含上述(i)~(xxi)中任一项所述的抗体恒定区的抗体。只要具有上述抗体恒定区即可,对抗原种类、抗体的来源等没有限定,可以是任何抗体。优选的抗体的例子有:与IL-6受体结合的抗体。其他优选的抗体的例子有:人源化抗体。这样的抗体的例子有:具有人源化PM-1抗体的可变区的抗体。可以对人源化PM-1抗体的可变区进行上述氨基酸取代,还可以进行其他氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入。具体的取代例子有:提高上述(a)~(y)的亲和性的修饰、降低(i)~(viii)的等电点的修饰、提高后述(α)~(ζ)的稳定性的修饰、降低免疫原性的修饰,但并不限于这些。
这样的抗体的一个方式为:包含具有SEQ ID NO:113记载的氨基酸序列(PF_1+M14ΔGK)的重链可变区和具有SEQ ID NO:23记载的氨基酸序列(PF1_L)的轻链可变区的抗体(PF1)(轻链恒定区可以是κ,也可以是λ,还可以是它们的修饰体),但并不限于此。
另外,上述抗体恒定区和/或包含上述抗体恒定区的抗体分子还可以与抗体样结合分子(支架分子)、生理活性肽、结合肽等以Fc融合分子的形式结合。
本发明的抗体,除实施例记载的方法外,还可如下取得。在取得本发明抗体的一个方式中,首先,在选自本领域技术人员公知的抗IL-6受体抗体的CDR区、FR区和恒定区的至少一个区中,将1个或多个氨基酸残基取代成其他目标氨基酸。对本领域技术人员公知的抗IL-6受体抗体的取得方法没有限定。作为在选自CDR区、FR区和恒定区的至少一个区中将1个或多个氨基酸残基取代成其他目标氨基酸的方法,例如有位点特异性诱变法(Hashimoto-Gotoh,T.,Mizuno,T.,Ogasahara,Y.,and Nakagawa,M.An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis(寡脱氧核糖核苷酸定向双琥珀色法位点定向诱变).Gene(1995)152,271-275;Zoller,M.J.,and Smith,M.Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragmentscloned into M13 vectors(DNA片段克隆到M13载体的寡聚核苷酸定向诱变).Methods Enzymol.(1983)100,468-500;Kramer,W.,Drutsa,V.,Jansen,H.W.,Kramer,B.,Pflugfelder,M.,and Fritz,H.J.(1984).Thegapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutationconstruction(带缺口的双链体DNA接近于寡聚核苷酸定向突变结构).Nucleic Acids Res.12,9441-9456;Kramer W.,and Fritz H.J.(1987).Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplexDNA Methods(经由带缺口的双链体DNA法突变的寡聚核苷酸定向结构).Enzymol.154,350-367;Kunkel,T.A.(1985)Rapid and efficientsite-specifc mutagenesis without phenotypic selection(无表型筛选的迅速及高效的位点特异性诱变法).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,488-492).利用该方法可以将抗体所期望的氨基酸取代成其他目标氨基酸。作为取代成其他氨基酸的方法,通过使用构架改组(Mol Immunol.2007 Apr;44(11):3049-60)和CDR修复(US2006/0122377)等文库技术,可以对适当的构架和CDR进行氨基酸取代。
作为用于取得抗体的另一方式,首先,按照本领域技术人员公知的方法得到与IL-6受体结合的抗体。当取得的抗体为非人动物抗体时,还可以将其人源化。之后,按照本领域技术人员公知的方法判定所取得的抗体是否具有中和活性。抗体的结合活性或中和活性可以按照实施例中记载的方法进行测定,但并不限于该方法。之后,将选自抗体的CDR区、FR区和恒定区的至少1区中的1个或多个氨基酸残基取代成其他目标氨基酸。
更具体而言,本发明涉及包括下述步骤(a)和(b)的抗体的制造方法,所述抗体的中和活性增强、结合活性增强、稳定性提高或免疫原性降低。
(a)使编码H链的DNA和编码L链的DNA表达的步骤,所述H链中选自CDR区、FR区和恒定区的至少1区中的1个或多个氨基酸残基被取代成其他目标氨基酸,所述L链中选自CDR区和FR区的至少1区中的1个或多个氨基酸残基被取代成其他目标氨基酸。
(b)回收步骤(a)的表达产物的步骤。
在本发明的制造方法中,首先,使编码抗IL-6受体抗体突变体的H链的DNA、即编码选自CDR区、FR区和恒定区的至少1区中的1个或多个氨基酸残基被取代成其他目标氨基酸的H链的DNA、以及编码抗IL-6受体抗体L链的DNA、即编码选自CDR区和FR区的至少1区中的1个或多个氨基酸残基被取代成其他目标氨基酸的L链的DNA表达。编码选自CDR区、FR区和恒定区的至少1区中的1个或多个氨基酸残基被取代成其他目标氨基酸的H链的DNA例如可以通过取得编码野生型H链的DNA的CDR区、FR区或恒定区部分,之后导入适当的取代,使编码选自该CDR区、FR区和恒定区的至少1区中的特定氨基酸的密码子编码其他目标氨基酸而得到。至于编码选自CDR区和FR区的至少1区中的1个或多个氨基酸残基被取代成其他目标氨基酸的L链的DNA,例如可以通过取得编码野生型L链的DNA的CDR区和/或FR区,之后导入适当的取代,使编码该CDR区、FR区中的特定氨基酸的密码子编码其他目标氨基酸而得到。
首先,设计编码选自野生型H链的CDR区、FR区和恒定区的至少1区中的1个或多个氨基酸残基被取代成其他目标氨基酸的蛋白的DNA,化学合成该DNA,从而也可以得到编码选自CDR区、FR区和恒定区的至少1区中的1个或多个氨基酸残基被取代成其他目标氨基酸的H链的DNA。关于L链,也设计编码野生型L链的CDR区和/或FR区的1个或多个氨基酸残基被取代成其他目标氨基酸的蛋白的DNA,化学合成该DNA,从而也可以得到编码CDR区和/或FR区的1个或多个氨基酸残基被取代成其他目标氨基酸的L链的DNA。
作为氨基酸取代的种类,并不限于此,有本说明书中记载的取代。
另外,编码在选自CDR区、FR区和恒定区的至少1区中1个或多个氨基酸残基被取代成其他目标氨基酸的H链的DNA可以分成部分DNA来制造。作为部分DNA的组合,例如有:编码可变区的DNA与编码恒定区的DNA、或者编码Fab区的DNA与编码Fc区的DNA等,但并不限于这些组合。编码L链的DNA也同样可以分成部分DNA来制造。
作为使上述DNA表达的方法,例举下述方法。例如,将编码H链可变区的DNA与编码H链恒定区的DNA同时整合到表达载体中,构建H链表达载体。同样,将编码L链可变区的DNA与编码L链恒定区的DNA同时整合到表达载体中,构建L链表达载体。这些H链和L链的基因也可以整合到同一载体中。作为表达载体,例如可以使用SV40病毒载体(SV40 virus-based vectors)、EB病毒载体(EBvirus-based vectors)和BPV(乳头瘤病毒)载体(BPV(papillomavirus)-based vectors)等,但并不限于这些。
利用按照上述方法制作的抗体表达载体共转化宿主细胞。作为宿主细胞,除CHO细胞(中国仓鼠卵巢)等上述细胞外,还可使用大肠杆菌、酵母或枯草杆菌等微生物或动植物个体(Nature Biotechnology 25,563-565(2007);Nature Biotechnology 16,773-777(1998);Biochemicaland Biophysical Research Communications 255,444-450(1999);NatureBiotechnology 23,1159-1169(2005);Journal of Virology 75,2803-2809(2001);Biochemical and Biophysical Research Communications 308,94-100(2003))。进行转化时优选采用脂质转染法(R.W.Malone等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6077(1989);P.L.Felgner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413(1987))、电穿孔法、磷酸钙法(F.L.Graham & A.J.van der Eb,Virology 52,456-467(1973))、DEAE-葡聚糖法等。
制造抗体时,接下来,回收步骤(a)中得到的表达产物。表达产物的回收例如可以通过在培养转化体后,从转化体的细胞内或培养液中分离表达产物来进行。在抗体的分离、纯化中可以适当组合离心、硫酸铵分级分离、盐析、超滤、lq、FcRn、蛋白A、蛋白G柱、亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法来进行。
需要说明的是,对于本发明的恒定区,本领域技术人员可以按照抗体的取得方法适当进行制备。
本发明还涉及增强抗IL-6受体抗体与IL-6受体的结合活性或中和活性的方法,该方法包括选自下述步骤(A)~(X)的至少1个步骤:
(A)将SEQ ID NO:1记载的氨基酸序列(HCDR1)中第1位的Ser取代成其他氨基酸的步骤;
(B)将SEQ ID NO:1记载的氨基酸序列(HCDR1)中第5位的Trp取代成其他氨基酸的步骤;
(C)将SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列(HCDR2)中第1位的Tyr取代成其他氨基酸的步骤;
(D)将SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列(HCDR2)中第8位的Thr取代成其他氨基酸的步骤;
(E)将SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列(HCDR2)中第9位的Thr取代成其他氨基酸的步骤;
(F)将SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第1位的Ser取代成其他氨基酸的步骤;
(G)将SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第2位的Leu取代成其他氨基酸的步骤;
(H)将SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第5位的Thr取代成其他氨基酸的步骤;
(I)将SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第7位的Ala取代成其他氨基酸的步骤;
(J)将SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第8位的Met取代成其他氨基酸的步骤;
(K)将SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第1位的Ser 和第5位的Thr取代成其他氨基酸的步骤;
(L)将SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第2位的Leu、第7位的Ala和第8位的Met取代成其他氨基酸的步骤;
(M)将SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列(LCDR1)中第1位的Arg取代成其他氨基酸的步骤;
(N)将SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列(LCDR1)中第4位的Gln取代成其他氨基酸的步骤;
(O)将SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列(LCDR1)中第9位的Tyr取代成其他氨基酸的步骤;
(P)将SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列(LCDR1)中第11位的Asn取代成其他氨基酸的步骤;
(Q)将SEQ ID NO:5记载的氨基酸序列(LCDR2)中第2位的Thr取代成其他氨基酸的步骤;
(R)将SEQ ID NO:6记载的氨基酸序列(LCDR3)中第1位的Gln取代成其他氨基酸的步骤;
(S)将SEQ ID NO:6记载的氨基酸序列(LCDR3)中第3位的Gly取代成其他氨基酸的步骤;
(T)将SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列(LCDR1)中第9位的Tyr取代成其他氨基酸的步骤和将SEQ ID NO:6记载的氨基酸序列(LCDR3)中第3位的Gly取代成其他氨基酸的步骤;
(U)将SEQ ID NO:6记载的氨基酸序列(LCDR3)中第5位的Thr取代成其他氨基酸的步骤;
(V)将SEQ ID NO:6记载的氨基酸序列(LCDR3)中第1位的Gln和第5位的Thr取代成其他氨基酸的步骤;
(W)将SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列(HCDR2)中第9位的Thr取代成其他氨基酸的步骤、以及将SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第1位的Ser和第5位的Thr取代成其他氨基酸的步骤;
(X)(V)和(W)所述的步骤。
上述(A)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要亲和性提高即可,但优选取代成Trp、Thr、Asp、Asn、Arg、Val、Phe、Ala、Gln、Tyr、Leu、His、Glu或Cys。
上述(B)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要亲和性提高即可,但优选取代成Ile或Val。
上述(C)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要亲和性提高即可,但优选取代成Phe。
上述(D)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要亲和性提高即可,但优选取代成Arg。
上述(E)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要亲和性提高即可,但优选取代成Ser或Asn。
上述(F)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要亲和性提高即可,但优选取代成Ile、Val、Thr或Leu。
上述(G)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要亲和性提高即可,但优选取代成Thr。
上述(H)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要亲和性提高即可,但优选取代成Ala、Ile或Ser。其他优选的取代有:第5位的Thr取代成Ser。
上述(I)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要亲和性提高即可,但优选取代成Ser或Val。
上述(J)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要亲和性提高即可,但优选取代成Leu。
上述(K)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要亲和性提高即可,但优选第1位的Ser取代成Leu、第5位的Thr取代成Ala。其他优选的取代的例子有:第1位的Ser取代成Val和第5位的Thr取代成Ala;第1位的Ser取代成Ile和第5位的Thr取代成Ala;第1位的Ser取代成Thr和第5位的Thr取代成Ala;第1位的Ser取代成Val和第5位的Thr取代成Ile;第1位的Ser取代成Ile和第5位的 Thr取代成Ile;第1位的Ser取代成Thr和第5位的Thr取代成Ile;或第1位的Ser取代成Leu和第5位的Thr取代成Ile。
上述(L)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要亲和性提高即可,但优选第2位的Leu取代成Thr、第7位的Ala取代成Val、第8位的Met取代成Leu。
上述(M)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要亲和性提高即可,但优选取代成Phe。
上述(N)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要亲和性提高即可,但优选取代成Arg或Thr。
上述(O)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要亲和性提高即可,但优选取代成Phe。
上述(P)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要亲和性提高即可,但优选取代成Ser。
上述(Q)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要亲和性提高即可,但优选取代成Gly。
上述(R)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要亲和性提高即可,但优选取代成Gly、Asn或Ser。
上述(S)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要亲和性提高即可,但优选取代成Ser。
上述(T)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要亲和性提高即可,但优选SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列(LCDR1)的Tyr取代成Phe、SEQ ID NO:6记载的氨基酸序列(LCDR3)的Gly取代成Ser。
上述(U)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要亲和性提高即可,但优选取代成Arg或Ser。
上述(V)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要亲和性提高即可,但优选第1位的Gln取代成Gly、第5位的Thr取代成Ser。其他优选的取代的例子有:第1位的Gln取代成Gly和第5位的Thr取代成Arg。
上述(W)中,优选SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列(HCDR2)的第9位的Thr取代成Asn。SEQ ID NO:3记载的氨基酸序列(HCDR3)的第1位的Ser和第5位的Thr取代后的氨基酸的优选组合有:Leu和Ala、Val和Ala、Ile和Ala、Thr和Ala、Val和Ile、Ile和Ile、Thr和Ile、或Leu和Ile。
在上述步骤(A)~(X)中,对进行氨基酸取代的方法没有特别限定,例如可以按照上述位点特异性诱变法或实施例中记载的方法进行。对重链可变区进行氨基酸取代时,取代前的原重链可变区的氨基酸序列优选为人源化PM-1的重链可变区的氨基酸序列。对轻链可变区进行氨基酸取代时,取代前的原轻链可变区的氨基酸序列优选为人源化PM-1的轻链可变区的氨基酸序列。另外,优选对人源化PM-1抗体进行上述步骤(A)~(X)中记载的氨基酸取代。
本发明的增强抗IL-6受体抗体的结合活性或中和活性的方法,只要至少包括上述(A)~(X)中任一项所述的步骤即可。即,本发明的方法可以包括上述(A)~(X)中任一项所述的步骤中2个以上的步骤。并且,只要包括上述(A)~(X)中任一项所述的步骤即可,还可以包括其他步骤(例如上述(A)~(X)以外的氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等)。例如,可以进行FR的氨基酸序列的取代、缺失、添加和/或插入等,还可以进行恒定区的氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等。优选对人源化PM-1抗体进行上述氨基酸取代。
<降低抗il-6受体抗体的免疫原性风险的方法>
本发明还涉及降低抗IL-6受体抗体的免疫原性的方法,该方法包括将SEQ ID NO:5记载的氨基酸序列(LCDR2)中第2位的Thr取代成Gly的步骤。本发明的降低抗IL-6受体抗体的免疫原性的方法只要包括将SEQ ID NO:5记载的氨基酸序列(LCDR2)中第2位的Thr取代成Gly的步骤即可,还可以包括其他氨基酸取代。对氨基酸取代的方法没有特别限定,例如可以通过上述位点特异性诱变法或实施例中记载的方法来进行。
优选对人源化PM-1抗体或其修饰(取代、缺失、插入)体进行上述氨基酸取代。
<降低抗il-6受体抗体的等电点的方法>
本发明还涉及降低抗IL-6受体抗体的等电点的方法,该方法包括选自下述(i)~(xv)的至少一个步骤。
(i)将SEQ ID NO:7记载的氨基酸序列(HFR1)中第16位的Gln取代成其他氨基酸的步骤;
(ii)将SEQ ID NO:8记载的氨基酸序列(HFR2)中第8位的Arg取代成其他氨基酸的步骤;
(iii)将SEQ ID NO:9记载的氨基酸序列(HFR3)中第16位的Arg取代成其他氨基酸的步骤;
(iv)将SEQ ID NO:10记载的氨基酸序列(HFR4)中第3位的Gln取代成其他氨基酸的步骤;
(v)将SEQ ID NO:11记载的氨基酸序列(LFR1)中第18位的Arg取代成其他氨基酸的步骤;
(vi)将SEQ ID NO:12记载的氨基酸序列(LFR2)中第11位的Lys取代成其他氨基酸的步骤;
(vii)将SEQ ID NO:13记载的氨基酸序列(LFR3)中第23位的Gln取代成其他氨基酸的步骤;
(viii)将SEQ ID NO:14记载的氨基酸序列(LFR4)中第10位的Lys取代成其他氨基酸的步骤;
(ix)将SEQ ID NO:1记载的氨基酸序列(HCDR1)中第1位的Ser取代成其他氨基酸的步骤;
(x)将SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列(LCDR1)中第1位的Arg取代成其他氨基酸的步骤;
(xi)将SEQ ID NO:5记载的氨基酸序列(LCDR2)中第4位的Arg取代成其他氨基酸的步骤;
(xii)将SEQ ID NO:7记载的氨基酸序列(HFR1)中第13位的Arg取代成其他氨基酸的步骤;
(xiii)将SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列(HFR1)或SEQ ID NO:100记载的氨基酸序列中第15位的Lys和/或第16位的Ser取代成其他氨基酸的步骤;
(xiv)将SEQ ID NO:4记载的氨基酸序列(LCDR1)或SEQ ID NO:101记载的氨基酸序列中第4位的Gln取代成其他氨基酸的步骤;
(xv)将SEQ ID NO:5记载的氨基酸序列(LCDR2)或SEQ ID NO:103记载的氨基酸序列中第6位的His取代成其他氨基酸的步骤;
上述(i)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要等电点降低即可,但优选取代成Glu。
上述(ii)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要等电点降低即可,但优选取代成Glu。
上述(iii)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要等电点降低即可,但优选取代成Lys。
上述(iv)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要等电点降低即可,但优选取代成Glu。
上述(v)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要等电点降低即可,但优选取代成Ser。
上述(vi)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要等电点降低即可,但优选取代成Glu。
上述(vii)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要等电点降低即可,但优选取代成Glu。
上述(viii)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要等电点降低即可,但优选取代成Glu。
上述(ix)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要等电点降低即可,但优选取代成Asp。
上述(x)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要等电点降低即可,但优选取代成Gln。
上述(xi)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要等电点降低即可,但优选取代成Glu。
上述(xii)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要等电点降低即可,但优选取代成Lys。
上述(xiii)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要等电点降低即可,但优选第15位的Lys取代成Gln、第16位的Ser取代成Asp。
上述(xiv)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要等电点降低即可,但优选取代成Glu。
上述(xv)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要等电点降低即可,但优选取代成Glu。
在上述步骤(i)~(xv)中,对氨基酸取代的方法没有特别限定,例如可以按照上述位点特异性诱变法或实施例中记载的方法进行。对重链可变区进行氨基酸取代时,取代前的原重链可变区的氨基酸序列优选为人源化PM-1的重链可变区的氨基酸序列。对轻链可变区进行氨基酸取代时,取代前的原轻链可变区的氨基酸序列优选为人源化PM-1的轻链可变区的氨基酸序列。另外,优选对人源化PM-1抗体进行上述步骤(i)~(xv)中记载的氨基酸取代。
本发明的降低抗IL-6受体抗体等电点的方法,只要至少包括上述(i)~(xv)中任一项所述的步骤即可。即,本发明的方法可以包括上述(i)~(xv)所述的步骤中2个以上的步骤。并且,只要包括上述(i)~(xv)中任一项所述的步骤即可,还可以包括其他步骤(例如上述(i)~(xv)以外的氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等)。例如还可以进行恒定区的氨基酸序列的取代、缺失、添加和/或插入等。
<提高抗il-6受体抗体稳定性的方法>
本发明还涉及提高抗IL-6受体抗体稳定性的方法,该方法包括选自下述(α)~(ζ)的至少一个步骤。
(α)将SEQ ID NO:9记载的氨基酸序列(HFR3)中第4位的Met取代成其他氨基酸的步骤;
(β)将SEQ ID NO:9记载的氨基酸序列(HFR3)中第5位的Leu取代成其他氨基酸的步骤;
(γ)将SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列(HCDR2)中第9位的Thr取代成其他氨基酸的步骤;
(δ)将SEQ ID NO:6记载的氨基酸序列(LCDR3)中第5位的Thr取代成其他氨基酸的步骤;
(ε)将SEQ ID NO:2记载的氨基酸序列(HCDR2)中第16位的Ser取代成其他氨基酸的步骤;
(ζ)将SEQ ID NO:10记载的氨基酸序列(FR4)中第5位的Ser取代成其他氨基酸的步骤。
上述(α)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要稳定性提高即可,但优选取代成Ile。
上述(β)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要稳定性提高即可,但优选取代成Ser。
上述(γ)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要稳定性提高即可,但优选取代成Asn。
上述(δ)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要稳定性提高即可,但优选取代成Ser。
上述(ε)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要稳定性提高即可,但优选取代成Gly。
上述(ζ)中,对取代后的氨基酸没有特别限定,只要稳定性提高即可,但优选取代成Ile。
在上述步骤(α)~(ζ)中,对氨基酸取代的方法没有特别限定,例如可以按照上述位点特异性诱变法或实施例中记载的方法进行。对重链可变区进行氨基酸取代时,取代前的原重链可变区的氨基酸序列优选为人源化PM-1的重链可变区的氨基酸序列。对轻链可变区进行氨基酸取代时,取代前的原轻链可变区的氨基酸序列优选为人源化PM-1的轻链可变区的氨基酸序列。另外,优选对人源化PM-1抗体进行上述步骤(α)~(ζ)的氨基酸取代。
本发明的提高抗IL-6受体抗体稳定性的方法,只要至少包括上述(α)~(ζ)中任一项所述的步骤即可。即,本发明的方法可以包括上述(α)~(ζ)所述的步骤中2个以上的步骤。并且,只要包括上述(α)~(ζ)中任一项所述的步骤即可,还可以包括其他步骤(例如上述(α)~(ζ)以外的氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等)。例如可以进行恒定区的氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等。
<降低抗il-6受体抗体的免疫原性的方法>
本发明还涉及降低抗IL-6受体抗体、特别是人源化PM-1抗体的免疫原性的方法,该方法包括:将SEQ ID NO:7记载的氨基酸序列(HFR1)中第13位的Arg取代成Lys、第16位的Gln取代成Glu、第23位的Thr取代成Ala和/或第30位的Thr取代成Ser的步骤。本发明的降低抗IL-6受体抗体的免疫原性的方法只要包括将SEQ ID NO:7记载的氨基酸序列(HFR1)中第30位的Thr取代成Ser的步骤即可,还可以包括其他氨基酸取代。
本发明还涉及降低抗IL-6受体抗体、特别是人源化PM-1抗体的免疫原性的方法,该方法包括:将SEQ ID NO:90记载的氨基酸序列(HFR3)中第27位的Ala取代成Val的步骤。本发明的降低抗IL-6受体抗体的免疫原性的方法只要包括将SEQ ID NO:90记载的氨基酸序列(HFR3)中第27位的Ala取代成Val的步骤即可,还可以包括其他氨基酸取代。
对氨基酸取代的方法没有特别限定,例如可以按照上述位点特异性诱变法或实施例中记载的方法进行。
本发明还涉及通过将抗IL-6受体抗体、特别是人源化PM-1抗体、H53/L28或PF1抗体的FR3转换成具有SEQ ID NO:128或SEQ ID NO: 129的氨基酸序列的FR3来降低抗体免疫原性的方法。
<提高抗体在酸性条件下的稳定性的方法>
本发明还涉及提高抗体在酸性条件下的稳定性的方法,该方法包括:将SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列(IgG2)中第276位(EU编号第397位)的Met取代成其他氨基酸的步骤。本发明的提高抗体在酸性条件下的稳定性的方法只要包括将SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列(IgG2)中第276位(EU编号第397位)的Met取代成其他氨基酸的步骤即可,还可以包括其他氨基酸取代。对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Val。对氨基酸取代的方法没有特别限定,例如可以按照上述位点特异性诱变法或实施例中记载的方法进行。
对作为对象的抗体没有特别限定,但优选为抗人IL-6受体抗体,进一步优选为人源化PM-1抗体或其修饰(取代、缺失、插入)体。
<改善来自igg2恒定区铰链部分的异质性的方法>
本发明还涉及改善抗体异质性的方法,该方法包括将SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列(IgG2)中第14位(EU编号第131位)的Cys取代成其他氨基酸的步骤、将第16位(EU编号第133位)的Arg取代成其他氨基酸的步骤、和/或将第102位(EU编号第219位)的Cys取代成其他氨基酸的步骤。对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选第14位的Cys取代成Ser、第16位的Arg取代成Lys、第102位的Cys取代成Ser。本发明的改善抗体异质性的方法只要包括对SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列(IgG2)中第14位(EU编号第131位)的Cys进行取代的步骤、对16位(EU编号第133位)的Arg进行取代的步骤、和/或对第102位(EU编号第219位)的Cys进行取代的步骤即可,还可以包括其他氨基酸取代。对氨基酸取代的方法没有特别限定,例如可以按照上述位点特异性诱变法或实施例中记载的方法进行。被取代的氨基酸可以是上述3个氨基酸均被取代,也可以是1个或2个(例如第14 位和第102位等)氨基酸被取代。
对作为对象的抗体没有特别限定,但优选为抗人IL-6受体抗体,进一步优选为人源化PM-1抗体或其修饰(取代、缺失、插入)体。
<降低来自igg2恒定区的c末端氨基酸缺失的异质性的方法>
本发明还涉及改善抗体异质性的方法,该方法包括:使具有SEQID NO:20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区中第325位(EU编号第446位)的Gly和第326位(EU编号第447位)的Lys缺失的步骤。本发明的改善抗体异质性的方法只要包括使具有SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区中第325位(EU编号第446位)的Gly和第326位(EU编号第447位)的Lys缺失的步骤即可,还可以包括其他氨基酸取代。对氨基酸取代的方法没有特别限定,例如可以按照上述位点特异性诱变法或实施例中记载的方法进行。
对作为对象的抗体没有特别限定,但优选为抗人IL-6受体抗体,进一步优选为人源化PM-1抗体或其修饰(取代、缺失、插入)体。
<在维持igg2恒定区的人序列不变的情况下降低与fcγr结合的方法>
本发明还涉及降低抗体与FcγR结合的方法,该方法包括:将具有SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区中第209位(EU330)的Ala取代成Ser的步骤、将第210位(EU331)的Pro取代成Ser的步骤、以及将第218位(EU339)的Thr取代成Ala的步骤。本发明的降低抗体与FcγR结合的方法只要包括将具有SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区中第209位(EU330)的Ala取代成Ser的步骤、将第210位(EU331)的Pro取代成Ser的步骤、以及将第218位(EU339)的Thr取代成Ala的步骤即可,还可以包括其他氨基酸取代。对氨基酸取代的方法没有特别限定,例如可以按照上述位点特异性诱变法或实施例中记载的方法进行。
<通过取代igg2恒定区的氨基酸来提高血浆中滞留性的方法>
本发明还涉及提高抗体的血浆中滞留性的方法,该方法包括:将具有SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区中第147位(EU268)的His、第234位(EU355)的Arg和/或第298位(EU419)的Gln取代成其他氨基酸的步骤。本发明的提高抗体的血浆中滞留性的方法只要包括上述步骤即可,还可以包括其他氨基酸取代。对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选第147位(EU268)的His取代成Gln、第234位(EU355)的Arg取代成Gln、第298位(EU419)的Gln取代成Glu。
本发明还涉及提高抗体的血浆中滞留性的方法,该方法包括:将具有SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:151(M58)的氨基酸序列的IgG2恒定区中第313位(EU434)的Asn取代成其他氨基酸的步骤。对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Ala。本发明的提高抗体的血浆中滞留性的方法只要包括上述步骤即可,还可以包括其他氨基酸取代。
对作为对象的抗体没有特别限定,但优选为抗人IL-6受体抗体,进一步优选为人源化PM-1抗体或其修饰(取代、缺失、插入)体。
本发明还涉及降低抗体的来自IgG2铰链部分的异质性的方法、提高抗体在酸性条件下的稳定性的方法、降低抗体的来自C末端异质性的方法、和/或降低抗体与FcγR结合的方法(M14ΔGK),上述方法均包括对具有SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区进行下述(a)~(j)的步骤:
(a)将SEQ ID NO:20的第209位(EU编号第330位)的Ala取代成Ser的步骤;
(b)将SEQ ID NO:20的第210位(EU编号第331位)的Pro取代成Ser的步骤;
(c)将SEQ ID NO:20的第218位(EU编号第339位)的Thr取代成Ala的步骤;
(d)将SEQ ID NO:20的第276位(EU编号第397位)的Met取代成Val的步骤;
(e)将SEQ ID NO:20的第14位(EU编号第131位)的Cys取代成Ser的步骤;
(f)将SEQ ID NO:20的第16位(EU编号第133位)的Arg取代成Lys的步骤;
(g)将SEQ ID NO:20的第102位(EU编号第219位)的Cys取代成Ser的步骤;
(h)将SEQ ID NO:20的第20位(EU编号第137位)的Glu取代成Gly的步骤;
(i)将SEQ ID NO:20的第21位(EU编号第138位)的Ser取代成Gly的步骤;以及
(j)使SEQ ID NO:20的第325位的Gly和第326位的Lys(分别为EU编号第446位和第447位)缺失的步骤。
本发明的方法只要包括上述步骤即可,还可以包括其他氨基酸取代和缺失的其他步骤。对氨基酸的取代和缺失的方法没有特别限定,例如可以按照上述位点特异性诱变法或实施例中记载的方法进行。
对作为对象的抗体没有特别限定,但优选为抗人IL-6受体抗体,进一步优选为人源化PM-1抗体或其修饰(取代、缺失、插入)体。
本发明还涉及降低抗体的来自IgG2铰链部分的异质性的方法、提高抗体在酸性条件下的稳定性的方法、和/或降低抗体的来自C末端的异质性的方法(M31ΔGK),上述方法均包括对具有SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区进行下述(a)~(g)的步骤:
(a)将SEQ ID NO:20的第276位(EU编号第397位)的Met取代成Val的步骤;
(b)将SEQ ID NO:20的第14位(EU编号第131位)的Cys取代成Ser的步骤;
(c)将SEQ ID NO:20的第16位(EU编号第133位)的Arg取代成Lys的步骤;
(d)将SEQ ID NO:20的第102位(EU编号第219位)的Cys取代成Ser的步骤;
(e)将SEQ ID NO:20的第20位(EU编号第137位)的Glu取代成Gly的步骤;
(f)将SEQ ID NO:20的第21位(EU编号第138位)的Ser取代成Gly的步骤;以及
(g)使SEQ ID NO:20的第325位的Gly和第326位的Lys(分别为EU编号第446位和第447位)缺失的步骤。
本发明还涉及降低抗体的来自IgG2铰链部分的异质性的方法、提高抗体的血浆中滞留性的方法、和/或降低抗体的来自C末端的异质性的方法(M58),上述方法均包括对具有SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区进行下述(a)~(i)的步骤:
(a)将SEQ ID NO:20的第14位(EU编号第131位)的Cys取代成Ser的步骤;
(b)将SEQ ID NO:20的第16位(EU编号第133位)的Arg取代成Lys的步骤;
(c)将SEQ ID NO:20的第102位(EU编号第219位)的Cys取代成Ser的步骤;
(d)将SEQ ID NO:20的第20位(EU编号第137位)的Glu取代成Gly的步骤;
(e)将SEQ ID NO:20的第21位(EU编号第138位)的Ser取代成Gly的步骤;
(f)将SEQ ID NO:20的第147位(EU编号第268位)的His取代成Gln的步骤;
(g)将SEQ ID NO:20的第234位(EU编号第355位)的Arg取代成Gln的步骤;
(h)将SEQ ID NO:20的第298位(EU编号第419位)的Gln取代成Glu的步骤;以及
(i)使SEQ ID NO:20的第325位的Gly和第326位的Lys(分别为EU编号第446位和第447位)缺失的步骤。
本发明还涉及降低抗体的来自IgG2铰链部分的异质性的方法、提高抗体的血浆中滞留性的方法、和/或降低抗体的来自C末端的异质性的方法(M73),上述方法均包括对具有SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区进行下述(a)~(j)的步骤:
(a)将SEQ ID NO:20的第14位(EU编号第131位)的Cys取代成Ser的步骤;
(b)将SEQ ID NO:20的第16位(EU编号第133位)的Arg取代成Lys的步骤;
(c)将SEQ ID NO:20的第102位(EU编号第219位)的Cys取代成Ser的步骤;
(d)将SEQ ID NO:20的第20位(EU编号第137位)的Glu取代成Gly的步骤;
(e)将SEQ ID NO:20的第21位(EU编号第138位)的Ser取代成Gly的步骤;
(f)将SEQ ID NO:20的第147位(EU编号第268位)的His取代成Gln的步骤;
(g)将SEQ ID NO:20的第234位(EU编号第355位)的Arg取代成Gln的步骤;
(h)将SEQ ID NO:20的第298位(EU编号第419位)的Gln取代成Glu的步骤;
(i)将SEQ ID NO:20的第313位(EU编号第434位)的Asn取代成Ala的步骤;以及
(j)使SEQ ID NO:20的第325位的Gly和第326位的Lys(分别为EU编号第446位和第447位)缺失的步骤。
本发明还涉及降低抗体的来自IgG2铰链部分的异质性的方法、降低抗体的来自C末端的异质性的方法、和/或降低抗体与FcγR结合的方法(M86ΔGK),上述方法均包括对具有SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区进行下述(a)~(i)步骤:
(a)将SEQ ID NO:20的第209位(EU编号第330位)的Ala取代成其他氨基酸的步骤;
(b)将SEQ ID NO:20的第210位(EU编号第331位)的Pro取代成其他氨基酸的步骤;
(c)将SEQ ID NO:20的第218位(EU编号第339位)的Thr取代成其他氨基酸的步骤;
(d)将SEQ ID NO:20的第14位(EU编号第131位)的Cys取代成其他氨基酸的步骤;
(e)将SEQ ID NO:20的第16位(EU编号第133位)的Arg取代成其他氨基酸的步骤;
(f)将SEQ ID NO:20的第102位(EU编号第219位)的Cys取代成其他氨基酸的步骤;
(g)将SEQ ID NO:20的第20位(EU编号第137位)的Glu取代成其他氨基酸的步骤;
(h)将SEQ ID NO:20的第21位(EU编号第138位)的Ser取代成其他氨基酸的步骤;以及
(i)使SEQ ID NO:20的第325位的Gly和第326位的Lys(分别为EU编号第446位和第447位)缺失的步骤。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选第209位(EU编号第330位)的Ala取代成Ser、第210位(EU编号第331位)的Pro取代成Ser、第218位(EU编号第339位)的Thr取代成Ala、第14位(EU编号第131位)的Cys取代成Ser、第16位(EU编号第133位)的Arg取代成Lys、第102位(EU编号第219位)的Cys取代成Ser、第20位(EU编号第137位)的Glu取代成Gly、第21位(EU编号第138位)的Ser取代成Gly。
本发明还涉及降低抗体的来自IgG2铰链部分的异质性的方法、和/或降低抗体的来自C末端的异质性的方法(M40ΔGK),上述方法均包括对具有SEQ ID NO:20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区进行下述(a)~(f)的步骤:
(a)将SEQ ID NO:20的第14位(EU编号第131位)的Cys取代成其他氨基酸的步骤;
(b)将SEQ ID NO:20的第16位(EU编号第133位)的Arg取代成其他氨基酸的步骤;
(c)将SEQ ID NO:20的第102位(EU编号第219位)的Cys取代成其他氨基酸的步骤;
(d)将SEQ ID NO:20的第20位(EU编号第137位)的Glu取代成其他氨基酸的步骤;
(e)将SEQ ID NO:20的第21位(EU编号第138位)的Ser取代成其他氨基酸的步骤;以及
(f)使SEQ ID NO:20的第325位的Gly和第326位的Lys(分别为EU编号第446位和第447位)缺失的步骤。
对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选第14位(EU编号第131位)的Cys取代成Ser、第16位(EU编号第133位)的Arg取代成Lys、第102位(EU编号第219位)的Cys取代成Ser、第20位(EU编号第137位)的Glu取代成Gly、第21位(EU编号第138位)的Ser取代成Gly。
本发明的方法只要包括上述步骤即可,还可以包括其他氨基酸取代和缺失的其他步骤。对氨基酸的取代和缺失的方法没有特别限定,例如可以按照上述位点特异性诱变法或实施例中记载的方法进行。
对作为对象的抗体没有特别限定,但优选为抗人IL-6受体抗体,进一步优选为人源化PM-1抗体或其修饰(取代、缺失、插入)体。
<提高igg4恒定区在酸性条件下的稳定性的方法>
本发明还涉及提高抗体在酸性条件下的稳定性的方法,该方法包括将具有SEQ ID NO:21记载的氨基酸序列的IgG4恒定区(Mol.Immunol.1993Jan;30(1):105-8)中第289位(EU编号第409位)的Arg取代成其他氨基酸的步骤。本发明的提高抗体在酸性条件下的稳定性的方法只要包括将SEQ ID NO:21记载的氨基酸序列(人IgG4恒定区)中第289位(EU编号第409位)的Arg取代成其他氨基酸的步骤即可,还可以包括其他氨基酸取代。对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Lys。对氨基酸取代的方法没有特别限定,例如可以按照上述位点特异性诱变法或实施例中记载的方法进行。
对作为对象的抗体没有特别限定,但优选为抗人IL-6受体抗体,进一步优选为人源化PM-1抗体或其修饰(取代、缺失、插入)体。
<降低来自igg4恒定区的c末端氨基酸缺失的异质性的方法>
本发明还涉及改善抗体异质性的方法,该方法包括使具有SEQ IDNO:21记载的氨基酸序列的IgG4恒定区(Mol.Immunol.1993 Jan;30(1):105-8)中第326位(EU编号第446位)的Gly和第327位(EU编号第447位)的Lys缺失的步骤。本发明的改善抗体异质性的方法只要包括使具有SEQ ID NO:21记载的氨基酸序列的IgG4恒定区(Mol.Immunol.1993 Jan;30(1):105-8)中第327位(EU编号第447位)的Lys和/或第326位(EU编号第446位)的Gly缺失的步骤即可,还可以包括其他氨基酸取代。对氨基酸取代的方法没有特别限定,例如可以按照上述位点特异性诱变法或实施例中记载的方法进行。
对作为对象的抗体没有特别限定,但优选为抗人IL-6受体抗体,进一步优选为人源化PM-1抗体或其修饰(取代、缺失、插入)体。
本发明还涉及提高IgG4在酸性条件下的稳定性的方法、降低抗体来自C末端的异质性的方法、减少抗体与FcγR结合的方法(M11ΔGK),上述方法均包括对具有SEQ ID NO:21记载的氨基酸序列的IgG4恒定区(Mol.Immunol.1993 Jan;30(1):105-8)进行下述(a)~(p)的步骤:
(a)将SEQ ID NO:21的第14位(EU编号第131位)的Cys取代成Ser的步骤;
(b)将SEQ ID NO:21的第16位(EU编号第133位)的Arg取代成Lys的步骤;
(c)将SEQ ID NO:21的第20位(EU编号第137位)的Glu取代成Gly的步骤;
(d)将SEQ ID NO:21的第21位(EU编号第138位)的Ser取代成Gly的步骤;
(e)将SEQ ID NO:21的第97位(EU编号第214位)的Arg取代成Thr的步骤;
(f)将SEQ ID NO:21的第100位(EU编号第217位)的Ser取代成Arg的步骤;
(g)将SEQ ID NO:21的第102位(EU编号第219位)的Tyr取代成Ser的步骤;
(h)将SEQ ID NO:21的第103位(EU编号第220位)的Gly取代成Cys的步骤;
(i)将SEQ ID NO:21的第104位(EU编号第221位)的Pro取代成Val的步骤;
(j)将SEQ ID NO:21的第105位(EU编号第222位)的Pro取代成Glu的步骤;
(k)将SEQ ID NO:21的第113位(EU编号第233位)的Glu取代成Pro的步骤;
(l)将SEQ ID NO:21的第114位(EU编号第234位)的Phe取代成Val的步骤;
(m)将SEQ ID NO:21的第115位(EU编号第235位)的Leu取代成Ala的步骤;
(n)使SEQ ID NO:21的第116位(EU编号第236位)的Gly缺失的步骤;
(o)将SEQ ID NO:21的第289位(EU编号第409位)的Arg取代成Lys的步骤;以及
(p)使SEQ ID NO:21的第236位(EU编号第446位)的Gly和第237位(EU编号第447位)的Lys缺失的步骤。
本发明的方法只要包括上述步骤即可,还可以包括其他氨基酸取代和缺失的其他步骤。对氨基酸的取代和缺失的方法没有特别限定,例如可以按照上述位点特异性诱变法或实施例中记载的方法进行。
对作为对象的抗体没有特别限定,但优选为抗人IL-6受体抗体,进一步优选为人源化PM-1抗体或其修饰(取代、缺失、插入)体。
<降低来自igg1恒定区的c末端氨基酸缺失的异质性的方法>
本发明还涉及改善抗体异质性的方法,该方法包括使具有SEQ IDNO:19记载的氨基酸序列的IgG1恒定区中第329位(EU编号第446位)的Gly和第330位(EU编号第447位)的Lys缺失的步骤。本发明的改善抗体异质性的方法只要包括使具有SEQ ID NO:19记载的氨基酸序列的IgG1恒定区中第330位(EU编号第447位)的Lys和第329位(EU编号第446位)的Gly缺失的步骤即可,还可以包括其他氨基酸取代。对氨基酸取代的方法没有特别限定,例如可以按照上述位点特异性诱变法或实施例中记载的方法进行。
<通过取代igg1恒定区的氨基酸来提高血浆中滞留性的方法>
本发明还涉及提高抗体的血浆中滞留性的方法,该方法包括将具有SEQ ID NO:19记载的氨基酸序列的IgG1恒定区中第317位(EU434)的Asn取代成其他氨基酸的步骤。对取代后的氨基酸没有特别限定,但优选取代成Ala。本发明的提高抗体的血浆中滞留性的方法只要包括上述步骤即可,还可以包括其他氨基酸取代。
本发明还涉及提高抗体的血浆中滞留性的方法和/或降低抗体的来自C末端的异质性的方法(M83),上述方法包括对具有SEQ ID NO: 19记载的氨基酸序列的IgG1恒定区进行下述(a)~(b)的步骤:
(a)将SEQ ID NO:19的第317位(EU 434)的Asn取代成Ala的步骤;以及
(b)使SEQ ID NO:19的第330位(EU编号第447位)的Lys和第329位(EU编号第446位)的Gly缺失的步骤。
对作为对象的抗体没有特别限定,但优选为抗人IL-6受体抗体,进一步优选为人源化PM-1抗体或其修饰(取代、缺失、插入)体。
上述本发明的恒定区可以和来自任何抗体的可变区组合,但优选与来自抗人IL-6受体抗体的可变区组合。抗人IL-6受体抗体的可变区的例子有:人源化PM-1抗体的可变区。人源化PM-1抗体的可变区可以是未进行氨基酸取代等的可变区,也可以是进行了上述氨基酸取代等的可变区。
本发明提供包含本发明抗体的医药组合物。本发明的医药组合物在类风湿性关节炎等与IL-6有关的疾病的治疗中有用。
本发明的医药组合物除包含抗体外,还可以导入医药上可接受的载体,按照公知的方法制成制剂。例如可以和水或除水以外的药学上可接受的液体制成无菌溶液或悬浮液剂的注射剂的形式,进行胃肠外给药。例如,考虑将其与药理学上可接受的载体或介质、具体有灭菌水或生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、媒介物、防腐剂、粘合剂等适当组合,按照通常认可的制药规则(製薬実施)所要求的单位用量形式进行混合,从而制成制剂。这些制剂中的有效成分量为得到所指示的范围的适当容量。
注射用无菌组合物可以使用注射用蒸馏水这样的媒介物,按照通常的制剂规则制成处方。
作为注射用水溶液,例如有生理盐水、含有葡萄糖或其他辅剂(例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠)的等渗溶液。上述注射用水溶液可以和适当的助溶剂、例如醇、具体有乙醇、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子性表面活性剂(例如聚山梨酯80(TM)、 HCO-50)结合使用。
油性液体包括芝麻油、大豆油。上述油性液体可以和作为助溶剂的苯甲酸苄酯、苯甲醇结合使用。还可以与缓冲剂(例如磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液)、镇痛剂(例如盐酸普鲁卡因)、稳定剂(例如苯甲醇、苯酚)、抗氧剂混合。所制备的注射液通常填充在适当的安瓿中。
给药方式优选为胃肠外给药,具体有注射剂型、经鼻给药剂型、经肺给药剂型、经皮给药剂型等。注射剂型的例子有:例如可以通过静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等进行全身或局部给药。
可以根据患者的年龄、症状选择适当的给药方法。作为含有抗体或编码抗体的多核苷酸的医药组合物的给药量,例如可以在每次0.0001mg~1000mg/kg体重的范围内选择。或者,例如可以按照每名患者0.001~100000mg/人的范围选择给药量,但并不限于上述数值。给药量、给药方法可以根据患者的体重、年龄和症状等而变动,本领域技术人员可以适当选择。
本说明书中使用的氨基酸的三字母表示与单字母表示的对应关系如下。
丙氨酸:Ala(A)
精氨酸:Arg(R)
天冬酰胺:Asn(N)
天冬氨酸:Asp(D)
半胱氨酸:Cys(C)
谷氨酰胺:Gln(Q)
谷氨酸:Glu(E)
甘氨酸:Gly(G)
组氨酸:His(H)
异亮氨酸:Ile(I)
亮氨酸:Leu(L)
赖氨酸:Lys(K)
甲硫氨酸:Met(M)
苯丙氨酸:Phe(F)
脯氨酸:Pro(P)
丝氨酸:Ser(S)
苏氨酸:Thr(T)
色氨酸:Trp(W)
酪氨酸:Tyr(Y)
缬氨酸:Val(V)
需要说明的是,本说明书中引用的所有在先技术文献均作为参照而纳入本说明书中。
实施例
以下,通过实施例来具体说明本发明,但本发明并不限于这些实施例。
[ 实施例 1] 利用亲和力成熟技术通过 CDR 修饰来提高抗原结合能力 SR344 的制备
制作J.Biochem.108,673-676(1990)中报道的、由N末端侧第1位~第344位氨基酸序列构成的可溶性人IL-6R(以下记作SR344)(Yamasaki等人,Science(1988)241,825-828(GenBank #X12830))的CHO细胞恒定表达株。
通过Blue Sepharose 6FF柱层析、固定有SR344特异性抗体的柱亲和层析、凝胶过滤柱层析这三种柱层析,从由SR344表达CHO细胞得到的培养上清中纯化SR344。
将培养上清直接添加到用20mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)平衡的Blue Sepharose 6 FF柱(GE Healthcare Bio-Sciences)上,用相同缓冲液将未吸附的组分完全洗脱。之后,用含有300mM KCl的相同缓冲液清洗柱。再在含有300mM KCl的相同缓冲液中,利用0M~0.5M KSCN的直线浓度梯度洗脱吸附的蛋白。通过使用了SR344特异性抗体的蛋白质印迹法分析在KSCN浓度梯度下洗脱的组分,收集含SR344的组分。
将固定有SR344特异性抗体的柱预先用Tris-缓冲盐(TBS)平衡。将步骤一中得到的SR344组分用Amicon Ultra-15(MILLIPORE;分子量截断值为10kDa)进行超滤、进行浓缩,再用TBS稀释两倍,之后添加到上述柱中。用TBS清洗柱,之后用100mM甘氨酸-盐酸缓冲液(pH2.5)洗脱吸附的蛋白。向洗脱的组分中添加1M Tris(pH8.1),使其pH值回复至中性。用SDS-PAGE分析所得的组分,收集含SR344的组分。
将步骤二中得到的组分用Amicon Ultra-15(分子量截断值为10kDa)浓缩,之后添加到用PBS平衡的Superdex 200柱(GE HealthcareBio-Sciences)上。将作为主峰洗脱的组分作为SR344的最终纯品。
gp130 表达 BaF3 细胞株的建立
为了得到显示IL-6依赖性增殖的细胞株,如下建立表达人gp130的BaF3细胞株。
通过PCR扩增全长人gp130cDNA(Hibi等人,Cell 1990;63:1149-1157(GenBank #NM_002184)),之后将其克隆到表达载体pCOS2Zeo中,构建pCOS2Zeo/gp130,所述表达载体pCOS2Zeo是通过除去pCHOI(Hirata等人,FEBS Letter;1994;356:244-248)的DHFR基因表达位点、并插入Zeocin耐性基因表达位点而得到的。通过PCR扩增全长人IL-6R cDNA,之后将其克隆到pcDNA3.1(+)(Invitrogen)中,构建hIL-6R/pcDNA3.1(+)。
将10μg pCOS2Zeo/gp130混合在悬浮于PBS中的BaF3细胞(0.8×107细胞)中,之后使用Gene Pulser(Bio-Rad)以0.33kV、950μFD的容量施加脉冲。将通过电穿孔处理导入有基因的BaF3细胞在含有0.2ng/mL小鼠白介素-3(Peprotech)、10%胎牛血清(以下记作FBS;HyClone)的RPMI 1640培养基(Invitrogen)中培养一夜,加入含100 ng/mL人白介素-6(R&D Systems)、100ng/mL人白介素-6可溶型受体(R&D Systems)和10%FBS的RPMI 1640培养基进行筛选,建立人gp130表达BaF3细胞株(以下记作BaF3/gp130)。由于该BaF/gp130在人白介素-6(R&D Systems)和SR344的存在下增殖,所以可以将其用于评价抗IL-6受体抗体的增殖抑制活性(即IL-6受体中和活性)。
CDR 修饰文库的建立
首先,将人源化PM-1抗体(Cancer Res.1993 Feb 15;53(4):851-6)转化成scFv。通过PCR扩增VH、VL区,制作在VH、VL之间具有接头序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:106)的人源化PM-1HL scFv。
以制作的人源化PM-1HL scFv DNA为模板,通过PCR制作各CDR氨基酸中的1个氨基酸为X的目标文库、以及CDR中的仅HotSpot(热点)序列为随机序列的文库。各CDR氨基酸中的1个氨基酸为X的目标文库如下构建:使用以将要文库化的氨基酸作为NNS的引物,通过PCR反应构建文库部分,除此以外的部分通过普通PCR来制作,通过装配PCR法进行连接即得。此时,仅1个CDR形成文库(参考J.Mol.Biol.1996;256:77-88)。关于仅Hot Spot序列为随机序列的文库,使用以所有Hot Spot氨基酸为NNS的引物,通过PCR按照相同的方式进行构建。此时,构建了仅VH的Hot Spot被文库化的文库、仅VL的Hot Spot被文库化的文库(参考Nature Biotechnology 1999June;17:568-572)。
使用上述文库,按照J.Immunological Methods 1999;231:119-135构建核糖体展示用文库。为了基于大肠杆菌无细胞系统在体外进行翻译,在5’侧添加SDA序列(核糖体结合位点)和T7启动子,且以gene3部分序列作为核糖体展示用接头,使用SfiI与3’侧连接。
通过核糖体展示获取高亲和性 scFv
按照Nature Biotechnology 2000 Dec;18:1287-1292,利用核糖体展示进行淘选。将制备的SR344用NHS-PEO4-Biotin(Pierce)进行生物素化用作抗原。为了高效率地获得高亲和性的scFv,参考JBC 2004;279(18):18870-18877进行解离率(off-rate selection)筛选。生物素化抗原量为1nM,竞争抗原量为1μM,在第4轮(in the fourth round)的竞争时间为10O/N。
scFv :插入噬菌粒、抗原结合活性和序列分析
以在第4轮得到的DNA库为模板,使用特异性引物进行PCR,从而使HL scFv复原。用SfiI进行消化,之后将所得片段插入同样用SfiI消化的噬菌粒载体pELBG lacI中,转化成XL1-Blue(Stratagene)。使用所得的集落,利用噬菌体ELISA进行抗原结合活性评价和HLscFv序列分析。按照J.Mol.Biol 1992;227:381-388,使用经1μg/mL的SR344包被的平板进行噬菌体-ELISA。使用特异性引物对确认到SR344结合活性的克隆进行序列分析。
scFv IgG 转化、以及 IgG 的表达和纯化
使用动物细胞表达用载体进行IgG的表达。对于确认到突变位点的浓缩的克隆,通过PCR分别扩增它们的VH和VL,利用XhoI/NheI消化和EcoRI消化,将扩增的DNA插入动物细胞表达用载体中。各DNA片段的核苷酸序列通过使用BigDye Terminator循环测序试剂盒(Applied Biosystems),利用DNA序列分析仪(ABI PRISM 3730xL DNA序列分析仪或ABI PRISM 3700DNA序列分析仪(AppliedBiosystems)),按照附录说明书中所述的方法进行确定。
IgG 化抗体的表达
抗体的表达采用下述方法进行。将来自人胚肾癌细胞的HEK293H株(Invitrogen)悬浮于含有10%胎牛血清(Invitrogen)的DMEM培养基(Invitrogen)中,以5~6×105细胞/mL的细胞密度在粘附细胞用培养皿(直径10cm;CORNING)的各培养皿中分别接种10mL,在37℃、5%CO 2 的培养箱内培养一昼夜,之后吸除培养基,添加6.9mLCHO-S-SFM-II培养基(Invitrogen)。将制备的质粒DNA混合液(总计13.8μg)与20.7μL 1μg/mL的聚乙烯亚胺(Polysciences Inc.)和690μL CHO-S-SFMII培养基混合,在室温下静置10分钟,之后投入各培养皿的细胞中,在37℃、5%CO 2 的培养箱内培养4~5小时。之后,添加6.9mL CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培养基,在CO 2 培养箱内培养3天。回收培养上清,之后以约2000g的离心力在室温下离心5分钟以除去细胞,再通过0.22μm的滤器MILLEX(R)-GV(Millipore)进行灭菌。该安瓿使用前一直在4℃下保存。
IgG 化抗体的纯化
向所得培养上清中添加悬浮于TBS中的50μL rProtein ASepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences),在4℃下倒置混合4小时以上。将该溶液移至0.22μm的滤杯Ultrafree(R)-MC(Millipore)中,用500μL TBS清洗3次,然后将rProtein A SepharoseTM树脂悬浮于100μL 50mM的乙酸钠水溶液(pH3.3)中,静置2分钟,之后洗脱抗体。立即加入6.7μL的1.5M Tris-HCl(pH7.8)进行中和。洗脱2次,得到200μL纯化抗体。将2μL含有抗体的溶液供给分光光度计ND-1000(NanoDrop)、或者将50μL含有抗体的溶液供给分光光度计DU-600(BECKMAN),测定280nm下的吸光度。使用下式由所得的值算出抗体浓度。
抗体浓度(mg/mL)=吸光度×稀释倍率÷14.6×10
IgG 化克隆的人 IL-6 受体中和活性的评价
使用显示IL-6/IL-6受体依赖性增殖的BaF3/gp130,评价IL-6受体中和活性。将BaF3/gp130用含有10%FBS的RPMI1640培养基清洗3次,之后悬浮于含有60ng/mL人白介素-6(TORAY)、60ng/mL重组可溶型人IL-6受体(SR344)和10%FBS的RPMI1640培养基中,使达到5×104细胞/mL的密度,再向96孔平板(CORNING)的各孔中分别注入50μL。接下来,将纯化的抗体用含有10%FBS的RPMI1640培养基稀释,向各孔中分别混合50μL。在37℃、5%CO 2 的条件下培养3天,以20μL/孔加入用PBS稀释2倍的WST-8试剂(细胞计数试剂盒8;株式会社同仁化学研究所),之后立即使用SUNRISE CLASSIC (TECAN)测定450nm的吸光度(参比波长为620nm)。培养2小时后,再次测定450nm的吸光度(参比波长为620nm),以2小时的吸光度变化为指标,评价IL-6受体中和活性。
其结果,得到多个活性较人源化PM-1抗体(野生型:WT)高的抗体。显示出高于WT的活性的抗体的突变位点见图4。例如,如图1所示,可知:与WT相比,RD_6在100%抑制浓度下显示出约50倍高的中和活性。
利用 Biacore 分析 IgG 化克隆的亲和性
对于活性高于野生型的克隆,使用Biacore T100(BIACORE)进行抗原抗体反应的速度论的分析。将1800RU~2600RU(共振单位)的rec-Protein A(ZYMED)(以下记作Protein A)固定在传感器芯片上,使各种抗体与该芯片结合,使抗原以分析物的形式流经芯片,测定抗体与抗原的相互作用。将调整成各种浓度的重组人IL-6R sR(R&DSystems)(以下记作rhIL-6sR)用作抗原。所有测定均在25℃下进行。由测定中得到的传感图算出动力学参数、即结合速度常数k a (1/Ms)和解离速度常数k d (1/s),根据该值算出K D (M)。使用Biacore T100评估软件(BIACORE)计算各参数。
其结果,得到多个亲和性高于人源化PM-1抗体(野生型:WT)的抗体。例如,野生型(WT)和RD_6的传感图见图2和图3。由动力学参数分析结果可知:与WT相比,RD_6显示出约50倍高的亲和性(表1)。此外,得到了保有数十倍高的亲和性的抗体。显示出高于WT的亲和性的突变位点见图4。
[表1]
[ 实施例 2] 利用各 CDR 修饰的组合来提高抗原结合能力
对活性及亲和性高的突变位点进行突变位点的融合,制作活性更高、亲和性更高的抗体。
修饰抗体的制作、表达、纯化
对所选定的位点进行用于制作修饰抗体的氨基酸修饰。具体而言,使用QuikChange位点定向诱变试剂盒(Stratagene),按照附录说明书所述的方法,向制作的H(WT)可变区(H(WT)、SEQ ID NO:107)和L(WT)链可变区(L(WT)、SEQ ID NO:108)中导入突变。用XhoI和NotI消化确认为目标人源化抗体可变区基因序列的H链抗体基因片段插入质粒,之后用EcoRI消化插入有L链抗体基因片段的质粒,之后将反应液供于1%琼脂糖凝胶电泳。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN),按照附录说明书所述的方法纯化目标尺寸(约400bp)的DNA片段,用30μL无菌水进行洗脱。之后将抗体H链基因片段插入动物细胞表达用载体中,制作目标H链表达载体。进行相同的操作,制作L链表达载体。使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics)进行连接反应,转化大肠杆菌DH5α株(东洋纺织)。各DNA片段的核苷酸序列通过使用BigDye Terminator循环测序试剂盒(AppliedBiosystems),利用DNA序列分析仪(ABI PRISM 3730xL DNA序列分析仪或ABI PRISM 3700 DNA序列分析仪(Applied Biosystems)),按照附录说明书所述的方法来确定。使用制作的表达载体,按照实施例1所述的方法进行表达、纯化。
IL-6 受体中和活性的评价
已纯化的抗体的中和活性的评价按照实施例1所述的方法进行。其中,使人白介素-6(TORAY)浓度达到600ng/mL,进行中和活性的评价。得到多个显示出高于WT的活性的新型抗体,这些抗体的CDR序列见图5。其中,作为显示出高活性的抗体,H链中使用了RDC_5H、L链中使用了RDC_11L的抗体(形成RDC_23)的中和活性见图6。可知:与WT相比,RDC_23在100%抑制浓度下具有约100倍高的活性。不仅在RDC_23、即H链中使用了RDC_5H、L链中使用了RDC_11L 的抗体中确认到中和活性提高,在H链中使用了RDC_2H、RDC_3H、RDC_4H、RDC_5H、RDC_6H、RDC_7H、RDC_8H、RDC_27H、RDC_28H、RDC_29H、RDC_30H、RDC_32H、L链中使用了L(WT)的抗体(分别形成RDC_2、RDC_3、RDC_4、RDC_5、RDC_6、RDC_7、RDC_8、RDC_27、RDC_28、RDC_29、RDC_30、RDC_32)、以及H链中使用了H(WT)、L链中使用了RDC_11L的抗体(形成RDC_11)中也确认到中和活性的提高,通过组合利用亲和力成熟技术发现的突变位点,可以取得具有更高活性的抗体。此外,由于组合有这些突变位点的抗体的中和活性有所提高,所以认为其亲和性也提高。
利用使用了蛋白 A Biacore 进行亲和性分析
于是,在中和活性提高的抗体中,对于RDC_2、RDC_3、RDC_4、RDC_5、RDC_6、RDC_7、RDC_8、RDC_11、RDC_23,使用BiacoreT100(BIACORE)进行抗原抗体反应的速度论的分析。通过胺耦合法将4400RU~5000RU的rec-蛋白A(ZYMED)固定在传感器芯片上,使各种抗体结合在芯片上,再使抗原以分析物的形式在芯片上流动,测定抗体与抗原的相互作用。抗原使用调整成各种浓度的rhIL-6sR。所有测定均在25℃下进行。由测定中得到的传感图算出动力学参数、即结合速度常数k a (1/Ms)和解离速度常数k d (1/s),根据该值算出K D (M)。使用Biacore T100评估软件(BIACORE)计算各参数。其结果,组合有突变位点的RDC_2、RDC_3、RDC_4、RDC_5、RDC_6、RDC_7、RDC_8、RDC_11、RDC_23具有较同时测定的包含1个突变位点的RD_28小的K D 值(表2)。其中,显示出高亲和性的RDC_23的传感图见图7。
[表2]
由此可知:与组合突变位点前的抗体相比,这些抗体的亲和性强。与中和活性一样,通过组合利用亲和力成熟技术发现的突变位点,可以获得具有更高亲和性的抗体。显示出高于WT的活性或亲和性的突变体的氨基酸序列如下(来自WT的突变位点带有下划线)。
(HCDR2)
SEQ ID NO:45 YISYSGIT N YNPSLKS
(HCDR3)
SEQ ID NO:57 L L A RATAMDY
SEQ ID NO:58 V L A RATAMDY
SEQ ID NO:59 I LAR A TAMDY
SEQ ID NO:60 T LAR A TAMDY
SEQ ID NO:61 V LAR I TAMDY
SEQ ID NO:62 I LAR I TAMDY
SEQ ID NO:63 T LAR I TAMDY
SEQ ID NO:64 L LAR I TAMDY
(LCDR3)
SEQ ID NO:79 G QGN R LPYT
即,通过制作HCDR2的第9位氨基酸为Asn、HCDR3的第1位氨基酸为Leu、Val、Ile、Thr中的任一个、HCDR3的第5位氨基酸为Ala或Ile、LCDR3的第1位氨基酸为Gly、LCDR3的第5位氨基酸为Arg的抗体,可以制作中和活性和亲和性较WT显著提高的抗IL-6受体抗体。
利用使用了蛋白 A/G Biacore 进行亲和性分析
使用Biacore T100(BIACORE),进行WT和RDC_23的抗原抗体反应的速度论的分析。将纯化的重组蛋白A/G(Pierce)(以下记作蛋白A/G)固定在传感器芯片上,使各种抗体与芯片结合,使抗原以分析物的形式在芯片上流动,测定抗体与抗原的相互作用。抗原使用调整成各种浓度的rhIL-6sR(R&D Systems)和重组可溶型IL-6受体(实施例1中制备的SR344)。由杆状病毒感染的昆虫细胞产生的rhIL-6sR的糖链结构为高甘露糖型,相对于此,认为由CHO细胞产生的SR344的糖链结构为复合型糖链、且末端结合有唾液酸。实际上,人体内的可溶型IL-6受体的糖链结构为复合型糖链、且末端结合有唾液酸,所以认为SR344与人体内可溶型IL-6受体的结构更接近,在本实验中进行rhIL-6sR与SR344的比较试验。
由测定中得到的传感图算出动力学参数、即结合速度常数k a (1/Ms)和解离速度常数k d (1/s),根据该值算出K D (M)。使用BiacoreT100评估软件(BIACORE)计算各参数。
传感器芯片是利用胺耦合法将约3000RU的蛋白A/G固定在CM5(BIACORE)上制作而成。使用制作的传感器芯片,进行与蛋白A/G结合的抗体(WT和RDC_23)、与rhIL-6sR和SR344这两种可溶型IL-6受体的相互作用的速度论的分析。运行缓冲液使用HBS-EP+,流速为20μL/分钟。各抗体制备成约100RU与蛋白A/G结合。用作分析物的rhIL-6sR使用HBS-EP+,制成0、0.156、0.313、0.625μg/mL。SR344制成0、0.0654、0.131、0.261μg/mL。测定中,首先使目标抗体WT和RDC_23与蛋白A/G结合,再使分析物溶液与其作用3分钟,之后切换成HBS-EP+(BIACORE),测定解离相10分钟。解离相的测定结束后,用10μL的10mM甘氨酸-HCl(pH1.5)进行清洗,使传感器芯片再生。该结合、解离、再生构成1个分析周期。所有实验均在 37℃下进行。
按照上述周期分别对WT和RDC_23进行测定,所得的rhIL-6sR和SR344这两种可溶型IL-6受体的传感图见图8、图9、图10和图11。使用Biacore专用的数据分析软件、即Biacore T100评估软件,对所得传感图进行速度论的分析(表3)。其结果可知:在rhIL-6sR和SR344的比较中,WT和RDC_23均为使用SR344时所得的亲和性弱2~3倍。与WT相比,RDC_23对rhIL-6sR和SR344两者的亲和性均提高约40~60倍,利用由亲和力成熟技术得到的各CDR修饰的组合,与WT相比,RDC_23对认为与人体内的可溶型IL-6受体的结构接近的SR344显示出非常强的亲和性。在以后的实施例中,使用了SR344和蛋白A/G的抗原抗体反应的速度论的分析均在37℃下进行
[表3]
[ 实施例 3] 通过 CDR 和构架的修饰使血浆中滞留性提高、以及免疫原性风险降低的 H53/L28 的研制
在Cancer Res.1993 Feb 15;53(4):851-6中,对于人源化小鼠PM-1抗体(以下记作野生型或简记作WT;H链WT记作H(WT);L链WT记作L(WT)),为了提高其血浆中滞留性、降低免疫原性风险及提高稳定性,实施了如下修饰。为了提高血浆中滞留性,向WT的H链可变区和L链可变区序列中导入降低等电点的修饰。
制作人源化 PM-1 抗体的立体结构模型
首先,为了确认暴露于人源化PM-1抗体(H(WT)/L(WT))可变区表面的氨基酸残基,使用MOE软件(Chemical Computing Group Inc.),利用同源性模拟制作人源化小鼠PM-1抗体的Fv区模型。
选择用于降低人源化 PM-1 抗体的等电点的修饰位点
通过详细分析制作的模型,认为作为降低等电点的修饰导入位点,在FR序列中暴露于表面的氨基酸中的H16、H43、H81、H105、L18、L45、L79、L107(Kabat编号;Kabat EA等人,1991,Sequences ofProteins of Immunological Interest(目标免疫蛋白序列),NIH)、以及作为CDR序列的H31、H64、H65、L24、L27、L53、L55成为不降低活性和稳定性、但可以降低等电点的候选位点。
除去人源化 PM-1 抗体中残留的小鼠序列
人源化PM-1抗体是将小鼠PM-1抗体人源化而得到的抗体序列(Cancer Res.1993 Feb 15;53(4):851-6)。人源化PM-1抗体的H链是通过将CDR嫁接到作为人抗体可变区的NEW构架中而得到的,但H链的H27、H28、H29、H30、H71直接利用小鼠序列以保持活性。考虑到免疫原性的风险,认为小鼠序列越少越好,因此探索用于将H27、H28、H29、H30转化成人序列的序列。
选择用于提高人源化 PM-1 抗体稳定性的修饰位点
本发明人等认为通过将人源化PM-1抗体(H(WT)/L(WT))的可变区中H65的丝氨酸取代成甘氨酸(转角结构的稳定化;通过将HCDR2转化成共有序列而实现稳定化)、H69的甲硫氨酸取代成异亮氨酸(疏水核结构的稳定化)、H70的亮氨酸取代成丝氨酸(通过将暴露表面的残基亲水化而实现稳定化)、H58的苏氨酸取代成天冬酰胺(通过将HCDR2转化成共有序列而实现稳定化)、L93的苏氨酸取代成丝氨酸(通过将暴露表面的残基亲水化而实现稳定化)、H107的丝氨酸取代成异亮氨酸(β折叠的稳定化),可以提高稳定性,认为这些修饰是提高稳定性的候选。
除去人源化 PM-1 抗体的在计算机芯片上预测的 T 细胞表位
首先,使用TEPITOPE(Methods 2004 Dec;34(4):468-75)对人源化PM-1抗体(H(WT)/L(WT))的可变区进行分析。结果显示:在L链 CDR2上存在多个与HLA结合的T细胞表位。因此,在TEPITOPE分析中研究降低L链CDR2的免疫原性风险但不降低稳定性、结合活性和中和活性的修饰。由结果可知:通过将L链CDR2的L51的苏氨酸取代成甘氨酸,可以在不降低稳定性、结合活性、中和活性的情况下除去与HLA结合的T细胞表位。
各构架序列的选择
由一般公开的Kabat数据库(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/)和IMGT数据库(http://imgt.cines.fr/)获取人抗体氨基酸序列数据,使用由此构建的数据库,区分各构架可以检索同源性。选择人构架时,从降低等电点、除去残留的小鼠序列、提高稳定性的角度考虑,利用数据库研究具有上述各项修饰的人构架序列。由结果可知:如下所示,通过使修饰抗体H53/L28的各构架形成下述序列,可以不降低结合活性、中和活性而满足上述各项。Source为该人序列的来源,而序列中下划线部分的氨基酸残基是与WT相比导入有修饰的氨基酸。
[表4]
由于上述H53的FR3存在非人序列,所以希望进一步降低免疫原性风险。作为降低免疫原性风险的修饰,认为可以形成将H89的Ala取代成Val的序列(SEQ ID NO:127)。并且,由于在H53的FR3中H71 位上的Arg对结合活性重要(Cancer Res.1993 Feb 15;53(4):851-6),所以认为通过使用H71位上保有Arg的人VH1亚纲的FR3序列(SEQID NO:128)或人VH3亚纲的FR3序列(SEQ ID NO:129),可以制作H链、L链的构架均完全为人序列的抗人IL-6受体抗体。
CDR 序列的选择
选择CDR序列时,第一,从不降低结合活性和中和活性、而降低等电点、提高稳定性、除去T细胞表位的角度考虑,如下选择H53/L28的各CDR序列。
[表5]
H53 序列
CDR1 DDHAWS
CDR2 YISYSGITNYNPSLKG
CDR3 SLARTTAMDY
L28 序列
CDR1 QaSQDISSYLN
CDR2 YGSELHS
CDR3 QQGNSLPYT
修饰抗体的表达载体的制作、表达、纯化
已发生修饰的抗体的表达载体的制作、表达、纯化按照实施例1所述的方法进行。向人源化小鼠PM-1抗体的H(WT)突变导入用载体、L(WT)突变导入用载体中依次导入修饰,使形成所选择的构架序列、CDR序列。使用最终得到的、编码具有所选择的构架序列、CDR序列的H53/L28(抗体氨基酸序列:H53,SEQ ID NO:104;L28,SEQ IDNO:105)的动物细胞表达用载体,进行H53/L28的表达、纯化,将其用于以下评价。
通过等电点电泳进行修饰抗体 H53/L28 的等电点评价
为了评价由可变区的氨基酸修饰引起的全长抗体的等电点变化,通过等电点电泳对WT和修饰抗体H53/L28进行分析。等电点电泳如下进行。使用Phastsystems Cassette(Amersham Biosciences社制),将Phast-Gel Dry IEF(Amersham Biosciences社制)凝胶在下述膨润液中膨润约30分钟。
Milli-Q水 1.5mL
IEF用Pharmalyte 5-8(Amersham Biosciences社制)50μL
IEF用Pharmalyte 8-10.5(Amersham Biosciences社制)50μL
使用已膨胀的凝胶,利用PhastSystems(Amersham Biosciences社制)按照下述程序进行电泳。在步骤2中将样品添加到凝胶中。pI标记使用pI的校准试剂盒(Amersham Biosciences社制)。
步骤1:2000V 2.5mA 3.5W 15℃ 75Vh
步骤2:200V 2.5mA 3.5W 15℃ 15Vh
步骤3:2000V 2.5mA 3.5W 15℃ 410Vh
电泳后,将凝胶用20%TCA固定,之后使用银染色试剂盒、蛋白(Amersham Biosciences社制),按照试剂盒中附带的操作指南进行银染色。染色后,由pI标记的已知等电点算出样品(全长抗体)的等电点。其结果,WT的等电点为约9.3,修饰抗体H53/L28的等电点为约6.5~6.7,通过对WT进行氨基酸取代得到了等电点下降约2.7的H53/L28。通过GENETYX(GENETYX CORPORATION)计算该H53/L28可变区(VH、VL序列)的理论等电点时,理论等电点为4.52。由于WT的理论等电点为9.20,所以通过对WT进行氨基酸取代得到了可变区理论等电点下降了约4.7的H53/L28。
H53/L28 的人 IL-6 受体中和活性的评价
按照实施例1所述的方法对WT和H53/L28进行评价。结果见图12。由结果可知:与WT相比,修饰抗体H53/L28对BaF/gp130的中和活性提高数倍。即,与WT相比,H53/L28可以在不降低等电点的同时提高中和活性。
利用 Biacore 进行 H53/L28 与人 IL-6 受体的亲和性的分析
关于WT和H53/L28与人IL-6受体的亲和性评价,使用BiacoreT100(BIACORE)进行速度论的分析。将纯化的重组蛋白A/G(Pierce)(以下记作蛋白A/G)固定在传感器芯片上,使各种抗体与芯片结合,使抗原以分析物的形式在芯片上流动,测定抗体与抗原的相互作用。抗原使用调整成各种浓度的重组可溶型IL-6受体(SR344)。测定条件与实施例2相同。
所得的WT和H53/L28的传感图见图13。使用Biacore专用的数据分析软件、即Biacore T100评估软件进行速度论的分析,结果见表6。由结果可知:与WT相比,H53/L28的K D 下降约6倍、而亲和性提高约6倍。即,与WT相比,H53/L28可以在不降低等电点的同时提高亲和性约6倍。详细的研究结果认为:有助于提高亲和性的氨基酸突变为将L51的苏氨酸取代成甘氨酸的突变。即,认为通过将L51的苏氨酸取代成甘氨酸,可以提高亲和性。
[表6]
利用 TEPITOPE 预测 H53/L28 中的 T 细胞表位
进行H53/L28的TEPITOPE分析(Methods.2004 Dec;34(4):468-75)。由结果可知:与WT相比,H53/L28中有可能与HLA结合的肽数大幅减少,由此认为在人体内的免疫原性风险降低。
[ 实施例 4]H53/L28 的血浆中滞留性的评价
评价修饰抗体 H53/L28 在正常小鼠血浆中的动力学
为了评价等电点降低的修饰抗体H53/L28在血浆中滞留性,对WT和修饰抗体H53/L28在正常小鼠血浆中的动力学进行了比较。
将WT和H53/L28以1mg/kg对小鼠(C57BL/6J;日本Charles River) 进行静脉内和皮下单次给药,于给药前、和给药后15分钟、2小时、8小时、1天、2天、5天、7天、14天、21天、28天进行采血。其中,给药后15分钟仅从静脉内给药组采血。将采集的血液立即在4℃下以15,000rpm的转速离心15分钟,得到血浆。分离的血浆在实施测定前一直保存在被设定为-20℃以下的冷库中。
小鼠血浆中浓度测定按照ELISA法进行。首先,使用EZ-LinkTMSulfo-NFS-生物素化试剂盒(PIERCE社制)将重组人IL-6sR(R&DSystems社制)生物素化。将该生物素化人-sIL-6R分别注入用Reacti-Bind高结合能链霉亲和素(HBC)包被的平板(PIERCE社制)中,在室温下静置1小时以上,制成人-sIL-6R-固定化平板。制备血浆中浓度为3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05μg/mL的标准曲线试样和小鼠血浆测定试样,分别注入人-sIL-6R-固定化平板中,在室温下静置1小时。之后使抗人IgG-AP(SIGMA社制)与其反应,使用BluePhosMicrowell磷酸酶底物系统(Kirkegaard & Perry Laboratories社制)作为底物进行显色反应,使用酶标仪(microplate reader)测定650nm的吸光度。使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices社制),由标准曲线的吸光度算出小鼠血浆中浓度。WT和H53/L28静脉内给药后的血浆中浓度变化见图14、皮下给药后的血浆中浓度变化见图15。
使用药物动力学分析软件WinNonlin(Pharsight社制),对所得的血浆中浓度变化数据进行非模型依赖性分析,算出药物动力学参数(AUC、清除率(CL)、半衰期(T1/2))。T1/2由最后3点或WinNonlin自动设定的最终相的血浆中浓度算出。BA由皮下给药后的AUC与静脉内给药后的AUC之比算出。所得的药物动力学参数见表7。
[表7]
静脉注射 CL T1/2 mL/h/kg 天 皮下注射 CL/F T1/2 BA mL/h/kg 天 %
WT H53/L28 0.177 18.5 0.102 23.5 0.180 14.7 113 0.086 29.7 121
H53/L28静脉内给药后的血浆中半衰期(T1/2)延长至WT的约1.3倍,清除率降低约1.7倍。H53/L28皮下给药后的T1/2延长至WT的约2倍,清除率降低约2.1倍。如此,通过降低WT的等电点,可以大幅提高H53/L28的血浆中滞留性。
与人源化PM-1抗体(WT)相比,H53/L28是结合活性及中和活性提高、免疫原性风险降低、同时血浆中滞留性大幅提高的人源化抗IL-6受体抗体,所以认为在药物开发中,H53/L28中适用的修饰极为有用。
[ 实施例 5]PF1 抗体的制作
人源化 PM-1 抗体的表达载体和突变导入载体的制作
向实施例4中制成的H53/L28中导入在实施例2中发现的、提高RDC_23的亲和性的2处H链、2处L链、总计4处CDR突变。向H53/L28中导入了RDC_23的突变的H链命名为PF1_H、向H53/L28中导入了RDC_23的突变的L链命名为PF1_L,修饰抗体的制作、表达、纯化按照实施例1所述的方法进行。PF1_H的氨基酸序列见SEQID NO:22,PF1_L的氨基酸序列见SEQ ID NO:23。
IL-6 受体中和活性的评价
已纯化的PF1抗体的中和活性评价按照实施例1所述的方法进行。其中,使人白介素-6(TORAY)的浓度达到600ng/mL,再进行中和活性的评价。WT和PF1的中和活性见图16。可知:与WT相比,PF1在100%抑制浓度下具有约100~1000倍的活性。
利用 Biacore 分析 PF1 抗体与人 IL-6 受体的亲和性
本测定在与实施例2相同的条件下进行。运行缓冲液使用HBS-EP+,流速为20μL/分钟。各抗体制备成约100RU与蛋白A/G结合。用作分析物的SR344使用HBS-EP+,调整成0、0.065、0.131、0.261μg/mL。测定中,首先使抗体溶液与蛋白A/G结合,再使分析物溶液与其作用3分钟,之后切换成HBS-EP+,测定解离相10分钟或 15分钟。解离相的测定结束后,用10μL的10mM甘氨酸-HCl(pH1.5)进行清洗,使传感器芯片再生。该结合、解离、再生构成1个分析周期。按照该周期对各种抗体进行测定。
所得PF1的传感图见图17。使用Biacore专用的数据分析软件、即Biacore T100评估软件对所得传感图进行速度论的分析,分析结果、与WT和H53/L28的分析结果一并见表8。由结果可知:与WT相比,PF1的亲和性提高约150倍。通过将利用亲和力成熟的组合得到的高亲和性的RDC_23、和血浆中滞留性提高且亲和性提高的H53/L28组合起来,由于协同效果PF1得到较上述RDC_23或H53/L28高的亲和性。
[表8]
利用差示扫描量热法 (DSC) 评价 PF1 抗体的热稳定性
为了评价PF1抗体的热稳定性,利用差示扫描量热法(DSC)进行热变性中间温度(Tm值)的评价。将WT和PF1的纯化抗体用20mM乙酸钠、150mM NaCl、pH6.0的溶液进行透析(EasySEP,TOMY)。在约0.1mg/mL蛋白浓度下,在40℃~100℃范围内以1℃/分钟的升温速度进行DSC测定。由结果可知:WT的Fab部分的Tm值为约94℃,而PF1的Fab部分的Tm值为91℃。普通IgG1型抗体分子的Fab部分的Tm值为约60℃~85℃的范围(Biochem.Biophys.Res.Commun.2007 Apr 13;355(3):751-7;Mol Immunol.2007 Apr;44(11):3049-60),由此表明:与普通IgG1分子相比,所得的PF1抗体的热稳定性极高。
评价 PF1 抗体在高浓度下的稳定性
进行PF1抗体在高浓度制剂中的稳定性的评价。将WT和PF1的纯化抗体用20mM组氨酰氯、150mM NaCl、pH6.5的溶液进行透析(EasySEP,TOMY),之后用超滤膜进行浓缩,进行在高浓度中的稳定性试验。条件如下。
抗体:WT和PF1
缓冲液:20mM组氨酰氯、150mM NaCl、pH6.0
浓度:145mg/mL
保存温度和保存时间:25℃下2周、25℃下4周或25℃下7周
聚集物评价方法:
系统:Waters Alliance
柱:G3000SWxl(TOSOH)
流动相:50mM磷酸钠、300mM KCl、pH7.0
流速、波长:0.5mL/分钟、220nm
将样品稀释100倍后进行分析
利用上述凝胶过滤层析法评价原始制剂(刚制成的制剂)中和在各种条件下保存后的制剂中聚集物的含量。原始制剂中聚集物的含量变化(增加量)见图18。其结果,WT和PF1均显示出非常高的稳定性;在25℃下保存7周后,WT和PF1中聚集物增加量分别为约0.7%和约0.3%;在25℃下保存1个月后,WT和PF1中聚集物增加量分别为约0.4%和约0.17%;可知:PF1在特别高的浓度下显示出极高的稳定性。WO 2003/039485中给出了作为IgG的高浓度制剂已上市的达珠单抗(Daclizumab)的100mg/mL制剂在25℃下的稳定性数据,但达珠单抗的100mg/mL制剂在25℃下保存1个月后聚集物增加量为约0.3%,即使与达珠单抗相比,PF1在高浓度下的稳定性也极其优异,在开发高浓度的溶液制剂作为药品中,聚集物的增加是重大问题,而PF1抗体在高浓度下聚集物的增加极少。
PF1是将WT加以修饰以达到下述目的的分子,所述目的包括:提高抗原结合能力、通过降低等电点来提高血浆中滞留性、通过除去残留的小鼠序列和T细胞表位来降低免疫原性风险、以及提高稳定性。实际上已经明确:即使与WT相比,PF1在100mg/mL以上的高浓度制剂中的稳定性也非常高,通过使用这样的分子,可以提供稳定且便利性高的高浓度皮下给药制剂。
[ 实施例 6] 利用人 IL-6 受体转基因小鼠进行的 PF1 抗体的 PK/PD 试验
使用人 IL-6 受体转基因小鼠进行的体内动力学试验
评价WT和实施例5中制成的PF1在人IL-6受体转基因小鼠(hIL-6R tg小鼠;Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.1995May 23;92(11):4862-6)体内的动力学和人可溶型IL-6受体在体内的中和活性。将WT和PF1以10mg/kg对hIL-6R tg小鼠进行静脉内单次给药,于给药前、和给药后15分钟、2小时、4小时、8小时、1天、2天、4天、7天进行采血。采集的血液立即在4℃下以15,000rpm的速度离心15分钟,得到血浆。分离的血浆在实施测定前一直保存在被设定为-20℃以下的冷库中。
小鼠血浆中浓度测定按照ELISA法进行。制备血浆中浓度为6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1μg/mL的标准曲线试样。将标准曲线试样和小鼠血浆测定试样分别注入用抗人IgG(γ-链特异性)F(ab’)2(Sigma社制)固定的微板(immunoplate)(Nunc-Immuno Plate,MaxiSorp(Nalge nunc International社制))中,在室温下静置1小时,之后使之与山羊抗人IgG-BIOT(Southern Biotechnology Associates社制)和链霉亲和素碱性磷酸酶缀合物(Roche Diagnostics社制)依次反应,使用BluePhos Microwel l磷酸酶底物系统(Kirkegaard & Perry Laboratories社制)作为底物进行显色反应,使用酶标仪测定650nm的吸光度。使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices社制),由标准曲线的吸光度算出小鼠血浆中浓度。WT和PF1的血浆中浓度变化见图19。与WT相比,PF1给药4天后的血浆中浓度高约5倍,由此可知:与WT相比,PF1在人IL-6受体转基因小鼠体内的血浆中滞留性有所提高。
已知人IL-6受体转基因小鼠在血浆中产生人可溶型IL-6受体。因此,通过对人IL-6受体转基因小鼠给予抗人IL-6受体抗体,可以评价血浆中存在的人可溶型IL-6受体的中和效果。
为了评价通过给予WT或PF1人可溶型IL-6受体被中和的程度,测定小鼠血浆中非结合型的人可溶型IL-6受体浓度。将6μL小鼠血浆用含有BSA的稀释缓冲液稀释至2倍,将其添加到在0.22μm滤杯(Millipore)中已干燥的适量的rProtein A Sepharose Fast Flow resin(GEHealthcare)上,使血浆中存在的所有IgG型抗体(小鼠IgG、抗人IL-6受体抗体和抗人IL-6受体抗体-人可溶型IL-6受体复合体)均吸附在蛋白A上。之后,用高速离心机进行旋转下降(spinned-down),回收通过的溶液。由于通过的溶液中不含与蛋白A结合的抗人IL-6受体抗体-人可溶型IL-6受体复合体,所以通过测定通过的溶液中的可溶型IL-6受体浓度,可以测定非结合型的可溶型IL-6受体浓度。可溶型IL-6受体的浓度测定使用Quantikine人IL-6sR(R&D Systems)来进行。将WT和PF1给予小鼠,4小时后、8小时后、24小时后、48小时后、96小时后、168小时后的非结合型的可溶型IL-6受体浓度的测定按照附录说明书进行。
结果见图20。WT和PF1以10mg/kg静脉内单次给药的4小时后、直至8小时后,在WT和PF1两者中,非结合型的可溶型IL-6受体浓度均为10ng/mL以下,确认人可溶型IL-6受体被中和。但给予WT 24小时后非结合型的可溶型IL-6受体浓度为约500ng/mL,相对于此,给予PF1后非结合型的可溶型IL-6受体浓度为10ng/mL以下,由此可知:与WT相比,PF1能够持续中和人可溶型IL-6受体。
PF1是将通过亲和力成熟技术发现的RDC_23和血浆中滞留性等得到改善的H53/L28组合而得到的,认为其在体内可以发挥长血浆中滞留性和高中和活性。实际上,与WT相比,PF1在产生人可溶型IL-6受体的人IL-6受体转基因小鼠中显示出的中和效果和血浆中浓度更持久。
PF1在高浓度制剂中的稳定性和免疫原性风险均优于WT(人源化PM-1抗体),而且即使在人IL-6受体转基因小鼠中IL-6受体中和效果和血浆中滞留性也优异。由此认为:在药品开发中,PF1中适用的修饰极为有用。
[ 实施例 7] 提高 IgG2 IgG4 在酸性条件下的稳定性
IgG2 IgG4 化人源化 IL-6 受体抗体表达载体的制作、表达
虽然人源化PM-1抗体(Cancer Res.1993Feb 15;53(4):851-6)的恒定区为IgG1同种型,但为了降低其与Fcγ受体的结合活性,制作将恒定区取代成IgG2的分子(WT-IgG2,SEQ ID NO:109)和将恒定区取代成IgG4(Mol.Immunol.1993Jan;30(1):105-8)的分子(WT-IgG4,SEQ ID NO:110)。在IgG的表达中使用动物细胞表达用载体。构建将实施例1中使用的人源化PM-1抗体(IgG1)的恒定区部分用NheI/NotI进行消化、之后通过连接将恒定区取代成IgG2或IgG4的表达载体。使用BigDye Terminator循环测序试剂盒(Applied Biosystems),利用DNA序列分析仪(ABI PRISM 3730xL DNA序列分析仪或ABIPRISM3700DNA序列分析仪(Applied Biosystems)),按照附录说明书所述的方法确定各DNA片段的核苷酸序列。使用WT作为L链,WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4的表达按照实施例1所述的方法进行。
(1)人源化PM-1抗体(WT-IgG1)H链:SEQ ID NO:15(氨基酸序列)
(2)WT-IgG2H链:SEQ ID NO:109(氨基酸序列)
(3)WT-IgG4H链:SEQ ID NO:110(氨基酸序列)
通过盐酸洗脱从蛋白 A 中纯化 WT-IgG1 WT-IgG2 WT-IgG4
向得到的培养上清中添加悬浮于TBS中的50μL rProteinASepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences),在4℃下倒置混合4小时以上。将该溶液移至0.22μm滤杯Ultrafree(R)-MC(Millipore)中,用500μL TBS清洗3次,之后将rProteinA SepharoseTM树脂悬浮于100μL的10mM HCl、150mM NaCl(pH 2.0)中,静置2分钟,之后洗脱抗体(盐酸洗脱法)。立即加入6.7μL的1.5M Tris-HCl(pH7.8)进行中和。洗脱2次,得到200μL纯化抗体。
通过盐酸洗脱法纯化的 WT-IgG1 WT-IgG2 WT-IgG4 的凝胶过滤层析分析
为了评价通过盐酸洗脱法得到的纯品的聚集物含量,进行凝胶过滤层析分析。
聚集物评价方法:
系统:Waters Alliance
柱:G3000SWxl(TOSOH)
流动相:50mM磷酸钠、300mM KCl、pH7.0
流速、波长:0.5mL/分钟、220nm
结果见图21。WT-IgG1纯化后的聚集物含量为约2%,相对于此,WT-IgG2和WT-IgG4纯化后的聚集物含量为约25%。由此认为:IgG1对盐酸洗脱时的酸稳定,而IgG2和IgG4对盐酸洗脱时的酸不稳定,发生变性、聚集化,由此可知:与IgG1相比,IgG2和IgG4在酸性条件下的稳定性低。在IgG分子的纯化中往往会使用蛋白A,而从蛋白A中洗脱IgG分子时则在酸性条件下进行。此外,开发IgG分子作为药品时必需将病毒灭活,该灭活通常在酸性条件下进行。由此可知:虽然希望IgG分子在酸性条件下的稳定性高,但IgG2和IgG4分子在酸性条件下的稳定性较IgG1差,首次明确了在开发IgG2和IgG4分子作为药品时存在酸生条件下的变性、聚集化的问题。认为在开发IgG2和IgG4分子作为药品时希望解决变性、聚集化的问题,但迄今为止通过氨基酸取代来解决此问题的方法未见报道。
WT-IgG2 WT-IgG4 CH3 结构域修饰体的制作和评价
由于IgG2和IgG4分子在酸性条件下的稳定性较IgG1差,所以研究IgG2和IgG4分子在酸性条件下的稳定性得到改善的修饰体。根据IgG2和IgG4分子的恒定区模型,认为在酸性条件下不稳定的要因在于CH3结构域中CH3/CH3界面的不稳定性,进行了各种研究,结果认为:IgG2中EU编号第397位的甲硫氨酸、IgG4中EU编号第409位的精氨酸分别使IgG2和IgG4的CH3/CH3界面不稳定。因此,制作了将IgG2的EU编号第397位的甲硫氨酸变成缬氨酸的抗体(IgG2-M397V,SEQ ID NO:111(氨基酸序列))和将IgG4的EU编号第409位的精氨酸变成赖氨酸的抗体(IgG4-R409K,SEQ ID NO:112(氨基酸序列))。
目标抗体的表达载体的制作、表达、纯化采用上述盐酸洗脱法来进行。为了评价通过盐酸洗脱法由蛋白A得到的纯品的聚集物含量,进行凝胶过滤层析分析。
聚集物评价方法:
系统:Waters Alliance
柱:G3000SWxl(TOSOH)
流动相:50mM磷酸钠、300mM KCl、pH7.0
流速、波长:0.5mL/分钟、220nm
结果见图21。WT-IgG1纯化后的聚集物含量为约2%,而WT-IgG2和WT-IgG4纯化后的聚集物含量为约25%。相对于此,作为CH3结构域修饰体的IgG2-M397V和IgG4-R409K的聚集物含量为约2%,与IgG1在同等水平。研究表明:通过将IgG2的EU编号第397位的甲硫氨酸变成缬氨酸、或者通过将IgG4的EU编号第409位的精氨酸变成赖氨酸,可以提高IgG2抗体和IgG4抗体在酸性条件下的稳定性。另外,按照与实施例5相同的方法测定WT-IgG2、WT-IgG4、IgG2-M397V、IgG4-R409K的热变性中间温度,结果表明:与WT-IgG2和WT-IgG4相比,IgG2-M397V和IgG4-R409K中分别导入了修饰的CH3结构域的Tm值均高。由此可知:与WT-IgG2和WT-IgG4相比,IgG2-M397V和IgG4-R409K的热稳定性也均优异。
由于IgG2和IgG4在使用了蛋白A的纯化步骤和病毒灭活步骤中被暴露在酸性条件下,所以上述步骤中的变性、聚集化成了问题。但通过使用IgG2-M397V和IgG4-R409K作为IgG2和IgG4的恒定区序列,可以解决上述问题。可知上述修饰在开发IgG2和IgG4抗体作为药品时极为有用。从IgG2-M397V和IgG4-R409K的热稳定性也优异方面考虑,两者也是有用的。
[ 实施例 8] 改善来自 IgG2 的二硫键的异质性
通过乙酸洗脱从蛋白 A 中纯化 WT-IgG1 WT-IgG2 WT-IgG4
向实施例7中得到的培养上清中添加50μL悬浮于TBS中的rProteinA SepharoseTM Fast FloW(Amersham Biosciences),在4℃下倒置混合4小时以上。将该溶液移至0.22μm滤杯Ultrafree(R)-MC(Millipore)中,用500μL TBS清洗3次,之后将rProtein A SepharoseTM树脂悬浮于100μL的50mM乙酸钠水溶液(pH3.3)中,静置2分钟,之后洗脱抗体。立即加入6.7μL的1.5M Tris-HCl(pH7.8)进行中和。洗脱2次,得到200μL的纯化抗体。
WT-IgG1 WT-IgG2 WT-IgG4 的阳离子交换层析 (IEC) 分析
为了评价纯化的WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4的均匀性,通过阳离子交换层析进行分析。
IEC评价方法:
系统:Waters Alliance
柱:ProPac WCX-10(Dionex)
流动相A:25mM MES-NaOH、pH6.1
B:25mM MES-NaOH、250mM乙酸钠、pH6.1
流速、波长:0.5mL/分钟、280nm
梯度B:分析WT-IgG1时,50%-75%(75分钟)
B:分析WT-IgG2和WT-IgG4时,30%-55%(75分钟)
结果见图22。由结果可知:在离子交换分析中,WT-IgG1和WT-IgG4为单峰,而WT-IgG2存在多个峰,与IgG1和IgG4相比,IgG2分子的异质性多。实际上,有人报道了IgG2的同种型的来自铰链区二硫键的异质性(不均匀性)(Chu GC,Chelius D,Xiao G,Khor HK, Coulibaly S,Bondarenko PV.Accumulation of Succinimide in aRecombinant Monoclonal Antibody in Mildly Acidic Buffers UnderElevated Temperatures.Pharm Res.2007 Mar 24;24(6):1145-56),认为图22所示的IgG2的杂峰也是来源于此的目标物质/相关物质。难以在维持目标物质/相关物质的异质性的制造间差的同时作为药品大量制造,希望开发作为药品的抗体分子尽可能是均匀(异质性少)的物质,因此,对于野生型IgG2而言,当开发抗体作为药品时,在重要的均匀性方面存在问题。实际上,US20060194280(A1)中报道了:天然型IgG2在离子交换层析分析中观察到了来自二硫键的各种杂峰,这些峰之间生物活性不同。作为将该杂峰单一化的方法,US20060194280(A1)中报道了在纯化步骤中进行重折叠的方法,但由于在制造中采用上述步骤会使成本增加且繁杂,所以优选通过氨基酸取代将杂峰单一化的方法。虽然认为在开发IgG2作为药品时,希望解决来自铰链区二硫键的异质性,但迄今为止通过氨基酸取代来解决此问题的方法未见报道。
WT-IgG2 CH1 结构域、铰链区的修饰体的制作和评价
如图23所示,认为IgG2分子存在各种二硫键构象。作为来自IgG2铰链区的二硫键的异质性的原因,认为是二硫键的不一致和游离半胱氨酸的存在。IgG2在上铰链区存在2个半胱氨酸(EU编号第219位和第220位),作为与该上铰链的2个半胱氨酸相邻的半胱氨酸,有存在于H链CH1结构域的EU编号第131位的半胱氨酸和L链C末端的半胱氨酸、以及二聚化的伙伴H链的相同上铰链的2个半胱氨酸。即,在IgG2的上铰链周边在H2L2缔合状态下总计有8个半胱氨酸相邻,由此认为存在由于二硫键的不一致和游离半胱氨酸产生的各种异质性。
为了降低来自IgG2铰链区的异质性,对IgG2的铰链区序列和CH1结构域进行了修饰。进行了用于避免IgG2中由于二硫键的不一致和游离半胱氨酸产生的异质性的研究。对各种修饰体进行研究的结果认为:通过将野生型IgG2恒定区序列中存在于H链CH1结构域的EU编号第131位的半胱氨酸和第133位的精氨酸分别修饰成丝氨酸和赖氨酸、并将存在于H链上铰链的EU编号第219位的半胱氨酸修饰成丝氨酸(以下记作IgG2-SKSC)(IgG2-SKSC,SEQ ID NO:120),可以在不降低热稳定性的情况下避免异质性。认为通过上述修饰,IgG2-SKSC的H链和L链的共价键通过在EU编号第220位的半胱氨酸与L链C末端的半胱氨酸之间的二硫键均一形成(图24)。
IgG2-SKSC的表达载体的制作、表达、纯化按照实施例1所述的方法进行。为了评价纯化的IgG2-SKSC和野生型IgG2(WT-IgG2)的均匀性,通过阳离子交换层析进行分析。
IEC评价方法:
系统:Waters Alliance
柱:ProPac WCX-10(Dionex)
流动相A:25mM MES-NaOH、pH5.6
B:25mM MES-NaOH、250mM乙酸钠、pH5.6
流速、波长:0.5mL/分钟、280nm
梯度B:50%-100%(75分钟)
结果见图25。如上所述,由结果可知:WT-IgG2存在多个峰,而IgG2-SKSC以单峰的形式洗脱。这表明:通过导入IgG2-SKSC的修饰使在EU编号第220位的半胱氨酸与L链C末端的半胱氨酸之间形成单一的二硫键,可以避免来自IgG2铰链区二硫键的异质性。按照与实施例5相同的方法测定WT-IgG1、WT-IgG2、IgG2-SKSC的热变性中间温度,结果:在WT-IgG2中观察到Tm值较WT-IgG1低的Fab结构域的峰,而在IgG2-SKSC中没有确认到这样的峰。由此可知:与WT-IgG2相比,IgG2-SKSC的热稳定性优异。
在开发抗体作为药品时,认为野生型IgG2在重要的均匀性方面存在问题,但已经明确:通过使用IgG2-SKSC作为IgG2的恒定区序列可以解决此问题,在开发IgG2作为药品时IgG2-SKSC非常有用。此外,从IgG2-SKSC的热稳定性也优异方面考虑,其也是有用的。
[ 实施例 9]IgG 分子的 C 末端异质性的改善
WT-IgG1 H C 末端Δ GK 抗体的表达载体的构建
作为抗体C末端序列的异质性,有人报道了:由C末端氨基酸的赖氨酸残基的缺失和C末端的2个氨基酸—甘氨酸和赖氨酸的缺失引起的C末端氨基的酰胺化(Johnson KA,Paisley-Flango K,Tangarone BS,Porter TJ,Rouse JC.Cation exchange-HPLC and mass spectrometryreveal C-terminal amidation of an IgG 1heavy chain(阳离子交换HPLC和质谱显示IgG1重链的C末端酰胺化).Anal Biochem.2007 Jan 1;360(1):75-83.),在开发抗体作为药品时,希望不存在上述异质性。实际上,即使在作为人源化PM-1抗体的TOCILIZUMAB中,其主要成分也是存在于核苷酸序列上的C末端氨基酸的赖氨酸在翻译后通过修饰而缺失的序列,残留有赖氨酸的副成分也以异质性的形式存在。因此,为了降低C末端氨基酸的异质性,对C末端氨基酸进行修饰。具体而言,通过预先使野生型IgG1的H链恒定区C末端的赖氨酸和甘氨酸从核苷酸序列上缺失,来研究是否可以抑制由C末端的2个氨基酸—甘氨酸和赖氨酸的缺失引起的C末端氨基的酰胺化。
使用实施例1中得到的人源化PM-1抗体(WT)的pB-CH载体,向H链C末端序列中导入突变。使用QuikChange位点定向诱变试剂盒(Stratagene),按照附录说明书中所述的方法,向编码EU编号第447位的Lys和/或EU编号第446位的Gly的核苷酸序列中导入突变,使其成为终止密码子。由此制作C末端的1个氨基酸—赖氨酸(EU编号第447位)预先缺失的抗体和C末端的2个氨基酸—甘氨酸和赖氨酸(分别为EU编号第446位和第447位)预先缺失的抗体的表达载体。通过表达人源化PM1抗体的L链,得到了H链C末端ΔK抗体和H链C末端ΔGK抗体。抗体的表达、纯化按照实施例1所述的方法进行。
纯化的H链C末端ΔGK抗体的阳离子交换层析分析如下进行。使用纯化的H链C末端ΔGK抗体,按照下述方法通过阳离子交换层析进行分析,评价C末端缺失对异质性的影响。阳离子交换层析分析条件如下,比较人源化PM1抗体、H链C末端ΔK抗体、H链C末端ΔGK抗体的层析图。
柱:ProPac WCX-10、4×250mm(Dionex)
流动相A:25mmol/L MES/NaOH、pH6.1
B:25mmol/L MES/NaOH、250mmol/L NaCl、pH6.1
流速:0.5mL/分钟
梯度:25%B(5分钟)→(105分钟)→67%B→(1分钟)→100%B(5分钟)
检测:280nm
未修饰的人源化PM-1抗体、H链C末端ΔK抗体、H链C末端ΔGK抗体的分析结果见图26。根据非专利文献(Chu GC,Chelius D,Xiao G,Khor HK,Coulibaly S,Bondarenko PV.Accumulation ofSuccinimide in a Recombinant Monoclonal Antibody in Mildly AcidicBuffers Under Elevated Temperatures.Pharm Res.2007 Mar 24;24(6):1145-56),保留时间较主峰延迟的基峰中包含H链C末端第449位的Lys残留体和第447位的Pro酰胺体,在H链C末端ΔK抗体中没有确认到基峰的大幅减少,但在H链C末端ΔGK抗体中确认到了基峰的大幅减少,由此可知:通过使H链C末端的2个氨基酸缺失,首次可以降低H链C末端异质性。
为了评价H链C末端的2个残基的缺失对热稳定性的影响,通过DSC测定H链C末端ΔGK抗体的热变性温度。作为DSC测定用,通过用含150mM NaCl的20mM乙酸缓冲液(pH6.0)进行透析来置换缓冲液。将人源化PM-1抗体、H链C末端ΔGK抗体和参比溶液(透析外液)充分脱气,之后将上述溶液分别封入量热计盒中,在40℃下充分进行热平衡。接下来,以约1K/分钟的扫描速度在40℃~100℃范围内进行DSC扫描。参考非专利文献(Rodolfo等人,ImmunologyLetters,1999,第47-52页),对所得变性峰进行峰指定时,确认C末端缺失对CH3结构域的热变性温度没有影响。
由此,通过预先使H链恒定区的C末端的赖氨酸和甘氨酸从核苷酸序列上缺失,可以在不影响抗体热稳定性的同时降低C末端氨基酸的异质性。由于在人抗体恒定区IgG1、IgG2、IgG4中C末端序列的EU编号第447位均为Lys、EU编号第446位均为Gly,所以认为在本实施例中等发现的降低C末端氨基酸异质性的方法也可适用于IgG2恒定区和IgG4恒定区、或它们的修饰体。
[ 实施例 10] 新型最优化恒定区 M14 Δ GK 序列的制作
在以中和抗原为目的的抗体药物中,不需要Fc区所具有的ADCC等效应子功能,所以不必与Fcγ受体结合。从免疫原性和副作用的角度考虑,认为并不优选与Fcγ受体的结合(Strand V,Kimberly R,IsaacsJD.Biologic therapies in rheumatology:lessons learned,future directions.Nat Rev Drug Discov.2007 Jan;6(1):75-92.,Gessner JE,Heiken H,Tamm A,Schmidt RE.The IgG Fc receptor family.Ann Hematol.1998Jun;76(6):231-48.)。作为人源化抗IL-6受体IgG1抗体的TOCILIZUMAB与IL-6受体进行特异性结合,通过中和其生物学作用,可以用作类风湿性关节炎等与IL-6有关的疾病的治疗药,不必与Fcγ受体结合。
Fc γ受体非结合的最优化恒定区 M14 Δ GK 的制作和评价
作为降低与Fcγ受体结合的方法,认为有将IgG抗体的同种型由IgG1变为IgG2或IgG4同种型的方法(Ann.Hematol.1998 Jun;76(6):231-48.)。作为完全消除与Fcγ受体结合的方法,有人报道了:向Fc区中导入人工修饰的方法。例如,由于抗CD3抗体和抗CD4抗体的效应子功能会引起副作用,所以向Fc区的Fcγ受体结合部分导入野生型序列中不存在的氨基酸突变(Cole MS,Anasetti C,Tso JY.Human IgG2 variants of chimeric anti-CD3 are nonmitogenic to T cells.JImmunol.1997 Oct 1;159(7):3613-21.,Reddy MP,Kinney CA,ChaikinMA,Payne A,Fishman-Lobell J,Tsui P,Dal Monte PR,Doyle ML,Brigham-Burke MR,Anderson D,Reff M,Newman R,Hanna N,SweetRW,Truneh A.Elimination of Fc receptor-dependent effector functions ofa modified IgG4 monoclonal antibody to human CD4.J Immunol.2000Feb 15;164(4):1925-33.),所得的Fcγ受体非结合型的抗CD3抗体和抗CD4抗体的临床试验正在进行中(Strand V,Kimberly R,Isaacs JD.Biologic therapies in rheumatology:lessons learned,future directions.NatRev Drug Discov.2007 Jan;6(1):75-92.,Chau LA,Tso JY,Melrose J,Madrenas J.HuM291(Nuvion),a humanized Fc receptor-nonbindingantibody against CD3,anergizes peripheral blood T cells as partial agonistof the T cell receptor.Transplantation.2001 Apr 15;71(7):941-50.)。有报道称:通过将IgG1的FcγR结合位点(EU编号第233、234、235、236、327、330、331位)转换成IgG2(EU编号第233、234、235、236位)和IgG4(EU编号第327、330、331位)的序列,可以制作Fcγ受体非结合型抗体(Kim SJ,Park Y,Hong HJ.,Antibody engineering for thedevelopment of therapeutic antibodies.,Mol Cells.2005Aug 31;20(1):17-29.Review.)。但若将上述所有突变导入IgG1中,则出现能够形成天然不存在的T细胞表位肽的9个氨基酸的新型肽序列,免疫原性风险会升高。在开发抗体作为药品时,希望免疫原性风险极低。
为了解决上述课题,研究了IgG2恒定区的修饰。在IgG2恒定区的FcγR结合位点中,EU编号第233、234、235、236位是非结合型,而FcγR结合位点中EU编号第327、330、331位是不同于非结合型IgG4的序列,所以必需将EU编号第327、330、331位的氨基酸变成IgG4的序列(Eur.J.Immunol.1999Aug;29(8):2613-24中的G2Δa)。但IgG4中EU编号第339位的氨基酸是丙氨酸,而IgG2中是苏氨酸,所以只将EU编号第327、330、331位的氨基酸变成IgG4的序列,就可出现能够形成天然不存在的T细胞表位肽的9个氨基酸的新型肽序列,导致免疫原性风险升高,因此不优选。所以本发明人发现:除上述修饰外,还将IgG2的EU编号第339位的苏氨酸取代成丙氨酸,从而可以防止新的肽序列的出现。
除了导入上述突变外,还导入了下述突变:实施例7中发现的提高IgG2在酸性条件下的稳定性的、IgG2中EU编号第397位的甲硫氨酸取代成缬氨酸的突变;实施例8中发现的改善来自铰链区二硫键的异质性的、EU编号第131位的半胱氨酸取代成丝氨酸的突变、EU编号第133位的精氨酸取代成赖氨酸的突变、以及EU编号第219位的半胱氨酸取代成丝氨酸的突变。并且,随着第131位和第133位的突变的导入,出现能够形成天然不存在的T细胞表位肽的9个氨基酸的新型肽序列,出现免疫原性风险,所以通过导入EU编号第137位的谷氨酸取代成甘氨酸的突变、第138位的丝氨酸取代成甘氨酸的突变,使第131位~第139位附近的肽序列与天然存在的人序列相同。并且,为了降低来自C末端的异质性,使H链C末端EU编号第446、447位的甘氨酸和赖氨酸缺失。将导入有上述所有突变的恒定区序列作为M14ΔGK(M14ΔGK,SEQ ID NO:24)。虽然M14ΔGK中存在1处由第219位的半胱氨酸取代成丝氨酸的突变作为能够形成T细胞表位肽的9个氨基酸的新的肽序列,但由于半胱氨酸和丝氨酸作为氨基酸序列的性质近似,所以认为免疫原性的风险极小。利用TEPITOPE进行的免疫原性预测中,也没有确认到免疫原性的变化。
按照实施例1所述的方法制作具有WT作为可变区序列、具有M14ΔGK作为恒定区序列的抗体H链序列(M14ΔGK,SEQ ID NO:24;WT-M14ΔGK,SEQ ID NO:113)的表达载体,使用WT-M14ΔGK作为H链、使用WT作为L链,按照实施例1所述的方法进行表达、纯化。
按照相同的方法制作WT-M17ΔGK(M17ΔGK,SEQ ID NO:116;WT-M17ΔGK,SEQ ID NO:115),在所述WT-M17ΔGK中,向IgG1恒定区的EU编号第233、234、235、236、327、330、331、339位中导入突变(Eur.J.Immunol.1999Aug;29(8):2613-24中的G1Δab),以降低与Fcγ受体的结合,并且使EU编号第446位和第447位的氨基酸缺失,以降低C末端的异质性(实施例9)。制作WT-M11ΔGK(M11ΔGK,SEQ ID NO:25;WT-M11ΔGK,SEQ ID NO:114)的表达载体,在所述WT-M11ΔGK中,向IgG4恒定区的EU编号第233、234、235、236位中导入突变,以降低与Fcγ受体的结合(Eur.J.Immunol.1999Aug;29(8):2613-24中的G4Δb;在该修饰中,由于产生新的非人序列,所以免疫原性风险提高);为了降低免疫原性风险,除上述修饰外,还向EU编号第131、133、137、138、214、217、219、220、221、222位中导入突变,使铰链区二硫键的构象与M14ΔGK的相同;并且,向EU编号第409位中导入突变,以提高在酸性条件下的稳定性(实施例7);使EU编号第446位和第447位的氨基酸缺失,以降低C末端异质性(实施例9)。使用WT-M17ΔGK或WT-M11ΔGK作为H链、使用WT作为L链,按照实施例1所述的方法进行表达、纯化。
WT-M14 Δ GK WT-M17 Δ GK WT-M11 Δ GK Fc γ受体结合活性的评价
与FcγRI结合的评价如下进行。使用Biacore T100,使固定在传感器芯片上的来源于人的Fcγ受体I(以下记作FcγRI)与用作分析物的IgG1、IgG2、IgG4、M11ΔGK、M14ΔGK、M1ΔGK7进行相互作用,比较其结合量。来源于人的FcγRI使用重组人FcRIA/CD64(R&DSystems),使用IgG1、IgG2、IgG4、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK作为样品进行测定。利用胺耦合法将FcγRI固定在传感器芯片CM5(BIACORE)上。hFcγRI的最终固定量为约13000RU(resonance units,共振单位)。运行缓冲液使用HBS-EP+,流速为20μL/分钟。将样品用HBS-EP+调整成100μg/mL的浓度。分析包括下述两个步骤:首先是2分钟的结合相,注入10μL抗体溶液,之后是4分钟的解离相,注入液切换成HBS-EP+。解离相结束后,注入20μL的5mM氢氧化钠,由此使传感器芯片再生。以此结合、解离、再生作为1个分析周期,注入各种抗体溶液,得到传感图。依次注入作为分析物的IgG4、IgG2、IgG1、M11、M14、M17,重复操作2次。测定的结合量数据的比较结果见图27。其结果,结合量按IgG1>IgG4>>IgG2=M11ΔGK=M14ΔGK=M17ΔGK的顺序递减,由此可知:与野生型IgG1、IgG4相比,野生型IgG2、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK与FcγRI的结合弱。
与FcγRIIa结合的评价如下进行。使用Biacore T100,使固定在传感器芯片上的来源于人的Fcγ受体IIa(以下记作FcγRIIa)与用作分析物的IgG1、IgG2、IgG4、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK发生相互作用,之后比较其结合量。来源于人的FcγRIIa使用重组人FcRIIA/CD32a(R&D Systems),使用IgG1、IgG2、IgG4、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK作为样品进行测定。利用胺耦合法将FcγRIIa固定在传感器芯片CM5(BIACORE)上。FcγRIIa的最终固定量为约3300RU。运行缓冲液使用HBS-EP+,流速为20μL/分钟。之后,注入运行缓冲液直至基线稳定,基线稳定后开始测定。使作为分析物的各IgG同种型(IgG1、IgG2、IgG4)和导入有突变的抗体(M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK)与固定的FcγRIIa发生相互作用,观察其结合量。运行缓冲液使用HBS-EP+,流速为20μL/分钟,测定温度为25℃。将各IgG和修饰体调整成100μg/mL,注入20μL分析物,使其与固定的FcγRIIa发生相互作用。进行相互作用后,注入200μL运行缓冲液,从而使分析物自FcγRIIa上解离,使传感器芯片再生。依次注入分析物IgG4、IgG2、IgG1、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK,重复操作2次。测定的结合量数据的比较结果见图28。其结果,结合量按IgG1>IgG2=IgG4>M11ΔGK=M14ΔGK=M17ΔGK的顺序递减,由此可知:与野生型IgG1、IgG2、IgG4相比,M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK与FcγRIIa的结合弱。
与FcγRIIb结合的评价如下进行。使用Biacore T100,使固定在传感器芯片上的、来源于人的Fcγ受体IIb(以下记作FcγRIIb)与用作分析物的IgG1、IgG2、IgG4、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK发生相互作用,比较其结合量。来源于人的FcγRIIb使用重组人FcRIIB/C(R&D Systems),使用IgG1、IgG2、IgG4、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK作为样品进行测定。通过胺耦合法将FcγRIIb固定在传感器芯片CM5(BIACORE)上,FcγRIIb的最终固定量为约4300RU。之后,注入运行缓冲液直至基线稳定,基线稳定后开始测定。使作为分析物的各IgG同种型(IgG1、IgG2、IgG4)和导入有突变的抗体(M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK)与固定的FcγRIIb发生相互作用,观察其结合量。运行缓冲液使用HBS-EP+(10mM HEPES、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05%v/v Surfactant P20),流速为20μL/分钟,测定温度为25℃。将各IgG及其修饰体调整成200μg/mL,注入20μL分析物,使其与固定的FcγRIIb发生相互作用。发生相互作用后,注入200μL运行缓冲液,使分析物自FcγRIIb上解离,使传感器芯片再生。依次注入分析物IgG4、IgG2、IgG1、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK,重复操作2次。测定的结合量数据的比较结果见图29。其结果,结合量按IgG4>IgG1>IgG2>M11ΔGK=M14ΔGK=M17ΔGK的顺序递减,由此可知:与野生型IgG1、IgG2、IgG4相比,M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK与FcγRIIb的结合弱。
与FcγRIIIa结合的评价如下进行。使用Biacore T100,使固定在传感器芯片上的、来源于人的Fcγ受体IIIa(以下记作FcγRIIIa)与用作分析物的IgG1、IgG2、IgG4、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK发生相互作用,比较其结合量。来源于人的FcγRIIIa使用hFcγRIIIaV-His6(重组hFcγRIIIaV-His6:社内制品),使用IgG1、IgG2、IgG4、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK作为样品进行测定。通过胺耦合法将FcγRIIIa固定在传感器芯片CM5(BIACORE)上,hFcγRIIIaV-His6的最终固定量为约8200RU(resonance units,共振单位)。运行缓冲液使用HBS-EP+,流速为5μL/分钟。将样品用HBS-EP+调整成250μg/mL的浓度。分析包括下述两个步骤:首先是2分钟的结合相,注入10μL 抗体溶液,之后是4分钟的解离相,注入液切换成HBS-EP+。解离相结束后,注入20μL的5mM盐酸,从而使传感器芯片再生。将该结合、解离、再生作为1个分析周期,注入各种抗体溶液,得到传感图。依次注入作为分析物的IgG4、IgG2、IgG1、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK。测定的结合量数据的比较结果见图30。其结果,结合量按IgG1>>IgG4>IgG2>M17ΔGK>M11ΔGK=M14ΔGK的顺序递减,这表明:与野生型IgG1、IgG2、IgG4相比,M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK与FcγRIIIa的结合弱。此外,与Eur.J.Immunol.1999Aug;29(8):2613-24中报道的、包含G1Δab突变的M17ΔGK相比,可知M11ΔGK、M14ΔGK与FcγRIIIa的结合更弱。
由上述结果确认:与野生型IgG1相比,WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK与各种Fcγ受体的结合明显降低。通过使用WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK作为恒定区,可以避免由于Fcγ受体介导的内化到APC中的免疫原性风险和由于ADCC等效应子功能引起的副作用,所以WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK作为以中和抗原为目的的抗体药物的恒定区序列是有用的。
WT-M14 Δ GK WT-M17 Δ GK WT-M11 Δ GK 的高浓度稳定性试验
评价WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK在高浓度制剂中的稳定性。将WT-IgG1、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK的纯化抗体用20mM组氨酰氯、150mM NaCl、pH6.5的溶液进行透析(EasySEP,TOMY),之后用超滤膜进行浓缩,进行高浓度稳定性试验。试验条件如下。
抗体:WT-IgG1、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK
缓冲液:20mM组氨酰氯、150mM NaCl、pH6.5
浓度:61mg/mL
保存温度和保存时间:40℃下2周、40℃下1个月、40℃下2个月
聚集物评价方法:
系统:Waters Alliance
柱:G3000SWxl(TOSOH)
流动相:50mM磷酸钠、300mM KCl、pH7.0
流速、波长:0.5mL/分钟、220nm
将样品稀释100倍后进行分析
利用上述凝胶过滤层析法评价原始制剂(刚制成的制剂)和在各种条件下保存后的制剂的聚集物含量,原始制剂中聚集物含量的变化量见图31。其结果,与WT-IgG1相比,WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK的聚集物增加量低,为WT中聚集物增加量的约1/2。如图32所示,就Fab片段的增加量而言,WT-IgG1和WT-M17ΔGK程度相同,但WT-M14ΔGK和WT-M11ΔGK中Fab片段的增加量为WT中的Fab片段增加量的约1/4。作为IgG型抗体制剂的变性途径(degeneration pathway),如WO 2003/039485所述,主要是聚集物的生成和Fab分解物的生成。研究发现:与WT-IgG1相比,WT-M14ΔGK和WT-M11ΔGK在聚集物的生成及Fab片段的生成这两个方面制剂的稳定性均优异。由此认为:即使是在IgG1恒定区的稳定性不充分、无法制成可以开发作为药品的高浓度溶液制剂的抗体,通过使用WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK作为恒定区,也可以制作具有更高稳定性的高浓度溶液制剂。
特别是M14ΔGK,认为其作为新的恒定区序列极为有用,所述新的恒定区序列使原始IgG2分子所具有的酸性条件下的不稳定性提高、改善了来自铰链区二硫键的异质性、不与Fcγ受体结合、将能够形成T细胞表位肽的9个氨基酸的新的肽序列抑制在最低限度、并且在高浓度制剂中的稳定性优于IgG1。
[ 实施例 11]PF1-M14 Δ GK 抗体的制作
使用XhoI/NheI切出实施例5中制作的PF1(恒定区为IgG1)的可变区部分,使用NheI/NotI切出实施例7中制作的M14ΔGK(可变区为WT)的恒定区部分,将2个H链抗体基因片段插入动物细胞表达用载体中,制作目标PF1-M14ΔGK的H链表达载体(PF1_H-M14ΔGK,SEQID NO:117)。L链使用PF1_L,按照实施例1所述的方法进行PF1-M14ΔGK抗体的表达、纯化。
PF1-M14ΔGK抗体作为抗IL-6受体抗体药物在各方面都优于WT(人源化PM-1抗体),认为其极为有用。
[ 实施例 12]M31 Δ GK 的制作和评价
将实施例10中制作的M14ΔGK的EU编号第330、331、339位的氨基酸变成IgG2的序列,制作M31ΔGK(M31ΔGK,SEQ ID NO:118)。按照实施例1所述的方法制作具有WT作为可变区序列、具有M31ΔGK作为恒定区序列的抗体H链序列(WT-M31ΔGK,SEQ ID NO:119)的表达载体,使用WT-M31ΔGK作为H链、使用WT作为L链,按照实施例1所述的方法表达、纯化WT-M31。
除WT-M31外,同时表达、纯化的WT-IgG2和WT-M14ΔGK的阳离子交换层析分析如下进行。阳离子交换层析分析条件如下,比较WT-IgG2、WT-M14ΔGK、WT-M31ΔGK的层析图。
柱:ProPac WCX-10、4×250mm(Dionex)
流动相A:25mmol/L MES/NaOH、pH6.1
B:25mmol/L MES/NaOH、250mmol/L NaCl、pH6.1
流速:0.5mL/分钟
梯度:0%B(5分钟)→(65分钟)→100%B→(1分钟)
检测:280nm
WT-IgG2、WT-M14ΔGK、WT-M31ΔGK的分析结果见图33。由结果可知:WT-IgG2存在多个峰,但WT-M31ΔGK和WT-M14ΔGK一样以单峰的形式洗脱。这表明:即使在WT-M31ΔGK中也可以避免来自IgG2的铰链区二硫键的异质性。
[ 实施例 13] 完全人源化抗体 F2H/L39-IgG1 的制作
PF1 抗体的构架序列的完全人源化
在实施例5制作的PF1_H中,仅第71位(Kabat编号;Kabat EA等人.1991.Sequence of Proteins of Immunological Interest(目标免疫蛋白序列).NIH)的精氨酸是原样残留的小鼠序列,所以从免疫原性的角度考虑并不优选。通常H链的第71位残基是决定HCDR2结构的重要序列,有报道称:实际上在制作人源化PM1抗体时,第71位的残基对小鼠PM1抗体的结合活性是重要的,已经明确:若将第71位由精氨酸取代成缬氨酸,则结合活性大幅下降(Cancer Research 53,851-856,1993)。同样,PF1_H被分类为人生殖系列基因的VH4家族,VH4家族中的第71位高度保存缬氨酸。确认到:若将第71位的精氨酸取代成缬氨酸,则中和活性大幅下降。
因此,为了保留第71位的精氨酸残基不变而完全除去小鼠序列,本发明人等研究了人生殖系列基因和所报道的人抗体序列,探索了第71位为精氨酸、且保有对维持抗体的立体结构重要的残基的序列。结果发现了一个候选序列,虽然该候选序列与表9所示的PF1_H的同源性低,但却保存有重要的残基。
[表9]
通过将PF1_H-IgG1的Kabat编号第66位~第94位取代成上述候选序列,设计了H96-IgG1(SEQ ID NO:134氨基酸序列)。通过组合有合成寡DNA的PCR法(装配PCR),制作抗体可变区。通过PCR法由IgG1的表达载体扩增恒定区。利用装配PCR法使抗体可变区与恒定区结合,之后插入动物细胞表达用载体中。H96/PF1L-IgG1的表达、纯化按照实施例1所述的方法进行。
构架完全人源化抗体 H96/PF1L-IgG1 的评价
使用纯化的H96/PF1L-IgG1,按照实施例5所述的方法测定Tm值。亲和性的测定原则上是按照与实施例5相同的条件进行。其中,将SR344的浓度调整成0、0.36、1.4μg/mL,且测定解离相15分钟。其结果,H96/PF1L-IgG1显示出与PF1-IgG1几乎同等的Tm值和亲和性(表10)。
[表10]
Tm(℃) ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
PF1抗体 91.3 1.4E+06 4.2E-05 3.1E-11
H96/PF1L-IgG1 89.8 1.2E+06 4.8E-05 3.9E-11
如上所述,通过将PF1抗体的H链作为H96,在维持Tm值和亲和性不变的同时将PF1抗体中残留的小鼠序列完全除去,得到将PF1抗体构架完全人源化的抗体。由于H96/PF1L-IgG1的构架序列中不存在来源于小鼠的序列,所以从免疫原性的角度考虑,认为H96/PF1L-IgG1特别优异。
pI 降低和免疫原性风险降低的 F2H/L39-IgG1 的制作
如实施例4所示,已经明确:通过修饰抗体可变区的氨基酸、降低pI,可以提高血浆中滞留性。因此,向上述制作的H96-IgG1中进一步导入下述氨基酸取代。为了降低pI,将第64位的赖氨酸取代成谷氨酰胺、将第65位的甘氨酸取代成天冬氨酸。另外,为了降低免疫原性风险,将第105位的谷氨酸取代成谷氨酰胺、将第107位的苏氨酸取代成异亮氨酸。并且,作为实施例2中得到的增强亲和性的修饰,将第95位的缬氨酸取代成亮氨酸、将第99位的异亮氨酸取代成丙氨酸。按照实施例1所述的方法,向H96-IgG1中导入上述氨基酸取代,制作F2H-IgG1(SEQ ID NO:135(氨基酸序列))。
向PF1L中导入下述氨基酸取代。为了降低pI,将第27位的谷氨酰胺取代成谷氨酸、将第55位的亮氨酸取代成谷氨酸。按照实施例1所述的方法,向PF1L中导入上述氨基酸取代,制作L39(SEQ ID NO:136(氨基酸序列))。利用实施例1所述的方法进行F2H/L39-IgG1的表达、纯化。
利用 Biacore 分析 F2H/L39-IgG1 与人 IL-6 受体的亲和性
测定人源化PM1抗体(野生型、WT)、PF1抗体(实施例5中制作)和F2H/L39-IgG1的亲和性。本测定原则上是按照与实施例4相同的条件进行。其中,将SR344的浓度调整成0、0.36、1.4μg/mL,且测定解离相15分钟(表11)。
[表11]
结果表明:F2H/L39-IgG1的KD值维持在10-11数量级,具有极强的亲和性,但是与PF1-IgG1相比,其k a 值下降至约1/2。
F2H/L39-IgG1 的人 IL-6 受体中和活性的评价
按照实施例1所示的方法,评价人源化PM1抗体(野生型、WT)和F2H/L39-IgG1的中和活性。其中,使人白介素-6(TORAY)的浓度达到600ng/mL,再进行中和活性的评价。如图34所示,可知:与WT相比,F2H/L39-IgG1在100%抑制浓度下保持100倍以上的极强的活性。
通过等电点电泳评价 F2H/L39-IgG1 的等电点
按照实施例3所述的方法测定F2H/L39-IgG1的等电点。F2H/L39-IgG1的等电点为5.5,与实施例5制作的PF1抗体相比,通过进一步降低等电点,使血浆中滞留性进一步得到改善。
利用GENETYX(GENETYX CORPORATION)计算该F2H/L39可变区(VH、VL序列)的理论等电点时,其理论等电点为4.3。而WT的理论等电点为9.20,所以通过对WT进行氨基酸取代,得到了可变区的理论等电点下降了约4.9的F2H/L39。
利用食蟹猴进行 F2H/L39-IgG1 PK/PD 试验
评价人源化PM1抗体(野生型、WT)、PF1抗体和F2H/L39-IgG1在食蟹猴体内的药物动力学(PK)和药效(PD)。将WT、PF1和F2H/L39-IgG1以1.0mg/kg进行皮下给药,于给药前和给药后随时间而采血。按照与实施例6相同的方式测定各抗体的血浆中浓度。WT、PF1和F2H/L39-IgG1的血浆中浓度变化见图35。为了评价各抗体中和膜型食蟹猴IL-6受体的药效,于抗体给药后第3天~第10天将食蟹猴IL-6以5μg/kg在腰背部连日进行皮下给药,测定24小时后各个体的CRP浓度。WT和F2H/L39给药后的CRP浓度变化见图36。为了评价各抗体中和可溶型食蟹猴IL-6受体的药效,测定食蟹猴血浆中非结合型的可溶型食蟹猴IL-6受体浓度。WT和F2H/L39给药后非结合型的可溶型食蟹猴IL-6受体的浓度变化见图37。
由上述结果可知:WT和PF1的血浆中浓度变化几乎相同,与这两种抗体相比,pI进一步降低的F2H/L39-IgG1抗体的血浆中浓度维持在高水平。另外发现:与WT相比,与IL-6受体亲和性强的F2H/L39-IgG1的CRP浓度和非结合型的可溶型食蟹猴IL-6受体浓度均维持在更低的水平。
[ 实施例 14]WT-M14 的血浆中滞留性的评价
人体内的血浆中滞留性的预测方法
IgG分子的血浆中滞留性长(消除慢),这是由于作为IgG分子的补救受体而已知的FcRn在起作用(Nat.Rev.Immunol.2007 Sep;7(9):715-25)。通过胞饮作用进入核内体中的IgG分子,其在核内体内的酸性条件下(pH6.0附近)与在核内体内表达的FcRn结合。无法与FcRn结合的IgG分子进入溶酶体内,被溶酶体分解,但与FcRn结合的IgG分子向细胞表面移动,在血浆中的中性条件下(pH7.4附近)自FcRn上解离,又返回到血浆中。
作为IgG型抗体,已知有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4同种型,有报道称,上述同种型在人体内的血浆中半衰期分别为:IgG1、IgG2的半衰期为约36天;IgG3的半衰期为约29天;IgG4的半衰期为16天(Nat.Biotechnol.2007Dec;25(12):1369-72),认为IgG1和IgG2的血浆中滞留性最长。通常,抗体药物的同种型为IgG1、IgG2、IgG4,作为进一步提高上述IgG抗体的血浆中滞留性的方法,有人报道了:通过修饰IgG恒定区的序列来提高上述的与人FcRn的结合活性的方法(J.Biol.Chem.2007 Jan 19;282(3):1709-17;J.Immunol.2006 Jan 1;176(1):346-56)。
由于小鼠FcRn与人FcRn之间存在种特异性差异(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2006 Dec 5;103(49):18709-14),所以为了预测恒定区序列已发生修饰的IgG抗体在人体内的血浆中滞留性,认为希望评价与人FcRn的结合以及在人FcRn转基因小鼠体内的血浆中滞留性(Int.Immunol.2006 Dec;18(12):1759-69)。
与人 FcRn 结合的评价
FcRn是FcRn与β2-微球蛋白的复合体。根据公开的人FcRn基因序列(J.Exp.Med.(1994)180(6),2377-2381)制作寡DNA引物。以人cDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA,Clontech)为模板,使用制作的引物,通过PCR法调整编码全长基因的DNA片段。以得到的DNA片段为模板,通过PCR法扩增编码包含信号区的胞外区(Met1-Leu290)的DNA片段,之后将其插入动物细胞表达载体中(人FcRn氨基酸序列、SEQ ID NO:140)。同样,根据公开的人β2-微球蛋白基因序列(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.99(26),16899-16903(2002))制作寡DNA引物。以人cDNA(Hu-Placenta Marathon-Ready cDNA,CLONTECH)为模板,使用制作的引物,利用PCR法制备编码全长基因的DNA片段。以所得的DNA片段为模板,通过PCR法扩增编码包含信号区的全长β2-微球蛋白(Metl-Met1 19)的DNA片段,之后将其插入动物细胞表达载体中(人β2-微球蛋白氨基酸序列、SEQ ID NO:141)。
可溶型人FcRn的表达按照下述程序进行。采用使用了10%胎牛血清(Invitrogen)的脂质转染法,将制备的人FcRn和人β2-微球蛋白的质粒导入来自人胚肾癌细胞的HEK293H株(Invitrogen)细胞中。回收所得的培养上清,之后使用IgG Sepharose 6 Fast Flow(AmershamBiosciences),按照(J.Immunol.2002 Nov 1;169(9):5171-80)的方法进行纯化。之后,使用HiTrap Q HP(GE Healthcare)进行纯化。
评价与人FcRn的结合时使用Biacore 3000,使作为分析物的人FcRn与抗体相互作用,所述抗体与固定在传感器芯片上的蛋白L或兔抗人IgGκ链抗体结合。由相互作用时的人FcRn的结合量算出亲和性(KD)。具体而言,使用含有150mM NaCl的50mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)作为运行缓冲液,利用胺耦合法将蛋白L或兔抗人IgGκ链抗体固定在传感器芯片CM5(BIACORE)上。之后,用含有0.02%Tween20的运行缓冲液稀释抗体并注入,使抗体与芯片结合,之后注入人FcRn,评价人FcRn与抗体的结合活性[0]。
计算亲和性时使用BIA评估软件。由得到的传感图求出在人FcRn注入即将结束前与抗体结合的hFcRn的量,通过稳态亲和法进行拟合,算出抗体与人FcRn的亲和性。
FcRn 转基因小鼠体内的血浆中滞留性的评价
人FcRn转基因小鼠(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 276+/+小鼠;Jackson Laboratories)的体内动力学的评价如下进行。将抗体以1mg/kg的给药量对小鼠进行静脉内单次给药,在适当的时间点采血。采集的血液立即在4℃下以15,000rpm的转速离心15分钟,得到血浆。分离的血浆在实施测定前一直保存在被设定为-20℃以下的冷库中。血浆中浓度按照ELISA法来测定。
WT-M14 在人体内的血浆中滞留性的预测评价
利用BIAcore评价WT-IgG1和WT-M14与人FcRn的结合活性,结果如表12所示,与WT-IgG1相比,WT-M14的结合活性略强。
[表12]
KD(μM)
WT-IgG1 2.07
WT-M14 1.85
但是,对WT-IgG1和WT-M14在人FcRn转基因小鼠体内的血浆中滞留性进行了评价,其结果如图38所示,WT-IgG1和WT-M14显示出同等的血浆中滞留性,由此认为:即使在人体内M14恒定区也显示出与IgG1恒定区同等的血浆中滞留性。
[ 实施例 15] 血浆中滞留性得到提高的 WT-M44 WT-M58 WT-M73 的制作
WT-M58 分子的制作
如实施例14所示,WT-M14在人FcRn转基因小鼠体内的血浆中滞留性与WT-IgG1同等。作为提高血浆中滞留性的方法,已知有降低抗体等电点的方法和增强FcRn结合活性的方法,但为了提高WT-M14的血浆中滞留性,导入下述修饰。具体而言,将实施例4中由WT-M14制作的WT-M31ΔGK的EU编号第397位的缬氨酸取代成甲硫氨酸、将第268位的组氨酸取代成谷氨酰胺、将第355位的精氨酸取代成谷氨酰胺、将第419位的谷氨酰胺取代成谷氨酸。将上述4处修饰导入WT-M31ΔGK中,制作WT-M58(SEQ ID NO:142(氨基酸序列))。表达载体的制作按照实施例1所述的方法进行。使用WT-M58作为H链、使用L(WT)作为L链。WT-M58的表达、纯化按照实施例1所述的方法进行。
WT-M73 分子的制作
另一方面,将IgG1的EU编号第434位的氨基酸取代成丙氨酸来制作WT-M44(SEQ ID NO:143(氨基酸序列))。再使M44的第446位的甘氨酸和第447位的赖氨酸缺失,以降低H链C末端的异质性,来制作WT-M83(SEQ ID NO:185(氨基酸序列))。将WT-M58的EU编号第434位的氨基酸取代成丙氨酸来制作WT-M73(SEQ ID NO:144(氨基酸序列))。
上述抗体的表达载体的制作按照实施例1的方法进行,使用WT-M44、WT-M58或WT-M73作为H链,使用L(WT)作为L链。WT-M44、WT-M58和WT-M73的表达、纯化按照实施例1所述的方法进行。
WT-M44 WT-M58 WT-M73 在人体内的血浆中滞留性的预测评价
使用BIAcore评价WT-IgG 1、WT-M44、WT-M58和WT-M73与人FcRn的结合活性,结果如表13所示,WT-M44、WT-M58和WT-M73的结合活性均较WT-IgG1优异,分别为WT-IgG1的约2.7倍、约1.4倍和约3.8倍左右。
[表13]
KD(μM)
WT-IgG1 1.62
WT-M44 0.59
WT-M58 1.17
WT-M73 0.42
对WT-IgG1、WT-M44和WT-M58在人FcRn转基因小鼠体内的血浆中滞留性进行了评价,其结果如图39所示,确认到:与WT-IgG1和WT-M44相比,WT-M58的血浆中滞留性有所提高。并且,对WT-IgG1、WT-M44、WT-M58和WT-M73在人FcRn转基因小鼠体内的血浆中滞留性进行了评价,其结果如图40所示,确认到:与WT-IgG1相比,WT-M44、WT-M58和WT-M73的血浆中滞留性均有所改善,其血浆中滞留性的改善效果与人FcRn结合能力相关。其中,与WT-IgG1相比,WT-M73在28天后的血浆中浓度改善约16倍,由此认为:即使在人体内,与具有IgG1恒定区的抗体相比,具有M73 恒定区的抗体的血浆中滞留性也大幅提高。
[ 实施例 16] 新的恒定区 M14 M58 降低各种抗体的异质性的效果
如实施例8所示,确认到:在作为抗IL-6受体抗体的人源化PM1抗体(WT)中,通过将恒定区由IgG2变成M14,可以降低来自IgG2的铰链区的异质性。因此,研究对于除人源化PM1抗体以外的IgG2型抗体,也进行了下述的研究:即通过将恒定区变成M14或M58,来研究其能否降低异质性。
作为除人源化PM1抗体以外的抗体,使用了作为抗IL-6受体抗体的F2H/L39(F2H/L39_VH氨基酸序列,SEQ ID NO:145;F2H/L39VL氨基酸序列,SEQ ID NO:146)、作为抗IL-31受体抗体的H0L0(H0L0_VH氨基酸序列,SEQ ID NO:147;H0L0_VL氨基酸序列,SEQID NO:148)、作为抗RANKL抗体的DNS(DNS_VH氨基酸序列,SEQID NO:149;DNS_VL氨基酸序列,SEQ ID NO:150)。对于各抗体,制作恒定区为IgG1(SEQ ID NO:19)、IgG2(SEQ ID NO:20)和M14(SEQ ID NO:24)或M58(SEQ ID NO:151)的抗体。
作为异质性的评价方法,通过阳离子交换层析进行评价。评价制作的抗体的异质性时,柱使用ProPac WCX-10(Dionex),流动相A使用20mM乙酸钠(pH5.0),流动相B使用20mM乙酸钠/1M NaCl(pH5.0),采用适当的流速和梯度进行评价。通过阳离子交换层析(IEC)进行评价的结果见图41。
如图41所示,确认到:不仅在作为抗IL-6受体抗体的人源化PM1抗体(WT)中,即使在作为抗IL-6受体抗体的F2H/L39、作为抗IL-31受体抗体的H0L0、作为抗RANKL抗体的DNS中,通过将恒定区由IgG1变成IgG2,异质性也增大;通过将恒定区变成M14或M58,在所有抗体中均可降低异质性。由此表明:通过将存在于H链CH1结构域的EU编号第131位的半胱氨酸和存在于H链上铰链的EU编号第219位的半胱氨酸取代成丝氨酸,无论可变区的抗体序列和抗原种类如何,均可降低来自天然型IgG2的异质性。
[ 实施例 17] 新的恒定区 M58 改善各种抗体的血浆中滞留性的效果
如实施例15所示,发现在作为抗IL-6受体抗体的人源化PM1抗体(WT)中,通过将恒定区由IgG1变成M58,与人FcRn的结合活性得到提高,在人FcRn转基因小鼠中血浆中滞留性得到提高。因此,对于除人源化PM1抗体以外的IgG1抗体,也进行了下述的研究:即通过将恒定区变成M58,来研究其能否提高血浆中滞留性。
作为除人源化PM1抗体(WT)以外的抗体,使用作为抗IL-31受体抗体的H0L0(H0L0_VH氨基酸序列,SEQ ID NO:147;H0L0_VL氨基酸序列,SEQ ID NO:148)、作为抗RANKL抗体的DNS(DNS_VH氨基酸序列,SEQ ID NO:149;DNS_VL氨基酸序列,SEQ ID NO:150)。相对于各抗体,制作恒定区为IgG1(SEQ ID NO:19)和M58(SEQID NO:151)的抗体,按照实施例14所述的方法评价其与人FcRn的结合活性。结果见表14。
[表14]
如表14所示,确认到:即使在作为抗IL-31受体抗体的H0L0、作为抗RANKL抗体的DNS中,通过将恒定区由IgG1变成M58,和作为抗IL-6受体抗体的WT一样,与人FcRn的结合活性提高。由此表明:无论可变区的抗体序列和抗原种类如何,通过将恒定区由IgG1变成M58,可以提高在人体内的血浆中滞留性。
[ 实施例 18]CH1 结构域的半胱氨酸对异质性和稳定性的影响
如实施例8所示,为了降低天然型IgG2的异质性,对IgG2铰链部分的半胱氨酸和存在于CH1结构域的半胱氨酸进行修饰。研究各种修饰体,结果发现:在野生型IgG2恒定区序列中,通过使用SKSC(SEQID NO:154),可以在不降低稳定性的情况下降低异质性,所述SKSC是将存在于H链CH1结构域的EU编号第131位的半胱氨酸和第133位的精氨酸分别取代成丝氨酸和赖氨酸、将存在于H链上铰链的EU编号第219位的半胱氨酸取代成丝氨酸而得到的恒定区。
另一方面,作为降低异质性的方法,认为有只将存在于H链上铰链的第219位的半胱氨酸取代成丝氨酸的方法、以及只将第220位的半胱氨酸取代成丝氨酸的方法。制作将IgG2的EU编号第219位的半胱氨酸取代成丝氨酸的恒定区SC(SEQ ID NO:155)和将IgG2的EU编号第220位的半胱氨酸取代成丝氨酸的恒定区CS(SEQ ID NO:156),之后制作分别具有SC和CS作为恒定区的WT-SC(SEQ ID NO:157)和WT-CS(SEQ ID NO:158),并与WT-IgG1、WT-IgG2、WT-SKSC和WT-M58比较异质性和热稳定性。另外,由不同于WT的抗IL-6受体抗体、即F2H/L39(F2H/L39_VH氨基酸序列,SEQ ID NO:145;F2H/L39_VL氨基酸序列,SEQ ID NO:146)制作分别具有恒定区IgG1(SEQ ID NO:19)、IgG2(SEQ ID NO:20)、SC(SEQ ID NO:155)、CS(SEQ ID NO:156)、SKSC(SEQ ID NO:154)、M14(SEQ ID NO:24)的F2H/L39-IgG1、F2H/L39-IgG2、F2H/L39-SC、F2H/L39-CS、F2H/L39-SKSC、F2H/L39-M14,比较上述抗体的异质性和稳定性。
作为WT-IgG1、WT-IgG2、WT-SC、WT-CS、WT-SKSC、WT-M58、F2H/L39-IgG1、F2H/L39-IgG2、F2H/L39-SC、F2H/L39-CS、F2H/L39-SKSC、F2H/L39-M14的异质性的评价方法,通过阳离子交换层析进行评价。柱使用ProPac WCX-10(Dionex),流动相A使用20mM乙酸钠(pH5.0),流动相B使用20mM乙酸钠/1M NaCl(pH5.0),采用适当的流量和梯度进行评价。利用阳离子交换层析进行评价的结果见图42。
其结果,如图42所示,在WT和F2H/L39的任一个中,通过将恒定区由IgG1变成IgG2,异质性均增大;但通过将恒定区变成SKSC和M14或M58,异质性均大幅下降。另一方面,当恒定区为SC时,与恒定区为SKSC时的情形一样,异质性大幅下降;而当恒定区为CS时,异质性没有得到充分改善。
通常,为了开发抗体作为药品,除了希望异质性少以外,还希望具有高稳定性,以制备稳定的制剂。因此,作为稳定性的评价方法,利用差示扫描量热法(DSC)测定热变性中间温度(Tm值)(VP-DSC、Microcal社制)。热变性中间温度(Tm值)是稳定性的指标,为了制备稳定的制剂作为药品,希望热变性中间温度(Tm值)高(J.Pharm.Sci.2008Apr;97(4):1414-26)。将WT-IgG1、WT-IgG2、WT-SC、WT-CS、WT-SKSC、WT-M58用20mM乙酸钠、150mM NaCl、pH6.0的溶液进行透析(EasySEP;TOMY),在约0.1mg/mL的蛋白浓度下以1℃/分钟的升温速度在40℃~100℃范围内进行DSC测定。所得的DSC变性曲线见图43,Fab部分的Tm值见下表15。
[表15]
Tm/℃
WT-IgG1 94.8
WT-IgG2 93.9
WT-SC 86.7
WT-CS 86.4
WT-SKSC 93.7
WT-M58 93.7
WT-IgG1和WT-IgG2的Tm值大致相等,均为约94℃左右(IgG2的Tm值低约1℃),而WT-SC和WT-CS的Tm值均为约86℃,与WT-IgG1和WT-IgG2相比,Tm值显著降低。另一方面,WT-M58和WT-SKSC的Tm值均为约94℃,与WT-IgG1和WT-IgG2大致相等。由于与IgG2相比,WT-SC和WT-CS的稳定性明显低,所以为了开发抗体作为药品,认为优选CH1结构域的半胱氨酸也取代成丝氨酸的WT-SKSC和WT-M58。与IgG2相比,WT-SC和WT-CS的Tm值大幅下降,认为其原因在于WT-SC和WT-CS在二硫键构象方面不同于IgG2。
比较DSC变性曲线时,WT-IgG1、WT-SKSC、WT-M58的Fab部分的变性峰窄且单一,相对于此,WT-SC和WT-CS的Fab部分的变性峰宽,确认WT-IgG2在Fab部分的变性峰的低温侧出现肩峰。认为当DSC的变性峰为单一成分时,通常显示窄变性峰,而当存在Tm值不同的多种成分(即异质性)时,变性峰变宽。即,上述结果表明:WT-IgG2、WT-SC和WT-CS中有可能存在多种成分,所以WT-SC和WT-CS的天然型IgG2的异质性没有得到充分的降低。由此认为:野生型IgG2的异质性不仅与铰链部分的半胱氨酸有关,还与存在于CH1结构域的半胱氨酸有关,为了降低DSC上的异质性,不仅必需修饰铰链部分的半胱氨酸,还必需修饰CH1结构域的半胱氨酸。如上所述,通过不仅修饰铰链部分的半胱氨酸、还修饰CH1结构域的半胱氨酸,首次有可能具有与野生型IgG2同等的稳定性。
根据上述结果认为:作为降低来自IgG2铰链区的异质性的恒定区,只将铰链部分的半胱氨酸取代成丝氨酸的恒定区SC和CS,从异质性和稳定性的角度考虑并不充分,发现除了将铰链部分的半胱氨酸取代成丝氨酸以外,还将存在于CH1结构域的EU编号第131位的半胱氨酸也取代成丝氨酸,从而首次可以在维持与IgG2同等的稳定性的同时大幅降低异质性。作为这样的恒定区,有上述M14、M31、M58、M73等,特别是M58和M73的血浆中滞留性提高、稳定性高、异质性下降,因此认为其作为抗体药物的恒定区非常有用。
[ 实施例 19]PK/PD 得到改善的完全人源化抗 IL-6 受体抗体的制作
为了制作PK/PD得到改善的完全人源化抗IL-6受体抗体,通过修饰TOCILIZUMAB(H链,WT-IgG1(SEQ ID NO:15);L链,WT(SEQ ID NO:105)),制作以下所示的分子。
为了提高F2H-IgG1的ka,进行实施例2中得到的亲和性增强的修饰,即:将第35位的色氨酸取代成缬氨酸、将第50位的酪氨酸取代成苯丙氨酸、和将第62位的丝氨酸取代成苏氨酸。另外,为了在不增加免疫原性风险的同时降低pI,将第102位的酪氨酸取代成缬氨酸、将第105位的谷氨酰胺取代成谷氨酸、将第107位的异亮氨酸取代成苏氨酸,并将恒定区由IgG1转换成M83,制成VH5-M83(SEQ IDNO:139(氨基酸序列))。为了提高L39的ka,制作第27位的谷氨酸被取代成谷氨酰胺的VL5-κ(SEQ ID NO:181(氨基酸序列))。并且,制作组合有多个在上述实施例中发现的TOCILIZUMAB的可变区和恒定区的突变以及新发现的突变的TOCILIZUMAB修饰体,进行各种筛选,结果发现了下述完全人源化IL-6受体抗体:Fv3-M73(H链VH4-M73SEQ ID NO:182;L链VL1-κSEQ ID NO:183)、Fv4-M73(H链VH3-M73 SEQ ID NO:180;L链VL3-κSEQ ID NO:181)、Fv5-M83(H链VH5-M83 SEQ ID NO:139;L链VL5-κSEQ ID NO:138)。
将制作的Fv3-M73、Fv4-M73及Fv5-M83与IL-6受体的亲和性、和TOCILIZUMAB进行比较(方法参照参考例)。测定上述抗体与IL-6受体的亲和性,结果见表16。此外,比较了TOCILIZUMAB和对照(参考例的公知的高亲和性抗IL-6受体抗体、US 2007/0280945中的VQ8F11-21 hIgG1)的BaF/gp130中和活性(方法参照参考例)。测定这些抗体在BaF/gp130中的生物活性,结果见图44(IL-6的终浓度为300ng/mL:TOCILIZUMAB、对照、Fv5-M83)和图45(IL-6的终浓度为30ng/mL:TOCILIZUMAB、Fv3-M73、Fv4-M73)。如表16所示,与TOCILIZUMAB相比,Fv3-M73和Fv4-M73具有约2~3倍强的亲和性;与TOCILIZUMAB相比,Fv5-M83显示出约100倍强的亲和性(由于Fv5-M83的亲和性难以测定,所以使用恒定区为IgG1的Fv5-IgG1来测定亲和性,认为恒定区通常对亲和性没有影响)。如图45所示,与TOCILIZUMAB相比,Fv3-M73、Fv4-M73显示出稍强的活性;如图44所示,与TOCILIZUMAB相比,Fv5-M83在50%抑制浓度下具有100倍以上的极强的活性,并且,与对照(公知的高亲和性抗IL-6受体抗体)相比,Fv5-M83在50%抑制浓度下也显示出约10倍高的中和活性。
[表16]
利用本领域技术人员公知的方法,通过等电点电泳来测定TOCILIZUMAB、对照、Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83的等电点,结果:TOCILIZUMAB的等电点为约9.3、对照的等电点为约8.4~8.5、Fv3-M73的等电点为约5.7~5.8、Fv4-M73的等电点为约5.6~5.7、Fv5-M83的等电点为约5.4~5.5,与TOCILIZUMAB和对照相比,这些抗体的等电点均大幅下降。另外,利用GENETYX(GENETYXCORPORATION)来计算可变区VH/VL的理论等电点时,TOCILIZUMAB的理论等电点为9.20、对照的理论等电点为7.79、Fv3-M73的理论等电点为5.49、Fv4-M73的理论等电点为5.01、Fv5-M83的理论等电点为4.27,与TOCILIZUMAB和对照相比,这些抗体的理论等电点均大幅下降。由此认为:与TOCILIZUMAB和对照相比,Fv3-M73、Fv4-M73、Fv5-M83的血浆中滞留性有所提高。
使用TEPITOPE(Methods.2004 Dec;34(4):468-75)对存在于TOCILIZUMAB、Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83的可变区序列的T细胞表位进行分析。其结果,虽然预测TOCILIZUMAB的多个序列存在与HLA结合的T细胞表位,但在Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83中被预测与T细胞表位结合的序列大幅减少。另外,Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83在构架中没有残留小鼠序列,被完全人源化。由此表明:与TOCILIZUMAB相比,Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83的免疫原性风险有可能大幅降低。
[ 实施例 20] 完全人源化抗 IL-6 受体抗体在猴体内的 PK/PD 试验
将TOCILIZUMAB、对照、Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83以1mg/kg对食蟹猴进行静脉内单次给药,评价血浆中浓度变化(方法参照参考例)。TOCILIZUMAB、Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83静脉内给药后的血浆中浓度变化见图46。其结果,与TOCILIZUMAB和对照相比,Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83在食蟹猴体内的血浆中滞留性大幅改善。其中,与TOCILIZUMAB相比,Fv3-M73和Fv4-M73的血浆中滞留性大幅改善。
为了评价各抗体中和膜型食蟹猴IL-6受体的药效,在抗体给药后第6天~第18天(给予TOCILIZUMAB后第3天~第10天)将食蟹猴IL-6以5μg/kg对腰背部连日进行皮下给药,测定24小时后各个体的CRP浓度(方法参照参考例)。各抗体给药后的CRP浓度变化见图47。为了评价各抗体中和可溶型食蟹猴IL-6受体的药效,测定食蟹猴血浆中非结合型的可溶型食蟹猴IL-6受体的浓度,计算可溶型IL-6受体的中和率(方法参照参考例)。各抗体给药后可溶型IL-6受体的中和率变化见图48。
与TOCILIZUMAB和对照(公知的高亲和性抗IL-6受体抗体)相比,Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83均能更持续地中和膜型食蟹猴IL-6受体,长期抑制CRP的增加。而且,与TOCILIZUMAB和对照相比,Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83均能更持续地中和可溶型食蟹猴IL-6受体,长期抑制非结合型的可溶型食蟹猴IL-6受体的增加。由此发现:在中和膜型IL-6受体和可溶型IL-6受体的持续性方面,Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83均较TOCILIZUMAB和对照优异。其中,Fv3-M73和Fv4-M73的中和的持续性极其优异。另一方面,与Fv3-M73和Fv4-M73相比,Fv5-M83将CRP和非结合型的可溶型食蟹猴IL-6受体抑制在低水平。由此认为:与Fv3-M73、Fv4-M73和对照(公知的高亲和性抗IL-6受体抗体)相比,Fv5-M83更强效地中和膜型IL-6受体和可溶型IL-6受体。认为这是Fv5-M83与IL-6受体的亲和性较对照强、且Fv5-M83在BaF/gp130中的生物活性强在食蟹猴体内得到反映的结果。
上述研究表明:与TOCILIZUMAB和对照相比,Fv3-M73和Fv4-M73作为抗IL-6受体中和抗体作用的持续性极其优异,可以大幅降低给药频率和给药量;另外,Fv5-M83作为抗IL-6受体中和抗体作用强度极其优异,作用的持续性也优异。因此,认为Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83可以以IL-6拮抗剂的形式用作药物。
[参考例]
重组可溶型食蟹猴 IL-6 受体 (cIL-6R) 的制备
根据公开的恒河猴IL-6受体基因序列(Birney等人,Ensembl 2006,Nucleic Acids Res.2006 Jan 1;34(Database issue):D556-61)制作寡DNA引物,以由食蟹猴胰脏制备的cDNA为模板,使用引物,通过PCR法制备编码食蟹猴IL-6受体全长基因的DNA片段。将得到的DNA片段插入动物细胞表达载体中,使用该载体制作CHO恒定表达株(产生食蟹猴sIL-6R的CHO细胞)。将产生食蟹猴sIL-6R的CHO细胞的培养液用HisTrap柱(GE Healthcare Bioscience)纯化,之后使用Amicon Ultra-15 Ultracel-10k(Millipore)进行浓缩,用Superdex200pg16/60凝胶过滤柱(GE Healthcare Bioscience)进一步纯化,得到可溶型食蟹猴IL-6受体(以下记作cIL-6R)的最终纯品。
重组食蟹猴 IL-6(cIL-6) 的制作
食蟹猴IL-6如下制备。制成编码在SWISSPROT Accession No.P79341中注册的212个氨基酸的核苷酸序列,将其克隆到动物细胞表达载体中,再将所得载体导入CHO细胞中,从而制作恒定表达细胞株(产生食蟹猴IL-6的CHO细胞)。将产生食蟹猴IL-6的CHO细胞的培养液用SP-Sepharose/FF柱(GE Healthcare Bioscience)纯化,之后用 Amicon Ultra-15 Ultracel-5k(Millipore)浓缩,再用Superdex75pg26/60凝胶过滤柱(GE Healthcare Bioscience)进一步纯化,并用AmiconUltra-15 Ultracel-5k(Millipore)进行浓缩,得到食蟹猴IL-6(以下记作cIL-6)的最终纯品。
公知高亲和性抗 IL-6 受体抗体的制作
为了表达公知的高亲和性抗IL-6受体抗体、即US 2007/0280945A1中所述的高亲和性抗IL-6受体抗体VQ8F11-21 hIgG1(US2007/0280945 A1,H链氨基酸序列、SEQ ID NO:19;L链氨基酸序列、SEQ ID NO:27),构建动物细胞表达用载体。抗体可变区通过组合有合成寡DNA的PCR法(装配PCR)来制作,恒定区则使用IgG1。利用装配PCR法使抗体可变区与恒定区结合,之后插入动物细胞表达用载体中,制作目标H链表达载体和L链表达载体。所得表达载体的核苷酸序列按照本领域技术人员公知的方法来确定,使用制作的表达载体进行表达、纯化。表达、纯化按照实施例1所述的方法进行,得到高亲和性抗IL-6受体抗体(以下记作对照)。
利用 Biacore 评价与 IL-6 受体的结合
使用Biacore T100(GE Healthcare),进行抗原抗体反应的速度论的分析。通过胺耦合法将适量的抗IgG(γ-链特异性)F(ab’) 2 固定在传感器芯片上,接下来,在pH7.4下使目标抗体结合,再于pH7.4下使调整成各种浓度的IL-6受体、即SR344以分析物的形式流动,测定抗体与SR344的相互作用。所有测定均在37℃下进行。由测定中得到的传感图算出动力学参数、即结合速度常数k a (1/Ms)和解离速度常数k d (1/s),根据该值算出K D (M)。使用Biacore T100评估软件(GEHealthcare)计算各参数。
通过猴 PK/PD 试验测定血浆中抗体浓度、 CRP 浓度、以及非结合型的可溶型 IL-6 受体浓度
食蟹猴血浆中浓度测定按照ELISA法、利用本领域技术人员公知的方法进行测定。CRP浓度利用Cias R CRP(关东化学株式会社)、使用自动分析装置(TBA-120FR、东芝Medical Systems株式会社)进行测定。
食蟹猴血浆中非结合型的可溶型食蟹猴IL-6受体浓度如下测定。将30μL食蟹猴的血浆添加到0.22μm的滤杯(Millipore)中已干燥的适量的rProtein A Sepharose Fast Flow resin(GE Healthcare)上,使血浆中存在的所有IgG型抗体(食蟹猴IgG、抗人IL-6受体抗体、抗人IL-6受体抗体-可溶型食蟹猴IL-6受体复合体)均吸附在蛋白A上。之后,用高速离心机进行旋转下降,回收通过的溶液。由于通过的溶液中不含与蛋白A结合的抗人IL-6受体抗体-可溶型食蟹猴IL-6受体复合体,所以通过测定通过蛋白A的溶液中的可溶型食蟹猴IL-6受体浓度,即可测定非结合型的可溶型IL-6受体浓度。至于可溶型食蟹猴IL-6受体浓度,以上述制作的可溶型食蟹猴IL-6受体(cIL-6R)作为标准品,利用测定人IL-6受体浓度的本领域技术人员公知的方法进行测定。可溶型IL-6受体的中和率通过下式来计算。
(抗体给予后的非结合型的可溶性IL-6受体浓度÷抗体给予前的可溶性IL-6受体浓度)×100
[ 实施例 21]
(1) 人源化 H0L0 抗体的点突变基因的制作
以WO2006/046751中公开的、编码包含人源化GC33抗体CDR的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的基因作为起始材料,制作各种点突变基因。合成根据包含修饰位点的正链和反链的序列设计的寡DNA。使用市售的QuikChange位点定向诱变试剂盒(Stratagene),制作多个点突变基因。点突变基因的制作按照下述条件、通过PCR法来进行。将由10ng模板质粒、10pmol正链和反链的合成寡DNA、添加在试剂盒中的10×Buffer、dNTP mix和Pfu turbo DNA聚合酶组成的反应混合物在95℃下加热30秒,之后实施18次由95℃×30秒、55℃×1分钟、68℃×4分钟构成的PCR反应周期。将试剂盒中所添加的DpnI添加到反应混合物中,之后继续在37℃下进行1小时由限制酶引起的限制消化反应。利用该反应液转化DH5α感受态细胞(TOYOBO),结果得到了转化体。确定从该转化体中分离的质粒DNA的核苷酸序列,将据此确认到导入有点突变的点突变基因在能够在动物细胞中表达插入基因的表达载体中进行克隆。修饰基因通过具有以下所示构成的修饰而获得。
人源化H0L0抗体及其点突变修饰抗体的一过性表达通过使用聚乙烯亚胺(Polysciences Inc.)的一过性表达来实施。将在胰蛋白酶EDTA(Invitrogen)中剥离的HEK293细胞接种在10cm2培养皿中,使达到6×106细胞/10mL的密度。第二天,向4.6μg H链表达质粒DNA和9.2μgL链表达质粒DNA中加入690μL SFMII培养基和20.8μg聚乙烯亚胺,混合后将该混合液在室温下静置10分钟。将全部混合液滴加到如上接种有HEK293细胞的培养皿中。约72小时后回收培养上清,使用rProteinA sepharoseTM Fast Flow(GE Healthcare),按照说明书从回收的培养上清中纯化已表达的人源化H0L0抗体及其点突变修饰抗体。
(1-1) 改变人源化 H0L0 抗体的 Tm
热变性中间温度(Tm)是指以程序化的恒定加热速度加热受检试样溶液,之后以所得的热图(Cp对T作图)中变性峰的顶点来把握。DSC测定用试样溶液的制备如下进行,由此测定人源化H0L0抗体的Tm值。首先,以含有150mmol/l氯化钠的20mol/l乙酸钠缓冲溶液(pH6.0)作为透析外液,将封入透析膜中的50-100μg相当量的抗体溶液透析一昼夜。之后,使用透析外液制备抗体浓度为50-100μg/mL的试样溶液,将该试样溶液用作DSC测定用试样溶液。
为了进行该实验,优选使用适当的DSC装置、例如DSC-II(Calorimetry Sciences Corporation)。将利用上述方法制备的试样溶液和参比溶液(透析外液)充分脱气,之后将各受检检体封入量热计盒中,在40℃下进行充分的热平衡。接下来,以约1K/分钟的扫描速度在 40℃~100℃范围内进行DSC扫描。该测定结果以作为温度函数的变性峰的顶点表示。参考非专利文献(Rodolfo等人,Immunology Letters(1999),47-52)来进行Fab结构域的峰指定,算出人源化H0L0抗体的热变性中间温度。作为具体例子,在图49中例示了由Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗体的DSC(差示扫描量热计)测定得到的图。
利用上述方法算出的、包含SEQ ID NO:195所示的H链和SEQ IDNO:201所示的L链的人源化H0L0抗体的Tm值为76.6℃,而作为现有抗体而例示的Synagis和Herceptin的Tm值分别被计测为85.4℃和81.8℃。由此表明:人源化H0L0抗体的Tm值低于现有抗体的Tm值。
于是,为了提高人源化H0L0抗体的Tm值,制作人源化H0L0抗体的修饰抗体。向SEQ ID NO:195所示的H0L0抗体H链的FR2中加入将其VH1b亚纲修饰成VH4亚纲的V37I、A40P、M48I、L51I的修饰,来制作H15(SEQ ID NO:196)。将其Tm值改善至79.1℃。进行将SEQ ID NO:201所示的H0L0抗体L链的FR2由VK2修饰成VK3亚纲的L42Q、S48A、Q50R的修饰、以及将FR1的V2取代成生殖细胞系列的序列I的V2I的修饰,来制作L4(SEQ ID NO:202)。将其Tm值改善至77.2℃。组合有这两个修饰体的H15L4抗体的Tm值被改善至80.5℃。
(1-2) 改变人源化 H0L0 抗体的 pI
通过减小抗体所具有的pI值,抗体的血中半衰期延长。反之,通过增大抗体的pI值,抗体的组织移动性得到改善。尚不明确发挥癌症治疗效果的抗体的pI值的增加或减少是否会增强肿瘤抑制效果。于是,制作pI值减少的人源化H0L0抗体的修饰抗体和pI值增加的人源化H0L0抗体的修饰抗体,通过比较研究两者的抗肿瘤效果,来验证其中任一种修饰是否会产生高肿瘤抑制效果。
根据等电点电泳分析算出各抗体的pI值。该电泳如下进行。使用Phastsystem Cassette(AmerchamBioscience社制),将Phast-Gel Dry IEF (AmerchamBioscience)凝胶用具有以下组成的膨润液膨润约60分钟。
(a)高pI用膨润液的组成:
1.5mL 10%的甘油
100μL IEF用Pharmalyte 8-10.5(AmerchamBioscience)
(b)低pI用膨润液的组成:
1.5mL纯化水
20μL IEF用Pharmalyte 8-10.5(AmerchamBioscience)
80μL IEF用Pharmalyte 5-8(AmerchamBioscience)
将约0.5μg抗体添加到膨胀的凝胶中,通过使用由下述程序控制的PhastSystem(AmerchamBioscience)来进行等电点电泳。在下述程序中的步骤2阶段将样品添加到凝胶中。pI标记使用pI的校准试剂盒(AmerchamBioscience)。
步骤1:2000V、2.5mA、3.5W、15℃、75Vh
步骤2:200V、2.5mA、3.5W、15℃、15Vh
步骤3:2000V、2.5mA、3.5W、15℃、410Vh
将电泳后的凝胶用20%TCA固定,之后使用银染色试剂盒、蛋白(AmerchamBioscience),按照试剂盒中附带的操作指南进行银染色。染色后,以pI标记所具有的已知等电点为基准,算出作为受检试样的各抗体的等电点。高pI等电点电泳的泳动像和低pI等电点电泳的泳动像分别见图50和图51。
(a)增加pI值的修饰
对H15进一步实施Q43K、D52N、Q107R的修饰,来制作Hspu2.2(Hu2.2)(SEQ ID NO:200)。另外,对L4实施E17Q、Q27R、Q105R以及S25A(将CDR2的S25取代成生殖细胞系列中高频的A)的修饰,来制作Lspu2.2(Lu2.2)(SEQ ID NO:206)。测得包含Hspu2.2(Hu2.2)和Lspu2.2(Lu2.2)的抗体、即Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗体的Tm值为76.8℃、pI值为9.6。由于H0L0抗体的pI值为8.9,所以Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗体的pI值增大了0.7。
(b)减小pI值的修饰
对H15进一步实施K19T、Q43E、K63S、K65Q、G66D的修饰,来制作Hspd1.8(Hd1.8)(SEQ ID NO:199)。对L4实施Q27E的修饰,将构成L4的FR3的79-84的序列、即KISRVE修饰成TISSLQ,对Lspu2.2(Lu2.2)同样实施S25A的修饰,来制作Lspd1.6(Ld1.6)(SEQID NO:205)。测得包含Hspd1.8(Hd1.8)和Lspd1.6(Ld1.6)的抗体、即Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)抗体的Tm值为72.6℃、pI值为7.4。由于H0L0抗体的pI值为8.9,所以Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)抗体的pI值减小了1.5。
(2) 通过竞争 ELISA 来评价 H0L0 抗体的点突变修饰抗体的结合活性
通过竞争ELISA评价(1)中纯化的H0L0抗体及其点突变修饰抗体。向96孔板的每孔中加入100μL制备成1μg/mL的可溶型GPC3核心多肽(SEQ ID NO:207)。将该板在4℃下静置一夜,将可溶型GPC3核心多肽固定在该板上。使用Skan WASHER400(Molecular Devices),将固定在该板上的可溶型GPC3核心多肽用清洗缓冲液清洗3次,加入200μL封闭缓冲液,在4℃下封闭一整夜以上。接下来,使用SkanWASHER400,将固定并封闭该可溶型GPC3核心多肽的板用清洗缓冲液清洗3次。之后,向该板的每孔中加入100μL各种浓度的H0L0抗体或其点突变修饰抗体和终浓度为0.3μg/mL的生物素化的H0L0抗体的混合液。H0L0抗体的生物素化使用生物素标记试剂盒(Roche),按照试剂盒的说明书来进行。该板在室温下静置1小时后,使用Skan WASHER400(Molecular Devices),用清洗缓冲液清洗5次。向每孔中加入100μL用基质缓冲液稀释至20,000倍的山羊抗链霉亲和素碱性磷酸酶(ZYMED),将该板在室温下静置1小时,之后使用Skan WASHER400,用清洗缓冲液清洗5次。使用基质缓冲液制备磷酸酶底物(Sigma)使达到1mg/mL,之后向每孔中加入100μL,静置1小时。使用Benchmark Plus(BIO-RAD),利用655nm的对照吸光度来测定各孔中的反应液在405nm的吸光度。
如图52所示,H15L4抗体的抗原结合活性与供给修饰的H0L0抗体的抗原结合活性几乎同等。另外,如图53所示,Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗体的抗原结合活性与供给修饰的H0L0抗体的抗原结合活性几乎同等。并且,如图54所示,Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)抗体的抗原结合活性与供给修饰的H0L0抗体的抗原结合活性几乎同等。
[ 参考实施例 22] 破坏 CHO 细胞中岩藻糖转运蛋白基因
(1) 寻靶载体的构建
(1-1)KO1 载体的制作
使用pcDNA3.1/Hygro(Invitrogen)以及Hyg5-BH和Hyg3-NT的引物,通过PCR向潮霉素耐性基因(Hygr)的起始密码子的5’侧添加BamH I位点和TGCGC序列,从而形成与岩藻糖转运蛋白基因的起始密码子的5’侧相同的序列,在包含直至SV40polyA添加信号的区的3’侧添加Not I位点,选出Hygr。
正向引物
Hyg5-BH:5’-GGATCCTGCGCATGAAAAAGCCTGAACTCACC-3’
(SEQ ID NO:208)
反向引物
Hyg3-NT:5’-GCGGCCGCCTATTCCTTTGCCCTCGGACG-3’(SEQID NO:209)
岩藻糖转运蛋白的寻靶载体ver.1(以下称作KO1载体)如下构建:在pMC 1DT-A载体(Yagi T,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87,9918-22)中插入岩藻糖转运蛋白的5’侧(从SEQ ID NO:210所示的核苷酸序列的第2,780位的SmaI到第4,232位的BamH I)、3’侧(从第4,284位到第10,934位的Sac I)和Hygr片段来构建。载体的特征在于:由于Hygr中未添加有启动子,所以在发生同源重组时,通过岩藻糖转运蛋白的启动子来表达Hygr。但是,通过同源重组向细胞中导入仅 1拷贝的载体时,Hygr的表达程度并不足以获得抗潮霉素B耐性。需要说明的是,将KO1载体用Not I切断后导入细胞中。认为是由于KO1载体的导入,岩藻糖转运蛋白缺失包含起始密码子的外显子1的41个碱基对,导致其失去功能。
(1-2)pBSK-pgk-1-Hygr 的制作
使用EcoR I-Pst I从pKJ2载体(Popo H,Biochemical Genetics(1990)28,299-308)中切出小鼠pgk-1基因的启动子,将其克隆到pBluescript(Stratagene)的EcoR I-Pst I位点中,制作pBSK-pgk-1。关于Hygr,使用pcDNA3.1/Hygro以及Hyg5-AV和Hyg3-BH的引物,通过进行PCR,在Hygr的5’侧添加EcoT22 I位点和Kozak序列,在包含直至SV40polyA添加信号的区的3’侧添加BamH I位点,选出Hygr。
正向引物
Hyg5-AV:5’-ATGCATGCCACCATGAAAAAGCCTGAACTCACC-3’(SEQ ID NO:211)
反向引物
Hyg3-BH:5’-GGATCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTC-3’(SEQ IDNO:212)
将该Hygr(EcoT22 I-BamH I)片段插入pBSK-pgk-1的Pst I-BamHI位点,制作pBSK-pgk-1-Hygr。
(1-3)KO2 载体的制作
岩藻糖转运蛋白的寻靶载体ver.2(以下称作KO2载体)如下构建:向pMC1DT-A载体中插入岩藻糖转运蛋白的5’侧(从SEQ ID NO:210所示的核苷酸序列的第2,780位的Sma I到第4,232位的BamH I)、3’侧(从第4,284位到第10,934位的SacI)和pgk-1-Hygr片段来构建。与KO1载体不同,由于KO2载体在Hygr中添加有pgk-1基因的启动子,所以即使通过同源重组向细胞中导入仅1拷贝的载体,也可以获得潮霉素B耐性。需要说明的是,将KO2载体用Not I切断后导入细胞中。认为通过导入KO2载体,岩藻糖转运蛋白缺失包含起始密码子的外显子1的46个碱基对,导致其失去功能。
(1-4)pBSK-pgk-1-Puror 的制作
用Pst I和BamH I切断pPUR载体(BD Biosciences),将切出的片段(Puror)插入pBSK-pgk-1的Pst I-BamH I位点,制作pBSK-pgk-1-Puror。
(1-5)KO3 载体的制作
岩藻糖转运蛋白的寻靶载体ver.3(以下称作KO3载体)如下构建:向pMC1DT-A载体中插入岩藻糖转运蛋白的5’侧(从SEQ ID NO:210所示的核苷酸序列的第2,780位的Sma I到第4,232位的BamH I)、3’侧(从第4,284位到第10,934位的SacI)和pgk-1-Puror片段来构建。需要说明的是,预先在pgk-1-Puror的3’末端添加以下所示的筛选用引物所结合的序列。需要说明的是,将KO3载体用Not I切断后导入细胞中。认为通过导入KO3载体,岩藻糖转运蛋白缺失包含起始密码子的外显子1的46个碱基对,导致其失去功能。
反向引物
RSGR-A 5’-GCTGTCTGGAGTACTGTGCATCTGC-3’(SEQ ID NO:213)
使用上述3种寻靶载体,尝试着敲除岩藻糖转运蛋白基因。
(2) CHO 细胞中导入载体
向CHO-S-SFMII HT-(Invitrogen)中加入分别为CHO-S-SFMIIHT-的容量的1/100量的HT Supplement(100x)(Invitrogen)和青霉素-链霉素(Invitrogen)。将其作为培养用培养基(以下称作SFMII(+)),将CHO细胞的DXB11株传代,并且导入基因之后的培养也在该SFMII(+)中进行。将8×106个CHO细胞悬浮于0.8mL Dulbecco磷酸缓冲液(以下简称PBS。Invitrogen)中。向细胞悬浮液中加入30μg寻靶载体,将细胞悬浮液移至Gene PulserCuvette(4mm)(Bio-Rad)中。在冰上放置10分钟后,使用GENE-PULSER II(Bio-Rad),在1.5kV、25μFD的条件下通过电穿孔法将载体导入细胞中。导入载体后,将细胞悬浮于 200mL SFMII(+)培养基中,将细胞按100μL/孔接种在20块96孔平底板(Iwaki)中。将该板在CO 2 培养箱内、于37℃下培养24小时,之后添加药剂。
(3) 敲除的第一阶段
将KO1载体或KO2载体分别导入CHO细胞中,导入载体后24小时利用潮霉素B(Invitrogen)进行筛选。将潮霉素B溶于SFMII(+)中使达到0.3mg/mL,按100μL/孔进行添加。
(4) 通过 PCR 筛选同源重组体
(4-1)PCR 用样品的制备
利用PCR法筛选同源重组体。筛选中使用的CHO细胞用96孔平底板进行培养,除去培养上清后,按50μL/孔加入细胞溶解用缓冲液,在55℃下加热2小时,之后在95℃下加热15分钟,从而使蛋白酶K失活,形成PCR的模板。每孔中的细胞溶解用缓冲液由5μL10X LA缓冲液II(添加在Takara LATaq中)、2.5μL10%NP-40(Roche)、4μL蛋白酶K(20mg/mL、Takara)和38.5μL蒸馏水(Nacalai Tesque)构成。
(4-2)PCR 的条件
PCR反应混合物的组成:1μL上述PCR样品、5μL10×LA缓冲液II、5μL MgCl2(25mM)、5μL dNTP(2.5mM)、2μL引物(各10μM)、0.5μL LA Taq(5IU/μL)和29.5μL蒸馏水(总量为50μL)。在导入有KO1载体的细胞的筛选中,使用TP-F4和THygro-R1作为PCR引物;在导入有KO2载体的细胞的筛选中,使用TP-F4和THygro-F1作为PCR引物。
导入有KO1载体的细胞的PCR条件为:在95℃下预热1分钟,之后进行40个扩增周期(以95℃×30秒、60℃×30秒和60℃×2分钟作为1个扩增周期),以及在72℃下再加热7分钟。在导入有KO2载体的细胞的筛选中,PCR条件为:在95℃下预热1分钟,之后进行40个扩增周期(以95℃×30秒和70℃×3分钟作为1个扩增周期),以及在 70℃下再加热7分钟。
引物如下。在由KO1载体介导的同源重组的细胞样品中,扩增约1.6kb的DNA;在由KO2载体介导的同源重组的细胞样品中,扩增约2.0kb的DNA。引物TP-F4被设定在载体外侧、且5’侧的岩藻糖转运蛋白的基因组区内,THygro-F1和THygro-R1被设定在载体内的Hygr中。
正向引物(KO1,KO2)
TP-F4:5’-GGAATGCAGCTTCCTCAAGGGACTCGC-3’(SEQ ID NO:214)
反向引物(KO1)
THygro-R1:5’-TGCATCAGGTCGGAGACGCTGTCGAAC-3’(SEQ IDNO:215)
反向引物(KO2)
THygro-F1:5’-GCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGC-3’(SEQ IDNO:216)
(5)PCR 筛选结果
分析918个导入有KO1载体的细胞,其中认为是同源重组体的细胞有1个(同源重组效率为约0.1%)。另外,分析537个导入有KO2载体的细胞,其中认为是同源重组体的细胞有17个(同源重组效率为约3.2%)。
(6)DNA 印迹分析
进一步通过DNA印迹法来确认重组细胞。按照常规方法从培养的细胞中制备10μg基因组DNA,进行DNA印迹确认。使用以下两种引物,利用PCR法从SEQ ID NO:210所示的核苷酸序列的第2,113位-第2,500位的区制备387bp的探针,将其用于利用DNA印迹法进行的确认中。基因组DNA用Bgl I切断。
正向引物
Bgl-F:5’-TGTGCTGGGAATTGAACCCAGGAC-3’(SEQ ID NO:217)
反向引物
Bgl-R:5’-CTACTTGTCTGTGCTTTCTTCC-3’(SEQ ID NO:218)
通过用Bgl II切断出现了来自岩藻糖转运蛋白的染色体的约3.0kb的带、来自KO1载体介导的发生了同源重组的染色体的约4.6kb的带、来自KO2载体介导的发生了同源重组的染色体的约5.0kb的带。由KO1载体和KO2载体介导的同源重组的细胞分别有1种和7种用于实验。通过KO1载体唯一获得的细胞命名为5C1,但通过之后的分析明确:5C1由多个细胞集团构成,所以通过有限稀释来进行克隆,将其用于以后的实验中。另外,通过KO2载体获得的细胞之一命名为6E2。
(7) 敲除的第二阶段
对于由KO1载体和KO2载体成功介导了同源重组的细胞,使用3种载体,尝试着建立岩藻糖转运蛋白基因完全缺失的细胞株。载体与细胞的组合如下。方法1:KO2载体和5C1细胞(KO1)、方法2:KO2载体和6E2细胞(KO2)、方法3:KO3载体和6E2细胞(KO2)。将载体导入各细胞中,载体导入后24小时利用潮霉素B、嘌呤霉素(Nacalai Tesque)开始筛选。在方法1中潮霉素B的最终浓度为1mg/mL、在方法2中潮霉素B的最终浓度为7mg/mL。并且,在方法3中,添加潮霉素B和嘌呤霉素,使两者的最终浓度分别为0.15mg/mL和8μg/mL。
(8) 通过 PCR 筛选同源重组体
样品的制备如下进行。在方法1的筛选中,进行检测由上述KO1载体和KO2载体介导了同源重组的细胞的两个PCR。在方法2中设计下述PCR引物。在SEQ ID NO:210所示的核苷酸序列的第3,924位-第3,950位的区设定TPS-F1,在第4,248位-第4,274位的区设定SHygro-R1。通过该PCR引物,扩增通过KO2载体而缺失的岩藻糖转运蛋白基因区的350bp。因此,在方法2的PCR筛选中,将350bp未扩增的基因区视为岩藻糖转运蛋白基因完全缺失的细胞。PCR条件如下:95℃下预热1分钟,进行35个扩增周期(以95℃×30秒、70℃×1分钟作为1个扩增周期)、以及在70℃下再次加热7分钟。
正向引物
TPS-F1:5’-CTCGACTCGTCCCTATTAGGCAACAGC-3’(SEQ IDNO:219)
反向引物
SHygro-R1:5’-TCAGAGGCAGTGGAGCCTCCAGTCAGC-3’(SEQ IDNO:220)
在方法3中,正向引物使用TP-F4、反向引物使用RSGR-A。PCR条件如下:95℃下预热1分钟,之后进行35个扩增周期(以95℃×30秒、60℃×30秒、72℃下扩增2分钟作为1个扩增周期),以及在72℃下再次加热7分钟。在由KO3载体介导的发生了同源重组的细胞样品中,约1.6kb的DNA被扩增。通过该PCR,检测出由KO3载体介导的发生了同源重组的细胞,同时还确认残留有由KO2载体介导的同源重组。
(9)PCR 筛选结果
在方法1中分析616个细胞,其中认为是相同重组体的细胞有18个(相同重组效率为2.9%)。在方法2中分析524个细胞,其中认为是相同重组体的细胞有2个(相同重组效率为约0.4%)。并且,在方法3中分析382个细胞,其中认为是相同重组体的细胞有7个(相同重组效率为约1.8%)。
(10)DNA 印迹分析
按照上述方法进行分析。其结果,在可以分析的细胞中,发现1个岩藻糖转运蛋白基因完全缺失的细胞。在第一阶段的敲除中,PCR和DNA印迹的分析结果一致,但在第二阶段的敲除中,PCR和DNA印迹的分析结果不一致。
(11) 岩藻糖的表达分析
进一步分析通过PCR判断为同源重组体的26个细胞中岩藻糖的表达。使用100μL含有5μg/mL Lens culinaris Agglutinin、FITC缀合物(Vector Laboratories)、2.5%FBS、0.02%叠氮化钠的PBS(以下称作FACS溶解液),将1×106个细胞在冰冷中染色1小时。之后,用FACS溶解液清洗细胞3次,利用FACSCalibur(Becton Dickinson)进行测定。DNA印迹分析结果表明:只在判断为岩藻糖转运蛋白基因完全缺失的细胞FTP-KO株中岩藻糖表达量降低。
[ 参考实施例 23] 来自 FTP-KO 株的抗体产生细胞的建立和由该细胞产生的抗体的纯化
制备含有潮霉素B的SFMII(+)培养基,使潮霉素B在SFMII(+)培养基中的最终浓度为1mg/mL,将实施例21中得到的岩藻糖转运蛋白缺失株(FT-KO细胞、克隆名3F2)进行传代。将8×106个3F2悬浮于0.8mL Dulbecco磷酸缓冲液中。向细胞悬浮液中加入25μg人源化磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体表达载体,将细胞悬浮液移至Gene PulserCuvette中。在冰上放置10分钟后,使用GENE-PULSER II,在1.5kV,25μFD的条件下通过电穿孔法将载体导入细胞中。导入载体后,将细胞悬浮于40mL SFMII(+)培养基中,之后将细胞以100μL/孔接种在96孔平底板(Iwaki社)中。将该板在CO 2 培养箱内、于37℃下培养24小时,之后添加遗传霉素(Invitrogen),使终浓度达到0.5mg/mL。测定产生耐药性的细胞的抗体产生量,分别建立人源化磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体产生细胞株。
从抗体表达株中回收培养上清,使用P-1泵(Pharmacia)向HitraprProtein A(Pharmacia)柱中加样。用结合缓冲液(20mM磷酸钠(pH7.0))清洗柱,之后用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸-HCl(pH2.7))洗脱结合的抗体。立即用中和缓冲液(1M Tris-HCl(pH9.0))中和洗脱液。通过DC蛋白分析(BIO-RAD)选择抗体的洗脱组分,集合在一起后,该洗脱组分用Centriprep-YM10(Millipore)浓缩至2mL左右。接下来,将该浓缩液供给凝胶过滤,该凝胶过滤使用经含有150mM NaCl的20mM乙酸缓冲液(pH6.0)平衡的Superdex200 26/60(Pharmacia)。回收洗脱液的单体组分的峰,用Centriprep-YM10浓缩该组分。将该浓缩液用MILLEX-GW 0.22μm滤器单元(Millipore)过滤后,在4℃下保管。根据在波长280nm测定的吸光度,通过摩尔吸光系数换算来确定纯化的抗体浓度。
[ 参考实施例 24] 与由 FT-KO 细胞产生的人源化抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3 抗体结合的糖链的分析
(1)2- 氨基苯甲酰胺标记糖链 (2-AB 化糖链 ) 的制备
通过使N-糖苷酶F(Roche diagnostics)与本发明FT-KO细胞产生抗体及作为对照试样的CHO细胞产生抗体发生作用,使与抗体结合的糖链从蛋白中游离出来(Weitzhandler M.等人,Journal ofPharmaceutical Sciences(1994)83(12),1670-5)。使用乙醇除去蛋白后(Schenk B.等人,The Journal of Clinical Investigation(2001),108(11),1687-95),将游离糖链浓缩干固,然后用2-氨基吡啶进行荧光标记(Bigge J.C.等人,Analytical Biochemistry(1995)230(2),229-238)。得到的2-AB化糖链利用使用纤维素柱体的固相提取进行脱试剂,之后通过离心进行浓缩,以纯化2-AB化糖链的形式用于以后的分析。接下来,通过使β-半乳糖苷酶(生化学工业)与纯化2-AB化糖链作用,制备非半乳糖基(agalactosyl)2-AB化糖链。
(2) 利用正相 HPLC 分析 半乳糖基 2-AB 化糖链
按照前项的方法,以自本发明的FT-KO细胞产生抗体和作为对照试样的CHO细胞产生抗体中游离的糖链作为起始材料,制备非半乳糖基2-AB化糖链,将该糖链通过使用酰胺柱TSKgel Amide-80(TosohCo.)的正相HPLC进行分析,比较其层析图。在CHO细胞产生抗体中,G(0)作为其糖链的主要成分而存在,根据峰面积比进行计算,发现整个糖链中存在4%左右的未添加岩藻糖的G(0)-Fuc。而在FT-KO细胞产生抗体中,G(0)-Fuc是主要成分,根据峰面积比进行计算,在由任一种产生株产生的抗体中,整个糖链中的90%以上均以未添加岩藻糖的糖链形式存在。
[表17]
根据正相HPLC分析推定的非半乳糖基2-AB化糖链中各糖链的相对比
[ 实施例 25] 人源化 H0L0 抗体及其点突变修饰抗体的稳定性表达株的建立
将按照实施例21中记载的方法制作的、编码作为H0L0抗体的修饰抗体的Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗体和Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)抗体或供给该修饰的H0L0抗体的基因在表达载体中进行克隆化。克隆化时,将编码H链和L链的各基因分别插入不同表达载体中,使编码构成抗体的H链和L链的各基因表达。如上所述,将按照编码H链和L链的各基因形成所期望的组合的形式选择的两种表达载体用PvuI切断,之后通过电穿孔法将其导入参考实施例22中制作的FTP-KO株中。
通过电穿孔制作稳定生产H0L0抗体及其修饰抗体的转导株时,使用Gene PulserII(Bio Rad社制)来进行。将各10μg的H链、L链表达质粒DNA与0.75mL悬浮于PBS中的CHO细胞(1×107细胞/mL)混合,使形成所期望的构成H链和L链的组合,将混合液在冰上静置10分钟。将混合液移至Gene PulserII用杯中,之后以1.5kV、25μFD的容量赋予电脉冲。赋予了电脉冲的混合液在室温下静置10分钟,之后悬浮于CHO-S-SFMII/1%HT/1%PS培养基中。向96孔培养用平板的各孔中分别注入100μL用相同培养基制备的5、10、50倍的稀释悬浮液。将该板在维持5%CO 2 浓度的CO 2 培养箱中培养24小时。之后,向各孔中添加遗传霉素(GIBCO)和Zeocin(Invitrogen),使最终浓度分别达到500μg/mL和600μg/mL,将该板再培养2周。将显示出遗传霉素和Zeocin(博莱霉素)耐性的转导细胞集落用含有500μg/mL遗传霉素(GIBCO)和600μg/mL Zeocin(Invitrogen)的相同培养基进行传代,从而进一步筛选。通过使用BiacoreQ(BIACORE)评价如上筛选的该转导细胞培养上清中的抗体浓度,建立高度表达所期望的抗体的转导株。培养上清中抗体浓度的测定按照BiacoreQ(BIACORE)中所附带的操作指南来进行。
[ 实施例 26] 使用体内模型进行人源化 H0L0 抗体及其点突变修饰抗体的药效试验
(1) 供给移植到体内模型中的细胞株的维持
使用Hep G2细胞(ATCC)。将Hep G2细胞在含有10%FBS、1mmol/l MEM丙酮酸钠(Invitrogen)、1mmol/l MEM非必需氨基酸(Invitrogen)的Minimun Essential Medium Eagle培养基(SIGMA)(以下称作继代用培养基)中进行传代使之维持。
(2)Hep G2 细胞移植小鼠模型的制作
使用含有传代用培养基和MATRIGEL Matrix(BD Bioscience)(1∶1)的溶液制备Hep G2细胞的细胞悬浮液,使达到5×107细胞/mL。将100μL该细胞悬浮液(5×106细胞/小鼠)移植到SCID小鼠(雄性、5周龄)(日本CLEA)的腹部皮下,该SCID小鼠在细胞移植的前1天预先将100μL抗缺乏唾液酸基的(asialo)GM1抗体(和光纯药、1小瓶中的内容物用5mL该溶液溶解)进行腹腔内给药。肿瘤体积由算式:肿瘤体积=长径×短径×短径/2算出,判断在肿瘤体积的平均值为130-330mm3时模型成立。
(3) 含有各受检抗体的给药试样的制备
包括H0L0抗体、Hu2.2Lu2.2抗体、Hd1.8Ld1.6抗体的给药试样在给药当天用生理盐水制备成0.5mg/mL(5mg/kg给药组)或0.1mg/mL(1mg/kg给药组)。
(4) 给予含有抗体的给药试样
向(2)中制作的小鼠模型中移植Hep G2细胞后,自第27天起每周1次、以3周期间将上述(3)中制备的给药试样以10mL/kg的给药量进行尾静脉给药。作为阴性对照,将生理盐水同样按每周1次、3周的期间以10mL/kg的给药量进行尾静脉给药。所有组均以5只为1组,对各组给予含有各受检抗体的给药试样。几乎在给药的同时,从各组的3只个体中采取静脉血,作为用于测定小鼠血中各抗体浓度的受检物质。具体而言,在初次给药后0.5小时、第二次临给药前这两个时间点从背中足静脉采血。采取的20μL容量的血用肝素进行处理,通过离心来制备血浆。
(5) 评价各受检抗体的抗肿瘤效果
各受检抗体在人肝癌移植小鼠模型中的抗肿瘤效果通过测定自给予给药试样最后1天起1周后的肿瘤体积来进行评价。其结果,如图55所示,使用Hspd1.8Lspd1.6(Hd1.8Ld1.6)抗体具有药效增强的趋势,而使用Hspu2.2Lspu2.2(Hu2.2Lu2.2)抗体具有药效减弱的趋势。
(6) 血中各受检抗体的浓度
按照实施例21中所述的ELISA法测定小鼠血浆中受检抗体的浓度。制备血浆中浓度为12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2μg/mL的标准曲线试样。将标准曲线试样和适当稀释成所期望的浓度的小鼠血浆受检试样分别注入固定有可溶型磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3核心(中外制药社制)的微板(Nunc-Immuno Plate,MaxiSoup(Nalge nuncInternational))中,将该板在室温下静置1小时。之后,依次分别注入山羊抗人IgG-BIOT(Southern Biotechnology Associates)和链霉亲和素碱性磷酸酶缀合物(Roche Diagnostics),使用BluePhos Microwell磷酸酶底物系统(Kirkegaard & PerryLaboratories)作为底物进行显色反应。各孔中反应液的显色通过使用酶标仪测定反应液在650nm的吸光度而算出。根据由各标准曲线试样的吸光度作成的标准曲线,使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)算出小鼠血浆中的抗体浓度。
给药后30分钟和7天后的小鼠血浆中浓度见图56。结果显示:在受检抗体的所有给药量下,当受检抗体的pI进一步降低时,投与7天后小鼠血浆中的抗体浓度均变高。
[ 实施例 27] 使用人末梢血单核细胞作为效应细胞的各受检抗体的 ADCC 活性
使用人末梢血单核细胞(以下称作人PBMC)作为效应细胞,如下测定各受检抗体的ADCC活性。
(1) PBMC 溶液的制备
使用预先注入有200μL 1000单位/mL肝素溶液(NoVo-肝素注入5千单位,Novo Nordisk)的注射器,从中外制药株式会社所属的健康志愿者(成人男性)体内采取50mL末梢血。将用PBS(-)稀释至2倍的该末梢血4等分,加入Leucosep淋巴细胞分离管(Greiner bio-one)中,该分离管预先注入有15mL Ficoll-Paque PLUS并进行了离心操作。将该注入有末梢血的分离管以2150rpm的速度在室温下离心10分钟,之后分离收集单核细胞组分层。用含有10%FBS的Dulbecco’s改良Eagle’s培养基(SIGMA)(以下称作10%FBS/D-MEM)清洗该各分层中所含的细胞1次,之后将该细胞悬浮于10%FBS/D-MEM中,使其细胞密度达到5×106/mL。将该细胞悬浮液作为人PBMC溶液,供给以后的实验。
(2) 靶细胞的制备
从培养皿中剥离Hep G2细胞,将其接种在96孔U底板中,使达到1×104细胞/孔的密度。该板在5%CO 2 培养箱中、于37℃下培养一夜。第二天,向该板的各孔中加入5.55MBq的Cr-51,将该板在5%CO 2 培养箱中、于37℃下培养3小时。以存在于该板的各孔中的Hep G2细胞作为靶细胞,在以后测定ADCC活性时使用。
(3) 铬游离试验 (ADCC 活性 )
ADCC活性通过铬游离法中的特异性铬游离率进行评价。用培养基清洗(2)中制备的靶细胞,分别添加100μL制备成各种浓度(0、0.004、 0.04、0.4、4、40μg/mL)的H0L0抗体、Hu2.2Lu2.2抗体、Hd1.8Ld1.6抗体。使该板在室温下反应15分钟,之后除去抗体溶液。接下来,将各孔中添加有各100μL传代用培养基的该板在5%CO 2 培养箱中、于37℃下培养1小时。将各孔中添加有各100μL(5×105细胞/孔)(1)中制备的人PBMC溶液的该板在5%CO 2 培养箱中、于37℃下静置4小时,之后进行离心操作。使用γ计数器测定该板的各孔中的100μL培养上清的放射活性。根据下式计算特异性铬游离率:特异性铬游离率(%)=(A-C)×100/(B-C)。
上式中,A表示各孔中100μL培养上清的放射活性(cpm)的平均值。B表示靶细胞中添加有100μL 2%NP-40水溶液(Nonidet P-40、Nacalai Tesque)和50μL 10%FBS/D-MEM培养基的孔中的100μL培养上清的放射活性(cpm)的平均值。C表示靶细胞中添加有150μL10%FBS/D-MEM培养基的孔中的100μL培养上清的放射活性(cpm)的平均值。试验按一式三份来实施,算出反映各受检抗体的ADCC活性的、上述试验中特异性铬游离率(%)的平均值和标准偏差。
(4) 评价各受检抗体的 ADCC 活性
评价经由各受检抗体发挥人PBMC的ADCC活性,其结果,确认所有受检抗体均具有ADCC活性。其结果见图57。对各浓度下的各受检抗体所显示的特异性铬游离率进行显著性差异检验,由结果确认:在所有抗体浓度下各受检抗体所显示出的特异性铬游离率在各受检抗体间不存在显著差异。统计分析中使用SAS前临床包装(preclinical package)(SAS Institute Inc.)。以上结果显示:在pI已改变的各受检抗体的ADCC活性间不存在差异。
[ 实施例 28] 抗人 IL-6 受体抗体、抗人 GPC3 抗体、抗人 IL-31 受体抗体的制作
1 抗人 IL-6 受体抗体的制作
作为抗人IL-6受体抗体,制作2种抗体。制作由作为H链的 6R_a_H1(SEQ ID NO:221)和作为L链的6R_a_L1(SEQ ID NO:224)构成的6R_a_H1L1、以及由作为H链的6R_b_H1(SEQ ID NO:227)和作为L链的6R_b_L1(SEQ ID NO:229)构成的6R_b_H1L1。按照参考例1、2,制作编码各自的氨基酸序列的动物细胞表达载体,进行抗体的表达、纯化。
2 抗人 GPC3 抗体的制作
制作抗人GPC3抗体。制作由作为H链的GPC3_H1(SEQ ID NO:233)和作为L链的GPC3_L1(SEQ ID NO:236)构成的GPC3_H1L1。按照参考例1、2,制作编码各自的氨基酸序列的动物细胞表达载体,进行抗体的表达、纯化。
3 抗人 IL-31 受体抗体
制作抗人IL-31受体抗体。制作由作为H链的31R_H1(SEQ IDNO:239)和作为L链的31R_L1(SEQ ID NO:242)构成的31R_H1L1。按照参考例1、2,制作编码各自的氨基酸序列的动物细胞表达载体,进行抗体的表达、纯化。
[ 实施例 29] 通过氨基酸取代来降低抗人 IL-6 受体抗体、抗人 GPC3 抗体、抗人 IL-31 受体抗体的等电点
1 探索在不减弱抗原结合活性的情况下降低等电点的 CDR 序列
WO/2007/114319中给出了利用CDR中的氨基酸取代来控制等电点的例子,对H链CDR3进行氨基酸取代,但由于H链CDR3与抗体的抗原结合活性密切相关,所以根据抗体种类,设想通过相同位点的氨基酸取代,不会减弱抗原结合活性,也不会降低等电点。于是,探索在与抗体种类无关、在不减弱抗原结合活性的情况下能够降低等电点的候选CDR序列。其结果,作为在不减弱抗原结合活性的情况下可以降低等电点的候选CDR序列,在H链可变区中有H31、H52、H61、H62、H64、H65,在L链可变区中有L24、L27、L27a、L53、L54、L55、L56(Kabat编号)。于是,在以下所示的抗人IL-6受体抗体、抗人GPC3抗体和抗人IL-31受体抗体中,分别对上述候选CDR序列中的几个进行氨基酸取代,研究能否在不减弱抗原结合活性的情况下降低等电点。
2 等电点降低的抗人 IL-6 受体抗体的制作、结合活性评价和等电点测定
向构成抗人IL-6受体抗体6R_a_H1L1的6R_a_H1(SEQ ID NO:221)和6R_a_L1(SEQ ID NO:224)中分别导入降低等电点的氨基酸取代和其他氨基酸取代,构建6R_a_H2(SEQ ID NO:222)和6R_a_L2(SEQ ID NO:225),按照参考例1、2的方法制作载体,进行6R_a_H2L2的表达、纯化。向6R_a_H2L2中进一步导入降低等电点的氨基酸取代和其他氨基酸取代,构建6R_a_H3(SEQ ID NO:223)和6R_a_L3(SEQ ID NO:226),按照参考例1的方法制作载体,进行6R_a_H3L3的表达、纯化。
利用参考例3所述的使用Biacore T100的方法测定6R_a_H1L1、6R_a_H2L2、6R_a_H3L3相对于作为抗原的人IL-6受体的解离常数(KD)。如下表18所示,6R_a_H1L1、6R_a_H2L2、6R_a_H3L3相对于IL-6受体的解离常数(KD)同等,通过导入氨基酸取代,没有确认到抗原结合活性大幅降低。
[表18]
解离常数(KD)
6R_a_H1L1 6.70E-11
6R_a_H2L2 3.00E-11
6R_a_H3L3 5.20E-11
利用本领域技术人员公知的等电点电泳测定等电点,结果如下:6R_a_H1L1的等电点为约9.2,相对于此,进行了降低等电点的氨基酸取代的6R_a_H2L2的等电点为约6.1,6R_a_H3L3的等电点为约5.4,与6R_a_H1L1相比,两者的等电点分别下降了约3.1和约3.8。另外,利用GENETYX(GENETYX CORPORATION)计算可变区 VH/VL的理论等电点时,6R_a_H1L1的理论等电点为9.37,相对于此,6R_a_H2L2的理论等电点为4.63,6R_a_H3L3的理论等电点为约4.27,与6R_a_H1L1相比,两者的理论等电点分别下降了4.74和5.10。上述结果汇总在表19中。
[表19]
导入到6R_a_H1L1的CDR序列中的氨基酸取代汇总在下表20中。结果表明:对于作为抗人IL-6受体抗体的6R_a_H1L1,这些CDR的氨基酸取代可以在不大幅降低抗原结合活性的情况下降低抗体分子的等电点。
[表20]
之后,向构成另一抗人IL-6受体抗体6R_b_H1L1的6R_b_H1(SEQ ID NO:227)和6R_b_L1(SEQ ID NO:229)中分别导入降低等电点的氨基酸取代和其他氨基酸取代,构建6R_b_H2(SEQ ID NO:228)和6R_b_L2(SEQ ID NO:230),按照参考例1、2的方法制作载体,进行6R_b_H2L2的表达、纯化。进一步向6R_b_H2L2中导入降低等电点的氨基酸取代和其他氨基酸取代,构建6R_b_L3(SEQ ID NO:231) 和6R_b_L4(SEQ ID NO:232),按照参考例1的方法制作载体,进行6R_b_H2L3、6R_b_H2L4的表达、纯化。
6R_b_H1L1、6R_b_H2L2、6R_b_H2L3、6R_b_H2L4对作为抗原的人IL-6受体的中和活性的测定按照参考例4所示的方法来进行。如图58所示,6R_b_H1L1、6R_b_H2L2、6R_b_H2L3、6R_b_H2L4的中和活性几乎同等,没有确认到因导入氨基酸取代而引起的抗原结合活性的大幅下降。
利用本领域技术人员公知的等电点电泳测定等电点,结果如下:6R_b_H1L1的等电点为约9.3,相对于此,进行了降低等电点的氨基酸取代的6R_b_H2L2的等电点为约5.9,与6R_b_H1L1相比,6R_b_H2L2的等电点下降了约3.4。另外,利用GENETYX(GENETYXCORPORATION)计算可变区VH/VL的理论等电点时,6R_b_H1L1的理论等电点为9.20,相对于此,6R_b_H2L2的理论等电点为4.52,6R_b_H2L3的理论等电点为约4.46,6R_b_H2L4的理论等电点为约4.37,与6R_b_H1L1相比,三者的理论等电点分别降低了4.68、4.74和4.83。上述结果汇总在表21中。
[表21]
N.T.:无法测定
导入到6R_b_H1L1的CDR序列中的氨基酸取代汇总在下述表22中。发现:对于抗人IL-6受体抗体6R_b_H1L1,这些CDR的氨基酸取代可以在不大幅降低抗原结合活性的情况下降低抗体分子的等电点。
[表22]
3 等电点降低的抗人 GPC3 抗体的制作、结合活性评价和等电点测定
向构成抗人GPC3抗体GPC3_H1L1的GPC3_H1(SEQ ID NO:233)和GPC3_L1(SEQ ID NO:236)中分别导入降低等电点的氨基酸取代和其他氨基酸取代,构建GPC3_H2(SEQ ID NO:234)和GPC3_L2(SEQ ID NO:237),按照参考例1、2的方法制作载体,进行GPC3_H2L2的表达、纯化。向GPC3_H2L2中进一步导入降低等电点的氨基酸取代和其他氨基酸取代,构建GPC3_H3(SEQ ID NO:235)和GPC3_L3(SEQ ID NO:238),按照参考例1的方法制作载体,进行GPC3_H3L3的表达、纯化。
使用参考例5所述的竞争ELISA法评价GPC3_H1L1、GPC3_H2L2、GPC3_H3L3与作为抗原的人GPC3的结合活性,其结果见图59和图60。GPC3-H1L1、GPC3-H2L2、GPC3-H2L2、GPC3-H3L3与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的结合活性几乎同等,没有确认到因导入氨基酸取代而引起的抗原结合活性的大幅下降。
利用本领域技术人员公知的等电点电泳测定等电点,结果如下:GPC3_H1L1的等电点为约9.6,相对于此,进行了降低等电点的氨基酸取代的GPC3_H2L2的等电点为约8.9,与GPC3_H1L1的等电点相比,GPC3_H2L2的等电点下降了0.7。同样,GPC3_H2L2的等电点为约8.7,相对于此,进行了降低等电点的氨基酸取代的GPC3_H3L3的等电点为约6.5,与GPC3_H2L2的等电点相比,GPC3_H3L3的等电点下降了2.2。此外,GPC3_H1L1的理论等电点为9.65,相对于此,GPC3_H2L2的理论等电点为8.47,与GPC3_H1L1相比,GPC3_H2L2的理论等电点下降了1.18。同样,GPC3_H2L2的理论等电点为8.47,相对于此,GPC3_H3L3的理论等电点为4.93,与GPC3_H2L2相比,GPC3_H3L3的理论等电点下降了3.54。上述结果汇总在表23中。
[表23]
导入到GPC3_H1L1的CDR序列中的氨基酸取代汇总在下述表24中。发现:对于作为抗人GPC3抗体的GPC3_H1L1,这些CDR的氨基酸取代可以在不大幅降低抗原结合活性的情况下降低抗体分子的等电点。
[表24]
4 等电点降低的抗人 IL-31 受体抗体、结合活性评价和等电点测定
向构成31R_H1L1的31R_H1(SEQ ID NO:239)和31R_L1(SEQID NO:242)中分别导入降低等电点的氨基酸取代和其他氨基酸取代,构建31R_H2(SEQ ID NO:240)和31R_L2(SEQ ID NO:243),按照参考例1、2的方法制作载体,进行31R_H2L2的表达、纯化。向31R_H2L2中进一步导入降低等电点的氨基酸取代和其他氨基酸取代,构建31R_H3(SEQ ID NO:241),按照参考例1的方法制作载体,进行31R_H3L2的表达、纯化。
使用参考例6所述的Biacore的方法评价31R_H2L2、31R_H3L2与IL-31的结合活性,其结果汇总在表25中。如表25所示,31R_H2L2、31R_H3L2与31R_H1L1的NR10的结合活性几乎同等,没有确认到因导入氨基酸取代而引起的抗原结合活性的大幅下降。
[表25]
利用本领域技术人员公知的等电点电泳测定等电点,结果如下:31R_H1L1的等电点为约7.76,相对于此,进行了降低等电点的氨基酸取代的31R_H2L2的等电点为约5.49,31R_H3L2的等电点为约5.43,与31R_H1L1相比,两者的等电点分别下降了约2.27和约2.33。此外,31R_H1L1的理论等电点为7.76,相对于此,31R_H2L2的理论等电点为4.63,31R_H3L2的理论等电点为约4.54,与31R_H1L1相比,两者的理论等电点分别下降了约3.13和约3.22。这些结果汇总在表26中。
[表26]
导入到31R_H1L1的CDR序列中的氨基酸取代汇总在下述表27中。发现:对于抗人IL-31受体抗体31R_H1L1,这些CDR的氨基酸取代可以在不大幅降低抗原结合活性的情况下降低抗体分子的等电点。
[表27]
5 可以在不减弱抗原结合活性的情况下降低抗人 IL-6 受体抗体、抗人 GPC3 抗体、抗人 IL-31 受体抗体的等电点的 CDR 序列
上述研究中制作的2种抗人IL-6受体抗体(6R_a和6R_b)、抗人GPC3抗体(GPC3)、抗人IL-31受体抗体(31R)的H链CDR序列汇总在表28中、L链CDR序列汇总在表29中。可以在不减弱抗原结合活性的情况下降低等电点的氨基酸取代用阴影表示。
[表28]
[表29]
由此发现:H链可变区中的H31、H61、H62、H64、H65和L链可变区中的L24、L27、L53、L54、L55(Kabat编号)不依赖于抗体种类、在多个抗体中是可以导入在不大幅降低抗体的抗原结合活性的情况下降低抗体等电点的氨基酸取代的共通CDR位点。
WO/2007/114319中显示:通过降低抗体的等电点,可以提高IgG的药物动力学。在WO/2007/114319中,由于没有减弱抗原结合活性,所以主要对抗体可变区的构架进行氨基酸取代,抗FactorIXa抗体的实测等电点变化约0.9、理论等电点变化约1.0;抗FactorX抗体的实测等电点变化约0.5、理论等电点变化约0.1,等电点的变化程度小。
在本发明中,发现了不会减弱抗原结合活性的CDR序列,不仅向抗体可变区的构架中、也可以向CDR中导入降低等电点的氨基酸取代。由此发现:在上述抗人IL-6受体抗体中,可实现实测等电点下降约3.8、理论等电点下降约5.1;在抗人GPC3抗体中,可实现实测等电点下降约3.1、理论等电点下降约4.7;在抗人IL-31受体抗体中,可实现实测等电点下降约3.2、理论等电点下降约2.3,与仅对构架进行氨基酸取代时相比,可实现大幅地降低等电点。
[ 实施例 30] 评价降低等电点的抗人 IL-6 受体抗体、抗人 GPC3 抗体、抗人 IL-31 受体抗体的药物动力学
1 评价抗人 IL-6 受体抗体在食蟹猴和小鼠体内的药物动力学
评价抗人IL-6受体抗体6R_a_H1L1及等电点降低的抗人IL-6受体抗体6R_a_H2L2和6R_a_H3L3在食蟹猴体内的药物动力学。将6R_a_H1L1和6R_a_H2L2均以1.0mg/kg进行静脉内单次给药,给药前和给药后随时间采血。另外,将6R_a_H2L2和6R_a_H3L3均以1.0mg/kg进行皮下单次给药,给药前和给药后随时间采血。
血浆中浓度测定按照ELISA法来进行。将适当浓度的标准曲线试样和血浆测定试样分别注入用抗人IgG(γ链特异性)F(ab′)2(Sigma社制)固定的微板(Nunc-Immuno Plate,MaxiSorp(Nalge nunc International社制))中,在室温下静置1小时后,依次使山羊抗人IgG-BIOT(SouthernBiotechnology Associates社制)和链霉亲和素碱性磷酸酶缀合物(RocheDiagnostics社制)与其反应,使用BluePhos Microwell磷酸酶底物系统(Kirkegaard & Perry Laboratories社制)作为底物进行显色反应,用酶标仪测定650nm的吸光度。使用分析软件SOFTmax PRO(MolecularDevices社制),由标准曲线的吸光度算出血浆中浓度。将得到的血浆中浓度变化的数据用药物动力学分析软件WinNonlin(Pharsight社制)进行非模型依赖性分析,算出清除率(CL),结果见表30。比较静脉内给药的6R_a_H1L1和6R_a_H2L2时,确认:等电点降低的6R_a_H2L2 的清除率小,通过降低等电点,其药物动力学提高。再比较皮下给药的6R_a_H2L2和6R_a_H3L3时,确认:等电点降低的6R_a_H3L3的清除率小,通过降低等电点,其药物动力学提高。
[表30]
CL(mL/h/kg)
6R_a_H1L1iv 1.82
6R_a_H2L2iv 0.91
6R_a_H2L2sc 1.43
6R_a_H3L3sc 0.93
之后,评价不同的抗人IL-6受体抗体6R_b_H1L1和等电点降低的抗人IL-6受体抗体6R_b_H2L2在小鼠(C57BL/6J、日本Charles River)体内的药物动力学。将6R_b_H1L1和6R_b_H2L2均以1.0mg/kg进行静脉内单次给药,给药前和给药后随时间采血。另外,将6R_b_H1L1和6R_b_H2L2均以1.0mg/kg进行皮下单次给药,给药前和给药后随时间采血。
血浆中浓度测定通过ELISA法来进行。首先,使用EZ-LinkTMSulfo-NFS-生物素化试剂盒(PIERCE社制)将重组人IL-6sR(R&DSystems社制)生物素化。将该生物素化人-sIL-6R分别注入到用Reacti-Bind高结合能链霉亲和素(HBC)包被的板(PIERCE社制)中,在室温下静置1小时以上,制成人-sIL-6R固化板。制备适当浓度的标准曲线试样和小鼠血浆测定试样,分别注入到人-sIL-6R固化板中,在室温下静置1小时。之后,使抗人IgG-AP(SIGMA社制)与其反应,使用BluePhos Microwell磷酸酶底物系统(Kirkegaard & PerryLaboratories社制)作为底物进行显色反应,用酶标仪测定650nm的吸光度。使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices社制),由标准曲线的吸光度算出血浆中浓度。将得到的血浆中浓度变化数据用药物动力学分析软件WinNonlin(Pharsight社制)进行非模型依赖性分析,算出清除率(CL),结果见表31。比较静脉内和皮下给药的6R_a_H1L1 和6R_a_H2L2时,确认:等电点降低的6R_a_H2L2在两种情况下的清除率均小,通过降低等电点,其药物动力学提高。
[表31]
CL(mL/h/kg)
6R_b_H1L1iv 0.18
6R_b_H2L2iv 0.10
6R_b_H1L1sc 0.18
6R_b_H2L2sc 0.09
2 评价抗人 GPC3 抗体在小鼠体内的药物动力学
评价抗人GPC3抗体GPC3_H1L1和等电点降低的抗人GPC3抗体GPC3_H2L2和GPC3_H3L3在C.B-17/Icr-scid小鼠体内的药物动力学。将GPC3_H1L1、GPC3_H2L2、GPC3_H3L3均以5.0mg/kg进行静脉内单次给药,给药前和给药后随时间采血。
血浆中浓度测定通过ELISA法来进行。将适当浓度的标准曲线试样和适当稀释成所期望的浓度的小鼠血浆受检试样分别注入到固定有抗原GPC3(中外制药社制)的微板(Nunc-Immuno Plate,MaxiSoup(Nalge nunc International))中,将该板在室温下静置1小时。之后,依次分别注入山羊抗人IgG-BIOT(Southern Biotechnology Associates)和链霉亲和素碱性磷酸酶缀合物(Roche Diagnostics),使用BluePhosMicrowell磷酸酶底物系统(Kirkegaard & Perry Laboratories社制)作为底物进行显色反应,用酶标仪测定650nm的吸光度。使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices社制),由标准曲线的吸光度算出血浆中浓度。将得到的血浆中浓度变化数据用药物动力学分析软件WinNonlin(Pharsight社制)进行非模型依赖性分析,算出清除率(CL),结果见表32。比较GPC3_H1L1和GPC3_H2L2时,等电点降低的GPC3_H2L2的清除率小,再比较GPC3_H2L2和GPC3_H3L3时,确认等电点进一步降低的GPC3_H3L3的清除率小,通过降低等电点,其药物动力学提高。
[表32]
CL(mL/h/kg)
GPC3_H1L1 2.34
GPC3_H2L2 0.38
GPC3_H3L3 0.22
评价抗人 IL-31 受体抗体在小鼠体内的药物动力学
评价抗人IL-31受体抗体31R_H1L1和等电点降低的抗人IL-31受体抗体31R_H2L2在小鼠(C57BL/6J、日本Charles River)体内的药物动力学。将31R_H1L1和31R_H2L2均以1.0mg/kg进行静脉内单次给药,给药前和给药后随时间采血。
血浆中浓度测定通过ELISA法来进行。将适当浓度的标准曲线试样和血浆测定试样分别注入到用抗人IgG(Fc特异性)抗体(Sigma社制)固化的微板(Nunc-Immuno Plate,MaxiSorp(Nalge nunc International社制))中,在室温下静置1小时后,使山羊抗人IgG-ALP(Sigma社制)在室温下与其反应1小时,之后使用BluePhos Microwell磷酸酶底物系统(Kirkegaard & Perry Laboratories社制)作为底物进行显色反应,用酶标仪测定650nm的吸光度。使用分析软件SOFTmax PRO(MolecularDevices社制),由标准曲线的吸光度算出血浆中浓度。
将得到的血浆中浓度变化数据用药物动力学分析软件WinNonlin(Pharsight社制)进行非模型依赖性分析,算出清除率(CL),结果见表33。比较31R_H1L1和31R_H2L2时,确认:等电点降低的31R_H2L2的清除率小,通过降低等电点,其消除速率变小。
[表33]
CL(mL/h/kg)
31R_H1L1 0.15
31R_H2L2 0.13
3 结论
在本发明中,本发明人等发现:在抗原种类不同的多个抗体中,利用CDR序列的氨基酸取代,可以在不减弱抗体的抗原结合活性的情况下,降低抗体的等电点、提高抗体的药物动力学。在发现的CDR序列的氨基酸取代中,H链可变区中的H31、H61、H62、H64、H65、L链可变区中的L24、L27、L53、L54、L55(Kabat编号)不依赖于抗体种类,在多个抗体中是可以导入在不大幅减弱抗体的抗原结合活性的情况下降低抗体等电点的氨基酸取代、提高药物动力学的CDR序列的氨基酸取代。认为CDR序列中的这些突变位点在不依赖于抗原种类、不大幅减弱抗体的抗原结合活性的情况下可以降低抗体的等电点,认为其可以用作提高抗体药物动力学的氨基酸取代位点。
[ 实施例 31] 利用标准层析法进行等电点降低的抗人 IL-6 受体抗体、抗人 GPC3 抗体、抗人 IL-31 受体抗体的异源二聚体与同源二聚体的峰分离
1 Factor IX 抗体 / Factor X 抗体的异源二聚体的表达
专利文献WO/2007/114325中就具有共通L链的IgG型双特异性抗体的纯化方法进行了报道。为了表达具有共通L链的IgG型双特异性抗体,必需表达与两种H链(A链和B链)共通的L链。此时,不仅表达作为目标双特异性抗的A链B链异源二聚体,还表达A链同源二聚体和B链同源二聚体,因此必须从3种抗体的混合物中纯化作为目标双特异性抗体的A链B链异源二聚体。在同一专利中显示:在现有方法中,无法利用标准层析法分离A链B链异源二聚体、A链同源二聚体和B链同源二聚体的峰,进而纯化A链B链异源二聚体,但通过取代作为2种H链的A链和B链的可变区的氨基酸,向A链同源二聚体和B链同源二聚体中导入等电点之差,从而可以利用标准层析法的阳离子交换层析分离A链B链异源二聚体、A链同源二聚体和B链同源二聚体的峰,纯化A链B链异源二聚体。在同一专利中,认为作为可变区氨基酸的CDR氨基酸取代会影响抗体的抗原结合活性,因此只对构架进行氨基酸取代。但是,如上所述,利用构架的氨基酸取代无法导入等电点的大幅变化,为了高效率地纯化A链B链异源二聚体,优选利用A链同源二聚体和B链同源二聚体导入更大的等电点之差。于是,研究通过导入实施例28中发现的、在不大幅减弱抗体的抗原结合活性的情况下降低抗体等电点的CDR中的氨基酸取代,能否分离A链B链异源二聚体、A链同源二聚体和B链同源二聚体的峰。
2 抗人 IL-6 受体抗体 /pI 降低的抗人 IL-6 受体抗体的异源二聚体的表达
使用6R_a_H1(SEQ ID NO:221)作为A链、使用在不减弱抗原结合活性的情况下降低等电点、且导入了与A链的等电点之差的6R_a_H3(SEQ ID NO:223)作为B链、以及使用6R_a_L3(SEQ ID NO:226)作为共通L链,按照参考例2所示的方法,进行6R_a_H1H3L3(A链B链异源二聚体(6R_a_H1/H3/L3)、A链同源二聚体(6R_a_H1/L3)和B链同源二聚体(6R_a_H3/L3)的混合物)的表达、纯化。
3 抗人 GPC3 抗体 /pI 降低的抗人 GPC3 抗体的异源二聚体的表达
使用GPC3_H2(SEQ ID NO:234)作为A链、使用在不减弱抗原结合活性的情况下降低等电点、且导入了与A链的等电点之差的GPC3_H3(SEQ ID NO:235)作为B链、以及使用GPC3_L3(SEQ ID NO:238)作为共通L链,按照参考例2所述的方法,进行GPC3_H2H3L3(A链B链异源二聚体(GPC3_H2/H3/L3)、A链同源二聚体(GPC3_H2/L3)和B链同源二聚体(GPC3_H3/L3)的混合物)的表达、纯化。
4 抗人 IL-31 受体抗体 /pI 降低的抗人 IL-31 受体抗体的异源二聚体的表达
使用31R_H1的恒定区已改变的31R_H1a(SEQ ID NO:244)作为A链、使用在不减弱抗原结合活性的情况下降低等电点、且导入了与A链的等电点之差的、31R_H2的恒定区已同样改变的31R_H2a(SEQ ID NO:245)作为B链、以及使用31R_L2(SEQ ID NO:243)作为共通L链,按照参考例2所示的方法,进行31R_H1aH2aL2(A链B链异源二聚体(31R_H1a/H2a/L2)、A链同源二聚体(31R_H1a/L2)和B链同源二聚体(31R_H2a/L2)的混合物)的表达、纯化。
5 通过阳离子交换层析进行表达抗体的评价
上述制作的抗体的A链同源二聚体与B链同源二聚体的VH/VL理论等电点之差汇总在下表34中。通过不仅向H链的构架中、还向CDR序列中导入保持结合活性不变而降低等电点的氨基酸取代,可以向A链同源二聚体和B链同源二聚体的理论等电点中导入最大为1.56的差。专利文献WO/2007/114325中显示:通过只向A链同源二聚体的构架中导入氨基酸取代使等电点降低、且只向B链同源二聚体的构架中导入氨基酸取代使等电点增大,可以向A链同源二聚体和B链同源二聚体的VH/VL理论等电点中导入1.13的差。本研究表明:尽管只对其中一个链实施氨基酸取代(不降低等电点),通过不仅向构架中、还向CDR序列中导入氨基酸取代,可以向理论等电点中导入最大为1.56的差。即,作为用于分离A链同源二聚体和B链同源二聚体的氨基酸取代,在保持结合活性不变的情况下不仅向构架中、还向CDR序列中导入氨基酸取代,从而可以进一步增大两者的等电点之差。通常,利用标准离子交换层析进行的分离依赖于将要分离的两种成分的等电点之差,所以认为由此可以更容易地分离两者。
[表34]
评价6R_a_H1H3L3、GPC3_H2H3L3和31R_H1aH2aL2各自的A链B链异源二聚体、A链同源二聚体和B链同源二聚体能否通过阳离子交换层析进行峰分离。标准阳离子交换层析柱使用ProPac WCX-10(Dionex),流动相A使用25mMMES(pH5.0)、流动相B使用25mM MES、1M NaCl(pH5.0),采用适当的流量和梯度进行分析。利用阳离子交换层析进行评价的结果见图61。其结果,在6R_a_H1H3L3、GPC3_H2H3L3和31R_H1aH2aL2中均发现A链B链异源二聚体、A链同源二聚体和B链同源二聚体的峰分离。
发现在H链可变区中,H31、H61、H62、H64、H65(Kabat编号)不依赖于抗体种类,通过同一位点的氨基酸取代,在不大幅减弱抗体的抗原结合活性的情况下可以降低抗体的等电点,由此可以通过阳离子交换层析分离异源二聚体和同源二聚体。认为CDR序列中的这些突变位点不论抗原种类如何,在不大幅减弱抗体的抗原结合活性的情况下可以降低抗体的等电点,可以用作用于增大双特异性抗体的异源二聚体与同源二聚体间的等电点之差的氨基酸取代位点。
[参考例1]
抗体表达载体基因的制作
各突变体的制作通过使用QuikChange位点定向诱变试剂盒(Stratagene)或PCR的装配PCR来进行。使用QuikChange位点定向诱变试剂盒(Stratagene)时,按照附录说明书的方法制作突变体。使用装配PCR来进行的方法采用下述任一种方法来进行。第一种方法中,进行根据包含修饰位点的正链和反链的序列设计的寡DNA的合成。将包含修饰位点的正链寡DNA和与插入有将进行修饰的基因的载体结合的反链寡DNA、包含修饰位点的反链寡DNA和与插入有将进行修饰的基因的载体结合的正链寡DNA分别组合,使用PrimeSTAR(TAKARA)进行PCR,由此制作包含修饰位点的5末端侧和3末端侧片段。通过装配PCR将该2个片段连接起来,由此制作各突变体。第二种方法中,通过制作适当条数的寡DNA以覆盖整个可变区,之后使用装配PCR将上述寡DNA连接起来,由此制作整个可变区。将按照上述方法制作的突变体插入能够在动物细胞中表达插入基因的表达载体中,得到的表达载体的核苷酸序列按照本领域技术人员公知方法进行确定。
[参考例2]
抗体的表达和纯化
抗体的表达采用下述方法来进行。将来自人胚肾癌细胞的HEK293H株(Invitrogen)悬浮于含有10%胎牛血清(Invitrogen)的DMEM培养基(Invitrogen)中,在粘附细胞用培养皿(直径10cm,CORNING)的各培养皿中按5~6×105个/mL的细胞密度接种10mL,在37℃、5%CO 2 的培养箱内培养一昼夜,之后吸除培养基,添加6.9mLCHO-S-SFM-II(Invitrogen)培养基。将已制备的质粒通过脂质转染法导入细胞中。回收得到的培养上清,之后在室温下以约2000g的离心力离心5分钟以除去细胞,再通过0.22μm的滤器MILLEX(R)-GV(Millipore)进行灭菌,得到培养上清。使用rProtein A SepharoseTM FastFlow(Amersham Biosciences),按照本领域技术人员公知的方法从所得的培养上清中纯化抗体。至于纯化抗体浓度,使用分光光度计测定280nm的吸光度。利用PACE法由所得的值算出吸光系数,使用该吸光系数算出抗体浓度(Protein Science 1995;4:2411-2423)。
[参考例3]
利用 Biacore 来评价抗人 IL-6 受体抗体与 IL-6 受体的亲和性的方法
1. 可溶型人 IL-6 受体的制备
作为抗原的人IL-6受体的重组人IL-6受体如下制备。制作J.Biochem.108,673-676(1990)中报道的、由N末端侧第1位~第344 位氨基酸序列构成的可溶型人IL-6受体(Yamasaki等人、Science 1988;241:825-828(GenBank #X12830))的CHO细胞恒定表达株。通过BlueSepharose 6 FF柱层析、固定有可溶型人IL-6受体特异性抗体的柱亲和层析、凝胶过滤柱层析这3种柱层析,从由可溶型人IL-6受体表达CHO细胞得到的培养上清中纯化可溶型人IL-6受体。作为主峰洗脱的组分为最终纯品。
2. 利用 Biacore 评价与可溶型人 IL-6 受体的亲和性
使用Biacore T100(GE Healthcare Bioscience),进行抗人IL-6受体抗体与可溶型人IL-6受体的抗原抗体反应的速度论的分析。按照本领域技术人员公知的方法,将rec-Protein A(ZYMED)(以下记作蛋白A)固定在传感器芯片上,将抗体捕获到该固定化蛋白A上,再使抗原作为分析物进行反应,测定抗体与抗原的相互作用。运行缓冲液使用HBS-EP+,流速为20μL/min。各抗体制备成约100RU与蛋白A/G结合。用作分析物的可溶型人IL-6受体用HBS-EP+调整成0、0.065、0.131、0.261μg/mL。测定中,首先使抗体溶液与蛋白A/G结合,再使分析物溶液与其相互作用3分钟,之后切换成HBS-EP+,测定解离相10分钟或15分钟。解离相的测定结束后,用10μL 10mM的甘氨酸-HCl(pH1.5)清洗,使传感器芯片再生。以该结合、解离、再生作为1个分析周期。按照该周期对各种抗体进行测定。使用Biacore专用数据分析软件、即Biacore T100评估软件(GE Healthcare Bioscience)对所得的传感图进行速度论的分析。
[参考例4]
使用 BaF/6R 细胞评价抗人 IL-6 受体抗体的 IL-6 受体中和活性的方法
为了得到显示IL-6依赖增殖性的细胞株,如下建立表达人gp130和人IL-6R的BaF3细胞株。通过PCR扩增全长人IL-6R cDNA,将其克隆到pcDNA3.1(+)(Invitrogen)中,构建hIL-6R/pcDNA3.1(+)。通过电穿孔处理将pCOS2Zeo/gp130基因导入BaF3细胞中,在人白介素 -6(R&D Systems)、100ng/mL人白介素-6可溶型受体(R&D Systems)的存在下进行筛选,建立人gp130表达BaF3细胞株(以下记作BaF/gp130)。再通过PCR扩增全长人IL-6R cDNA,将其克隆到pcDNA3.1(+)(Invitrogen)中,构建hIL-6R/pcDNA3.1(+)。通过电穿孔处理将pcDNA3.1(+)/hIL-6R基因导入上述制作的BaF/gp130细胞中,在人白介素-6(R&D Systems)的存在下进行筛选,建立人IL-6R表达BaF3细胞株(以下记作BaF/6R)。该BaF/6R在人白介素-6(R&DSystems)的存在下增殖,所以可用于评价抗人IL-6受体抗体的增殖阻害活性(即人IL-6受体中和活性)。
使用BaF/6R来评价抗人IL-6受体抗体的人IL-6受体中和活性。将BaF/6R用含有10%FBS的RPMI1640培养基清洗3次,之后悬浮于含有20ng/mL人白介素-6(TORAY)(终浓度为10ng/mL)和10%FBS的RPMI1640培养基中,使达到2.5~5.0×104细胞/mL,向96孔平板(CORNING)的各孔中分别注入50μL。接下来,将抗人IL-6受体抗体用含有10%FBS的RPMI1640稀释,向各孔中混合各50μL。在37℃、5%CO 2 的条件下培养3天,以20μL/孔加入用PBS稀释至2倍的WST-8试剂(细胞计数试剂盒-8、株式会社同仁化学研究所),之后立即用SUNRISE CLASSIC(TECAN)测定450nm的吸光度(参比波长为620nm)。培养2小时后,再次测定450nm的吸光度(参比波长为620nm),以2~4小时的吸光度变化为指标,评价人IL-6受体中和活性。
[参考例5]
通过竞争 ELISA 评价抗人 GPC3 抗体的各突变修饰抗体的结合活性
通过竞争ELISA评价制作的抗体的结合活性。向96孔平板的每孔中加入100μL制备成1μg/mL的可溶型GPC3核心多肽(SEQ IDNO::207)。将该板在4℃下静置一夜,将可溶型GPC3核心多肽固定在该板上。使用Skan WASHER400(Molecular Devices),用清洗缓冲液清洗固定在该板上的可溶型GPC3核心多肽3次,加入200μL封闭缓冲液,在4℃下封闭30分钟以上。接下来,使用Skan WASHER400,用清洗缓冲液清洗固定、封闭该可溶型GPC3核心多肽的板3次。之后,向板的每孔中加入200μL混合有100μL各种浓度的GPC3-H2L2抗体或其他抗体和100μL终浓度为0.3μg/mL的生物素化GPC3-H2L2抗体的混合液。GPC3-H2L2抗体的生物素化使用生物素标记试剂盒(Roche),按照试剂盒的操作指南来实施。将该板在室温下静置1小时,之后使用Skan WASHER400(Molecular Devices),用清洗缓冲液清洗5次。向板的每孔中加入100μL用基质缓冲液稀释至20,000倍的山羊抗链霉亲和素碱性磷酸酶(ZYMED),将该板在室温下静置1小时,之后使用Skan WASHER400,用清洗缓冲液清洗5次。使用基质缓冲液制备磷酸酶底物(Sigma),使其浓度达到1mg/mL,每孔中加入100μL,静置1小时。使用Benchmark Plus(BIO-RAD),利用655nm的对照吸光度来测定各孔中的反应液在405nm的吸光度。
[参考例6]
利用 Biacore 评价抗人 IL-31 受体抗体与 IL-31 受体的亲和性的方法
1. 可溶型人 IL-31 受体的制备
以人IL31受体的cDNA为模板,通过PCR法只扩增胞外区,并向C末端添加FLAG tag序列,将其整合到哺乳动物细胞用表达载体中。通过电穿孔法将10μg直链状载体导入中国仓鼠卵巢细胞株DG44中(BioRad Gene PulserII,25μF,1.5kV),得到高度表达的细胞株。大量培养该细胞株,利用抗FLAG抗体柱(SIGMA制)、凝胶过滤法从培养上清中纯化,得到可溶型NR10。可溶型人IL31受体的氨基酸序列见SEQ ID NO:246。
2. 利用 Biacore 评价与可溶型人 IL-31 受体的亲和性
使用Biacore T100(GE Healthcare Bioscience),进行抗人IL-31受体抗体与可溶型人IL-31受体的抗原抗体反应的速度论的分析。按照本领域技术人员公知的方法,将rec-Protein A(ZYMED)(以下记作Protein A)固定在传感器芯片上,将抗体捕获到该固定的蛋白A上,再使抗原作为分析物进行反应,测定抗体与抗原的相互作用。制备各抗体,使适当量的该抗体与蛋白A/G结合。用作分析物的可溶型人IL-31受体用HBS-EP+制备成0、38.5、77.0、154nM。测定中,首先使抗体溶液与蛋白A/G结合,使分析物溶液与其相互作用3分钟,之后切换成HBS-EP+,测定解离相5分钟。解离相的测定结束后,用10μL的10mM甘氨酸-HCl(pH1.5)进行清洗,使传感器芯片再生。该结合、解离、再生构成1个分析周期。按照该周期对各种抗体进行测定。使用Biacore专用数据分析软件、即Biacore T100评估软件(GE HealthcareBioscience),对得到的传感图进行速度论的分析。
产业实用性
通过本发明,提供通过在保持抗原结合活性的同时改变能够暴露于互补性决定区(CDR)表面的至少1个氨基酸残基的电荷来改变抗体等电点的方法、纯化多特异性抗体的方法、改善抗体的血浆中药物动力学的方法、含有等电点已改变的抗体作为有效成分的医药组合物及其制造方法。通过改变抗体的等电点,可以高效率地、以高纯度纯化多特异性抗体。另外,通过改变抗体的等电点,可以改善血浆中药物动力学,可以减少给药频率,持续发挥治疗效果。需要说明的是,按照本发明的方法得到的抗体保持抗原结合活性。
序列表
<110>中外制药株式会社
<120>利用CDR的氨基酸取代来改变抗体等电点的方法
<130>C1-A0708P2
<150>JP 2007-250165
<151>2007-09-26
<150>JP 2007-256063
<151>2007-09-28
<160>246
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>6
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>1
Ser Asp His Ala Trp Ser
1 5
<210>2
<211>16
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>2
Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210>3
<211>10
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>3
Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210>4
<211>11
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>4
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210>5
<211>7
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>5
Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>6
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210>7
<211>30
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>7
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr
20 25 30
<210>8
<211>14
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>8
Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210>9
<211>32
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>9
Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg
1 5 10 15
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210>10
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>10
Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210>11
<211>23
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210>12
<211>15
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>12
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210>13
<211>32
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>13
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210>14
<211>10
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>14
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210>15
<211>448
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>15
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
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Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
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Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
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<223>人工合成肽序列
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
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130 135 140
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