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1. WO2020115823 - PROCÉDÉ DE PRODUCTION D'UNE MATIÈRE DE DÉPART POUR DES PRODUITS COSMÉTIQUES, À L'AIDE D'UNE LIQUEUR DE SURNAGEANT DE CULTURE DE CELLULES SOUCHES OU DE CELLULES IPS

Document

明 細 書

発明の名称 幹細胞またはiPS細胞の培養上清液を用いた化粧品の原料の製造方法

技術分野

0001  

背景技術

0002   0003   0004   0005   0006   0007   0008  

先行技術文献

特許文献

0009  

発明の開示

発明が解決しようとする課題

0010  

課題を解決するための手段

0011   0012   0013   0014  

発明の効果

0015   0016   0017  

発明を実施するための最良の形態

0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041  

図面の簡単な説明

0042  

符号の説明

0043  

請求の範囲

1   2   3   4   5  

図面

1   2  

明 細 書

発明の名称 : 幹細胞またはiPS細胞の培養上清液を用いた化粧品の原料の製造方法

技術分野

[0001]
 本発明は、化粧品の原料の製造方法に関し、特に、幹細胞またはiPS細胞の培養上清液を抽出して精製加工することにより構成した、皮膚細胞の活性化を図ることを可能とする化粧品のための原料の製造方法に関する。

背景技術

[0002]
 従来より、皮膚細胞を活性化させるための化粧品等の原料として、あらゆる素材が使用されており、例えば化粧品においては、コラーゲン、コエンザイムQ10などの有効成分をその原料として配合させた化粧水等が開発され、使用されている。
[0003]
 化粧品においては、従来より、表皮の油分や水分などの保湿のバランスを整えることを目的とした製品が多く使用されており、例えば、コラーゲン、セラミド、ヒアルロン酸、アミノ酸等を保湿剤・整肌剤として配合したり、植物性由来の成分を配合することにより、化粧品から直接皮膚に有効成分を補給することを可能とした製品が開発され使用されている。しかしながら、これらは日常生活において皮膚が失った成分を補給する対処療法的な処置に過ぎず、皮膚の老化を止めるようなアンチエイジングの観点からは、十分とは言えないという問題点があった。
[0004]
 皮膚細胞を活性化させるための技術として、例えば、特開2018-90631号公報が存在する。ここでは、加齢、老化によるシワ、小ジワ、シミ、弛みなど、皮膚の外観上のトラブルを予防又は改善するとともに、皮膚におけるバリアー機能及びヒアルロン酸の産生を維持又は亢進するためのアンチエイジング用皮膚外用組成物として、水性媒体を基剤とし、有効成分としてL-アスコルビン酸、その誘導体及びそれらの塩から選ばれる1種又は2種以上を含んでなるアンチエイジング用皮膚外用組成物に関する技術が開示されている。
[0005]
 確かにこの技術によれば、皮膚トラブルや老化の防止を行うことが可能になると考えられるが、この方法は、従来技術と同様に皮膚が失った成分を補給するための対処療法的処置であり、皮膚の老化を止めるようなアンチエイジングの観点からは、十分とは言えないという問題点があった。
[0006]
 また、特開2014-214094号公報では、ヒト由来幹細胞培養液抽出物を包接させたリポソームを含有する化粧料組成物に関する技術として、 レシチンと水を、超臨界二酸化炭素を用いて逆ミセルエマルションを形成させてから、超臨界二酸化炭素を減圧気化させてリポソーム懸濁液を誘導し、低温工程リポソームにヒト由来幹細胞培養液抽出物を含有させる技術が開示されている。これにより、常温及び低温でリポソームを形成することにより有効成分の活性を維持することができ、皮膚美白及び皮膚しわの改善効果が極めて優れた化粧料を提供することが可能となる旨が開示されている。
[0007]
 この技術によれば、高温でリポソームを形成することにより熱に弱い有効成分が不安定化または破壊することを防止でき、更にヒト由来幹細胞培養液抽出物を含有させて、皮膚美白及び皮膚しわの改善効果が優れた化粧料を構成することが可能となると考えられるが、不純物の含有による肌等のトラブルのリスクを完全に排除するという観点からは、十分とは言えないという問題点があった。
[0008]
 そこで、幹細胞またはiPS細胞の培養上清液を用いた化粧品であって、上清液を抽出して不純物を確実に除去するとともに、成分を高濃度とすることで皮膚細胞の活性化を図る効果を高めることを可能とした化粧品のための原料の製造方法の開発が待たれていた。

先行技術文献

特許文献

[0009]
特許文献1 : 特開2018-90631号公報
特許文献2 : 特開2014-214094号公報

発明の開示

発明が解決しようとする課題

[0010]
 本発明は、上記問題点を解決するために、化粧品の原料の製造方法であって、特に、幹細胞またはiPS細胞の培養上清液を抽出して精製加工し、上清液の不純物を確実に除去するとともに、成分を高濃度とすることで皮膚細胞の活性化を図る効果を高めた、皮膚細胞の活性化を図ることを可能とする化粧品のための原料の製造方法を提供する。

課題を解決するための手段

[0011]
 上記の目的を達成するために本発明に係る幹細胞またはiPS細胞の培養上清液を用いた化粧品の原料の製造方法は、前記培養上清液中から100KDa以上からなる物質を除去して第一上清液を取得する第一生成工程と、前記第一上清液から1KDa未満からなる物質を除去して第二上清液を取得する第二生成工程と、からなり、前記第二生成工程は、更に前記第一上清液を濃縮する濃縮工程を含む構成である。
[0012]
 また、前記第一生成工程は、前記培養上清液をUF膜(限外濾過膜)によって濾過することにより該UF膜を通過した前記第一上清液を取得する構成である。
[0013]
 また、前記第二生成工程は、前記第一上清液をNF膜によって濾過しNF膜を通過した液体を除去した残余液体を取得することにより濃縮を行う濃縮工程を含み、該濃縮工程を経た液体を第二上清液として取得する構成である。
[0014]
 また、前記UF膜は孔径が0.01μmからなるとともに、前記NF膜は孔径が0.001μmからなる構成である。
 更に、前記第一生成工程および第二生成工程は、遠心分離法またはクロスフロー方式により濾過処理を行う構成である。

発明の効果

[0015]
 本発明は、上記詳述した通りの構成であるので、以下のような効果を奏する。
1.培養上清液中から100KDa以上の物質を除去する工程を含む構成としたため、ウイルス、バクテリア、アレルゲン、たんぱく質や免疫グロブリンなどを除去することが可能となり、安全な上清液を精製することが可能となる。また、上清液から1KDa未満からなる物質を除去する工程を含む構成としたため、アミノ酸、無機塩などの不要な物質を排出して必要な物質のみを残すことが可能となる。
2.第一生成工程において、限外濾過膜によって濾過する構成としたため、ウイルス、バクテリア、アレルゲン、たんぱく質や免疫グロブリンなど不純物を確実に除去することが可能となる。
[0016]
3.第二生成工程において、NF膜によって濾過する構成としたため、純金属、アミノ酸等を透過させて排出し、必要な物質が残存する残余液体を取得することが可能となるとともに、取得した液体を濃縮する濃縮工程を含むことが可能となる。
4.UF膜の孔径が0.01μmからなり、NF膜の孔径が0.001μmからなる構成としたため、各生成工程における濾過によって不要な物質等を確実に除去することが可能となるとともに、液体の濃縮が実現可能となる。
[0017]
5.遠心分離法またはクロスフロー方式により濾過処理を行う構成としたため、濾過処理の迅速性や経済性を確保することが可能となる。

発明を実施するための最良の形態

[0018]
 以下、本発明に係る幹細胞またはiPS細胞の培養上清液を用いた化粧品の原料の製造方法を、図面に示す実施例に基づいて詳細に説明する。
 図1は、本発明を構成する各工程を示す概念図であり、図2は、各工程において濾過する物質を示す一覧図である。
[0019]
 本発明に係る幹細胞またはiPS細胞の培養上清液を用いた化粧品の原料の製造方法は、主に、化粧品に混成するための原料1を製造する方法であり、幹細胞またはiPS細胞の培養工程において得られる幹細胞等から分泌された様々な成長因子等を含有する上清液を原料1として生成するものである。
[0020]
 ここで、本発明に係る培養上清液とは、幹細胞またはiPS細胞を培養する工程において得られる液体である。幹細胞等を培養すると、幹細胞は、多数のたんぱく質を含む成分を分泌する。この分泌成分の中には、損傷を受けた組織や細胞の機能を回復するのに重要な役割を果たすサイトカイン等が多く含まれている。本発明は、これら分泌成分を含有する上清液を化粧品の原料1として利用するものである。
[0021]
 本発明に係る幹細胞またはiPS細胞の培養上清液を用いた化粧品の原料の製造方法において製造する原料の一実施態様として、幹細胞の一態様であるヒト由来の真皮線維芽細胞の培養上清液を製造している。なお、培養する幹細胞としては、これに限定されるものではなく、その他の線維芽細胞ないしiPS細胞を培養する構成とすることはもちろん可能であり、略同様の工程によって培養することも可能である。また、以下に説明する培養方法は一実施例であってこれに限定されるものではなく、周知の技術を用いて適宜培養することが可能である。
[0022]
 幹細胞(真皮線維芽細胞)の培養方法の概要は、ヒト由来の真皮線維芽細胞を培養して継代する工程と、該工程で得られた培養物の培養上清液を回収する工程と、前記工程によって回収した培養上清液を濃縮する工程と、からなる。ここで用いる幹細胞(真皮線維芽細胞)は、本実施例では、採取した皮膚片より分離した真皮線維芽細胞をそのまま用いているが、これに限定されることはなく、凍結保存された真皮線維芽細胞を解凍して用いることも、長期保存等の観点から有益である。
[0023]
 幹細胞(真皮線維芽細胞)を、採取した皮膚片より分離する場合、ヒト対象より得た皮膚片をプロテアーゼ処理して表皮と真皮を分離し、真皮を細切してシャーレ中で培養して真皮線維芽細胞を伸展させることにより、幹細胞(真皮線維芽細胞)を得ることができる。この工程に用いるプロテアーゼは、表皮と真皮が分離可能なプロテアーゼであれば特に限定されるものではない。また、真皮線維芽細胞の伸展は、細切した真皮をヒト線維芽細胞の培養に適した培地中で培養することにより行っている。なお、真皮線維芽細胞を継代する回数に特に限定はないが、本実施例では、少なくとも2回、または3回行う構成である。
[0024]
 また、真皮線維芽細胞の培地は、ヒト線維芽細胞の培養に適した培地であれば特に限定されない。なお、ヒト線維芽細胞の培養に適した培地は、例えば、(i)アミノ酸として、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、およびトレオニンからなる群より選択される1以上の成分、(ii)ビタミン類として、アスコルビン酸、ビオチン、塩化コリン、葉酸、ナイアシンアミド、D-パントテン酸カルシウム、リボフラビン、チアミン、ビタミンB12、およびビタミンEからなる群より選択される1以上の成分(iii)核酸として、チミジン,(iv)その他の成分として、グルコース、ピルビン酸ナトリウム、および/またはコハク酸、を含む構成とすることが可能であるが、これに限定されるものではない。
[0025]
 また、培地は、血清含有培地である。血清含有培地に含まれる血清の種類は特に限定されないが、培養する真皮線維芽細胞を採取した対象と同一対象由来の血液から得られたものとすることが可能である。培地中に含まれる血清の量は、特に限定されるものではない。なお、培養は、本実施例では、37℃のCO インキュベーター内で行う構成であるがこれに限定されるものではない。
[0026]
 真皮線維芽細胞を培養して継代する工程で得られた培養物の培養上清液は、次の工程で回収され、本発明で生成される原料となる。本実施例では、真皮線維芽細胞の培養工程における最終回の継代の培養物を回収利用している。培養上清液の回収は、平板培養である場合、ピペットによる吸引によって行うことが可能であり、また、浮遊培養である場合は、培養液の遠心分離後にデカントを行うことにより回収することが可能であるが、これに限定されることはなく、当業者に公知の手法を用いて培養上清液を回収することが可能である。
[0027]
 本発明に係る原料の製造方法は、図1に示すように、第一生成工程100と、第二生成工程200とにおいて、前記工程において得られた培養上清液10を濾過して濃縮する。第一生成工程100は、本発明に係る方法によって得られる化粧品等の原料1である幹細胞またはiPS細胞の培養上清液10を濾過することにより不純物を取り除くための初期工程である。
[0028]
 本実施例の第一生成工程100は、前工程で得られた培養上清液10中から100KDa以上からなる物質を除去する工程である。培養上清液10は、幹細胞を培養した際に分泌された多数のたんぱく質を含む成分を含有するが、それ以外の不純物も併せて含有している。例えば、培養上清液10内には、例えば細菌、ウイルス、バクテリア、アレルゲン、たんぱく質や免疫グロブリンなど、その分子量が100KDa以上からなる不純物が多数含まれており、この状態のものを前記原料1とすると、使用者に有害となる可能性が考えられる。
[0029]
 そこで、第一生成工程100は、このような有害な不純物を除去するための工程である。これにより、培養上清液10中から100KDa以上からなる物質を除去した第一上清液20を取得する。
[0030]
 第二生成工程200は、第一上清液20を更に濾過することにより不純物を排出するための中間工程である。本実施例では、第一上清液20から1KDa未満からなる物質を除去する構成である。第一上清液20は、第一生成工程100によって不純物が濾過除去された液体であるが、該第一上清液20は、未だ化粧品に不要な物質も併せて含有している。例えば、第一上清液20には、金属類、アミノ酸など、その分子量が1KDa未満からなる不要な不純物が多数含まれており、化粧品の原料1としては最適なものとは言えない。
[0031]
 そこで、第二生成工程200は、このような不要な不純物を除去するための工程である。これにより、第一上清液20中から1KDa未満からなる物質を除去した第二上清液30を取得する。
[0032]
 第二生成工程200は、図1に示すように、更に濃縮工程300を含む構成である。濃縮工程300は、第一上清液20を濃縮して化粧品として有効な物質の濃度を高めるための工程である。上記工程を経ることによって生成された第二上清液30は化粧品の原料1として使用することが可能な条件を具備したこととなる。
[0033]
 すなわち、この工程を第二生成工程200に含ませることにより、不要な物質の排出と有効な物質の濃縮を同時に行うことが可能となり、効率が良く純度の高い高品質な化粧品の原料1を製造することが可能となった。なお、本実施例では、更に第二上清液30に無菌処理を施して原料1を生成する構成が加えられている。これにより、より安全な化粧品の原料1を提供することが可能となった。
[0034]
 本実施例の第一生成工程100は、UF膜(限外濾過膜)を用いて培養上清液を濾過する構成である。UF膜は、微細な孔を有する膜であり、培養上清液10がこのUF膜を通過することにより、細菌、ウイルス、バクテリア、アレルゲン、たんぱく質や免疫グロブリン等の100KDa以上からなる有害な不純物が除去され、濾過された第一上清液20を取得することが可能となる。
[0035]
 また、本実施例の第二生成工程200は、第一上清液20をNF膜によって濾過する構成である。NF膜はUF膜より更に微細な孔を有する膜であり、第一上清液20がNF膜を通過すると、孔より小さいアミノ酸等が通過することとなる。これらは化粧品の原料として不要な不純物であるため、NF膜を通過させて排出し、NF膜より大きい化粧品の原料として有用な生理活性物質(成長因子、サイトカイン)等を取得液体に残存させることができる。更に、不要な不純物を液体ごと通過させるため、NF膜を通過した液体を排出除去した残余液体を取得することとなり、これにより第一上清液20が濃縮されることとなる。すなわち、第二生成工程200に濃縮工程300を含ませる構成とすることが可能となり、これにより、不要な不純物を排出除去するとともに濃縮工程300を経て濃縮された第二上清液30(原料1)を取得することが可能となった。
[0036]
 本発明に係る化粧品の原料の製造方法を上記とすることにより、100KDa以上からなる、細菌、ウイルス、バクテリア、アレルゲン、たんぱく質や免疫グロブリン(IgG、IgMなど)を除去することが可能となり、また、1KDa未満の純金属、アミノ酸を排出することが可能となる。これにより、培養上清液10に含まれる生理活性物質(成長因子、サイトカイン)、ケラチン等の有効な物質を濃縮した状態で取得することが可能となり、皮膚細胞の活性化を図る効果を高めた化粧品の原料を製造することが可能となった。
[0037]
 本実施例の第一生成工程100で用いるUF膜は、孔径が0.01μmからなる構成である。また、本実施例の第二生成工程200で用いるNF膜は、孔径が0.001μmからなる構成である。この構成とすることにより、各生成工程における濾過によって不要な物質等を確実に除去することが可能となるとともに、液体の濃縮が実現可能となり、特に、細菌、ウイルス、バクテリア、アレルゲン、たんぱく質、免疫グロブリン、純金属、アミノ酸等を確実に除去・排出して濃縮することが可能となった。
[0038]
 第一生成工程100および第二生成工程200は、本実施例では、遠心分離法またはクロスフロー方式により濾過処理を行う構成としている。この構成とすることにより、濾過処理の迅速性や経済性を確保することが可能となった。なお、濾過処理の方法は、これに限定されることはなく、適宜選択して使用することが可能である。例えば、本実施例では、ザルトリウス社のフィルターであるVivaflow(登録商標)や、日本ポール株式会社のラボ用TFF限外ろ過デバイスを用いて濾過を行うことが可能であるが、これに限定されることはない。
[0039]
 幹細胞の培養上清液10には、培養中の細胞から産生される様々な成長因子やサイトカインが含まれており、それらの相互作用によって細胞の培養が促進される。主に、細胞の増殖に関わる有効因子として、EGFやFGFなどの成長因子が挙げられる。これらは、培養液内にも培養促進剤として添加されており、細胞の増殖に貢献している。また、細胞の培養過程における培養液中にも細胞から産生される成長因子が分泌されている。
[0040]
 これらの成分は、皮膚の外側から線維芽細胞に作用することはなく、培養上清液により活性化された線維芽細胞は、コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸などの肌に有益な要素を産生し、年齢とともに衰えた細胞を活性化させる。
[0041]
 この成長因子を多量に含んだ培養上清液10を化粧品として応用することで肌の再生に繋げ、しわ、たるみ、くすみ、ほうれい線等を改善する効果が期待できる。すなわち、本発明に係る製造方法によって製造された原料を用いて化粧品を製造することにより、肌に有効な化粧品を提供できることとなった。なお、本発明に係る製造方法によって製造された原料は、化粧品以外に、医薬品や医薬部外品に応用する化学材としても利用することが可能である。

図面の簡単な説明

[0042]
[図1] 本発明を構成する各工程を示す概念図
[図2] 各工程において濾過する物質を示す一覧図

符号の説明

[0043]
 1  原料
 10  培養上清液
 20  第一上清液
 30  第二上清液
 100  第一生成工程
 200  第二生成工程
 300  濃縮工程

請求の範囲

[請求項1]
 幹細胞またはiPS細胞の培養上清液を用いた化粧品の原料の製造方法が、
 前記培養上清液中から100KDa以上からなる物質を除去して第一上清液を取得する第一生成工程と、前記第一上清液から1KDa未満からなる物質を除去して第二上清液を取得する第二生成工程と、からなり、
 前記第二生成工程は、更に前記第一上清液を濃縮する濃縮工程を含むことを特徴とする幹細胞またはiPS細胞の培養上清液を用いた化粧品の原料の製造方法。
[請求項2]
 前記第一生成工程は、前記培養上清液をUF膜(限外濾過膜)によって濾過することにより該UF膜を通過した前記第一上清液を取得することを特徴とする請求項1記載の幹細胞またはiPS細胞の培養上清液を用いた化粧品の原料の製造方法。
[請求項3]
 前記第二生成工程は、前記第一上清液をNF膜によって濾過しNF膜を通過した液体を除去した残余液体を取得することにより濃縮を行う濃縮工程を含み、該濃縮工程を経た液体を第二上清液として取得することを特徴とする請求項1記載の幹細胞またはiPS細胞の培養上清液を用いた化粧品の原料の製造方法。
[請求項4]
 前記UF膜は孔径が0.01μmからなるとともに、前記NF膜は孔径が0.001μmからなることを特徴とする請求項1記載の幹細胞またはiPS細胞の培養上清液を用いた化粧品の原料の製造方法。
[請求項5]
 前記第一生成工程および第二生成工程は、遠心分離法またはクロスフロー方式により濾過処理を行うことを特徴とする請求項1記載の幹細胞の培養上清液を用いた化粧品の原料の製造方法。

図面

[ 図 1]

[ 図 2]