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1. WO2020114399 - ANTICORPS CD47, SON PROCÉDÉ DE PRÉPARATION ET SES APPLICATIONS

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说明书

发明名称 0001   0002   0003   0004   0005   0006   0007   0008   0009   0010   0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061   0062   0063   0064   0065   0066   0067   0068   0069   0070   0071   0072   0073   0074   0075   0076   0077   0078   0079   0080   0081   0082   0083   0084   0085   0086   0087   0088   0089   0090   0091   0092   0093   0094   0095   0096   0097   0098   0099   0100   0101   0102   0103   0104   0105   0106   0107   0108   0109   0110   0111   0112   0113   0114   0115   0116   0117   0118   0119   0120   0121   0122   0123   0124   0125   0126   0127   0128   0129   0130   0131   0132   0133   0134   0135   0136   0137   0138   0139   0140   0141   0142   0143   0144   0145   0146   0147   0148   0149   0150   0151   0152   0153   0154   0155   0156   0157   0158   0159   0160   0161   0162   0163   0164   0165   0166   0167   0168   0169   0170   0171   0172   0173   0174   0175   0176   0177   0178   0179   0180   0181   0182   0183   0184   0185   0186   0187   0188   0189   0190   0191   0192   0193   0194   0195   0196   0197   0198   0199   0200   0201   0202   0203   0204   0205   0206   0207   0208   0209   0210   0211   0212   0213   0214   0215   0216   0217   0218   0219   0220   0221   0222   0223   0224   0225   0226   0227   0228   0229   0230   0231   0232   0233   0234   0235   0236   0237   0238   0239   0240   0241   0242   0243   0244   0245   0246   0247   0248   0249   0250   0251   0252   0253   0254   0255   0256   0257   0258   0259   0260   0261   0262   0263   0264   0265   0266   0267   0268   0269   0270   0271   0272   0273   0274   0275   0276   0277   0278   0279   0280   0281   0282   0283   0284   0285   0286   0287   0288   0289   0290   0291   0292   0293   0294   0295   0296   0297   0298   0299   0300   0301   0302   0303   0304   0305   0306   0307   0308   0309   0310   0311   0312   0313   0314   0315   0316   0317   0318   0319   0320   0321   0322   0323   0324   0325   0326   0327   0328   0329   0330   0331   0332   0333   0334   0335   0336   0337   0338   0339   0340   0341   0342   0343   0344   0345   0346   0347   0348   0349   0350   0351   0352   0353   0354   0355   0356   0357   0358   0359   0360   0361   0362   0363   0364   0365   0366   0367   0368   0369   0370   0371   0372   0373   0374   0375   0376   0377   0378   0379   0380   0381   0382   0383   0384   0385   0386   0387   0388   0389   0390   0391   0392   0393   0394   0395   0396   0397   0398   0399   0400   0401   0402   0403   0404   0405   0406   0407   0408   0409   0410   0411   0412   0413   0414   0415   0416   0417   0418   0419   0420   0421   0422   0423   0424   0425   0426   0427   0428   0429   0430   0431   0432   0433   0434   0435   0436   0437   0438   0439   0440   0441   0442   0443   0444   0445   0446   0447   0448   0449   0450   0451   0452   0453   0454   0455   0456   0457   0458   0459   0460   0461   0462   0463   0464   0465   0466   0467   0468   0469   0470   0471   0472   0473   0474   0475   0476   0477   0478   0479   0480   0481   0482   0483   0484   0485   0486   0487   0488   0489   0490   0491   0492   0493   0494   0495   0496   0497   0498   0499   0500   0501   0502   0503   0504   0505   0506   0507   0508   0509   0510   0511   0512   0513   0514   0515   0516  

权利要求书

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17  

附图

1   2   3   4   5   6   7   8A   8B   9   10   11   12   13   14   15A   15B   15C   15D   16   17   18   19   20   21A   21B   22   23   24   25   26   27   28  

说明书

发明名称 : CD47抗体及其制备方法和应用

技术领域

[0001]
本发明属于生物医药领域,具体地涉及一种CD47抗体及其制备方法和应用。

背景技术

[0002]
CD47,也称作整联蛋白相关蛋白(IAP)、卵巢癌抗原OA3、Rh相关抗原和MER6,是一种广泛表达于细胞表面的跨膜糖蛋白,属于免疫球蛋白超家族。CD47分子量在47-55kD之间,包含1个胞外类Ig可变结构域、5个高度疏水延伸的跨膜片段以及1个段选择性拼接的羧基端胞质尾区。
[0003]
SIRPα(信号调节蛋白α)同样是一种跨膜蛋白,主要表达于巨噬细胞、树突状细胞和神经细胞表面,其胞外区含具有3个免疫球蛋白超家族样区域,其中N末端的区域介导与CD47的结合,通过细胞表面受体与配体的接触来调节细胞的迁移和吞噬活性、免疫自稳及神经元网络。
[0004]
CD47通过与SIRPα结合可产生抑制性信号从而降低巨噬细胞的活性,抑制非特异性免疫系统,如红细胞表面的CD47表达下降可以增强红髓区巨噬细胞对红细胞的吞噬作用,这是溶血性贫血的一个重要发病因素。CD47高表达则可以抑制巨噬细胞的吞噬,如在正常造血干细胞迁移过程之前和过程中,均有CD47的短暂上调。在白血病、非霍奇金淋巴瘤、膀胱癌和乳腺癌等恶性疾病的研究中,发现肿瘤细胞存在CD47的升高,且CD47高表达提示临床预后不良。肿瘤细胞可能借助“别吃我”信号,逃避肿瘤免疫。通过使用抗CD47抗体阻断CD47-SIRPα通路,从而介导细胞吞噬作用,能够靶向性杀伤肿瘤细胞。
[0005]
Majeti等在体内外实验中证明阻断性CD47单克隆抗体能促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞,消除小鼠体内移植的急性髓细胞白血病(AML),并靶向清除白血病干细胞(LSC)。Chao等对CD47单克隆抗体对急性淋巴性白血病(ALL)研究中,能有效清除或减少原始移植部位小鼠外周血和骨髓中的ALL细胞的肿瘤,还能消除脾和肝等部位扩散的肿瘤,达到长期生存且抑制肿瘤复发的疗效。抗CD47单克隆抗体的抗肿瘤治疗还与其他机制相关,包括与抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用,直接诱导肿瘤细胞发生凋亡,激活杀伤性T细胞从而杀死肿瘤细胞等因素。
[0006]
现有3种针对CD47的药物已经进入I期临床试验,包括两种单克隆抗体(Hu5F9-G4,CC-90002)和一种融合蛋白(TTI-621),覆盖了多种血液肿瘤和实体瘤。Hu5F9-G4和TTI-621在已公布的I期临床结果中显示了不同的安全性。使用Hu5F9-G4的16例患者全部出现了不同程度的贫血,部分发生了高胆红素血症, 然而并没有报道低血小板的现象发生,与之相反TTI-621的试验组,5例患者中4例出现G3和G4级别的血小板低下症状,但是全部11例患者血红蛋白均稳定,并无报道贫血的发生。此外,抗CD47治疗的临床前模型中存在高估疗效的因素,且疗效在不同肿瘤间存在巨大差异。不可否认CD47已成为近年来的免疫治疗中的热门靶点,在防止肿瘤复发、治疗晚期癌症及其并发症等方面具有诸多优势,因此亟待研究安全且特异性高的CD47治疗性抗体。
[0007]
发明内容
[0008]
为了克服目前缺少安全且特异性高的CD47抗体的不足,本发明提供一种亲和力高、特异性强的CD47抗体及其制备方法和应用。
[0009]
在本发明的第一方面,提供了一种抗体的重链可变区,所述的重链可变区具有选自下组的互补决定区CDR:
[0010]
SEQ ID NO.10n+3所示的VH-CDR1,
[0011]
SEQ ID NO.10n+4所示的VH-CDR2,和
[0012]
SEQ ID NO.10n+5所示的VH-CDR3;
[0013]
其中,各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、或7;
[0014]
其中,上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的,并能够保留CD47结合亲和力的衍生序列。
[0015]
在另一优选例中,所述重链可变区具有SEQ ID NO.10n+1所示的氨基酸序列,其中,n为0、1、2、3、4、5、6、7、或8。
[0016]
在另一优选例中,所述重链可变区具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
[0017]
在另一优选例中,所述重链可变区具有SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列。
[0018]
在另一优选例中,所述重链可变区具有SEQ ID NO.21所示的氨基酸序列。
[0019]
在另一优选例中,所述重链可变区具有SEQ ID NO.31所示的氨基酸序列。
[0020]
在另一优选例中,所述重链可变区具有SEQ ID NO.81所示的氨基酸序列。
[0021]
在本发明的第二方面,提供了一种抗体的重链,所述的重链具有如本发明的第一方面所述的重链可变区。
[0022]
在另一优选例中,所述重链还包括重链恒定区。
[0023]
在另一优选例中,所述重链恒定区为人源或鼠源的。
[0024]
在另一优选例中,所述重链恒定区为人源抗体重链IgG4恒定区。
[0025]
在另一优选例中,所述重链恒定区为人源抗体重链IgG4PE恒定区。
[0026]
在本发明的第三方面,提供了一种抗体的轻链可变区,所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR:
[0027]
SEQ ID NO.10n+8所示的VL-CDR1,
[0028]
SEQ ID NO.10n+9所示的VL-CDR2,和
[0029]
SEQ ID NO.10n+10所示的VL-CDR3;
[0030]
其中,各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、或7;
[0031]
其中,上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的,并能够保留CD47结合亲和力的衍生序列。
[0032]
在另一优选例中,所述轻链可变区具有SEQ ID NO.10n+6所示的氨基酸序列,其中,n为0、1、2、3、4、5、6、或7。
[0033]
在另一优选例中,所述轻链可变区具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
[0034]
在另一优选例中,所述轻链可变区具有SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列。
[0035]
在另一优选例中,所述轻链可变区具有SEQ ID NO.26所示的氨基酸序列。
[0036]
在另一优选例中,所述轻链可变区具有SEQ ID NO.36所示的氨基酸序列。
[0037]
在另一优选例中,所述轻链可变区具有SEQ ID NO.82所示的氨基酸序列。
[0038]
在本发明的第四方面,提供了一种抗体的轻链,所述的轻链具有如本发明的第三方面所述的轻链可变区。
[0039]
在另一优选例中,所述轻链还包括轻链恒定区。
[0040]
在另一优选例中,所述轻链恒定区为人源或鼠源的。
[0041]
在另一优选例中,所述轻链恒定区为人源抗体轻链kappa恒定区。
[0042]
在本发明的第五方面,提供了一种抗体,所述抗体具有:
[0043]
(1)如本发明的第一方面所述的重链可变区;和/或
[0044]
(2)如本发明的第三方面所述的轻链可变区;
[0045]
或者,所述抗体具有:如本发明的第二方面所述的重链;和/或如本发明的第四方面所述的轻链,
[0046]
其中,上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的,并能够保留CD47结合亲和力的衍生序列。
[0047]
在另一优选例中,上述任一CDR的氨基酸序列中包含经过添加、缺失、修饰和/或取代1、2或3个氨基酸的衍生CDR序列,并且使得含有所述衍生CDR序列的VH和VL所构成的衍生抗体能够保留与CD47结合的亲和力。
[0048]
在另一优选例中,所述的衍生抗体与CD47结合的亲和力F1与相应非衍生的抗体与CD47结合的亲和力F0之比(F1/F0)为0.5-2,较佳地为0.7-1.5,和更佳地0.8-1.2。
[0049]
在另一优选例中,所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量为1-5个(如1-3个,较佳地1-2个,更佳地1个)。
[0050]
在另一优选例中,所述的经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的,并能够保留CD47结合亲和力的衍生序列为同源性或序列相同性为至少96%的氨基酸序列。
[0051]
在另一优选例中,所述的抗体还包括重链恒定区和/或轻链恒定区。
[0052]
在另一优选例中,所述的重链恒定区为人源的,和/或所述的轻链恒定区为人 源的。
[0053]
在另一优选例中,所述重链恒定区为人源抗体重链IgG4恒定区,且所述轻链恒定区为人源抗体轻链kappa恒定区。
[0054]
在另一优选例中,所述重链恒定区为人源抗体重链IgG4PE恒定区,且所述轻链恒定区为人源抗体轻链kappa恒定区。
[0055]
在另一优选例中,所述抗体的重链可变区还包括人源的框架区,和/或所述抗体的轻链可变区还包括人源的框架区。
[0056]
在另一优选例中,所述抗体的重链可变区还包括鼠源的框架区,和/或所述抗体的轻链可变区还包括鼠源的框架区。
[0057]
在另一优选例中,所述抗体选自下组:动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、或其组合。
[0058]
在另一优选例中,所述的嵌合抗体在人中的免疫原性Z1与非嵌合的抗体(如鼠源抗体)在人中的免疫原性Z0之比(Z1/Z0)为0-0.5,较佳地0-0.2,更佳地0-0.05(如0.001-0.05)。
[0059]
在另一优选例中,所述的抗体是部分或全人源化、或全人的单克隆抗体。
[0060]
在另一优选例中,所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。
[0061]
在另一优选例中,所述抗体为抗体全长蛋白、或抗原结合片段。
[0062]
在另一优选例中,所述抗体为双特异性抗体、或多特异性抗体。
[0063]
在另一优选例中,所述的抗体为药物偶联物形式。
[0064]
在另一优选例中,所述抗体具有选自下组的一个或多个特性:
[0065]
(a)抑制肿瘤细胞迁移或转移;
[0066]
(b)抑制肿瘤生长。
[0067]
在另一优选例中,所述的抗体具有如本发明的第一方面所述的重链可变区和如本发明的第三方面所述的轻链可变区;
[0068]
其中,所述的重链可变区和所述的轻链可变区包括选自下组的CDR:
[0069]
[0070]
其中,上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的,并能够保留CD47结合亲和力的衍生序列。
[0071]
在另一优选例中,所述的抗体具有如本发明的第一方面所述的重链可变区和如本发明的第三方面所述的轻链可变区;其中,
[0072]
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR:
[0073]
SEQ ID NO.3所示的VH-CDR1,
[0074]
SEQ ID NO.4所示的VH-CDR2,和
[0075]
SEQ ID NO.5所示的VH-CDR3;
[0076]
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR:
[0077]
SEQ ID NO.8所示的VL-CDR1,
[0078]
SEQ ID NO.9所示的VL-CDR2,和
[0079]
SEQ ID NO.10所示的VL-CDR3;
[0080]
[0081]
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR:
[0082]
SEQ ID NO.13所示的VH-CDR1,
[0083]
SEQ ID NO.14所示的VH-CDR2,和
[0084]
SEQ ID NO.15所示的VH-CDR3;
[0085]
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR:
[0086]
SEQ ID NO.18所示的VL-CDR1,
[0087]
SEQ ID NO.19所示的VL-CDR2,和
[0088]
SEQ ID NO.20所示的VL-CDR3;
[0089]
[0090]
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR:
[0091]
SEQ ID NO.23所示的VH-CDR1,
[0092]
SEQ ID NO.24所示的VH-CDR2,和
[0093]
SEQ ID NO.25所示的VH-CDR3;
[0094]
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR:
[0095]
SEQ ID NO.28所示的VL-CDR1,
[0096]
SEQ ID NO.29所示的VL-CDR2,和
[0097]
SEQ ID NO.30所示的VL-CDR3;
[0098]
[0099]
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR:
[0100]
SEQ ID NO.33所示的VH-CDR1,
[0101]
SEQ ID NO.34所示的VH-CDR2,和
[0102]
SEQ ID NO.35所示的VH-CDR3;
[0103]
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR:
[0104]
SEQ ID NO.38所示的VL-CDR1,
[0105]
SEQ ID NO.39所示的VL-CDR2,和
[0106]
SEQ ID NO.40所示的VL-CDR3。
[0107]
在另一优选例中,所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.1、11、21、31、41、51、61、或71所示的氨基酸序列;和/或所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.6、16、26、36、46、56、66、或76所示的氨基酸序列。
[0108]
在另一优选例中,所述抗体为人源化抗体,并且,所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.81所示的氨基酸序列,和/或所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.82所示的氨基酸序列。
[0109]
在另一优选例中,所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列;且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
[0110]
在另一优选例中,所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列;且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列。
[0111]
在另一优选例中,所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.21所示的氨基酸序列;且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.26所示的氨基酸序列。
[0112]
在另一优选例中,所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.31所示的氨基酸序列;且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.36所示的氨基酸序列。
[0113]
在另一优选例中,所述的抗体选自下组:
[0114]
[0115]
在另一优选例中,所述重链可变区的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID NO.1、11、21、31、41、51、61、或71所示的氨基酸序列至少有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性或序列相同性。
[0116]
在另一优选例中,所述轻链可变区的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID NO.6、16、26、36、46、56、66、或76所示的氨基酸序列至少有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性或序列相同性。
[0117]
在本发明的第六方面,提供了一种重组蛋白,所述的重组蛋白包括:
[0118]
(i)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体;以及
[0119]
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
[0120]
在另一优选例中,所述的标签序列包括6His标签。
[0121]
在另一优选例中,所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
[0122]
在另一优选例中,所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。
[0123]
在另一优选例中,所述重组蛋白包括:
[0124]
(i)选自下组的抗体,
[0125]
[0126]
以及
[0127]
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
[0128]
在本发明的第七方面,提供了一种多核苷酸,所述多核苷酸编码选自下组的多肽:
[0129]
□1)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体;以及
[0130]
(2)如本发明的第六方面所述的重组蛋白。
[0131]
在另一优选例中,编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO.2、12、22、32、42、52、62、或72所示;和/或,编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO.7、17、27、37、47、57、67、或77所示。
[0132]
在另一优选例中,编码所述重链可变区序列的多核苷酸和编码所述轻链可变区序列的多核苷酸选自下组:
[0133]
[0134]
[0135]
在本发明的第八方面,提供了一种载体,所述载体含有本发明本发明的第七方面中任一项所述的多核苷酸。
[0136]
在另一优选例中,所述的载体包括:细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
[0137]
在本发明的第九方面,提供了一种遗传工程化的宿主细胞,所述宿主细胞含有本发明的第八方面所述的载体或基因组中整合有本发明的第七方面所述的多核苷酸。
[0138]
在本发明的第十方面,提供了一种抗体偶联物,该抗体偶联物含有:
[0139]
(a)抗体部分,所述抗体部分选自下组:如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、或其组合;和(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分,所述偶联部分选自下组:可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
[0140]
在另一优选例中,所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
[0141]
在本发明的第十一方面,提供了一种免疫细胞,所述免疫细胞表达或在细胞膜外暴露有本发明的第五方面所述的抗体。
[0142]
在另一优选例中,所述的免疫细胞包括NK细胞、T细胞。
[0143]
在另一优选例中,所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。
[0144]
在本发明的第十二方面,提供了一种药物组合物,所述药物组合物含有:
[0145]
(i)活性成分,所述活性成分选自下组:如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合;以及
[0146]
(ii)药学上可接受的载体。
[0147]
在另一优选例中,所述的药物组合物为液态制剂。
[0148]
在另一优选例中,所述的药物组合物为注射剂。
[0149]
在另一优选例中,所述的药物组合物包括0.01~99.99%的如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合和0.01~99.99%的药用载体,所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
[0150]
在本发明的第十三方面,提供了一种活性成分的用途,所述活性成分选自下组:如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合,其中所述活性成分被用于(a)制备诊断试剂或试剂盒;和/或(b)制备预防和/或治疗与CD47表达或功能异常相关的疾病的药物。
[0151]
在另一优选例中,所述的诊断试剂为检测片或检测板。
[0152]
在另一优选例中,所述CD47表达或功能异常相关的疾病为肿瘤。
[0153]
在另一优选例中,所述肿瘤选自下组:乳腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、头颈癌、结直肠癌、软组织肉瘤、恶性血液瘤、转移性肿瘤、神经胶质瘤、胰腺癌、胃癌、肾癌、肺癌、膀胱癌、食管癌。
[0154]
在另一优选例中,所述诊断试剂或试剂盒用于:
[0155]
(1)检测样品中CD47蛋白;和/或
[0156]
(2)检测肿瘤细胞中内源性的CD47蛋白;和/或
[0157]
(3)检测表达CD47蛋白的肿瘤细胞;
[0158]
而所述药物用于预防和/或治疗与CD47表达或功能异常相关的疾病,所述与CD47表达或功能异常相关的疾病为肿瘤。
[0159]
在另一优选例中,所述肿瘤选自下组:乳腺癌、黑色素瘤、头颈癌、淋巴瘤、结直肠癌、软组织肉瘤、恶性血液瘤、转移性肿瘤、神经胶质瘤、胰腺癌、胃癌、肾癌、肺癌、膀胱癌、食管癌。
[0160]
在另一优选例中,所述的抗体为药物偶联物(ADC)形式。
[0161]
在另一优选例中,所述的诊断试剂或试剂盒用于诊断CD47相关疾病。
[0162]
在另一优选例中,所述的诊断试剂或试剂盒用于检测样品中CD47蛋白。
[0163]
在本发明的第十四方面,提供了一种体外检测(包括诊断性或非诊断性)样品中CD47蛋白的方法,所述方法包括步骤:
[0164]
(1)在体外,将所述样品与如本发明的第五方面所述的抗体接触;
[0165]
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物,其中形成复合物就表示样品中存在CD47蛋白。
[0166]
在本发明的第十五方面,提供了一种体外检测样品中CD47蛋白的组合物, 其包括如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合作为活性成分。
[0167]
在本发明的第十六方面,提供了一种检测板,所述的检测板包括:基片(支撑板)和测试条,所述的测试条含有如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合。
[0168]
在本发明的第十七方面,提供了一种试剂盒,所述试剂盒中包括:
[0169]
(1)第一容器,所述第一容器中含有本发明的抗体;和/或
[0170]
(2)第二容器,所述第二容器中含有抗本发明抗体的二抗;
[0171]
或者,
[0172]
所述试剂盒含有如本发明的第十六方面所述的检测板。
[0173]
在本发明的第十八方面,提供了一种重组多肽的制备方法,该方法包括:
[0174]
(a)在适合表达的条件下,培养如本发明的第九方面所述的宿主细胞;
[0175]
(b)从培养物中分离出重组多肽,所述的重组多肽是如本发明的第五方面所述的抗体或如本发明的第六方面所述的重组蛋白。
[0176]
在本发明的第十九方面,提供了一种药物组合,包括:
[0177]
(i)第一活性成分,所述第一活性成分包括如本发明的第五方面所述的抗体1、或如本发明的第六方面所述的重组蛋白、或如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、或如本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或如本发明的第十二方面所述的药物组合物、或其组合;
[0178]
(ii)第二活性成分,所述第二活性成分包括第二抗体、或化疗剂。
[0179]
在另一优选例中,所述第二抗体选自下组:CTLA4抗体、PD-1抗体。
[0180]
在另一优选例中,所述的第二抗体为PD-1抗体。
[0181]
在另一优选例中,所述化疗剂选自下组:多西他赛、卡铂、或其组合。
[0182]
在本发明的第二十方面,提供了本发明的第五方面所述的抗体,或本发明的第六方面所述的重组蛋白、或本发明的第十方面所述的抗体偶联物、或本发明的第十一方面所述的免疫细胞、和/或本发明的第十二方面所述的药物组合物与第二抗体或化疗剂的组合在制备用于治疗CD47表达或功能异常相关的疾病的药物中的用途。
[0183]
在另一优选例中,所述第二抗体选自下组:CTLA4抗体、PD-1抗体。
[0184]
在另一优选例中,所述的第二抗体为PD-1抗体。
[0185]
在本发明的第二十一方面,提供了一种治疗与CD47表达或功能异常相关的疾病的方法,向有需要的对象施用有效量的如本发明的第五方面所述的抗体、或如本发明的第六方面所述的重组蛋白、或如本发明的第十方面所述的抗体偶联 物、或如本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或如本发明的第十二方面所述的药物组合物、或其组合。
[0186]
在另一优选例中,所述与CD47表达或功能异常相关的疾病为肿瘤。
[0187]
在另一优选例中,所述肿瘤选自下组:乳腺癌、黑色素瘤、头颈癌、淋巴瘤、结直肠癌、软组织肉瘤、恶性血液瘤、转移性肿瘤、神经胶质瘤、胰腺癌、胃癌、肾癌、肺癌、膀胱癌、食管癌。
[0188]
在另一优选例中,所述的方法还包括:在施用第一活性成分之前、之中和/或之后,向所述对象施用安全有效量的第二抗体。
[0189]
在另一优选例中,所述的第二抗体选自下组:PD-1抗体、CTLA4抗体。
[0190]
在另一优选例中,所述的第二抗体为PD-1抗体。
[0191]
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。

附图说明

[0192]
图1为SIRPα-hFc蛋白与生物素标记的CD47-hFc的结合活性。
[0193]
图2为流式细胞实验(FACS)检测抗体与表达人源CD47细胞的结合。
[0194]
图3为流式细胞实验(FACS)检测抗体与表达猴源CD47细胞的结合。
[0195]
图4为流式细胞实验(FACS)检测抗体与表达鼠源CD47细胞的结合。
[0196]
图5为CD47抗体阻断CD47蛋白与其受体SIRPα的结合反应。
[0197]
图6为CD47抗体介导人外周血原代巨噬细胞对Jurkat细胞的吞噬作用。
[0198]
图7为CD47抗体介导小鼠骨髓巨噬细胞对CHOK1-mCD47的吞噬作用。
[0199]
图8a和图8b为CD47抗体的血凝反应活性。
[0200]
图9为CD47抗体诱导原代CD3+T细胞的凋亡实验。
[0201]
图10为酶联免疫吸附实验(ELISA)检测鼠源抗体与CD47蛋白的结合。
[0202]
图11为流式细胞实验(FACS)检测鼠源抗体与表达人源CD47细胞的结合。
[0203]
图12为流式细胞实验(FACS)检测鼠源抗体与表达猴源CD47细胞的结合。
[0204]
图13为CD47鼠源抗体阻断CD47蛋白与其受体SIRPα的结合反应。
[0205]
图14为CD47鼠源抗体介导人外周血原代巨噬细胞对Jurkat细胞的吞噬作用。
[0206]
图15a、图15b,图15c和图15d为CD47鼠源抗体的血凝反应活性。
[0207]
图16为CD47鼠源抗体诱导原代CD3+T细胞的凋亡实验。
[0208]
图17为流式细胞实验(FACS)检测嵌合抗体与表达人源CD47细胞的结合。
[0209]
图18为流式细胞实验(FACS)检测嵌合抗体与表达猴源CD47细胞的结合。
[0210]
图19为CD47嵌合抗体阻断CD47蛋白与其受体SIRPα的结合反应。
[0211]
图20为CD47嵌合抗体介导人外周血原代巨噬细胞对Jurkat细胞的吞噬作用。
[0212]
图21a和图21b为CD47嵌合抗体的血凝反应活性。
[0213]
图22为CD47嵌合抗体诱导原代CD3+T细胞的凋亡实验。
[0214]
图23为CD47抗体对B-hSIRPα/hCD47人源化小鼠体重的影响。
[0215]
图24为分组后第1天血常规指标的变化。
[0216]
图25为分组后第3天血常规指标的变化。
[0217]
图26为分组后第6天血常规指标的变化。
[0218]
图27为分组后第13天血常规指标的变化。
[0219]
图28为分组后第6天血生化指标的变化。

具体实施方式

[0220]
本发明人通过广泛而深入的研究,以人源CD47蛋白、稳定表达CD47蛋白的细胞株以及包含编码CD47蛋白cDNA的质粒作为免疫原,采用杂交瘤技术和噬菌体技术,意外地获得一组具有全新氨基酸序列的鼠源或人鼠嵌合的CD47抗体。本发明所述的CD47抗体能够有效阻断CD47蛋白与其受体SIRPα的结合(能够剂量依赖性地抑制CD47与其受体SIRPα的结合),促进肿瘤细胞被巨噬细胞吞噬,体外不引起显著的血凝反应,体内没有明显的血液毒性,不引起红细胞衰竭,在以后的动物模型以及临床试验中降低产生溶血等安全性隐患。报道中的许多CD47抗体会引起显著的活化T细胞死亡的现象,包括参考抗体Hu5F9-G4,而活化的T细胞应激产生的免疫应答也是杀死肿瘤细胞一种主要方式,本发明所述的CD47抗体安全性更高,不引起红细胞血凝,对活化的正常T细胞没有杀伤作用,体内毒性检测不会引起红细胞或血小板的异常减少;对活化的原代T细胞没有明显的促凋亡作用。本发明抗体能够运用于治疗肿瘤、自身免疫疾病等药物的制备中。在此基础上完成了本发明。
[0221]
术语
[0222]
本发明中,“VH-CDR1”与“CDR-H1”可互换使用,均指重链可变区的CDR1;“VH-CDR2”与“CDR-H2”可互换使用,均指重链可变区的CDR2;“VH-CDR3”与“CDR-H3”可互换使用,均指重链可变区的CDR3。“VL-CDR1”与“CDR-L1”可互换使用,均指轻链可变区的CDR1;“VL-CDR2”与“CDR-L2”可互换使用,均指轻链可变区的CDR2;“VL-CDR3”与“CDR-L3”可互换使用,均指轻链可变区的CDR3。
[0223]
抗体
[0224]
如本文所用,术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白,其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连,而不同免疫球蛋白同种型的重链间的 二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH),其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL),另一端有恒定区;轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对,轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
[0225]
如本文所用,术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同,它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而,可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区,它们大致上呈β-折叠构型,由形成连接环的三个CDR相连,在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I,647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合,但是它们表现出不同的效应功能,例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
[0226]
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列,免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中一些还可进一步分成亚类(同种型),如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
[0227]
一般,抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述,称为可变区域(CDR),将该段间隔成4个框架区域(FR),4个FR的氨基酸序列相对比较保守,不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构,通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近,重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
[0228]
本发明不仅包括完整的抗体,还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此,本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
[0229]
在本发明中,抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体,例如嵌合的和人源化的单克隆抗体,包括人的和非人的部分,可以通过标准的DNA重组技术获得,它们都是有用的抗体。嵌合抗体是一个分子,其中不同的部分来自不同的动物种,例如具有来自鼠的单克隆抗体的可变区,和来自人免疫球蛋白的恒定区的嵌合抗体(见例如美国专利4,816,567和美国专利4,816,397,在此通过引用方式整体引入本文)。人 源化的抗体是指来源于非人物种的抗体分子,具有一个或多个来源于非人物种的互补决定区(CDRs)和来源于人免疫球蛋白分子的框架区域(见美国专利5,585,089,在此通过引用方式整体引入本文)。这些嵌合和人源化的单克隆抗体可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。
[0230]
在本发明中,抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。
[0231]
在本发明中,本发明的抗体还包括其保守性变异体,指与本发明抗体的氨基酸序列相比,有至多10个,较佳地至多8个,更佳地至多5个,最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表16进行氨基酸替换而产生。
[0232]
表16
[0233]
[表0001]
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val;Leu;Ile Val
Arg(R) Lys;Gln;Asn Lys
Asn(N) Gln;His;Lys;Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro;Ala Ala
His(H) Asn;Gln;Lys;Arg Arg
Ile(I) Leu;Val;Met;Ala;Phe Leu
Leu(L) Ile;Val;Met;Ala;Phe Ile
Lys(K) Arg;Gln;Asn Arg
Met(M) Leu;Phe;Ile Leu
Phe(F) Leu;Val;Ile;Ala;Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr;Phe Tyr
Tyr(Y) Trp;Phe;Thr;Ser Phe
Val(V) Ile;Leu;Met;Phe;Ala Leu

[0234]
抗CD47的抗体
[0235]
本发明中,所述抗体为抗CD47的抗体。本发明提供一种针对CD47的高特异性和高亲和力的抗体,其包括重链和轻链,所述重链含有重链可变区(VH)氨 基酸序列,所述轻链含有轻链可变区(VL)氨基酸序列。
[0236]
优选地,
[0237]
所述的重链可变区(VH)具有选自下组的互补决定区CDR:
[0238]
SEQ ID NO.10n+3所示的VH-CDR1,
[0239]
SEQ ID NO.10n+4所示的VH-CDR2,和
[0240]
SEQ ID NO.10n+5所示的VH-CDR3;
[0241]
其中,各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、或7;
[0242]
所述的轻链可变区(VL)具有选自下组的互补决定区CDR:
[0243]
SEQ ID NO.10n+8所示的VL-CDR1,
[0244]
SEQ ID NO.10n+9所示的VL-CDR2,和
[0245]
SEQ ID NO.10n+10所示的VL-CDR3;
[0246]
其中,各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、或7;
[0247]
其中,上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的,并能够保留CD47结合亲和力的衍生序列。
[0248]
优选地,重链可变区(VH)包括以下三个互补决定区CDR:
[0249]
SEQ ID NO.10n+3所示的VH-CDR1,
[0250]
SEQ ID NO.10n+4所示的VH-CDR2,和
[0251]
SEQ ID NO.10n+5所示的VH-CDR3;
[0252]
轻链可变区(VL)包括以下三个互补决定区CDR:
[0253]
SEQ ID NO.10n+8所示的VL-CDR1,
[0254]
SEQ ID NO.10n+9所示的VL-CDR2,和
[0255]
SEQ ID NO.10n+10所示的VL-CDR3;
[0256]
各n独立地为0、1、2或3;较佳地n为0或1;
[0257]
其中,上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的,并能够保留CD47结合亲和力的衍生序列。
[0258]
在另一优选例中,所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性或序列相同性为至少80%,较佳地至少85%,更佳地至少为90%,最佳地至少95%的氨基酸序列。
[0259]
本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于:计算机分子生物学(Computational Molecular Biology),Lesk,A.M.编,牛津大学出版社,纽约,1988;生物计算:信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and Genome Projects),Smith,D.W.编,学术出版社,纽约,1993;序列数据的计算机分析(Computer Analysis of Sequence Data),第一部分,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编,Humana Press,新泽西,1994;分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology), von Heinje,G.,学术出版社,1987和序列分析引物(Sequence Analysis Primer),Gribskov,M.与Devereux,J.编M Stockton Press,纽约,1991和Carillo,H.与Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于:GCG程序包(Devereux,J.等,1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S,F.等,1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册,Altschul,S.等,NCBI NLM NIH Bethesda,Md.20894;Altschul,S.等,1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。
[0260]
较佳地,本文所述抗体为抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体(single chain antibody fragment,scFv)、单域抗体(single domain antibody,sdAb)和单区抗体(Signle-domain antibody)中的一种或多种,以及上述抗体所制得的单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制,包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等,主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。
[0261]
所述的抗体全长蛋白为本领域常规的抗体全长蛋白,其包括重链可变区、轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区。所述的蛋白质的重链可变区和轻链可变区与人源重链恒定区和人源轻链恒定区构成全人源抗体全长蛋白。较佳地,所述的抗体全长蛋白为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
[0262]
本发明的抗体可以是双链或单链抗体,并且可以是选自动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体,更优选为人源化抗体、人-动物嵌合抗体,更优选为全人源化抗体。
[0263]
本发明所述抗体衍生物可以是单链抗体、和/或抗体片段,如:Fab、Fab‘、(Fab‘)2或该领域内其他已知的抗体衍生物等,以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM抗体或其他亚型的抗体中的任意一种或几种。
[0264]
所述的单链抗体为本领域常规的单链抗体,其包括重链可变区、轻链可变区和15~20个氨基酸的短肽。
[0265]
其中,所述动物优选为哺乳动物,如鼠。
[0266]
本发明抗体可以是靶向CD47(例如人CD47)的嵌合抗体、人源化抗体、CDR嫁接和/或修饰的抗体。
[0267]
本发明上述内容中,所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量,优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40%,更优选为不超过35%,更优选为1-33%,更优选为5-30%,更优选为10-25%,更优选为15-20%。
[0268]
本发明上述内容中,更优选地,所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸 数量,可以是1-7个,更优选为1-5个,更优选为1-3个,更优选为1-2个。
[0269]
在另一优选例中,所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.1、11、21、31、41、51、61、或71。所示的氨基酸序列。
[0270]
在另一优选例中,所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.6、16、26、36、46、56、66、或76所示的氨基酸序列。
[0271]
在另一优选例中,所述靶向CD47的抗体的重链可变区(VH)氨基酸序列,和/或,轻链可变区氨基酸序列如下表17所示:
[0272]
表17
[0273]
[0274]
在另一优选例中,所述靶向CD47的抗体为4D10B11、29A03NA、20H4G5、54G8G6、132D1E5、25E3B5、51E2F11、95E2D10、158B3G6、2G9C7、92D9G2、95B9E7、89A4H1、95F7E5、126G2B1、128D8D6、144B4E6。
[0275]
在另一优选例中,所述靶向CD47的抗体为4D10B11。
[0276]
在另一优选例中,所述靶向CD47的抗体为29A03NA。
[0277]
重组蛋白
[0278]
本发明还提供一种重组蛋白,其包括CD47抗体的重链CDR1(VH-CDR1)、重链CDR2(VH-CDR2)和重链CDR3(VH-CDR3)中的一种或多种,和/或,CD47抗体的轻链CDR1(VL-CDR1)、轻链CDR2(VL-CDR2)和轻链CDR3(VL-CDR3)中的一种或多种,
[0279]
所述重链CDR1-3的序列如下:
[0280]
SEQ ID NO.10n+3所示的VH-CDR1,
[0281]
SEQ ID NO.10n+4所示的VH-CDR2,
[0282]
SEQ ID NO.10n+5所示的VH-CDR3;
[0283]
所述轻链CDR1-3的序列如下:
[0284]
SEQ ID NO.10n+8所示的VL-CDR1,
[0285]
SEQ ID NO.10n+9所示的VL-CDR2,和
[0286]
SEQ ID NO.10n+10所示的VL-CDR3;
[0287]
各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、或7;较佳地n为0或1;
[0288]
其中,上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的,并能够保留CD47结合亲和力的衍生序列。
[0289]
在另一优选例中,所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性或序列相同性为至少80%,较佳地至少85%,更佳地至少为90%,最佳地至少95%的氨基酸序列。
[0290]
在另一优选例中,本发明所述的重组蛋白包括CD47抗体的重链可变区和/或CD47抗体的轻链可变区,所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.1、11、21、31、41、51、61、或71所示的氨基酸序列;所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.6、16、26、36、46、56、66、或76所示的氨基酸序列。
[0291]
在另一优选例中,本发明所述的重组蛋白包括CD47抗体的重链可变区和CD47抗体的轻链可变区,所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.1、11、21、31、41、51、61、或71所示的氨基酸序列,且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.6、16、26、36、46、56、66、或76所示的氨基酸序列。
[0292]
在另一优选例中,所述重组蛋白及其包括的重链CDR1-3、轻链CDR1-3的氨基酸序列的序列编号如表18所示:
[0293]
表18重链CDR1-3、轻链CDR1-3的氨基酸序列的序列编号
[0294]
[0295]
其中,上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的,并能够保留CD47结合亲和力的衍生序列。
[0296]
较佳地,所述的重组蛋白还包括抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区,所 述的抗体重链恒定区为本领域常规,较佳地为大鼠源抗体重链恒定区或人源抗体重链恒定区,更佳地为人源抗体重链恒定区。所述的抗体轻链恒定区为本领域常规,较佳地为大鼠源轻链抗体恒定区或人源抗体轻链恒定区,更佳地为人源抗体轻链恒定区。
[0297]
所述的重组蛋白为本领域常规的蛋白质,较佳地,其为抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体(single chain antibody fragment,scFv)、单域抗体(single domain antibody,sdAb)和单区抗体(Signle-domain antibody)中的一种或多种,以及上述抗体所制得的单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制,包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等,主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。
[0298]
所述的抗体全长蛋白为本领域常规的抗体全长蛋白,其包括重链可变区、轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区。所述的蛋白质的重链可变区和轻链可变区与人源重链恒定区和人源轻链恒定区构成全人源抗体全长蛋白。较佳地,所述的抗体全长蛋白为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
[0299]
所述的单链抗体为本领域常规的单链抗体,其包括重链可变区、轻链可变区和15~20个氨基酸的短肽。
[0300]
所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为本领域常规的抗原抗体结合域蛋白质片段,其包括轻链可变区、轻链恒定区和重链恒定区的Fd段。较佳地,所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为Fab和F(ab’)。
[0301]
所述的单域抗体为本领域常规的单域抗体,其包括重链可变区和重链恒定区。
[0302]
所述的单区抗体为本领域常规的单区抗体,其仅包括重链可变区。
[0303]
其中,所述重组蛋白的制备方法为本领域常规的制备方法。所述制备方法较佳地为:从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得或者通过人工合成蛋白质序列获得。所述的从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得优选如下方法:将编码所述蛋白质并且带有点突变的核酸分子克隆到重组载体中,将所得重组载体转化到转化体中,得到重组表达转化体,通过培养所得重组表达转化体,即可分离纯化获得所述重组蛋白。
[0304]
核酸
[0305]
本发明还提供一种核酸,其编码上述的抗体(例如抗CD47的抗体)或重组蛋白或抗CD47的抗体的重链可变区或轻链可变区。
[0306]
较佳地,编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2、12、22、32、42、52、62、或72所示;和/或,编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7、17、27、37、47、57、67、或77所示。
[0307]
更佳地,编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2、12、22、32、42、52、62、或72所示;且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7、17、27、37、47、57、67、或77所示。
[0308]
所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法,较佳地,包括以下的步骤:通过基因克隆技术获得编码上述蛋白质的核酸分子,或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述蛋白质的核酸分子。
[0309]
本领域技术人员知晓,编码上述蛋白质的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
[0310]
载体
[0311]
本发明还提供一种包含所述核酸的重组表达载体。
[0312]
其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得,即:将本发明所述的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体,只要其能够容载前述核酸分子即可。所述载体较佳地包括:各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等。
[0313]
本发明还提供一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。
[0314]
其中,所述重组表达转化体的制备方法为本领域常规的制备方法,较佳地为:将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞,只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制,且所携带所述的核酸可被有效表达即可。较佳地,所述宿主细胞为E.coli TG1或E.coli BL21细胞(表达单链抗体或Fab抗体),或者HEK293或CHO细胞(表达全长IgG抗体)。将前述重组表达质粒转化至宿主细胞中,即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法,较佳地为化学转化法,热激法或电转法。
[0315]
抗体的制备
[0316]
本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术,比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外,还可将轻链和重链的编码序列融合在一起,形成单链抗体。
[0317]
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
[0318]
此外,还可用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。
[0319]
目前,已经可以完全通过化学合成来得到编码所述的本发明的抗体(或其片 段,或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外,还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
[0320]
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
[0321]
宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。优选的动物细胞包括(但并不限于):CHO-S、HEK-293细胞。
[0322]
通常,在适合本发明抗体表达的条件下,培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤,如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。
[0323]
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如,单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
[0324]
本发明的抗体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
[0325]
抗体-药物偶联物(ADC)
[0326]
本发明还提供了基于本发明抗体的抗体偶联药物(antibody-drug conjugate,ADC)。
[0327]
典型地,所述抗体偶联药物包括所述抗体、以及效应分子,所述抗体与所述效应分子偶联,并优选为化学偶联。其中,所述效应分子优选为具有治疗活性的药物。此外,所述效应分子可以是毒蛋白、化疗药物、小分子药物或放射性核素中的一种或多种。
[0328]
本发明抗体与所述效应分子之间可以是通过偶联剂进行偶联。所述偶联剂的例子可以是非选择性偶联剂、利用羧基的偶联剂、肽链、利用二硫键的偶联剂中的任意一种或几种。所述非选择性偶联剂是指使效应分子和抗体形成共价键连接的化合物,如戊二醛等。所述利用羧基的偶联剂可以是顺乌头酸酐类偶联剂(如顺乌头酸酐)、酰基腙类偶联剂(偶联位点为酰基腙)中的任意一种或几种。
[0329]
抗体上某些残基(如Cys或Lys等)用于与多种功能基团相连,其中包括成像试剂(例如发色基团和荧光基团),诊断试剂(例如MRI对比剂和放射性同位素),稳定剂(例如乙二醇聚合物)和治疗剂。抗体可以被偶联到功能剂以形成抗体-功能剂的偶联物。功能剂(例如药物,检测试剂,稳定剂)被偶联(共价连接)至抗体上。功能剂可以直接地、或者是通过接头间接地连接于抗体。
[0330]
抗体可以偶联药物从而形成抗体药物偶联物(ADCs)。典型地,ADC包含位于药物和抗体之间的接头。接头可以是可降解的或者是不可降解的接头。可降解的接头典型地在细胞内环境下容易降解,例如在目标位点处接头发生降解,从而使药物从抗体上释放出来。合适的可降解的接头包括,例如酶降解的接头,其中包括可以被细胞内蛋白酶(例如溶酶体蛋白酶或者内体蛋白酶)降解的含有肽基的接头,或者糖接头例如,可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的接头。肽基接头可以包括,例如二肽,例如缬氨酸-瓜氨酸,苯丙氨酸-赖氨酸或者缬氨酸-丙氨酸。其它合适的可降解的接头包括,例如,pH敏感接头(例如pH小于5.5时水解的接头,例如腙接头)和在还原条件下会降解的接头(例如二硫键接头)。不可降解的接头典型地在抗体被蛋白酶水解的条件下释放药物。
[0331]
连接到抗体之前,接头具有能够和某些氨基酸残基反应的活性反应基团,连接通过活性反应基团实现。巯基特异性的活性反应基团是优选的,并包括:例如马来酰亚胺类化合物,卤代酰胺(例如碘、溴或氯代的);卤代酯(例如碘、溴或氯代的);卤代甲基酮(例如碘、溴或氯代),苄基卤代物(例如碘、溴或氯代的);乙烯基砜,吡啶基二硫化物;汞衍生物例如3,6-二-(汞甲基)二氧六环,而对离子是醋酸根、氯离子或者硝酸根;和聚亚甲基二甲基硫醚硫代磺酸盐。接头可以包括,例如,通过硫代丁二酰亚胺连接到抗体上的马来酰亚胺。
[0332]
药物可以是任何细胞毒性,抑制细胞生长或者免疫抑制的药物。在实施方式中,接头连接抗体和药物,而药物具有可以和接头成键的功能性基团。例如,药物可以具有可以和连接物成键的氨基,羧基,巯基,羟基,或者酮基。在药物直接连接到接头的情况下,药物在连接到抗体之前,具有反应的活性基团。
[0333]
有用的药物类别包括,例如,抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。特别有用的细胞毒性药物类的例子包括,例如,DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素类化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepine containing drugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs),吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines) 和噁唑烷并苯并二氮卓类(oxazolidinobenzodiazepines))和长春花生物碱(vinca alkaloids)。
[0334]
在本发明中,药物-接头可以用于在一个简单步骤中形成ADC。在其它实施方式中,双功能连接物化合物可以用于在两步或多步方法中形成ADC。例如,半胱氨酸残基在第一步骤中与接头的反应活性部分反应,并且在随后的步骤中,接头上的功能性基团与药物反应,从而形成ADC。
[0335]
通常,选择接头上功能性基团,以利于特异性地与药物部分上的合适的反应活性基团进行反应。作为非限制性的例子,基于叠氮化合物的部分可以用于特异性地与药物部分上的反应性炔基基团反应。药物通过叠氮和炔基之间的1,3-偶极环加成,从而共价结合于接头。其它的有用的功能性基团包括,例如酮类和醛类(适合与酰肼类和烷氧基胺反应),膦(适合与叠氮反应);异氰酸酯和异硫氰酸酯(适合与胺类和醇类反应);和活化的酯类,例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(适合与胺类和醇类反应)。这些和其它的连接策略,例如在《生物偶联技术》,第二版(Elsevier)中所描述的,是本领域技术人员所熟知的。本领域技术人员能够理解,对于药物部分和接头的选择性反应,当选择了一个互补对的反应活性功能基团时,该互补对的每一个成员既可以用于接头,也可以用于药物。
[0336]
本发明还提供了制备ADC的方法,可进一步地包括:将抗体与药物-接头化合物,在足以形成抗体偶联物(ADC)的条件下进行结合。
[0337]
在某些实施方式中,本发明方法包括:在足以形成抗体-接头偶联物的条件下,将抗体与双功能接头化合物进行结合。在这些实施方式中,本发明方法还进一步地包括:在足以将药物部分通过接头共价连接到抗体的条件下,将抗体接头偶联物与药物部分进行结合。
[0338]
在一些实施方式中,抗体药物偶联物ADC如下分子式所示:
[0339]
[0340]
其中:
[0341]
Ab是抗体,
[0342]
LU是接头;
[0343]
D是药物;
[0344]
而且下标p是选自1到8的值。
[0345]
应用
[0346]
本发明还提供了本发明抗体、抗体偶联物ADC、重组蛋白、和/或免疫细胞的用途,例如用于制备诊断制剂或制备药物。
[0347]
较佳地,所述的药物是用于预防和/或治疗与CD47表达或功能异常相关的疾病的药物。
[0348]
本发明中,所述与CD47表达或功能异常相关的疾病是本领域常规的与CD47表达或功能异常相关的疾病。较佳地,所述与CD47表达或功能异常相关的疾病为肿瘤/癌症。
[0349]
本发明中,所述癌症为本领域常规的癌症,较佳地为乳腺癌、黑色素瘤、头颈癌、淋巴瘤、结直肠癌、软组织肉瘤、恶性血液瘤、转移性肿瘤、神经胶质瘤、胰腺癌、胃癌、肾癌、肺癌、膀胱癌、食管癌。
[0350]
本发明抗体、ADC、重组蛋白、和/或免疫细胞的用途,包括(但并不限于):
[0351]
(i)诊断、预防和/或治疗肿瘤发生、生长和/或转移,尤其是CD47高表达的肿瘤。所述肿瘤包括(但并不限于):乳腺癌、黑色素瘤、头颈癌、淋巴瘤、结直肠癌、软组织肉瘤、恶性血液瘤、转移性肿瘤、神经胶质瘤、胰腺癌、胃癌、肾癌、肺癌、膀胱癌、食管癌。
[0352]
检测用途和试剂盒
[0353]
本发明的抗体或其ADC可用于检测应用,例如用于检测样本,从而提供诊断信息。
[0354]
本发明中,所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如肿瘤的切除样本、通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。
[0355]
本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。
[0356]
本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒,在本发明的一个优选例中,所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中,本发明的抗体可以固定于检测板。
[0357]
药物组合物
[0358]
本发明还提供了一种组合物。在优选例中,所述的组合物是药物组合物,它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相应的免疫细胞,以及药学上可接受的载体。通常,可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中,其中pH通常约为5-8,较佳地pH约为6-8,尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。
[0359]
配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药,其中包括(但并不限于):瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。典型地,本发明所述的药物组合物的给药途径较佳地为注射给药或口服给药。所述注射给药较佳地包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型,较佳地为固体、半固体或液体的形式,可以为水溶液、非水溶液或混悬液,更佳地为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。
[0360]
本发明所述抗体也可以是由核苷酸序列在细胞内表达用于的细胞治疗,比 如,所述抗体用于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)等。
[0361]
本发明所述的药物组合物是用于预防和/或治疗与CD47表达或功能异常相关的疾病的药物组合物。
[0362]
本发明的药物组合物可直接用于结合CD47蛋白分子,因而可用于预防和治疗肿瘤等疾病。
[0363]
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt%,较佳地0.01-90wt%,更佳地0.1-80wt%)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量,例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外,本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
[0364]
本发明中,较佳地,本发明所述的药物组合物还包括一种或多种药用载体。所述的药用载体为本领域常规药用载体,所述的药用载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料,较佳的包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地,所述的药物组合物包括0.01~99.99%的上述蛋白质和0.01~99.99%的药用载体,所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
[0365]
本发明中,较佳地,所述的药物组合物的施用量为有效量,所述有效量为能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。所述有效量可以以个体基础来测定,并将部分基于待治疗症状和所寻求结果的考虑。本领域技术人员可以通过使用个体基础等上述因素和使用不超过常规的实验来确定有效量。
[0366]
使用药物组合物时,是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物,其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重,而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重,较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0367]
本发明提供上述药物组合物在制备预防和/或治疗与CD47表达或功能异常相关的疾病的药物中的应用。较佳地,所述与CD47表达或功能异常相关的疾病为肿瘤/癌症。
[0368]
检测样品中CD47蛋白的方法、组合物
[0369]
本发明还提供一种检测样品中CD47蛋白(例如检测过表达CD47细胞)的方法,包括如下的步骤:上述的抗体与待检样品在体外接触,检测上述的抗体与所述待检样品是否结合形成抗原-抗体复合物即可。
[0370]
所述的过表达的含义为本领域常规,指CD47蛋白在待检样品中的RNA或蛋白质的过表达(由于转录增加、转录后加工、翻译、翻译后加工以及蛋白质降解改变),以及由于蛋白质运送模式改变(核定位增加)而导致的局部过表达和功能活性提高(如在底物的酶水解作用增加的情况下)。
[0371]
本发明中,上述是否结合形成抗原-抗体复合物的检测方式是本领域常规的检测方式,较佳地为流式细胞实验(FACS)检测。
[0372]
本发明提供一种检测样品中CD47蛋白的组合物,其包括上述的抗体、重组蛋白、抗体偶联物、免疫细胞、或其组合作为活性成分。较佳地,其还包括上述的抗体的功能片段组成的化合物作为活性成分。
[0373]
在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发明各较佳实例。
[0374]
本发明的主要优点在于:
[0375]
(1)本发明所述CD47抗体是鼠源或人鼠嵌合的,具有高亲和力,与人源CD47蛋白具有高度亲和力,与食蟹猴源CD47蛋白有相似的结合能力;
[0376]
(2)本发明所述CD47抗体能够抑制CD47与其受体SIRPα的结合;能够剂量依赖性地抑制CD47与其受体SIRPα的结合;
[0377]
(3)本发明所述CD47抗体能够促使肿瘤细胞被巨噬细胞吞噬;
[0378]
(4)本发明部分抗体不引起显著的红细胞血凝反应,部分抗体对活化的原代T细胞没有杀伤作用;
[0379]
(5)本发明抗体在体内安全性评价中有良好的耐受性,不会引起显著的红细胞衰竭;
[0380]
(6)所述CD47抗体在制备肿瘤防治药物的应用中有重要价值,包括白血病、淋巴瘤、乳腺癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、胰腺癌、宫颈癌、肠癌、胃癌、肾癌、肺癌、膀胱癌和、或食管癌。
[0381]
下面结合具体实施例,进一步详陈本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法,通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译,北京:科学出版社,2002年)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件(例如商品说明书)。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
[0382]
实施例中所述的室温为本领域常规的室温,一般为10~30℃。
[0383]
若无特别说明,实施例中所述的PBS为PBS磷酸缓冲液,pH7.2。
[0384]
实施例1 CD47抗体的制备
[0385]
(一)、免疫原A的制备
[0386]
将含有编码人源CD47蛋白胞外区氨基酸序列19-141(Gln19-Glu141)(其中,人源CD47蛋白在UniProtKB数据库的蛋白序列号为Q08722)克隆到pCPC载体(购自Invitrogen,V044-50)并按照已建立的标准分子生物学方法(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(Plainview,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)制备重组质粒。将制备好的重组质粒对HEK293细胞(购自Invitrogen)进行瞬时转染[聚醚酰亚胺(PEI)购自Polysciences]并扩大培养,4天后收集细胞培养液,离心去除细胞成分,得含CD47蛋白的培养上清液。向培养上清液加入终浓度10mM的咪唑后,用0.22μm滤膜过滤后上样到镍柱,同时用紫外(UV)检测仪监测紫外吸收值(A280nm)的变化。上样后分别用Buffer A(1×PBS中加入20mM咪唑)、Buffer B[Buffer A中加入0.1%(v/v)triton×100和0.1%(v/v)triton×114]平衡,然后用Buffer C[1×PBS中加入250mM咪唑]洗脱,将收集的样品用分子筛superdex200(购自GE Healthcare)进一步纯化,得到高纯度的人源CD47蛋白(hCD47)胞外区蛋白,用PBS在4℃冰箱透析过夜。透析后的蛋白经0.22μm无菌过滤后分装-80℃保存,即为免疫原A。免疫原A在使用前需要进行一系列质控检测,如检测其蛋白浓度、纯度、分子量、生物活性等,结果如图1和表1所示。
[0387]
表1 SIRPα-hFc蛋白与生物素标记的CD47-hFc的结合活性
[0388]
[0389]
表1说明CD47与SIRPα在蛋白水平的结合随CD47的浓度变化而变化,其中对照蛋白为非CD47融合蛋白,表中的数据为OD 450nm值。
[0390]
其中,免疫原A生物活性采用ELISA检测,具体为:
[0391]
将带hFc标签的SIRPα蛋白(SIRPα-hFc)用PBS稀释至1μg/ml,以100μl/孔加入ELISA微孔板,4℃孵育过夜;所述SIRPα-hFc的制备方法与免疫原A的制备方法相同,其中SIRPα胞外区蛋白(Glu31-Arg370)的氨基酸序列信息参见Uniprot数据库,编号P78324;用ELISA封闭液(含1%BSA,pH7.4的PBS磷酸缓冲液,所述百分比为质量百分比)37℃封闭两小时后,再加入梯度稀释的生物素标记的CD47-hFc(即免疫原A,生物素标记的CD47-hFc的制备方法如下:将CD47-hFc与生物素化试剂反应即可。所述生物素化试剂购自Sigma,商品号B3295;与生物素化试剂反应的操作步骤参见该生物素化试剂的说明书),37℃温育1小时;加入链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(购自Sigma商品号S2438),室温孵育30分钟后;加入100微升/孔TMB显色液,室温孵育15分钟后,加入50微升1N盐酸 终止显色反应,用ELISA读板机读取OD 450nm读数。
[0392]
(二)、免疫原B的制备
[0393]
编码人源CD47全长氨基酸序列的核苷酸序列被克隆到pIRES载体(购自Clontech)并制备质粒。对HEK293细胞系和NIH3T3细胞系(均购自Invitrogen)进行质粒转染(PEI,购自Polysciences)后,在含0.5μg/ml的含10%(w/w)胎牛血清的DMEM培养基中选择性培养2周,用有限稀释法在96孔培养板中进行亚克隆,并置于37℃,5%(v/v)CO 2培养,大约2周后选择部分单克隆孔扩增到6孔板中。对扩增后的克隆用已知的CD47抗体(Hu5F9-G4)经流式细胞分析法进行筛选。选择长势较好、荧光强度较高、单克隆的细胞系继续扩大培养并液氮冻存,即获得免疫原B。具体选择结果如表2所示,表2中阳性细胞(%)指阳性细胞占总细胞数目的百分比。
[0394]
表2 CD47蛋白转染的HEK293细胞FACS筛选检测结果
[0395]
[0396]
表2说明,已经制得一系列CD47阳性表达的HEK293细胞系。
[0397]
(三)、免疫原C的制备
[0398]
CD47全长氨基酸序列的cDNA被克隆到pCDNA3.1载体(购自Invitrogen), 并包被到1.0um金胶体子弹上,用Helios基因枪(Helios Gene Gun System,Bio-rad,货号165-2431)免疫。其中,包被到1.0μm金胶体子弹和免疫的方法参见Helios基因枪说明书。免疫后即获得了免疫原C。
[0399]
(四)、杂交瘤细胞的制备和抗体筛选
[0400]
(1)免疫原A 免疫采用6-8周龄Balb/c和SJL小鼠(购自上海斯莱克),小鼠接收后在SPF条件下饲养。初次免疫免疫原A用福氏完全佐剂乳化后腹腔注射0.25mL,50μg蛋白每只小鼠。加强免疫免疫原A用福氏不完全佐剂乳化后腹腔注射0.25mL,50μg免疫原A每只小鼠。初次免疫与第一次加强免疫之间隔2周,以后每次加强免疫间隔3周。每次加强免疫7天后采血,用ELISA检测血清中抗体效价和特异性(表3)。表3中空白对照为1%(w/w)BSA,其中批次指第二次加强免疫后第七天的小鼠血清,表中的数据为OD 450nm值。两次加强免疫后,ELISA效价通常在1∶10000。
[0401]
表3 ELISA检测CD47蛋白免疫后SJL小鼠血清抗体效价
[0402]
[0403]
(2)免疫原B 免疫采用6-8周龄Balb/c和SJL小鼠(购自上海斯莱克),小鼠接收后在SPF条件下饲养。含有编码人源CD47全长氨基酸序列的核苷酸序列的pIRES质粒[参见实施例1步骤(二)]转染HEK293细胞系,得含人源CD47的HEK293和NIH3T3稳定细胞系(转染使用X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent,购自Roche公司,货号Cat#06 366 236 001,并按说明书操作)在T-75细胞培养瓶中扩大培养至90%汇合度,吸尽培养基,用DMEM基础培养基(购自Invitrogen)洗涤2次,然后用无酶细胞解离液(购自Invitrogen)37℃处理直至细胞从培养皿壁上可脱落,收集细胞。用DMEM基础培养基洗涤2次,进行细胞计数后将细胞用磷酸盐缓冲液(pH7.2)稀释至2×10 7细胞每毫升。每只小鼠每次免疫时腹腔注射0.5毫升细胞悬液。第一次与第二次免疫之间间隔2周,以后每次 免疫间隔3周。除第一次免疫以外,每次免疫1周后采血,用FACS检测血清中抗体效价和特异性。在第二次加强免疫后,FACS检测血清抗体效价达到1:1000以上。
[0404]
(3)免疫原C 免疫采用6-8周龄Balb/c和SJL小鼠(购自上海斯莱克),小鼠接收后在SPF条件下饲养。所有小鼠经腹部用Helios基因枪免疫4次,每次4枪,每枪1.0微克cDNA。初次免疫与第一次加强免疫之间隔2周,以后每次加强免疫间隔3周。每次加强免疫1周后采血,用ELISA或FACS检测血清中抗体效价。在第二次加强免疫后,FACS检测血清抗体效价达到1:1000以上,ELISA效价在1:10000以上。
[0405]
(1)~(3)步骤完成前,将所选择的每只小鼠最后一次免疫腹腔注射100微克纯化的CD47-hFc(针对免疫原A和免疫原C进行免疫反应的小鼠)或含人CD47的HEK293或NIH3T3稳定细胞系(针对免疫原B进行免疫反应的小鼠),5天后处死小鼠,收集脾细胞。加入NH 4OH至终浓度1%(w/w),裂解脾细胞中参杂的红细胞,获得脾细胞悬液。用DMEM基础培养基1000转每分钟离心清洗细胞3次,然后按活细胞数目5:1比率与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(购自ATCC)混合,采用PEG(聚乙二醇)融合方法进行细胞融合。融合后的细胞稀释到含20%胎牛血清、1×HAT的DMEM培养基中,所述百分比为质量百分比。然后按1×10 5/200微升每孔加入到96孔细胞培养板中,放入5%CO 2、37℃培养箱中,所述百分比为体积百分比。14天后用ELISA和Acumen(微孔板细胞检测法)筛选细胞融合板上清,将ELISA中OD450nm>1.0和Acumen中MFI值>100的阳性克隆扩增到24孔板,在含10%(w/w)HT胎牛血清,DMEM(invitrogen)在37℃,5%(v/v)CO 2条件下扩大培养。培养3天后取24孔板中扩大培养的培养液进行离心,收集上清液,对上清液进行抗体亚型分析,用ELISA、FACS确定对CD47蛋白和CD47阳性细胞的结合活性(结合活性的检测方法请分别参见实施例3A和实施例3B),配体受体结合实验确定抗体样品对CD47受体的封闭活性(结合活性的检测方法请分别参见实施例4)。
[0406]
根据24孔板筛选结果,挑选ELISA实验中OD450nm>1.0、FACS实验中MFI值>50和配体受体结合实验中杂交瘤细胞培养上清对CD47受体的封闭抑制率达到60%的杂交瘤细胞为符合条件的阳性克隆,选择符合条件的杂交瘤细胞用有限稀释法在96孔板进行亚克隆,在含10%(w/w)FBS的DMEM培养基中(购自invitrogen)37℃,5%(v/v)CO 2条件下培养。亚克隆后10天用ELISA和Acumen进行初步筛选,挑选单个阳性单克隆扩增到24孔板继续培养。3天后用FACS确定抗原结合阳性并用CD47受体配体结合实验评估生物活性(评估标准为ELISA实验中OD450nm>1.0、FACS实验中MFI值>50和配体受体结合实验中杂交瘤细胞培养上清对CD47受体的封闭抑制率达到60%)。
[0407]
根据24孔板样品检测结果,挑选出最优的克隆,并于含10%(w/w)FBS的DMEM培养基中(购自invitrogen)在37℃,5%(v/v)CO 2条件下将该最优的克隆进行扩大培养,液氮冻存即得本发明杂交瘤细胞,并可用于后续的抗体生产和纯化。
[0408]
实施例2鼠源抗体的生产和纯化
[0409]
杂交瘤细胞产生的抗体浓度较低,大约仅1-10微克/毫升,浓度变化较大。且培养基中细胞培养所产生的多种蛋白和培养基所含胎牛血清成分对很多生物活性分析方法都有不同程度的干扰,因此需要进行小规模(1-5毫克)抗体生产纯化。
[0410]
将实施例1所得的杂交瘤细胞接种到T-75细胞培养瓶并用生产培养基(Hybridoma serum free medium,购自Invitrogen公司)驯化传代3代。待其生长状态良好,接种细胞培养转瓶。每个2升的培养转瓶中加入500毫升生产培养基,接种细胞密度为1.0×10 5/毫升。盖紧瓶盖,将转瓶置于37℃培养箱中的转瓶机上,转速3转/分钟。连续旋转培养14天后,收集细胞培养液,过滤去除细胞,并用0.45微米的滤膜过滤至培养上清液澄清。澄清的培养上清液可马上进行纯化或-30℃冻存。
[0411]
澄清的杂交瘤细胞的培养上清液(300mL)中的单克隆抗体用2mL蛋白G柱(购自GE Healthcare)纯化。蛋白G柱先用平衡缓冲液(PBS磷酸缓冲液,pH7.2)平衡,然后将澄清的培养上清液上样到蛋白G柱,控制流速在3mL/分钟。上样完毕后用平衡缓冲液清洗蛋白G柱,平衡缓冲液的体积为4倍蛋白G柱柱床体积。用洗脱液(0.1M甘氨盐酸缓冲液,pH2.5)洗脱结合在蛋白G柱上的CD47抗体,用紫外检测器监测洗脱情况(A280紫外吸收峰)。收集洗脱的抗体,加入10%1.0M Tris-HCl缓冲液中和pH,所述百分比为体积百分比,然后立即用PBS磷酸缓冲液透析过夜,第二天换液1次并继续透析3小时。收集透析后的CD47抗体,用0.22微米的滤器进行无菌过滤,无菌保存,即得纯化的CD47抗体。
[0412]
将纯化的CD47抗体进行蛋白浓度(A280/1.4)、纯度、内毒(Lonza试剂盒)等检测分析,结果如表4所示。
[0413]
表4纯化的CD47抗体检测分析
[0414]
[0415]
[0416]
结果发现,抗体最终产品浓度、纯度和内毒素浓度均表现正常。
[0417]
实施例3噬菌体展示库构建和抗体筛选
[0418]
获取脾脏细胞:分别将NIH3T3-hCD47、293-hCD47细胞和pCp-hCD47作为抗原免疫过的小鼠,分别用NIH3T3-hCD47、293-hCD47细胞和号hCD47-ECD-hFc蛋白做冲刺免疫,3天后分离小鼠脾脏细胞制备免疫库。将分离的脾细胞重悬到DMEM培养基中,2000rpm,4℃离心10min,弃去上清。用RNAiso plus裂解细胞沉淀,比例为1ml RNAiso plus(购自Takara,货号:9108)加入一只小鼠的脾脏,室温孵育5min后,保存于-80℃。
[0419]
抽提RNA:将冻存的小鼠脾脏细胞于室温解冻并涡旋5min。每1ml的RNAiso plus样品中加入0.2ml的1-溴-3-氯丙烷(1-Bromo-3-chloropropane,购自Sigma,货号:B9673-200ml),剧烈震荡15seconds,然后于室温孵育5min。将样品4℃,12000g离心10min,将水相转移到一只新管,加入0.7ml异丙醇沉淀RNA,室温孵育10min后,12000g离心10min,4℃,弃去上清。将RNA沉淀用1ml 75%乙醇(无RNAase)洗涤一次,12000g离心5min,4℃,弃去上清。干燥RNA沉淀15min后,用40ul含DEPC的水溶解RNA(购自Invitrogen,46-2224),轻柔混匀并于室温放置5min。将所有样品的RNA各取一半混合,并对所获得RNA库进行浓度测定,结果为2175.6ng/ul.
[0420]
cDNA文库的制备:参照逆转录试剂盒5*PrimeScriptTMRT Master Mix(购自Takara,货号RR036A)准备逆转录反应体系如下表,进行热循环。设定条件为37℃20min,85℃20s,4℃持续。将所获得逆转录产物混合,并分为两份。一份保存于-80℃,一份储存于4℃进行后续实验。
[0421]
[表0002]
试剂 体积(ul) Master Mix(*3)

[0422]
[表0003]
5*Mix 20 60
RNA 6.9 21
H 2O 补充至100

[0423]
VH和VL库的扩增和纯化:扩增用引物设计参见Journal of Immunological Methods 201(1997),35-5。分别混合重链,轻链的正向,反向扩增引物,并准备PCR反应如下:
[0424]
[0425]
设定PCR程序如下:
[0426]
[表0004]
94℃ 1min 30s
94℃ 1min
63℃ 30s
58℃ 50s
72℃ 1min
94℃ 1min
63℃ 1min
72℃ 1min
72℃ 5min
4℃ 持续

[0427]
PCR结束,对扩增产物进行凝胶纯化,将获得的VH和VL库通过SOE(splicing overlap extension)PCR的方法组装scFvs,将所得PCR产物进行纯化(QIAquick Gel)/PCR纯化试剂盒)。
[0428]
制备噬菌粒:将pCAN载体与scFv用Sfi酶(购自NEB,货号R0123S)进行酶切,并胶回收酶切产物,对所获得pCAN载体和scFv用T4连接酶(购自NEB)进行酶连反应,并用纯化试剂盒(购自Qiagen,货号:28014)纯化所得连接产物,用于制备免疫噬菌体库。
[0429]
免疫噬菌体库的制备:将500ng上述纯化所得DNA与200ul TG1感受态大肠杆菌混合并进行电转。将电转产物于1ml YT培养中震荡培养1h,37℃。取10ul细胞悬液以10倍梯度稀释后(10-4,10-5,10-6),涂平板检测库容。离心收集将余菌液,将细菌沉淀重悬后涂平板,培养过夜。第二天刮下培养板中细菌克隆, 离心收集沉淀,并重悬于4ml 2*YT medium(含40%甘油),将所得免疫库冻存于-80℃。
[0430]
淘选:
[0431]
将上述获得免疫库用His标签的hCD47蛋白进行正筛选。将CD47-His蛋白稀释成20ug/ml,分别取1ml涂布在4个免疫管上,用2%MPBS室温封闭2小时。另外4个直接涂布PBS作为负筛选,将1ml的噬菌体库和3ml的2%MPBS混合,每管加入上述混合物1ml,室温2小时。清空CD47-his包被的管子,加入负选过的噬菌体库,用石蜡封口,室温缓慢震荡2小时。在4ml的2YT培养液中接种40ul的TG1并37℃培养过夜,直至OD600读数超过0.5。用胰蛋白酶处理过后,将1ml的管中液体转入4ml处于对数生长期的TG1,37℃孵育30min,得到TG1的培养液。将TG1的培养液梯度稀释,涂布平板,37℃培养过夜。计算所得的CD47-His结合的和对照管的克隆数,随机挑选30个克隆测序。然后进行总共三轮淘选。第一轮淘选后共获得40000个克隆。
[0432]
从上述淘选策略的平板中挑选单克隆于96孔板培养,每孔中含有200μL加抗生素的2YT培养基,37℃、1000rpm振荡培养过夜。取10μL过夜培养的上清加到4mL含抗生素培养基中,37℃、250rpm振荡培养1.5-2.5小时。添加终浓度为1mM的IPTG,30℃振荡培养16小时,4000rpm离心10分钟,上清即得到单链抗体。
[0433]
首先用ELISA方法确定筛选得到的scFv抗体与hCD7-ECD-hFc的结合活性,并能阻断CD47与受体SIRPa-hFc的结合。部分克隆用FACS方法确定筛选得到的scFv抗体与CHOK1/hCD47和细胞的结合活性。特异的只与CHOK1/hCD47细胞结合的克隆挑选出来。将上述所有特异性的克隆通过FACS方法确定其与CHOK1/cynoCD47和CHOK1/mCD47细胞的结合活性,对仍旧呈现阳性的克隆进行测序,得到具有不同重链CDR3序列的克隆。
[0434]
噬菌体来源的先导抗体的生产和纯化:扩增重链与轻链可变区:根据阳性克隆的测序结果,通过PCR方法分别扩增轻链和重链的可变区。配置50μL反应体系,包括0.5μL含有转染阳性克隆大肠杆菌TG1中提取的质粒、每种引物10pmol、25μL Q5高保真DNA聚合酶以及加水补足至50μL。设置PCR程序,预变性95℃5分钟,变性95℃30秒,退火55℃30秒,延伸68℃30秒,25个循环后再额外68℃延伸1分钟,得到PCR产物。其中PCR所用的DNA聚合酶,购自NEB,货号E0555L。取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,将检测阳性样品使用回收试剂盒纯化,其中回收试剂盒为QIAquick Gel extraction kit,购自Qiagen,货号28706。
[0435]
人IgG4型抗体的制备:进行连接反应:插入片段3μL,酶切过的表达载体2μL,重组酶Exnase 2μL,缓冲液4μL,反应体系20μL,于37℃反应半小时得 到连接产物,即构建好的重组载体。其中,重组酶购自Vazyme,货号C112-01/02;缓冲液为该重组酶配套购买使用的缓冲液;将重链可变区定向克隆到包含信号肽和人源抗体重链IgG4(S228P)恒定区的表达载体(其中表达载体购买自Invitrogen,重组步骤为常规步骤),将轻链可变区定向克隆到包含信号肽和人源抗体轻链kappa恒定区的表达载体(其中表达载体购买自Invitrogen,重组步骤为常规步骤)中。将10μL连接产物加入100μL的感受态细胞(Ecos 101competent cells,购自Yeastern,货号FYE607)中,冰浴30分钟。再于42℃水浴热激90秒,放回冰上2分钟后加入800μL无抗生素的2YT培养基,于37℃摇床上以200rpm培养45分钟,取出200μL涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上,于37℃孵箱过夜培养。次日,使用表达载体上引物pTT-EF1a-F和pSV40配置30μL PCR体系,进行菌落PCR。菌落PCR的体系为:引物各1μL,10μL的PCR预混液(购自Novoprotein),补足至20μL。用移液器枪头蘸取菌落于PCR反应体系中吹吸,并吸出0.5μL点于另一块含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养皿上以保存菌株。PCR反应结束后,取出5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测,将阳性样品进行测序和分析[参见Kabat,“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)]。
[0436]
经过菌落PCR验证,将序列正确的重组抗体重、轻链的表达载体瞬时转染FreeStyleTM 293-F细胞(购自Invitrogen)以生产抗体。其中,克隆29A03VL和29A03VL构建突变体载体,将CDRL1区的NG位点突变为QG或NA,分别在克隆号后加字母WT、QG或NA表示。转染时,293-F细胞的密度应为1-1.5×10 6个/mL,100mL细胞需要100μg上述已构建好的重组载体(其中,重组重链载体和轻链载体的质量比为2:3)和200μg的转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)。将重组载体和PEI分别加入到5mL培养基中,室温静置5分钟,0.22μm滤膜过滤后,将重组载体和PEI的混合物于室温静置15分钟。然后将上述混合物缓慢地加入到细胞中,在37℃、8%(v/v)CO 2培养箱中以120rpm的转速培养。7天后,3500g离心细胞培养液30分钟,收集上清液,0.22μm滤器过滤。用1mL蛋白A柱(购自GE Healthcare)纯化200mL澄清上清液中的单克隆抗体。蛋白A柱先用平衡缓冲液(PBS磷酸缓冲液,pH7.2)平衡,然后将上清液上样到蛋白A柱,控制流速在3mL/分钟。上样完毕后用平衡缓冲液清洗蛋白A柱,平衡缓冲液的体积为蛋白A柱柱床体积的20倍。用洗脱液(0.1M甘氨盐酸缓冲液,pH3.0)洗脱结合在蛋白A柱上的单克隆抗体,用紫外检测器监测洗脱情况(A280紫外吸收峰)。收集洗脱的抗体,加入10%(v/v)1.0M Tris-HCl缓冲液中和pH。然后立即用PBS磷酸缓冲液透析过夜。收集透析后的单克隆抗体,用0.22μm的滤器进行无菌过滤,无菌保存,即得纯化的CD47抗体作为先导抗体。将先导抗体进行蛋白浓度(A280/1.4)、纯度、内毒(Lonza试剂盒)等检测分析。结果如下表6所示。
[0437]
表6 CD47抗体检测分析
[0438]
[0439]
表6结果表明,抗体浓度、纯度、内毒素均分析均表现正常。
[0440]
先导抗体的活性鉴定
[0441]
A.流式细胞实验(FACS)检测抗体与CD47表达细胞的结合(方法同实施例4),结果如图2、图3和图4所示。结果表明:检测抗体可以与细胞表面的人、猴或鼠源CD47结合。其中对照IgG为人IgG。
[0442]
B.CD47抗体阻断CD47蛋白与其受体SIRPα的结合反应(方法同实施例5),结果如图5所示,结果表明:检测抗体能阻断CD47受体与其受体SIRPα的结合。其中对照IgG为人IgG。
[0443]
C.CD47抗体介导人外周血原代巨噬细胞对Jurkat细胞的吞噬作用(方法同实施例6),结果如图6所示,结果表明:检测抗体能够促进巨噬细胞吞噬Jurkat细胞,并且与Hu5F9-G4有相似的吞噬效果。
[0444]
D.CD47抗体介导小鼠骨髓巨噬细胞对CHOK1-mCD47的吞噬作用
[0445]
将C57BL/6小鼠(购自斯莱克)的后肢取下,剔除筋肉,收集骨髓细胞,均匀铺在6孔板上,加入小鼠巨噬细胞集落刺激因子(murine M-CSF,购自peprotech),隔天换液,刺激7-10天。然后用胰蛋白酶消化后种于96孔细胞培养板,依次加入不同浓度的CD47抗体和用CFSE(购自Sigma)标记的CHOK1-mCD47细胞,37℃孵育4小时。接着弃上清,洗去未被吞噬的CHOK1-mCD47细胞,用胰酶将巨噬细胞消化下来,加入APC偶联的抗鼠CD11b 抗体(购自eBioscience)标记巨噬细胞。4℃孵育1小时,用PBS洗两遍后,用流式细胞仪进行细胞的散射和荧光检测,四象限散点图中,认为CD11b和CFSE双阳性的表示吞噬了CHOK1-mCD47的巨噬细胞,CD11b阳性CFSE阴性的表示未发生吞噬的巨噬细胞,用前者的细胞数比上两者之和即为发生吞噬的细胞比例,用百分比表示为吞噬率,如图7所示。吞噬率表示为发生吞噬CHOK1-mCD47细胞的巨噬细胞占总的巨噬细胞的比例。图7结果表明,由实施例2得到的CD47抗体能够与鼠源CD47有交叉反应,并促进巨噬细胞吞噬CHOK1-mCD47细胞。
[0446]
E.CD47抗体的血凝反应活性(方法同实施例7),结果如图8a和图8b所示,结果表明:检测抗体与Hu5F9-G4相似,会引起红细胞血凝反应。
[0447]
F.CD47抗体诱导原代CD3+T细胞的凋亡实验(方法同实施例8),结果如图9所示,结果表明:低浓度的检测抗体不会引起激活的T细胞凋亡,Hu5F9-G4引起较明显的T细胞凋亡现象。
[0448]
实施例4先导抗体的检定
[0449]
A.酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体与CD47蛋白的结合
[0450]
对实施例2所得的纯化的CD47抗体进行与人CD47-hFc蛋白结合反应检测。
[0451]
按照实施例1免疫原A的制作方法制作带His标签的CD47重组蛋白CD47-His,用PBS稀释到终浓度1.0μg/mL,然后以100μl每孔加到96孔ELISA板。用塑料膜封好4℃孵育过夜,第二天用洗板液[PBS+0.01%(v/v)Tween20]洗板2次,加入封闭液[PBS+0.01%(v/v)Tween20+1%(w/w)BSA]室温封闭2小时。倒掉封闭液,加入实施例2所得的纯化的CD47抗体100μl每孔。37℃孵育2小时后,用洗板液[PBS+0.01%(v/v)Tween20]洗板3次。加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗(购自Sigma),37℃孵育2小时后,用洗板液[PBS+0.01%(v/v)Tween20]洗板3次。加入TMB底物100μl每孔,室温孵育30分钟后,加入终止液(1.0N HCl)100μl每孔。用ELISA读板机(SpectraMax 384plus,购自Molecular Device)读取A450nm数值,结果如图10和表7所示。
[0452]
表7 ELISA检测CD47抗体与人CD47-His蛋白的结合反应
[0453]
[0454]
[0455]
表7表明,纯化后的抗体与CD47重组蛋白在ELISA水平结合。其中IgG对照为鼠IgG,表中的数据为OD 450nm值。
[0456]
B.流式细胞实验(FACS)检测抗体与CD47表达细胞的结合
[0457]
将实施例1步骤(二)中所述含有编码人源CD47全长氨基酸序列的核苷酸序列的pIRES质粒转染CHOK1细胞株得含人CD47的CHOK1稳定细胞株(此处称为CHOK1-hCD47稳定细胞株),将带有猴源CD47全长基因的pIRES质粒(其制备方法与实施例1步骤(一)“免疫原A的制备”中带有人源IgG Fc片段(hFc)的pCpC载体的制备方法相同,其中猴源CD47蛋白胞外区(Leu25-Gln167)氨基酸序列的数据库登录号为B0LAJ3)转染CHOK1细胞株得含猴CD47的CHOK1稳定细胞株(此处称为CHOK1-cCD47稳定细胞株),将CHOK1-hCD47稳定细胞株和CHOK1-cCD47稳定细胞株在T-75细胞培养瓶中扩大培养至90%汇合度,吸尽培养基,用HBSS缓冲液(Hanks Balanced Salt Solution)(购自Invitrogen)洗涤2次,然后用无酶细胞解离液(Versene solution:购自Life technology公司)处理和收集细胞。用HBSS缓冲液洗涤细胞2次,进行细胞计数后将细胞用HBSS缓冲液稀释至2×10 6细胞每毫升,加入1%山羊血清封闭液,所述百分比为质量百分比,冰上孵育30分钟,然后用HBSS缓冲液离心洗涤2次。将收集的细胞用FACS缓冲液(HBSS+1%BSA,所述百分比为质量百分比)悬浮至2×10 6细胞/mL,按每孔100微升加入到96孔FACS反应板中,加入实施例2所得的纯化的CD47抗体待测样品每孔100微升,冰上孵育2小时。用FACS缓冲液离心洗涤2次,加入每孔100微升荧光(Alexa 488)标记的二抗(购自Invitrogen),冰上孵育1小时。用FACS缓冲液离心洗涤3次,加入每孔100微升固定液[4%(v/v)多聚甲醛]悬浮细胞,10分钟后用FACS缓冲液离心洗涤2次。用100微升FACS缓冲液悬浮细胞,用FACS(FACS Calibur,购自BD公司)检测和分析结果。结果如图11、图12和表8~ 9所示。
[0458]
表8 FACS检测CD47抗体与CHOK1-hCD47的结合反应
[0459]
[0460]
表9 FACS检测CD47抗体与CHOK1-cCD47的结合反应
[0461]
[0462]
[0463]
表8~9说明,待测抗体可结合细胞表面的CD47蛋白。其中IgG对照为鼠IgG,表中的数据为MFI所测细胞群的平均荧光强度值。
[0464]
实施例5 CD47抗体阻断CD47蛋白与其受体SIRPα的结合反应
[0465]
CD47蛋白的受体配体结合试验检测CD47抗体阻断CD47蛋白与其受体SIRPα的结合。
[0466]
将实施例1中纯化的SIRPα胞外区蛋白(SIRPα-hFc)用PBS稀释到终浓度1.0μg/mL,然后以100μl每孔加到96孔ELISA板。用塑料膜封好4℃孵育过夜,第二天用洗板液[PBS+0.01%(v/v)Tween20]洗板2次,加入封闭液[PBS+0.01%(v/v)Tween20+1%(w/w)BSA]室温封闭2小时。倒掉封闭液,先加入实施例2所得的纯化的CD47抗体待测样品50μl每孔,后加入生物素标记的CD47胞外区蛋白(CD47-ECD)每孔50微升,混匀后37℃孵育2小时后,用洗板液[PBS+0.01%(v/v)Tween20]洗板3次。加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的亲和素(购自Sigma)稀释液每孔100微升,37℃孵育2小时后,用洗板液[PBS+0.01%(v/v)Tween20]洗板3次。加入TMB底物100μl每孔,室温孵育30分钟后,加入终止液(1.0N HCl)100μl每孔。用ELISA读板机(SpectraMax 384plus,Molecular Device)读取A450nm数值,结果如表10和图13所示。
[0467]
表10 CD47抗体对CD47蛋白与其受体SIRPα的结合的抑制
[0468]
[0469]
[0470]
表10和图13说明,CD47抗体能阻断CD47受体与其受体SIRPα的结合。其中IgG对照为鼠IgG,表中的数据为OD450值。
[0471]
实施例6 CD47抗体介导人外周血原代巨噬细胞对Jurkat细胞的吞噬作用
[0472]
将分离纯化的人外周血单核细胞(PBMC,购自AllCells)均匀铺在6孔板上,加入巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF,购自peprotech),隔天换液,刺激7-10天。然后用胰蛋白酶消化后种于96孔细胞培养板,依次加入不同浓度的CD47抗体和用CFSE(购自Sigma)标记的Jurkat细胞,37℃孵育4小时。接着弃上清,洗去未被吞噬的Jurkat细胞,用胰酶将巨噬细胞消化下来,加入APC偶联的CD14抗体(购自eBioscience)标记巨噬细胞。4℃孵育1小时,用PBS洗两遍后,用流式细胞仪进行细胞的散射和荧光检测,四象限散点图中,认为CD14和CFSE双阳性的表示吞噬了Jurkat的巨噬细胞,CD14阳性CFSE阴性的表示未发生吞噬的巨噬细胞,用前者的细胞数比上两者之和即为发生吞噬的细胞比例,用百分比表示为吞噬率,如图7所示。其中Hu5F9-G4为参考抗体(US9382320B2),吞噬率表示为发生吞噬Jurkat细胞的巨噬细胞占总的巨噬细胞的比例。图14中,由实施例2得到的CD47抗体能够促进巨噬细胞吞噬Jurkat细胞,并且与Hu5F9-G4有相似吞噬效果。
[0473]
实施例7 CD47抗体的血凝反应活性
[0474]
为了评估CD47抗体引发血凝反应的能力,将人血红细胞RBC在PBS中稀释至5%,加入相同体积的CD47抗体,滴定到圆底96孔板,37℃孵育2-4个小时,结果如图8a和图8b。如图8a和图8b所示,存在未固定的RBC表明有血凝反应的迹象,与未发生血凝反应的RBC的清晰红点相比,发生血凝反应的RBC的外观 模糊。显示了血凝反应实验的定量结果,通过对存在抗体时RBC小球的面积进行定量并相对于不存在抗体时测得的数据进行标准化,确定了血凝反应指数,结果如图15a、图15b,图15c和图15d所示。结果表明,其中54G6G8和89A4H1会引起血凝,其余抗体不会引起血凝反应。
[0475]
实施例8 CD47抗体诱导原代CD3+T细胞的凋亡实验
[0476]
为了评估CD47抗体对正常的T细胞诱导凋亡的能力,将外周血细胞中的CD3+T分离出来,铺到预不同浓度CD47抗体4℃包被过夜的96孔板上,37℃孵育20-24个小时,收集细胞,洗两遍之后用Annexin-V-FITC(购自invitrogen)室温下标记10-15分钟,然后用流式细胞仪检测细胞凋亡,结果如图16所示。其中Hu5F9-G4为参考抗体(US9382320B2),细胞凋亡率为Annexin-V显示阳性的细胞比例。图16结果表明:在加入CD47抗体同时加入1μg/mL的CD3抗体激活T细胞,发现Hu5F9-G4会显著引起活化T细胞的凋亡,而实施例2得到的CD47抗体对没有活化的T细胞没有明显的杀伤作用。
[0477]
实施例9轻重链可变区氨基酸序列测定及鼠-人嵌合抗体的制备
[0478]
总RNA分离:将实施例1亚克隆培养所得的上清液检验过抗原结合后(即经过实施例3~6的检定和活性测定后),通过离心搜集5×10 7个杂交瘤细胞,加入1mL Trizol混匀并转移到1.5mL离心管中,室温静置5分钟。加0.2mL氯仿,振荡15秒,静置2分钟后于4℃,12000g离心5分钟,取上清转移到新的1.5mL离心管中。加入0.5mL异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置10分钟后于4℃,12000g离心15分钟,弃上清。加入1mL 75%乙醇(所述百分比为体积百分比),轻轻洗涤沉淀,4℃,12000g离心5分钟后弃上清,将沉淀物晾干,加入DEPC处理过的H 2O溶解(55℃水浴促溶10分钟),即得总RNA。
[0479]
逆转录与PCR:取1μg总RNA,配置20μl体系,加入逆转录酶后于42℃反应60分钟,于7℃反应10分钟终止反应。配置50μl PCR体系,包括1μl cDNA、每种引物25pmol、1μl DNA聚合酶以及相配的缓冲体系、250μmol dNTPs。设置PCR程序,预变性95℃3分钟,变性95℃30秒,退火55℃30秒,延伸72℃35秒,35个循环后再额外于72℃延伸5分钟,得PCR产物。其中逆转录所用的试剂盒为PrimeScript RT Master Mix,购自Takara,货号RR036;PCR所用的试剂盒为Q5超保真酶,购自NEB,货号M0492。
[0480]
克隆与测序:取5μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,将检测阳性样品使用柱回收试剂盒纯化,其中回收试剂盒为 Gel&PCR Clean-up,购自MACHEREY-NAGEL,货号740609。进行连接反应:样品50ng,T载体50ng,连接酶0.5μl,缓冲液1μl,反应体系10μl,于16℃反应半小时得连接产物,其中连接的试剂盒为T4DNA连接酶,购自NEB,货号M0402;取5μl连接产物加入100μl的感受态细胞(Ecos 101competent cells,购自Yeastern,货号FYE607)中, 冰浴5分钟。而后于42℃水浴热激1分钟,放回冰上1分钟后加入650μl无抗生素SOC培养基,于37℃摇床上以200RPM的速度复苏30分钟,取出200μl涂布于含抗生素的LB固体培养基上于37℃孵箱过夜培养。次日,使用T载体上引物M13F和M13R配置30μl PCR体系,进行菌落PCR,用移液器枪头蘸取菌落于PCR反应体系中吹吸,并吸出0.5μl点于另一块含100nM氨苄青霉素的LB固体培养皿上以保存菌株。PCR反应结束后,取出5μl进行琼脂糖凝胶电泳检测,将阳性样品进行测序。其中,测序的步骤参见Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)。测序结果见本发明的序列信息。
[0481]
根据上步的测序结果得到了抗体重链可变区和轻链可变区序列。小鼠-人嵌合CD47抗体的生产和制备参考实施例3中步骤,即:1、重组载体制备:将重链可变区定向克隆到包含信号肽和人源抗体重链IgG4PE(S228P/L235E)恒定区的表达载体(其中表达载体购买自Invitrogen,重组步骤为常规步骤),将轻链可变区定向克隆到包含信号肽和人源抗体轻链kappa恒定区的表达载体(其中表达载体购买自Invitrogen,重组步骤为常规步骤);2、细胞转染;3、抗体纯化。并对所获CD47嵌合抗体进行特性鉴定(方法参见实施例4~7)。制得的各嵌合抗体命名在对应的先导抗体克隆号前加上首字符“c”,例如嵌合抗体c4D10B11对应的先导抗体克隆号为4D10B11。
[0482]
将纯化的CD47抗体进行蛋白浓度(A280/1.4)、纯度、内毒(Lonza试剂盒)等检测分析,结果如表11所示。
[0483]
表11嵌合CD47抗体检测分析
[0484]
[0485]
[0486]
嵌合抗体的活性鉴定
[0487]
A.流式细胞实验(FACS)检测抗体与CD47表达细胞的结合(方法同实施例4),结果如图17、图18所示。结果表明:嵌合抗体与细胞表面表达的人源、猴源CD47能够结合。
[0488]
B.CD47抗体亲和常数的测定
[0489]
使用Octet red96仪器(购自Fortiebio)进行亲和常数的测定。具体操作和方法根据仪器说明书和厂家提供的详细方法。具体为:用链霉素亲和素传感器(SA sensor,购自Fortiebio)进行亲和力测定。将CD47嵌合抗体用含0.1%(w/w)BSA,0.02%(v/v)Tween,pH 7.4的PBS溶液稀释至10μg/ml,然后与AHC传感器偶联反应;结合免疫原A的传感器与稀释成100nM的CD47-His蛋白在30℃下温育三分钟,再和含0.1%(w/v)BSA,0.02%(v/v)Tween,pH 7.4的PBS溶液30℃温育5分钟;通过Octet仪器检测干涉波长的变化来检测抗体与免疫原A结合与解离,然后用 Software软件拟合得到解离常数与结合常数,亲和力常数为解离常数与结合常数的比值。结果如表12所示:
[0490]
表12 CD47抗体对抗原CD47-His的亲和常数
[0491]
[0492]
[0493]
C.CD47抗体阻断CD47蛋白与其受体SIRPα的结合反应(方法同实施例5),结果如图19所示。结果表明:嵌合抗体能够阻断CD47蛋白与SIRPα的结合。
[0494]
D.CD47抗体介导人外周血原代巨噬细胞对Jurkat细胞的吞噬作用(方法同实施例6),结果如图20所示。结果表明:嵌合抗体能够促进巨噬细胞吞噬Jurkat细胞。
[0495]
E.CD47抗体的血凝反应活性(方法同实施例7),结果如图21a和图21b所示。结果表明:c158B3G6会引起红细胞凝集,其余抗体不会引起明显的红细胞凝集反应。
[0496]
F.CD47抗体诱导原代CD3+T细胞的凋亡实验(方法同实施例8),结果如图22所示。结果表明:高浓度c158B3G6会引起激活的T细胞凋亡,其余抗体不会引起明显的T细胞凋亡。
[0497]
实施例10基于B-hSIRPα/hCD47人源化小鼠的抗体毒性实验
[0498]
隔离检疫期后,从B-hSIRPα/hCD47人源化小鼠(百奥赛图提供)中挑选个体体重适中的24只小鼠入组,将动物按体重随机分配到8个实验组中,每组3只。所有组给药途径均为腹腔注射,在分组后第0天、第2天、第4天分别各给药1次,共给药3次。分组后第0~7天,每天测量体重1次;分组后第9~15天,每隔一天测量体重1次,记录小鼠体重数据。分组后第1天、第3天、第6天、第13天从每只小鼠眼眶内眦静脉丛采血100-150μL,进行血常规检测。分组后第6天从每只小鼠眼眶内眦静脉丛采血150-200μL,收集血清进行血生化检测。实验结束时,动物安乐死,称取动物体重。结果见表13和图23。
[0499]
表13 CD47抗体B-hSIRPα/hCD47人源化小鼠体重的影响
[0500]
[0501]
[0502]
注:体重显示为平均数±标准误差值;
[0503]
*:在首次给药后,各给药组体重与首次给药时统计学比较,t-test,P<0.05。
[0504]
**:在首次给药后,各给药组体重与首次给药时统计学比较,t-test,P<0.01。
[0505]
表13和图23的结果表明:分组后0~15天,与首次给药前体重相比,G1组、G2组、G8组小鼠平均体重无显著变化(P>0.05);G4组小鼠平均体重在分组后第11天有显著升高(P<0.05),说明实验动物对c4D10B11、c95E2D10耐受性良好。另外,与首次给药前体重相比,G3组小鼠平均体重在分组后第5-6天有明显降低(P<0.05);G7组小鼠平均体重在分组后第6天明显下降(P<0.05),说明实验动物对受试品c20H4G5、Hu5F9-G4耐受性一般。此外,实验期间,与首次给药前体重相比,G5组、G6组实验动物平均体重在分组后第0~7天有显著下降(P<0.05),分组后第7~15天逐渐恢复至首次给药前体重,说明实验动物对受试品c158B3G6、c29A03NA的耐受性较差。
[0506]
分组后第1天、第3天、第6天、第13天从每只小鼠眼眶内眦静脉丛采血100-150μL,进行血常规检测。血常规指标变化情况见图24、图25、图26、图27。分组后第6天从每只小鼠眼眶内眦静脉丛采血150-200μL,收集血清进行血生化检测,结果如图28。在本实验模型上,实验动物对c4D10B11、c95E2D10耐受性良好。
[0507]
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0508]
本发明的序列信息
[0509]
表14本发明抗体的VH、VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3,VL、VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3的序列编号(SEQ ID NO.)
[0510]
[0511]
表15本发明序列信息
[0512]
[0513]
[0514]
[0515]
[0516]

权利要求书

[权利要求 1]
一种抗体的重链可变区,其特征在于,所述的重链可变区具有选自下组的互补决定区CDR: SEQ ID NO.10n+3所示的VH-CDR1, SEQ ID NO.10n+4所示的VH-CDR2,和 SEQ ID NO.10n+5所示的VH-CDR3; 其中,各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、或7; 其中,上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的,并能够保留CD47结合亲和力的衍生序列。
[权利要求 2]
一种抗体的重链,其特征在于,所述的重链具有如权利要求1所述的重链可变区。
[权利要求 3]
一种抗体的轻链可变区,其特征在于,所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR: SEQ ID NO.10n+8所示的VL-CDR1, SEQ ID NO.10n+9所示的VL-CDR2,和 SEQ ID NO.10n+10所示的VL-CDR3; 其中,各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、或7; 其中,上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的,并能够保留CD47结合亲和力的衍生序列。
[权利要求 4]
一种抗体的轻链,其特征在于,所述的轻链具有如权利要求3所述的轻链可变区。
[权利要求 5]
一种抗体,其特征在于,所述抗体具有: (1)如权利要求1所述的重链可变区;和/或 (2)如权利要求3所述的轻链可变区; 或者,所述抗体具有:如权利要求2所述的重链;和/或如权利要求4所述的轻链, 其中,上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的,并能够保留CD47结合亲和力的衍生序列。
[权利要求 6]
如权利要求5所述的抗体,其特征在于,所述的抗体具有如权利要求1所述的重链可变区和如权利要求3所述的轻链可变区; 其中,所述的重链可变区和所述的轻链可变区包括选自下组的CDR: 其中,上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的,并能够保留CD47结合亲和力的衍生序列。
[权利要求 7]
如权利要求5所述的抗体,其特征在于,所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.1、11、21、31、41、51、61、或71所示的氨基酸序列;和/或所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.6、16、26、36、46、56、66、或76所示的氨基酸序列。
[权利要求 8]
如权利要求6所述的抗体,其特征在于,所述的抗体选自下组:
[权利要求 9]
一种重组蛋白,其特征在于,所述的重组蛋白包括: (i)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5-8中任一项所述的抗体;以及 (ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
[权利要求 10]
一种多核苷酸,其特征在于,所述多核苷酸编码选自下组的多肽: (1)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5-8中任一项所述的抗体;以及 (2)如权利要求9所述的重组蛋白。
[权利要求 11]
如权利要求10所述的多核苷酸,其特征在于,编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO.2、12、22、32、42、52、62、或72所示;和/或,编码所述 轻链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO.7、17、27、37、47、57、67、或77所示。
[权利要求 12]
如权利要求11所述的多核苷酸,其特征在于,编码所述重链可变区序列的多核苷酸和编码所述轻链可变区序列的多核苷酸选自下组:
[权利要求 13]
一种载体,其特征在于,所述载体含有本发明权利要求10-12中任一项所述的多核苷酸。
[权利要求 14]
一种遗传工程化的宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞含有权利要求13所述的载体或基因组中整合有权利要求10-12中任一项所述的多核苷酸。
[权利要求 15]
一种抗体偶联物,其特征在于,该抗体偶联物含有: (a)抗体部分,所述抗体部分选自下组:如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5-8中任一项所述的抗体、或其组合;和 (b)与所述抗体部分偶联的偶联部分,所述偶联部分选自下组:可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
[权利要求 16]
一种免疫细胞,其特征在于,所述免疫细胞表达或在细胞膜外暴露有权利要求5-8中任一项所述的抗体。
[权利要求 17]
一种药物组合物,其特征在于,所述药物组合物含有: (i)活性成分,所述活性成分选自下组:如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5-8中任一项所述的抗体、如权利要求9所述的重组蛋白、如权利要求15所述的抗体偶联物、权利要求16所述的免疫细胞、或其组合;以及 (ii)药学上可接受的载体。

附图

[ 图 1]  
[ 图 2]  
[ 图 3]  
[ 图 4]  
[ 图 5]  
[ 图 6]  
[ 图 7]  
[ 图 8A]  
[ 图 8B]  
[ 图 9]  
[ 图 10]  
[ 图 11]  
[ 图 12]  
[ 图 13]  
[ 图 14]  
[ 图 15A]  
[ 图 15B]  
[ 图 15C]  
[ 图 15D]  
[ 图 16]  
[ 图 17]  
[ 图 18]  
[ 图 19]  
[ 图 20]  
[ 图 21A]  
[ 图 21B]  
[ 图 22]  
[ 图 23]  
[ 图 24]  
[ 图 25]  
[ 图 26]  
[ 图 27]  
[ 图 28]