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1. WO2020108497 - PRÉPARATION D'UN ANTICORPS ANTI-PD-L1

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说明书

发明名称 0001   0002   0003   0004   0005   0006   0007   0008   0009   0010   0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061   0062   0063   0064   0065   0066   0067   0068   0069   0070   0071   0072   0073   0074   0075   0076   0077   0078   0079   0080   0081   0082   0083   0084   0085   0086   0087   0088   0089   0090   0091   0092   0093   0094   0095   0096   0097   0098   0099   0100   0101   0102   0103   0104   0105   0106   0107   0108   0109   0110   0111   0112   0113   0114   0115   0116   0117   0118   0119   0120   0121   0122   0123   0124   0125   0126   0127   0128   0129   0130   0131   0132   0133   0134   0135   0136   0137   0138   0139   0140   0141   0142   0143   0144   0145   0146   0147   0148   0149   0150   0151   0152   0153   0154   0155   0156   0157   0158   0159   0160   0161   0162   0163   0164   0165   0166   0167   0168   0169   0170   0171   0172   0173   0174   0175   0176   0177   0178   0179   0180   0181   0182   0183   0184   0185   0186   0187   0188   0189   0190   0191   0192   0193   0194   0195   0196   0197   0198   0199   0200   0201   0202   0203   0204   0205   0206   0207   0208   0209   0210   0211   0212   0213   0214   0215   0216   0217   0218   0219   0220   0221   0222   0223   0224   0225   0226   0227   0228   0229   0230   0231   0232   0233   0234   0235   0236   0237   0238   0239   0240   0241   0242   0243  

权利要求书

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说明书

发明名称 : 一种抗PD-L1抗体制剂

技术领域

[0001]
本发明涉及治疗性抗体领域,更具体地,本发明涉及一种抗PD-L1抗体制剂及其医药用途。

背景技术

[0002]
PD-1(Programmed Death 1)全称程序性死亡受体1,是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白,属于CD28家族成员。PD-L1(Programmed Cell Death-Ligand 1)全称程序性死亡受体-配体1,是大小为40KDa的Ⅰ型跨膜糖蛋白。
[0003]
正常生理条件下,抗原进入机体后,经抗原提呈细胞(APC)加工并与MHC连接。T细胞表面TCR分子经特异性识别APC所提呈的抗原肽,并同时识别与抗原肽形成复合物的MHC分子,此外T细胞表面众多免疫调节分子参与反应,产生共刺激信号,促使T细胞活化并发挥免疫效应。PD-1在活化的T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和DC表面均有表达,与处于APC细胞表面的PD-L1、PD-L2等相互作用,可传导抑制性信号,抑制T细胞的活化,维持机体免疫稳态。肿瘤细胞表面往往存在高表达PD-L1,与肿瘤浸润T淋巴细胞高表达PD-1结合,导致PD-1通路持续激活,从而抑制T细胞活化,实现肿瘤的免疫逃逸。所以阻断PD-1/PD-L1结合成为肿瘤免疫治疗领域重要策略之一。PD-L1抗体能阻断肿瘤PD-L1与T细胞PD-1的结合,消除这一免疫抑制效应,使得T细胞被重新激活,识别并杀伤肿瘤细胞。
[0004]
WO2017/148424公开了新的抗PD-L1单克隆抗体,所述抗体能够十分有效地阻断PD-1与PD-L1结合,对肿瘤或者贫血病显示出更好的疗效。但PD-L1抗体用于临床治疗需要解决适合给药的理化性质及储存阶段的稳定性的问题。抗体制剂是抗体在储存运输和临床治疗中的最终形式,需要兼顾其理化性质、生理性质及有效期内的稳定性,如蛋白含量、pH、渗透压、不溶性微粒、纯度、聚集体、结合活性等。由于不同的抗体在理化性质方面各有特点,稳定性也相差很大,制备制剂难以得到稳定通用的液体制剂处方。因此对于每个创新研发的抗体,需进行深入研究,寻找适合的制剂处方,以得到生理相容性好的抗体制剂,方便药品储存以及临床用药。
[0005]
因此,针对抗PD-L1抗体,开发合适的制剂处方以得到生理相容性和稳定性满足需求的抗体制剂,是十分必要的。
[0006]
发明内容
[0007]
本申请的发明人经过大量实验和反复摸索,出人意料地发现,抗PD-L1抗体与特定处方组成的液体制剂,具有优良的生理相容性和稳定性,进一步开发 了高浓度的抗体制剂,高浓度蛋白制剂克服了稳定性差、粘性大和易混浊的难题,因此本申请公开了特别有利于药品长期储存和临床用药的液体制剂,由此完成了本发明。
[0008]
液体制剂
[0009]
因此,在一方面,本发明提供了一种液体制剂,其包含:
[0010]
(1)浓度为约10mg/ml至约150mg/ml的抗PD-L1抗体;其中,所述抗PD-L1抗体包含分别如SEQ ID NOs:1-3所示的重链CDRs,以及分别如SEQ ID NOs:4-6所示的轻链CDRs;
[0011]
(2)浓度为约5mM至约40mM的缓冲液;
[0012]
(3)浓度为约80mM至约160mM的氯化钠;
[0013]
其中,所述液体制剂具有约5.0至约7.0的pH;并且,所述液体制剂不存在添加的糖和/或糖醇;
[0014]
并且,液体制剂具有与人血液相当的渗透压。
[0015]
本文公开的抗PD-L1抗体液体制剂的特征在于不存在添加的糖和/或糖醇,因此在本文中也可被称为无糖的抗体制剂。
[0016]
在某些优选的实施方案中,所述液体制剂不含有选自下列的糖和/或糖醇:蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇和山梨醇。
[0017]
在某些优选的实施方案中,所述抗PD-L1抗体具有如SEQ ID NO:7所示的重链可变区以及如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区。在某些优选的实施方案中,所述抗PD-L1抗体具有如SEQ ID NO:9所示的重链以及如SEQ ID NO:10所示的轻链。
[0018]
在另一优选例中,所述抗PD-L1抗体的浓度为10mg/ml至30mg/ml。
[0019]
在另一优选例中,所述抗PD-L1抗体的浓度为10mg/ml至120mg/ml,较佳地为30mg/ml至70mg/ml。
[0020]
在某些优选的实施方案中,所述抗PD-L1抗体的浓度为约15mg/ml至约25mg/ml。在某些优选的实施方案中,所述抗PD-L1抗体的浓度为约20mg/ml。
[0021]
在某些优选的实施方案中,所述抗PD-L1抗体的浓度为约50mg/ml至约70mg/ml。在某些优选的实施方案中,所述抗PD-L1抗体的浓度为约60mg/ml。
[0022]
在某些优选的实施方案中,所述抗PD-L1抗体的浓度为约80mg/ml至约150mg/ml。在某些优选的实施方案中,所述抗PD-L1抗体的浓度为约90mg/ml,约100mg/ml,约110mg/ml或约120mg/ml。
[0023]
在某些优选的实施方案中,所述氯化钠的浓度为约100mM至约160mM。在某些优选的实施方案中,所述氯化钠的浓度为约105mM、约110mM、约115mM、约120mM、约130mM、约135mM、约140mM、约145mM、约150mM或约155mM。在某些更优选的实施方案中,所述氯化钠的浓度为约140mM。
[0024]
在某些优选的实施方案中,所述缓冲液选自:柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液或乙酸-乙酸盐缓冲液。在某些优选的实施方案中,所述组氨酸缓冲液中的组氨酸单独存在或以组氨酸盐酸盐或组氨酸乙酸盐形式存在。
[0025]
在某些优选的实施方案中,所述缓冲液是组氨酸缓冲液。在某些优选的实施方案中,所述组氨酸缓冲液中的组氨酸单独存在或以组氨酸-盐酸盐或组氨酸-乙酸盐形式存在。
[0026]
在某些优选的实施方案中,所述缓冲液的浓度是约10mM至约20mM。在某些优选的实施方案中,所述缓冲液的浓度是约20mM。在某些优选的实施方案中,所述液体制剂包含浓度为约20mM的组氨酸缓冲液,优选地所述组氨酸缓冲液中的组氨酸单独存在或以组氨酸盐酸盐或组氨酸乙酸盐形式存在。
[0027]
在另一优选例中,所述缓冲液是20mM的组氨酸-盐酸组氨酸。
[0028]
在本发明中,通过缓冲液调节所述液体制剂的pH,所述缓冲液还可以进一步使用pH调节剂(例如盐酸、醋酸、磷酸等)调节pH。在某些优选的实施方案中,所述液体制剂具有约5.2至约6.8的pH。在某些优选的实施方案中,所述液体制剂具有约5.6至约6.8的pH。在某些优选的实施方案中,所述液体制剂具有约5.6至约6.0的pH。在某些示例性实施方案中,所述液体制剂的pH为约5.0、约5.2、约5.6、约5.8、约6.0、约6.4、约6.8或约7.0。在某些示例性实施方案中,所述液体制剂的pH为5.8±0.1。在某些示例性实施方案中,所述液体制剂的pH为约5.8。
[0029]
在某些优选的实施方案中,其中,所述液体制剂具有约260mOsmol/kg至约380mOsmol/kg的重量摩尔渗透压浓度。在某些优选的实施方案中,所述液体制剂具有约280mOsm/kg至约380mOsmol/kg(例如280mOsmol/kg至约360mOsmol/kg)的重量摩尔渗透压浓度。在某些优选的实施方案中,所述液体制剂具有约280mOsm/kg至约330mOsmol/kg的重量摩尔渗透压浓度。在某些优选的实施方案中,所述液体制剂具有与人血液基本上相同的渗透压。
[0030]
在另一优选例中,所述与人血液相当的渗透压为约280mOsmol/kg至约400mOsmol/kg的重量摩尔渗透压浓度,较佳地290mOsmol/kg至约320mOsmol/kg的重量摩尔渗透压浓度,更佳地为295mOsmol/kg至约315mOsmol/kg的重量摩尔渗透压浓度。
[0031]
在某些优选的实施方案中,所述液体制剂还包含有表面活性剂。在某些优选的实施方案中,所述表面活性剂是聚山梨酯80/聚山梨酯20或泊洛沙姆188。在某些优选的实施方案中,所述表面活性剂是聚山梨酯80。
[0032]
在某些优选的实施方案中,所述表面活性剂的浓度是约0.01%w/v至约0.02%w/v。在某些优选的实施方案中,所述表面活性剂的浓度是约0.02%w/v。在某些优选的实施方案中,所述液体制剂包含浓度为约0.02%w/v的聚山梨酯80。
[0033]
在某些优选的实施方案中,所述液体制剂包含:
[0034]
(1)浓度为约20mg/ml、约60mg/ml、约90mg/ml或约120mg/ml的所述抗PD-L1抗体;
[0035]
(2)浓度为约20mM的缓冲液;所述缓冲液选自组氨酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液和乙酸-乙酸盐缓冲液;
[0036]
(3)浓度为约140mM的氯化钠;
[0037]
其中,所述液体制剂具有约5.2至约6.8的pH(例如,约5.6至约6.8的pH,例如约5.6至约6.0的pH,例如约5.8的pH);并且,所述液体制剂不含有糖和/或糖醇。
[0038]
在某些优选的实施方案中,本发明的液体制剂可以在5℃±3℃下稳定并可以储存至少约2周,至少约1个月,至少约2个月,至少约3个月,至少约6个月,至少约9个月,至少约1年或至少约2年。在某些优选的实施方案中,本发明的液体制剂在约40℃下稳定并可以储存至少约2周,至少约1个月,至少约2个月,至少约3个月,至少约6个月,至少约9个月,至少约1年或至少约2年。在某些优选的实施方案中,本发明的液体制剂在室温(例如约25℃)稳定并可以储存至少约2周,至少约1个月,至少约2个月,至少约3个月,至少约6个月,至少约9个月,至少约1年或至少约2年。
[0039]
在某些示例性实施方案中,所述液体制剂包含:浓度为20mg/ml的所述抗PD-L1抗体,浓度为140mM的氯化钠,浓度为20mM的组氨酸-盐酸盐缓冲液,浓度为0.02%w/v的聚山梨酯80;并且,所述液体制剂的pH为5.8。在此类实施方案中,所述液体制剂在40℃下能稳定至少28天,并且在在5℃±3℃下能稳定至少12个月。
[0040]
在某些示例性实施方案中,所述液体制剂包含:浓度为20mg/ml的所述抗PD-L1抗体,浓度为140mM的氯化钠,浓度为20mM的组氨酸-盐酸盐缓冲液,浓度为0.02%w/v的聚山梨酯80;并且,所述液体制剂的pH为5.0。在此类实施方案中,所述液体制剂在40℃下能稳定至少28天。
[0041]
在某些示例性实施方案中,所述液体制剂包含:浓度为20mg/ml的所述抗PD-L1抗体,浓度为140mM的氯化钠,浓度为20mM的组氨酸-盐酸盐缓冲液,浓度为0.02%w/v的聚山梨酯80;并且,所述液体制剂的pH为7.0。在此类实施方案中,所述液体制剂在40℃下能稳定至少28天。
[0042]
在某些示例性实施方案中,所述液体制剂包含:浓度为20mg/ml的所述抗PD-L1抗体,浓度为140mM的氯化钠,浓度为20mM的组氨酸-乙酸盐缓冲液,浓度为0.02%w/v的聚山梨酯80;并且,所述液体制剂的pH为5.8。在此类实施方案中,所述液体制剂在40℃下能稳定至少28天。
[0043]
在某些示例性实施方案中,所述液体制剂包含:浓度为20mg/ml的所述抗PD-L1抗体,浓度为140mM的氯化钠,浓度为20mM的乙酸-乙酸钠缓冲液,浓度为0.02%w/v的聚山梨酯80;并且,所述液体制剂的pH为5.8。在此类实施方 案中,所述液体制剂在40℃下能稳定至少28天。
[0044]
在某些示例性实施方案中,所述液体制剂包含:浓度为20mg/ml的所述抗PD-L1抗体,浓度为140mM的氯化钠,浓度为20mM的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,浓度为0.02%w/v的聚山梨酯80;并且,所述液体制剂的pH为5.8。在此类实施方案中,所述液体制剂在40℃下能稳定至少28天。
[0045]
在某些示例性实施方案中,所述液体制剂包含:浓度为20mg/ml的所述抗PD-L1抗体,浓度为140mM的氯化钠,浓度为20mM的以单独组氨酸形式存在的组氨酸缓冲液,浓度为0.02%w/v的聚山梨酯80;并且,所述液体制剂的pH为5.8。在此类实施方案中,所述液体制剂在40℃下能稳定至少28天,在25℃下能稳定至少6个月,并且在5℃±3℃下能稳定至少36个月。
[0046]
在某些示例性实施方案中,所述液体制剂包含:浓度为20mg/ml的所述抗PD-L1抗体,浓度为140mM的氯化钠,浓度为20mM的组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液,浓度为0.02%w/v的聚山梨酯80;并且,所述液体制剂的pH为5.8。在此类实施方案中,所述液体制剂在40℃下能稳定至少28天,在25℃下能稳定至少6个月,并且在5℃±3℃下能稳定至少36个月。
[0047]
在某些示例性实施方案中,所述液体制剂包含:浓度为60mg/ml的所述抗PD-L1抗体,浓度为140mM的氯化钠,浓度为10mM的以单独组氨酸形式存在的组氨酸缓冲液,浓度为0.02%w/v的聚山梨酯80;并且,所述液体制剂的pH为5.7。在此类实施方案中,所述液体制剂在40℃下能稳定至少14天。
[0048]
在某些示例性实施方案中,所述液体制剂包含:浓度为60mg/ml的所述抗PD-L1抗体,浓度为140mM的氯化钠,浓度为10mM的组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液,浓度为0.02%w/v的聚山梨酯80;并且,所述液体制剂的pH为5.7。在此类实施方案中,所述液体制剂在40℃下能稳定至少14天。
[0049]
在某些示例性实施方案中,所述液体制剂包含:浓度为60mg/ml的所述抗PD-L1抗体,浓度为140mM的氯化钠,浓度为20mM的以单独组氨酸形式存在的组氨酸缓冲液,浓度为0.02%w/v的聚山梨酯80;并且,所述液体制剂的pH为5.8。所述液体制剂在5℃下能稳定至少6个月。
[0050]
在某些示例性实施方案中,所述液体制剂包含:浓度为60mg/ml的所述抗PD-L1抗体,浓度为140mM的氯化钠,浓度为20mM的组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液,浓度为0.02%w/v的聚山梨酯80;并且,所述液体制剂的pH为5.8。所述液体制剂在5℃下能稳定至少6个月。
[0051]
在某些示例性实施方案中,所述液体制剂包含:浓度为90mg/ml的所述抗PD-L1抗体,浓度为140mM的氯化钠,浓度为20mM的以单独组氨酸形式存在的组氨酸缓冲液,浓度为0.02%w/v聚山梨酯80;并且,所述液体制剂的pH为5.8。在此类实施方案中,所述液体制剂在40℃下能稳定至少13天,在25℃± 2℃下能稳定至少2个月。
[0052]
在某些示例性实施方案中,所述液体制剂包含:浓度为90mg/ml的所述抗PD-L1抗体,浓度为140mM的氯化钠,浓度为20mM的以单独组氨酸形式存在的组氨酸缓冲液,浓度为0.02%w/v聚山梨酯80;并且,所述液体制剂的pH为5.8。在此类实施方案中,所述液体制剂在40℃下能稳定至少13天,在25℃±2℃下能稳定至少2个月。
[0053]
在某些示例性实施方案中,所述液体制剂包含:浓度为120mg/ml的所述抗PD-L1抗体,浓度为140mM的氯化钠,浓度为20mM的组氨酸-盐酸盐缓冲液,浓度为0.02%w/v聚山梨酯80;并且,所述液体制剂的pH为5.8。在此类实施方案中,所述液体制剂在40℃下能稳定至少13天,在25℃±2℃下能稳定至少2个月。
[0054]
在某些示例性实施方案中,所述液体制剂包含:浓度为120mg/ml的所述抗PD-L1抗体,浓度为140mM的氯化钠,浓度为20mM的组氨酸-盐酸盐缓冲液,浓度为0.02%w/v聚山梨酯80;并且,所述液体制剂的pH为5.8。在此类实施方案中,所述液体制剂在40℃下能稳定至少13天,在25℃±2℃下能稳定至少2个月。
[0055]
在某些示例性实施方案中,所述液体制剂包含:浓度为20mg/ml的所述抗PD-L1抗体,浓度为100mM的氯化钠,浓度为20mM的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,并且,所述液体制剂的pH为5.6。在此类实施方案中,所述液体制剂样品的Tm值大于65℃,在40℃下稳定至少3天。
[0056]
在某些示例性实施方案中,所述液体制剂包含:浓度为20mg/ml的所述抗PD-L1抗体,浓度为100mM的氯化钠,浓度为20mM的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,并且,所述液体制剂的pH为6.0。在此类实施方案中,所述液体制剂样品的Tm值大于65℃,在40℃下稳定至少3天。
[0057]
在某些示例性实施方案中,所述液体制剂包含:浓度为20mg/ml的所述抗PD-L1抗体,浓度为100mM的氯化钠,浓度为20mM的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,并且,所述液体制剂的pH为6.8。在此类实施方案中,所述液体制剂样品的Tm值大于65℃,在40℃下稳定至少3天。
[0058]
在另一优选例中,所述液体制剂的规格为150mg(10ml)/瓶至2000mg(10ml)/瓶。
[0059]
在另一优选例中,所述液体制剂的规格选自下组:200mg(10ml)/瓶、600mg(10ml)/瓶、900mg(10ml)/瓶、1200mg(10ml)/瓶或1500mg(10ml)/瓶。本发明的抗PD-L1抗体液体制剂可采用本领域公知的方法将各种组分按预定浓度进行组合制备。例如,可以将抗PD-L1抗体透析至包含该液体制剂中其他组分 的溶液中,并调整至所需浓度。采用0.22μm孔径的过滤器将制剂过滤除菌。对所制备的制剂进行包装以方便使用。包材可以是玻璃瓶(例如西林瓶)、金属合金容器、预填充注射器或笔式注射器。
[0060]
本发明的抗PD-L1抗体液体制剂可包含在任何适于储存药物以及其他药物组合物的容器中。例如,本发明的液体制剂可包含在具有一定体积的密封及灭菌的塑料容器、金属合金容器或玻璃容器中,诸如安瓿、西林瓶或注射器。因此,在某些优选的实施方案中,本发明的液体制剂包含在玻璃小瓶(例如安瓿或西林瓶)、注射器或微量输液器中。在某些示例性实施方案中,本发明的液体制剂包含在玻璃小瓶(例如安瓿或西林瓶)中。
[0061]
因此,在另一方面,本发明还提供一种制品,其包含装有本发明液体制剂的容器。在某些优选的实施方案中,合适的容器包括例如塑料容器、金属合金容器或玻璃容器,诸如安瓿、西林瓶或注射器。在某些优选的实施方案中,本发明的制品包含装有本发明液体制剂的容器,合适的容器为玻璃瓶,金属合金容器或预冲注射器。在某些优选的实施方案中,所述制品可进一步包括印有使用说明的包装插页。
[0062]
本发明的抗PD-L1抗体液体制剂可通过肠胃外途径施用于受试者,诸如注射(例如,皮下、静脉内、肌内、腹膜内等)、或经皮、粘膜、鼻、呼吸道和/或口腔施用。在某些优选的实施方案中,所述液体制剂通过静脉内注射或皮下注射施用于受试者(例如人)。
[0063]
液体制剂的治疗用途
[0064]
本发明的抗PD-L1抗体液体制剂抗体可通过抑制和/或阻断由PD-1结合PD-L1介导的细胞内信号传导从而用于预防和/或治疗肿瘤或贫血病。
[0065]
因此,在另一方面,本发明还涉及本发明的液体制剂在制备药物中的用途,所述药物用于:
[0066]
(a)预防和/或治疗肿瘤或者贫血病;
[0067]
(b)辅助治疗肿瘤或者贫血病;
[0068]
(c)诊断肿瘤或者贫血病;
[0069]
(d)(a)-(c)的任意组合。
[0070]
在某些实施方案中,本发明的液体制剂与另外的药学活性剂分开、联合、同时、或相继施用,用于预防和/或治疗和/或辅助治疗肿瘤或者贫血病。在某些实施方案中,另外的药学活性剂例如为化疗药物。在某些优选的实施方案中,所述肿瘤选自乳腺癌、肺癌例如非小细胞性肺癌和肺鳞癌、肝癌、胃癌、肠癌例如结肠癌或者直肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、Merkel细胞癌、胆管癌、鼻咽癌、和头颈鳞癌、神经胶质瘤、黑素瘤白血病和淋巴瘤。
[0071]
在某些优选的实施方案中,所述淋巴瘤为霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。在某些优选的实施方案中,所述非霍奇金淋巴瘤为外周T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤和B细胞非霍奇金淋巴瘤中的一种或多种。
[0072]
术语定义
[0073]
在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所用的药剂学生物化学、核酸化学、免疫学实验室等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时,为了更好地理解本发明,下面提供相关术语的定义和解释。
[0074]
如本文中所使用的,术语“抗体”(Ab)应包括但不限于特异性结合抗原并且包含通过二硫键相互连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的免疫球蛋白。每个重链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定域CH1、CH2和CH3。每个轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定域CL。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR)),其间散布有较保守的区域(称为构架区(FR))。各VH和VL由按下列顺序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。基于恒定区的氨基酸序列和可变区的骨架区的氨基酸序列,重链可分类为μ、δ、γ、α或ε,并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE,“轻链”分为两种严格的类型:kappa(κ)和lambda(λ)。
[0075]
术语“抗体”包括例如天然存在和非天然存在的抗体;单克隆和多克隆抗体;嵌合和人源化抗体;人或非人抗体;全合成抗体。非人抗体可以通过重组方法进行人源化以降低其在人中的免疫原性。除非特别另外指出,本文使用的“抗体”应当理解为包含完整的抗体分子,既免疫球蛋白IgG。
[0076]
术语“抗PD-L1抗体”是指能够特异性结合PD-L1的抗体。术语“特异性结合”是指抗体与抗原形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合可通过约1×10 -9M或更小的平衡解离常数(K D)来表征。用于确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域公知的,例如生物发光干涉测量法或表面等离子共振技术(例如Biacore)。适用于本文公开的液体制剂中的抗PD-L1抗体(完整的抗体分子)呈现于PCT专利公开号WO2017/148424中,其通过引用以其整体并入本文。在某些优选的实施方案中,本文所述的抗PD-L1抗体包含分别如SEQ ID NO:1-3所示的重链CDR,以及分别如SEQ ID NO:4-6所示的轻链CDR。在某些优选的实施方案中,本文所述的抗PD-L1抗体具有如SEQ ID NO:7所示的重链可变区以及如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区。在某些优选的实施方案中, 本文所述的抗PD-L1抗体具有如SEQ ID NO:9所示的重链以及如SEQ ID NO:10所示的轻链。重链末位Lys是容易缺失的,但这种缺失并不影响生物活性,参见Dick,L.W.等人,Biotechnol.Bioeng.,100:1132-1143。
[0077]
如本文中所使用的,术语“程序性死亡-1(PD-1)”是指属于CD28家族的免疫抑制受体。PD-1在体内主要在以前活化的T细胞上表达,并结合两种配体PD-L1和PD-L2。完整的hPD-1序列可以在GenBank登录号U64863下找到。相应地,术语“程序性死亡配体-1(PD-L1)”是PD-1的两种细胞表面糖蛋白配体之一(另一种是PD-L2),其在结合PD-1时下调T细胞活化和细胞因子分泌。本文所用的术语“PD-L1”包括人PD-L1(h PD-L1),h PD-L1的变体、同工型和物种同源物,以及具有至少一个与h PD-L1共同的表位的类似物。完整的h PD-L1序列可以在GenBank登录号Q9NZQ7下找到。
[0078]
如本文中所使用的,术语“液体制剂”表示至少一种活性成分(例如抗体,其能够在受试者中发挥生物活性)以及至少一种非活性成分的组合,所述非活性成分当与活性成分组合时,适合于施用给受试者。通常,液体制剂不含有对会施用该制剂的受试者有不可接受的毒性的成分。在本文中,受试者可以包括哺乳动物,优选为人。
[0079]
如本文中所使用的,表述抗体的“稳定性”是指一种抗体在贮藏后基本上保留其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性。贮藏期一般基于制剂的预定货架期来选择。用于测量抗体稳定性的分析技术是本领域所公知的,可以在选定温度下用选定时间测定稳定性(例如,在40℃下储存至少28天并检测期间的抗体稳定性,或者在5℃±3℃下储存至少12个月并检测期间的抗体稳定性)。
[0080]
对于物理稳定性而言,如果在通过对颜色和/或透明度进行肉眼检查,或通过UV光散射或通过大小排阻层析测定时基本没有表现出明显的聚集,沉淀和/或变性的迹象,则认为制剂中的抗体保持它的物理稳定性。
[0081]
对于化学稳定性而言,可以通过检测和定量所述抗体的化学改变形式来进行评估。化学改变可能涉及大小改变(例如,剪切),例如,可以通过采用大小排阻层析,SDS-PAGE和/或矩阵辅助的激光解析离子化/飞行时间质谱分析(MALDI/TOF MS)进行评估。其他类型的化学改变包括电荷改变(例如,因为脱酰胺导致的改变),例如,可以通过离子交换层析对它进行评估。
[0082]
对于生物学活性而言,如果一种制剂中的抗体具有它预期用途的生物学活性,则所述抗体在制剂中保持它的生物学活性。例如,如果所述制剂中的抗体的生物学活性为在制备所述制剂时所表现出的生物学活性的大约70%~130%(例如80%~130%)内,就认为保持了它的生物学活性(例如,通过抗原结合测定确定)。
[0083]
如本文中所使用的,术语“缓冲液”是指通过其酸-碱共轭成分的作用来抵 抗pH的改变的缓冲溶液。此类缓冲液的例子包括乙酸盐、琥珀酸盐、葡糖酸盐、组氨酸、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸及其他有机酸缓冲液。在某些优选的实施方案中,适用于本文公开的液体制剂中的缓冲液选自柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液和乙酸-乙酸盐缓冲液。
[0084]
术语“组氨酸缓冲液”是指包含组氨酸的缓冲液,该缓冲液中的组氨酸可以以单独存在,或以以下形式存在:例如,组氨酸盐酸盐、组氨酸乙酸盐、组氨酸磷酸盐或组氨酸硫酸盐。当组氨酸不是以单独存在时,氨酸缓冲液(例如组氨酸盐酸盐缓冲液)可以通过用相应的酸(例如盐酸)滴定L-组氨酸(游离碱,固体)进行制备。当组氨酸以单独形式存在时,后续制备步骤可根据实际情况加入pH调节剂以获得适宜pH值范围的液体制剂。在某些优选的实施方案中,适用于本文公开的液体制剂中的组氨酸缓冲液中的组氨酸单独存在或以组氨酸盐酸盐或组氨酸乙酸盐形式存在。
[0085]
术语“柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液”是包括柠檬酸和柠檬酸盐的混合物。在某些优选的实施方案中,所述柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液是柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,也即,包含柠檬酸和柠檬酸钠的混合物。柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液(例如柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液)可以通过向柠檬酸中加入成盐所需的碱(例如氢氧化钠)进行制备。
[0086]
术语“乙酸-乙酸盐缓冲液”是包括乙酸和乙酸盐的混合物。在某些优选的实施方案中,所述乙酸-乙酸盐缓冲液是乙酸-乙酸钠缓冲液,也即,包含乙酸和乙酸钠的混合物。乙酸-乙酸盐缓冲液(例如乙酸-乙酸钠缓冲液)可以通过向乙酸中加入成盐所需的碱(例如氢氧化钠)进行制备。
[0087]
如本文中所使用的,术语“糖”或“糖醇”具有本领域技术人员通常所理解的含义。糖包括一般组成(CH 2O)n及其衍生物,包括单糖、二糖、三糖、多糖、还原糖、非还原糖等,其在本文中的非限制性实例包括葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、果糖、麦芽糖、葡聚糖(dextran)等。糖醇可以从相应的糖制取获得,即将糖分子上的醛基或酮基还原成羟基从而获得糖醇;糖醇具有通式H(CHOH)nH,其在本文中的非限制性实例包括,赤藓醇、苏糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇等。
[0088]
本发明的抗PD-L1抗体液体制剂不含有糖和/或糖醇,因此在本文中该制剂亦可被称为无糖的抗体制剂。在某些优选的实施方案中,本发明的抗PD-L1抗体液体制剂不含有选自下列的糖和/或糖醇:蔗糖、海藻糖、葡萄糖、甘露醇和山梨醇。本领域已知,通常抗体制剂中需要加入糖和/或糖醇(例如,蔗糖、海藻糖、葡萄糖、甘露醇和山梨醇等)作为抗体的稳定剂,此外,糖和/或糖醇同时也可作为有效的渗透压调节剂,能够维持该制剂的稳定(例如等渗,即具有与人血液基本上相同的渗透压)。
[0089]
如本文中所使用的,术语“重量摩尔渗透压浓度”是指溶解的溶质颗粒在 水溶液中的渗透压的量度。溶质颗粒包括两种离子以及非离子化分子。渗透压表示为溶解在1kg溶剂(即水)中的渗透活性颗粒的浓度(即渗透压摩尔)。本文以毫渗透压摩尔/千克水(mOsmol/kg)为单位表示重量摩尔渗透压浓度。本领域技术人员已知,期望水平的重量摩尔渗透压浓度可以通过添加一种或多种渗透压调节剂(诸如糖和/或糖醇)来实现。
[0090]
如本文中所使用的,术语“等渗”意指目的制剂具有与人血液基本上相同的渗透压。在某些优选的实施方案中,所述等渗的制剂一般将具有约260-330mOsmol/kg的渗透压。等渗性可以使用例如蒸气压或冰冻型渗透压计进行测量。
[0091]
如本文中所使用的,术语“质量体积比”或“w/v”表示单一组分相对于含有该组分的混合物的总体积(以毫升计)的百分比重量(以克计)。例如,总体积100ml中的20mg组分为0.02%w/v。
[0092]
如本文中所使用的,术语“约”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值或组成可接受的误差范围内的值或组成,这将部分地取决于值或组成如何测量或确定,即测量系统的限制。在本文中,当“约”用于描述可测量的值(例如,物质的浓度、时间、温度等)时,意味着包含给定值的±5%的范围,例如表述“约10mM”是指9.5-10.5mM。
[0093]
发明的有益效果
[0094]
在制备抗体制剂过程中,本领域通常需要加入糖和/或糖醇以维持抗体的稳定性,然而,糖和/或糖醇的使用对于糖尿病人而言有一定的局限性。本申请的发明人经过大量实验,出乎意料的发现,本发明的无糖抗体制剂不仅能够维持该抗体制剂的渗透压以获得优良的生理相容性,并且能够维持制剂的物理稳定性、化学稳定性及生物学活性,在储存运输期间耐受剧烈条件,从而特别有利于药品长期储存,并且能够扩展临床用药范围,具有重大的临床价值。
[0095]
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不是对本发明的范围的限定。根据优选实施方案的下列详细描述,本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
[0096]
序列信息
[0097]
本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。
[0098]
表1:序列的描述
[0099]
[0100]
[0101]
上述CDR可以通过本领域技术人员所熟知的技术手段,例如通过VBASE2数据库根据IMGT定义分析下面的重链可变区的氨基酸序列或者轻链可变区的氨基酸序列得到。

具体实施方式

[0102]
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
[0103]
除非特别指明,否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓,实施例以举例方式描述本发明,且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。
[0104]
实验材料及方法
[0105]
表2:实施例涉及的试剂
[0106]
[表0001]
物料名称 厂家
聚山梨酯80 南京威尔化工有限公司
盐酸组氨酸 上海协和氨基酸有限公司
组氨酸 上海协和氨基酸有限公司
氯化钠 江苏勤奋药业有限公司
蔗糖 默克
乙酸 湖南尔康制药股份有限公司
乙酸钠 湖南尔康制药股份有限公司
枸橼酸 湖南尔康制药股份有限公司
枸橼酸钠 湖南尔康制药股份有限公司

[0107]
以下实施例中的抗PD-L1人源化单克隆抗体的来源参见PCT专利公开号WO2017/148424,并且具备如SEQ ID NO:9所示的重链和如SEQ ID NO:10所示的轻链。
[0108]
检测方法
[0109]
(1)蛋白质浓度
[0110]
采用Solo-VPE可变光程紫外分光光度计,吸取约30μl的样品置于比色皿中,通过测量UV吸光度来测定样品蛋白质浓度。
[0111]
(2)Flowcam
[0112]
采用Flowcam GWF-8JD测定样品中的颗粒数量,用移液枪吸取约1ml样品,将装有样品的枪头置于样品口上,测定样品中≥10μm以及≥25μm的不溶性颗粒数量。
[0113]
(3)渗透压
[0114]
取25μl样品置于样品管中,将样品管置于819M冰点渗透压仪 探针下,测定样品渗透压。
[0115]
(4)分子大小排阻层析(SEC-HPLC)
[0116]
在Waters e2695HPLC上,柱温保持室温,使用TSKgel G3000SWXL柱,将处理后样品进样,流动相洗脱约20min,经分子大小排阻层析法确定样品中大小分子分布。根据280nm处UV吸收得出样品曲线,并将总面积的相对百分比峰面积作为结果报告。
[0117]
(5)离子交换色谱(IEC-HPLC)
[0118]
在Waters e2695HPLC上,柱温30℃,使用ProPac WCX-10柱,将处理后样品进样,以流动相洗脱,经离子交换色谱法确定样品中不同带电离子组分分布。根据280nm处UV吸收得出样品曲线,并将总面积的相对百分比峰面积作为结果报告。
[0119]
(6)毛细管电泳(CE-SDS)
[0120]
采用十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)紫外检测方法,将样品进行处理后,在非还原(Non-reduced,NR)条件下,依据分子量大小,定量测定重组单克隆抗体产品的纯度。
[0121]
(7)相对结合活性(%)
[0122]
建立酶联免疫法(ELISA)检测样品的EC50(半数有效浓度)。通过比较样品与参比品的EC50,计算样品的相对结合活性,由于该方法的检测偏差为±20%,所以标准初步定为70-130%。
[0123]
实施例1
[0124]
处方1:抗PD-L1人源化单克隆抗体20mg/ml,100mM的氯化钠,20mM柠檬酸-柠檬酸钠,pH5.2。
[0125]
处方2:抗PD-L1人源化单克隆抗体20mg/ml,100mM的氯化钠,20mM柠檬酸-柠檬酸钠,pH 5.6。
[0126]
处方3:抗PD-L1人源化单克隆抗体20mg/ml,100mM的氯化钠,20mM柠檬酸-柠檬酸钠,pH 6.0。
[0127]
处方4:抗PD-L1人源化单克隆抗体20mg/ml,100mM的氯化钠,20mM柠檬酸-柠檬酸钠,pH 6.4。
[0128]
处方5:抗PD-L1人源化单克隆抗体20mg/ml,100mM的氯化钠,20mM柠檬 酸-柠檬酸钠,pH 6.8。
[0129]
处方1-5的抗体制剂制备方法如下:
[0130]
1.配置缓冲液:向注射用水中加入100mM氯化钠、20mM柠檬酸,用氢氧化钠调节至上述处方中所需的pH值。
[0131]
2.抗体原液(四川科伦博泰生物医药股份有限公司,批号1)经超滤换液,透析至上述缓冲液中,调整抗体浓度至20mg/ml。
[0132]
3.将配置好的样品在层流条件下经0.22μm孔径的过滤器进行除菌过滤,灌装至西林瓶,加塞轧盖即获得样品。
[0133]
通过DSF法考察制剂pH值对单克隆抗体稳定性的影响,结果显示不同的pH值样品的Tm值均大于65℃,表明在pH 5.6-6.8范围内pH值对蛋白质热稳定性并无显著影响(表3)。将样品置于40℃条件下放置3天进行加速实验,SEC-HPLC结果显示单体大于99.0%,没有明显降低,低聚物未检出,高聚物均小于0.20%,无明显增加,各样品稳定性良好(表4)。
[0134]
表3:不同pH值样品Tm值
[0135]
[表0002]
样品 处方1 处方2 处方3 处方4 处方5
DSF Tm(℃) 65.31 66.25 66.25 66.33 66.40

[0136]
表4:不同pH值样品加速实验结果
[0137]
[0138]
实施例2
[0139]
处方6:抗PD-L1人源化单克隆抗体20mg/ml,140mM氯化钠,20mM组氨酸-盐酸组氨酸,质量体积比为0.02%的聚山梨酯80,pH 5.8。
[0140]
制备处方6的抗体制剂100ml,制备方法如下:
[0141]
1.配置缓冲液:向注射用水中加入140mM氯化钠、20mM组氨酸,用盐酸调节至pH 5.8。
[0142]
2.抗体原液(批号1)经超滤换液,透析至上述缓冲液,调整抗体浓度至20mg/ml,加入适量聚山梨酯80储存液。
[0143]
3.将配置好的样品在层流条件下经0.22μm孔径的过滤器进行除菌过滤,灌装至西林瓶,加塞轧盖即获得样品。
[0144]
考察处方6在40℃条件下28天样品稳定性,其检测结果分别示于表5-9中。
[0145]
实施例3
[0146]
处方7:抗PD-L1人源化单克隆抗体20mg/ml,140mM氯化钠,20mM组氨酸-盐酸组氨酸,质量体积比为0.02%的聚山梨酯80,pH 5.0。
[0147]
调节缓冲液pH至5.0,其余制备方法同实施例2。
[0148]
考察处方7在40℃条件下28天样品稳定性,其检测结果分别示于表5-9中。
[0149]
实施例4
[0150]
处方8:抗PD-L1人源化单克隆抗体20mg/ml,140mM氯化钠,20mM组氨酸-盐酸组氨酸,质量体积比为0.02%的聚山梨酯80,pH 7.0。
[0151]
调节缓冲液pH至7.0,其余制备方法同实施例2。
[0152]
考察处方8在40℃条件下28天样品稳定性,其检测结果分别示于表5-9中。
[0153]
实施例5
[0154]
处方9:抗PD-L1人源化单克隆抗体20mg/ml,140mM氯化钠,20mM组氨酸-乙酸组氨酸,质量体积比为0.02%的聚山梨酯80,pH 5.8。
[0155]
向注射用水中加入140mM氯化钠、20mM组氨酸,用乙酸调节至pH至5.8,其余制备方法同实施例2。
[0156]
考察处方9在40℃条件下28天样品稳定性,其检测结果分别示于表5-9中。
[0157]
实施例6
[0158]
处方10:抗PD-L1人源化单克隆抗体20mg/ml,140mM氯化钠,20mM乙酸-乙酸钠,质量体积比为0.02%的聚山梨酯80,pH 5.8。
[0159]
向注射用水中加入140mM氯化钠、20mM乙酸钠,用乙酸调节pH至5.8,其 余制备方法同实施例2。
[0160]
考察处方10在40℃条件下28天样品稳定性,其检测结果分别示于表5-9中。
[0161]
实施例7
[0162]
处方11:抗PDL-1人源化单克隆抗体20mg/ml,140mM氯化钠,20mM枸橼酸-枸橼酸钠,质量体积比为0.02%的聚山梨酯80,pH 5.8。
[0163]
向注射用水中加入140mM氯化钠、20mM枸橼酸钠,用枸橼酸调节pH至5.8,其余制备方法同实施例2。
[0164]
考察处方11在40℃条件下28天样品稳定性,其检测结果分别示于表5-9中。
[0165]
实施例8
[0166]
处方12:抗PD-L1人源化单克隆抗体20mg/ml,140mM氯化钠,20mM组氨酸-盐酸组氨酸,质量体积比为0.02%的聚山梨酯20,pH 5.8。
[0167]
处方8中聚山梨酯80替换为聚山梨酯20,其余制备方法同实施例2。
[0168]
考察处方12在40℃条件下28天样品稳定性,其部分检测结果分别示于表7-9中。
[0169]
实施例9
[0170]
检测上述实施例2-8样品在40℃条件下放置28天的稳定性。
[0171]
9.1渗透压检测
[0172]
实施例2-7的渗透压检测结果如下表所示。结果显示,在40℃条件下放置28天,实施例2-7样品的渗透压能够稳定在280-320mOsmol/kg范围内,稳定性良好。
[0173]
表5:渗透压检测结果
[0174]
[0175]
9.2不溶性颗粒检测
[0176]
通过Flowcam检测实施例2-7样品的不溶性颗粒,结果见下表。结果显示,各处方样品中≥10μm的颗粒数量均小于1000,≥25μm的颗粒数量均小于200,表明处方6-11在40℃条件下放置28天后依然无明显聚集,满足药用要求。
[0177]
表6:Flowcam检测结果
[0178]
[0179]
9.3分子大小排阻层析(SEC-HPLC)检测
[0180]
通过分子大小排阻层析检测实施例2-8样品中单体含量,结果见下表。结果显示,处方6-12样品单体含量均大于95%,在40℃条件下放置28天保持稳定。
[0181]
表7:SEC-HPLC检测结果
[0182]
[0183]
9.4离子交换色谱(IEC-HPLC)检测
[0184]
通过离子交换色谱检测实施例2-8样品的主峰含量,结果见下表。结果显示,在40℃条件下放置28天,处方6-12的主峰含量均维持稳定,符合质量要求。
[0185]
表8:IEC-HPLC检测结果
[0186]
[0187]
[0188]
9.5毛细管电泳(CE-SDS)检测
[0189]
通过毛细管电泳检测实施例2-8样品的主峰纯度,结果见下表。结果显示,在40℃条件下放置28天后,处方6-12样品的主峰纯度高,含量保持稳定,且符合质量要求。
[0190]
表9:非还原CE-SDS检测结果
[0191]
[表0003]
主峰纯度(%) 40℃0天 40℃14天 40℃28天
实施例2 96.3 95.9 95.0
实施例3 97.0 95.8 89.2
实施例4 97.0 95.3 94.0
实施例5 96.8 95.9 93.4
实施例6 97.0 95.7 93.1
实施例7 97.0 95.1 91.3
实施例8 97.2 95.0 93.4

[0192]
实施例10
[0193]
处方6:抗PD-L1人源化单克隆抗体20mg/ml,140mM氯化钠,20mM组氨酸-盐酸组氨酸,质量体积比为0.02%的聚山梨酯80,pH 5.8。
[0194]
制备处方6的抗体制剂放大到10L,制备方法如下:
[0195]
1.配置超滤缓冲液:向注射用水中加入氯化钠与组氨酸,并用盐酸调节pH值至5.8,配置成含140mM氯化钠和20mM组氨酸-盐酸组氨酸溶液。
[0196]
2.抗体原液(批号2)使用Millipore超滤膜包,根据载量选取合适膜包数量并用Thermo Pellicon超滤系统进行超滤换液。将蛋白透析至上述缓冲液,调整抗体浓度至20mg/ml,加入适量聚山梨酯80。
[0197]
3.将配置好的样品在层流条件下进行除菌过滤,滤器采用Millipak系列0.22μm滤器(Millipore公司),进行过滤。如有需要,可在除菌滤器前串联预过滤膜Opticap滤器以增大滤器载量。在无菌环境(超净台)中将除菌过滤器用硅胶管与蠕动泵连接,下经0.22μm孔径的过滤器进行除菌过滤。收集过滤后样品溶液,分别灌装至西林瓶,加塞轧盖即获得样品。
[0198]
进行5℃±3℃长期12月稳定性研究,考察项目为蛋白浓度,SEC-HPLC、CE-SDS、IEC-HPLC,结果如表10所示。结果显示,该处方的抗PD-L1人源化单 克隆抗体液体制剂可放大生产,经放大生产仍可达到与小规模配置制剂相同的质量,抗体浓度稳定,纯度保持较高,稳定性良好,在5℃±3℃温度条件下至少可以稳定保存12个月。
[0199]
表10:处方6的长期稳定性检测数据
[0200]
[0201]
此外,对处方6进行-20℃48小时冻融稳定性研究,考察项目为OD405,SEC-HPLC以及IEC-HPLC,结果如表11所示。结果显示,该处方的抗PD-L1人源化单克隆抗体液体制剂冻融4个循环周期稳定性良好,可以耐受制剂在储存运输期间的剧烈条件。
[0202]
表11:处方6的冻融稳定性检测数据
[0203]
[0204]
按本例上述相同的方法制备另一批抗体原液(批号3)的相同处方制剂。进行处方6的5±3℃长期稳定性研究和25±2℃加速稳定性研究,考察项目为外观,蛋白浓度,pH,渗透压,不溶性微粒,SEC-HPLC、CE-SDS、IEC-HPLC,结合活性。结果如下:
[0205]
表12:处方6的5±3℃长期稳定性研究检测数据
[0206]
[0207]
[0208]
处方6在5℃条件下长期放置36月,外观澄清透明,蛋白含量、pH、摩尔渗透压、CE-SDS还原和非还原、SEC-HPLC、IEC-HPLC和相对结合活性均未发生明显改变,稳定性较好。
[0209]
表13:处方6的25℃±2℃加速稳定性研究检测数据
[0210]
[0211]
处方6在25±2℃加速条件下放置6个月,外观澄清透明,蛋白含量、pH、渗透压和相对结合活性均未发生明显变化,CE-SDS还原和非还原、SEC-HPLC和IEC-HPLC纯度略微下降,蛋白稳定性较好,符合质量要求。
[0212]
实施例11
[0213]
处方16:抗PD-L1人源化单克隆抗体60mg/ml,10mM组氨酸-盐酸组氨酸,140mM氯化钠,质量体积比为0.02%的聚山梨酯80,pH 5.7。缓冲液中的抗体浓 度为60mg/ml,其余制备方法同实施例2。
[0214]
40℃条件稳定性检测结果如表14所示,处方16样品外观为微带乳光澄清透明液体;并且,在40℃条件下随时间延长,OD405稳定,表明该处方具有稳定性。
[0215]
表14:处方16的稳定性检测结果
[0216]
[0217]
实施例12
[0218]
处方17:抗PD-L1人源化单克隆抗体60mg/ml,20mM组氨酸-盐酸组氨酸,140mM氯化钠,0.02%w/v聚山梨酯80,pH5.8,其制备方法同实施例2。
[0219]
处方18:抗PD-L1人源化单克隆抗体90mg/ml,20mM组氨酸-盐酸组氨酸,140mM氯化钠,0.02%w/v聚山梨酯80,pH5.8,其制备方法同实施例2。
[0220]
处方19:抗PD-L1人源化单克隆抗体120mg/ml,20mM组氨酸-盐酸组氨酸,140mM氯化钠,0.02%w/v聚山梨酯80,pH5.8,其制备方法同实施例2。
[0221]
分别考察处方6,处方17、处方18和处方19的粘度以及不同温度条件下的粘度变化。结果如表15所示,低浓度条件下处方6的粘度较低,随着浓度增加,处方17、18和19的粘度逐渐增加。处方6和处方17在5℃放置6个月,粘度与起始时相比没有明显变化;处方18和处方19,在5℃和25℃放置3个月,粘度与起始时相比没有明显改变。高浓度制剂通常粘度较高,本申请制剂在高浓度时粘度可控且稳定,符合质量要求。
[0222]
表15:处方6和17-19的粘度以及不同温度条件下的粘度值
[0223]
[0224]
NT代表未检测。
[0225]
实施例13
[0226]
分别考察处方18和处方19在振荡、40℃、25℃和5℃条件下的稳定性。结果如表16所示,在1000rpm条件下连续振荡2h,处方18和处方19各检项均未发生明显改变,稳定性良好。在5℃条件下,放置2个月,处方19的各理化检项基本保持不变,稳定性良好,表明处方19制剂成品在5±3℃条件下可至少放置2个月。加速25℃条件下,放置2个月,处方18和处方19的IEC主峰略微降低,其余各检项基本不变,表明处方18和处方19制剂成品在25±2℃条件下可至少放置2个月。在40℃条件下,放置13天,处方18和处方19的IEC主峰和CE-SDS非还原主峰有小幅下降以外,其余各检项没有明显改变,符合质量要求,表明处方18和处方19制剂成品在40℃条件下可至少放置13天。本申请制剂克服稳定性、粘性、渗透压和混浊性的难题,有利于药品长期储存和临床用药。
[0227]
表16:处方18和处方19在振荡、40℃、25℃和5℃条件下的稳定性检测结果。
[0228]
[0229]
NT代表未检测。
[0230]
对比例1
[0231]
处方13:抗PD-L1人源化单克隆抗体20mg/ml,140mM蔗糖,20mM组氨酸-盐酸组氨酸,质量体积比为0.02%的聚山梨酯80,pH 5.8。缓冲液中140mM氯化钠替换为140mM蔗糖,其余制备方法同实施例2。
[0232]
处方14:抗PD-L1人源化单克隆抗体20mg/ml,105mM蔗糖,35mM氯化钠,20mM组氨酸-盐酸组氨酸,质量体积比为0.02%的聚山梨酯80,pH 5.8。缓冲液中140mM氯化钠替换为105mM蔗糖和35mM氯化钠,其余制备方法同实施例2。
[0233]
处方15:抗PD-L1人源化单克隆抗体20mg/ml,70mM蔗糖,70mM氯化钠,20mM组氨酸-盐酸组氨酸,质量体积比为0.02%的聚山梨酯80,pH 5.8。缓冲液中140mM氯化钠替换为70mM氯化钠和70mM蔗糖,其余制备方法同实施例2。
[0234]
经检测,处方13-15的渗透压分别为199mOsmol/kg、232mOsmol/kg和258mOsmol/kg,均低于正常人体血浆渗透压,该抗体制剂为低渗溶液,静脉给药有发生溶血现象的风险,不满足临床用药需求。
[0235]
总结在本发明的实施例中所涉及的所有处方及其各自的成分总结如表17所示。
[0236]
表17各处方编号及其各自的成分
[0237]
[0238]
首先,通过对处方1-5的抗体制剂进行Tm值测定以及40℃条件稳定性测定实验,其结果表明本发明处方1-5的抗体制剂均有良好的稳定性。这也表明当pH值在5.6-6.8范围内,本发明PD-L1抗体均具有一个较好的稳定性。
[0239]
随后,通过对处方6-12的抗体制剂分别进行了40℃条件下防止28天的渗 透压监测、不溶性颗粒监测、SEC-HPLC检测、IEC-HPLC检测,以及CE-SDS检测,其结果表明本发明的处方6-12的抗体制剂的稳定性良好、无明显聚集,均符合药用要求。并且,结果表明,当pH为5.8时本发明抗体的稳定性最佳,并且,当制剂中的缓冲对为组氨酸-盐酸组氨酸时,其稳定性效果相对优于其他的缓冲对。
[0240]
因此,本发明人对相对效果更优的处方6的抗体制剂进行了进一步的检测和分析。具体地,分析了其5℃±3℃的长期12个月的稳定性和在5℃长期存放36个月的稳定性,分别测试了蛋白浓度、SEC-HPLC、CE-SDS、IEC-HPLC、结合活性等;并且,分析了其-20℃、48小时冻融的稳定性,分别测试了OD405、SEC-HPLC以及IEC-HPLC。结果表明,处方6的抗体制剂,在5℃±3℃下至少可以稳定保存12个月,经放大生产仍可达到与小规模配制制剂相同的产品质量;并且,反复冻融4个循环周期后,稳定性良好,可以耐受制剂在储存运输期间的剧烈条件;此外,在5℃下长期放置36个月,外观澄清透明,蛋白含量、pH、摩尔渗透压、CE-SDS还原和非还原、SEC-HPLC、IEC-HPLC和相对结合活性均未发生明显改变,稳定性较好。
[0241]
进一步地,本发明人尝试了高抗体浓度条件下的抗体制剂-处方16-19,分别尝试了PD-L1抗体浓度为60mg/ml、90mg/ml和120mg/ml的情况下,抗体制剂的稳定性。结果表明,在40℃的条件下,处方16的抗体制剂外观为微带乳光澄清透明液体、OD405稳定;在不同的温度条件下,随着时间的推移,处方17-19的抗体制剂的粘度没有发生明显的变化;处方18和19的抗体制剂,在1000rpm条件下连续震荡2h稳定性好,在5℃、25℃下可放置2个月,在40℃下可放置13天。因此,在本发明中,高浓度抗体浓度下的抗体制剂,可克服稳定性、粘性、渗透压和混浊性的难题,有利于药品长期储存和临床用药。
[0242]
此外,本发明人对抗体制剂中NaCl的浓度进行了筛选-处方13-15(对比例)。结果表明,当NaCl浓度分别为0mM、35mM和70mM时,渗透压分别为199mOsmol/kg、232mOsmol/kg和258mOsmol/kg,均低于正常人体血浆渗透压,静脉给药有发生溶血现象的风险,因此不满足临床用药需求。
[0243]
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,但本领域技术人员将理解:根据已经公布的所有教导,可以对细节进行各种修改和变动,并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

权利要求书

[权利要求 1]
一种液体制剂,其包含: (1)浓度为约10mg/ml至约150mg/ml的抗PD-L1抗体;其中,所述抗PD-L1抗体包含分别如SEQ ID NO:1-3所示的重链CDRs,以及分别如SEQ ID NO:4-6所示的轻链CDRs; (2)浓度为约5mM至约40mM的缓冲液; (3)浓度为约80mM至约160mM的氯化钠; 其中,所述液体制剂具有约5.0至约7.0的pH,并且,所述液体制剂不存在添加的糖和/或糖醇; 并且,液体制剂具有与人血液相当的渗透压。
[权利要求 2]
权利要求1的液体制剂,其中,所述抗PD-L1抗体具有如SEQ ID NO:7所示的重链可变区以及如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区; 优选地,所述抗PD-L1抗体具有如SEQ ID NO:9所示的重链以及如SEQ ID NO:10所示的轻链。
[权利要求 3]
权利要求1或2的液体制剂,其中,所述抗PD-L1抗体的浓度为约15mg/ml至约25mg/ml、约50mg/ml至约70mg/ml,或约80mg/ml至约150mg/ml; 优选地,所述抗PD-L1抗体的浓度为约20mg/ml、约60mg/ml、约90mg/ml或约120mg/ml。
[权利要求 4]
权利要求1-3任一项的液体制剂,其中,所述液体制剂不含有选自下列的糖和/或糖醇:蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇和山梨醇。
[权利要求 5]
权利要求1-4任一项的液体制剂,其中,所述氯化钠的浓度为约100mM至约160mM,如约110mM,约120mM,约130mM,约140mM,约150mM,约155mM; 优选地,所述氯化钠的浓度为约140mM。
[权利要求 6]
权利要求1-5任一项的液体制剂,其中,所述缓冲液选自:柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液或乙酸-乙酸盐缓冲液;所述组氨酸缓冲液中的组氨酸单独存在或以组氨酸-盐酸盐或组氨酸-醋酸盐形式存在。
[权利要求 7]
权利要求1-6任一项的液体制剂,其中,所述缓冲液的浓度是约10mM至约20mM。
[权利要求 8]
权利要求1-7任一项的液体制剂,其中,所述液体制剂具有约5.2至约7.0的pH; 优选地,所述液体制剂具有约5.6至约6.8的pH; 优选地,所述液体制剂具有约5.6至约6.0的pH;优选地,所述液体制剂具有5.8±0.1的pH。
[权利要求 9]
权利要求1-8任一项的液体制剂,其中,所述与人血液相当的渗透压为具有约280mOsmol/kg至约380mOsmol/kg的重量摩尔渗透压浓度; 优选地,所述液体制剂具有约280mOsmol/kg至约360mOsmol/kg的重量摩尔渗透压浓度。
[权利要求 10]
权利要求1-9任一项的液体制剂,其中,所述液体制剂还包含有表面活性剂;所述表面活性剂是聚山梨酯80、聚山梨酯20或泊洛沙姆188; 其中,所述表面活性剂的浓度是约0.01%w/v至约0.02%w/v。 优选地,所述表面活性剂是浓度为约0.02%w/v的聚山梨酯80。
[权利要求 11]
权利要求1-10的液体制剂,所述液体制剂的成分选自下组: (a)抗PD-L1人源化单克隆抗体20mg/ml,140mM氯化钠,20mM组氨酸-盐酸组氨酸,质量体积比为0.02%的聚山梨酯80,pH 5.8; (b)抗PD-L1人源化单克隆抗体20mg/ml,140mM氯化钠,20mM组氨酸-盐酸组氨酸,质量体积比为0.02%的聚山梨酯80,pH 5.0; (c)抗PD-L1人源化单克隆抗体20mg/ml,140mM氯化钠,20mM组氨酸-乙酸组氨酸,质量体积比为0.02%的聚山梨酯80,pH 5.8; (d)抗PD-L1人源化单克隆抗体20mg/ml,140mM氯化钠,20mM乙酸-乙酸钠,质量体积比为0.02%的聚山梨酯80,pH 5.8; (e)抗PDL-1人源化单克隆抗体20mg/ml,140mM氯化钠,20mM枸橼酸-枸橼酸钠,质量体积比为0.02%的聚山梨酯80,pH 5.8; (f)抗PD-L1人源化单克隆抗体20mg/ml,140mM氯化钠,20mM组氨酸-盐酸组氨酸,质量体积比为0.02%的聚山梨酯20,pH 5.8; (g)抗PD-L1人源化单克隆抗体60mg/ml,10mM组氨酸-盐酸组氨酸,140mM氯化钠,质量体积比为0.02%的聚山梨酯80,pH 5.7; (h)抗PD-L1人源化单克隆抗体60mg/ml,20mM组氨酸-盐酸组氨酸,140mM氯化钠,0.02%w/v聚山梨酯80,pH5.8; (i)抗PD-L1人源化单克隆抗体90mg/ml,20mM组氨酸-盐酸组氨酸,140mM氯化钠,0.02%w/v聚山梨酯80,pH5.8; (j)抗PD-L1人源化单克隆抗体120mg/ml,20mM组氨酸-盐酸组氨酸,140mM氯化钠,0.02%w/v聚山梨酯80,pH5.8; (k)抗PD-L1人源化单克隆抗体20mg/ml,100mM的氯化钠,20mM柠檬酸-柠檬酸钠,pH 5.6; (l)抗PD-L1人源化单克隆抗体20mg/ml,20mM组氨酸-盐酸组氨酸,140mM氯化钠,0.02%的聚山梨酯80,pH 7.0。
[权利要求 12]
一种制品,其包含装有权利要求1-11任一项的液体制剂的容器。
[权利要求 13]
如权利要求12所述的制品,其特征在于,所述容器为玻璃瓶,金属合金容器或预充注射器。
[权利要求 14]
权利要求1-11任一项的液体制剂或权利要求12的制品在制备药物中的用途,所述药物用于: (a)预防和/或治疗肿瘤或者贫血病; (b)辅助治疗肿瘤或者贫血病; (c)诊断肿瘤或者贫血病; (d)(a)-(c)的任意组合;
[权利要求 15]
如权利要求14所述的用途,其特征在于,所述药物与另外的药学活性剂分开、联合、同时、或相继施用;其中,另外的药学活性剂是化疗药物。
[权利要求 16]
如权利要求14所述的用途,其特征在于,所述肿瘤选自乳腺癌、肺癌例如非小细胞性肺癌或肺鳞癌、肝癌、胃癌、肠癌例如结肠癌或者直肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、Merkel细胞癌、胆管癌、鼻咽癌、头颈鳞癌、神经胶质瘤、黑素瘤白血病和淋巴瘤。
[权利要求 17]
如权利要求16所述的用途,其特征在于,所述淋巴瘤为霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤;更优选地,所述非霍奇金淋巴瘤为外周T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤和B细胞非霍奇金淋巴瘤中的一种或多种。