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1. WO2020108462 - MONOOXYGÉNASE ET APPLICATION CORRESPONDANTE DANS LA PRÉPARATION DE SULFOXYDE OPTIQUEMENT PUR

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说明书

发明名称 0001   0002   0003   0004   0005   0006   0007   0008   0009   0010   0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061   0062   0063   0064   0065   0066   0067   0068   0069   0070   0071   0072   0073   0074   0075   0076   0077   0078   0079   0080   0081   0082   0083   0084   0085   0086   0087   0088   0089   0090   0091   0092   0093   0094   0095   0096   0097   0098   0099   0100   0101   0102   0103   0104   0105   0106   0107   0108   0109   0110   0111   0112   0113   0114   0115   0116   0117   0118   0119   0120   0121   0122   0123   0124   0125   0126   0127   0128   0129   0130   0131   0132   0133   0134   0135   0136   0137   0138   0139   0140   0141   0142   0143   0144   0145   0146   0147   0148   0149   0150   0151   0152   0153   0154   0155   0156   0157   0158   0159   0160   0161   0162   0163   0164   0165   0166   0167   0168   0169   0170   0171   0172   0173   0174   0175   0176   0177   0178   0179   0180   0181   0182   0183   0184   0185   0186   0187   0188   0189   0190   0191   0192   0193   0194   0195   0196   0197   0198   0199   0200   0201   0202   0203   0204   0205   0206   0207   0208   0209   0210   0211   0212   0213   0214   0215   0216   0217   0218   0219   0220   0221   0222   0223   0224   0225   0226   0227   0228   0229   0230   0231   0232   0233   0234   0235   0236   0237   0238   0239   0240   0241   0242   0243   0244   0245   0246   0247   0248   0249   0250   0251   0252   0253   0254   0255   0256   0257  

权利要求书

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12  

附图

1   2   3   4   5  

说明书

发明名称 : 一种单加氧酶及其在制备光学纯亚砜中的应用

技术领域

[0001]
本发明涉及一种非天然硫醚单加氧酶以及酶法催化硫醚类化合物不对称氧化制备亚砜化合物的应用。

技术背景

[0002]
艾司奥美拉唑,又称(S)-奥美拉唑,化学名为5-甲氧基-2-((S)-((4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲基)亚硫酰基)-1H-苯并咪唑,化学结构如式I所示。艾司奥美拉唑是首个应用于临床的质子泵抑制剂奥美拉唑的(S)-单一构型异构体。该药主要用于治疗十二指肠溃荡、胃溃荡、胃炎以及消化道食管炎。临床上已经证明该药比外消旋体和(R)-奥美拉唑的毒副作用低,且疗效要更好。化学法利用金属催化剂不对称氧化硫醚合成艾司奥美拉唑,但这类方法存在光学纯度受限、过度氧化、副产物多、分离提纯工艺复杂等缺点。
[0003]
[0004]
使用酶法来对硫醚化合物进行不对称氧化,得到单一对映体的手性亚砜,这种方法环境污染小,副产物少,原子经济性好,而且产物光学纯度高,因此利用酶法不对称氧化合成手性亚砜受到了越来越多的关注。
[0005]
发明人也曾筛选获得一株红球菌(CGMCC2547)可催化一系列潜手性苯烷基硫醚及其衍生物的不对称氧化,获得了光学活性的手性苯甲亚砜及其衍生物(CN101372676B)。捷克科学家筛选获得了一株短小芽孢杆菌Lysinibacillus sp.,利用其生长细胞可催化奥美拉唑硫醚生成(S)-奥美拉唑,但当底物浓度仅为0.1g/L时,44h转化率仅为43%(Bioresources Technology 2011,102:7621–7626)。专利WO2011071982对环己酮单加氧酶NCIMB9871进行了定向进化,该工程酶催化100g/L底物上载量,分5批补加冻干酶粉10g/L,底物在反应69h后实现转化,ee值达到99%。在专利WO2011071982公布的突变序列157基础上,专利CN108118035A公开了将突变体157第386位丝氨酸突变成天冬酰胺,第435位丝氨酸突变成苏氨酸,获得的突变体催化底物浓度高达165g/L。虽然这些可以实现不对称氧化奥美拉唑硫醚合成艾司奥美拉唑,但仍然存在着催化活 力低、催化剂加入量大、反应规模局限于实验室规模等问题。
[0006]
发明内容
[0007]
本发明提供的一种单加氧酶,所述单加氧酶包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的突变体,所述突变体的突变方式包括指定位置的氨基酸残基替换,所述指定位置包括如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的Xaa21,Xaa40,Xaa55,Xaa70Xaa143,Xaa145,Xaa156,Xaa185,Xaa220,Xaa244,Xaa246,Xaa248,Xaa249,Xaa277,Xaa281,Xaa326,Xaa386,Xaa388,Xaa390,Xaa405,Xaa426,Xaa430,Xaa432,Xaa433,Xaa435,Xaa438,Xaa465,Xaa468,Xaa488,Xaa489,Xaa490,Xaa497,Xaa501以及Xaa505。
[0008]
在其中一个事实方式中,所述指定位置的氨基酸残基替换包括至少2处指定位置的氨基酸残基替换。
[0009]
在其中的一种实施方式中,所述单加氧酶还可选地包括以下任意一种或多种突变方式,所述突变方式包括:
[0010]
(a)指定位置以外的氨基酸残基替换任意1处或2处或3处或4处或5处;
[0011]
(b)指定位置以外的氨基酸残基缺失任意1处或2处或3处或4处或5处;
[0012]
(c)指定位置以外的氨基酸残基插入任意1处或2处或3处或4处或5处。
[0013]
在其中的一种实施方式中,所述指定位置的氨基酸残基替换包括以下任意一种或几种替换方式:
[0014]
Xaa21由S替换为G;Xaa40由T替换为A;Xaa55由L替换为Y、W、F或N;Xaa70由E替换为G;Xaa143由L替换为P、或A;Xaa145由A替换为S;Xaa156由E替换为G;Xaa185由G替换为A或S;Xaa220由M替换为R;Xaa244由L替换为V、或I;Xaa246由F替换为Y;Xaa248由L替换为E、N、A、或W;Xaa249由N替换为S;Xaa277由F替换为L、V、Y、I、或D;Xaa281由F替换为V、或A;Xaa326由K替换为C、或F;Xaa386由N替换为S;Xaa388由I替换为F、C、K、G;Xaa390由M替换为S、V、I;Xaa405由K替换为M;Xaa426由L替换为F、或P;Xaa430由G替换为T、或S;Xaa432由F替换为L、或I;Xaa433由T替换为C、或A;Xaa435由L替换为S;Xaa438由S替换为I;Xaa465由K替换为R;Xaa468由V替换为A;Xaa488由E替换为K;Xaa489由S替换为C;Xaa490由W替换为R;Xaa497由P替换为S;Xaa501由N替换为Y;Xaa505由F替换为L。
[0015]
在其中的一种实施方式中,所述指定位置的氨基酸残基替换包括以下任意一种替换方式:
[0016]
(1)替换2处,Xaa326由K替换为C,Xaa432由F替换为L;(2)替换2处,Xaa326由 K替换为F,Xaa432由F替换为L;(3)替换2处,Xaa326由K替换为C,Xaa432由F替换为I;
[0017]
(4)替换4处,Xaa326由K替换为C,Xaa432由F替换为L,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I;
[0018]
(5)替换4处,Xaa326由K替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I;
[0019]
(6)替换5处,Xaa326由K替换为C,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为C,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I;
[0020]
(7)替换5处,Xaa326由K替换为C,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I;
[0021]
(8)替换6处,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I;
[0022]
(9)替换6处,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为P,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I;
[0023]
(10)替换7处,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L;
[0024]
(11)替换8处,Xaa143由L替换为P,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L;
[0025]
(12)替换8处,Xaa143由L替换为A,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L;
[0026]
(13)替换8处,Xaa244由L替换为V,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L;
[0027]
(14)替换8处,Xaa244由L替换为I,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L;
[0028]
(15)替换9处,Xaa143由L替换为P,Xaa248由L替换为E,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S, Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L;
[0029]
(16)替换8处,Xaa248由L替换为N,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L;
[0030]
(17)替换8处,Xaa248由L替换为A,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L;
[0031]
(18)替换8处,Xaa248由L替换为W,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L;
[0032]
(19)替换9处,Xaa143由L替换为P,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L;
[0033]
(20)替换9处,Xaa143由L替换为P,Xaa277由F替换为V,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L;
[0034]
(21)替换9处,Xaa143由L替换为P,Xaa277由F替换为Y,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L;
[0035]
(22)替换8处,Xaa277由F替换为I,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L;
[0036]
(23)替换8处,Xaa277由F替换为D,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L;
[0037]
(24)替换8处,Xaa281由F替换为V,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L;
[0038]
(25)替换8处,Xaa281由F替换为A,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I, Xaa505由F替换为L;
[0039]
(26)替换10处,Xaa143由L替换为P,Xaa277由F替换为L,Xaa281由F替换为V,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L;
[0040]
(27)替换10处,Xaa143由L替换为P,Xaa277由F替换为V,Xaa281由F替换为A,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L;
[0041]
(28)替换11处,Xaa143由L替换为P,Xaa200由M替换为R,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa465由K替换为R,Xaa505由F替换为L;
[0042]
(29)替换10处,Xaa143由L替换为P,Xaa185由G替换为A,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L;
[0043]
(30)替换10处,Xaa143由L替换为P,Xaa246由F替换为Y,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L;
[0044]
(31)替换11处,Xaa143由L替换为P,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa405由K替换为M,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa501由N替换为Y,Xaa505由F替换为L;
[0045]
(32)替换10处,Xaa143由L替换为P,Xaa156由E替换为G,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L;
[0046]
(33)替换10处,Xaa143由L替换为P,Xaa249由N替换为S,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L;
[0047]
(34)替换10处,Xaa40由T替换为A,Xaa143由L替换为P,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L;
[0048]
(35)替换11处,Xaa143由L替换为P,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S, Xaa438由S替换为I,Xaa489由S替换为C,Xaa490由W替换为R,Xaa505由F替换为L;
[0049]
(36)替换12处,Xaa143由L替换为P,Xaa246由F替换为Y,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa489由S替换为C,Xaa490由W替换为R,Xaa505由F替换为L;
[0050]
(37)替换13处,Xaa143由L替换为P,Xaa246由F替换为Y,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa489由S替换为C,Xaa490由W替换为R,Xaa501由N替换为Y,Xaa505由F替换为L;
[0051]
(38)替换14处,Xaa143由L替换为P,Xaa246由F替换为Y,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa386由N替换为S,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa489由S替换为C,Xaa490由W替换为R,Xaa501由N替换为Y,Xaa505由F替换为L;
[0052]
(39)替换15处,Xaa143由L替换为P,Xaa246由F替换为Y,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa386由N替换为S,Xaa388由I替换为F,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa489由S替换为C,Xaa490由W替换为R,Xaa501由N替换为Y,Xaa505由F替换为L;
[0053]
(40)替换16处,Xaa143由L替换为P,Xaa246由F替换为Y,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa386由N替换为S,Xaa388由I替换为K,Xaa390由M替换为I,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa489由S替换为C,Xaa490由W替换为R,Xaa501由N替换为Y,Xaa505由F替换为L;
[0054]
(41)替换16处,Xaa143由L替换为P,Xaa246由F替换为Y,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa386由N替换为S,Xaa388由I替换为K,Xaa390由M替换为I,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa488由E替换为K,Xaa489由S替换为C,Xaa490由W替换为R,Xaa505由F替换为L;
[0055]
(42)替换19处,Xaa21由S替换为G,Xaa55由L替换为Y,Xaa70由E替换为G,Xaa143由L替换为P,Xaa246由F替换为Y,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa386由N替换为S,Xaa388由I替换为K,Xaa390由M替换为I,Xaa426由L替换为F,Xaa432 由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa489由S替换为C,Xaa490由W替换为R,Xaa501由N替换为Y,Xaa505由F替换为L;
[0056]
(43)替换21处,Xaa21由S替换为G,Xaa55由L替换为Y,Xaa70由E替换为G,Xaa143由L替换为P,Xaa185由G替换为S,Xaa246由F替换为Y,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa386由N替换为S,Xaa388由I替换为K,Xaa390由M替换为I,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa489由S替换为C,Xaa490由W替换为R,Xaa497由P替换为S,Xaa501由N替换为Y,Xaa505由F替换为L;
[0057]
(44)替换22处,Xaa21由S替换为G,Xaa55由L替换为Y,Xaa70由E替换为G,Xaa143由L替换为P,Xaa145由A替换为S,Xaa185由G替换为S,Xaa246由F替换为Y,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa386由N替换为S,Xaa388由I替换为K,Xaa390由M替换为I,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa489由S替换为C,Xaa490由W替换为R,Xaa497由P替换为S,Xaa501由N替换为Y,Xaa505由F替换为L;
[0058]
(45)替换23处,Xaa21由S替换为G,Xaa55由L替换为Y,Xaa70由E替换为G,Xaa143由L替换为P,Xaa145由A替换为S,Xaa185由G替换为S,Xaa246由F替换为Y,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa386由N替换为S,Xaa388由I替换为K,Xaa390由M替换为I,Xaa426由L替换为F,Xaa430由G替换为T,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa489由S替换为C,Xaa490由W替换为R,Xaa497由P替换为S,Xaa501由N替换为Y,Xaa505由F替换为L。
[0059]
本发明还提供了一种单加氧酶,所述单加氧酶的氨基酸序列:如SEQ ID NO:4所示,或如SEQ ID NO:6所示,或如SEQ ID NO:8所示,或如SEQ ID NO:10所示,或如SEQ ID NO:12所示,或如SEQ ID NO:14所示,或如SEQ ID NO:16所示,或如SEQ ID NO:18所示,或如SEQ ID NO:20所示,或如SEQ ID NO:22所示,或如SEQ ID NO:24所示,或如SEQ ID NO:26所示,或如SEQ ID NO:28所示,或如SEQ ID NO:30所示,或如SEQ ID NO:32所示,或如SEQ ID NO:34所示,或如SEQ ID NO:36所示,或如SEQ ID NO:38所示,或如SEQ ID NO:40所示,或如SEQ ID NO:42所示,或如SEQ ID NO:44所示,或如SEQ ID NO:46所示,或如SEQ ID NO:48所示,或如SEQ ID NO:50所示,或如SEQ ID NO:52所示,或如SEQ ID NO:54所示,或如SEQ ID NO:56所示,或如SEQ ID NO:58所示,或如SEQ ID NO:60所示,或如SEQ ID NO:62所示,或如SEQ ID NO:64所示,或如SEQ ID NO:66所示,或如SEQ ID NO:68 所示,或如SEQ ID NO:70所示,或如SEQ ID NO:72所示,或如SEQ ID NO:74所示,或如SEQ ID NO:76所示,或如SEQ ID NO:78所示,或如SEQ ID NO:80所示,或如SEQ ID NO:82所示,或如SEQ ID NO:90所示,或如SEQ ID NO:92所示,或如SEQ ID NO:94所示,或如SEQ ID NO:96所示,或如SEQ ID NO:98所示。
[0060]
本发明还提供了一种分离的核酸,所述核酸编码上述的单加氧酶。
[0061]
本发明还提供了一种重组表达载体,所述重组表达载体包含如上所述的核酸。
[0062]
本发明一种重组表达转化体,所述重组表达转化体包含如上所述的重组表达载体。
[0063]
本发明还提供了一种如上所述的单加氧酶的制备方法,包括以下步骤:培养如上所述的重组表达转化体,从中分离所述单加氧酶。
[0064]
本发明还提供了一种如上所述的单加氧酶在不对称催化氧化潜手性硫醚化合物为亚砜化合物中的应用。
[0065]
在其中的一个实施方式中,所述潜手性硫醚化合物选自以下任一化学式所示的化合物:
[0066]
[0067]
需要说明的是本发明中“Xaa数字”表示氨基酸序列中第“数字”位的氨基酸残基,例如 “Xaa40”表示氨基酸序列中第“40”位的氨基酸残基。
[0068]
本发明中“氨基酸残基(a)+Xaa数字”表示氨基酸序列中第“数字”位的氨基酸残基为“氨基酸残基(a)”,也可简写为“氨基酸残基(a)+数字”;例如“K326”表示氨基酸序列中第“326”位的氨基酸残基为“K”(赖氨酸)。
[0069]
本发明中“氨基酸残基(a)+Xaa数字+氨基酸残基(b)”表示氨基酸序列中第“数字”位的氨基酸残基由“氨基酸残基(a)”替换为“氨基酸残基(b)”,也可简写为“氨基酸残基(a)+数字+氨基酸残基(b)”;例如“K326C”表示氨基酸序列中第“326”位的氨基酸残基由“K”(赖氨酸)替换为“C”(半胱氨酸)。
[0070]
本发明中,除非有特别说明,否则“Xaa数字”、“氨基酸残基(a)+Xaa数字”、“氨基酸残基(a)+数字”、“氨基酸残基(a)+Xaa数字+氨基酸残基(b)”、“氨基酸残基(a)+数字+氨基酸残基(b)”中的“数字”,是指以SEQ ID NO:2中的氨基酸位点为基准。
[0071]
为了克服现有技术的缺陷,本发明解析不动杆菌硫醚单加氧酶的晶体结构,建立高通量的平板透明圈筛选方法,结合理性设计和高通量筛选,获得的单加氧酶催化活力高,反应作为催化剂加入量小,显著提高了酶的催化活力和催化反应的时空产率,反应规模不仅仅局限于实验室规模,为手性亚砜药物的工业合成提供了新的生物催化剂资源。
[0072]
本发明与现有不对称氧化的其他方法相比,使用本发明的单加氧酶制备手性亚砜类药物具有反应条件温和、环境友好、产率高、产品光学纯度高、过氧化产物少等优势,在胃溃疡治疗药质子泵抑制剂的生产中具有很好的工业应用前景。

附图说明

[0073]
图1为重组质粒pET28a-AcPSMO的构建图;
[0074]
图2为单加氧酶AcPSMO的底物通道及其关键位点图;
[0075]
图3为单加氧酶AcPSMO结构中影响副产物产生的关键位点图;
[0076]
图4为结晶级纯化SDS-PAGE图,其中泳道1为破碎液,2为Ni洗脱液,3为分子筛上样前样品,4-12为分子筛分离后样品;
[0077]
图5为平板透明圈筛选法的构建图,其中左图中“+”和“-”分别表示AcPSMO突变体和AcPSMO(SEQ ID NO:2),右图为实际突变体库的筛选。

具体实施方式

[0078]
本发明通过生物信息学的方法,分析预测可能对硫醚具有氧化活性的单加氧酶基因,成功 对多个单加氧酶基因进行克隆表达,并验证其功能;其中部分验证结果如表1所示。其中从醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)中克隆的酶序列WP_045432192.1(NCBI Reference Sequence:WP_045432192.1;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),重组表达的硫醚单加氧酶可高效催化苯甲硫醚(式IIa化合物)氧化为苯甲亚砜(式IIb化合物),将该硫醚单加氧酶命名为AcPSMO,其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0079]
表1硫醚单加氧酶催化苯甲硫醚为苯甲亚砜
[0080]
[0081]
[0082]
本发明采用的醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC,北京市朝阳区北辰西路1号院3号),保藏时间为:2014年03月20日,其保藏编号为:CGMCC No.8936。该菌株在提交保藏时,保藏证明文件中菌株命名为不动杆菌(Acinetobacter sp.)。Acinetobacter表示属名,calcoaceticus表示种名,sp.表示种名未定,在提交保藏后至本专利申请提交之日,发明人将生物保藏证明中的不动杆菌(Acinetobacter sp.)进一步鉴定到钟,即为醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)。
[0083]
天然存在的单加氧酶AcPSMO催化加氧制备某些亚砜化合物的催化活力较低,例如氧化奥美拉唑硫醚(式IIIa化合物)为式IIIb化合物等,本发明通过解析单加氧酶AcPSMO的晶体结构,创造性地发现,某些位点的氨基酸残基是影响底物进入催化中心、影响催化活力的关键,并通过大量的研究,提供了一种单加氧酶,该单加氧酶的氨基酸序列是由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列通过包括替换指定位置的氨基酸残基的任意2处或2处以上的获得;例如可以是通过替换指定位置的氨基酸残基的任意2处、3处、4处、5处、6处、7处、8处、9处、10处、11处、12处、13处、14处、15处、16处、17处、18处、19处、20处、21处、22处、23处、24处、25处、 26处、27处、28处、29处、30处、31处、32处、33处、或34处。
[0084]
指定位置的氨基酸残基选自:Xaa21,Xaa40,Xaa55,Xaa70,Xaa143,Xaa145,Xaa156,Xaa185,Xaa220,Xaa244,Xaa246,Xaa248,Xaa249,Xaa277,Xaa281,Xaa326,Xaa386,Xaa388,Xaa390,Xaa405,Xaa426,Xaa430,Xaa432,Xaa433,Xaa435,Xaa438,Xaa465,Xaa468,Xaa488,Xaa489,Xaa490,Xaa497,Xaa501,Xaa505。
[0085]
进一步可选地,替换指定位置的氨基酸残基选自包括以下替换方式:
[0086]
Xaa21由S替换为G;Xaa40由T替换为A;Xaa55由L替换为Y、W、F或N;Xaa70由E替换为G;Xaa143由L替换为P、或A;Xaa145由A替换为S;Xaa156由E替换为G;Xaa185由G替换为A或S;Xaa220由M替换为R;Xaa244由L替换为V、或I;Xaa246由F替换为Y;Xaa248由L替换为E、N、A、或W;Xaa249由N替换为S;Xaa277由F替换为L、V、Y、I、或D;Xaa281由F替换为V、或A;Xaa326由K替换为C、或F;Xaa386由N替换为S;Xaa388由I替换为F、C、K、G;Xaa390由M替换为S、V、I;Xaa405由K替换为M;Xaa426由L替换为F、或P;Xaa430由G替换为T、或S;Xaa432由F替换为L、或I;Xaa433由T替换为C、或A;Xaa435由L替换为S;Xaa438由S替换为I;Xaa465由K替换为R;Xaa468由V替换为A;Xaa488由E替换为K;Xaa489由S替换为C;Xaa490由W替换为R;Xaa497由P替换为S;Xaa501由N替换为Y;Xaa505由F替换为L。
[0087]
通过上述替换方式,或可以促进底物进入活化中心,提高催化活力;或可以减少反应副产物,提高产物纯度。
[0088]
天然存在的单加氧酶AcPSMO能够氧化苯甲硫醚(式IIa化合物)转化为苯甲亚砜(式IIb化合物),但氧化奥美拉唑硫醚(式IIIa化合物)为式IIIb化合物的活性很低。请参阅图2所示,本发明解析了单加氧酶AcPSMO的晶体结构,预测了底物的进出通道,发现式IIIa化合物进入通道存在明显的瓶颈部分,其中残基L143、K326、L426、F432、T433、S438和F505是影响底物式IIIa化合物进入催化中心的关键。
[0089]
[0090]
[0091]
在一些实施方案中,针对上述关键位点改造获得的单加氧酶AcPSMO突变体催化底物特异性发生了改变,能够将式IIIa化合物转化为式IIIb化合物的活力提高5倍以上。示例性的单加氧酶AcPSMO突变体氨基酸序列选自:SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26;其相对于单加氧酶AcPSMO(SEQ ID NO:2)对式IIIa化合物的氧化活力如表2所示;(S)-式IIIb化合物即为艾司奥美拉唑。
[0092]
表2具有改善性质的单加氧酶AcPSMO突变体
[0093]
[0094]
在酶催化氧化式IIIa化合物的反应过程中会过度氧化式IIIb化合物,产生副产物式IIIc化合物,最终导致目标产物式IIIb化合物的纯度和产量的大幅度下降,不利于工业生产。请参阅图3所示,本发明基于解析的单加氧酶AcPSMO晶体结构,发现了影响底物选择性和过氧化副产物式IIIc化合物生成的关键位点是F277、L248、L244和F281。
[0095]
[0096]
在一些实施方案中,针对上述关键位点改造获得的单加氧酶AcPSMO突变体降低副产物式IIIc化合物的产生,对式IIIa化合物活力与式IIIb化合物氧化活力比值相比SEQ ID NO:22提高1.5倍以上。示例性的单加氧酶AcPSMO突变体氨基酸序列选自:SEQ ID NO:28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56;其相对于SEQ ID NO:22的底物选择性提高倍数如表3所示;表3中式IIIb化合物为S构型式IIIb化合物。
[0097]
表3具有降低副产物产生的单加氧酶AcPSMO突变体
[0098]
[0099]
基于底物式IIIa化合物和产物式IIIb化合物的溶解度差异,本发明提供了平板透明圈高通量 筛选方法。底物式IIIa化合物溶液平铺在平板上呈现出乳白色不透明状态,当菌落生长12h以后表达多肽将部分式IIIa化合物转化为产物式IIIb化合物,产物式IIIb化合物因溶解度比化合物IIIa更高,逐渐产生透明圈。采用定向进化构建突变体库,基于此透明圈法筛选活性更高的酶。
[0100]
在一些实施方案中,基于上述高通量透明圈筛选方法,获得的单加氧酶AcPSMO突变体能够以大于SEQ ID NO:40活力1.5倍将式IIIa化合物转化为式IIIb化合物,所述单加氧酶AcPSMO突变体的氨基酸序列选自:SEQ ID NO:58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、90、92、94、96、98。
[0101]
表4基于高通量筛选获得的具有改善性质的单加氧酶AcPSMO突变体
[0102]
[0103]
[0104]
可选地,针对指定位置以外的氨基酸残基,可以通过替换、缺失、插入任意一种或多种突变方式进一步地处理。上述突变方式包括:
[0105]
(a)指定位置以外的氨基酸残基替换任意1处或2处或3处或4处或5处;
[0106]
(b)指定位置以外的氨基酸残基缺失任意1处或2处或3处或4处或5处;
[0107]
(c)指定位置以外的氨基酸残基插入任意1处或2处或3处或4处或5处。
[0108]
需要说明的是,此处氨基酸残基的替换(缺失、插入)1处或2处或3处或4处或5处是指替换(缺失、插入)氨基酸残基1个或2个或3个或4个或5个。
[0109]
本发明提供了一种编码单加氧酶AcPSMO突变体的核酸序列,所述核酸分子包括但不限于:从生物体内提取天然存在的编码单加氧酶AcPSMO的核酸分子,通过基因克隆技术对已有核酸片段进行基因工程操作制得的编码单加氧酶AcPSMO突变体的核酸分子,或通过人工合成方法得到的编码所述单加氧酶AcPSMO突变体的核酸分子。术语“核酸”和“核酸分子”在本文中可互换使用,指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。
[0110]
本发明提供了一种重组表达载体,该重组表达载体包含编码如上所述的单加氧酶AcPSMO突变体的核酸序列。由于密码子的简并性,编码同一个单加氧酶AcPSMO突变体的核酸序列有可能不是唯一的。所述重组表达载体可通过本领域常规方法将编码如上所述的单加氧酶AcPSMO突变体的核酸序列连接于各种合适载体上构建而成。其中,载体可以是本领域的各种常规载体,如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等;进一步地,载体优选质粒,根据本领 域常规的技术手段制备的重组表达载体为重组表达质粒,更优选的质粒为质粒pET28a。
[0111]
本发明提供了一种重组表达转化体,该重组表达转化体包含如上所述的重组表达载体。可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞中来制得重组表达转化体。其中,宿主细胞可以是本领域的各种常规宿主细胞,前提是能使该重组表达载体稳定地自行复制,且其所携带的单加氧酶的分离基因可被有效表达。本发明优选大肠杆菌,优选大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)。
[0112]
将通过PCR扩增所得的包含单加氧酶AcPSMO基因(如SEQ ID NO:1所示)的PCR产物用限制性内切酶Nde I和Hind III双酶切,形成互补的粘性末端,同时将表达载体pET28a用限制性内切酶Nde I和Hind III双酶切,经T4 DNA连接酶连接经过酶切的基因片段和表达载体生成含有本发明的单加氧酶基因的重组表达质粒pET28a-AcPSMO,如图1所示。将所述重组表达质粒pET28a-AcPSMO转化至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中,即可获得重组表达单加氧酶AcPSMO的基因工程菌株,即大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28a-AcPSMO。采用类似的方法,可以很方便地获得表达本发明所述的单加氧酶AcPSMO的各种突变体的基因工程菌株;或者以pET28a-AcPSMO或其突变体为模板,通过定点突变或随机突变的方法,获得表达如上所述的单加氧酶AcPSMO突变体的重组质粒,进而获得表达本发明所述的单加氧酶AcPSMO的各种突变体的基因工程菌株。
[0113]
本发明公开了一种上述单加氧酶的制备方法,培养上述的重组表达转化体,然后从中分离单加氧酶。
[0114]
本发明所述重组表达转化体的培养方法和培养条件没有特殊的限制,可以根据宿主细胞类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择,只要使转化体能够生长并高效产生本发明所述单加氧酶AcPSMO突变体即可。当本发明所述重组表达转化体是大肠杆菌时,优选LB培养基进行重组表达转化体的培养以及诱导产酶,该培养基含有蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L,NaCl 10g/L,pH7.0。重组表达转化体的培养和单加氧酶AcPSMO突变体的产生,可优选下述方法:将本发明涉及的重组大肠杆菌(优选E.coli BL21(DE3))接种至含卡那霉素的LB培养基中培养,当培养液的光密度OD 600达到0.5~0.7(优选0.6)时,在终浓度为0.1~1.0mmol/L(优选0.2mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和50~100mg/L维生素B的诱导下,即可高效表达本发明的重组单加氧酶。
[0115]
可以通过本领域常规的技术手段从所述重组表达转化体分离获得单加氧酶AcPSMO突变体。示例性的方法为:将重组大肠杆菌的发酵液(包括但不限于摇瓶培养、发酵罐培养)离心,收集重组大肠杆菌细胞。细胞用磷酸钾缓冲液(KPB缓冲液,例如100mM、pH=9.0)重悬,然后进行超声破碎或高压匀浆破碎。破碎液离心取上清酶液,上清酶液还可以通过冷冻干燥制成 冻干酶粉。示例性的超声破碎条件为,超声破碎仪的设定功率为400W,工作4s,间歇6s,共循环99次。示例性的高压匀浆破碎条件为,700~800bar,2cycles。
[0116]
本发明还提供了一种上述单加氧酶AcPSMO突变体在不对称催化氧化潜手性硫醚化合物中的应用。优选地,所述单加氧酶将所述潜手性硫醚化合物不对称催化氧化为亚砜化合物。优选地,所述潜手性硫醚化合物选自式IIIa化合物或以下任一化学式所示的化合物:
[0117]
[0118]
其中,本发明中将上述式IIIa、IVa、Va、VIa、VIIa的化合物分别以奥美拉唑硫醚、兰索拉唑硫醚、泮托托拉唑硫醚、雷贝拉唑硫醚、艾普拉唑硫醚进行命名,当然,在其他文献中也可以以不同的命名方式命名。
[0119]
利用本发明所述单加氧酶AcPSMO突变体将潜手性硫醚化合物不对称催化氧化为亚砜化合物,所涉及的具体反应条件如底物浓度、pH、缓冲液组成、酶用量等可按本领域此类反应的常规条件进行选择。进一步地,不对称催化氧化反应可在振荡或搅拌条件下进行。
[0120]
在一些实施方案中,将收获的上清酶液或者冻干酶粉,悬浮于pH为8.5~10的磷酸钾缓冲溶液中,加入底物式IIIa溶液,在20~35℃反应6~48小时。
[0121]
在一些实施方案中,采用共溶剂助溶硫醚底物,例如甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、丙酮、叔丁醇、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSO),添加比例为2%~10%(体积比);同时添加羟丙基-β-环糊精、聚乙二醇、Triton、Span或吐温添加剂使底物分散更好,添加比例为0.1%~1.5%(重量比)。
[0122]
在一些实施方案中,采用辅因子再生系统将NADP +再生为NADPH,例如利用甲酸脱氢酶氧化甲酸盐生成CO 2或者醇脱氢酶氧化异丙醇生成丙酮实现还原性辅因子的再生。
[0123]
本发明所述单加氧酶AcPSMO或其突变体对式IIIa化合物或式IIIb化合物的活力可用如下方法测定:将含1mmol/L式IIIa化合物或式IIIb化合物和0.2mmol/L NADPH的0.5mL反应体系(100mmol/L KPB缓冲液,pH9.0)预热至30℃,然后加入适量的硫醚单加氧酶,30℃保温震荡反应,在液相色谱上检测产物的生成。
[0124]
本发明所述单加氧酶AcPSMO或其突变体氧化式IIIa化合物转化率可用如下方法测定:2mmol/L式IIIa化合物和2mmol/L NADPH的0.5mL反应体系(100mmol/L KPB缓冲液,pH9.0,2%(v/v)DMSO)预热至30℃,然后加入适量的硫醚单加氧酶,30℃保温震荡反应,在液相色谱上检测产物的生成。
[0125]
本发明采用蛋白质工程手段对单加氧酶AcPSMO进行多轮分子改造,构建的单加氧酶AcPSMO突变体可以将式IIIa化合物转化为式IIIb化合物,并且具有更高的活性、热稳定性和产物得率。
[0126]
以下实施例是对本发明进行的进一步的阐述,而不是对本发明保护范围的限制。如无特别说明,所用的原料和试剂均为普通市售产品,所采取的方法和操作方式均为本领域常规方式。
[0127]
实施例1单加氧酶AcPSMO的基因克隆
[0128]
根据单加氧酶AcPSMO的开放阅读框,设计上、下游引物如下:
[0129]
上游引物SEQ ID NO:83:
[0130]
GGGAATTC CATATGATGACCCAGAAGATGGACTT
[0131]
下游引物SEQ ID NO:84:
[0132]
CCC AAGCTTTTAGCTTTCGATCAGGTTGG
[0133]
其中,上游引物划线部分为Nde I酶切位点,下游引物划线部分为Hind III酶切位点。
[0134]
以醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)WP_045432192.1的基因组DNA为模板,进行PCR扩增。PCR体系为:2×Taq PCR MasterMix 25μL,上游引物和下游引物(10ng/μL)各2.5μL,基因组DNA(100ng/μL)1μL和ddH 2O 19μL。PCR扩增程序为:95℃预变性5分钟后进行32次如下循环:94℃变性30秒,50℃退火40秒,72℃延伸1.5分钟;最后72℃再延伸10分钟。PCR扩增产物进行凝胶电泳纯化后,用DNA回收试剂盒回收目的片段。经过DNA测序,该序列中编码的开放阅读框全长1629bp,其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
[0135]
实施例2单加氧酶AcPSMO重组表达质粒和重组表达转化体的制备
[0136]
如图1所示,将实施例1中PCR扩增所得的单加氧酶AcPSMO目的片段以及pET28a空质粒同时用限制性内切酶Nde I和Hind III双酶切过夜,然后经琼脂糖凝胶电泳纯化、DNA试 剂盒回收。将回收的经酶切目的片段和空质粒载体在T4 DNA连接酶的作用下,于4℃连接12小时,得到重组质粒pET28a-AcPSMO。
[0137]
将所得重组质粒转化至E.coli BL21(DE3),涂布到含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板上,37℃培养12~16小时,对长出来的菌落进行菌落PCR验证,挑取菌落PCR扩增出长度约1629bp的目的条带的阳性克隆。测序验证后获得重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET28a-AcPSMO。
[0138]
实施例3单加氧酶酶AcPSMO的诱导表达及活力测定
[0139]
将实施例2中所得的重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET28a-AcPSMO,接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中,37℃摇床振荡培养12小时,之后按1%(v/v)的接种量接种至装有100mL的LB培养基的500mL三角瓶中,放入37℃、180rpm摇床振荡培养,当培养液的OD 600达到0.6时,加入IPTG至终浓度0.1mmol/L、复合维生素B终浓度70mg/L进行诱导,16℃诱导24h后,将培养液以15000rpm转速离心5分钟,收集细胞,并用生理盐水洗涤,得到静息细胞。将所得细胞用10mL的KPB缓冲液(100mM,pH9.0)重悬,冰水浴中进行如下超声处理:400W功率,工作4s,间歇6s,进行99个循环,4℃下15000rpm离心40min,收集上清酶液,冻干制得冻干酶粉。按实施例8所述方法进行活力测定(对式IIIa化合物氧化活力的测定),活力为58U/g冻干酶粉。
[0140]
实施例4单加氧酶AcPSMO的纯化、结晶和结构解析
[0141]
(1)结晶级蛋白纯化
[0142]
Ni亲和自装柱纯化过程中使用的缓冲液为:A液:50mM KPB pH8.0,500mM NaCl,10mM咪唑,2mMβ-巯基乙醇;B液:50mM KPB pH8.0,500mM NaCl,300mM咪唑,2mMβ-巯基乙醇;C液:50mM KPB pH9.0,150mM NaCl,1mM DTT。纯化方法如下:
[0143]
a)菌体用A液重悬后超声破碎,破碎后的液体用低温高速离心机在4℃离心,12000rpm离心45min,离心后的上清液暂时保存在4℃冰箱或冷库里;
[0144]
b)Ni柱用5~10倍柱体积的A液预先平衡;
[0145]
c)步骤a)保存的上清液上样;
[0146]
d)上样完成后用5~10倍柱体积的A和B混合液(10%B液,体积比)洗去杂蛋白;
[0147]
e)用1个柱体积的B液洗脱目的蛋白并收集;
[0148]
f)收集到的目的蛋白用30kDa的超滤管进行浓缩;
[0149]
g)用1个柱体积纯水冲洗分子筛凝胶柱,然后用1个柱体积C液平衡柱子,流速设为0.5mL/min(可以根据柱压进行调整);
[0150]
h)步骤f)获得的蛋白上样至凝胶柱,上样体积2mL,蛋白浓度控制在10mg/mL以内;
[0151]
i)洗脱:用C液洗脱蛋白,根据280nm处的出峰时间收集目标蛋白,收集到的蛋白通过SDS-PAGE验证纯度,如图4所示;
[0152]
j)纯度达到要求的样品合并后用30kDa超滤管超滤浓缩至合适浓度,分装后用液氮速冻,并保存于-80℃超低温冰箱。
[0153]
(2)晶体初筛与条件优化
[0154]
将步骤(1)得到的高纯度酶液放置于冰上解冻并于4℃离心去除沉淀。在晶体生长条件筛选之前先用Pre Crystallization Test(PCT)试剂盒进行蛋白结晶浓度的筛选,根据蛋白的沉淀情况最终选择14mg/mL作为结晶蛋白浓度。将目标蛋白用C液稀释至该浓度后开始晶体初筛。
[0155]
首先将结晶试剂盒中的结晶试剂分装到96孔座滴平板中,每个槽中分装75μL;在每个座滴小孔中加入1μL稀释好的酶液和1μL对应槽液,充分混匀但注意不要有气泡产生;用密封膜将加好的结晶初筛板密封后,放入18℃恒温结晶培养箱中;晶体生长一段时间(三天)以后,定期用SX10型显微镜观察晶体生长情况;如果发现初筛板中有晶体长出的条件,记录该条件并查找对应的槽液成分,并在24孔结晶复筛板中进行条件优化,主要是优化晶体生长的pH、沉淀剂浓度、盐浓度等,每个复筛板上优化一个初筛条件;从晶体复筛板上用大小合适的cryoloop捞取生长较好的单颗晶体,快速放置于冷冻保护剂中,在冷冻保护剂中平衡一定时间后迅速放置于液氮中冷冻保存。这里我们对冷冻保护剂进行了优化,分别优化了不同浓度的甘油、PEG和重油,最后选择15%的甘油作为冷冻保护剂。
[0156]
(3)晶体的X-ray衍射数据采集和处理
[0157]
将冻存于液氮中的晶体用cryotong等晶体转移工具放置于上海同步辐射中心(上海光源,Shanghai Synchrotron Radiation Facility)BL17U或BL19U X-ray衍射仪的测角器上,并调整晶体的位置后收集X-ray衍射数据。收集到的衍射数据为图谱形式,通过HKL2000进行数据预处理。预处理包括Index、Integrate以及Scale三个步骤,经过这三个步骤处理后会生成sca和log格式文件,可用于晶体数据的后续处理。
[0158]
后处理中主要用到三个软件:CCP4、Phenix和Coot。具体处理流程如下:
[0159]
1)在CCP4中用scalepack2mtz程序打开预处理生成的sca文件并将其转换为mtz格式的文件,用Mattews coef程序来计算每个不对称单元中的蛋白分子个数,完成后用Phaser MR程序进行同源分子置换,这里使用RmCHMO(PDB ID:3UCL)为分子置换的模板,最后会生成一个pdb格式文件,这也是目标蛋白的初步三维结构文件;
[0160]
2)在Phenix软件中对初步得到的结构文件进行自动优化;
[0161]
3)在Coot软件中通过电子云密度及一级序列中氨基酸残基的骨架对结构进行精修,使R-free、R-work和拉式图等参数达到标准,最后得到单加氧酶AcPSMO的完整晶体结构。
[0162]
实施例5单加氧酶AcPSMO的定点突变
[0163]
以pET28a_AcPSMO(实施例2)作为模板,以SED ID NO:85和SED ID NO:86为上下游引物,用Primer Star聚合酶进行高保真PCR。反应体系如下:质粒模板(100ng/μL),上下游引物(10ng/μL)各0.5μL,DMSO 0.3μL,ddH 2O 8μL,2×Prime Star 10μL。PCR反应程序:95℃预变性3分钟,98℃变性30秒,55℃退火15秒,72℃延伸7.5分钟;最后72℃再延伸5分钟。PCR产物经过Dpn I消化3~5h后将消化产物转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞并涂布于含有卡那霉素的平板中,置于37℃培养箱中静置培养约12~16h。将所得到的单克隆菌落进行测序后,利用试剂盒抽取其质粒。以该质粒作为模板,SED ID NO:87和SED ID NO:88为上下游引物重复上述PCR、消化和转化步骤后,将所得到的单克隆菌落进行测序,其碱基序列如SEQ ID NO:3所示,表达的单加氧酶AcPSMO突变体氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0164]
上游引物SEQ ID NO:85:
[0165]
ACCGACCTGTACGCG TGCCGTCCGCTGTGCGAT
[0166]
下游引物SEQ ID NO:86:
[0167]
ATCGCACAGCGGACG GCACGCGTACAGGTCGGT
[0168]
上游引物SEQ ID NO:87:
[0169]
GGCCCGAACGGTCCG CTGACCAACCTGCCGCCG
[0170]
上游引物SEQ ID NO:88:
[0171]
CGGCGGCAGGTTGGT CAGCGGACCGTTCGGGCC
[0172]
采用与获得SEQ ID NO:4所示单加氧酶AcPSMO突变体相似的方法,通过合适的上下游引物,可以获得以下单加氧酶AcPSMO突变体:
[0173]
氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:5所示);
[0174]
氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:7所示);
[0175]
氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:9所示);
[0176]
氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:11所示);
[0177]
氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:13所示);
[0178]
氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:15所示);
[0179]
氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:17所示);
[0180]
氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:19所示);
[0181]
氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:21所示);
[0182]
氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:23所示);
[0183]
氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:25所示);
[0184]
氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:27所示);
[0185]
氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:29所示);
[0186]
氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:31所示);
[0187]
氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:33所示);
[0188]
氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:35所示);
[0189]
氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:37所示);
[0190]
氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:39所示);
[0191]
氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:41所示);
[0192]
氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:43所示);
[0193]
氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:45所示);
[0194]
氨基酸序列如SEQ ID NO:48所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:47所示);
[0195]
氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:49所示);
[0196]
氨基酸序列如SEQ ID NO:52所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:51所示);
[0197]
氨基酸序列如SEQ ID NO:54所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:53所示);
[0198]
氨基酸序列如SEQ ID NO:56所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:55所示)。
[0199]
实施例6单加氧酶AcPSMO突变体高通量筛选方法的建立
[0200]
当式IIIa化合物和助溶剂DMSO按一定比例添加时,在溶液中呈现出乳白色,随着反应进行过程中底物消耗及产物产生,溶液会逐渐向透明的方向转变。基于此现象建立了一种可用于判断式IIIa化合物氧化活力的高通量平板透明圈筛选法。筛选平板为LB固体平板,并加入50μg/mL的卡那霉素、0.1mM终浓度的IPTG、2mM式IIIa化合物及1%v/v的助溶剂DMSO。筛选平板在30℃的恒温培养箱中培养12h以上,观察透明圈的产生情况,有明显透明圈(比空白对照大)的潜在阳性克隆子被挑选出来。照片如图5所示。
[0201]
实施例7硫醚单加氧酶AcPSMO随机突变体的构建
[0202]
采用易错PCR技术构建硫醚单加氧酶AcPSMO的随机突变库:以实施例5中制备的用于表达SEQ ID NO:40所示单加氧酶AcPSMO突变体的重组质粒作为模板,以For_Nde I和Rev_Hind III为引物,用Taq DNA聚合酶进行易错PCR。为了获得合适的突变率,选择一系列不同的MnCl 2浓度梯度(100μM~300μM的MnCl 2)构建突变库。PCR反应条件如下:总体积为50μL 的PCR反应体系中,加入模板0.5~20ng,5μL 10×PCR buffer(Mg 2+Plus),4μL dNTP(各2.0mM),5μL MnCl 2(1mM),一对突变引物各2μL(10μM),0.25μL Taq DNA polymerase,加灭菌蒸馏水至50μL。PCR反应程序:(1)95℃变性3min;(2)94℃变性10sec;(3)60℃退火30sec;(4)72℃延伸90sec;步骤(2)~(4)共进行30个循环,最后72℃延伸10min,4℃保存产物。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶纯化回收,对回收之后的目的基因及pET28a用限制性内切酶Nde I和Hind III在37℃双酶切3~5h。双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶纯化回收,用T4 DNA连接酶将得到的线性化pET28a质粒与目的基因片段置于16℃进行连接。将连接产物转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞并涂布于含有卡那霉素的平板中,置于37℃培养箱中静置培养约12~16h。将平板上的转化子转移至含有1mM卡那霉素、1%(v/v)DMSO、0.1mM IPTG、2mM底物(式IIIa化合物)的平板上,37℃培养12~14h,通过实施例6的方法进行活性筛选,将产生透明圈的转化子进行试管扩大培养。对活性较高的突变体进行纯化表征,对相应基因进行测序。
[0203]
获得了以下单加氧酶AcPSMO突变体:
[0204]
氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:57所示);
[0205]
氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:59所示);
[0206]
氨基酸序列如SEQ ID NO:62所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:61所示);
[0207]
氨基酸序列如SEQ ID NO:64所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:63所示);
[0208]
氨基酸序列如SEQ ID NO:66所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:65所示);
[0209]
氨基酸序列如SEQ ID NO:68所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:67所示);
[0210]
氨基酸序列如SEQ ID NO:70所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:69所示);
[0211]
氨基酸序列如SEQ ID NO:72所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:71所示);
[0212]
氨基酸序列如SEQ ID NO:74所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:73所示);
[0213]
氨基酸序列如SEQ ID NO:76所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:75所示);
[0214]
氨基酸序列如SEQ ID NO:78所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:77所示);
[0215]
氨基酸序列如SEQ ID NO:80所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:79所示);
[0216]
氨基酸序列如SEQ ID NO:82所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:81所示);
[0217]
氨基酸序列如SEQ ID NO:90所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:89所示);
[0218]
氨基酸序列如SEQ ID NO:92所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:91所示);
[0219]
氨基酸序列如SEQ ID NO:94所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:93所示);
[0220]
氨基酸序列如SEQ ID NO:96所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:95所示);
[0221]
氨基酸序列如SEQ ID NO:98所示(相应的碱基序列如SEQ ID NO:97所示)。
[0222]
需要补充说明的是,本实施例通过随机突变获得的单加氧酶AcPSMO突变体,通过测序获知其氨基酸序列和/或核酸序列后,本领域技术人员也可以通过实施例5所述的定点突变技术来制备获得。
[0223]
实施例8分析方法
[0224]
1)单加氧酶AcPSMO及其突变体对式IIIa化合物氧化活力的测定
[0225]
测定方法:500μL反应体系中加入390μL 50mM、pH 9.0的KPB缓冲液,50μL 10mM底物溶液(式IIIa化合物,终浓度1mM,DMSO助溶),10μL 10mM NADPH(终浓度0.2mM),一定量的酶液,置于30℃,1000rpm反应10min。HPLC检测产物(式IIIb化合物)生成的量,计算酶活。示例性的液相色谱条件为:C18反相柱,流动相为乙腈:水=53:47,流速1mL/min,柱温30℃,检测波长为254nm,检测时间为10min。式IIIa和式IIIb的出峰时间分别是7.5min和5.9min。
[0226]
酶活(U)定义:每分钟催化生成1μM的产物(式IIIb化合物)所需要的酶量。
[0227]
2)单加氧酶AcPSMO及其突变体对式IIIb化合物氧化活力的测定
[0228]
测定方法:500μL反应体系中加入390μL 50mM、pH 9.0的KPB缓冲液,50μL 10mM(S)-式IIIb化合物溶液(终浓度1mM,DMSO助溶),10μL 10mM NADPH(终浓度0.2mM),一定量的酶液,置于30℃,1000rpm反应10min。HPLC检测式IIIc化合物生成的量,计算酶活。采用手性柱IA柱,以正庚烷/乙醇(70:30)为流动相,流速为1.0mL/min,检测温度40℃,检测波长为300nm,检测时间为20min。(S)-式IIIb化合物和式IIIc化合物的出峰时间分别是11.2min和8.0min。
[0229]
酶活(U)定义:每分钟催化生成1μmol的式IIIc化合物所需要的酶量。
[0230]
3)单加氧酶AcPSMO及其突变体不对称氧化式IIIa化合物的选择性测定
[0231]
本发明中,光学纯度一般以术语“对映体过量”或符号“ee”表示,该术语是指混合物中一种对映体相对于另一种的过量。除非另有说明,说明书中涉及纯度或ee值时,“>99%”表示残余底物或某异构体含量低于检测下限而无法准确测定。ee值的分析可通过将提取后的产物进行手性液相色谱分析来实现,示例性的液相色谱条件为:采用手性柱IA柱,以正庚烷/乙醇(70:30)为流动相,流速为1.0mL/min,检测温度40℃,检测波长为300nm,检测时间为20min。(S)-式IIIb化合物和(R)-式IIIb化合物的出峰时间分别为11.2min和16.8min。
[0232]
4)甲酸脱氢酶活力的测定
[0233]
测定方法:500μL比色皿中加入430μL KPB缓冲液(50mM、pH 9.0),50μL 1M甲酸钠(溶解于水,终浓度100mM),10μL 10mM NADP +(溶解于水,终浓度0.2mM),10μL适当浓度的酶液。在30℃,340nm检测,记录1min内吸收峰的变化值(△A),根据下列公式计算酶活:
[0234]
酶活(U)=△A×V×稀释倍数×10 3/(ε×l)
[0235]
其中,V是酶液体积,mL;ε(摩尔消光系数)=6220L·mol -1·cm -1;l为光程,cm。
[0236]
酶活(U)定义:每分钟生成1μmol NADPH所需要的酶量。
[0237]
5)异丙醇脱氢酶活力的测定
[0238]
测定方法:500μL比色皿中加入430μL KPB缓冲液(50mM、pH9.0),50μL 1M异丙醇(溶解于水,终浓度100mM),10μL 10mM NADP +(溶解于水,终浓度0.2mM),10μL适当浓度的酶液。在30℃,340nm,1min内吸收峰的变化值(△A),根据下列公式计算酶活:
[0239]
酶活(U)=△A×V×稀释倍数×10 3/(ε×l)
[0240]
其中,V是酶液体积,mL;ε(摩尔消光系数)=6220L·mol- 1·cm- 1;l为光程,cm。
[0241]
酶活(U)定义:每分钟生成1μmol NADPH所需要的酶量。
[0242]
实施例9单加氧酶AcPSMO催化氧化苯甲硫醚生成苯甲亚砜
[0243]
在1mL磷酸钾缓冲液(100mM,pH 9.0)中加入AcPSMO冻干酶粉0.1g(实施例3),加入2mM化合物IIa、DSMO至终浓度为2%(v/v),NADP +0.1mM,葡萄糖脱氢酶0.2U,1.5倍底物当量的葡萄糖。在28℃,180rpm搅拌反应,间歇取样100μL。取样后加入0.6mL乙酸乙酯进行萃取,萃取液加入无水硫酸钠干燥,挥发除去溶剂,然后加入0.5mL异丙醇溶解,进行HPLC检测,24h时转化率大于99%。
[0244]
实施例10单加氧酶AcPSMO突变体V1催化氧化式IIIa化合物生成艾司奥美拉唑
[0245]
在100mL KPB缓冲液(100mM,pH8.5)中加入单加氧酶AcPSMO突变体V1(SEQ ID NO:40)冻干酶粉0.1g,葡萄糖脱氢酶15U,加入底物(式IIIa化合物)0.1g,1.5倍当量的葡萄糖,NADP +0.2mM,DMSO至终浓度5%(v/v)。在28℃,180rpm搅拌反应,间歇取样100μL。取样后加入0.6mL乙酸乙酯进行萃取,萃取液加入无水硫酸钠干燥,挥发除去溶剂,然后加入0.5mL异丙醇溶解,分析测定底物转化率和产物ee值,16h时转化率大于99%,产物((S)-式IIIb化合物)的ee值大于99%,副产物砜(式IIIc化合物)含量为0.4%。
[0246]
实施例11单加氧酶AcPSMO突变体V2催化氧化式IIIa化合物生成艾司奥美拉唑
[0247]
在10mL KPB缓冲液(100mM,pH9.0)中加入单加氧酶AcPSMO突变体V2(SEQ ID NO:70)冻干酶粉0.01g,甲酸脱氢酶2.5U,加入底物(式IIIa化合物)0.02g,1.5倍当量的甲酸钠, NADP +0.2mM,叔丁醇至终浓度10%(v/v)。在28℃,180rpm搅拌反应,间歇取样100μL。取样后加入0.6mL乙酸乙酯进行萃取,萃取液加入无水硫酸钠干燥,挥发除去溶剂,然后加入0.5mL异丙醇溶解,分析测定底物转化率和产物ee值,12h时转化率大于97%,产物((S)-式IIIb化合物)的ee值大于99%,副产物砜(式IIIc化合物)含量0.3%。
[0248]
实施例12单加氧酶AcPSMO突变体V2催化氧化式IIIa化合物生成艾司奥美拉唑
[0249]
在10mL KPB缓冲液(100mM,pH 9.0)中加入单加氧酶AcPSMO突变体V2(SEQ ID NO:70)冻干酶粉0.03g,葡萄糖脱氢酶2.5U,加入底物(式IIIa化合物)0.05g,1.5倍当量的葡萄糖,NADP +0.2mM,异辛烷至终浓度30%(v/v)。在28℃,180rpm搅拌反应,反应过程以1M NaOH溶液调节pH为9.0,间歇取样100μL。取样后加入0.6mL乙酸乙酯进行萃取,萃取液加入无水硫酸钠干燥,挥发除去溶剂,然后加入0.5mL异丙醇溶解,分析测定底物转化率和产物ee值,16h时转化率大于97%,产物((S)-式IIIb化合物)的ee值大于99%,副产物砜(式IIIc化合物)含量0.4%。
[0250]
实施例13单加氧酶AcPSMO突变体V3催化氧化式IIIa化合物生成艾司奥美拉唑
[0251]
在10mL KPB缓冲液(100mM,pH 9.0)中加入单加氧酶AcPSMO突变体V3(SEQ ID NO:74)冻干酶粉0.01g,甲酸脱氢酶2.5U,加入底物(式IIIa化合物)0.1g,1.5倍当量的甲酸钠,NADP +0.2mM,甲醇至终浓度5%(v/v)。在28℃,180rpm搅拌反应,反应过程以1M NaOH溶液调节pH为9.0,间歇取样100μL。取样后加入0.6mL乙酸乙酯进行萃取,萃取液加入无水硫酸钠干燥,挥发除去溶剂,然后加入0.5mL异丙醇溶解,分析测定底物转化率和产物ee值,16h时转化率大于97%,产物((S)-式IIIb化合物)的ee值大于99%,副产物砜(式IIIc化合物)含量0.5%。
[0252]
实施例14单加氧酶AcPSMO突变体V4催化氧化式IIIa化合物生成艾司奥美拉唑
[0253]
在0.5L KPB缓冲液(50mM,pH 9.0)中加入单加氧酶AcPSMO突变体V4(SEQ ID NO:82)冻干酶粉5g,甲酸脱氢酶2.5g,以7.5g/L的流速连续流加入底物(式IIIa化合物),持续16h,至终浓度120g/L 1.5倍底物当量的甲酸钠,NADP +0.3mM,甲醇至终浓度10%(v/v),添加剂吐温2%。在25℃,定时通氧气反应36h,间歇取样100μL。取样后加入0.6mL乙酸乙酯进行萃取,萃取液加入无水硫酸钠干燥,挥发除去溶剂,然后加入0.5mL异丙醇溶解,分析测定底物转化率和产物ee值,36h时转化率大于99%,产物((S)-式IIIb化合物)的ee值大于99%,副产物砜(式IIIc化合物)含量0.6%。
[0254]
实施例15单加氧酶AcPSMO突变体V5催化氧化式IIIa化合物生成艾司奥美拉唑
[0255]
在9L KPB缓冲液(50mM,pH 9.0)中加入单加氧酶AcPSMO突变体V5(SEQ ID NO:98)冻 干酶粉100g,甲酸脱氢酶50g,以7.5g/L的流速连续流加入底物(式IIIa化合物),持续16h,至终浓度120g/L 1.5倍底物当量的甲酸钠,NADP +0.2mM,甲醇至终浓度10%(v/v),添加剂吐温2%。在25℃,定时通氧气反应20h,间歇取样100μL。取样后加入0.6mL乙酸乙酯进行萃取,萃取液加入无水硫酸钠干燥,挥发除去溶剂,然后加入0.5mL异丙醇溶解,分析测定底物转化率和产物ee值,20h时转化率大于97%,产物((S)-式IIIb化合物)的ee值大于99%,副产物砜(式IIIc化合物)含量0.9%。
[0256]
本发明解析不动杆菌硫醚单加氧酶的晶体结构,建立高通量的平板透明圈筛选方法,结合理性设计和高通量筛选显著提高了酶的催化活力和催化反应的时空产率。
[0257]
本发明的单加氧酶催化活力高,反应作为催化剂加入量小,反应规模不仅仅局限于实验室规模,可以产业化,为手性亚砜药物的工业合成提供了新的生物催化剂资源。

权利要求书

[权利要求 1]
一种单加氧酶,其特征在于,所述单加氧酶包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的突变体,所述突变体的突变方式包括指定位置的氨基酸残基替换,所述指定位置选自如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的Xaa21,Xaa40,Xaa55,Xaa70,Xaa143,Xaa145,Xaa156,Xaa185,Xaa220,Xaa244,Xaa246,Xaa248,Xaa249,Xaa277,Xaa281,Xaa326,Xaa386,Xaa388,Xaa390,Xaa405,Xaa426,Xaa430,Xaa432,Xaa433,Xaa435,Xaa438,Xaa465,Xaa468,Xaa488,Xaa489,Xaa490,Xaa497,Xaa501以及Xaa505。
[权利要求 2]
根据权利要求1所述的单加氧酶,其特征在于,所述指定位置的氨基酸残基替换包括至少2处指定位置的氨基酸残基替换。
[权利要求 3]
根据权利要求1所述的单加氧酶,其特征在于,所述单加氧酶还包括以下任意一种或多种突变方式,所述突变方式包括: (a)指定位置以外的氨基酸残基替换任意1处或2处或3处或4处或5处; (b)指定位置以外的氨基酸残基缺失任意1处或2处或3处或4处或5处; (c)指定位置以外的氨基酸残基插入任意1处或2处或3处或4处或5处。
[权利要求 4]
根据权利要求1至3任意一项所述的单加氧酶,其特征在于,所述指定位置的氨基酸残基替换包括以下任意一种或几种替换方式: Xaa21由S替换为G; Xaa40由T替换为A; Xaa55由L替换为Y、W、F或N; Xaa70由E替换为G; Xaa143由L替换为P、或A; Xaa145由A替换为S; Xaa156由E替换为G; Xaa185由G替换为A或S; Xaa220由M替换为R; Xaa244由L替换为V、或I; Xaa246由F替换为Y; Xaa248由L替换为E、N、A、或W; Xaa249由N替换为S; Xaa277由F替换为L、V、Y、I、或D; Xaa281由F替换为V、或A; Xaa326由K替换为C、或F; Xaa386由N替换为S; Xaa388由I替换为F、C、K、G; Xaa390由M替换为S、V、I; Xaa405由K替换为M; Xaa426由L替换为F、或P; Xaa430由G替换为T、或S; Xaa432由F替换为L、或I; Xaa433由T替换为C、或A; Xaa435由L替换为S; Xaa438由S替换为I; Xaa465由K替换为R; Xaa468由V替换为A; Xaa488由E替换为K; Xaa489由S替换为C; Xaa490由W替换为R; Xaa497由P替换为S; Xaa501由N替换为Y; Xaa505由F替换为L。
[权利要求 5]
根据权利要求4所述的单加氧酶,其特征在于,所述指定位置的氨基酸残基替换包括以下任意一种替换方式: (1)替换2处,Xaa326由K替换为C,Xaa432由F替换为L; (2)替换2处,Xaa326由K替换为F,Xaa432由F替换为L; (3)替换2处,Xaa326由K替换为C,Xaa432由F替换为I; (4)替换4处,Xaa326由K替换为C,Xaa432由F替换为L,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I; (5)替换4处,Xaa326由K替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I; (6)替换5处,Xaa326由K替换为C,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为C,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I; (7)替换5处,Xaa326由K替换为C,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I; (8)替换6处,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I; (9)替换6处,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为P,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I; (10)替换7处,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L; (11)替换8处,Xaa143由L替换为P,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L; (12)替换8处,Xaa143由L替换为A,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L; (13)替换8处,Xaa244由L替换为V,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L; (14)替换8处,Xaa244由L替换为I,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L; (15)替换9处,Xaa143由L替换为P,Xaa248由L替换为E,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L; (16)替换8处,Xaa248由L替换为N,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L; (17)替换8处,Xaa248由L替换为A,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L; (18)替换8处,Xaa248由L替换为W,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F, Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L; (19)替换9处,Xaa143由L替换为P,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L; (20)替换9处,Xaa143由L替换为P,Xaa277由F替换为V,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L; (21)替换9处,Xaa143由L替换为P,Xaa277由F替换为Y,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L; (22)替换8处,Xaa277由F替换为I,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L; (23)替换8处,Xaa277由F替换为D,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L; (24)替换8处,Xaa281由F替换为V,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L; (25)替换8处,Xaa281由F替换为A,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L; (26)替换10处,Xaa143由L替换为P,Xaa277由F替换为L,Xaa281由F替换为V,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L; (27)替换10处,Xaa143由L替换为P,Xaa277由F替换为V,Xaa281由F替换为A,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L; (28)替换11处,Xaa143由L替换为P,Xaa200由M替换为R,Xaa277由F替换为L, Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa465由K替换为R,Xaa505由F替换为L; (29)替换10处,Xaa143由L替换为P,Xaa185由G替换为A,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L; (30)替换10处,Xaa143由L替换为P,Xaa246由F替换为Y,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L; (31)替换11处,Xaa143由L替换为P,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa405由K替换为M,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa501由N替换为Y,Xaa505由F替换为L; (32)替换10处,Xaa143由L替换为P,Xaa156由E替换为G,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L; (33)替换10处,Xaa143由L替换为P,Xaa249由N替换为S,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L; (34)替换10处,Xaa40由T替换为A,Xaa143由L替换为P,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa505由F替换为L; (35)替换11处,Xaa143由L替换为P,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa489由S替换为C,Xaa490由W替换为R,Xaa505由F替换为L; (36)替换12处,Xaa143由L替换为P,Xaa246由F替换为Y,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa489由S替换为C,Xaa490由W替换为R,Xaa505由F替换为L; (37)替换13处,Xaa143由L替换为P,Xaa246由F替换为Y,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa489由S替换为C,Xaa490由W替换为R, Xaa501由N替换为Y,Xaa505由F替换为L; (38)替换14处,Xaa143由L替换为P,Xaa246由F替换为Y,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa386由N替换为S,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa489由S替换为C,Xaa490由W替换为R,Xaa501由N替换为Y,Xaa505由F替换为L; (39)替换15处,Xaa143由L替换为P,Xaa246由F替换为Y,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa386由N替换为S,Xaa388由I替换为F,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa489由S替换为C,Xaa490由W替换为R,Xaa501由N替换为Y,Xaa505由F替换为L; (40)替换16处,Xaa143由L替换为P,Xaa246由F替换为Y,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa386由N替换为S,Xaa388由I替换为K,Xaa390由M替换为I,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa489由S替换为C,Xaa490由W替换为R,Xaa501由N替换为Y,Xaa505由F替换为L; (41)替换16处,Xaa143由L替换为P,Xaa246由F替换为Y,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa386由N替换为S,Xaa388由I替换为K,Xaa390由M替换为I,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa488由E替换为K,Xaa489由S替换为C,Xaa490由W替换为R,Xaa505由F替换为L; (42)替换19处,Xaa21由S替换为G,Xaa55由L替换为Y,Xaa70由E替换为G,Xaa143由L替换为P,Xaa246由F替换为Y,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa386由N替换为S,Xaa388由I替换为K,Xaa390由M替换为I,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa489由S替换为C,Xaa490由W替换为R,Xaa501由N替换为Y,Xaa505由F替换为L; (43)替换21处,Xaa21由S替换为G,Xaa55由L替换为Y,Xaa70由E替换为G,Xaa143由L替换为P,Xaa185由G替换为S,Xaa246由F替换为Y,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa386由N替换为S,Xaa388由I替换为K,Xaa390由M替换为I,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa489由S替换为C,Xaa490由W替换为R,Xaa497由P替换为S,Xaa501由N替换为Y,Xaa505由F替换为L; (44)替换22处,Xaa21由S替换为G,Xaa55由L替换为Y,Xaa70由E替换为G,Xaa143由L替换为P,Xaa145由A替换为S,Xaa185由G替换为S,Xaa246由F替换为Y,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa386由N替换为S,Xaa388由I替换为K,Xaa390由M替换为I,Xaa426由L替换为F,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa489由S替换为C,Xaa490由W替换为R,Xaa497由P替换为S,Xaa501由N替换为Y,Xaa505由F替换为L; (45)替换23处,Xaa21由S替换为G,Xaa55由L替换为Y,Xaa70由E替换为G,Xaa143由L替换为P,Xaa145由A替换为S,Xaa185由G替换为S,Xaa246由F替换为Y,Xaa277由F替换为L,Xaa326由K替换为C,Xaa386由N替换为S,Xaa388由I替换为K,Xaa390由M替换为I,Xaa426由L替换为F,Xaa430由G替换为T,Xaa432由F替换为L,Xaa433由T替换为A,Xaa435由L替换为S,Xaa438由S替换为I,Xaa489由S替换为C,Xaa490由W替换为R,Xaa497由P替换为S,Xaa501由N替换为Y,Xaa505由F替换为L。
[权利要求 6]
一种单加氧酶,其特征在于,所述单加氧酶的氨基酸序列: 如SEQ ID NO:4所示,或 如SEQ ID NO:6所示,或 如SEQ ID NO:8所示,或 如SEQ ID NO:10所示,或 如SEQ ID NO:12所示,或 如SEQ ID NO:14所示,或 如SEQ ID NO:16所示,或 如SEQ ID NO:18所示,或 如SEQ ID NO:20所示,或 如SEQ ID NO:22所示,或 如SEQ ID NO:24所示,或 如SEQ ID NO:26所示,或 如SEQ ID NO:28所示,或 如SEQ ID NO:30所示,或 如SEQ ID NO:32所示,或 如SEQ ID NO:34所示,或 如SEQ ID NO:36所示,或 如SEQ ID NO:38所示,或 如SEQ ID NO:40所示,或 如SEQ ID NO:42所示,或 如SEQ ID NO:44所示,或 如SEQ ID NO:46所示,或 如SEQ ID NO:48所示,或 如SEQ ID NO:50所示,或 如SEQ ID NO:52所示,或 如SEQ ID NO:54所示,或 如SEQ ID NO:56所示,或 如SEQ ID NO:58所示,或 如SEQ ID NO:60所示,或 如SEQ ID NO:62所示,或 如SEQ ID NO:64所示,或 如SEQ ID NO:66所示,或 如SEQ ID NO:68所示,或 如SEQ ID NO:70所示,或 如SEQ ID NO:72所示,或 如SEQ ID NO:74所示,或 如SEQ ID NO:76所示,或 如SEQ ID NO:78所示,或 如SEQ ID NO:80所示,或 如SEQ ID NO:82所示,或 如SEQ ID NO:90所示,或 如SEQ ID NO:92所示,或 如SEQ ID NO:94所示,或 如SEQ ID NO:96所示,或 如SEQ ID NO:98所示。
[权利要求 7]
一种分离的核酸,其特征在于,所述核酸编码如权利要求1至6任一项所述的单加氧酶。
[权利要求 8]
一种重组表达载体,其特征在于,所述重组表达载体包含如权利要求7所述的核酸。
[权利要求 9]
一种重组表达转化体,其特征在于,所述重组表达转化体包含如权利要求8所述的重组表达载体。
[权利要求 10]
一种单加氧酶的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:培养如权利要求8所述的重组表达转化体,从中分离所述单加氧酶。
[权利要求 11]
一种如权利要求1至6任一项所述的单加氧酶在不对称催化氧化潜手性硫醚化合物为亚砜化合物中的应用。
[权利要求 12]
根据权利要求10所述的应用,其特征在于,所述潜手性硫醚化合物选自以下任一化学式所示的化合物:

附图

[ 图 1]  
[ 图 2]  
[ 图 3]  
[ 图 4]  
[ 图 5]