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1. WO2020107564 - PETITE PROTÉINE PERMETTANT D'INDIQUER DES IONS CALCIQUES ET SES APPLICATIONS

Document

说明书

发明名称 0001   0002   0003   0004   0005   0006   0007   0008   0009   0010   0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046  

权利要求书

1   2   3   4   5   6   7  

附图

1   2(A)   2(B)   2(C)   2(D)   2(E)   2(F)  

说明书

发明名称 : 一种用于指示钙离子的小分子蛋白质及其应用

技术领域

[0001]
本申请涉及生物领域,尤其涉及一种用于指示钙离子的小分子蛋白质及其应用。

背景技术

[0002]
钙成像技术(calcium imaging)是指利用钙离子指示剂检测组织细胞内钙离子浓度的方法。在生物有机体内,钙离子产生各种各样的胞内信号,这些胞内信号几乎在每种类型的细胞中都存在,在很多功能方面有很重要的作用,例如心肌细胞收缩的控制等。在哺乳动物的神经系统中,钙离子是一类重要的神经元胞内信号分子。在静息状态下,大多数神经元的胞内钙离子浓度约为50-100nM,当神经元兴奋时,胞内钙离子浓度能上升10-100倍,钙离子浓度的升高对于神经递质的释放过程是必不可少的。总的来说神经元的活动与其内部的钙离子浓度密切相关,神经元在放电的时候会爆发出一个短暂的钙离子浓度高峰。根据钙离子浓度与神经元活动之间的严格对应关系,利用特殊的荧光染料或者蛋白质荧光探针,将神经元中的钙离子浓度通过荧光强度表现出来,这样就可以做到检测神经元活动的目的,而这一技术即为神经元钙成像技术。
[0003]
目前,钙成像所用的钙离子指示剂主要有两大类:一类是化学性钙离子指示剂。另一类为基因编码的钙离子指示剂。化学性钙离子指示剂一般指的是可以螯合钙离子的小分子。而目前基因编码的钙离子指示剂主要是来自于绿色荧光蛋白(GFP)及其变异体(例如YFP、CFP等)的荧光蛋白,与钙调蛋白(CaM)和肌球蛋白轻链激酶M13融合。现在目前使用较为广泛的基因编码的钙离子指示剂有:GCaMP、Pericams和TN-XXL等,其中GCaMP由于其超强的灵敏度, 现在被广泛应用于在体钙成像研究。
[0004]
CN101372482公开了结一种荧光素类钙离子荧光指示剂,其中R1、R2选自氢、甲基、乙基、丙基或异丙基,合成得到的荧光素类钙离子指示剂粗品与无水甲醇酯化得到荧光素类钙离子指示剂甲酯,经柱层析分离得到酯化纯品,最后水解得到荧光素类钙离子指示剂纯品。荧光素类钙离子荧光指示剂可用于胞内游离钙离子浓度测定。目前来说,不论采用哪一类钙离子指示剂,其成像的记录过程是非常类似的。即带有钙离子指示剂的细胞可以通过荧光显微镜观测,然后通过CCD摄像机捕捉、记录图像。由于离体实验本身的限制,现在越来越多的神经科学家等科研人员更倾向于获得在体的钙成像实验,因为在体实验能更加准确并且更能反映生理状况的数据。为了达到在体实时观测体内钙成像这个目的,钙离子成像技术必须借助双光子显微镜来完成。虽然这几年双光子显微镜技术发展较为迅速,但其具有几个非常致命的缺陷:
[0005]
首先,操作十分繁琐,钙成像结合双光子观察实验动物脑内钙活动时,需要对实验动物做提前处理,例如打磨动物头骨等,以达到更好的成像效果;其次,现有的钙成像技术受限于显微镜的视野,只能对脑内很小的一片区域进行记录。而神经系统的正常运作是由许多不同的脑区相互协作,因此对于这些过程的研究需要对整个中枢神经系统甚至外周神经系统进行细致全面的观测分析,而目前的钙成像技术确达不到这个要求;第三,由于目前钙成像技术的成像需借助双光子显微镜,其成像的光路极为稳定单一,因此需要科研人员把实验动物固定起来才能成像,而这种情况下脑内的活动与动物正常自由状态下的脑内活动具有极大的差别,所获得的数据也是不准确的。
[0006]
因此,神经科学领域迫切需要一种能够兼顾全局和微观、并且能够记录到真正意义上自由活动的实验动物脑内活动的钙成像技术,研发一种新型基因编 码的小分子蛋白质,作为钙离子指示剂,具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
[0007]
发明内容
[0008]
针对现有技术的不足及实际的需求,本申请提供一种用于指示钙离子的小分子蛋白质及其应用,所述小分子蛋白质通过与钙调蛋白(CaM)和肌球蛋白轻链激酶M13融合(即利用GEM取代现有GCaMP中的荧光蛋白),能解决现有钙成像技术中的众多缺陷,作为一种钙离子指示剂,具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
[0009]
为达此目的,本申请采用以下技术方案:
[0010]
第一方面,本申请提供一种用于指示钙离子的小分子蛋白质,所述小分子蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0011]
所述SEQ ID NO.1如下:
[0012]
[0013]
优选地,所述小分子蛋白质的亲和金属离子包括2价锰离子。
[0014]
优选地,所述小分子蛋白质的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示:
[0015]
[0016]
[0017]
优选地,所述小分子蛋白质的分子量小于15KD。
[0018]
本申请中,申请人经过复杂实验验证,所述小分子蛋白质在体内可以结合锰离子,锰离子是一种顺磁性物质,在核磁共振成像(MRI)时,结合了锰离子的GEM蛋白在T1加权像下呈现高信号,根据这一原理,本申请将GEM取代现有GCaMP融合蛋白中的荧光蛋白GFP(或YFP、CFP),在脑内表达后,借助核磁成像技术,可以通过T1加权像下信号的变化从而可以做到实时在体的检测动物体内钙离子水平的变化,达到监测神经元活动的目的。
[0019]
本申请要求保护上述基因序列,但不局限于此,在此基础上所做的基因突变和改造都属于本申请的保护点。
[0020]
第二方面,本申请提供一种质粒,所述质粒包括编码第一方面所述的小分子蛋白质的核苷酸序列。
[0021]
第三方面,本申请提供一种慢病毒,所述慢病毒通过第二方面所述的质粒和辅助质粒共转染包装得到。
[0022]
第四方面,本申请一种如第一方面所述的小分子蛋白质、第二方面所述的质粒或第三方面所述的慢病毒用于指示钙离子的用途。
[0023]
本申请提供了一种基因编码的指示剂,虽然发挥作用的是蛋白质,但是本质是一种DNA工具,蛋白的表达是在生物体内自行完成。
[0024]
第五方面,本申请提供一种钙离子成像方法,所述方法采用第一方面所述的小分子蛋白质、第二方面所述的质粒或第三方面所述的慢病毒中的任意一种或至少两种的组合进行核磁共振成像。
[0025]
本申请提供了一种基因编码的小分子蛋白质,命名为GEM,与钙调蛋白 (CaM)和肌球蛋白轻链激酶M13融合(即利用GEM取代现有GCaMP中的荧光蛋白),能解决现有钙成像技术中的众多缺陷,实现了一种能够兼顾全局和微观、并且能够记录到真正意义上自由活动的实验动物脑内活动的钙成像技术。
[0026]
本申请专利并不局限于某一形式融合改造,凡是在此基础上开发的钙离子成像技术都属于本申请的保护范围
[0027]
本申请的使用并不局限于中枢神经系统的使用,外周神经系统,血液循化系统等的使用范畴都属于本申请技术的保护范围。
[0028]
与现有技术相比,本申请具有如下有益效果:
[0029]
本申请提供的小分子蛋白质基因序列明确,分子量较小,对于后续的优化改进更容易操作;本申请利用核磁共振技术对钙离子变化成像,克服了现有钙成像技术中双光子显微镜视野的局限性,因此能兼顾全局和微观的检测脑内神经元电活动;本申请在进行钙成像时不需要对实验动物进行固定,能做到真正意义上Free-moving状态下的神经元电活动,数据更为准确;由于核磁成像技术没有组织穿透性的限制,因此不需要对实验动物进行预处理,大大节约了实验周期、人力物力等。

附图说明

[0030]
图1为本申请的M13-GEM-CaM结构示意图;
[0031]
图2为本申请的7.0T MRI扫描结果,其中图2(A)为冠状面的T1成像结果图,图2(B)为冠状面的T2成像结果图,图2(C)为水平面的T1成像结果图,图2(D)为水平面的T2成像结果图,图2(E)为矢状面的T1成像结果图,图2(F)为矢状面的T2成像结果图。

具体实施方式

[0032]
为更进一步阐述本申请所采取的技术手段及其效果,以下结合附图并通过 具体实施方式来进一步说明本申请的技术方案,但本申请并非局限在实施例范围内。
[0033]
实施例1质粒构建
[0034]
GEM核心核苷酸序列;
[0035]
[0036]
此段DNA序列为设计改造后的核心序列,经过验证可以在动物体内结合锰离子,在核磁共振成像下会呈现高信号,本申请即是利用此原理采用此段序列代替传统钙离子成像蛋白中的荧光蛋白;由于此段DNA序列为设计改造的,因此需要人工合成得到;
[0037]
通用钙调蛋白CaM以及肌球蛋白轻链M13 DNA序列合成并连接至核心序列GEM的C端和N末端,见图1;这种模式为经典的GCaMP的结构模式,已经过验证,为目前最常用的基因编码钙离子指示剂;
[0038]
而本申请利用原有的结构框架,并用改造设计的GEM序列代替原有的荧光序列GFP,因此在本申请中验证GEM的MRI的信号效果即可;图1所示中钙调蛋白CaM是一种能与钙离子结合的蛋白质,肌球蛋白轻链M13能与钙调蛋白GaM结合,当在体内结合钙离子时,由于Ca 2+-CaM-M13相互作用,构象改变 会导致核心蛋白GEM的构象改变,从而会导致其在MRI成像时信号发生变化,从而可以监视体内钙离子水平变化。
[0039]
完整质粒构建:将M13-GEM-CaM插入载体pET32a中,其中酶切位点分别选用为NcoI/NotI,其中载体的选择以及酶切位点的选择并不会影响本申请的核心作用,可以根据实际不同需要选择。
[0040]
实施例2实验检测
[0041]
脑内病毒微量注射:
[0042]
本申请选择大鼠纹状体脑区进行验证(纹状体这一核团相对比较大,比较均一,各向同性比较好,其他脑区也可以作为实验脑区);成年大鼠经水合氯醛腹腔注射麻醉后,将大鼠俯卧固定于立体定位上,头皮正中切开并分离骨膜;根据大鼠脑图谱中纹状体核团的位置(A/P 0.6,M/L 3.0,D/V 5.2)用颅钻在颅骨开一小孔,用10微升微量注射针向纹状体脑区缓慢注射2000nL的慢病毒,进样速度100nL/min,注射完毕后,停针5min,缓慢移除针头;
[0043]
在病毒注射后5-6周后,对大鼠进行麻醉后进行MRI(uMR790,Shanghai United Imaging Healthcare)扫描,采用立体像素分辨率为0.25*0.25*1.5mm的三维磁化强度预备梯度回波序列,采集大鼠全脑冠状面、水平面的T1加权图像,每个面扫描4-6分钟。
[0044]
结果见图2(A)-图2(F),GEM能并且只在T1加权成像下呈现信号。
[0045]
综上所述,本申请提供一种用于指示钙离子的小分子蛋白质及其应用,命名为GEM,与钙调蛋白(CaM)和肌球蛋白轻链激酶M13融合,能解决现有钙成像技术中的众多缺陷,采用本申请提供的小分子蛋白质能实现一种新的兼顾全局和微观、并且能够记录到真正意义上自由活动的实验动物脑内活动的钙成像技术,具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
[0046]
申请人声明,本申请通过上述实施例来说明本申请的详细方法,但本申请并不局限于上述详细方法,即不意味着本申请必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本申请的任何改进,对本申请产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本申请的保护范围和公开范围之内。

权利要求书

[权利要求 1]
一种用于指示钙离子的小分子蛋白质,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[权利要求 2]
根据权利要求1所述的小分子蛋白质,其中,所述小分子蛋白质的亲和金属离子包括2价锰离子。
[权利要求 3]
根据权利要求1或2所述的小分子蛋白质,其中,所述小分子蛋白质的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[权利要求 4]
一种质粒,其包括编码权利要求1-3中任一项所述的小分子蛋白质的核苷酸序列。
[权利要求 5]
一种慢病毒,其通过权利要求4所述的质粒和辅助质粒共转染包装得到。
[权利要求 6]
如权利要求所述1-3中任一项所述的小分子蛋白质、权利要求4所述的质粒或权利要求5所述的慢病毒用于指示钙离子的用途。
[权利要求 7]
一种钙离子成像方法,其采用权利要求1-3中任一项所述的小分子蛋白质、权利要求4所述的质粒或权利要求5所述的慢病毒中的任意一种或至少两种的组合进行核磁共振成像。

附图

[ 图 1]  
[ 图 2(A)]  
[ 图 2(B)]  
[ 图 2(C)]  
[ 图 2(D)]  
[ 图 2(E)]  
[ 图 2(F)]