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1. WO2020107495 - PROCÉDÉ DE PRÉPARATION D'UN ÉCHANTILLON DE LYMPHOCYTE POUR ANALYSE PAR CYTOMÉTRIE DE FLUX

Document

说明书

发明名称 0001   0002   0003   0004   0005   0006   0007   0008   0009   0010   0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061   0062   0063   0064   0065   0066   0067   0068   0069   0070   0071   0072   0073   0074   0075   0076   0077   0078   0079   0080   0081   0082   0083   0084   0085   0086   0087   0088   0089   0090   0091   0092   0093   0094   0095   0096   0097   0098   0099   0100   0101   0102   0103   0104   0105   0106   0107   0108   0109   0110   0111   0112   0113   0114   0115   0116   0117   0118   0119   0120   0121   0122   0123   0124   0125   0126   0127   0128   0129   0130   0131   0132   0133   0134   0135   0136   0137   0138   0139   0140   0141   0142   0143   0144   0145   0146   0147   0148   0149   0150   0151   0152   0153   0154   0155   0156   0157  

权利要求书

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11  

附图

1   2   3   4   5   6   7   8  

说明书

发明名称 : 一种用于流式细胞仪分析的淋巴细胞样品的制备方法

技术领域

[0001]
本发明涉及医药领域,具体涉及一种淋巴细胞样品的制备方法,特别是涉及一种用于流式细胞仪分析的免疫细胞中淋巴细胞样品的制备方法。

背景技术

[0002]
流式细胞样品主要用于血液样品检测中,而常规的流式细胞仪检测细胞样品的制备通常采用如下方法:(1)外周血不同处理方式对流式细胞仪检测结果影响分析;(2)流式细胞术检测25例肺癌患者T淋巴细胞亚群表型分析;取流式管,加入相应体积的抗体,然后加入抗凝外周血样品50或100μl,混匀,室温避光孵育20分钟,分别加入1×溶血素(即红细胞裂解液),混匀后再用于上机检测。目前的流式细胞样本制备方法多是通过抗凝外周血与抗体孵育20-30分钟,加入红细胞裂解液进行裂解5-15分钟,然后直接上机检测,或者洗涤一次再上机检测。这样的制备方法,有如下问题,一、加入红细胞裂解液控制时间问题。根据红细胞的多少,加入足量的溶血素,加入溶血素后要观察是否清亮,如果清亮就说明红细胞裂解完全,但是容易造成淋巴细胞损伤,如果裂解时间不足,红细胞裂解不完全,影响检测分析。二、不能严格控制淋巴细胞样本量,无论原血中的淋巴细胞多与少,都加入一样体积的抗体,容易造成抗体过饱和或不足,细胞检测样本量少时,微量的细胞亚型很难被检测到或因样本量少而不准确,不能够准确反映某些淋巴细胞亚群的实际情况。细胞样本量多时,如患病的某些人群淋巴细胞超标,抗体的量就会不足,导致检测结果偏低;三、裂解得到样品碎片多,背景不干净,影响流式细胞仪数据的收集和分析,对淋巴细胞补偿调整可能引起偏倚现象。
[0003]
CN 201410486089.7公开了一种淋巴细胞免疫分型的方法和试剂盒,其方法包括:取两根流式管,加入混合抗体到相应流式管中,加入50μl抗凝外周血样品,充分混均,室温避光孵育30分钟,然后,用红细胞裂解液裂解红细胞,5分钟,加入1mlPBS洗涤一次后(3500rpm,2min),加入200μl PBS,流式细胞仪上机检测,该发明同样存在上述技术问题。
[0004]
因此,有必要开发新的用于流式细胞仪分析的淋巴细胞样品的制备方法。
[0005]
发明内容
[0006]
针对以上技术现状,本发明提供一种流式细胞样品的制备方法,所述方法包括:
[0007]
1)取离体抗凝血液样品进行离心,分离血浆和血液沉淀,得血液细胞沉淀;
[0008]
2)将血液细胞沉淀与PBS溶液混合,得血液细胞稀释液;
[0009]
3)取一支离心管,加入步骤2)中终体积等量的淋巴细胞分离液。将血液细胞稀释液加入到淋巴细胞分离液的离心管中,去除血浆,取白膜层细胞;
[0010]
4)添加白膜层细胞到离心管中,添加PBS溶液混匀、离心、弃上清液,再加入PBS溶液调整细胞浓度,得1×10 5个/ml~1×10 8个/ml,优选1.5×10 6个/ml~3×10 6个/ml,最佳为1.5~2.0×10 6个/ml的淋巴细胞悬液;
[0011]
作为示例性的说明,可以为1.5×10 6个/ml、1.6×10 6个/ml、1.7×10 6个/ml、1.8×10 6个/ml、1.9×10 6个/ml、或2.0×10 6个/ml的浓度;
[0012]
5)将淋巴细胞悬液分别加入流式管内,然后加入用于标记淋巴细胞亚群的流式抗体,混匀,静置于2~8℃避光孵育;
[0013]
6)加入PBS溶液混匀,离心去除未结合的抗体;
[0014]
7)样本的完成
[0015]
①如果立即上机检测,弃去上清,用2~8℃的PBS-EDTA溶液,混匀,用于流式检测;
[0016]
②如不能立即检测,加入0.05-5%的福尔马林、优选1%的福尔马林,混匀,静置于2~8℃避光保存;检测前各管加入PBS溶液离心弃掉上清 液;用2~8℃的PBS-EDTA溶液,混匀,用于流式检测;
[0017]
本发明方法中,作为实施方案之一,所述PBS溶液为pH7.2~7.4的0.005-0.05M PBS溶液;本发明方法中,作为示例的说明,所述0.005-0.05M PBS溶液可以为0.005M PBS、0.01M PBS、0.02M PBS、0.03M PBS、0.04M PBS或0.05M PBS溶液
[0018]
作为实施方案之一,可选择地,PBS缓冲溶液中可以含有小牛血清和/或EDTA,所述小牛血清或EDTA的浓度可是本领域常规的浓度。
[0019]
本发明方法中,作为实施方案之一,所述PBS-EDTA溶液为pH7.2~7.4的含有0.005-0.05M PBS和终浓度为2-3mM EDTA的混合溶液。
[0020]
本发明方法中,作为实施方案之一,本发明所述步骤1)进一步包括离心条件:1500~3500rpm、5~30min;优选为1500-2900rpm、15-20min。
[0021]
本发明方法中,作为实施方案之一,所述步骤2)中血液细胞沉淀与PBS溶液的按1:0.5~1:2、优选1:1的体积比例加入
[0022]
本发明方法中,作为实施方案之一,本发明所述步骤3)进一步包括离心条件为1500-3500rpm,10-20min,4℃;优选1500-2900rpm,20min,4℃。
[0023]
本发明方法中,作为实施方案之一,本发明所述步骤4)进一步包括离心为条件为1500-3500rpm离心5-20分钟;优选1500-2900rpm下离心5-10分钟。
[0024]
本发明方法中,作为实施方案之一,本发明所述步骤6)进一步包括离心为条件为1500-2900rpm下离心5-10分钟。
[0025]
本发明方法中,作为实施方案之一,所述步骤6)中加入PBS溶液的量为血液细胞沉淀的等体积的量。
[0026]
本发明方法中,作为实施方案之一,所述步骤7)中的PBS溶液为pH7.2~7.4的0.005-0.05M PBS溶液;作为实施方案之一,可选择地,PBS缓冲溶液中可以含有小牛血清和/或EDTA,所述小牛血清或EDTA的浓度可是本领域常规的浓度;作为实施方案之一,所述PBS-EDTA溶液为pH7.2~7.4的含有0.005-0.05M PBS和终浓度为2-3mM EDTA的混合溶液。
[0027]
本发明方法中,作为实施方案之一,所述淋巴细胞包括但不限于淋 巴细胞亚群,可以包括记忆性淋巴细胞和其它需要检测的淋巴细胞亚群,以及针对淋巴细胞亚群的功能性分析和细胞因子分析、树突细胞成熟度检测等。
[0028]
作为实施方案之一,本发明所述方法包括
[0029]
(一)外周血中分离人外周血单核细胞
[0030]
(1)取离体抗凝外周血液样品
[0031]
(2)将血液样品加入到离心管中离心;弃掉上层血浆,得下层血液细胞沉淀;
[0032]
(3)将血液细胞沉淀与PBS溶液按1:1体积比进行稀释,得血液细胞稀释液。
[0033]
(4)取离心管,加入与血液细胞稀释液等体积的淋巴细胞分离液。
[0034]
(5)将血液细胞稀释液缓慢加入到步骤(4)的离心管中,保持分离液分层清晰。
[0035]
(6)缓慢放入低速离心机内,配平后离心。
[0036]
(7)离心结束后弃掉上清,得白膜层细胞。
[0037]
(8)取白膜层细胞至离心管内,并添加PBS溶液,计数后、离心。
[0038]
(9)离心后,去除上清液。根据计数结果计算加入2~8℃的PBS溶液,使细胞密度在1.5-3.0×10 6个/ml,即得淋巴细胞悬液;
[0039]
作为示例性说明,1.5×10 6个/ml、2.0×10 6个/ml、2.5×10 6个/ml、3.0×10 6个/ml的浓度。
[0040]
(二)制作流式细胞样本
[0041]
(1)样本染色
[0042]
流式管内加入淋巴细胞悬液100μl,加入要标记淋巴细胞亚群的流式抗体,混均,2~8℃避光孵育10~30分钟,优选15~20分钟,最佳为20分钟。
[0043]
(2)样本洗涤、加液
[0044]
孵育后,加入预冷的PBS溶液重悬细胞,离心1500-2900rpm下离心5-10分钟,混均,去除未结合的抗体,即得。
[0045]
本发明方法中,作为实施方案之一,所述方法包括:
[0046]
(一)外周血中分离人外周血单核细胞
[0047]
(1)取离体抗凝外周血液,其中取0.2ml计数,留样1ml,标记信息,放置4℃度冰箱保存;
[0048]
(2)将剩余血液加入到离心管中,1500-2900rpm,离心20min;去掉上层血浆。
[0049]
(3)剩余血液细胞沉淀与PBS溶液按体积比1:1进行稀释。
[0050]
(4)离心管中加入血液细胞稀释液等量的淋巴细胞分离液。
[0051]
(5)将血液细胞稀释液缓慢加入到步骤(4)的离心管中,保持分离液分层清晰。
[0052]
(6)缓慢放入低速离心机内,配平,1500-2900rpm,离心10-20min。
[0053]
(7)离心结束后用移液管缓慢吸取上层上清弃掉。
[0054]
(8)吸取中间白膜层细胞至一个新的离心管内,加PBS溶液至10ml,取200μl细胞悬液,用血细胞计数仪计数。剩余细胞悬液1500-2900rpm,离心5-10min。
[0055]
(9)离心后,弃上清,吸尽残余液体。根据计数结果,加入适量2~8℃预冷的PBS溶液,调整细胞密度在1.5-2.0×10 6个/ml。
[0056]
作为示例性的说明,可以为1.5×10 6个/ml、1.6×10 6个/ml、1.7×10 6个/ml、1.8×10 6个/ml、1.9×10 6个/ml或2.0×10 6个/ml的浓度。
[0057]
(二)制作流式细胞样本
[0058]
(1)样本染色
[0059]
每个流式管内加入100μl细胞悬液,加入要标记淋巴细胞亚群的流式抗体。并用涡旋振荡器轻缓震荡,2~8℃,避光孵育10-30分钟,优选15~20分钟,最佳20分钟。
[0060]
(2)样本洗涤、加液
[0061]
染色结束后,加入2ml预冷的PBS溶液重悬细胞,1500-2900rpm,离心5-10min。倒掉上清后加入400μl 2~8℃的PBS-EDTA溶液,混匀即得。
[0062]
本发明解决现有技术中存在的技术不足问题,本发明采用离心分离出血浆,利用淋巴细胞分离液纯化出单核细胞,抗体孵育后洗涤。目前这种用淋巴细胞分离液和离心辅助的方法,根据淋巴细胞计数定量,加入定量的淋巴细胞,加入相匹配的抗体量,从而解决了现有技术中存在 的问题,同时避免了抗体过饱和,而形成二次结合,也不会因为细胞过多而造成抗体量不足。
[0063]
与传统的样品相比,本发明富集纯化了淋巴细胞亚群,使得部分粒细胞、红细胞、血小板等背景细胞亚群均被除去,使检测时淋巴亚群分群明显,背景干净,补偿容易,节省抗体,使得流式细胞仪分析检测更加准确便捷。本发明节约了时间及抗体使用量,降低检测成本,使得背景干净、分群清晰明显、微量的亚群如DC细胞经过了富集,明显分群,使检测结果更加准确。

附图说明

[0064]
图1:试验例1中现有技术用溶血素方法即裂解法所得样品的流式细胞图;
[0065]
图2:试验例1中本发明实施例1所得样品的流式细胞图;
[0066]
图3:试验例1中本发明实施例1所得样品的流式细胞图;
[0067]
图4:试验例1中现有技术裂解法所得样品的流式细胞图;
[0068]
图5:试验例1中本发明实施例1所得样品的流式细胞图;
[0069]
图6:试验例2中按实施例1方法所得样品与现有技术裂解法所得样品的细胞群对比图(上边3个图为裂解法所得流式细胞图,下边三图是上边3图对应样品的分离法所得的流式细胞图);
[0070]
图7:试验例2中按实施例1方法所得样品与现有技术裂解法所得样品的细胞富集对比图;
[0071]
图8:试验例2中按实施例1方法所得样品与现有技术裂解法所得样品的不同类型细胞富集对比图。

具体实施方式

[0072]
以下实施例和试验例用于进一步阐述本发明,但不以任何的方式限制本发明的有效范围。
[0073]
实施例1流式检测所需的PBMC样本的制备
[0074]
1、目的
[0075]
制备流式检测所需的PBMC样本(本发明上下中也成称为“样品”)。
[0076]
2、原理
[0077]
活细胞表面保留有较完整的抗原或受体,用荧光标记的抗体与细胞表面相应抗原结合,根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
[0078]
3、仪器耗材准备
[0079]
3.1仪器
[0080]
苏净超净台,时代北利低速离心机DT5-4,血细胞分析仪、涡旋振荡器,各量程移液器
[0081]
3.2耗材
[0082]
15ml离心管,10ml移液管,1.5ml离心管,流式管,3ml巴氏吸管,各量程枪头。
[0083]
3.3试剂配制
[0084]
[0085]
常规流式检测用抗体:抗CD3抗体、lin1[Lineage Cocktail 1]、抗CD123的抗体、抗CD11的抗体。
[0086]
4、操作步骤(以抗凝原血样5ml为例进行说明)
[0087]
4.1.外周血中分离PBMC
[0088]
(1)取原血0.2ml计数。
[0089]
(2)将剩余血液加入离心管中,1500-2900rpm,离心15-20min,去 除上层血浆。
[0090]
(3)剩余血液细胞沉淀与PBS溶液按体积进行稀释。
[0091]
(4)准备1支离心管,用移液管加入与血液细胞稀释液等体积的淋巴细胞分离液。
[0092]
(5)将血液细胞稀释液缓慢加入到步骤4的离心管中,保持分离液分层清晰。
[0093]
(6)缓慢放入离心机内,配平后1500-2900rpm,离心15-20min。
[0094]
(7)离心结束后用移液管缓慢吸取上清弃掉。
[0095]
(8)吸出中间白膜层细胞至一个新的离心管内,加PBS溶液至10ml,取100μl细胞液用全血细胞计数仪计数,以备后续稀释用。剩余细胞悬液1500-2900rpm,离心5-10min。
[0096]
(9)离心后,弃上清,用1ml移液器吸尽残余液体。根据计数结果,加入适量4℃度预冷的PBS溶液,调整细胞浓度在1.5-3.0×10 6个/ml,作为示例性说明,可以2×10 6个/ml的浓度。
[0097]
4.2制作流式细胞样本(本操作控制温度,全程样品及抗体在冰盒内操作)
[0098]
(1)样本染色
[0099]
每个流式管内加入100μl细胞液,加入用于标记淋巴细胞亚群的流式抗体,使抗体与细胞充分混均,2~8℃,避光孵育20分钟。
[0100]
(3)样本洗涤
[0101]
染色结束后,加入2ml预冷的PBS溶液重悬细胞,1500-2900rpm,离心5-10min。
[0102]
(4)样本完成
[0103]
①如果立即上机检测,则弃去上清,用预冷的PBS-EDTA溶液400μl混匀细胞,用于流式检测。
[0104]
②如不能立即检测,则用0.05-5%福尔马林500μl悬起细胞,充分混匀,2~8℃避光保存。检测前各管加入2ml PBS溶液,1500-2900rpm,离心5-10min,弃掉上清。用预冷的PBS-EDTA溶液400μl,混匀细胞,上机检测。
[0105]
试验例1本发明制备样品与用血溶素处理方法所得样品的对比试验
[0106]
1.1样品和试剂:
[0107]
本发明淋巴细胞样品:取离体血液样本按实施例1方法制备即得;
[0108]
对比淋巴细胞样品:取离体血液样本按取离体血液样本1.2.1部分中用血溶素处理法处理所得
[0109]
5ml抗凝血样;
[0110]
PBS溶液:10×PBS溶液:纯水按照1:9体积比配制
[0111]
PBS-EDTA溶液:向1×PBS中加入0.5M EDTA直至EDTA的终浓度为2.5mM;
[0112]
常规流式检测用抗体:抗CD3抗体、lin1[Lineage Cocktail 1]、抗CD123的抗体、抗CD11的抗体;
[0113]
1.2试验方法:
[0114]
1.2.1血溶素处理方法:
[0115]
(1)样本染色:每个流式管内加入100μl抗凝血液样本,加入要标记淋巴细胞亚群的流式抗体。并用涡旋振荡器轻缓震荡,使抗体与细胞充分混均,2~8℃,避光孵育20分钟。
[0116]
(2)裂解:向流式管中加入2ml 1×BD溶血素(即红细胞裂解液),5分钟。
[0117]
(3)样本洗涤:5分钟后,离心,1500-2900rpm,10分钟,离心结束后,弃掉上清,加入2ml预冷的PBS溶液重悬细胞,1500-2900rpm,离心5-20min。倒掉上清后加入400μl 2~8℃PBS-EDTA溶液,涡旋3秒混匀,即得对比淋巴细胞样品。
[0118]
1.2.2上流式细胞仪检测方法:
[0119]
a)开机前检查仪器状态;
[0120]
b)对流式细胞仪系统进行开机预热5~10分钟,进行灌注;
[0121]
c)进行质控程序,通过以后进行下一步;
[0122]
d)设置仪器各个参数,调节各个检测通道的电压,调节液流速度为35~40μl/min;
[0123]
e)分别取制备好的本发明淋巴细胞样品和对比淋巴细胞样品涡旋振荡3秒,分别进行检测。设置条件:门内15000个细胞;采集样品。
[0124]
1.3实验结果:
[0125]
本发明制备的样品与用溶血素处理的方法处理样品对比观察结果如下:
[0126]
1.3.1用溶血素处理的方法处理样品观察如下:所得的细胞群,可以看出细胞较少,细胞群过于紧密,且其中的一部分粒细胞与淋巴细胞粘连严重,分不清楚式哪一个群;细胞碎片较多且弥散,具体参见图1。
[0127]
本发明所得样品观察如下:分离富集后细胞数量较多,分群明显,界限清晰,且粒细胞那部分粘连的细胞群也在处理过程中去除了,具体参见图2。
[0128]
对比图1,图2所得的细胞,本发明样品成功实现了分离富集后细胞数量较多,分群明显,界限清晰,且粒细胞那部分粘连的细胞群也在处理过程中去除了。
[0129]
1.3.2本发明制备的样品与用溶血素处理的方法处理样品富集细胞对比观察结果如下:
[0130]
图3、4、5染色为抗体lin1[Lineage Cocktail 1]、抗CD123的抗体、抗CD11的抗体;FITC是第一通道,染色的为抗体lin1[Lineage Cocktail 1];PerCP是第三通道,染色为抗CD123的抗体;APC是第4通道,染色的为抗CD11的抗体。其中,图4是通过溶血素的方法得到的细胞图;图5是通过淋巴细胞分离液和离心的方法得到的流式细胞图。比较明显的图5中细胞较图4中得到富集。
[0131]
从细胞数目上看,本发明样品中细胞富集效果更高。具体分析过程如下:首先画直方图,圈门1:FL1-,然后在门1内,圈FL3-H,FL4-H子细胞群-1,即细胞表面标志lin1 -CD123 +CD11C -代表浆细胞源性DC细胞(pDC);
[0132]
细胞表面标志lin1 -CD11C +代表髓细胞源性DC细胞(mDC);其中,在流式细胞检测领域中,能收集到的细胞相对越多,越准确。比较明显的上图5中mDC细胞和pDC细胞的数量和分群都优于图4。
[0133]
试验例2本发明制备样品与血溶素裂解法所得样品的对比
[0134]
2.1样品和试剂:
[0135]
本发明淋巴细胞样品:取离体血液样品按实施例1方法制备,即得。
[0136]
对比淋巴细胞样品:取离体血液样品按如下2.2.1部分方法制备即得;
[0137]
5m l抗凝血样;
[0138]
PBS溶液:10×PBS溶液:纯水按照1:9体积比配制;
[0139]
PBS-EDTA溶液:向1×PBS中添加0.5M EDTA直至EDTA的终浓度为2.5mM;
[0140]
常规流式检测用抗体:抗CD3抗体、lin1、抗CD123的抗体、抗CD11的抗体、CD3FITC、CD8PerCP、CD4PerCP。
[0141]
2.2试验方法:
[0142]
2.2.1血溶素裂解法处理方法:
[0143]
(1)样本染色:每个流式管内加入100μl抗凝血液样本,分别加入要标记淋巴细胞亚群的流式抗体。使抗体与细胞充分混均,2~8℃,避光孵育20分钟。
[0144]
(2)裂解:向流式管中加入2ml 1×BD溶血素(即红细胞裂解液),5分钟。
[0145]
(3)样本洗涤:5分钟后,离心,1500rpm,10分钟,离心结束后,弃掉上清,加入2ml预冷的PBS溶液重悬细胞,1500rpm,离心5min。倒掉上清后加入400μl 2~8℃PBS-EDTA溶液,混匀即得。
[0146]
2.2.2上流式细胞仪检测方法:
[0147]
a)开机前检查仪器状态;
[0148]
b)对流式细胞仪系统进行开机预热5~10分钟,进行灌注;
[0149]
c)进行质控程序,通过以后进行下一步;
[0150]
d)设置仪器各个参数,调节各个检测通道的电压,调节液流速度为优选35~40μl/min;
[0151]
e)分别取制备好的本发明淋巴细胞样品和对比淋巴细胞样品涡旋 振荡3秒,分别进行检测。设置条件:门内15000个细胞;采集样品。
[0152]
2.3实验结果:
[0153]
2.3.1通过对比可以看出裂解得到样品碎片多,背景不干净,影响流式细胞仪数据的收集和分析,对淋巴细胞补偿调整可能引起偏倚现象;本方法(淋巴细胞分离液分离方法)使得背景干净、分群清晰明显(参见图6)。
[0154]
其中,通过观察裂解法得到的淋巴细胞亚群分析的图中圈的门内为淋巴细胞,由图可见淋巴细胞群和细胞碎片群分的很不理想(参见图6第一排三幅图)。
[0155]
本发明所得到的淋巴细胞亚群分析的图中圈的门内为淋巴细胞群,由图可见淋巴细胞群和细胞碎片群分的很开,很理想(参见图6第二排三幅图)。
[0156]
2.3.2图7可以看出:本发明在使用荧光抗体时,由于是检测了淋巴细胞数量,根据比例添加荧光抗体,节约了70%以上的抗体,本发明检测时组合抗体的使用量为15μl,而裂解法的使用量为60μl。而本发明法不会造成抗体过量或不足。由图7可知:1组标记的均是CD3FITC、CD8PerCP;2组标记的均是CD3FITC、CD4PerCP。由于处理方法所得样品的不同,对于同一份离体外周血样品,其结果为裂解法得到的样品中的双阳性群比例明显减少,且抗体用量无法进行定量;而本发明方法得到的样品可以根据细胞的量进行抗体定量添加,除此之外,很明显,分离法细胞得到了一定程度的富集。
[0157]
2.3.3图8可以看出:本发明制得的样品对于细胞亚群比例较小的样本,具有富集作用。同一份离体外周血样品,细胞亚群mDC和pDC所占比例比较小,在裂解法和本发明方法下,其所得样品的观察结果是不同的,本发明所得到样品中的细胞亚群都得到了富集。从细胞数目和百分比上看都可证明。

权利要求书

[权利要求 1]
一种供流式细胞仪分析的免疫细胞中的淋巴细胞样品的制备方法,其特征在于,所述方法包括: 1)取离体抗凝血液样品离心,分离血浆和血液细胞沉淀,得血液细胞沉淀; 2)将血液细胞沉淀与PBS溶液进行混合,得血液细胞稀释液; 3)将血液细胞稀释液加入到含等体积量的淋巴细胞分离液的离心管中离心,去除血浆,得白膜层细胞; 4)将白膜层细胞加入到离心管中,然后添加PBS溶液混匀,离心,弃上清液,然后加入PBS溶液调整细胞浓度,得1×10 5个/ml~1×10 8个/ml浓度的淋巴细胞悬液;优选浓度1.5×10 6个/ml~5×10 6个/ml,进一步优选浓度1.5~3.0×10 6个/ml; 5)取淋巴细胞悬液加入流式管内;并加入用于标记淋巴细胞亚群的流式抗体,混匀,静置并在2~8℃下避光孵育; 6)加入PBS溶液,混匀,离心并去除未结合抗体; 7)样本的完成 ①如果立即上机检测,弃去上清,用2~8℃的PBS-EDTA溶液,混匀,用于流式检测;或 ②如不能立即检测,加入福尔马林溶液,混匀,静置于2~8℃避光保存;检测前各管加入PBS溶液离心弃掉上清液;用2~8℃的PBS-EDTA溶液,混匀,用于流式检测。
[权利要求 2]
根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述PBS溶液为pH7.2~7.4的0.005-0.05M PBS溶液;所述PBS-EDTA溶液为pH 7.2~7.4的含有0.005-0.05M PBS和终浓度为2-3mM EDTA的混合溶液。
[权利要求 3]
根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤1)进一步包括离心条件为1500~3500rpm,5~30min;优选为1500-2900rpm,15-20min。
[权利要求 4]
根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤2)中血液细胞沉淀与PBS溶液按1:0.5~1:2,优选1:1的体积比例加入。
[权利要求 5]
根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤3)进一步包括离心条件为1500-3500rpm,10-20min,4℃;优选1500-2900rpm,20min,4℃。
[权利要求 6]
根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤4)进一步包括离心条件为:1500-3500rpm离心5-20分钟;优选离心条件为1500-2900rpm,离心5-10分钟。
[权利要求 7]
根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤6)进一步包括离心为条件为1500-2900rpm离心5-10分钟。
[权利要求 8]
根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤6)中加入PBS溶液的量为血液细胞沉淀的等体积的量。
[权利要求 9]
根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤7)样品的后处理: ①立即用于上机检测时,则弃去上清,用2~8℃的PBS-EDTA溶液,混匀,用于流式检测;或 ②不用于立即检测时,加入0.05-5%福尔马林溶液、优选1%的福尔马林溶液悬起细胞,混匀,静置于2~8℃避光保存;检测前各管加入PBS溶液,离心,弃掉上清液,用2~8℃的PBS-EDTA溶液,混匀,用于流式检测。
[权利要求 10]
根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述PBS溶液为pH 7.2~7.4的0.005-0.05M PBS溶液;所述PBS-EDTA溶液为pH 7.2~7.4的含0.005-0.05M PBS和终浓度为2-3mM EDTA的混合溶液。
[权利要求 11]
根据权利要求1~10任一所述的方法,其特征在于,所述方法包括: (一)人外周血单核细胞的分离 (1)取离体抗凝外周血液样品计数; (2)将血液样品加入到离心管中离心;去除上层血浆,得下层血液细胞沉淀; (3)剩余血液细胞沉淀与PBS溶液按1:1进行稀释,得血液细胞稀释液; (4)取离心管,加入与血液细胞稀释液等体积的淋巴细胞分离液; (5)将血液细胞稀释液缓慢加入到步骤(4)的离心管中,保持分离液液面分层清晰; (6)缓慢放入离心机内,配平后离心; (7)离心结束后弃掉上层血浆,得白膜层细胞; (8)取白膜层细胞至离心管中,并添加PBS溶液、计数后离心; (9)离心后,去除上清液,根据结果计数,加入2~8℃度预冷的PBS溶液,使得到1.5-3.0×10 6个/ml浓度的淋巴细胞悬液; (二)制作流式细胞样本 (10)样本染色 向流式管内加入淋巴细胞悬液,加入相应抗体,混均,2~8℃避光孵育10~30分钟,优选15-20分钟,最佳20分钟; (11)样本洗涤 染色后,加入2~8℃预冷的PBS溶液重悬细胞1500-2900rpm,离心5-10min,去除未结合的抗体,即得。

附图

[ 图 1]  
[ 图 2]  
[ 图 3]  
[ 图 4]  
[ 图 5]  
[ 图 6]  
[ 图 7]  
[ 图 8]