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1. WO2020107088 - PROCÉDÉ MICROFLUIDIQUE D'OBTENTION DE LIPOSOMES STEALTH CATIONIQUES

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[ PT ]

PROCESSO MICROFLUÍDICO DE OBTENÇÃO DE LIPOSSOMAS STEALTH

CATIÔNICOS

Campo da. invenção:

[1] O presente pedido é um certificado de adição do pedido de patente BR 10 2017 025862 9, depositado em 30 de novembro de 2017 e intitulado "Processo microfluidico de obtenção de lipossomas stealth catiônicos, lipossomas stealth catiônicos obtidos e seu uso".

[2] Este certificado de adição se insere no campo das ciências médicas, mais especificamente no que se refere às preparações medicinais caracterizadas por formas físicas especiais, e descreve um processo de obtenção de lipossomas Stealth em sistema microfluidico utilizando solvente orgânico miscível em água com alto rendimento baseado em advecção caótica sem que ocorra a formação de micelas . Por utilizar um elevado teor de etanol (50%) quando comparado a BR 10 2017 025862 9 e dispensar o uso de sal (força iônica) , o presente certificado de adição evita possíveis desnaturações de moléculas sensíveis que podem vir a ser associadas aos lipossomas (por ex. ; proteínas), não limitando, portanto, suas aplicações.

[3] Ao final deste processo, os solventes orgânicos solúveis em água (como o etanol) , que estão em concentração equivalente a da fase aquosa e são remanescentes na formulação final dos lipossomas obtidos, é recuperado pelo uso de um concentrador de centrífuga a vácuo para remoção ou diminuição do mesmo, sem alterar significativamente as propriedades físico químicas das estruturas lipossomais.


[4] A terapia gênica é uma estratégia terapêutica que atua a partir da introdução de material genético nas células-alvo, visando correção ou inativação dos genes responsáveis por uma patologia. Entretanto, devido ao tamanho, caráter aniônico e instabilidade química do material genético frente aos fluidos celulares, sua interiorização no núcleo celular (transfecção) é dificultada.

[5] A fim de aumentar a taxa de transfecção in vitro e in vivo, diversos sistemas de entrega controlada de ácidos nucleicos têm sido estudados. Dentre estes, destacam-se os lipossomas catiônicos, cujas estruturas são aproximadamente esféricas e formadas a partir da auto-agregação de lipídeos anfifílicos em lamelas. Pelo fato de as lamelas mimetizarem membranas celulares, os lipossomas possuem várias características biológicas, que incluem interações com biomembranas e com diversas células, facilitando a internalização e entrega de fármacos e ácidos nucleicos. Devido ao seu caráter catiônico, esses lipossomas podem interagir eletrostaticamente com material genético (carregado negativamente) , formando lipoplexos que apresentam aptidão para adentrar as células, em consequência da interação eletrostática dos lipoplexos com a membrana celular aniônica.

[6] Além do caráter catiônico, os lipossomas em questão apresentam boa compatibilidade e facilidade de modificação química de sua superfície, o que permite a produção de lipossomas ligados covalentemente a moléculas de polietilenoglicol (PEG) .

[7] Essa nova geração de lipossomas é conhecida como S tealth e responsabilizam-se por aumentar significativamente o tempo de circulação desses nanocarreadores nos fluidos corporais, devido à formação de uma barreira protetora promovida por cadeias de PEG em sua superfície. Em vista disso, a otimização de processos para a produção desses nanocarreadores estabilizados com PEG se faz necessário.

[8] Nesse contexto, a microfluídica emerge como uma técnica vantajosa para a produção de lipossomas de alto valor agregado, trabalhando com sistemas que processam pequenas quantidades de fluidos (IO-9 a IO-18 litros) , usando canais com dimensões de até centenas de micrômetros. Recentes avanços nesta ciência criaram novas perspectivas para a área de sistemas de entrega gênica ( gene delivery) .

[9] A formação de lipossomas nesses processos microfluídicos ocorre pela auto-agregação das moléculas de lipídeo através do contato de dois fluidos solúveis entre si, um aquoso e outro orgânico (podendo ser alcoólico) e miscível em água (contendo os lipídeos) . Conforme a difusão entre as espécies ocorre, os lipídeos se tornam cada vez menos solúveis no meio aquoso e começam a se autoagregar, formando fragmentos de bicamadas lipídicas.

[10] À medida que esses fragmentos de bicamadas lipídicas crescem, eles se unem a fim de diminuir a área superficial das extremidades hidrofóbicas, por fim agregando-se em vesículas esféricas com uma bicamada que separa um meio aquoso do meio externo.

[11] Todavia, são conhecidos no estado da técnica diversos problemas técnicos envolvidos em processos de obtenção de lipossomas Stealth utilizando dispositivos microfluídicos, tal como a formação indesejável de filmes lipídicos e micelas sobre a superfície do referido dispositivo, acarretando limitações no controle dos parâmetros finais de processamento.

[12] O documento WO 2017/106799 Al descreve um processo de obtenção de Lipidoids (agregados que possuem além de lipídeos, moléculas sintéticas para estruturação em membrana) para a entrega de mRNA, o qual faz uso de misturadores microfluídicos para a realização da advecção caótica. Dentre os fosfolipídeos passíveis de uso nesta invenção, são citados o EPC, o DOTAP e o DOPE, bem como o polímero PEG associado ao lipídeo DSPE.

[13] No entanto, o processo proposto neste documento não forma lipossomas e nem lipossomas Stealth, e tão pouco menciona a recuperação do solvente. Diferentemente, de acordo com o presente certificado de adição, o solvente orgânico é totalmente removido por destilação, permitindo que os lipossomas unilamelares obtidos sejam misturados com quaisquer outras soluções para usos diversos, especialmente para fins farmacêuticos. Além disso, este processo propõe a utilização de moléculas sintéticas com estrutura diferente dos lipídeos normalmente utilizados para a construção de lipossomas .

[14] No documento US 2018/0028664 Al, são descritas composições lipídicas para a liberação de substâncias ativas in vivo. Esse documento visa a formação de Nanopartículas lipídicas (Lipid Nanoparticles ) , as quais podem compreender fosfolipídeos, tais como o DOPE, e lipídeos modificados, tais como o DSPE-PEG. Estas nanopartículas lipídicas são obtidas por microfluidização, tal como por advecção caótica, em que o solvente utilizado é recuperado por diálise. Nesse caso, a formação dessas nanopartículas se dá pela mistura simultâncea dos lipídeos e os componentes a serem encapsulados, no caso mRNA, para a formação da nanopartícula . Não se garante nessa situação, a formação de lipossomas ou lipossomas Stealth.

[15] Diferentemente, o presente certificado de adição prevê a obtenção de lipossomas Stealth (cuja estrutura difere das nanoparticulas lipidicas) , em que o solvente é recuperado após a advecção caótica por destilação a vácuo.

[16] Em US 2010/0022680 Al, faz-se referência a métodos para a produção de nanoparticulas, tais como lipossomas, para a liberação de fármacos. Dentre os referidos métodos, destaca-se o uso de dispositivos microfluidicos , sendo a remoção dos solventes realizada por evaporação usando vácuo.

[17] Neste documento, não há referências ou evidências cientificas de que a destilação ou concentração a vácuo mantém as propriedades dos lipossomas, tal como previsto no presente certificado de adição.

[18] Por sua vez, o artigo "Microfluidic manufacturing of phospholipid nanoparticles : stability, encapsulation efficacy and drug release" também faz referência a preparação de lipossomas que compreendem fosfolipideos usando métodos microfluidicos, tal como, por exemplo, utilizando micro misturador em baixo perfil caótico.

[19] Diferentemente do presente certificado de adição, a análise das caracteristica fisico-quimica, morfológica e estrutural destes lipossomas não menciona se os mesmos são unilamelares . Ainda, o processo apresenta uma etapa de diálise para remoção do fármaco não encapsulado, não sendo mencionado como o produto obtido é purificado.

[20] Por fim, o artigo intitulado "High-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization", publicado por Kastner et al. (2015), refere-se à investigação da produção de LC convencional, utilizando fosfolipideos 1, 2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina (DOPE) e 1 , 2-dioleil-3- trimetilamônio propano (DOTAP) em dispositivo microfluidico chamado "Staggered Herringbone Micromixer" com 2 entradas (neste caso, um dispositivo microfluidico baseado em advecção caótica) que foi fornecido pela empresa "Precision NanoSystem Inc." No referido artigo os autores analisaram o efeito da razão de taxa de fluxo de etanol e água introduzidos dentro do microcanal, em que foram avaliadas as seguintes razões de taxa de fluxo a) 1 etanol :1 água; b) 1 etanol: 3 água; c) 1 etanol: 5 água. Porém, os autores do artigo caracterizaram os LCs somente por meio da técnica de Espalhamento Dinâmico de Luz (Dynamic Light. Scattering, DLS) , sendo que as distribuições de tamanho não foram demonstradas neste estudo. Adicionalmente, os autores afirmaram que produziram LC utilizando a composição DOPE-DOTAP; o que contraria o conhecimento da literatura {An Inverted Hexagonal Phase of Cationic Liposome-DNA Complexes Related to DNA Release and Delivery, Koltover, 1998), o qual esclarece que a formulação contendo DOTAP/DOPE na proporção 1:1 não fornece somente a formação exclusiva de bicamadas lipidicas, mas sim a coexistência das fases lamelar (La) (formando lipossomas) e hexagonal inversa (HII) (outra estrutura diferente de lipossomas) . Com isso, estruturas instáveis e diferentes são formadas. Em termos de aplicação na área farmacêutica, esta variação leva a interação diferenciada nas células causando grande variação. A inclusão de EPC (50% molar) permite a formação exclusiva de bicamadas lipidicas caracterizando a formação de liposomas, conforme já comprovado por Balbino et al. (2012). Assim, embora Kastner et al. (2015), que usa DOPE/DOTAP, citar que forma lipossomas, não há evidências estruturais que suportam a formação exclusiva de lipossomas.

[21] Diferentemente do artigo de 2015, o presente certificado de adição de invenção refere-se a um processo aperfeiçoado de produção de lipossomas S tealth catiônico sem a presença de hexagonal inversa (HII) , em que o dito processo se utiliza do fosfolipideo "fosfatidilcolina de ovo (EPC) " e do lipídeo DSPE-PEG (2000) associados à formulação DOTAP/DOPE, além de um dispositivo com configuração distinta .

[22] Portanto, nenhum documento do estado da técnica descreve um processo microfluídico de obtenção de lipossomas S tealth, envolvendo alta quantidade de etanol e sua posterior remoção via destilação tal como ora proposto no presente certificado de adição.

[23] É importante ressaltar que não existe na literatura investigação de LC do tipo Stealth em sistema microfluídico baseado em advecção caótica. As publicações e patentes geralmente focam a formação de "lipid nanoparticles" que é a síntese conjunta de estruturas com ácidos nucleicos, destinada para terapia gênica. Nestes estudos, até incluem os lipídeos com PEG, mas não há como comparar com a formação de lipossomas. Somado a isto, tem-se um gargalo tecnológico associado à produção de LC do tipo Stealth, cujo problema técnico a ser superado é a formação simultânea de micelas e lamelas, uma vez que o DSPE-PEG pode ser usado para produzir sistema micelar (Wu et al. 2013) . Em solução aquosa, durante o processo de difusão entre o DSPE-PEG e outros fosfolipidios (EPC/DOTAP/DOPE) , os tempos de formação de micelas (IO-3 a IO-6 segundos) e de formação de bicamada fosfolipidica (10-1 a 10-3 segundos) são diferentes (Evans and Wennerstrõm, 1999) . Como o tempo para a formação de micelas é menor, é favorecida a geração de micelas. Os processos de difusão empregados em sistemas microfluidicos para produção de LC do tipo Stealth não são muito eficientes devido à formação de nanoparticulas semelhantes às micelas e possível acúmulo dessas partículas ao longo dos canais, resultando em propriedades físico-químicas desfavoráveis. Outro parâmetro crucial em síntese de LC do tipo Stealth é incorporar a quantidade máxima de PEG na bicamada fosfolipídica antes que o PEG seja convertido em micelas, assim evitando a fase micelar e promovendo a fase lamelar para produzir LC com inserção adequada do lipídeo-PEG. Diversos fatores influenciam a transição de fase (da fase lamelar para a fase micelar) dos conjugados fosfolipídeos-PEG. Foi demonstrado que a principal razão por trás dessa transição de fase é a propriedade polimórfica dos fosfolipídios, que é a propriedade de moléculas anfifílicas que formam agregados de lipídios sob diferentes condições, tais como teor de água, solução orgânica temperatura e pH (Hristova et al. 1995). Entre outros, teor de água e teor de etanol (como solução orgânica) introduzidos no sistema tem uma influência significativa na formação de LC do tipo Stealth. Por este motivo, a investigação da relação entre os fluxos (Flow Rate Ratio - FRR, que é a razão entre a soma das vazões laterais pela vazão central) é muito importante e foi considerado para a solução proposta no presente certificado de adição de invenção.

Breve descrição das figuras

[24] A Figura 1 apresenta um projeto geométrico de estruturas semelhantes a espinha de peixe de dispositivo microfluidico baseado em advecção caótica.

[25] A Figura 2 apresenta configurações de escoamento em dispositivos microfluidicos testados. (A) dispositivo microfluidico à base de difusão (D-MD) ; (B) dispositivo microfluidico baseado em advecção caótica com 3 entradas; (C) Dispositivo microfluidico baseado em advecção caótica com 2 entradas. Os dispositivos microfluidicos mostrados em B e C foram usados para a formação de CL com FRR (relação de vazões) variável (entre 1 e 10), enquanto o D-MD em (A) foi avaliado usando somente FRR 10. A TFR (total flow ratio) foi ajustada para 120,12 pL / min em D-MD, enquanto variou entre 100-1500 pL / min em outros dispositivos.

[26] A Figura 3 mostra a aglomeração de partículas possivelmente causada pela presença de DSPE-PEG (2000) ao longo do canal central durante a produção LC do tipo Stealth em D-MD (A) ; A distribuição de tamanho por intensidade e por volume de LCs do tipo Stealth caracterizados por DLS (Dynamic Light Scattering) (B) ; Propriedades físico-químicas de LCs do tipo Stealth produzidos no mesmo dispositivo microfluidico (C) . Os fluxos centrais (10,92 pL / min) e laterais (54,6 pL / min cada entrada) são fosfolipídeos e PEG dispersos em etanol e solução aquosa, respectivamente . As linhas em cada distribuição de tamanho representam o perfil de três replicatas independentes.

[27] A Figura 4 apresenta a produção de LC em dispositivo microfluidico baseado em advecção caótica. A primeira imagem foi obtida durante as primeiras unidades semelhantes a espinha de peixe do dispositivo, enquanto a segunda e terceira imagens são tiradas no meio do dispositivo. A primeira e segunda imagens foram tiradas em magnitudede 4X e a terceira imagem é tirada em 10X. As setas mostram a direção do fluxo. As imagens foram transformadas de objetos 2D em 3D com programa de computador para facilitar a visualização.

[28] A Figura 5 mostra a distribuição de tamanho baseado em intensidade e volume de LCs convencionais e do tipo Stealth produzidos no CA-MD com 3 entradas em FRR 1 e TFR 500 pL / min. As linhas em cada distribuição de tamanho representam o perfil de três replicatas independentes.

[29] A Figura 6 mostra a intensidade de espalhamento de raios X a baixos ângulos de lipossomas catiônicos convencionais e do tipo Stealth produzidos por CA-MD com 2 e 3 entradas com vazão total de 500 pL/min. A: Medida realizada antes da remoção do etanol; B: Após a remoção do etanol .

[30] A Figura 7 mostra imagens morfológicas de LCs convencionais e do tipo Stealth obtidas de crio-microscopia eletrónica (Cryo-TEM) .

[31] A Figura 8 demonstra a eficiência da transfecção de LCs convencionais e do tipo Stealth em células PC3. A eficiência da transfecção de lipoplexos contendo eGFP pDNA foi medida pela percentagem de células (painel da esquerda) e a intensidade de fluorescência de GFP (painel da direita) . Os gráficos apresentam média e desvio padrão das amostras; n=9. (a) representa a diferença estatística (p < 0,05) entre a média da amostra e o a média de controle (CTRL) corrigida pelo teste de Dunnett; (c) representa a diferença estatística (p < 0,05) entre a média da amostra e lipossomas catiônicos que contém PEG (CL-PEG) corrigida pelo teste de Dunnett.

Breve descrição da invenção:

[32] A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de lipossomas Stealth em sistema microfluídico com alto rendimento baseado em advecção caótica.

[33] Os lipossomas Stealth são formados a partir dos fosfolipídeos fosfatidilcolina de ovo (EPC) , 1, 2-dioleil-3-trimetilamônio propano (DOTAP) e 1, 2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina (DOPE), além do 1, 2-diestearil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina associado ao polietilenoglicol (DSPE-PEG) em uma proporção molar de 50:25:24:1.

[34] O dispositivo microfluídico usado foi fabricado pela técnica de litografia macia em polidimetilsiloxano (PD S) , em que empregaram-se duas correntes correspondentes à fase aquosa e a corrente contendo fosfolipídeos junto com DSPE-PEG (2000 ) dispersos em etanol. Devido à presença de microcanais repetitivos no dispositivo microfluídico, ocorre uma mistura eficiente para promover a formação dos lipossomas .

[35] Ao final deste processo, os solventes orgânicos solúveis em água (como o etanol) , remanescente na formulação final dos lipossomas obtidos, é recuperado pelo uso de um concentrador de centrífuga a vácuo para remoção ou diminuição do teor do mesmo, sem alterar significativamente as propriedades físico químicas das estruturas lipossomais.

[36] Assim, em um primeiro aspecto, o presente Certificado de Adição refere-se a um processo microfluídico de obtenção de lipossomas catiônicos e S tealth que compreende dispositivo microfluidico baseado em advecção caótica e as etapas de:

(i) inserção de 5 a 25 mM de fosfatidilcolina de ovo,

1.2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina (DOPE) ,

1.2-dioleil-3- trimetilamônio propano (DOTAP) e 1,2-diestearil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina com polietilenoglicol (DSPE-PEG) na proporção que varia de 50:20:25:5% a 50:24:25:1% de EPC : DOPE : DOTAP : DSPE-PEG respectivamente, dispersos em 100 % de etanol anidro em um dispositivo microfluidico, a partir de uma vazão total de escoamento que varia de 120 pL min-1 a 1500 pL min-1, sendo que a dispersão resultante na saida do referido dispositivo microfluido compreende teor de etanol na faixa de 33,5 a 51%, preferencialmente 50%;

(ii) meios para recuperação do solvente orgânico excedente e ajuste da concentração lipidica, em que os referidos meios compreendem destilação convencional ou destilação em larga escala, sendo que quando é realizada por esta última a remoção do solvente ocorre em um intervalo de processamento de 1 a 2 horas em concentrador de centrífuga a vácuo.

[37] O referido dispositivo microfluidico compreende 2 (duas) ou 3 (três) entradas e é composto por duas bases de poli dimetil siloxano (PDMS) seladas com plasma de O2, em que uma base contém microcanais e a outra base contém piscinas, construídos pela técnica de litografia macia empregando fotorresiste SU-8, preferencialmente em bolacha de silício, em que as referidas piscinas possuem altura fixa ao longo dos referidos microcanais que causam advecção caótica .

[38] Na concretização do presente Certificado de Adição em que o dispositivo microfluídico compreende 2 (duas) entradas, a vazão total de cada entrada deve ser igual, resultando em vazões individuais de 60 a 1000 mΐ/min.

[39] Na concretrização do presente Certificado de Adição em que o dispositivo microfluídico compreende 3 (três) entradas, o parâmetro de operação FRR ( flow rate ratio que consiste na razão da soma das vazões correntes laterais, aquosas, pela vazão da corrente central, orgânica) deve, preferencialmente, ter o valor de 1 quando a dispersão lipídica e inserida na corrente central e fase aquosa nas laterais, sendo que a referida fase aquosa compreende água ou tampão convencional (tal como PBS IX) . O arranjo pode ser alterado desde que se mantenha a preferencial proporção de 1:1 de fase aquosa e dispersão lipídica. As vazões laterais podem variar de 30 a 500 mΐ/min e a vazão central de 60 a 1000 mΐ/min, sendo que a vazão total de produção pode operar de 100 a 2000 pL/min.

[40] O processo conforme ora proposto permite a formação exclusiva da fase lamelar (La) (formando lipossomas) e impede a formação da fase hexagonal inversa (HII) (outra estrutura diferente de lipossomas) .

[41] Em um segundo aspecto, o presente Certificado de Adição refere-se aos lipossomas Stealth catiônicos obtidos conforme descrição acima e compreenderem de 50:20:25:5% a 50:24:25:1% de EPC : DOPE : DOTAP : DSPE-PEG, preferencialmente 50:24:25:1%; e concentração lipídica final de 25 a 10 mM, preferencialmente 12,5 mM, em que a referida concentração da dispersão lipídica final pode ser modulada, pois a operação de remoção de etanol via concentador à vácuo ou destilação não altera as propriedades fisico-quimicas dos lipossomas até uma concentração critica..

[42] Os referidos lipossomas apresentam diâmetro médio que varia de 250 a 120 nm, preferencialmente 180 nm; índice de polidispersidade (PDI) que varia de 0,13 a 0,3, preferencialmente 0,25; e potencial zeta que varia de +45 a +55 mV, preferencialmente +50 mV quando produzido em água ultra pura.

[43] Em um terceiro aspecto, o presente Certificado de Adição refere-se ao uso dos lipossomas S tealth catiônico, conforme definidos acima, pelo fato de serem aplicados nas áreas agrícola, alimentícia, cosmética, médica; em sistemas de liberação sustentada de biofármacos, vetores de proteínas, de agentes anticancerígenos ; e preferencialmente em terapia e vacinação gênicas .

[44] Dessa forma, os lipossomas Stealth obtidos possuem aplicação em diversas áreas, em especial a área médica, em sistemas de liberação sustentada de biofármacos, incluindo proteínas, de agentes anticancerígenos e principalmente aplicações em terapia e vacinação gênicas.

Descrição detalhada da invenção:

[45] O presente pedido é um certificado de adição do pedido de patente BR 10 2017 025862 9 e este pedido refere-se a um processo de obtenção de lipossomas tipo Stealth em sistema microfluídico com alto rendimento baseado em advecção caótica. O processo ainda inclui uma etapa de recuperação do solvente orgânico utilizado pelo uso de um concentrador de centrífuga a vácuo para remoção ou diminuição do mesmo, e também difere-se do pedido de patente BR 10 2017 025862 9 quanto à configuração do dispositivo microfluidico utilizado. Outra diferença em relação ao pedido de patente BR 10 2017 025862 9 é que não é necessária a utilização de alta força iônica, como por exemplo, a utilização do tampão PBS em alta concentração (5X) . Neste certificado de adição, os lipossomas Stealth são formados a partir de processo com maior teor de etanol (50%), enquanto no pedido de patente BR 10 2017 025862 9 utiliza-se 10%.

[46] O referido processo compreende a etapa de inserção de 25 mM de fosfatidilcolina de ovo (EPC) , 1, 2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina (DOPE) e 1, 2-dioleil-3-trimetilamônio propano (DOTAP) , bem como 1, 2-diestearil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina com polietilenoglicol (DSPE-PEG) em uma proporção de 50:24:25:1% de EPC : DOPE : DOTAP : DSPE-PEG, respectivamente, dispersos em 100% de etanol anidro em um dispositivo microfluidico, a partir de uma vazão total que varia de 120 pL min-1 a 1500 pL min-1. Essa corrente alcoólica é misturada a uma corrente aquosa (que não necessita de sal em sua composição), em uma proporção de 50% de cada corrente. A mistura ocorre em dispositivo microfluidico baseado em advecção caótica que permite a operação em alta produtividade, diferentemente do pedido de patente de invenção BR 10 2017 025862 9.

[47] Ao final do processo, para remoção do excesso e recuperação do solvente orgânico utilizado, emprega-se um concentrador de centrífuga à vácuo por um intervalo de processamento de 1 a 2 horas, sem que essa etapa cause alteração significativa em termos de tamanho, polidispersidade, potencial zeta e morfologia dos lipossomas, além da manutenção da atividade biológica.

[48] O referido dispositivo microfluidico é construído em poli dimetil siloxano (PDMS) utilizando a técnica de litografia macia, conforme metodologia já descrita por Duffy e McDonald (1998).

[49] Portanto, através do processo aqui descrito, empregando dispositivos todo em PDMS e que permite a mistura de correntes laterais compostas por soluções aquosas (com ou sem sal) , seguido de etapa de remoção do solvente orgânico por destilação, obtêm-se lipossomas Stealth com excelentes características físico-químicas em processos reprodutíveis, incluindo tamanho controlado e baixo índice de polidispersidade e unilamelares .

[50] A tecnologia desenvolvida possibilita a aplicação dos lipossomas Stealth em várias áreas, em especial a área médica, em sistemas de liberação sustentada de biofármacos, incluindo vetores de proteínas, de agentes anticancerígenos e principalmente aplicações em terapia e vacinação gênicas.

[51] Mais detalhes sobre os materiais e métodos compreendidos na concretização do presente certificado de adição de invenção, incluindo a fabricação do dispositivo microfluidico, a formação do lipossoma catiônico no referido dispositivo, bem como a remoção do etanol da solução lipossomal, seguem abaixo.

Materiais

[52] 1, 2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) , 1, 2-dioleo-3-trimetilamina-propano (DOTAP) e fosfatidilcolina de ovo (EPC) foram adquiridos da Lipoid (Ludwigshafen, Alemanha) e utilizados como fosfolipídeos para formar lipossomas catiônicos (LC) sem purificão adicional . 1 , 2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [amino (polietilenoglicol ) -2000] (DSPE-PEG (2000) ) foi utilizado para formar lipossomas do tipo Stealth e adquirido da Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabama, EUA) . O etanol foi obtido da Labsynth (São Paulo, Brasil) e utilizado após o processo de desidratação com peneira molecular para dispersar os fosfolipidios . O Kit de Elastômero de Silicone Sylgard® 184, usado para fabricação de dispositivos microfluidicos, foi adquirido da Dow Corning (Auburn, MI, Estados Unidos) . A água deionizada foi obtida da Samtec Biotechnology (São Paulo, Brasil) . O pDNA foi amplificado em bactérias Escherichia coli e purificado usando PureLink™ HiPure Plasmid pDNA Purification Kit-Maxiprep K2100-07 (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos) . Mediu-se espectrofotometricamente a qualidade e quantidade de pDNA com um espectrofotômetro ND-1000 NanoDrop UV-vis (PeqLab, Erlangen, Alemanha) .

Fabricação de dispositivos microfluidicos

[53] Dispositivos microfluidicos baseados em advecção caótica (CA-MD, chaotic advection-based microfluidic device, com 2 e 3 entradas) foram microfabricados de acordo com o método descrito anteriormente por McDonald et al. (2000) usando o Kit de Elastômero de Silicone Sylgard® 184 como material precursor do polidimetilsiloxano (PDMS) . 0 desenho geométrico do canal principal e unidades semelhantes a espinha de peixe (Figura 1) do microdispositivo foram projetados separadamente no software AutoCAD. Após a fotolitografia, os layouts de máscara foram expostos a foto-plotagem com resolução de 8000 dpi, e as exposições em UV foram feitas em uma máscara de contato MJB-3 UV300 alinhada (Karl-Suss, Garching, Alemanha) . As unidades do canal em Ύ' e espinha de peixe, sendo duas camadas de PDMS, foram irreversivelmente seladas através da técnica de selagem por ativação da superfície por plasma de O2 (Plasma Technology PLAB SE80, plasma cleaner, Wrington, Inglaterra) . Antes de selar duas camadas de PDMS, a superfície da camada contendo o canal principal foi mantida em solução de KOH durante 10 segundos para aumentar a eficiência de selagem das camadas de PDMS e depois lavada com etanol para remover a solução do KOH não ligado. Para fortalecer as propriedades mecânicas do microdispositivo, ele foi coberto com uma camada adicional de PDMS. Ambos CA-MD com 2 e 3 entradas possuem 40 sub-unidades semelhantes a espinha de peixe. Método similar foi utilizado para a microfabricação do dispositivo microfluídico baseado em difusão (D-MD, diffusion-based microfluidic device) . Os canais PDMS e o vidro foram irreversivelmente selados oxidando as superfícies usando um limpador de plasma com oxigénio (limpador de plasma Plasma Technology PLAB SE80, Wrington, Inglaterra) . Todos os canais da D-MD possuíam seção transversal retangular com profundidade de 100 pm e largura de 140 pm.

Síntese de liposscmas catiônicos em sistema microfluídicos

[54] A produção de LCs convencionais e do tipo stealth foi realizada usando D-MD (como controle) e CA-MD com 2 e 3 entradas. EPC, DOTAP e DOPE com razão molar de 50:25:25 % foram dispersos em etanol anidro com concentração lipídica de 25 mM. Para a produção de LC do tipo Stealth, a razão molar de EPC, DOTAP, DOPE e DSPE-PEG (2000) foi 50-25-24-1 %. Antes da produção, a solução lipídica foi sonicada durante 15 min a 35° C (Ultrasonic Cleaner 8890, Cole-Parmer) . A solução lipídica e a água deionizada foram carregadas em seringas de vidro com volumes variáveis (Hamilton, NV, Estados Unidos) . Bombas de seringa (PHD Ultra, Harvard Apparatus, Holliston, MA, Estados Unidos) foram usadas para manter taxas de infusão constantes de cada solução nos dispositivos D-MD e CA-MD. A produção de LC em D-MD foi testada apenas em FRR 10 (Figura 2A) . Para o dispositivo CA-MD com 2 entradas, as soluções lipidica e aquosa foram introduzidas através de duas entradas com a mesma vazão (Figura 2B) . Para o dispositivo CA-MD com 3 entradas, diferentes configurações de fluxo foram testadas e o efeito de cada configuração na formação de LC foi avaliado. As configurações testadas do CA-MD com 3 entradas foram as seguintes: (1) solução fosfolipidica através da entrada central, soluções aquosas a partir das duas entradas laterais com o a relação entre a soma das vazões laterais pela vazão central ( Flow rate ratio) - FRR de 10; (2) solução de fosfolipidos através da entrada central, soluções aquosas nas duas entradas laterais com FRR de 1; (3) solução lipidica em uma entrada lateral, soluções aquosas na entrada central e outra na entrada lateral (Figura 2C e 2D) . A vazão total de escoamento (TFRs, total flow rates) variou entre 100 e 1500 pL / min para cada configuração de fluxo usando o CA-MD com 2 e 3 entradas. Em nosso estudo, a razão da taxa de fluxo FRR ( flow rate ratio) é definida como a razão entre a soma dos fluxos laterais e o fluxo central, enquanto a TFR ( Total Flow Rate) é o volume total de fluxo (pL) introduzido nos canais de entrada do dispositivo microfluidico por minuto e que consequentemente gera a vazão de produção dos lipossomas. Durante cada produção, a amostra foi coletada durante três momentos diferentes.

Remoção de etanol da solução de lipossama

[55] A concentração total de etanol na solução final de lipossoma foi de 50% para CA-MD com 2 entradas e CA-MD com 3 entradas, isso gera um FRR 1. No entanto, quando FRR 10 foi utilizado, o teor de etanol foi de 10% para D-MD e CA-MD com 3 entradas. Para remoção do etanol da solução final, utilizou-se o concentrador centrífugo a vácuo (Savant DNA 110 SpeedVac Concentrator, Marshall Scientific, New Hampshire, Estados Unidos) usando a taxa de secagem média. O mesmo procedimento também foi utilizado para a concentração de lipossomas para análises posteriores em técnicas de Crio-Microscopia Eletrónica de Transmissão (Cryo-TEM) e espalhamento de raios X a baixos ângulos (SAXS) , que requerem formulação lipídica altamente concentrada.

Análise Físico-química

[56] O tamanho hidrodinâmico médio ponderado pela intensidade e o índice de polidispersidade (Pdl) dos LCs foram medidos utilizando espalhamento dinâmico de luz (Zetasizer NanoZS, Malvern, Reino Unido) . Foi utilizada a configuração de medição por retroespalhamento, onde a detecção foi realizada em um ângulo de espalhamento de 173°. O comprimento de onda do laser He / Ne e a potência da fonte de energia para análise das partículas lipídicas foram de 633 nm e 4,0 mW, respectivamente . Todas as amostras foram diluídas antes da medição. O potencial zeta foi determinado usando através da técnica de Anemometria a Laser Doppler. A medição foi realizada em triplicata em água a 25 °C (Zetasizer NanoZS, Malvern, Reino Unido) .

Caracterização estrutural usando SAXS síncrotron

[57] As informações estruturais dos LCs produzidos, como a fração de vesículas multilamelares em relação às vesículas unilamelares pequenas (SUVs, small unilamellar liposomes) e o tamanho da bicamada foram obtidas por meio da análise de espalhamento de raios X a baixos ângulos (SAXS, Small Angle X-ray Scattering) . Os experimentos foram realizados na linha de luz SAXS1 do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) utilizando um feixe com energia de 8.3 keV (l = 0.149 nm-1) e uma distância amostra-detector de 880 mm. A intensidade do feixe espalhado é exibida em função do módulo do vetor de transferência de momento Q = 4n sen (Q) / l, onde 2Q é o ângulo de espalhamento e l é o comprimento de onda da radiação. O intervalo típico de valores de Q foi entre 0,20 nm-1 e 5.0 nm-1.

[58] As análises foram realizadas utilizando os modelos descritos em trabalhos anteriores (Balbino et al. 2012, Balbino et al. 2013). Assumimos que o sistema era composto de duas fases: uma fração de vesículas de bicamada única e uma fração de vesículas em multicamadas . Portanto, a intensidade de espalhamento I (Q) pode ser escrita da seguinte forma :

I (Q) =P (Q) Seff(Q)

onde P(Q) é o fator de forma da bicamada e Seff (Q) = fsb + fm SMCT (Q) é o fator de estrutura efetivo, onde fSb é a fração de bicamadas simples, fm=(l-fsb) representa a fração de vesículas em multicamadas e SMCT (q) é o fator de estrutura de Caillé Modificado.

Análise morfológica.

[59] A morfologia dos lipoplexos (LCs e pDNA) produzidos em bulk e os LCs produzidos por microfluídica foram analisadas usando Crio-Microscopia Eletrónica de Transmissão (Cryo-TEM) . Um sistema automatizado de vitrificação (Vitrobot Mark IV, FEI, Holanda) foi usado para a preparação das grades. As grades foram expostas ao tratamento de descarga por incandescência (sistema de descarga easiGlow, Pelco) com corrente de 15 mA durante 25 s para aumentar a hidrofilicidade . As amostras foram preparadas em temperatura (22 °C) e umidade (100%) controladas para evitar a evaporação das amostras. Colocou-se 3 pL de amostra numa grade de cobre revestido de carbono de 300 mesh (Ted Pella) com um tempo de deposição de 3 s . Posteriormente, as amostras foram avaliadas com Jeol JEM-2100 operando a 200 kV com uma faixa de desfocagem de -2 a -4 pm. As imagens foram obtidas usando uma câmera CMOS F-416 (TVIPS, Alemanha) . A aquisição de dados foi realizada no Laboratório de Microscopia Eletrónica do Laboratório Nacional de Nanotecnologia (LNNano, CNPEM, Brasil) .

Estudos de transfecção com células PC-3

[60] As células de adenocarcinoma da próstata caucasianas (PC-3) foram mantidas em meio RPMI (suplementado por 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina e estreptomicina) sob atmosfera húmida a 37 ° C e 5% de CO2. As células foram divididas usando tripsina / PBS a cada 2 ou 3 dias. O ensaio de transfecção foi realizado em células PC3 utilizando o plasmideo pEGFP-Nl (BD Biosciences Clontech, Paio Alto, EUA) (4,7 kpb) . O plasmideo foi amplificado em Escherichia coli e purificado utilizando o Kit de PureLink™ HiPure Plasmid pDNA Purification-Maxiprep K2100-07 (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos) seguindo as instruções do fabricante. A qualidade e quantidade de pDNA foram espectrofotometricamente medidas com um espectrofotômetro ND-1000 NanoDrop UV-vis (PeqLab, Erlangen, Alemanha) . Para experiências de transfecção, 105 células/poço foram adicionadas numa placa de 12 poços e deixadas aderir durante a noite. No dia seguinte, as células foram lavadas uma vez com PBS e incubadas com lipoplexos LC ou LC do tipo Stealth durante 4 horas. Após 4h, o meio foi substituído por meio RPMI completo, e as células foram mantidas na incubadora por 24h. Em seguida, as células foram lavadas com PBS, tripsinizadas e analisadas no citômetro FACScalibur (BD, EUA) .

Análise estatística

[61] Todos os dados obtidos foram expressos como a média de triplicatas com desvio padrão (DP) . O teste de Tukey foi usado para fazer comparações múltiplas de valores obtidos para diferentes taxas de fluxo.

Resultados e discussão

Síntese de LCs convencionais e do tipo Stealth em dispositivo microfluídico baseado em difusão

[62] A produção de LC em dispositivo microfluídico baseado em difusão (D-MD) usando fosfolipídios DOPE / DOTAP / EPC foi anteriormente demonstrada por Balbino et al. 2013. Neste procedimento, a vazão total de fluxo (TFR) e a velocidade do escoamento foram 120,12 pL/min e 143 mm/s, respectivamente, com razão da taxa de fluxo (FRR) de 10 (leva a uma concentração final de 10% de etanol) . A concentração inicial de lipídios na dispersão etanólica foi ajustada para 25 M, enquanto a concentração lipídica na solução de lipossoma produzida foi de 2,27 mM. Foram obtidos LCs com diâmetro médio de 146,8 + 4,9 nm, Pdl 0,12 ± 0,04 e potencial zeta 55,5 ± 2,1 mV, confirmando a alta reprodutibilidade deste procedimento. Parâmetros fisico-quimicos de LCs produzidos por D-MD foram submetidos a 7 meses de armazenamento a 8°C. Além disso, trabalhos anteriores demonstraram que os LCs convencionais produzidos neste sistema eram unilamelares e capazes de transfectar células de carcinoma epitelial humano (HeLa) e linhagem celular de câncer de próstata humana (PC-3) usando DNA plasmidial (pDNA) (Balbino et al. 2012, Balbino et al 2013, Balbino et al., 2016, Balbino et al., 2017) e RNA de interferência (siRNA) (E§ et al . 2018 ) .

[63] A importância da produção de lipossomas catiônicos modificados com polímero PEG foi anteriormente investigado (Kolate et al. 2014). Na primeira investigação, foi testado o D-MD para produção de LCs do tipo Stealth. Utilizando a mesma configuração de processo de produção LC convencional desenvolvida por Balbino et al. 2013, adicionando o DSPE-PEG (2000) (1% da quantidade molar lipídica total) na mesma dispersão lipídica / etanol na corrente central (Figura 2A) . No entanto, ao longo do microcanal central, observou-se intensa aglomeração de partículas (Figura 3A) , que foi um fator significativo para alterar a concentração final e a composição lipídica dos LCs produzidos. Esse comportamento não foi observado na produção LC convencional (sem PEG) e uma possível hipótese é que a difusão das moléculas durante a mistura entre o etanol a a água, facilita agregados ou aglomerados de partículas irregulares (Figura 3A) , na presença de DSPE-PEG (2000). Apesar da formação de agregados ao longo do canal, foi possível produzir nanoagregados (Figura 3B e 3C) . No entanto, quando caracterizados via técnica de Dispersão Dinâmica de Luz (DLS) (Figura 3B) , a distribuição de tamanho por intensidade revelou a presença de populações com tamanhos diferentes (aprox. 30 nm, 125 nm e a terceira com tamanho maior) . Como a distribuição de tamanhos pela intensidade é sensível à presença de populações diferentes (a luz difusa é proporcional ao diâmetro gerado pela sexta potência) (Egelhaaf et al. 1996), foi observado a relevância de diferentes populações no tamanho pelo volume. Nesta distribuição, a população mais relevante é a de 30 nm, caracterizando a formação de micelas possivelmente causadas por moléculas de PEG (Figura 3B) (Johnson e Prud'homme, 2003) .

[64] Uma questão crítica associada à produção de LC do tipo Stealth é a formação incontrolável de micelas (Hu et al., 2012), uma vez que o polímero PEG tem sido usado para formar partículas de micela para aplicações de liberação de fármacos (Danafar et al. 2017). Em solução aquosa, durante o processo de difusão, entre o DSPE-PEG e outros fosfolipídios, a formação da micela (10-3 - 10-6 s) ocorre mais rapidamente que a formação da bicamada fosfolipídica (10_1 - 10-3 s) (Evans e Wennerstrõm, 1999) . Nessas circunstâncias, os processos de difusão empregados em sistemas microfluídicos para produção de LCs do tipo Stealth não são considerados eficientes devido à possível formação de micelas e consequente acúmulo de agregados ao longo do canal, resultando em propriedades físico-químicas desfavoráveis .

[65] Um parâmetro crucial para síntese de LC do tipo Stealth é incorporar a quantidade máxima de PEG na bicamada fosfolipídica (fase lamelar) antes que o PEG seja convertido em micelas (fase micelar) . Diversos fatores desempenham um papel na transição de fase (da fase lamelar para a fase micelar) dos conjugados fosfolipideos-PEG. Foi demonstrado que a principal razão por trás dessa transição de fase é a propriedade polimórfica dos fosfolipidios , que é a propriedade de moléculas anfifilicas que formam agregados de lipídios sob diferentes condições, tais como teor de água, temperatura e pH (Hristova et al. 1995). Outro fator crítico que pode provocar a formação de micelas é o comprimento da cadeia dos conjugados PEG / fosfolipídeo, que está associado ao peso molecular (PM) do PEG (Bedu-Addo et al., 1995). Foi anteriormente demonstrado que o aumento da concentração de PEG a ser incorporada na superfície da bicamada pode resultar em uma fase micelar, que é mais favorável que a fase de bicamada em termos de energia (Hristova e Needham, 1995) . Nesta investigação, utilizou-se PEG (PM = 2000) , mas o sistema microfluídico baseado em difusão (D-MD) foi incapaz de produzir lipossomas livres de micelas. Como uma possível solução para produzir LC do tipo Stealth em D-MD sem formação de micelas, PEG com menos massa molecular poderia ser empregado. No entanto, investigou-se uma solução microfluídica alterando as estratégias de mistura para eliminar a formação de micelas e também alterar o FRR. Por isso, investigou-se o uso do dispositivo microfluídico baseado em advecção caótica (CA-MD) para síntese de LC convencional e do tipo stealth.

Síntese de LCs convencionais e do tipo stealth em dispositivo microfluídico baseado em advecção caótica

[66] Como a formação concomitante de micelas durante a produção de LCs do tipo Stealth é uma desvantagem para aplicações biológicas e a síntese de LCs em plataformas microfluídicas baseadas em difusão requer um tempo de processamento prolongado (apenas 5-10 mL de produção de LC em uma hora) , investigou-se o efeito da advecção caótica na síntese de LC (Figura 4). Neste contexto, um dispositivo microfluídico baseado em advecção caótica (CA-MD) foi produzido, baseado em um dispositivo relatado "Staggered Herringbone Micromixer" (Belliveau et al. 2012), com 2 e 3 entradas para investigar a síntese de LCs convencionais e do tipo Stealth.

[67] Diferente da mistura dominada por difusão, estudos recentes mostraram que o processo de mistura em escoamentos não turbulentos pode ser significativamente melhorado pela alteração do comportamento de partículas complexas usando a advecção caótica, que é um estado de arte inventada a partir da dinâmica não linear de fluxo (Aref, 1984; Aref, 2002; Vijayendran et al . 2003). Neste estudo, a ideia inicial era comparar apenas o efeito da mistura (difusão ou advecção caótica) , mantendo o FRR e a concentração lipídica final (2,27 mM) , bem como a quantidade de solvente orgânico (<10%) nas condições já estabelecidas para o dispositivo baseado em difusão (D-MD) . Portanto, foi utilizado o mesmo FRR (10), que foi usado para o D-MD, para operar o CA-MD com 3 entradas, variando a TFR de 100 a 1500 pL / min.

[68] No FRR 10, o D-MD foi adequado para a síntese de LC convencional. Curiosamente, na mesma FRR, embora não houvesse evidência de agregação no CA-MD (3 entradas) , as propriedades físico-químicas dos LCs convencionais pioraram e a técnica de DLS detectou um pico intenso (perto da região de 10 nm) possivelmente indicando agregação desorganizada, devido à perturbação nos padrões de difusão. Neste caso, o LC convencional produzido no CA-MD (TFR = 120,12 pL / min; FRR = 10) apresentou o tamanho próxima a ~ 110 nm, enquanto o Pdl foi maior que 0,5 e o potencial zeta foi significativamente menor (~ 44 mV) do que os LCs produzidos em D-MD. Para a produção de LC do tipo Stealth no CA-MD (3 entradas) , nenhuma agregação ao longo do canal foi observada; entretanto, de acordo com a caracterização do DLS, as propriedades fisico-quimicas foram semelhantes às LCs convencionais. Tanto no convencional quanto no do tipo Stealth, as propriedades fisico-quimicas apresentaram um grande desvio padrão e a presença de agregados apresentando tamanhos próximos a 10 nm. Os resultados de DLS indicam a formação de estruturas desorganizadas que não estão relacionadas à formação convencional esperada de LC, comprometendo aplicações biológicas e indicando baixa reprodutibilidade do processo.

[69] Como discutido anteriormente, para o dispoditivo D-MD, a difusão é predominante e fortemente depende da velocidade de escoamento, que é a razão pela qual houve a necessidade de usar baixo TFRs, para aumentar o tempo de residência nos microcanais e permitir a formação de gradiente de concentração adequado ao longo do microcanal. Para o CA-MD, uma vez que a mistura ocorre por advecção caótica, levantou-se a hipótese de que esse dispositivo microfluidico poderia funcionar com mais eficiência a taxas de fluxo mais altas (TFR) . Portanto, diferentes TFRs foram testados (até 1500 pL / min) para descobrir se esses resultados poderiam ser atribuídos à velocidade de escoamento. Infelizmente, os resultados de DLS não mudaram significativamente para cada TFR testado. Também foram produzidos CLs Stealth (dados não mostrados) usando as mesmas condições, mas os resultados foram semelhantes aos obtidos com CLs convencionais.

[70] Para investigar os efeitos de mistura do CA-MD (3 entradas) nas propriedades fisico-quimicas dos LCs convencionais e do tipo Stealth, foram realizadas alterações no FRR do sistema. O FRR foi reduzido de 10 para 1 (isso significa que o teor de etanol no final do dispositivo microfluidico aumentou) , mantendo a configuração de fluxo (Figura S2-A) , obtendo resultados promissores em relação ao diâmetro, Pdl e potencial zeta. Inicialmente, testou-se o mesmo TFR empregado no D-MD (120,12 pL / min) para confirmar se o FRR teve um efeito significativo sobre essas propriedades. Os resultados de DLS para LC convencional e do tipo Stealth foram significativamente melhorados. Neste TFR, o diâmetro médio, Pdl e o potencial zeta dos LCs convencionais foram de 200 ± 14 nm, 0,120 ± 0,008 e 61,3 ± 2,7 mV, respectivamente . Comparando com LCs convencionais produzidos em D-MD (FRR 10), os CLs produzidos por CA-MD foram aproximadamente 50 nm maior em tamanho e 6 mV maior em potencial zeta, enquanto Pdl não mostrou diferença significativa. Comparando com as propriedades dos LCs convencionais produzidos por CA-MD obtidos em FRR 10, o diâmetro médio e o potencial zeta dos LCs convencionais em FRR 1 aumentaram significativamente (de ~ 110 nm para ~ 200 nm e ~ 44 mV para 61 mV, respectivamente) . A melhora mais promissora foi observada no Pdl. Pode ser possível produzir lipossomas com Pdl tão pequenos quanto 0,03 em certos TFR, o que torna esses CLs injetáveis no corpo humano (Harashima et al. 1994; Woodle, 1995).

[71] No caso de LCs do tipo Stealth, o diâmetro médio, o Pdl e o potencial zeta foram de 168 ± 1 nm, 0,08 ± 0,03 e 57,0 ± 1,8 mV, respectivamente . As distribuições de tamanho por intensidade e volume de LCs convencionais e do tipo Stealth (Figura 5) indicaram a presença de uma população tipica de lipossomas e na ausência de outros picos menores (que poderiam indicar a formação de micelas) . Além disso, o potencial zeta dos LCs do tipo Stealth foi relativamente menor que o potencial zeta dos LCs convencionais produzidos nas mesmas FRR e TFR. Este comportamento sugere a formação adequada de lipossomas, e no caso de LC do tipo Stealth, o conjugado de DSPE-PEG (2000) foi apropriadamente inserido na estrutura da bicamada de lipossomas sem qualquer formação de micelas. Outra mudança interessante foi observada no diâmetro médio. LCs do tipo Stealth foram aproximadamente 30 nm menores que os convencionais, que podem ser causados pela inserção de PEG. Em seguida, variou-se os TFRs entre 120,12 e 1250 pL / min; no entanto, não se observou nenhuma mudança significativa nas propriedades fisico-quimicas de LCs convencionais e do tipo Stealth.

[72] Além da melhora significativa nas propriedades fisico-quimicas das LCs convencionais e do tipo Stealth produzidos na FRR 1, a concentração lipidica final de LCs também aumentou. A concentração final de lipídeos de LC era 2.27 mM em LCs produzidos em D-MD e CA-MD com 3 entradas operando em FRR 10; no entanto, no FRR 1, a concentração aumentou para 12,5 mM. Além disso, o CA-MD pode operar a TFR de 1500 pL / min sem qualquer alteração nas propriedades físico-químicas para ambas as estruturas lipídicas LCs e Stealth-LCs. Desta forma, a operação com em FRR 1 aumentar a produtividade mássica (g.mL-1.min-1) cerca de 70 vezes (5,5 vezes devido ao aumento da concentração "12,5 / 2,21" e 12,5 vezes devido ao aumento do TFR, 1500/120) em comparação ao D-MD. No entanto, embora essa diminuição no FRR de 10 para 1 tenha resultado em uma maior concentração lipidica final, essa situação também causou um aumento significativo na quantidade total de solvente orgânico (etanol) na solução final (de 9,09 para 50%), é uma preocupação para aplicações biológicas. Deve-se ressaltar que para análise de DLS, todas os lipossomas produzidos foram diluído em águas, atingindo valores equivalentes aos utilizados para medir CLs D-MD. Este procedimento foi aplicado, pois sabes-se que o aumento na concentração de etanol pode alterar o diâmetro médio dos lipossomas .

[73] Na investigação envolvendo o D-MD, levantou-se a hipótese de que a FRR poderia influenciar significativamente a formação de LC, uma vez que o FRR 10 resultou em propriedades físico-químicas desfavoráveis e precipitação ao longo do canal. Desta forma, conduziu-se um conjunto de experimentos, utilizando o D-MD no qual o o FRR foi diminuído para 1 para confirmar se o FRR poderia melhorar as características dos LCs. Após a análise de DLS, observou-se que partículas semelhantes a micelas (menores que 50 nm) não aparecem nos gráficos de distribuição de tamanho (dados não mostrados) . No entanto, o diâmetro médio, Pdl, e o potencial zeta dos LCs do tipo Stealth ficaram em torno de 230 nm, 0,21 e 54 mV, respectivamente . Além disso, a intensidade e a distribuição de tamanho por volume confirmaram a presença de picos acima de 5000 nm, o que poderia indicar uma formação inadequada das partículas. Consequentemente, concluímos que o CA-MD na FRR 1 foi mais eficaz na síntese do LC do tipo Stealth em comparação com o D-MD na FRR 1, portanto. Desta forma, as investigações foram continuadas utilizando-se o dispositivo CA-MD.

[74] Em geral, a formação de nanopartículas é resultado de o processo de nanoprecipitação, que ocorre no contato entre as duas correntes de solvente e fase aquosa. No caso dos lipossomas, a formação é principalmente causada pela alteração da polaridade devido à mistura causada pela geometria do microcanal, que inclui as micropiscinas do CA-MD. Além disso, a área superficial da interface entre o solvente e as fases aquosas aumenta significativamente à medida que os fluidos são dobrados uns sobre os outros, resultando numa mistura caótica. A polaridade pode ser facilmente aumentada ao longo do microcanal, deviso ao processo intrínseco de mistura de etanol e água, favorecendo a formação dos lipossomas. Assim, a alteração do TFR bem como do FRR, que está diretamente associada à proporção entre fase aquoso e solvente, podem exercer grande influência na síntese dos lipossomas. A alteração do FRR muda a proporção etanol/água e por consequência leva a alteração da polaridade da mistura final, influenciando na autoagregação dos lipídeos em bicamadas A taxa de aumento de polaridade e o seu efeito na formação de lipossomas foram previamente demonstrados (Bally et al., 2012, Zhigaltsev et al., 2012). Além disso, observa-se que LCs convencionais e do tipo Stealth apresentaram tamanho médio mior em FRR 1 (~ 170 nm) em comparação com FRR 10 (~ 120 nm) . No FRR 10, a concentração final de etanol foi de cerca de 9,09%, resultando, portanto, numa redução da formação de lipossomas maiores devido à minimização da fusão de partículas e troca lipídica através do fenômeno de amadurecimento de Ostwald. Este fenômeno foi mostrado anteriormente para a produção de LC convencional usando o CA-MD (Kastner et al. 2014). Outra explicação para o aumento no tamanho usando CA-MD na FRR 1 é a presença de maior teor de etanol, pois sabe-se que o etanol, como solvente, interage fortemente com bicamadas fosfolipídicas na interface lipídio-água (composta principalmente de cabeça polar) e não no interior hidrocarbônico . Como consequência da incorporação de moléculas de etanol em bicamadas de vesículas, os lipossomas podem expandir-se (Barry e Gawrisch, 1994).

[75] Outra possível razão para a alteração significativa nas propriedades físico-químicas de ambos lipossomas em diferentes FRRs é a distância (Wf) entre 2 fases aquosas laterais e a fase central do solvente. Para FRR 10, Wf é extremamente pequeno e isso indica um contato intenso entre duas correntes até que as partículas entrem nas primeiras subunidades do canal central semelhantes a espinha de peixe, que foram colocadas a uma distância de 4 mm da seção de cruzamento das entradas central e duas laterais. No entanto, para FRR 1, Wf é consideravelmente maior, uma vez que a proporção de etanol é maior, e há menos contato entre dois fluxos antes de entrar em unidades semelhantes a espinha de peixe. Até o início da mistura de advecção caótica, a difusão ao longo da distância de 4 mm pode ser considerada predominante. Jahn et al. 2010 investigou o efeito do FRR em dispositivos microfluídicos baseados em difusão e à medida que aumentavam FRR, a interface de contato entre o solvente e a fase aquosa se tornou mais próxima e resultou em uma mistura mais rápida e consequentemente lipossomas menores. Os achados sobre o efeito da FRR estão em acordo com estudos anteriores (Kastner et al 2015; Zook e Vreeland, 2010; Jahn et al. 2010), no entanto, a advecção caótica como mistura predominante é empregada neste estudo.

[76] Como foi mostrado anteriormente, a concentração final de lipídios dos LCs produzidos no CA-MD (3 entradas) em FRR 10 e FRR 1 foi de 2,27 e 12,5 mM, respectivamente . O aumento na concentração de fosfolipídios no sistema microfluídico é outro fator crítico que pode influenciar a formação adequada de lipossomas em FRR 1. Para a produção microfluídica baseada em difusão (D-MD) , esse aumento pode prejudicar a eficácia da difusão, pois pode interferir na formação de vários fragmentos de bicamadas e, consequentemente, formam vesículas lipídicas maiores e polidispersas . No entanto, na produção microfluídica baseada em advecção caótica, esse aumento não afetou negativamente a formação de lipossomas. O FRR baixo aumenta Wf na entrada do canal principal (antes de começar advecção caótica) , minimizando o contato entre o etanol e a fase aquosa. Em seguida, inicia-se a mistura caótica de advecção e a alta porcentagem de etanol pode provavelmente controlar a formação do fragmento das bicamadas, devido a mudanças na polaridade, favorecendo a formação de lipossomas com características adequadas. Mas, a concentração de etanol deve ser mantida até um determinado valor, uma vez que a quantidade excessiva de solvente pode-se incorporar nas bicamadas das vesículas e assim simplesmente rompe-las.

[77] Assim, a fim de melhorar o sistema, o dispositivo microfluídico baseado em advecção caóticac (CA-MS) foi adaptado as mesmas condições de processo para gerar o CA-MD com 2 entradas. A proporção solvente: água foi mantida idêntica ao obtido anteriormente em 1:1. Assim, diferentes TFRs variando de 100 a 1250 pL / min foram testados. A análise do tamanho de partículas por DLS mostrou resultados semelhantes aos obtidos com CA-MD de 3 entradas, com ao mesmoFRR 1. Para todos os TFRs testados, LCs convencionais apresentaram diâmetro médio, Pdl e, potencial zeta de 163 + 13 nm, 0,13 + 0,03 e 62 + 1 mM, respectivamente, enquanto os LCs do tipo Stealth apresentaram diâmetro médio, Pdl e, potencial zeta de 153 + 5 nm, 0,11 + 0,01 e 60 + 2 mV, respectivamente. Após a análise do teste t, como esperado, não houve diferença estatística entre LCs convencionais e do tipo Stealth, produzidos via CA-MD (3 entradas) ou CA-MD (2 entradas) . Embora o potencial zeta fosse ligeiramente menor em LC do tipo Stealth, a diferença não foi suportada estatisticamente. Além disso, não se observou nenhum pico que pudesse caracterizar estruturas correspondentes a micelas (ordem de 10 - 30 nm) , sugerindo a formação adequada de lipossomas. O diâmetro das partículas por tanto intensidade como por volume foram semelhantes aos LCs obtidos com o CA-MD com 3 entradas na FRR 1. A produção de LCs convencionais no CA-MD foi previamente demonstrada por Kastner et al. 2015; no entanto, os lipossomas produzidos foram caracterizados apenas pela técnica de DLS, não apresentando dados associados à distribuição de tamanho por intensidade, volume ou número. Os LCs convencionais apresentaram tamanho médio, Pdl e potencial zeta de aprox. 180 nm, 0,2 e 60 mV, respectivamente, usando a proporção de solvente/fase aquosa de 1. Diferente de nosso estudo, eles usaram a formulação fosfolipidica DOTAP / DOPE. De acordo com o estudo anterior (Koltover, 1998), a formulação DOTAP / DOPE não permite a formação adequada de bicamadas lipidicas, pois pode resultar na coexistência de ambas as fases lamelar (La) e hexagonal invertida (Hn) , o que pode causar instabilidade dos lipossomas. Esta presença de La e Hn é relevante para aplicações farmacêuticas, uma vez que essa variação leva a uma interação diferenciada nas células, consequentemente, criando uma variação considerável. No mesmo estudo de Koltover, 1998, a inclusão de EPC (50 mol%) resultou na formação exclusiva de bicamadas lipidicas caracterizando a formação de lipossomas. Portanto, embora o estudo de Kastner et al., 2015 declare que são formados lipossomas, não há evidência cientifica que suporte sua afirmação. O presente certificado de adição relata que é possível produzir LCs sem a presença da fase hexagonal inversa (Hn) . Além disso, esses resultados foram comparados ao processo convencional baseado em difusão (D-MD) . Além disso, a solução tecnológica ora proposta mostra a capacidade de produzir LC do tipo Stealth.

[78] Diferente da produção de LC convencional, 1% dos conjugados de DSPE-PEG (2000) foi introduzido no sistema juntamente com outros fosfolipídios . De acordo com os resultados de potencial zeta, a inclusão do lipídeo DSPE-PEGgerou uma diminuição de ~ 5 mV, comparado aos LCs convencionais, o que pode indicar a presença de PEG na superfície externa do LC.

[79] Na maioria dos casos, a inserção de DSPE-PEG (2000) pode diminuir significativamente a carga de superfície dos lipossomas devido à ação Sstealth (Frõhlich, 2012). No entanto, esta diminuição também depende da quantidade de PEG incorporada na superfície dos LCs, bem como a formulação de fosfolipídeo e o processo utilizado para incorporação de PEG em lipossomas. Até agora, as concretizações do presente Certificado de Adição foram conduzidos com l%molar de DSPE-PEG. Para melhor compreender o efeito do polímero de PEG incorporado nos LCs, os experimentos foram repetidos com o lipídeo DSPE-PEG à concentração de 5%. Primeiramente, realizou-se o experimento utilizando o CA-MD (3 entradas) com FRR 10, e os resultados foram semelhantes semelhantes aos LCs e LCs do tipo Stealth com 1% de DSPE-PEG) . Os resultados da distribiução de tamanhos (DLS) mostraram diferentes picos abaixo de 10 nm, possivelmente pertencentes a estruturas semelhantes a micelas. À medida que se diminuiFRR de 10 para 1 no CA-MD (3 entradas) , os resultados de tamanho, mais uma vez, foram significativamente melhorados. O tamanho médio, Pdl e potencial zeta dos LCs do tipo SStealth (5% PEG) foram 145,1 ± 1,5 nm, 0,11 ± 0,01 e 61,0 ± 1,8 mV, respectivamente . A análise estatística não mostrou diferença significativa entre os LCs do tipo Stealth produzidos no mesmo sistema com 1% de PEG. No entanto, quando foi testado o CA-MD (2 entradas) , LCs do tipo Stealth apresentaram tamanho médio de 144 ± 3 nm, Pdl de 0,12 ± 0,01 e potencial zeta de 51,4 + 4,4 mV. Comparando com o CA-MD (3 entradas) em FRR 1, o tamanho e o Pdl não mudaram; no entanto, observou-se uma diminuição significativa no potencial zeta após a inserção de 5% de PEG. As densidades de carga superficial dos LCs convencional e do tipo Stealth foram 61,3 ± 2,7 mV e 62 ± 1 mM, respectivamente. Com a inclusão de 5% de conjugados de DSPE-PEG (2000) , a densidade de carga superficial diminuiu para 51,4 ± 4,4 mV. Este resultado mostra que o aumento da quantidade de DSPE-PEG (2000) utilizada para produzir LCs do tipo Stealth resultou na incorporação destas moléculas na superfície externa.

[80] Wolfram et al. (2014) incorporaram PEG (1%) em sua formulação lipossomal aniônica (PC, colesterol, DPPEmPEG (2000) com razão molar de 6: 3: 1) e obtiveram uma diminuição de ~ 5 mV no valor de potencial zeta. Resultados semelhantes foram mostrados por Yang et al. (2007). Eles produziram lipossomas convencionais utilizando S100PC / CH (razão molar 90:10) e o lipossoma PEGuilado composto por S100PC / CH / MPEG (2000) -DSPE (proporção molar 90: 10: 5). Os lipossomas convencionais tinham cerca de zero carga superficial, enquanto a inserção de PEG (5%) reduziu o potencial por 20 mV. Além disso, observaram que a solução líquida em que os lipossomas estão suspensos também afeta a carga superficial dos lipossomas. O potencial zeta dos lipossomas PEGuilados variou em ± 2-4 mV dependendo da presença da solução de Tween 80. Curiosamente, os resultados foram contrários no estudo realizado por Kim et al. (2010). LCs convencionais compostos de DOTAP / DOPE / Chol / PEG na proporção de 75: 20: 5: 0 tinham potencial zeta de 15,4 + 7,5 mV, enquanto a inserção de DSPE-PEG (2000) (70: 20: 5: 5) aumentou o potencial zeta para 25,3 ± 5,7 mV. Nesta formulação, o DOTAP é o único fosfolipídio que fornece propriedades catiônicas aos LCs. Portanto, a redução de 5% na concentração de DOTAP substituída pelos conjugados de DSPE-PEG (2000) também deve diminuir a densidade de carga de superfície dos LCs, e com a inserção adequada de PEG na superfície, o potencial zeta total deve ter diminuído ainda mais. Contudo, o potencial inesperadamente aumentou.


[81] Como apresentado anteriormente, a porcentagem final de etanol presente na formulação de LC foi de 50% em CA-MD (3 entradas, FRR 1) e CA-MD (2 entradas) , o que é considerado uma limitação significativa para futuras aplicações biológicas. Na maioria das vezes, a remoção de etanol da solução lipídica final é conduzida pelo processo de diálise. No entanto, a diálise é um processo demorado (dependendo do volume final da solução, pode ser de até dias) e o trabalho necessário para realizar com sucesso. Os solventes do tipo etanol são normalmente removidos da solução final via diálise. No entanto, para produções industriais, a diálise não é um processo viável, uma vez que requer um alto volume de solução de diálise, bem como pesquisadores qualificados. Portanto, também no presente Certificado de Adição é proposto uma nova solução tecnológica para a remoção eficiente do etanol da solução lipossomal. Para tanto, foi utilizado um concentrador de centrífuga a vácuo a baixa pressão e temperatura ambiente como um processo alternativo de destilação. Resumidamente, o concentrador de centrífuga a vácuo usa uma combinação de força centrífuga, vácuo e calor para acelerar a taxa de evaporação de múltiplas amostras pequenas. No entanto, este processo pode alterar significativamente a estrutura ou morfologia e até mesmo atividades biológicas de amostras sensíveis, como pDNA e siRNA. Portanto, todas as análises físico-químicas, estruturais e morfológicas devem ser avaliadas para controlar se houve alguma alteração nessas propriedades. Por essa razão, produziu-seas dispersões lipossomis e avaliou-se o efeito do processamento no concentrador de centrífuga a vácuo para remover o etanol. Assim, considerando as taxas de evaporação do etanol e da água residual após a remoção do etanol, a porcentagem de etanol remanescente na dispersão lipossomal foi insignificante e aceitável para estudos posteriores de transfecção. Porém, não se observou alterações significativas nas propriedades físico-químicas (Tabela 1) .

Tabela 1: Comparação da propriedades físico-químicas dos lipossomas antes e após a remoção de etanol via concentrador de centrífuga a vácuo. LCs convencionais e LCs do tipo Stealth (1% DSPE-PEG (2000 ) ) foram obtidos em CA-MD, FRR 1 com 2 entradas.

[82] Pode-se observar na Tabela 1 que o tamanho médio dos LCs convencionais e do tipo Stealth foi quase similar logo após a produção nas entradas CA-MD com 2 entradas. A diferença no tamanho médio após o processo de remoção de etanol não foi estatisticamente significativa. As mudanças mais significativas foram observadas em Pdl e potencial zeta. Pdl aumentou de 0,1 para 0,24 para LCs do tipo Stealth. Embora este aumento possa ser estatisticamente significativo no caso de LC do tipo Stealth, ainda é aceitável para estudos de transfecção. O potencial zeta dos LCs convencionais produzidos neste micromisturador é de cerca de 60 mV. A inserção de DSPE-PEG (2000) envolve modificação de superfície, portanto, diminui o potencial zeta de sistemas coloidais. Mas observamos uma diminuição adicional na carga de superfície dos LCs após o emprego de concentrador de centrífuga a vácuo. Essa situação poderia ser vantajosa, já que um potencial muito alto pode causar um efeito tóxico nas células animais (Frõhlich, 2012).

[83] Tempo e taxa de remoção do etanol são fatores essenciais que afetam a velocidade de evaporação do etanol. Como mencionado anteriormente, a evaporação do etanol ocorre mais rapidamente que a da água. Pesquisas anteriores (Balbino et al. 2013) demonstraram que certa quantidade de resíduo de etanol (cerca de 8%) na solução final de LC, e após nossos estudos biológicos, não houve diminuição na eficiência de transfecção testada com a formulação final com teor de etanol. Além disso, a formulação de LC não apresentou citotoxicidade significativa para as células. À medida que continuamos a empregar o concentrador de centrífuga a vácuo, a solução de LC começa a perder uma quantidade significativa de água e torna-se mais concentrada, o que altera as propriedades dos lipossomas. Portanto, é essencial interromper o processo de concentrador de centrífuga a vácuo no tempo para minimizar o efeito do processo de remoção de etanol nos LCs. Por esta razão, uma solução de etanol (100%) com 1 mL de volume em um tubo de Eppendorf contendo metade do volume total das amostras de LC (2 mL = 1 mL de água + 1 mL de etanol) para ser passado através do processo de remoção de etanol foi colocado em concentrador de centrífuga a vácuo e, quando 1 mL de solução de etanol foi completamente evaporado, o concentrador de centrífuga a vácuo foi parado e as amostras foram retiradas para análise posterior. Essa otimização simples foi considerada suficiente para obter LCs com alterações mínimas em suas propriedades.

Análise de espalhamento de raios X a baixos ângulos (SAXS)

[84] O SAXS é usado para estudar a estrutura de uma variedade de materiais biológicos. Ele fornece informações sobre a forma, tamanho e organização de coloides, cristais líquidos, polímeros e muitas outras estruturas. Uma vez que os lipossomas são vesículas esféricas que consistem em bicamadas fosfolipídicas com propriedades anfifílicas, o seu arranjo na presença de solução aquosa é importante para formar lipossomas com estrutura bem definida. Este arranjo pode variar significativamente dependendo do método de fabricação, bem como do tipo de fosfolipídios usados na formulação. A caracterização do SAXS permite o acesso, por meio de modelagem, à densidade eletrónica através da membrana, fornecendo informações sobre o perfil da bicamada e a lamelaridade, entre outros parâmetros estruturais. A estrutura final dos complexos lipossoma / DNA afetará a internalização celular e, consequentemente, a eficiência da transfecção .

[85] Inicialmente, foi analisado o efeito do misturador microfluidico baseado em advecção caótico na estrutura de lipossomas catiônicos com / sem DSPE-PEG (2000) . Não foi encontrado na literatura estudos para explorar a análise estrutural de lipossomas produzidos neste microdispositivo operado com advecção caótica. A Figura 6A mostra curvas de SAXS para LCs com e sem lipidos PEGuilados produzidos em microdispositivos CA-MD com 2 e 3 entradas (2 configurações de fluxo diferentes)". A partir de curvas ajustadas (não mostradas) usando um modelo descrito em outro estudo [Balbino et al. 2012 e Balbino et al. 2013], é possível inferir que esses sistemas são unilamelares (> 99%) , e há uma pequena diferença entre seu perfil eletrónico de densidade. TAvaliou-se ambém o efeito do concentrador de centrífuga a vácuo, utilizado para remover parcialmente ou completamente o etanol da formulação final dos lipossomas. A Figura 6B mostra curvas SAXS para os mesmos sistemas após a remoção de etanol. Nas curvas, é possível observar uma diferença razoável nos perfis das curvas quando comparadas às obtidas antes da remoção do etanol. Essas diferenças estão relacionadas à saida do etanol da bicamada, que altera a densidade eletrónica da bicamada (fator de forma de bicamada) , como pode ser inferido a partir de ajustes de curva (não mostrados) . De acordo com a modelagem, também foi possível constatar que a lamelaridade não sofreu alterações significativas (os sistemas mantiveram a multilamelidade abaixo de 1%), mostrando que os sistemas são estáveis quanto a essa propriedade mesmo após o uso do concentrador de centrífuga a vácuo.

Caracterização morfológica de lipossomas catiônicos

[86] A lamelaridade lipossómica (uni- ou multi-) tem uma grande importância na eficiência de entrega de material genético. Na maioria das aplicações, a estrutura unilamelar de LCs é altamente recomendada e mostrou-se mais eficiente para entregar material genético. Técnicas como DLS e SAXS podem fornecer informações cruciais sobre essa propriedade de LCs por meio de modelagem matemática. No entanto, a análise morfológica pode fornecer uma informação adicional sobre a característica uni ou multilamelar dos lipossomas produzidos. Por esse motivo, a técnica de crio-microscopia eletrónica (Cryo-TEM) foi utilizada para caracterizar os LCs e Stealth LCs.

[87] De acordo com as imagens apresentadas na Figura 7, todas as amostras de LCs produzidos no CA-MD (2 entradas) mostraram-se unilamelares e suportaram os resultados obtidos de DLS e SAXS. Observou-se também que os LCs convencionais e do tipo Stealth mostraram Pdl e diâmetros baixos entre 150-200 nm, em concordância com os resultados obtidos por DLS. Devido ao pequeno tamanho do PEG e à sua menor influência nas propriedades físico-químicas dos lipossomas, não foi possível identificar qualquer diferença morfológica entre LCs convencionais e do tipo Stealth. Além disso, a inserção de DSPE-PEG nos lipossomas LC resulta em redução da taxa de captação por macrófagos e tempo prolongado de circulação na corrente sanguínea. Consequentemente, requer mais tempo para um LC PEGuilado transfectar células, uma vez que o PEG retardará o processo de transfecção, diminuindo a interação da superfície entre células e LCs .

Avaliação in vitro da eficiência da transfecção de lipoplexos

[88] A atividade biológica (eficiência de transfecção) de formulações de LCs convencionais e do tipo Stealth foi investigada em células PC-3. Antes dos estudos de transfecção, o etanol residual foi removido para evitar efeitos tóxicos de LCs convencionais e do tipo Stealth usando o concentrador de centrífuga a vácuo. LCs convencionais mostraram um nível de transfecção de aproximadamente 20%, enquanto os LCs do tipo Stealth apresentaram eficiência de transfecção significativamente menor (~ 5%) . O mesmo padrão foi observado para a intensidade de fluorescência da GFP (Figura 8). A diminuição no nível de transfecção usando LC do tipo Stealth pode ser explicada com o efeito stealth do DSPE-PEG (2000) na superfície dos lipossomas, impedindo a interação com as células PC3.

Conclusão

[89] A produtividade dos processos é uma questão importante na produção industrial. Esta questão torna-se mais crítica nas indústrias farmacêuticas, devido à complexidade do sistema de produção, bem como materiais caros que trazem graves preocupações económicas. Com as concretizações do presente Certificado de Adição foi possível demonstrar que a produção microfluídica de alto rendimento de lipossomas catiônicos, com proporção de etanol de 50%, seguido de operação de remoção de etanol em concentrador a vácuo na formação permite a formação de lipossomas catiônicos e também do tipo Stealth (com até 5% de lipideo-PEG) . Neste último caso, o processo apresentado evita a formação concomitante de micelas, indesejáveis para aplicações biológicas. De acordo com as análises de Cryo-TE e SAXS, os LCs convencionais e do tipo Stealth apresentaram estrutura unilamelar e eficiência de transfecção significativa em linhas celulares de próstata humana (PC-3) . Com um único dispositivo microfluidico (~ 4 cm x 7 cm) , seria possível produzir cerca de 100 ml de LC em uma hora. Considerando 12 horas de produção contínua, com número suficiente de dispositivos microfluídicos que ocuparão 1 m2 de área, é possível produzir 400 L de LC, o que é altamente aceitável para produção em escala industrial. Devido à simplicidade do processo de remoção de etanol, a mesma quantidade de LC pode ser processada usando concentrador de centrífuga a vácuo adaptado para escala industrial sem alterar quaisquer propriedades estruturais, morfológicas e biológicas de LCs. O processo que proposto é promissor para a produção de LC em escala industrial é possível fornecer vetores não virais seguros, eficientes e livres de solvente para entrega de genes.

[90] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes, abrangidas no escopo das reivindicações anexas.