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1. WO2020007087 - COMPOSITION PHARMACEUTIQUE POUR LE TRAITEMENT DU LYMPHOME À LYMPHOCYTES B

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说明书

发明名称  (R37.2) 0001   0002   0003   0004   0005   0006   0007   0008   0009   0010   0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061   0062   0063   0064   0065   0066   0067   0068   0069   0070   0071   0072   0073   0074   0075   0076   0077   0078   0079   0080   0081   0082   0083   0084   0085   0086   0087   0088   0089   0090   0091   0092   0093   0094   0095   0096   0097   0098   0099   0100   0101   0102   0103   0104   0105   0106   0107   0108   0109   0110   0111   0112   0113   0114   0115   0116   0117   0118   0119   0120   0121   0122   0123   0124   0125   0126   0127   0128   0129   0130   0131   0132   0133   0134   0135   0136   0137   0138   0139   0140   0141   0142   0143   0144   0145   0146   0147   0148   0149   0150   0151   0152   0153   0154   0155   0156   0157   0158   0159   0160   0161   0162   0163   0164   0165   0166   0167   0168   0169   0170   0171   0172   0173   0174   0175   0176   0177   0178   0179   0180   0181   0182   0183   0184   0185   0186   0187   0188   0189   0190   0191   0192   0193   0194   0195   0196   0197   0198   0199  

权利要求书

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16  

附图

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29   30   31   32   33   34   35   36   37   38   39   40   41   42   43   44   45   46   47   48   49   50   51   52   53   54   55   56   57   58   59   60   61   62   63   64   65   66   67   68   69   70   71   72   73   74   75   76   77   78   79   80  

说明书

发明名称 : [根据细则37.2由ISA制定的发明名称] 治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物

技术领域

[0001]
本发明涉及一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物,尤其涉及一种治疗复发/难治性B细胞淋巴瘤的药物组合物。

背景技术

[0002]
耐药性问题一直是癌症治疗中的一大困扰,这种获得性耐药至少部分来源于肿瘤内部的细胞类型异质性,包括各种快速生长的分化癌细胞和极少数生长缓慢的癌症干细胞(Cancer Stem Cell,CSC)。虽然肿瘤传统疗法,如放疗和化疗等,能消除肿瘤中大多数的分化细胞,但癌症干细胞却依然存活着,这可能是促进耐药性发展的一个重要原因。CSC最初在白血病中被发现,比例极低,但可播种新肿瘤,后续进一步在实体瘤中得到证实。CSC具有特定的膜蛋白标志物,具有自我更新、分化和静息能力,以及与耐药、复发和转移高度相关的特征。因此,本领域技术人员一直致力于研发一种传统疗法和CSC特异性疗法的组合疗法。
[0003]
累积数年或数十年的一系列遗传学事件,包括癌基因的激活或过表达,和/或抑癌基因的低表达或缺失表达,最终均可导致肿瘤的发生和发展。随着肿瘤的进展,肿瘤逐渐丧失分化表型,并获得干细胞样特征,CSC比例增加,导致肿瘤远处转移,以及对治疗的耐药。然而,目前通过间接减缓CSC生长或直接清除CSC来逆转耐药的各种尝试均远未取得成功,包括通过CSC依赖性的信号传导分子(Wnt/β-连环蛋白、Hedgehog、Notch、NF-κB、FAK、PTEN、Nanog和JAK/STAT等)抑制剂、肿瘤微环境调节剂、通过CD44靶向纳米颗粒药物或CD133靶向免疫疗法,以及分化疗法。值得注意的是,用全反式维甲酸(ATRA)/三氧化二砷(ATO)药物治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)的分化疗法并非直接针对CSC。APL以表达PML/RARA融合基因产物为特征,而仅仅应用ATRA通过诱导PML/RARα的降解、细胞凋亡和终端分化,就可实现APL患者约85%的完全缓解率。但是,该分化治疗方案对其他造血系统恶性肿瘤和实体瘤尤其是它们的CSC是无效的。目前,特异性靶向CSC的分化治疗方案主要采用组蛋白去乙酰化酶抑制剂(如辛二酰苯胺异羟肟酸)和组蛋白甲基转移酶抑制剂(如EZH2抑制剂),然而,这些表观遗传学药物仍处于研究的早期阶段,且它们的副作用仍需后续进一步评估。
[0004]
SOX2是一种细胞干性相关转录因子,对于胚胎干细胞和诱导多能干细胞的干性维持至关重要。然而,SOX2在肿瘤细胞中的表达却可促进肿瘤增殖、侵袭转移,诱导治疗耐药,对肿瘤治疗带来非常不利的影响。针对SOX2的表达调控研究,主要集 中于非编码RNA对SOX2的调控,而对于SOX2的转录调控和翻译后修饰的报道则很少。另外,PI3K/AKT信号通路不仅在肿瘤发生、肿瘤进展和耐药性方面发挥重要调控作用,而且对CSC的调控也飞回重要作用。有报道表明,PI3K/AKT信号通路的激活可通过调控SOX2的甲基化(K119位)和磷酸化(T118位)开关,而抑制SOX2的泛素化,从而增加SOX2的蛋白稳定性。
[0005]
非霍奇金淋巴瘤(NHL)引起的肿瘤患者死亡率已位列与肿瘤相关死亡率的前十位,其中的弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是又是NHL最常见的亚型,占所有成人淋巴瘤的30%。根据基因表达谱分析结果目前将DLBCL又进一步细分为三种不同的亚亚型:生发中心B细胞样(GCB)、活化B细胞样(ABC)和比例更低(10-20%)的原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)。尽管一半以上的DLBLC患者可以通过R-CHOP(利妥昔单抗/R、环磷酰胺/C、多柔比星/H、长春新碱/O和强的松/P)方案治愈,但是多达三分之一的患者最终复发。这些患者剩余可供选择的治疗方案,包括高剂量化疗和自体干细胞移植,其效果及其有限,成功率极低,最终导致死亡。因此,迫切需要开发新的治疗复发/难治性DLBCL的方法。
[0006]
发明内容
[0007]
有鉴于现有技术中存在的上述问题,本发明的目的是提供一种治疗B细胞淋巴瘤的方法及其药物,特别是针对复发/难治性B细胞淋巴瘤的治疗方法及其药物。
[0008]
为实现上述目的,本发明通过大量的实验研究找到了一种针对CSC的独特治疗策略,称为促分化疗法(pro-differentiation therapy,PDT),该方法的治疗机理如图80所示。简而言之,在RCHO耐药的DLBCL细胞中,BCR-和TCF-3/SHP-1介导的Syk、整合素、CCR7和FGFR1/2多种信号分子均可以激活PI3K/AKT通路,进而增强SOX2磷酸化和减少SOX2甲基化,从而稳定SOX2不被泛素化降解,最终,上调的SOX2可通过CDK6或FGFR1/2(取决于耐药DLBCL细胞的亚型)提高癌症干细胞(CSC)的比例,延长了CSC的存活时间,从而诱导DLBCL细胞对RCHO的耐药。当与R-CHOP联合用药时,PI3K/AKT信号通路抑制剂通过加速SOX2的泛素化降解,进而促进CSC的分化,导致原来耐药的DLBCL细胞对R-CHOP治疗异常敏感,最终完全逆转耐药。
[0009]
基于上述的治疗原理,本发明首先提供了一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物,包括促进CSC分化的药物和化疗药物。
[0010]
进一步,所述治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物包括PI3K/AKT信号通路抑制剂和化疗药物。
[0011]
进一步,所述化疗药物还可以是任意一种或多种对肿瘤有效的化疗药物。优选地,所述化疗药物选自环磷酰胺(C)、多柔比星(H)和长春新碱(O)中的一种或几种;在本发明的一种优选实施方式中,所述化疗药物为前述三种药物和激素药物强的松(P)的组合。
[0012]
优选地,所述治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物还包括靶向CD20的单抗,包括但不限于利妥昔单抗(Rituximab,R)。
[0013]
进一步,所述治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。
[0014]
进一步,所述PI3K/AKT信号通路抑制剂可选自PI3K抑制剂和AKT抑制剂;更进一步,所述PI3K/AKT信号通路抑制剂可以是PI3K/AKT上游和下游的相关蛋白的抑制剂。
[0015]
进一步,所述PI3K抑制剂为广谱型PI3K抑制剂或亚型特异性PI3K抑制剂;所述PI3K抑制剂包括但不限于:噻吩并嘧啶类及其衍生物、噻吩并吡喃类及其衍生物、嘧啶类及其类似物、喹唑酮类及其类似物、双烯酮类及其类似物、咪唑并喹啉类及其类似物、咪唑并吡啶类及其衍生物、噻唑烷二酮类及其衍生物、Pyridofuropyrimidines及其类似物。
[0016]
优选地,所述PI3K抑制剂选自IPI-145(INK1197,duvelisib)、其衍生物、其药学上可接受的盐、其溶剂合物和其前药中的一种或多种;IPI-145(INK1197,duvelisib)是一种选择性PI3Kδ/γ抑制剂,duvelisib具有如下式I所示的化学结构:
[0017]
[0018]
进一步,所述AKT抑制剂包括但不限于:PH结构域抑制剂、变构抑制剂、ATP竞争性抑制剂,如MK-2206、GSK690693、Ipatasertib(GDC-0068)等。
[0019]
在本发明的一种实施方式中,所述PI3K/AKT信号通路抑制剂为PI3K/AKT上游蛋白抑制剂,优选自FAK抑制剂、Syk抑制剂和Src抑制剂中的一种或几种;所述FAK抑制剂优选自PF-573228(式II)、其衍生物、其药学上可接受的盐、其溶剂合物和其前药中的一种或多种,所述Syk抑制剂优选自R788(Fostamatinib,式III)、其衍生物、其药学上可接受的盐、其溶剂合物和其前药中的一种或多种;所述Src抑制剂优选自saracatinib(AZD0530,式IV)、其衍生物、其药学上可接受的盐、其溶剂合物和其前药中的一种或多种,结构式II-IV如下所示:
[0020]
[0021]
[0022]
[0023]
进一步,所述PI3K/AKT信号通路抑制剂为调节耐药细胞干细胞性的PI3K/AKT/SOX2轴抑制剂;优选地,所述PI3K/AKT/SOX2轴抑制剂为SOX2下游蛋白抑制剂,所述下游蛋白优选为CDK6和/或FGFR1/2。
[0024]
在本发明的一种优选实施方式中,所述PI3K/AKT/SOX2轴抑制剂为CDK6抑制剂,可选自但不限于:abemaciclib、Ribociclib、Palbociclib,最优选自abemaciclib(LY2835219)、其衍生物、其药学上可接受的盐、其溶剂合物和其前药中的一种或多种,abemaciclib具有如下式V所示的化学结构:
[0025]
[0026]
在本发明的另一种优选实施方式中,所述PI3K/AKT/SOX2轴抑制剂为FGFR1/2抑制剂,可选自但不限于:BGJ398、AZD4547、PRN1371、LY2874455、FIIN-2,最优选自AZD4547、其衍生物、其药学上可接受的盐、其溶剂合物和其前药中的一种或多种,AZD4547具有如下式VI所示的化学结构:
[0027]
[0028]
本发明发现CSC在耐药性DLBCL细胞中的比例显著升高,其干细胞性由活化的PI3K/AKT/SOX2轴调节。此外,PI3K/AKT信号通路抑制剂通过降低SOX2水平将CSC转化为分化的肿瘤细胞,从而在与R-CHOP方案结合时能完全阻止接种的耐药性细胞的生长。
[0029]
基于上述研究成果,本发明还提供了一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物,其包括不同规格单位制剂的PI3K/AKT信号通路抑制剂、靶向CD20的单抗和化疗药物及药学上可接受的载体或赋形剂,用于同时、分别或依次给药。
[0030]
优选地,所述靶向CD20的单抗为利妥昔单抗。
[0031]
进一步,所述化疗药物可以是任意一种或多种对肿瘤有效的化疗药物。优选地,所述化疗药物选自环磷酰胺、多柔比星和长春新碱中的一种或几种;在本发明的一种优选实施方式中,所述化疗药物为前述三种药物和激素药物强的松的组合。
[0032]
进一步,本发明提供了一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物,包括PI3K/AKT信号通路抑制剂和药学上可接受的载体形成的第一制剂、靶向CD20单抗及药学上可接受的载体形成的第二制剂,以及化疗药物及药学上可接受的载体形成的第三制剂。
[0033]
优选地,所述靶向CD20的单抗为利妥昔单抗。
[0034]
可选地,上述制剂的剂型为注射给药制剂、经胃肠道给药制剂、呼吸道给药制剂、皮肤给药制剂、粘膜给药制剂或腔道给药制剂。
[0035]
其中,本发明所述注射给药制剂包括但不限于静脉注射、肌内注射、皮下注射、皮内注射及腔内注射等;本发明所述经胃肠道给药制剂是指经口服用后进入胃肠道,起局部或经吸收而发挥全身作用的药物剂型,包括但不限于散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂等;本发明所述呼吸道给药制剂包括但不限于喷雾剂、气雾剂、粉雾剂等;本发明所述皮肤给药制剂包括但不限于外用溶液剂、洗剂、搽剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂等;本发明所述粘膜给药剂型包括但不限于滴眼剂、滴鼻剂、眼用软膏剂、含漱剂、舌下片剂、粘贴片及贴膜剂等;本发明所述腔道给药制剂包括但不限于栓剂、气雾剂、泡腾片、滴剂及滴丸剂等。
[0036]
优选地,所述PI3K/AKT信号通路抑制剂选自duvelisib、其衍生物、其药学上可接受的盐、其溶剂合物和其前药中的一种或多种。
[0037]
本发明还提供了一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物,包括CDK6抑制剂和化疗药物;进一步还可包括靶向CD20的单抗,如利妥昔单抗。
[0038]
进一步,本发明提供了一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物,其包括不同规格单位制剂的CDK6抑制剂、利妥昔单抗和化疗药物及药学上可接受的载体或赋形剂,用于同时、分别或依次给药。
[0039]
优选地,所述CDK6抑制剂选自abemaciclib、其衍生物、其药学上可接受的盐、其溶剂合物和其前药中的一种或多种。
[0040]
本发明还提供了一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物,包括FGFR1/2抑制剂和化 疗药物;进一步还可包括靶向CD20的单抗,如利妥昔单抗。
[0041]
进一步,本发明提供了一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物,其包括不同规格单位制剂的FGFR1/2抑制剂、利妥昔单抗和化疗药物及药学上可接受的载体或赋形剂,用于同时、分别或依次给药。
[0042]
优选地,所述FGFR1/2抑制剂选自AZD4547、其衍生物、其药学上可接受的盐、其溶剂合物和其前药中的一种或多种。
[0043]
进一步,本发明还提供了PI3K/AKT信号通路抑制剂在治疗对化疗药物耐药的B细胞淋巴瘤中的应用,以及在制备对化疗药物耐药的B细胞淋巴瘤治疗药物中的应用;其中所述PI3K/AKT信号通路抑制剂包括PI3K抑制剂、AKT抑制剂,及PI3K/AKT上游蛋白FAK抑制剂、Syk抑制剂和Src抑制剂,PI3K/AKT下游蛋白CDK6抑制剂和FGFR1/2抑制剂。
[0044]
进一步,本发明还提供了化疗药物和PI3K/AKT信号通路抑制剂在治疗B细胞淋巴瘤中的应用,以及在制备B细胞淋巴瘤治疗联合用药物中的应用;其中所述PI3K/AKT信号通路抑制剂包括PI3K抑制剂、AKT抑制剂,及PI3K/AKT上游蛋白FAK抑制剂、Syk抑制剂和Src抑制剂,PI3K/AKT下游蛋白CDK6抑制剂和FGFR1/2抑制剂。
[0045]
进一步,本发明还提供了化疗药物、靶向CD20的单抗和PI3K/AKT信号通路抑制剂在治疗B细胞淋巴瘤中的应用,以及在制备B细胞淋巴瘤治疗联合用药物中的应用;其中所述PI3K/AKT信号通路抑制剂包括PI3K抑制剂、AKT抑制剂,及PI3K/AKT上游蛋白FAK抑制剂、Syk抑制剂和Src抑制剂,PI3K/AKT下游蛋白CDK6抑制剂和FGFR1/2抑制剂。
[0046]
其中,所述B细胞淋巴瘤为弥漫性大B细胞淋巴瘤,或者所述B细胞淋巴瘤为对化疗药物耐药的B细胞淋巴瘤,或者所述B细胞淋巴瘤为CSC比例升高的B细胞淋巴瘤,或者所述B细胞淋巴瘤为SOX2稳定性升高的B细胞淋巴瘤。
[0047]
鉴于CSC在转移和耐药过程中的关键作用,本发明提出了一种新的应对CSC的PDT策略,即确定维持肿瘤干细胞干性的关键信号传导通路,然后通过干扰该通路来诱导CSC分化。分化的细胞最终会对常规疗法(如化疗)敏感。在这种情况下,PI3K/AKT信号通路抑制剂联合R-CHOP方案在移植模型小鼠上获得了良好的治疗效果,因此该方案值得在临床试验中评估耐药性DLBCL患者。
[0048]
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明,以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

[0049]
图1是通过升高药物浓度构建耐药DLBCL细胞的流程示意图;其中,L、M和H分别表示低剂量、中剂量和高剂量的不用药物;
[0050]
图2是通过补体介导的细胞毒性(Complement-Dependent Cytotoxicity,CDC)测定确认耐药DLBCL细胞对R-介导的CDC的耐药性的结果图,其中细胞用3.2μg/mL的利妥昔单抗和20%NHS处理2小时,数据以平均值±SD表示,n=3,****P<0.0001;
[0051]
图3是通过CCK-8方法测定确认耐药DLBCL细胞对化疗药物的耐药性的结果图,其中细胞分别用剂量递增的4-羟基环磷酰胺(4-HC)、多柔比星或长春新碱处理48小时,数据以平均值±SD表示,n=3;
[0052]
图4是原始(Orignial,ORI)和耐药(R、CHO、RCHO,意味分别对R、CHO、或RCHO耐药)DLBCL细胞中干细胞样球体的数量统计比较及其照片,比例尺:100μm,数据以平均值±SD表示,n=3,***P<0.001和****P<0.0001;
[0053]
图5是原始和耐药DLBCL细胞中ALDH1阳性细胞的百分比对比图,与原始细胞相比,耐药DLBCL细胞中ALDH1阳性细胞的百分比按R、CHO和RCHO耐药细胞的顺序逐渐增强,表明耐药DLBCL细胞的干细胞性增强,数据以平均值±SD表示,n=3,*P<0.05,**P<0.01和***P<0.001;
[0054]
图6是对原始和耐药DLBCL细胞进行Aldefluor测定的结果的代表性图像;
[0055]
图7是原始和耐药DLBCL细胞中干细胞标志物CD34、CD133表达的免疫印迹分析结果;
[0056]
图8是原始和耐药DLBCL细胞中干细胞性相关转录因子SOX2、OCT4、NANOG、KLF4和c-Myc表达的免疫印迹分析结果,其中仅SOX2的表达随着耐药性增强趋势而逐渐升高;
[0057]
图9是在GCB亚型(6对)中,同一病人初次就诊时和复发后的组织中SOX2免疫组织化学染色对比图像,比例尺:20μm,P:病人(Patient);
[0058]
图10是在ABC亚型(6对)中,同一病人初次就诊时和复发后的组织中SOX2免疫组织化学染色对比图像,比例尺:20μm,P:病人(Patient);
[0059]
图11是在GCB和ABC亚型中,同一病人初次就诊时和复发后的组织中SOX2免疫组织化学染色的定量评分对比结果,数据以平均值±SD表示,n=3,**P<0.01和***P<0.001;
[0060]
图12是CDC测定的结果,其中用R+NHS处理SOX2过表达的原始LY8和NU-DUL-1细胞(空白载体原始细胞做对照),以及用R+NHS处理SOX2沉默的RCHO耐药的LY8和NU-DUL-1细胞(SCR沉默的耐药细胞做对照),结果表明:异常的SOX2表达降低了原始细胞对利妥昔单抗介导的CDC的易感性,而SOX2沉默在RHO耐药细胞中则表现出相反的作用,数据以平均值±SD表示,n=3,**P<0.01和****P<0.0001;
[0061]
图13是CytoTox-Glo细胞毒性测定的结果,其中用CHO处理SOX2过表达的原始LY8和NU-DUL-1细胞(空白载体原始细胞做对照),以及用CHO处理SOX2沉默的RCHO耐药的LY8和NU-DUL-1细胞(无关shRNA,即SCR沉默的耐药细胞做 对照),结果表明:异常的SOX2表达降低了CHO在原始细胞中的细胞毒性作用,而SOX2沉默在RHO耐药细胞中恢复了对CHO的敏感性,数据以平均值±SD表示,n=3,***P<0.001和****P<0.0001;
[0062]
图14是原始和耐药DLBCL细胞中,SOX2的mRNA水平的qRT-PCR测定结果,表明在几乎所有的耐药DLBCL细胞中SOX2mRNA水平均显著降低,数据以平均值±SD表示,n=3,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001;
[0063]
图15是基于RNA-seq的差异基因数据应用Cytoscape软件生成的信号网络及其在KEGG数据库中进行相互作用得分的结果图,其表明PI3K/AKT信号传导通路(PI3K/AKT signaling pathway)和类固醇生物合成(Steroid biosynthesis)显示出最高的相互作用得分;
[0064]
图16是RCHO耐药LY8和NU-DUL-1细胞中基于RNA-seq的差异基因数据进行基因集富集分析获得的PI3K/AKT通路的GSEA富集特征图,FDR<0.25被认为差异显著;
[0065]
图17是原始和耐药DLBCL细胞中PI3K/AKT信号传导通路中各蛋白表达(p110α/β/γ/δ、p85、Akt1)及AKT(S473)、SOX2(T118)磷酸化和SOX2(K119)甲基化的免疫印迹分析结果,该结果表明PI3K/AKT信号传导被激活,从而促进SOX2的磷酸化并减少SOX2的甲基化;
[0066]
图18是在GCB亚型(6对)中,同一病人初次就诊时和复发后的组织中p-AKT(S473)免疫组织化学染色对比图像,比例尺:20μm,P:病人;
[0067]
图19是在ABC亚型(6对)中,同一病人初次就诊时和复发后的组织中p-AKT(S473)免疫组织化学染色对比图像,比例尺:20μm,P:病人;
[0068]
图20是在GCB和ABC亚型中,同一病人初次就诊时和复发后的组织中p-AKT(S473)免疫组织化学染色的定量评分对比结果,数据以平均值±SD表示,n=3,**P<0.01;
[0069]
图21是原始和耐药DLBCL细胞在用10μM的MG-132(泛素蛋白酶体抑制剂)处理8小时后,SOX2表达的免疫印迹分析结果,表明SOX2的泛素化在耐药DLBCL细胞中减少了;
[0070]
图22是阐述RCHO耐药LY8和NU-DUL-1细胞各自PK3K/AKT通路中上调基因数及其重合的基因数的文氏图(Venn diagram);
[0071]
图23是全部124个上调基因富集的前10个信号传导通路列表;
[0072]
图24是原始和耐药DLBCL细胞中FAK表达及其磷酸化的免疫印迹分析结果,表明FAK在耐药LY8中被激活但在耐药NU-DUL-1细胞中没有被激活;
[0073]
图25是通过qRT-PCR获得的原始和耐药LY8细胞中整合素(Integrin)各亚基的mRNA水平检测结果,表明整合素亚基ITGA1和ITGB5的mRNA水平在耐药LY8细胞中显著上调;
[0074]
图26是原始和耐药LY8细胞中整合素α1和β5亚基表达的免疫印迹分析结果,表明整合素α1和β5亚基在耐药LY8细胞中上调;
[0075]
图27是在LY8-RCHO细胞中敲减ITGA1或ITGB5后,对FAK-AKT信号传导轴进行免疫印迹分析的结果,表明ITGA1或ITGB5的敲减抑制了FAK-AKT信号传导轴,从而导致SOX2的降解;
[0076]
图28是原始和耐药DLBCL细胞中BCR信号传导通路的免疫印迹分析结果,表明通过BCR/Lyn和TCF-3/THP-1信号传导通路,Syk在耐药DLBCL细胞中被激活;
[0077]
图29是在LY8-RCHO细胞中敲减CD79A后,对BCR-Lyn-Syk-AKT信号传导轴进行免疫印迹分析的结果,表明BCR的组成亚基CD79A的沉默抑制了BCR-Lyn-Syk-AKT信号传导轴,从而导致SOX2的降解;
[0078]
图30是LY8-RCHO细胞中基于RNA-seq的差异基因数据进行基因集富集分析获得的趋化因子信号传导通路的GSEA富集特征图,FDR<0.25被认为是显著的;
[0079]
图31是趋化因子信号传导通路中前10个上调基因的列表;
[0080]
图32是通过qRT-PCR获得的原始和耐药LY8细胞中CCR7的mRNA水平检测结果,表明CCR7的mRNA水平在耐药LY8细胞中显著升高,数据以平均值±SD表示;n=3,***P<0.001和****P<0.0001;
[0081]
图33是原始和耐药DLBCL细胞中CCR7、Src表达及Src磷酸化水平的免疫印迹分析的结果,表明在CHO和RCHO耐药细胞中CCR7的表达上调,因此增强了下游Src(Y418)的磷酸化;
[0082]
图34是在LY8-RCHO和NU-DUL-1-RCHO细胞中敲减CCR7后,对CCR7-Src-AKT信号传导轴进行免疫印迹分析的结果,表明CCR7的敲减抑制了CCR7-Src-AKT信号传导轴,从而导致SOX2的降解;
[0083]
图35是单独用PI3K抑制剂duvelisib处理,以及duvelisib和CHO共同处理两种RCHO耐药细胞,并用CytoTox-Glo细胞毒性测定法测定细胞死亡率进行比较的结果图,表明联合使用duvelisib和CHO显著逆转了RCHO耐药细胞对CHO的耐药性,而单独使用duvelisib对直接诱导细胞死亡的影响可以忽略不计,数据以平均值±SD表示,n=3,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001和****P<0.0001;
[0084]
图36是单独用FAK抑制剂PF-573228处理,以及PF-573228和CHO共同处理LY8-RCHO耐药细胞,并用CytoTox-Glo细胞毒性测定法测定细胞死亡率进行比较的结果图,表明联合使用PF-573228和CHO显著逆转了RCHO耐药细胞对CHO的耐药性,而单独使用PF-573228对直接诱导细胞死亡的影响可以忽略不计,数据以平均值±SD表示,n=3,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001和****P<0.0001;
[0085]
图37是单独用Syk抑制剂R788处理,以及R788和CHO共同处理两种RCHO耐药细胞,并用CytoTox-Glo细胞毒性测定法测定细胞死亡率进行比较的结果图,表明联合使用R788和CHO显著逆转了RCHO耐药细胞对CHO的耐药性,而单独使用 R788对直接诱导细胞死亡的影响可以忽略不计,数据以平均值±SD表示,n=3,**P<0.01,***P<0.001和****P<0.0001;
[0086]
图38是单独用Src抑制剂Saracatinib处理,以及Saracatinib和CHO共同处理两种RCHO耐药细胞,并用CytoTox-Glo细胞毒性测定法测定细胞死亡率进行比较的结果图,表明联合使用Saracatinib和CHO显著逆转了RCHO耐药细胞对CHO的耐药性,而单独使用Saracatinib对直接诱导细胞死亡的影响可以忽略不计,数据以平均值±SD表示,n=3,**P<0.01,***P<0.001和****P<0.0001;
[0087]
图39是用于评估原始和耐药DLBCL细胞中CD46、CD55、CD59和CD20膜表达的FACS分析的代表性图像;
[0088]
图40是用于评估原始和耐药DLBCL细胞中CD46、CD55、CD59和CD20膜表达的FACS分析的定量热图,每格代表三个生物重复的平均值,该图表明在耐受R和RCHO的DLBCL细胞中膜CD46、CD55和CD59的表达水平没有升高,而膜CD20的表达水平显著降低;
[0089]
图41是原始和耐药DLBCL细胞中CD20表达水平的免疫印迹分析的结果;
[0090]
图42是原始和耐药DLBCL细胞中CD20的相对mRNA水平的检测结果,表明特别是在R和RCHO耐药细胞中显著下降,数据以平均值±SD表示,n=3,*P<0.05,**P<0.01和***P<0.001;
[0091]
图43是用于评估在异常SOX2表达的原始LY8细胞以及在敲减SOX2的RCHO耐药LY8细胞中CD46、CD55、CD59和CD20膜表达的FACS分析的代表性图像及其对应的定量热图,每格代表三个生物重复的平均值,结果表明异常SOX2表达降低了膜CD20的水平,而SOX2不足则增加了膜CD20的水平;
[0092]
图44是用于评估在异常SOX2表达的原始NU-DUL-1细胞以及在敲减SOX2的RCHO耐药NU-DUL-1细胞中CD46、CD55、CD59和CD20膜表达的FACS分析的代表性图像及其对应的定量热图,每格代表三个生物重复的平均值,结果表明异常SOX2表达降低了膜CD20的水平,而SOX2不足则增加了膜CD20的水平;
[0093]
图45是用于评估RCHO耐药DLBCL细胞中PI3K抑制剂duvelisib和AKT抑制剂MK-2206处理对CD46、CD55、CD59和CD20膜表达影响的FACS分析的的代表性图像及其对应的定量热图,每格代表三个生物重复的平均值,该图表明在duvelisib或MK-2206处理后,CD20的表达显著降低,但其它三个mCRP没有;
[0094]
图46是PI3K/AKT被duvelisib或MK-2206抑制后RCHO耐药DLBCL细胞中CD20的相对mRNA水平的检测结果,数据以平均值±SD表示,n=3,****P<0.0001;
[0095]
图47是PI3K/AKT被duvelisib或MK-2206抑制后RCHO耐药DLBCL细胞中AKT、CD20、SOX2表达水平以及AKT磷酸化水平的免疫印迹分析的结果;
[0096]
图48是通过CDC测定确认用duvelisib或MK-2206抑制PI3K/AKT对RCHO耐药DLBCL细胞对R-介导的CDC的耐药性影响,其中细胞用1μM浓度的duvelisib 或MK-2206处理24小时,数据以平均值±SD表示,n=3,*P<0.05;
[0097]
图49是阐述RCHO耐药LY8和NU-DUL-1细胞各自PK3K/AKT通路中的上调基因数及其与SOX2靶点之间重合基因数的文氏图(Venn diagram);
[0098]
图50是原始和耐药LY8细胞中CDK6表达水平的免疫印迹分析的结果,表明CDK6在耐药LY8细胞中过表达;
[0099]
图51是在GCB亚型(6对)中,同一病人初次就诊时和复发后的组织中CDK6免疫组织化学染色对比图像,比例尺:20μm,P:病人,表明复发组织中CDK6的表达水平高于最初就诊时的组织;
[0100]
图52是在ABC亚型(6对)中,同一病人初次就诊时和复发后的组织中CDK6免疫组织化学染色对比图像,比例尺:20μm,P:病人;
[0101]
图53是在GCB亚型和ABC亚型中,同一病人初次就诊时和复发后的组织中CDK6免疫组织化学染色的定量评分对比结果,数据以平均值±SD表示,n=3,*P<0.05,NS:没有意义;
[0102]
图54是原始和耐药NU-DUL-1细胞中FGFR1/2表达水平的免疫印迹分析的结果,表明FGFR1和FGFR2在耐药性NU-DUL-1细胞中过表达;
[0103]
图55是在ABC亚型(6对)中,同一病人初次就诊时和复发后的组织中FGFR1免疫组织化学染色对比图像,比例尺:20μm,P:病人,表明复发组织中FGFR1的表达水平高于最初就诊时的组织;
[0104]
图56是在GCB亚型(6对)中,同一病人初次就诊时和复发后的组织中FGFR1免疫组织化学染色对比图像,比例尺:20μm,P:病人;
[0105]
图57是在GCB亚型和ABC亚型中,同一病人初次就诊时和复发后的组织中FGFR1免疫组织化学染色的定量评分对比结果,数据以平均值±SD表示,n=3,*P<0.05,NS:没有意义;
[0106]
图58是在ABC亚型(6对)中,同一病人初次就诊时和复发后的组织中FGFR2免疫组织化学染色对比图像,比例尺:20μm,P:病人,表明复发组织中FGFR2的表达水平高于最初就诊时的组织;
[0107]
图59是在GCB亚型(6对)中,同一病人初次就诊时和复发后的组织中FGFR2免疫组织化学染色对比图像,比例尺:20μm,P:病人;
[0108]
图60是在GCB亚型和ABC亚型中,同一病人初次就诊时和复发后的组织中FGFR2免疫组织化学染色的定量评分对比结果,数据以平均值±SD表示,n=3,*P<0.05,NS:没有意义;
[0109]
图61是LY8-RCHO细胞用Duvelisib处理后,AKT1磷酸化及AKT、SOX2和CDK6的表达水平的免疫印迹分析的结果,表明Duvelisib通过抑制AKT磷酸化来降低SOX2和CDK6的表达;
[0110]
图62是NU-DUL-1-RCHO细胞用Duvelisib处理后,AKT1磷酸化及AKT、SOX2 和FGFR1/2的表达水平的免疫印迹分析的结果,表明Duvelisib通过抑制AKT磷酸化来降低SOX2和FGFR1/2的表达;
[0111]
图63是CytoTox-Glo细胞毒性测定结果,其中分别用abemaciclib单独或与CHO共同处理LY8-RCHO细胞,结果表明用abemaciclib抑制CDK6恢复了RCHO耐药细胞对CHO的敏感性,而单用abemaciclib对诱导细胞死亡的影响可以忽略不计,数据以平均值±SD表示,n=3,**P<0.01,***P<0.001和****P<0.0001;
[0112]
图64是CytoTox-Glo细胞毒性测定结果,其中分别用AZD4547单独或与CHO共同处理NU-DUL-1-RCHO细胞,结果表明用AZD4547抑制FGFR1/2恢复了RCHO耐药细胞对CHO的敏感性,而单用AZD4547对诱导细胞死亡的影响可以忽略不计,数据以平均值±SD表示,n=3,****P<0.0001;
[0113]
图65是CDC测定的结果,其中用abemaciclib预处理LY8-RCHO细胞24小时,然后用利妥昔单抗以及20%NHS处理LY8-RCHO细胞2小时,与对照组相比的结果表明:abemaciclib未能逆转对R-介导的CDC的耐药性,数据以平均值±SD表示,n=3;
[0114]
图66是CDC测定的结果,其中用AZD4547预处理NU-DUL-1-RCHO细胞24小时,然后用利妥昔单抗以及20%NHS处理NU-DUL-1-RCHO细胞2小时,与对照组相比的结果表明:AZD4547反而加剧了对R-介导的CDC的耐药性,数据以平均值±SD表示,n=3,*P<0.05;
[0115]
图67是在原始LY8和NU-DUL-1细胞中过表达SOX2后,OCT4、NANOG、KLF4和c-MYC、CD34和CD133表达水平的免疫印迹分析结果,表明异常SOX2表达升高了原始细胞中CSC相关分子的水平;
[0116]
图68是在RCHO耐药LY8和NU-DUL-1细胞中敲减SOX2后,OCT4、NANOG、KLF4和c-MYC、CD34和CD133表达水平的免疫印迹分析结果,表明SOX2不足降低了RCHO耐药细胞中CSC相关分子的水平;
[0117]
图69是对LY8-RCHO细胞用Duvelisib和Abemaciclib处理,对NU-DUL-1-RCHO细胞用Duvelisib和AZD4547处理后,ALDH1+细胞的比例对比图,表明Duvelisib显著降低LY8-RCHO和NU-DUL-1-RCHO细胞中的ALDH1+亚群,Abemaciclib对LY8-RCHO细胞中的ALDH1+亚群没有影响,而AZD4547显著降低NU-DUL-1-RCHO细胞中的ALDH1+亚群,但与duvelisib相比,其程度大大降低,数据以平均值±SD表示,n=3,**P<0.01,***P<0.001;
[0118]
图70是对两种RCHO耐药细胞分别用Duvelisib、Abemaciclib和AZD4547处理后,AKT、OCT4、NANOG、KLF4和c-MYC、CD34和CD133表达水平和p-AKT磷酸化水平的免疫印迹分析结果,表明Duvelisib明显降低耐RCHO细胞中CSC相关分子的水平,abemaciclib对其水平没有影响,但导致C-MYC减少,而AZD4547也降低了它们的水平,但与duvelisib相比程度大大降低了;
[0119]
图71是对LY8-RCHO细胞用Duvelisib和Abemaciclib处理,对NU-DUL-1-RCHO细胞用Duvelisib和AZD4547处理后48小时和120小时的EdU掺入测定细胞增殖情况的结果,数据以平均值±SD表示,n=3,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001和****P<0.0001;
[0120]
图72是接种LY8-RCHO-Luc细胞并按表1中的方式分组给药后第50天和第90天肿瘤的生长情况,肿瘤质量由萤火虫荧光素酶活性强度表示,“X”代表小鼠死亡;
[0121]
图73是图72中总光子通量的定量结果,数据表示为平均值±SEM(n=7),*P<0.05,**P<0.01和***P<0.001;
[0122]
图74是接种LY8-RCHO-Luc细胞后用不同药物处理组小鼠的Kaplan-Meier存活曲线,数据表示为平均值±SEM(n=7),*P<0.05,**P<0.01和***P<0.001;
[0123]
图75是接种NU-DUL-1-RCHO-Luc细胞后第50天、70天和90天肿瘤的生长情况,肿瘤质量由萤火虫荧光素酶活性强度表示,“X”代表小鼠死亡;
[0124]
图76是图75中总光子通量的定量结果,数据表示为平均值±SEM(n=7),*P<0.05和**P<0.01;
[0125]
图77是接种NU-DUL-1-RCHO-Luc细胞后用不同药物处理组小鼠的Kaplan-Meier存活曲线,数据表示为平均值±SEM(n=7),**P<0.01,***P<0.001和****P<0.0001;
[0126]
图78是对接种LY8-RCHO-Luc细胞后不同药物处理组生长的肿瘤组织中的SOX2进行免疫组织化学染色后的图像,比例尺:20μm,表明与盐水对照相比,Duvelisib显著降低了SOX2的表达水平,而R-CHOP和abemaciclib没有;
[0127]
图79是对接种NU-DUL-1-RCHO-Luc细胞后不同药物处理组生长的肿瘤组织中的SOX2进行免疫组织化学染色后的图像,比例尺:20μm,表明与盐水对照相比,Duvelisib和AZD4547显著降低了SOX2的表达水平,而R-CHOP没有;
[0128]
图80是针对CSC的促分化疗法逆转对DLBCL中R-CHOP的耐药性的机理的示意图。

具体实施方式

[0129]
实施例1 SOX2调节干细胞样耐药DLBCL细胞的耐药性
[0130]
抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)是利妥昔单抗治疗效果的主要机制。对ADCC的耐受性可能来自于个体患者免疫细胞的内在特征;而对CDC的耐受性是由CD20的低表达水平和/或膜结合补体调节蛋白(mCRP)的高表达水平(包括CD46、CD55和特别是CD59)介导的。CHO化学药物通过诱导DNA损伤或与微管蛋白结合抑制肿瘤细胞的复制,并且环磷酰胺必须在细胞中代谢活化成4-羟基环磷酰胺(4-HC)以发挥这种作用。因此,使用利妥昔单抗加正常人血清(NHS,作为补体来源)、4-HC加多柔比星加长春新碱,以及它们的组合,我们构建了耐药 LY8(GCB亚型)或NU-DUL-1(ABC亚型)的DLBCL细胞,分别以R、CHO和RCHO命名(图1)。我们验证了它们对CDC(图2)和化疗药物(图3)的耐药性,并且在一定程度上观察到了它们对利妥昔单抗介导的CDC和对CHO介导的化疗的交叉耐药性。此外,与原始(ORI)细胞相比,耐药细胞呈现不同大小的干细胞样球体,并且球体的数量按照R、CHO和RCHO的顺序逐渐增加(图4)。尽管很少有研究通过实验证明NHL中存在CSC,但它们确实存在。因此,我们用各种癌症类型的CSC中的乙醛脱氢酶1(ALDH1)以及白血病的CSC中的CD34和CD133来确定耐药DLBCL细胞的干细胞性。结果显示与原始细胞相比,耐药细胞中ALDH1 +细胞的比例显著升高(图5和图6),同时CD34和CD133表达水平增加(图7)。
[0131]
为了研究耐药细胞中干细胞性的分子调节机制,我们检测了核心的干细胞性相关转录因子,即SOX2、OCT4、NANOG、KLF4和c-Myc的表达。如图8所示,只有SOX2的表达水平随着耐药性增强趋势而逐渐升高。此外,在来自DLBCL患者的临床样本中,我们观察到在GCB和ABC亚型中,在复发组织中SOX2的免疫组织化学(IHC)染色率明显高于它们所对应的初次就诊时的组织(图9、图10和图11)。在原始LY8或NU-DUL-1细胞中,异常的SOX2表达(图67)显著降低了由利妥昔单抗(图12)或CHO(图13)诱导的细胞死亡;相反,SOX2不足(图68)在RCHO耐药的LY8或NU-DUL-1细胞中诱导了相反的效应(图12和图13)。这些结果表明,在耐药DLBCL细胞中CSC的比例显著增加了,并且SOX2的升高是对利妥昔单抗和CHO产生耐药性的原因。
[0132]
实施例2 PI3K/AKT信号传导磷酸化并由此稳定SOX2来抵抗泛素化介导的降解
[0133]
我们接下来研究了耐药DLBCL细胞中SOX2上调的机制。出乎意料的是,SOX2mRNA水平在耐药细胞中显著下降,特别是在耐药LY8细胞中(图15),这表明转录调节不参与SOX2的过表达。基于原始细胞和耐药细胞的RNA-seq数据,来自KEGG通路分析的相互作用得分显示PI3K/AKT信号传导通路(PI3K/AKT signaling pathway)和类固醇生物合成(Steroid biosynthesis)是最富集的通路(图15)。此外,基因集富集分析(GSEA)表明,PI3K/AKT信号通路的基因特征(gene signatures)在两种RCHO耐药细胞系中均显著活化(图16)。通过实验确认了AKT(S473)的磷酸化随耐药程度的增加而增加,从而增强了SOX2(T118)的磷酸化并随后抑制了两种细胞系中SOX2(K119)的甲基化;另外,耐药LY8细胞中的PI3K亚基p110α/δ和p85的表达以及耐药NU-DUL-1细胞中的p110γ的表达也升高(图17)。相应地,对于GCB和ABC亚型而言,AKT(S473)磷酸化在复发活检组织中与对应患者初次就诊时的组织相比也显著增加(图18、图19和图20)。本实施例证实SOX2的稳定性是由PI3K/AKT调节的SOX2磷酸化-甲基化转换通过泛素化系统来调节的。相应地,泛素化的SOX2在耐药细胞中显著减少(图21)。因此,GCB和ABC亚型的耐药CSC中SOX2的表 达升高可能是由AKT调节的磷酸化-甲基化转换引起的,进一步抑制了SOX2的泛素化和降解。
[0134]
实施例3 多个信号事件在耐药细胞中激活PI3K/AKT通路
[0135]
对PI3K/AKT通路上游的关键调节子的研究有助于寻找可以减少SOX2表达的潜在药物靶点。因此,我们确定了PK3K/AKT通路中的124个上调基因(图16)并根据细胞亚型将它们分类(图22)。由于两种细胞亚型中重叠基因的数量有限(仅18个),所以我们使用所有124个基因进行KEGG通路分析。图23列出了前10条通路,而PI3K/AKT通路则被排在第一位。PI3Kα/β亚型广泛表达,而PI3Kγ/δ亚型仅在造血细胞中表达,其中PI3Kδ在B细胞的发育和功能中起着关键的作用,并且在B细胞恶性肿瘤中通过将来自BCR和其他受体的信号转导至各种整合素和细胞因子/趋化因子而始终保持着极度地活跃。一致地,我们发现整合素调节的黏着斑(focal adhesion)通路排在第二位(图23),然而,下游的FAK仅在耐药LY8细胞中被激活(图24)。接下来,我们通过qRT-PCR筛选了所有整合素亚基的转录水平,发现在三种耐药LY8细胞系中只有ITGA1和ITGB5显著升高(图25),这一点通过蛋白水平得到证实(图26)。我们在ITGA1或ITGB5敲减的LY8-RCHO细胞上的免疫印迹分析结果表明,ITGA1或ITGB5的不足显著抑制了FAK的表达和磷酸化,从而增加了SOX2的降解(图27)。这些结果表明整合素亚基α1和β5的表达升高通过耐药LY8细胞中的FAK/AKT磷酸化促进了SOX2的稳定。另外,BCR信号传导通路也参与了PI3K/AKT的激活(图23)。BCR/Lyn和TCF3/SHP-1信号传导在不同的耐药细胞中激活了Syk(图28),但是CD79A(BCR信号传导通路的组成亚基)的不足却抑制了BCR/Lyn/Syk/AKT信号传导轴,从而诱导了SOX2的不稳定(图29)。此外,我们进一步研究了趋化因子的表达,其被认为可以激活PI3K/AKT通路(图23)。GSEA结果还显示趋化因子信号传导通路在RCHO耐药LY8细胞中显著富集(图30),但在NU-DUL-1细胞中则没有;图31中显示了前10个相关基因。我们证实CCR7排在第一位,发现在不同的耐药LY8细胞中,特别是RCHO耐药细胞中CCR7的mRNA水平显著升高(图32)。CCR7蛋白水平也升高,特别是在CHO和RCHO耐药LY8细胞中(图33,左);此外,在耐药NU-DUL-1细胞中CCR7表达也升高,但升高的程度较低(图33,右)。CCR7不足削弱了Src/AKT的信号传导,从而导致两种RCHO耐药细胞系中的SOX2降解(图34)。
[0136]
接下来,我们在功能上测试了上述信号分子的抑制剂对逆转耐药细胞对化学疗法(CHO)的耐药性的作用。单独使用PI3K抑制剂duvelisib处理,如果说诱导产生了细胞毒性也只是略微有点细胞毒性;而使用duvelisib和CHO共同处理则会以剂量依赖性的方式显著增强CHO在两种RCHO耐药细胞系中的细胞毒性作用(图35)。类似地,用FAK、Syk或Src抑制剂单独处理诱导产生的细胞毒性可忽略不计;然而, 与CHO联合处理则显著增强了CHO的细胞毒性作用,但程度远小于CHO与duvelisib的联合处理(图36-图38)。总而言之,耐药LY8和NU-DUL-1细胞中PI3K/AKT信号传导的增强是由多种因素诱导的,包括整合素、BCR和趋化因子信号传导,而除了抑制PI3K/AKT以外,对其上游通路的抑制都不能有效地降低耐药细胞在化疗期间的存活率。
[0137]
实施例4 SOX2调节的CD20表达是对利妥昔单抗诱导的CDC耐药的决定性因素
[0138]
CDC是利妥昔单抗的重要细胞毒性作用,而对耐药性发展的机制的理解可能有助于设计逆转耐药性的治疗药物。我们观察到在LY8和NU-DUL-1的R和RCHO耐药细胞中,CD20的膜表达显著降低,而其它三种mCRP的表达则略有下降(图39和图40)。用免疫印迹法获得一致的总CD20表达水平的结果(图41)。CD20的膜水平显著降低很可能是转录抑制所导致的(图42)。
[0139]
SOX2在利妥昔单抗介导的CDC耐药的DLBCL中的关键作用先前已被证实(图12),因此我们进一步研究了其基本机制。在原始的LY8和NU-DUL-1细胞中,SOX2的异常表达显著降低了CD20的表达,而在耐药的LY8和NU-DUL-1细胞中,SOX2的不足则显著增加了CD20的表达(图43和图44)。然而,另三种mCRP的表达并不总是与利妥昔单抗介导的CDC耐药性相关(图43和图44)。这些结果表明,与其它的mCRP相比,由SOX2调控的CD20的表达是利妥昔单抗介导的CDC对DLBCL耐药性的决定性因素。
[0140]
我们进一步确定了PI3K/AKT信号通路抑制剂对利妥昔单抗介导的CDC的作用。在两种RCHO耐药细胞系中,对PI3K或AKT的抑制都能显著降低CD20的表达,而另三种mCRP的表达水平没有显著改变(图45)。类似地,造成CD20的表达减少的最可能的原因是其转录被抑制(图46)。我们通过免疫印迹验证了AKT的抑制以及CD20和SOX2的表达(图47)。这些结果还表明PI3K/AKT对CD20表达的调节可能与SOX2无关。随后,我们发现PI3K/AKT抑制在RCHO耐药细胞中破坏了利妥昔单抗介导的CDC(图48)。因此,与逆转对化疗耐药性的作用相反,PI3K/AKT信号通路抑制剂可能反而加剧对利妥昔单抗介导的CDC的耐药性。
[0141]
实施例5 GCB和ABC细胞采用不同的SOX2下游信号分子来产生耐药性
[0142]
考虑到PI3K/AKT抑制或SOX2的不足对利妥昔单抗和/或CHO治疗的逆转耐药性的影响,我们分析了PI3K/AKT通路中的上调基因(图16)和SOX2-靶向基因(分子特征数据库Molecular Signatures Database,MSigDB)来鉴定RCHO耐药细胞中SOX2的关键靶点。在RCHO耐药的LY8细胞中,CDK6、GSK3B和SGK3三个基因上调,而在RCHO耐药的NU-DUL-1细胞中,FCHR1、FGFR2、KDR和TNC四个基因上调(图49)。考虑到CDK4/6和FGFR抑制剂正在进行治疗多种癌症的临床试验,我们 随后研究了它们的表达和功能。CDK6在耐药LY8细胞(图50)和复发的GCB亚型中高度表达,但是在ABC亚型的DLBCL组织中却没有(图51-图53)。一致地,FGFR1/2在耐药NU-DUL-1细胞(图54)和复发的ABC亚型中过表达,但在GCB亚型的DLBCL组织中却没有(图55-图60)。用duvelisib抑制PI3K阻止了AKT的磷酸化并诱导了SOX2的降解,从而减少了RCHO耐药LY8细胞中CDK6的表达(图61)或RCHO耐药NU-DUL-1细胞中FGFR1/2的表达(图62)。与PI3K抑制的作用类似,在RCHO耐药LY8细胞中用abemaciclib抑制CDK6或在RCHO耐药NU-DUL-1细胞中用AZD4547抑制FGFR1/2显著增强了CHO的细胞毒性,而这些抑制剂的单独使用则对耐药细胞仅显示出可忽略不计的细胞毒性作用(图63和图64)。然而,LY8-RCHO耐药细胞中的CDK6抑制或NU-DUL-1-RCHO耐药细胞中的FGFR1/2抑制未能逆转对R-介导的CDC的耐药性(图65和图66)。这些结果表明,抑制SOX2靶点(LY8-RCHO耐药细胞中的CDK6和NU-DUL-1-RCHO耐药细胞中的FGFR1/2)至少可部分逆转对化学疗法的耐药性,但对R-介导的CDC无效。
[0143]
实施例6 PI3K/AKT抑制通过减少SOX2促进CSC分化
[0144]
鉴于CSC在耐药DLBCL细胞中的比例增加以及SOX2在RCHO耐药中的关键作用,我们研究了SOX2在维持其干细胞性中的作用。异常SOX2表达或SOX2不足分别显著增加或抑制CD34和CD133水平以及其他与干细胞性相关的转录因子,包括OCT4、NANOG、KLF4和c-MYC(图67和图68)。这些结果表明SOX2可能是RCHO耐药DLBCL细胞中的干细胞性决定性转录因子。此外,在两种RCHO耐药细胞系中,PI3K抑制显著降低了CSC(标记为ALDH1 +细胞)的比例(图69),CDK6抑制未能改变RCHO耐药LY8细胞中CSC的比例(图69,左),而FGFR1/2抑制显著降低了RCHO耐药NU-DUL-1细胞中CSC的比例,但程度要比PI3K抑制作用小得多(图69,右),与先前的研究一致,表明PI3K/AKT可能被FGFR信号激活。此外,CD34、CD133和干细胞性相关的转录因子(包括SOX2、OCT4、NANOG、KLF4和c-Myc)的表达水平,在两种RCHO耐药细胞系的PI3K抑制后明确下降了,而CDK6抑制对上述分子的表达没有显著影响,但导致c-MYC的减少,上述分子的表达水平在FGFR1/2抑制后也下降了,但程度小于PI3K抑制(图70)。值得注意的是,FGFR1/2上调并参与了PI3K/AKT信号的激活;因此,它们的抑制减少了AKT的磷酸化并降低了SOX2的稳定性(图70)。这些结果揭示,用duvelisib直接或用AZD4547间接抑制PI3K/AKT可促进CSC的分化。
[0145]
分化的肿瘤细胞比CSC生长更快。因此,我们使用EdU掺入测定法功能性检测了PI3K抑制对细胞增殖的影响。在用duvelisib处理48小时后,直接的PI3K抑制强烈阻止了LY8-RCHO和NU-DUL-1-RCHO细胞的增殖,并在120小时时显著促进了细胞的增殖(图71)。这一结果揭示了由duvelisib诱导的从CSC向分化细胞分化的 动态进程。由于不存在对PI3K/AKT信号传导的抑制,abemaciclib对CDK6的抑制在48小时和120小时时都阻止了LY8-RCHO细胞的生长(图71)。由于参与了PI3K/AKT信号传导的抑制,AZD4547对FGFR1/2的抑制则促进了NU-DUL-1-RCHO细胞的增殖,但程度低于PI3K抑制(图71,右)。这些结果表明CDK6或FGFR1/2抑制剂和PI3K抑制剂可能采用不同的机制来逆转化疗的耐药性。PI3K/AKT抑制有效地将CSC转化为分化细胞,而CDK6抑制可能通过细胞周期靶向直接阻止CSC的生长,而FGFR1/2可能对CSC产生双重作用。所有这些干预措施最终都增强了CSC对不同疗效的化疗的敏感性。
[0146]
实施例7 通过将PI3K抑制剂与R-CHOP组合而形成的CSC的预分化疗法完全抑制了RCHO耐药细胞的肿瘤生长
[0147]
构建移植模型:我们用过量表达萤火虫萤光素酶基因的慢病毒转导LY8-RCHO细胞和NU-DUL-1-RCHO细胞,以分别产生表达萤火虫萤光素酶的稳定细胞,分别称为LY8-RCHO-Luc细胞和NU-DUL-1-RCHO-Luc细胞。8周龄雌性SCID小鼠购自SLAC(Shanghai Laboratory Animal Center,上海实验动物中心)。将LY8-RCHO-Luc细胞和NU-DUL-1-RCHO-Luc细胞重悬于PBS中,然后给每只小鼠腹腔注射1.5×10 7个细胞。在腹腔注射LY8-RCHO-Luc细胞后,将小鼠随机分成6组(每组7只小鼠)并分别给予生理盐水、R-CHOP、duvelisib、abemaciclib、R-CHOP+duvelisib和R-CHOP+abemaciclib。将接种有NU-DUL-1-RCHO-Luc细胞的小鼠随机分成6组(每组7只小鼠),对其分别给予生理盐水、R-CHOP、duvelisib、AZD4547、R-CHOP+duvelisib和R-CHOP+AZD4547。表1中示出了基于一个疗程的临床使用的药物给药方法;R-CHOP方案被临床用于治疗DLBCL,而duvelisib、abemaciclib和AZD4547在临床试验中进行了测试(相关的NCT号分别是NCT02576275、NCT01739309和NCT01739309)。接种后第50天和第90天通过生物发光监测肿瘤的生长情况。对于在体发光成像,将D-荧光素(Promega公司,Madison,WI)腹腔注射到小鼠体内(150mg/kg)。10分钟后,通过腹腔注射戊巴比妥(50mg/kg)将小鼠麻醉,然后使用In Vivo MS FX PRO系统(Bruker公司,Billerica,MA)检查其生物发光强度。用30秒的暴露时间捕获发光图像,并使用Bruker MI软件测量肿瘤的信号强度。记录每只小鼠的存活时间。在接种后120天将幸存的小鼠安乐死并解剖,没有发现腹膜内肿瘤。从濒临死亡的小鼠收集肿瘤组织并用4%福尔马林固定。所有动物实验均严格按照复旦大学上海医学院动物伦理委员会批准的实验方案进行。
[0148]
表1.移植模型中的给药方式
[0149]
[0150]
[0151]
将用表达萤光素酶的质粒转导的RCHO耐药LY8细胞和NU-DUL-1细胞分别植入免疫缺陷型SCID小鼠中,并施用各种治疗方案。由图72-图74可见,在携带RCHO耐药LY8细胞的小鼠中,尽管R-CHOP显著延长了存活率(图74),但与盐水对照相比,R-CHOP治疗对肿瘤的生长没有疗效(图72和图73)。这些结果表明,LY8细胞对RCHO的体外耐药在小鼠中得到了高度的重现。不幸的是,单用duvelisib或abemaciclib都不能抑制肿瘤生长或延长存活率(图72-图74);相反地,与生理盐水相比,duvelisib加速了肿瘤的生长,虽然这种差异并没有统计学意义(图72和图73),但导致存活率显著缩短了(图74)。相比之下,和R-CHOP联用时,与单独使用R-CHOP或抑制剂相比,duvelisib或abemaciclib显著抑制了肿瘤的生长并延长了生存率(图72-图74)。更重要的是,R-CHOP与的duvelisib联合治疗完全抑制了肿瘤的发生,并且所有接受治疗的小鼠一直存活到第120天实验结束,与此相比,接受abemaciclib联合治疗的两只小鼠在第62天和第78天死亡(图72-图74)。由图75-图77可见,在携带RCHO耐药NU-DUL-1细胞的小鼠中获得了类似但不完全相同的结果。R-CHOP显著抑制了肿瘤生长并延长了存活时间(图75-图77),这可能是由于干细胞性较弱和CSC比例的减少,导致其对RCHO的耐受性比RCHO耐药LY8细胞要弱(图4、图5和图7)。单独使用Duvelisib对肿瘤生长和存活时间也没有疗效,而单独使用AZD4547则显著延长了存活时间(图75-图77)。重要的是,当与R-CHOP联合使用时,duvelisib和AZD4547都可以完全抑制肿瘤的生长并延长存活时间至第120天实验结束(图75-图77)。Duvelisib、abemaciclib和AZD4547它们不同的抑制肿瘤作用进一步支持了它们潜在的不同的耐药逆转机制;即duvelisib将CSC转化为分化的细胞,abemaciclib抑制CSC生长,而AZD4547对CSC表现出双重作用。对用不同药物处理的接种后生长的肿瘤组织的SOX2染色支持了这一发现。Duvelisib或AZD4547显著降低了SOX2的表达,但R-CHOP或abemaciclib没有(图78和图79)。因此,这种联合治疗的成功很可能是由于CSC通过PI3K/AKT/SOX2轴抑制转化为分化细胞所致。
[0152]
实施例8相关实验的具体方法
[0153]
一、DLBCL组织样本采集
[0154]
我们在复旦大学上海癌症中心对2008年至2015年所有DLBCL患者的病史进行了调查,共发现24位患者同时接受了初次就诊时和复发时的组织标本石蜡包埋。基于汉斯免疫组织化学算法,将DLBCL病例分为GCB(12例)或ABC(12例)分子亚型。复发患者接受R-CHOP治疗至少6个疗程。第一次活检是在初次就诊时进行诊断,而第二次活检用于确定是复发状态还是原发诊断。每个患者两次活检的时间间隔各不相同。随后收集这些DLBCL样品用于IHC染色。复旦大学上海癌症中心伦理委员会批准了这项研究,所有患者都签署了知情同意书。
[0155]
二、细胞培养和试剂
[0156]
人DLBCL细胞系GCB亚型OCI-LY8和ABC亚型NU-DUL-1来自于复旦大学上海癌症中心(中国上海)病理学系。将LY8细胞培养在含有10%(v/v)胎牛血清和1%(v/v)青霉素/链霉素的IMDM(Iscove's modified Dulbecco's medium)培养基中。将NU-DUL-1细胞培养在含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中。
[0157]
作为补充剂来源,从10名健康人体内采集正常人血清(NHS)并合并后分装,储存在-80℃直至使用。使用前,用在65℃水浴中孵育30分钟制作的热灭活人血清(IHS)作为阴性对照。
[0158]
实验前,制备了抗SOX2-T118p和抗SOX2-K119me的多克隆抗体。表2中列出了本研究中使用的商业抗体的信息。
[0159]
PI3K抑制剂IPI-145(duvelisib)、CDK6抑制剂abemaciclib、FGFR1/2抑制剂AZD4547、FAK抑制剂PF-573228、Syk抑制剂R788、Src抑制剂saracatinib和泼尼松龙(prednisolone)购自于MedChem Express公司(Monmouth Junction,NJ)。
[0160]
三、RCHO耐药DLBCL细胞的构建和表征
[0161]
我们构建了对利妥昔单抗介导的补体依赖性细胞毒性(CDC)耐受的LY8细胞和NU-DUL-1细胞。简而言之,原始LY8(LY8-ORI)细胞和原始NU-DUL-1(NU-DUL-1-ORI)细胞用含20%(v/v)NHS的利妥昔单抗(Roche公司,Basel,Switzerland)从4μg/mL浓度逐步升高至32μg/mL处理构建耐药细胞。利妥昔单抗的耐药细胞用LY8-R和NU-DUL-1-R表示。每21天用含20%(v/v)NHS的32μg/mL利妥昔单抗处理LY8-R和NU-DUL-1-R细胞以维持耐药性。通过用荧光激活细胞分选(FACS)法检测碘化丙啶(PI)染色阳性细胞来评估由CDC诱导的细胞溶解。
[0162]
进一步,我们构建了对化疗药物耐药的LY8和NU-DUL-1细胞。简而言之,通过 升高浓度,用多柔比星(Selleck Chemicals公司,Houston,TX)和长春新碱(Selleck Chemicals公司,Houston,TX)以50:1.4的临床比例处理LY8-ORI和NU-DUL-1-OR1细胞。对于LY8细胞的最大耐药剂量为多柔比星125ng/mL和长春新碱3.5ng/mL,对于NU-DUL-1细胞的最大耐药剂量为多柔比星25ng/mL和长春新碱0.7ng/mL。然后将这些细胞每21天用2μg/mL的4-氢过氧环磷酰胺(4-HC)(Santa Cruz Biotechnology公司,Santa Cruz,CA)处理3个周期。所获得的CHO耐药细胞分别被称为LY8-CHO和NU-DUL-1-CHO。每隔21天用多柔比星、长春新碱和4-HC处理CHO耐药细胞以维持对CHO的耐受性。
[0163]
使用类似的方法,我们处理了LY8-R和NU-DUL-1-R细胞以构建耐药的LY8-RCHO细胞和耐药的NU-DUL-1-RCHO细胞。为了维持RCHO的耐药性,每隔21天先用含20%(v/v)NHS的32μg/mL的利妥昔单抗处理LY8-RCHO细胞和NU-DUL-1-RCHO细胞,然后用多柔比星、长春新碱和4-HC处理。在多柔比星、长春新碱和4-HC处理48小时后,通过一系列的CCK-8测定来确定对CHO和RCHO的耐药性。
[0164]
四、Aldefluor分析
[0165]
ALDH1是多种正常和癌症干细胞的选择性标记物,包括造血干细胞。因此,我们通过检测ALDH1阳性细胞来评估造血系统恶性肿瘤中的癌症干细胞数量。如前所述,我们使用ALDEFLUOR TM试剂盒(StemCell Technologies公司,Vancouver,BC,CA)检测具有高ALDH1活性的群体。简而言之,将1x10 6个细胞悬浮在1mL含有1μM浓度的MALDH1的底物BAAA的测定缓冲液中。然后将悬浮的细胞等分成两个试样,一个作为阴性对照,另一个作为测试样品。为了形成阴性对照,将50mM DEAB(一种特异性ALDH抑制剂)加入到一个等分试样中。然后在流式细胞术分析前将细胞在37℃孵育30分钟。
[0166]
五、球形成分析
[0167]
将细胞悬浮于含有0.4%(v/v)BSA和不含维生素A的0.2×B27(Life Technologies公司,Gaithersburg,MD)并含有10ng/mL浓度的重组EGF(PeproTech公司,Rocky Hill,NJ)、10ng/mL浓度的重组碱性成纤维细胞生长因子(PeproTech公司,Rocky Hill,NJ)和5μg/mL浓度的胰岛素(Sigma-Aldrich公司,St.Louis,MO)的无血清培养基(DMEM/F12,3:1混合)中。然后将细胞以1×10 4个细胞/mL的密度接种于超低附着24孔板中。每7天更换一次培养基,并在14天时进行球体计数并收集细胞。用上述培养基以克隆密度传代培养球细胞。在传代3次后的第14天拍照获得图像。
[0168]
六、CytoTox-Glo TM细胞毒性分析
[0169]
将细胞以1×10 4个/100μL/孔的密度接种在96孔板中。在进行CytoTox-Glo TM细胞毒性测定之前,将细胞用含有或不含有CHO且浓度逐渐升高的IPI-145、abemaciclib、AZD4547、PF-573228、R788或saracatinib预处理48小时。我们按其说明书使用CytoTox-Glo TM细胞毒性测定试剂盒(Promega公司,Madison,WI)进行细胞毒性测定。简而言之,将50μL的CytoTox-Glo TM细胞毒性测定试剂加入所有孔中,通过轨道摇动混合,然后在室温下孵育15分钟。用Synergy HT酶标仪(BioTek公司,Biotek Winooski,MN)检测实验性死细胞的发光量,其中将50μL裂解液加入所有孔中,混合并在室温下孵育15分钟,随后检测总发光量。根据下式计算细胞毒性:细胞毒性(%)=实验性死细胞发光量/总发光量×100%。
[0170]
七、IHC染色
[0171]
来自患者或动物模型的肿瘤组织用4%的福尔马林固定、石蜡包埋并切片。将石蜡切片与3%过氧化氢在37℃下温育15分钟以封闭内源性过氧化物酶,并用0.01M的PBS冲洗,然后在EDTA缓冲液中进行高压抗原修复。然后将切片与兔抗SOX2单克隆抗体(1:200;Cell Signaling Technology公司,Danvers,MA)在4℃下孵育过夜。在PBS中冲洗3次后,将切片与过氧化物酶缀合的AffiniPure山羊抗兔IgG H&L(1:200;Proteintech公司,Chicago,IL)在室温下孵育1小时。然后,根据其说明书使用GTVision III免疫组织化学检测试剂盒(GK500705;Gene Tech公司,中国上海)检测免疫反应性。表2中显示了用于组织微阵列的免疫组织化学染色的一抗的稀释比例。在显微镜下由三个独立的切片进行SOX2、p-AKT、CDK6、FGFR1和FGFR2的免疫染色定量评分,根据公式:得分=3(强阳性)×百分比+2(中等阳性)×百分比+1(弱阳性)×百分比+0(阴性)×百分比。
[0172]
八、免疫印迹分析
[0173]
我们根据标准方法进行了免疫印迹分析,相关抗体见表2。
[0174]
九、定量实时PCR(qRT-PCR)
[0175]
用TRIzol试剂(Invitrogen公司,Grand Island,NY)提取来自细胞的总RNA,然后使用逆转录系统(Promega公司,Madison,WI)将其转录成cDNA。使用SYBR Green Master Mix(Invitrogen公司,Grand Island,NY)和基因特异性引物在Roche LightCycler 480系统(Roche公司,Basel,Switzerland)上对输入的cDNA进行标准化并进行40个循环的扩增。我们使用编码β-actin的ACTB基因作为内源性对照,并且对样品一式三份进行分析。表3中列出了qRT-PCR的引物。
[0176]
十、FACS分析
[0177]
用PBS洗涤后,细胞与荧光素缀合的抗体一起孵育30分钟,然后清洗并将细胞重悬于PBS中。流式细胞仪分析在Cytomics FC500 MPL仪器(Beckman Coulter公司,Brea,CA)上进行并用FlowJo软件(Ashland公司,OR)进行分析。然后使用MoFlo XDP分选仪(Beckman Coulter公司,Brea,CA),根据其相对荧光强度进行细胞分选。
[0178]
十一、EdU细胞增殖测定
[0179]
在EdU测定之前,将RCHO耐药DLBCL细胞用浓度为1μM的duvelisib、abemaciclib或AZD4547预处理48或120小时。对于研究的120小时,在48小时时用含有1μM抑制剂的新鲜培养基替换培养基。根据其说明书使用Cell-Light EdU Apollo643体外流式细胞术试剂盒(广州RiboBio有限公司,广州,中国)进行EdU细胞增殖测定。接下来,我们在Cytomics FC500 MPL流式细胞仪(Beckman Coulter,Brea,CA)上测定EdU染色阳性细胞。
[0180]
十二、质粒构建和慢病毒转导
[0181]
通过从A549细胞的cDNA库中PCR扩增获得人SOX2的编码DNA序列(CDS)。通过EcoRI和BamHI内切酶位点将该序列克隆到pCDH cDNA克隆和表达慢病毒载体(cat#CD511B-1,System Biosciences公司,Palo Alto,CA 94303)中,以在OCI-LY8和OCI-NU-DUL-1细胞中稳定地过表达SOX2。萤火虫荧光素酶基因的CDS从pGL3-Basic质粒中通过PCR扩增获得,并通过EcoRI和BamHI内切酶位点插入到pCDH cDNA克隆和表达慢病毒载体中。使用pLKO.3G克隆载体(质粒#14748,Addgene公司,Cambridge,MA)构建Scramble(SCR)、SOX2、ITGA1、ITGB5、CD79A和CCR7的shRNA质粒。将293FT细胞与pCDH或pLKO.3G质粒以及pMD.2G和psPAX2质粒共转染以分别生成SOX2、萤火虫萤光素酶过表达的慢病毒,或SOX2、ITGA1、ITGB5、CD79A、或CCR7敲减的慢病毒。随后将该慢病毒加入OCI-LY8、OCI-NU-DUL-1、LY8-RCHO或NU-DUL-1-RCHO培养基中孵育48小时。本研究中用慢病毒转导的所有细胞均通过GFP用MoFlo XDP分选仪(Beckman Coulter公司,Brea,CA)分选。有关shRNA寡核苷酸序列的信息显示在表3中。
[0182]
十三、RNA测序
[0183]
用TRIzol试剂(Invitrogen公司,Grand Island,NY)从LY8-ORI、LY8-R、LY8-CHO、LY8-RCHO、NU-DUL-1、NU-DUL-1-R、NU-DUL-1-CHO和NU-DUL-RCHO细胞中提取总RNA。将来自3个不同代的每个组的总RNA分别合并。由上海Novelbio有限公司根据其已建立的方法进行RNA测序(RNA-seq)和生物信息学分析。我们应用DEseq算法筛选差异表达基因,其显著性和错误发现率(FDR)分析遵循以下标准: (1)倍数变化>1.5或<0.667;(2)FDR<0.05。根据KEGG数据库,使用通路分析来确定差异基因的显著通路。根据ORI-R-RCHO和ORI-CHO-RCHO序列的信号密度进行系列聚类分析以确定表达的全局趋势和模型概况。Fisher精确检验和多重比较检验用于选择显著通路,显著性阈值由P值和FDR定义。我们在ORI-R-RCHO和ORI-CHO-RCHO序列中筛选了有显著增加趋势的富集通路,然后使用Cytoscape软件分析这些组之间这些通路的相互作用频率。
[0184]
本研究的RNA-seq数据可通过GEO系列登录号GSE112989和GSE113001在NCBI GEO数据库中获取。
[0185]
十四、基因集富集分析
[0186]
我们使用Broad Institute(博德研究所,麻省理工学院)的GSEA软件进行了基于RNA-seq的差异表达基因功能的基因集富集分析(GSEA)。该软件的预排序版本用于确定显著富集的通路,并且FDR<0.25的富集通路被认为是显著的。本研究中使用的PI3K-AKT信号传导通路基因集由PathCards通路统一数据库(版本4.6.0.37,Weizmann Institute of Science)中的PI3K-AKT信号传导通路SuperPath的341个基因组成。GSEA术语KEGG_CHEMOKINE_SIGNALING_PATHWAY也用于识别趋化因子信号传导通路。
[0187]
十五、统计方法
[0188]
除非另有说明,本发明实施例中的数据以平均值±标准差表示。使用双尾学生t检验未配对数据以确定两组之间的显著差异,并且P<0.05被认为具有统计学显著性。对于组织微阵列的IHC染色评分,通过双尾配对t检验确定显著性,并且P<0.05被认为是统计学显著的。对于动物模型的总光子通量,通过单尾Mann-Whitney检验确定显著性,并且P<0.05被认为具有统计学显著性。我们应用Mantel-Cox检验比较两组异种移植模型的存活率,P<0.05被认为具有统计学意义。
[0189]
表2.实施例中应用到的抗体商品列表
[0190]
[0191]
[0192]
[0193]
[0194]
表3.实施例中用到的引物和shRNA序列列表
[0195]
[0196]
[0197]
[0198]
[0199]
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解,本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此,凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案,皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

权利要求书

[权利要求 1]
一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物,其特征在于,包括PI3K/AKT信号通路抑制剂和化疗药物。
[权利要求 2]
如权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,还包括靶向CD20的单抗。
[权利要求 3]
如权利要求2所述的药物组合物,其特征在于,所述靶向CD20的单抗为利妥昔单抗。
[权利要求 4]
如权利要求1或2所述的药物组合物,其特征在于,还包括药学上可接受的载体或赋形剂。
[权利要求 5]
如权利要求1或2所述的药物组合物,其特征在于,所述化疗药物选自环磷酰胺、多柔比星和长春新碱中的一种或几种。
[权利要求 6]
如权利要求1或2所述的药物组合物,其特征在于,所述PI3K/AKT信号通路抑制剂选自PI3K抑制剂、AKT抑制剂或PI3K/AKT上游和下游的相关蛋白的抑制剂。
[权利要求 7]
如权利要求1或2所述的药物组合物,其特征在于,所述PI3K/AKT信号通路抑制剂选自duvelisib、其衍生物、其药学上可接受的盐、其溶剂合物和其前药。
[权利要求 8]
如权利要求1或2所述的药物组合物,其特征在于,所述PI3K/AKT信号通路抑制剂选自FAK抑制剂、Syk抑制剂和Src抑制剂。
[权利要求 9]
如权利要求1或2所述的药物组合物,其特征在于,所述PI3K/AKT信号通路抑制剂选自abemaciclib、其衍生物、其药学上可接受的盐、其溶剂合物和其前药。
[权利要求 10]
如权利要求1或2所述的药物组合物,其特征在于,所述PI3K/AKT信号通路抑制剂选自AZD4547、其衍生物、其药学上可接受的盐、其溶剂合物和其前药。
[权利要求 11]
一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物,其特征在于,包括PI3K/AKT信号通路抑制剂和药学上可接受的载体形成的第一制剂、靶向CD20的单抗和药学上可接受的载体形成的第二制剂,以及化疗药物及药学上可接受的载体形成的第三制剂。
[权利要求 12]
如权利要求11所述的药物组合物,其特征在于,所述PI3K/AKT信号通路抑制剂选自duvelisib、其衍生物、其药学上可接受的盐、其溶剂合物和其前药。
[权利要求 13]
PI3K/AKT信号通路抑制剂、靶向CD20的单抗和化疗药物在制备B细胞淋巴瘤治疗联合用药物中的应用。
[权利要求 14]
如权利要求13所述的应用,其特征在于,所述B细胞淋巴瘤为弥漫性大B细胞淋巴瘤。
[权利要求 15]
如权利要求13所述的应用,其特征在于,所述B细胞淋巴瘤为对化疗药物耐药的B细胞淋巴瘤。
[权利要求 16]
如权利要求13所述的应用,其特征在于,所述B细胞淋巴瘤为CSC比例升高的B细胞淋巴瘤。

附图

[ 图 1]  
[ 图 2]  
[ 图 3]  
[ 图 4]  
[ 图 5]  
[ 图 6]  
[ 图 7]  
[ 图 8]  
[ 图 9]  
[ 图 10]  
[ 图 11]  
[ 图 12]  
[ 图 13]  
[ 图 14]  
[ 图 15]  
[ 图 16]  
[ 图 17]  
[ 图 18]  
[ 图 19]  
[ 图 20]  
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[ 图 78]  
[ 图 79]  
[ 图 80]