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1. (WO2018224765) PROCÉDÉ DE SÉLECTION DE COLONIES D'ABEILLES PRÉSENTANT LE CARACTÈRE VSH ET COMPOSITION ET KIT POUR SA MISE EN ŒUVRE
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PROCÉDÉ DE SÉLECTION DE COLONIES D'ABEILLES PRÉSENTANT LE CARACTÈRE VSH ET COMPOSITION ET KIT POUR SA MISE EN ŒUVRE

La présente invention s'inscrit dans le domaine de l'apiculture, et plus particulièrement de la protection des abeilles contre le parasite Varroa destructor et de la sélection des colonies résistantes à ce parasite.

Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé pour déterminer si une colonie d'abeilles présente le caractère hygiénique spécifique du parasite Varroa destructor, ainsi que l'utilisation de substances particulières pour une telle détermination. L'invention concerne également une composition adaptée à la mise en œuvre d'un tel procédé, ainsi qu'un kit pour cette mise en œuvre.

Depuis quelques années, le parasite Varroa destructor est devenu la principale menace pathogène des insectes de l'espèce Apis mellifera, communément nommés, et désignés dans la présente description, pour plus de commodité, par les termes « abeilles à miel », « abeilles domestiques », ou encore simplement « abeilles ». Ce parasite, que l'on désignera dans la présente description également par le simple terme Varroa, se reproduit sur les couvains en développement, transmettant à cette occasion à ces derniers plusieurs espèces virales. Ceci entraine des dommages importants dans les colonies d'abeilles, car les couvains engendrent alors des adultes dysfonctionnels et à très courte durée de vie, désorganisant l'équilibre social de la colonie. En l'absence de contrôle vis-à-vis de ce parasite, les colonies d'abeilles infestées disparaissent généralement en 2 à 3 ans.

Cependant, il existe certaines colonies d'abeilles à miel qui présentent la capacité de survivre naturellement à l'infestation par le parasite Varroa destructor. Cette capacité est fortement associée à l'expression de deux caractères liés entre eux. Les colonies résistantes sont ainsi capables de détecter la présence du Varroa à travers l'opercule du couvain en développement et de nettoyer le couvain parasité. Cette forme de comportement hygiénique est connue sous le nom de comportement VSH

(pour l'anglais Varroa Sensitive Hygiène - comportement hygiénique spécifique du Varroa). Les alvéoles contenant des femelles Varroa accompagnées d'immatures sont préférentiellement ciblées par les abeilles porteuses du caractère VSH. Ce comportement VSH permet aux abeilles d'éliminer les varroas immatures. S'il ne tue généralement pas les femelles Varroa fondatrices qui infestent les alvéoles ciblées, il perturbe toutefois la reproduction de ces femelles. Par conséquent, les femelles Varroa situées dans des colonies d'abeilles exprimant le caractère VSH se retrouvent fréquemment en échec dans leurs cycles de reproduction. Cet échec de reproduction du Varroa est appelé SMR (pour l'anglais Suppressed mite reproduction).

A partir de cette découverte, l'art antérieur a cherché à développer des procédés de sélection des colonies d'abeilles résistantes au Varroa, afin de favoriser l'élevage de ces colonies, moins difficiles à maintenir en vie que les autres, ou d'éviter de traiter inutilement, contre l'infestation par le parasite Varroa, des colonies qui y sont naturellement résistantes.

Selon un de ces procédés, notamment décrit dans la publication de Villa et al., 2009, dans Journal of Apicultural Research 48(3):162-167, l'évaluation du caractère VSH des colonies d'abeilles est réalisée par le biais d'une procédure qui implique de placer un cadre de couvain fortement infesté en Varroa dans la colonie à tester. Après un temps d'incubation, le cadre est récupéré et l'infestation réévaluée, pour déterminer si les abeilles de la colonie ont procédé ou non à un nettoyage des alvéoles parasitées. Un tel procédé est cependant contraignant à mettre en œuvre, et il requiert de posséder un grand nombre de « colonies donneuses » infestées en Varroa.

Selon un autre procédé proposé par l'art antérieur, notamment décrit dans la publication de Villa et al., 2016, dans Apidologie 47(6)771 -778, le potentiel de résistance des colonies d'abeilles au Varroa est plutôt évalué en utilisant un test d'évaluation du caractère SMR des abeilles. Ce test consiste à évaluer, sur un cadre de couvain operculé, la proportion de femelles Varroa qui sont en échec de reproduction. Cependant, même si ce test est plus simple à

mettre en œuvre que le procédé décrit ci-dessus, il est très chronophage et en pratique impossible à réaliser sur un grand nombre de colonies sur le terrain.

A l'heure actuelle, aucun outil pratique d'utilisation n'est donc à la disposition des apiculteurs pour estimer le potentiel de résistance au Varroa de leurs colonies d'abeilles à miel.

La présente invention vise à remédier aux inconvénients des solutions proposées par l'art antérieur pour évaluer si une colonie d'abeilles est résistante au parasite Varroa, notamment aux inconvénients exposés ci-avant, en proposant un procédé pour déterminer in vivo, directement dans la ruche, si une colonie d'abeilles de l'espèce Apis mellifera présente le caractère hygiénique spécifique du parasite Varroa destructor, ce procédé étant facile à mettre en œuvre, de préférence par les apiculteurs eux-mêmes, et qui plus est à faible coût.

De manière tout à fait surprenante, il a été découvert par les présents inventeurs que certains composés particuliers déclenchent le comportement VSH des abeilles porteuses de ce caractère, par mise en présence de ces composés avec ces abeilles. L'analyse du degré de réponse des abeilles à cette mise en présence permet alors avantageusement de déterminer si la colonie concernée est ou non porteuse du caractère VSH.

Ainsi, selon un premier aspect, il est proposé selon la présente invention un procédé pour déterminer si une colonie d'abeilles de l'espèce Apis mellifera d'une ruche présente le caractère hygiénique spécifique du parasite Varroa destructor, dit caractère VSH. Ce procédé comprend :

- l'application dans la ruche d'au moins une substance choisie parmi la tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2-one, l'acétate d'hexacosyle, la nonacosan-2-one, le palmitate de méthyle, le palmitate d'éthyle, le stéarate de méthyle, l'oléate de méthyle, le stéarate d'éthyle, l'oléate d'éthyle, le linoléate d'éthyle et le linolénate de méthyle, ou l'un quelconque de leurs mélanges, de sorte à réaliser l'exposition de la colonie d'abeilles à ladite substance,

- la détermination d'un niveau de réponse de la colonie d'abeilles à l'exposition à ladite substance,

- et la comparaison du niveau de réponse ainsi déterminé avec un niveau de réponse de référence indicatif du fait que la colonie d'abeilles présente le caractère hygiénique spécifique du parasite Varroa destructor.

Ladite substance est notamment choisie parmi :

- la tricosan-2-one,

- la pentacosan-2-one,

- l'acétate de tétracosyle,

- l'heptacosan-2-one,

- l'acétate d'hexacosyle,

- la nonacosan-2-one

- et un mélange de palmitate de méthyle, palmitate d'éthyle, stéarate de méthyle, oléate de méthyle, stéarate d'éthyle, oléate d'éthyle, linoléate d'éthyle et linolénate de méthyle.

Par exposition de la colonie d'abeilles à ladite substance, on entend ici que la substance est appliquée dans la ruche de manière telle qu'elle puisse être détectée par l'abeille, par exemple de manière olfactive. L'application de la ou des substance(s) dans la ruche ne se limite notamment pas à des conditions assurant que l'abeille puisse venir en contact avec la ou les substance(s).

Comme indiqué ci-avant, il a été découvert par les présents inventeurs que l'exposition d'une colonie d'abeilles à chacune des substances listées ci-dessus déclenche le comportement VSH des abeilles lorsque la colonie est porteuse de ce caractère. L'analyse du comportement de la colonie, suite à une exposition à l'une ou plusieurs de ces substances, permet de ce fait avantageusement de déterminer de manière relativement simple si elle présente ou non ce caractère VSH.

A cet effet, il peut être mis en œuvre l'analyse de tout type de réponse permettant de refléter un comportement de nettoyage par la colonie d'abeilles. La réponse de la colonie d'abeilles à l'exposition au(x) substance(s), dont le niveau est évalué selon la présente invention, peut ainsi être déterminée de plusieurs façons. Il entre dans les compétences de l'homme du métier de choisir le type de réponse qui sera analysé dans le cadre du procédé selon l'invention, notamment en fonction des conditions choisies pour l'application du ou des substance(s) dans la ruche. Des exemples de types de réponse pouvant entrer dans le cadre de l'invention sont décrits plus avant dans la présente description.

Le niveau de réponse de référence dépend de plusieurs paramètres, notamment du type de réponse analysé, de la ou des substance(s) particulière(s) mises en œuvre, de leur concentration appliquée dans la ruche, de la méthode d'application, etc.

Pour un ensemble de paramètres opératoires donné, il entre dans les compétences de l'homme du métier de déterminer, pour un type de réponse donné, le niveau de réponse de référence qui est indicatif du fait que la colonie d'abeilles testée présente le caractère hygiénique spécifique du parasite Varroa destructor. A cet effet, l'homme du métier peut par exemple effectuer, préalablement à la mise en œuvre du procédé selon l'invention, des tests comparatifs sur des colonies d'abeilles cobayes, plus particulièrement de mettre en œuvre sur ces colonies d'abeilles, d'une part le procédé selon l'invention dans les conditions opératoires choisies, et d'autre part un procédé de l'art antérieur, par exemple le procédé de mesure du caractère SMR, tel que décrit ci-avant et dans la publication de Villa et al., 2016, de sorte à déterminer, pour les colonies d'abeilles classées comme résistantes au Varroa par le test de l'art antérieur, quel est le niveau de réponse de référence pour le procédé selon l'invention, en fonction du type de réponse particulier sélectionné.

Une fois le niveau de réponse de référence obtenu pour un type de réponse donné, le procédé selon la présente invention s'avère particulièrement simple à mettre en œuvre, in vivo et directement dans la ruche, ce qui le rend tout à fait adapté à une mise en œuvre par les apiculteurs eux-mêmes.

De préférence, le type de réponse analysé est choisi pour ne pas nécessiter de matériel d'analyse complexe et coûteux, ni de procédure d'analyse longue et contraignante. Le procédé selon l'invention constitue ainsi un outil particulièrement pratique d'estimation du potentiel de résistance des colonies d'abeilles domestiques au parasite Varroa destructor, par identification des colonies ayant un comportement de détection et de nettoyage des alvéoles de couvain parasitées. Le procédé selon l'invention constitue en particulier à ce titre un outil efficace d'aide à la sélection des colonies d'abeilles dont l'élevage doit être favorisé.

Le procédé selon l'invention peut en outre répondre à l'une ou plusieurs des caractéristiques décrites ci-après, mises en œuvre isolément ou en chacune des leurs combinaisons techniquement opérantes.

Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, l'application de la substance dans la ruche est réalisée par application de cette substance sur un élément dans la ruche, et le niveau de réponse de la colonie d'abeilles à l'exposition à cette substance est un niveau de destruction de cet élément par la colonie d'abeilles. L'analyse d'un tel type de réponse, c'est-à-dire du niveau de destruction d'un élément donné, qui reflète particulièrement bien le comportement VSH naturel des abeilles, dont la réaction naturelle en présence du parasite Varroa est de procéder à une désoperculation et un nettoyage des couvains infestés, permet d'obtenir une évaluation du caractère VSH de la colonie d'abeilles particulièrement fiable.

L'élément porteur de la ou des substance(s) selon l'invention peut aussi bien être un élément constitutif de la ruche, tel qu'un cadre de couvain operculé, qu'un objet extérieur à la ruche, qui est introduit dans la ruche pour les besoins du procédé selon l'invention.

L'application de la ou des substance(s) sur cet élément peut être réalisée de toute manière classique en elle-même, par exemple par pulvérisation, trempage, injection, etc.

A cet effet, la ou les substance(s) peuvent notamment être mises en œuvre dans une composition les comprenant dans un véhicule physiologiquement compatible, c'est-à-dire inoffensif pour les abeilles, et de préférence n'ayant pas d'effet significatif sur leur comportement.

Ce véhicule peut aussi bien être sous forme liquide, dans lequel la ou les substances sont solubilisées et/ou en suspension, que sous forme solide, dans laquelle la ou les substances sont dispersées sous forme pulvérulente.

Préférentiellement, le niveau de réponse de référence est une valeur numérique de référence. Le procédé selon l'invention comprend alors la quantification d'un niveau de réponse de la colonie d'abeilles à l'exposition à ladite substance selon l'invention, puis la comparaison de la valeur ainsi obtenue à une valeur seuil de référence, qui a été prédéterminée pour être indicative du fait que la colonie d'abeilles présente le caractère hygiénique spécifique du parasite Varroa destructor, notamment comme indiqué ci-avant.

Le niveau de réponse de référence peut autrement être de tout type, et notamment consister en un gabarit de référence, qui est destiné à être comparé, par exemple visuellement, à l'élément ayant servi de test dans la ruche, et dont le niveau de destruction est analysé dans le cadre de l'invention.

Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, la détermination du niveau de réponse de la colonie d'abeilles suite à son exposition à la substance est réalisée après au moins 1 heure, de préférence après au moins 2 heures, ou après au moins 8 heures, ou encore après au moins 24 heures, et par exemple après au moins 48 heures, d'exposition de la colonie d'abeilles à ladite substance. Une telle caractéristique assure avantageusement une fiabilité importante du procédé selon l'invention, en termes d'évaluation de la présence du caractère VSH pour la colonie d'abeilles testée.

Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, l'application de la substance dans la ruche est réalisée au niveau d'un cadre de couvain operculé de la ruche. Cette application peut être réalisée par injection de la ou des substance(s) dans des alvéoles de ce cadre, ou encore, et préférentiellement, par pulvérisation de la ou des substance(s) sur ce cadre. Cette dernière méthode est particulièrement préférée dans le cadre de l'invention, car simple et rapide à mettre en œuvre.

Cette étape peut être réalisée à l'écart de la ruche, le cadre étant ôté de cette dernière au préalable, puis réintroduit dans la ruche une fois traité. Préférentiellement, elle est réalisée in situ, le cas échéant en extrayant le cadre de la ruche entièrement, ou partiellement seulement.

A titre d'exemple, l'application de la ou des substance(s) au niveau d'un cadre de la ruche peut consister en la pulvérisation de la ou des substance(s) sur une surface du cadre équivalent à 100 alvéoles.

Le niveau de réponse de la colonie d'abeilles à l'exposition à la substance, qui est déterminé dans le cadre de l'invention, peut alors être un taux d'alvéoles du cadre ayant été désoperculées par la colonie d'abeilles en suite de l'application de la substance, par rapport au nombre total d'alvéoles au niveau desquelles la substance a été appliquée.

Dans un tel mode de mise en œuvre, le niveau de réponse de référence est un taux seuil, au-dessus duquel tout résultat est indicatif d'une colonie d'abeilles porteuse du caractère VSH, et pour lequel et en-dessous duquel tout résultat est indicatif d'une colonie d'abeilles non porteuse du caractère VSH. Il a été établi par les présents inventeurs que ce taux seuil est d'environ 55 % d'alvéoles désoperculées par les abeilles, par rapport au total des alvéoles au niveau desquelles la substance a été appliquée. Il peut varier en fonction de plusieurs paramètres, notamment en fonction de la substance particulière mise en œuvre, de sa concentration appliquée dans la ruche, des modalités d'application, etc.

Dans d'autres modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, l'application de la substance dans la ruche est réalisée par introduction dans la ruche d'un élément externe destructible par les abeilles, véhiculant cette substance de manière telle que les abeilles de la colonie puissent détecter sa présence dans la ruche, par exemple de manière olfactive. Préférentiellement, l'élément est imprégné de la substance.

Parmi les éléments répondant à une telle définition, on peut citer à titre d'exemples les objets en matériau mou, tels qu'en paraffine, en carton, etc., qui offrent par ailleurs l'avantage de pouvoir être facilement imprégnés par la substance à appliquer dans la ruche.

Dans une telle configuration, le niveau de réponse de la colonie d'abeilles à l'exposition à la substance est alors la proportion de l'élément qui a été détruite par la colonie d'abeilles en suite de l'introduction dans la ruche de l'élément transportant la ou les substance(s) selon l'invention.

Cette proportion peut notamment être déterminée par calcul d'une différence de masse entre la masse initiale connue de l'élément et sa masse finale, après un temps donné de présence dans la ruche.

De manière générale, la quantité de substance appliquée dans la ruche pour la mise en œuvre du procédé selon l'invention dépend de la substance particulière et de la méthode d'application choisie.

Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, une seule des substances choisies parmi la tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2-one, l'acétate d'hexacosyle, la nonacosan-2-one, le palmitate de méthyle, le palmitate d'éthyle, le stéarate de méthyle, l'oléate de méthyle, le stéarate d'éthyle, l'oléate d'éthyle, le linoléate d'éthyle et le linolénate de méthyle, est appliquée dans la ruche.

Dans d'autres modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, le procédé comprend l'application simultanée d'au moins deux de ces substances, voire plus, et même de la totalité, de ces substances.

Plus généralement, le procédé peut comprendre l'application simultanée d'une pluralité de ces substances, tout nombre et toute combinaison de ces substances entrant dans le cadre de l'invention.

Lorsque plusieurs substances de la liste ci-dessus sont mises en

œuvre simultanément, elles peuvent se trouver dans toutes proportions les unes par rapport aux autres.

Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, le procédé comprend l'application dans la ruche d'au moins une substance choisie parmi la tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2-one, l'acétate d'hexacosyle et la nonacosan-2-one ; en particulier au moins deux, au moins trois, au moins quatre ou au moins cinq de ces substances, ou encore l'ensemble de ces six substances. Cette ou ces substance(s) peuvent être appliquée(s) dans la ruche en combinaison avec une ou plusieurs des substances choisies parmi le palmitate de méthyle, le palmitate d'éthyle, le stéarate de méthyle, l'oléate de méthyle, le stéarate d'éthyle, l'oléate d'éthyle, le linoléate d'éthyle et le linolénate de méthyle ; en particulier en combinaison avec au moins deux, au moins trois, au moins quatre, au moins cinq, au moins six ou au moins sept de ces substances ; ou encore en combinaison avec un mélange de palmitate de méthyle, palmitate d'éthyle, stéarate de méthyle, oléate de méthyle, stéarate d'éthyle, oléate d'éthyle, linoléate d'éthyle et linolénate de méthyle.

Le procédé selon l'invention peut en outre, ou autrement, comprendre l'application dans la ruche d'au moins deux substances choisies parmi le palmitate de méthyle, le palmitate d'éthyle, le stéarate de méthyle, l'oléate de méthyle, le stéarate d'éthyle, l'oléate d'éthyle, le linoléate d'éthyle et le linolénate de méthyle ; en particulier d'au moins trois, au moins quatre, au moins cinq, au moins six ou au moins sept de ces substances ; ou encore un mélange de palmitate de méthyle, palmitate d'éthyle, stéarate de méthyle, oléate de méthyle, stéarate d'éthyle, oléate d'éthyle, linoléate d'éthyle et linolénate de méthyle.

Des combinaisons de substances particulières pouvant être mises en œuvre dans le cadre de l'invention sont par exemple les suivantes :

- un mélange d'acétate de tétracosyle et d'acétate d'hexacosyle, à l'exclusion de toute autre des substances selon l'invention ;

- les substances suivantes, dans les proportions en poids suivantes, par rapport au poids total de ces substances : tricosan-2-one (4,8%), pentacosan-2-one (1 1 ,9%), acétate de tétracosyle (1 1 ,9%), l'heptacosan-2-one (47,6%), acétate d'hexacosyle (9,5%) et nonacosan-2-one (14,3%) ; à l'exclusion de toute autre des substances selon l'invention ;

- les substances suivantes, dans les proportions en poids suivantes, par rapport au poids total de ces substances : palmitate de méthyle (8,1 %), palmitate d'éthyle (27,0%), stéarate de méthyle (8,1 %), oléate de méthyle (8,1 %), stéarate d'éthyle (21 ,6%), oléate d'éthyle (5,4%), linoléate d'éthyle (19,0%) et linolénate de méthyle (2,7%) ; à l'exclusion de toute autre des substances selon l'invention.

La ou les substance(s) peuvent être mises en œuvre seules, sur un support, en particulier un support solide, ou dans une composition les contenant dans un véhicule physiologiquement compatible avec une mise en œuvre en présence d'abeilles. Préférentiellement, ce véhicule est choisi de sorte à solubiliser la ou les substance(s) selon l'invention. Il est en outre de préférence choisi de sorte à ne pas avoir d'impact substantiel sur le comportement des abeilles.

Le procédé selon l'invention peut être appliqué à une ou plusieurs colonies d'un même rucher. Les résultats qu'il permet d'obtenir pour chacune des colonies testées, en termes de niveau de réponse à l'exposition à la ou aux substance(s), peuvent être comparés les uns aux autres, de sorte à déterminer quelles colonies présentent le caractère hygiénique spécifique du parasite Varroa destructor \e plus important.

Selon un autre aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'au moins une substance choisie parmi la tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2-one, l'acétate d'hexacosyle, la nonacosan-2-one, le palmitate de méthyle, le palmitate d'éthyle, le stéarate de méthyle, l'oléate de méthyle, le stéarate d'éthyle, l'oléate d'éthyle, le linoléate d'éthyle et le linolénate de méthyle, ou l'un quelconque de leurs mélanges, pour déterminer si une colonie d'abeilles de l'espèce Apis mellifera présente le caractère hygiénique spécifique du parasite Varroa destructor. Cette substance peut notamment être un mélange de palmitate de méthyle, palmitate d'éthyle, stéarate de méthyle, oléate de méthyle, stéarate d'éthyle, oléate d'éthyle, linoléate d'éthyle et linolénate de méthyle.

Cette utilisation peut répondre à l'une ou plusieurs des caractéristiques décrites ci-avant en référence au procédé proposé par la présente invention pour déterminer si une colonie d'abeilles de l'espèce Apis mellifera d'une ruche présente le caractère hygiénique spécifique du parasite Varroa destructor.

Un autre aspect de la présente invention est une composition, se présentant notamment sous forme solide ou sous forme liquide, particulièrement adaptée à la mise en œuvre d'un procédé selon l'invention. Cette composition contient au moins une substance choisie parmi la tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2-one, l'acétate d'hexacosyle, la nonacosan-2-one, le palmitate de méthyle, le palmitate d'éthyle, le stéarate de méthyle, l'oléate de méthyle, le stéarate d'éthyle, l'oléate d'éthyle, le linoléate d'éthyle et le linolénate de méthyle, ou l'un quelconque de leurs mélanges, dans un véhicule physiologiquement compatible avec une utilisation en présence des abeilles de l'espèce Apis mellifera.

Elle contient par exemple au moins une substance choisie parmi :

la tricosan-2-one,

la pentacosan-2-one,

l'acétate de tétracosyle,

l'heptacosan-2-one,

- l'acétate d'hexacosyle,

la nonacosan-2-one

et un mélange de palmitate de méthyle, palmitate d'éthyle, stéarate de méthyle, oléate de méthyle, stéarate d'éthyle, oléate d'éthyle, linoléate d'éthyle et linolénate de méthyle,

dans un véhicule physiologiquement compatible avec une utilisation en présence des abeilles de l'espèce Apis mellifera.

On entend par physiologiquement compatible, le fait que le véhicule ne présente aucune toxicité vis-à-vis des abeilles, et de préférence aucun impact substantiel sur leur comportement.

Ce véhicule peut aussi bien se présenter sous forme liquide que sous forme solide, par exemple pulvérulente.

Préférentiellement, le véhicule est sous forme liquide, et la ou les substances(s) y sont solubles. Elles peuvent autrement s'y trouver en suspension.

A titre d'exemple, le véhicule mis en œuvre est l'isohexane.

La composition selon l'invention peut contenir une seule substance choisie parmi la tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2-one, l'acétate d'hexacosyle, la nonacosan-2-one, le palmitate de méthyle, le palmitate d'éthyle, le stéarate de méthyle, l'oléate de méthyle, le stéarate d'éthyle, l'oléate d'éthyle, le linoléate d'éthyle et le linolénate de méthyle.

Elle peut autrement contenir au moins deux, voire plus, et même l'ensemble, de ces substances, en mélange les unes avec les autres.

Tout nombre et toute combinaison de ces substances entre dans le cadre de l'invention.

Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, la composition contient au moins de la nonacosan-2-one, seule ou en mélange avec l'un ou plusieurs de la tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2-one, l'acétate d'hexacosyle, le palmitate de méthyle, le palmitate d'éthyle, le stéarate de méthyle, l'oléate de méthyle, le stéarate d'éthyle, l'oléate d'éthyle, le linoléate d'éthyle et le linolénate de méthyle

La composition selon l'invention contient par exemple au moins de la

nonacosan-2-one et un mélange de palmitate de méthyle, palmitate d'éthyle, stéarate de méthyle, oléate de méthyle, stéarate d'éthyle, oléate d'éthyle, linoléate d'éthyle et linolénate de méthyle ; le cas échéant avec l'un ou plusieurs de la tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2-one, l'acétate d'hexacosyle.

Elle peut par exemple contenir au moins de la nonacosan-2-one et au moins une substance, de préférence au moins deux substances, ou au moins trois substances, au moins quatre substances, ou préférentiellement au moins cinq substances, parmi la tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2-one et l'acétate d'hexacosyle.

Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, la composition ne contient pas, en tant que substance conforme à l'invention, un mélange de palmitate de méthyle, palmitate d'éthyle, stéarate de méthyle, oléate de méthyle, stéarate d'éthyle, oléate d'éthyle, linoléate d'éthyle, linolénate de méthyle, à l'exclusion de tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2-one, l'acétate d'hexacosyle et la nonacosan-2-one.

La composition selon l'invention peut notamment contenir au moins une substance choisie parmi la tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2-one, l'acétate d'hexacosyle et la nonacosan-2-one. Elle peut notamment contenir au moins deux, au moins trois, au moins quatre ou au moins cinq de ces substances, ou encore l'ensemble de ces six substances.

La composition selon l'invention peut par exemple contenir un mélange de tricosan-2-one, pentacosan-2-one, acétate de tétracosyle, heptacosan-2-one, acétate d'hexacosyle et nonacosan-2-one, ainsi qu'une ou plusieurs substances choisies parmi le palmitate de méthyle, le palmitate d'éthyle, le stéarate de méthyle, l'oléate de méthyle, le stéarate d'éthyle, l'oléate d'éthyle, le linoléate d'éthyle et le linolénate de méthyle.

La composition selon l'invention peut autrement contenir un mélange de palmitate de méthyle, palmitate d'éthyle, stéarate de méthyle, oléate de méthyle, stéarate d'éthyle, oléate d'éthyle, linoléate d'éthyle et linolénate de méthyle, ainsi qu'une ou plusieurs substances choisies parmi la tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2-one, l'acétate d'hexacosyle et la nonacosan-2-one.

La composition selon l'invention peut autrement par exemple contenir, en tant que substance conforme à l'invention, uniquement l'acétate de tétracosyle et l'acétate d'hexacosyle, en mélange. Cette ou ces substance(s) peuvent se trouver dans la composition selon l'invention en combinaison avec une ou plusieurs des substances choisies parmi le palmitate de méthyle, le palmitate d'éthyle, le stéarate de méthyle, l'oléate de méthyle, le stéarate d'éthyle, l'oléate d'éthyle, le linoléate d'éthyle et le linolénate de méthyle ; en particulier en combinaison avec au moins deux, au moins trois, au moins quatre, au moins cinq, au moins six ou au moins sept de ces substances ; ou encore en combinaison avec un mélange de palmitate de méthyle, palmitate d'éthyle, stéarate de méthyle, oléate de méthyle, stéarate d'éthyle, oléate d'éthyle, linoléate d'éthyle et linolénate de méthyle.

La composition selon l'invention peut autrement ne contenir, en tant que substances conformes à l'invention, que des substances choisies parmi la tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2-one, l'acétate d'hexacosyle et la nonacosan-2-one, notamment uniquement ces six substances en mélange les unes avec les autres.

La composition selon l'invention peut en outre contenir au moins deux substances choisies parmi le palmitate de méthyle, le palmitate d'éthyle, le stéarate de méthyle, l'oléate de méthyle, le stéarate d'éthyle, l'oléate d'éthyle, le linoléate d'éthyle et le linolénate de méthyle, par exemple au moins trois, au moins quatre, au moins cinq, au moins six ou au moins sept, de ces substances.

Lorsque la composition selon l'invention contient plusieurs substances selon l'invention, toutes les proportions relatives de ces substances les unes par rapport aux autres entrent dans le cadre de l'invention.

A titre d'exemple, une composition selon l'invention peut contenir les substances suivantes, dans les proportions respectivement associées suivantes, exprimées en poids par rapport au poids total de ces substances : tricosan-2-one (4,8%), pentacosan-2-one (1 1 ,9%), acétate de tétracosyle (1 1 ,9%), l'heptacosan-2-one (47,6%), acétate d'hexacosyle (9,5%) et nonacosan-2-one (14,3%).

Une autre composition selon l'invention peut contenir les substances suivantes, dans les proportions respectivement associées suivantes, exprimées en poids par rapport au poids total de ces substances : palmitate de méthyle (8,1 %), palmitate d'éthyle (27,0%), stéarate de méthyle (8,1 %), oléate de méthyle (8,1 %), stéarate d'éthyle (21 ,6%), oléate d'éthyle (5,4%), linoléate d'éthyle (19,0%) et linolénate de méthyle (2,7%).

Un autre aspect de l'invention concerne un kit pour la mise en œuvre d'un procédé selon l'invention. Ce kit comprend :

- au moins une substance choisie parmi la tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2-one, l'acétate d'hexacosyle, la nonacosan-2-one, le palmitate de méthyle, le palmitate d'éthyle, le stéarate de méthyle, l'oléate de méthyle, le stéarate d'éthyle, l'oléate d'éthyle, le linoléate d'éthyle et le linolénate de méthyle, ou l'un quelconque de leurs mélanges ; par exemple au moins une substance choisie parmi la tricosan-2-one, la pentacosan-2-one, l'acétate de tétracosyle, l'heptacosan-2-one, l'acétate d'hexacosyle, la nonacosan-2-one et un mélange de palmitate de méthyle, palmitate d'éthyle, stéarate de méthyle, oléate de méthyle, stéarate d'éthyle, oléate d'éthyle, linoléate d'éthyle et linolénate de méthyle ; de préférence sous forme d'une composition selon l'invention, répondant à l'une ou plusieurs des caractéristiques décrites dans la présente description,

- et des instructions de mise en œuvre de cette ou ces substance(s), et préférentiellement de cette composition, pour déterminer si une colonie d'abeilles de l'espèce Apis mellifera présente le caractère hygiénique spécifique du parasite Varroa destructor, conformément au procédé selon

l'invention.

En particulier, ce kit contient de préférence le niveau de réponse de référence indicatif du fait que la colonie d'abeilles présente le caractère hygiénique spécifique du parasite Varroa destructor, associé au mode d'application particulier de la ou des substance(s) dans la ruche correspondant aux instructions de mise en œuvre fournies.

Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, le kit comporte un élément destructible par les abeilles, et apte à véhiculer la ou les substance(s) de manière telle que les abeilles de la colonie puissent détecter sa/leur présence lorsque l'élément est introduit dans la ruche. Cet élément est notamment apte à être imprégné par la ou les substance(s).

L'élément et la/les substance(s), en particulier sous forme d'une composition la/les contenant dans un véhicule adapté, peuvent être présents dans le kit séparément, et destinés à être assemblés par l'utilisateur lui-même, en particulier l'apiculteur, par exemple extemporanément.

Autrement, ils peuvent être présents dans le kit sous une forme dans laquelle l'élément véhicule déjà la substance, de manière telle que les abeilles de la colonie puissent détecter sa présence lorsque l'élément est introduit dans la ruche. En particulier, l'élément peut être présent dans le kit sous forme pré-imprégnée par la/les substance(s) selon l'invention.

Le kit selon l'invention peut en outre comporter un élément de référence, également nommé élément gabarit, ou gabarit de référence, indicatif du fait que la colonie d'abeilles présente le caractère hygiénique spécifique du parasite Varroa destructor. Cet élément de référence est destiné à être comparé à l'élément véhiculant la/les substance(s) selon l'invention ayant été mises en œuvre selon l'invention, c'est-à-dire ayant été introduite(s) dans la ruche, pour déterminer, en particulier de manière visuelle ou par pesée comparative, si la colonie d'abeilles testée est ou non porteuse du caractère VSH. En particulier, s'il est observé qu'à l'issue d'un temps de séjour déterminé dans la ruche (ce temps étant indiqué dans les instructions de mise en œuvre du kit), l'élément testé a été détruit par les abeilles en proportion telle qu'il est plus petit, ou plus léger, que l'élément de référence, il sera déterminé que la colonie d'abeilles présente le caractère VSH. Si au contraire, il est observé qu'à l'issue de ce temps de séjour, l'élément testé a été détruit par les abeilles en proportion telle qu'il est identique ou plus gros, ou plus lourd, que l'élément de référence, il sera déterminé que la colonie d'abeilles ne présente pas le caractère VSH.

Les caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront plus clairement à la lumière des exemples de mise en œuvre ci-après, fournis à simple titre illustratif et nullement limitatifs de l'invention, avec l'appui des figures 1 à 4, dans lesquelles :

- la figure 1 montre un graphe en barres représentant la réponse de colonies d'abeilles, exprimée en taux de désoperculation (plus ou moins l'erreur standard SE), par les colonies d'abeilles, après 48 h d'exposition aux compositions suivantes, injectées dans les opercules de cadres de la ruche : isohexane (« Iso », contrôle négatif), extrait de nymphes mortes (« NM », contrôle positif), composition conforme à l'invention (« C1 ») à différents taux de dilution ;

- la figure 2 montre des graphes en barres, représentant la réponse de colonies d'abeilles, exprimée en taux de désoperculation (plus ou moins l'erreur standard SE), par les colonies d'abeilles, après 48 h d'exposition aux compositions suivantes, injectées dans les opercules de cadres de la ruche : isohexane (« Iso », contrôle négatif), extrait de nymphes mortes (« NM », contrôle positif), et différentes compositions conformes à l'invention, pour des concentrations différentes (concentrations en substances selon l'invention 3 fois plus importantes en b/ qu'en a/) ;

- la figure 3 montre un graphe en barres, représentant la réponse de colonies d'abeilles, exprimée en taux de désoperculation (plus ou moins l'erreur standard SE), par les colonies d'abeilles, après 48 h d'exposition aux compositions suivantes, injectées dans les opercules de cadres de la ruche : isohexane (« Iso », contrôle négatif), extrait de nymphes mortes (« NM1 »,

contrôle positif), et différentes compositions conformes à l'invention (C1 0, C220, C3, CI 30, C230, C4) ;

- et la figure 4 montre des graphes illustrant les résultats obtenus pour des colonies d'abeilles testées en parallèle pour leur score SMR d'une part, et par le procédé selon l'invention d'autre part, le résultat s'exprimant alors en taux de désoperculation par les colonies d'abeilles après 48 h d'exposition à la composition selon l'invention, injectée dans les opercules de cadres de la ruche ; pour différentes compositions selon l'invention : a/ C1 0, b/ C22o et cl C3.

MATERIEL ET METHODES

Procédé selon l'invention

Design du test et validations préliminaires

Les substances / combinaisons de substances ont été solubilisées dans l'isohexane et exposées au couvain par injection d'1 μί. de la composition obtenue à travers l'opercule d'alvéoles contenant des nymphes aux yeux blancs à rosés à l'aide d'une seringue Hamilton.

Des essais préliminaires en laboratoire ont permis de contrôler que l'injection de solvant à travers l'opercule (70 à 100 alvéoles par échantillon) n'altère pas la survie des nymphes en développement. Le taux de survie a été estimé en mesurant le nombre d'alvéoles qui émergent à la fin de la métamorphose. Les cadres étaient conservés dans une étuve (34 °C) après injection et jusqu'à émergence. Les alvéoles contrôles (sans injection) ont montré un taux d'émergence de 95,9% (± 4 % - n = 6) et les alvéoles percées (groupe contrôle dans lequel un trou a été réalisé dans l'opercule avec la seringue) de 93% (± 7% - n = 3). 93,5% (± 6% - n = 6) des alvéoles injectées avec 1 μ\- d'isohexane émergeaient, alors que seulement 15% (± 1 2% - n = 3) des alvéoles injectées avec 5 μί. d'isohexane émergeaient.

Les tests de terrain ont par conséquent été réalisés avec l'injection de 1 μ\- de composition dans chaque alvéole.

Cette validation préliminaire a également permis de s'assurer que si une activité de comportement hygiénique était enregistrée dans le test de terrain, elle n'était pas ciblée sur du couvain mort.

Afin de contrôler l'âge du couvain dans les alvéoles recevant les traitements et pour assurer l'homogénéité entre les réplicas d'alvéoles et de colonies, sur chaque cadre de couvain prélevé, quelques alvéoles operculées ont été ouvertes afin de vérifier que le couvain était au stade nymphal, 3 à 6 jours après operculation. Les essais ont été réalisés sur un total de 1 12 cadres appartenant à 46 colonies différentes.

Sur chaque cadre, 15 ou 30 alvéoles operculées ont été injectées pour chaque condition de traitement. La position de chaque alvéole injectée a été marquée sur une feuille plastique transparente afin d'assurer le suivi de l'activité de désoperculation/nettoyage. 2, 4, 24 et 48 h après réintroduction des cadres dans leurs colonies d'origine, les cadres ont été vérifiés pour la réponse de désoperculation ou nettoyage. A la fin de la période d'observation de 48 h, la proportion totale d'alvéoles ciblées a été estimée.

Validation du test par contrôles positif et négatif

La première étape a consisté en la validation du bio-essai. Les traitements ont été considérés comme des contrôles négatifs si après injection ils ne déclenchaient pas plus d'activité hygiénique sur les alvéoles traitées que sur des alvéoles non traitées. Trois contrôles négatifs différents ont été testés : alvéoles percées (alvéoles injectées avec 1 μί. d'air), isohexane (alvéoles injectées avec 1 μί. d'isohexane), extraits de nymphes non-parasitées (alvéoles injectées avec 1 μί. d'extrait de nymphes non-parasitées au stade yeux violets). Aucun des trois contrôles n'a déclenché d'activité hygiénique significative en comparaison des alvéoles qui n'ont pas été manipulées. Le contrôle négatif à partir d'isohexane a été choisi comme contrôle négatif pour les expériences suivantes.

La validation du test comportemental de terrain a également nécessité d'identifier un extrait biologique contenant des odeurs auxquelles les abeilles peuvent être naturellement exposées dans une colonie, et qui, une fois injectées à travers l'opercule des alvéoles de couvain, déclencheraient un niveau élevé d'activité hygiénique. Des essais préliminaires ont montré que l'injection d'un extrait obtenu à partir de 10 nymphes mortes préparé dans l'isohexane déclenchait une réponse de type hygiénique quasi-systématique, avec en moyenne 85% des alvéoles traitées ciblées. Cette réponse est significativement plus élevée que celle obtenue pour le contrôle négatif. Les extraits de nymphes mortes ont donc été utilisés comme contrôle positif dans le test de terrain.

La proportion d'alvéoles injectées ciblées par le comportement hygiénique (désoperculation et/ou nettoyage) a été comparée à la proportion d'alvéoles non injectées ciblées par le comportement durant la même plage de temps. Les contrôles négatifs incluaient l'injection d'1 μί. d'air, d'1 μί. d'isohexane (« Iso ») ou d'1 μί. d'extraits de nymphes non parasitées (NP). Le contrôle positif était constitué d'1 μί. d'extrait de nymphes mortes (NM). L'extrait NM a été à cet effet préparé par immersion de 10 nymphes mortes dans 2 mL d'isohexane pendant 10 min, récupération de l'extrait, puis concentration sous un flux d'azote et ajout d'1 μί. d'isohexane.

Préparation de compositions selon l'invention

Plusieurs compositions ont été préparées en utilisant différentes substances / mélanges de substances selon l'invention. Les composés palmitate de méthyle, palmitate d'éthyle, stéarate de méthyle, oléate de méthyle, stéarate d'éthyle, oléate d'éthyle, linoléate d'éthyle et linolénate de méthyle ont été achetés chez Sigma-AIdrich, et les composés tricosan-2-one, pentacosan-2-one, acétate de tétracosyle, heptacosan-2-one, acétate d'hexacosyle et nonacosan-2-one ont été synthétisés à façon par Omega-Cat System (Rennes, France). La pureté des composés variait entre 94 et 99 %. L'identité de tous les composés a été vérifiée par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS).

Les composés ont été solubilisés dans l'isohexane, sauf pour la 2-heptacosanone et la 2-nonacosanone qui ont été solubilisées dans un premier temps dans le cyclohexane. Toutes les dilutions ont été réalisées avec de l'isohexane pur, pour tous les composés. Les composés et les mélanges ont été testés en différentes concentrations.

Evaluation du caractère SMR

Sur 18 des colonies utilisées pour le test de terrain, le caractère SMR a été mesuré de façon concomitante. Dans chaque colonie, un cadre contenant du couvain operculé à un stade de développement tardif a été échantillonné puis disséqué au laboratoire. Les alvéoles ont été ouvertes avec précaution, sous une loupe binoculaire et la présence de Varroa recherchée. Lorsqu'une alvéole était parasitée, le contenu de la famille Varroa était décrit avec précision afin de déterminer si la femelle fondatrice aurait pu produire au moins une femelle fécondée au moment de l'émergence de l'abeille, selon le protocole décrit dans la publication de Villa et al., 2016, citée ci-avant. Cette procédure a été répétée jusqu'à ce que 35 alvéoles infestées soient décrites au moins, et la proportion d'alvéoles infestées contenant des Varroa en reproduction effective calculée, de sorte à obtenir le score SMR.

Analyses statistiques

Toutes les analyses statistiques et les figures ont été générées dans l'environnement R (Version 3.3.1 ). Dans les tests comportementaux de terrain, les colonies ont été considérées comme l'individu statistique. Les analyses ont été réalisées à l'aide de modèle linéaires mixtes (LMEM - package Ime4). Dans le bio-essai, la proportion d'alvéoles ciblées par un comportement hygiénique a été analysée en fonction des traitements. Afin de prendre en compte le fait que différentes alvéoles traitées pouvaient appartenir à la même colonie, l'identité des alvéoles au sein des colonies expérimentales a été incluse comme facteur aléatoire, et l'effet du traitement comme une variable explicative fixe. La relation entre la réponse obtenue dans le test SMR et dans le procédé selon l'invention a été analysée à l'aide de régressions linéaires (LM).

EXEMPLE 1 - mélange de substances selon l'invention

Il a été réalisé l'exposition de nymphes saines à un stimulus chimique par une composition conforme à la présente invention, de sorte à évaluer le comportement de désoperculation / nettoyage des alvéoles.

Cette composition, désignée C1 , contient les composés suivants, dans les proportions en poids suivantes, par rapport au poids total de ces composés dans la composition : tricosan-2-one (4,8%), pentacosan-2-one (1 1 ,9%), acétate de tétracosyle (1 1 ,9%), l'heptacosan-2-one (47,6%), acétate d'hexacosyle (9,5%) et nonacosan-2-one (14,3%).

Pour la composition mère (C15o) la quantité totale de composés dans l'isohexane est de 21000 ng^L.

Cette composition est mise en œuvre aux différentes dilutions suivantes dans l'isohexane : non diluée (C15o), diluée 1 ,67 fois (C13o), diluée 2,5 fois (C120), diluée 5 fois (C1 10), diluée 10 fois (C15), diluée 50 fois (C1 i), et diluée 100 fois (Cl o.s).

La réponse de l'exposition de colonies d'abeilles à ces différentes dilutions de la composition C1 a été analysée. Chaque dilution a été testée sur 12 colonies non apparentées.

A titre de validation, il a également été testé l'isohexane seul (« Iso »), et le contrôle positif extrait de nymphes mortes (« NM »).

L'injection de la composition déclenche une réponse dose-dépendante, comme on peut l'observer sur la figure 1 , qui montre l'activité de désoperculation mesurée en fonction de la dose de composés injectée (n = 12 colonies) (LMEM : χ2 = 87.08, p < 10"15).

La comparaison de la réponse obtenue pour chaque dose de composition injectée indique qu'une réponse significative est obtenue lorsque les taux de dilution de 10 fois ou moins de la composition C1 sont utilisés. La plus haute dose testée déclenche une réponse similaire à celle obtenue avec le contrôle positif ("NM").

Dans les essais suivants, la composition C1 aux taux de dilution de

5 fois (C1 10) et 1 ,67 fois (C130) a été utilisée.

EXEMPLE 2 - Composés selon l'invention testés seuls ou par paires

Les composés suivants : tricosan-2-one (TrCO), pentacosan-2-one (PCO), acétate de tétracosyle (TCA), l'heptacosan-2-one (HPCO), acétate d'hexacosyle (HCA) et nonacosan-2-one (NCO), ont été testés séparément. La combinaison de composés « acétate de tétracosyle (TCA) / acétate d'hexacosyle (HCA) » a également été testée.

A titre comparatif, ont également été testés : la composition C1 de l'Exemple 1 diluée 5 fois (« C1 10 ») ou 1 ,67 fois (« C130 »), l'isohexane (« Iso ») et un extrait de nymphes mortes (« NM »).

Les différents composés ont été mis en solution dans l'isohexane, aux concentrations suivantes :

- expérience a/ (33 colonies) : tricosan-2-one 200 mg/l ; pentacosan-2-one 500 mg/l ; acétate de tétracosyle 500 mg/l ; l'heptacosan-2-one 2000 mg/l ; acétate d'hexacosyle 400 mg/l ; nonacosan-2-one 600 mg/l ; combinaison d'acétate de tétracosyle 500 mg/l et d'acétate d'hexacosyle 400 mg/l (en comparaison avec la composition C1 10) ;

- expérience b/ (22 colonies) : tricosan-2-one 600 mg/l ; pentacosan-2-one 1500 mg/l ; acétate de tétracosyle 1500 mg/l ; l'heptacosan-2-one 6000 mg/l ; acétate d'hexacosyle 1200 mg/l ; nonacosan-2-one 1800 mg/l ; combinaison d'acétate de tétracosyle 1500 mg/l et d'acétate d'hexacosyle 1200 mg/l (en comparaison avec la composition C13o)-

Les résultats obtenus, en termes de taux de désoperculation par les abeilles sont montrés sur la figure 2, en a/ pour l'expérience a/, et en b/ pour l'expérience b/.

On y observe que des résultats assez similaires ont été obtenus dans les deux expériences. Il y a un effet traitement significatif (LMEM : %2ioeq = 366.75, p < 10"15 ; %23oeq = 247.28, p < 10"15) pour tous les composés testés.

Cela indique que l'ensemble de ces composés conformes à l'invention peuvent être utilisés pour évaluer le caractère VSH de colonies d'abeilles domestiques.

EXEMPLE 3 - mélanges de substances selon l'invention

Il a été testé les compositions suivantes :

- composition C1 décrite dans l'Exemple 1 , aux taux de dilution de 5 fois (C1 10) et de 1 ,67 fois (C1∞) ;

- composition C2 contenant, dans l'isohexane : palmitate de méthyle 900 mg/l, palmitate d'éthyle 3000 mg/l, stéarate de méthyle 900 mg/l, oléate de méthyle 900 mg/l, stéarate d'éthyle 2400 mg/l, oléate d'éthyle 600 mg/l, linoléate d'éthyle 2100 mg/l et linolénate de méthyle 300 mg/l ; non diluée (C230) ou diluée 1 ,5 fois (C220) ;

- composition C3 contenant, dans l'isohexane : tricosan-2-one 200 mg/l, pentacosan-2-one 500 mg/l, acétate de tétracosyle 500 mg/l, heptacosan-2-one 2000 mg/l, acétate d'hexacosyle 400 mg/l, nonacosan-2-one 600 mg/l, palmitate de méthyle 600 mg/l, palmitate d'éthyle 2000 mg/l, stéarate de méthyle 600 mg/l, oléate de méthyle 600 mg/l, stéarate d'éthyle 1600 mg/l, oléate d'éthyle 400 mg/l, linoléate d'éthyle 1400 mg/l et linolénate de méthyle 200 mg/l ; non diluée ;

- composition C4 contenant, dans l'isohexane : tricosan-2-one 600 mg/l, pentacosan-2-one 1500 mg/l, acétate de tétracosyle 1500 mg/l, heptacosan-2-one 6000 mg/l, acétate d'hexacosyle 1200 mg/l, nonacosan-2-one 1800 mg/l, palmitate de méthyle 900 mg/l, palmitate d'éthyle 3000 mg/l, stéarate de méthyle 900 mg/l, oléate de méthyle 900 mg/l, stéarate d'éthyle 2400 mg/l, oléate d'éthyle 600 mg/l, linoléate d'éthyle 2100 mg/l et linolénate de méthyle 300 mg/l ; non diluée.

Pour les compositions C1 i0, C22o et C3, le nombre de colonies testées a été de 9. Pour les compositions C13o, C23o et C4, le nombre de colonies testées a été de 17.

A titre comparatif, il a également été testé l'isohexane seul (« Iso ») et l'extrait de nymphes mortes tel que décrit dans l'Exemple 1 (« NM »).

Les résultats obtenus, en termes de taux de désoperculation par les colonies d'abeilles, sont montrés sur la figure 3.

Comme on peut l'observer sur cette figure, pour toutes les compositions selon l'invention testées, l'effet traitement est significatif (LMEM : χ2 = 204.25, p < 10"15).

EXEMPLE 4 - Comparaison avec le taux SMR des colonies testées

Le procédé selon l'invention, et le test SMR décrit par l'art antérieur, ont été mis en œuvre en parallèle sur les mêmes colonies d'abeilles.

La corrélation entre la réponse obtenue dans le test SMR de référence

(score SMR) et la réponse obtenue par le procédé selon l'invention (taux de désoperculation) a été analysée.

A cet effet, ont été mises en œuvre les compositions C1 -i0 (18 colonies), C22o (17 colonies), et C3 (9 colonies) selon l'invention, décrites dans l'Exemple 3.

Pour chaque colonie testée, il a été calculé d'une part le score SMR obtenu par le protocole décrit dans l'art antérieur, dans la publication de Villa et al., 2016, citée ci-avant, et d'autre part le taux de désoperculation obtenu conformément à l'invention. Les résultats obtenus sont montrés sur la figure 4, en a/ pour la composition C1 -m, en b/ pour la composition C22o et en cl pour la composition C3.

On observe que lorsque la composition selon l'invention C1 0 est appliquée, l'association entre les résultats du procédé selon l'invention et le score SMR est significative (LM : F = 14.49, p = 0.00155) et le degré de corrélation relativement élevé (r2 = 0.44) (Figure 4, a/).

Lorsque la composition C22o est appliquée, une relation linéaire significative est également obtenue (LM : F = 8.93, p = 0.008681 ) (Figure 4, b/).

Le degré de corrélation le plus élevé avec le score SMR est détecté pour la composition C3 (LM : F = 14.29, p = 0.0069, r2 = 0.62, n = 9) (Figure 4, c/).

Pour chacune des compositions selon l'invention testées, on observe qu'il peut être établi une valeur de référence, exprimée sous forme d'un taux de désoperculation seuil, au-dessus duquel on peut déterminer, par comparaison avec le score SMR (dont il est connu de l'art antérieur qu'il est supérieur à 0,5 pour les abeilles porteuses du caractère VSH), que la colonie d'abeilles testée est porteuse du caractère VSH.

Pour la composition C1 i0, ce taux seuil est de 63 %, pour la composition C22o il est de 55 %, et pour la composition C3 il est de 62 %.